Méthode de mesure quantitative par immunochromatographie, d'analvtes dans un échantillon liquide
La présente invention concerne une méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ainsi que le dispositif mis en œuvre à cet effet.
Apparue vers la fin des années 1980, la technologie de l'immunochromatographie a connu un développement important. Elle offre aujourd'hui un large éventail d'applications, depuis les champs traditionnels du diagnostic médical ou vétérinaire, jusqu'à l'environnement ou l'agroalimentaire.
L'immunochromatographie entre dans un groupe de méthodes de diagnostic basées sur des réactions de liaisons par affinité entre membres de paires de liaisons spécifiques, regroupées sous le terme générique d'immuno-essais.
Globalement, selon l'approche utilisée, les immuno-essais sont divisés en deux grandes catégories : celles faisant intervenir la compétition pour un ligand spécifique entre l'analyte recherché et un analyte marqué et celles qui sont dites de type "Sandwich", dans lesquelles la liaison de l'analyte à un premier ligand spécifique est révélée par un second ligand spécifique marqué, fixé sur ledit analyte.
Les immuno-essais ont progressivement évolué vers des dispositifs de plus en plus simples d'utilisation, permettant le développement de méthodes de diagnostic de routine, rapides et d'un coût modéré.
Cette évolution a été particulièrement sensible dans le domaine médical, avec la forte émergence du diagnostic par "point of care" ou "home testing", dans lequel un diagnostic est directement réalisé près du lit du patient ou à son domicile, sans qu'il soit nécessaire de faire appel aux techniques de laboratoire d'analyse automatisées.
L'immunochromatographie fait partie des technologies utilisées pour ce type de diagnostic rapide.
II s'agit d'une méthode de diagnostic en phase solide, utilisant la chimie sèche et la migration latérale sur une membrane inerte. Cette approche met en œuvre un support poreux sous forme de bandelette, dans lequel sont intégrés sous forme sèche les réactifs nécessaires à la réalisation du test. La membrane est traitée de façon à ce qu'une réaction de reconnaissance entre partenaires de liaison spécifiques (généralement antigène / anticorps) se produise au niveau d'une zone déterminée et puisse être révélée à ce niveau. Schématiquement, lorsque l'échantillon à analyser est déposé sur le support, celui-ci migre le long de la membrane par un phénomène de capillarité. L'analyte recherché est capturé par un ligand spécifique immobilisé sur une zone déterminée de la membrane, et la réaction est révélée par un second ligand spécifique marqué, selon le principe de la méthode sandwich.
Il est également possible d'utiliser en immunochromatographie une réaction de type compétition. On utilise dans ce cas un analyte marqué compétiteur de l'analyte recherché pour la liaison avec le ligand immobilisé. Pour ce même type de test, on peut aussi utiliser le ligand marqué: dans ce cas, l'analyte recherché est en compétition avec l'analyte immobilisé.
Enfin, il est également possible d'utiliser en immunochromatographie une réaction de type sérologique concernant la recherche d'anticorps. Dans ce
cas une possibilité de dosage est décrite. L'antigène spécifique de la pathologie est immobilisé sur le support. Il permet de capturer les anticorps humains spécifiques de l'antigène et de la pathologie, présents dans l'échantillon. La présence des anticorps humains est révélée après addition d'un anticorps secondaire dirigé contre les immunoglobulines humaines. Pour ces tests de sérologie, il est même possible de faire une typologie des anticorps pour déterminer la classe d'anticorps humains détectés (IgM, IgG ou IGA) (Le principe d'une bandelette d'immunochromatographie est schématisé sur la figure 1 ).
De nombreux documents de l'état de l'art décrivent des tests et dispositifs d'immunochromatographie et des adaptations particulières de cette technique à certaines applications. On peut par exemple citer, à titre non exhaustif, US5,591 ,645, US5,120,643, EP299428 ou EP250137 qui visent des tests d'immunochromatographie dans leur principe général, comprenant une bandelette de test permettant une migration de liquide par capillarité et la capture de l'analyte recherché par un réactif spécifique immobilisé au niveau d'une zone déterminée de la bandelette, EP291184 qui décrit un appareil d'analyse spécifique composé d'un boîtier creux contenant un support de réaction, EP383619 qui concerne un support membranaire spécifique, ou EP267006, qui décrit un procédé d'immunochromatographie qualitative pour la détection simultanée de la présence de plusieurs analytes dans un échantillon.
Toutefois, la plupart des tests rapides unitaires par immunochromatographie décrits dans l'état de l'art sont des tests qualitatifs de type "yes/no" basés sur une lecture à l'œil nu. Or, la subjectivité de ce type de lecture est une source de variabilité et de confusion. De plus, ces tests ne peuvent pas être utilisés dans certaines applications pour lesquelles existe un seuil de décision, comme c'est par exemple le cas de
certains marqueurs d'exclusion de thrombose, tels les D-Dimères, dans le domaine de l'hémostase.
Il est donc rapidement apparu le besoin de disposer d'approches permettant de quantifier les résultats obtenus d'une manière la plus simple possible.
L'une des approches les plus anciennes couramment utilisée par l'homme du métier est celle utilisant un contrôle interne spécifique appelé "Témoin de Bon Fonctionnement" (TBF) (voir par exemple EP 0 542 627, WO 96/10179, WO 94/07163 ou AN1 CD., YOSHIKI T., LEE G. and OKADA Y., Cancer Letters, 2001 , 162: 135-139 CHAN, C.P.Y., SUM K.W., CHEUNG K.Y., GLATZ J.F.C., SANDERSON J.E., HEMPEL A., LEHMANN M., RENNEBERG I. and RENNEBERG R., J. Immunol. Methods, 2003, 279:91-100).
Schématiquement dans ce système, l'échantillon à analyser est mis en présence d'un conjugué spécifique de l'analyte recherché lors du dépôt sur la bandelette d'immunochromatographie.
Le conjugué se lie à l'analyte recherché et le complexe formé migre le long de la membrane jusqu'à la zone de capture test spécifique de l'analyte. La coloration qui se développe au niveau de cette zone est proportionnelle à la concentration d'analyte recherché. L'excès de conjugué qui n'est pas lié à l'analyte est capturé au niveau d'une zone TBF, en aval de la zone de capture test sur la bandelette. Cette zone de TBF comprend un réactif immobilisé spécifique du conjugué utilisé. En pratique, dans cette approche, le conjugué est en général un anticorps monoclonal d'origine animale et le réactif immobilisé dans cette zone de TBF est un anticorps anti-espèce, dirigé contre l'espèce animale du conjugué.
Bien que relativement simple dans son principe, ce système présente toutefois certains inconvénients. Ainsi, le même réactif conjugué sert à révéler le test et le contrôle. De ce fait le signal du TBF est fortement dépendant de la concentration de l'analyte. Pour une concentration élevée, le signal peut être fortement diminué, voire absent pour les cas extrêmes. En outre, dans un tel système de contrôle, il n'y a aucune pondération des variations liées à l'échantillon et à la membrane.
Dans d'autres approches, EP088636 décrit un procédé d'analyse quantitative basé sur l'utilisation de plusieurs zones de réaction successives spécifiques d'un même analyte, espacées sur le support de migration.
WO 91 /12528 décrit une méthode d'immunochromatographie quantitative, utilisant également une bandelette à zones multiples, dans laquelle, schématiquement, l'analyte recherché est pris en "sandwich" entre deux réactifs spécifiques dont l'un est couplé à un marqueur et l'autre à de la biotine. Le produit résultant de ces interactions migre le long de la bandelette et est capturé au niveau de la zone de détection par un agent de capture constitué par de l'avidine fixée sur des particules de latex, l'ensemble étant immobilisé sur la bandelette.
WO 97/09620 concerne une méthode pour la détection quantitative ou semi-quantitative d'un analyte dans un échantillon, consistant à utiliser un agent de calibration et basée sur la présence de plusieurs zones dont au moins une pour la calibration, une pour la mesure et une dernière pour le contrôle de bon fonctionnement du test.
WO 00/43786 décrit une approche pour quantifier les résultats obtenus par immunochromatographie avec une visualisation des résultats associée à une coloration, dans laquelle on affecte des valeurs ou domaines de
valeurs à des colorations ou des intensités de coloration de signal, et où l'on compare la coloration du résultat avec celle d'un témoin interne de calibrage. La démarche utilisée dans cette référence est en réalité celle d'un test semi- quantitatif, avec définition d'une intensité de coloration de référence correspondant à une concentration de référence de l'analyte recherché. Elle ne fait pas recours à un instrument de mesure et de pré calibration, seuls moyens pour garantir des résultats fiables lorsqu'il s'agit de tests quantitatifs.
WO 97/37222 et WO 02/077646, concernent des méthodes d'immunochromatographie quantitative mises en œuvre avec un dispositif RAMP™ (Rapid Antigen Measurement Platform). Ces méthodes sont relativement complexes dans leur application. Elles font notamment intervenir une différentiation entre la zone d'application de l'échantillon et la zone mise en contact de celui-ci avec le réactif spécifique de l'analyte recherché. Par ailleurs, elles utilisent comme réactif de détection des populations de particules capables de se lier spécifiquement à l'analyte recherché, qui migrent avec celui-ci jusqu'à une zone de détection.
La présente invention vise à fournir une méthode générale d'immunochromatographie quantitative simple, assurant une fiabilité des résultats malgré certaines fluctuations dues à des facteurs tels que l'échantillon (viscosité, composition, etc.) ou la membrane (micro hétérogénéité de structure), grâce à un système de pondération spécifique.
En particulier, l'invention propose des moyens permettant de recueillir un signal lié à la présence de l'analyte recherché et par ailleurs un signal de contrôle, ce dernier étant choisi pour être indépendant de la réaction principale impliquant l'analyte et ainsi pour assurer une constance du signal de contrôle et par ailleurs l'objectivité du résultat du test.
Ainsi, la présente invention fournit un procédé et un dispositif de ce type dans lesquels un échantillon biologique est déposé sur une extrémité d'une bandelette de matériau poreux et migre par capillarité vers la seconde extrémité de la bandelette, l'échantillon venant au début de sa migration en contact, d'une part, avec un produit de test (réactif de capture) propre à former un complexe de liaison spécifique avec la substance (analyte) à doser et, d'autre part, avec un produit de contrôle (réactif de contrôle). Le complexe formé par la substance avec le produit de test est déplacé, lors de la migration de l'échantillon, vers la seconde extrémité de la bandelette qui comporte une zone de test dans laquelle a été déposé un réactif de capture de ce complexe. Le produit de contrôle est également déplacé par la migration de l'échantillon vers la seconde extrémité de la bandelette qui comporte une zone de contrôle dans laquelle a été déposé un réactif de capture du produit de contrôle, la zone de test étant au voisinage de la zone de contrôle.
Le réactif de test et le produit de contrôle comprennent des marqueurs de détection ou de repérage d'un type quelconque, qui sont détectables par exemple par des moyens optiques, des moyens magnétiques, des moyens électromagnétiques ou autres.
Selon un aspect particulier, la présente invention a ainsi pour objet une méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ladite méthode comprenant les étapes consistant à : a) fournir un dispositif d'immunochromatographie comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), la ou lesdites zones de capture spécifiques comprenant chacune un réactif de capture immobilisé sur le support, ledit réactif de capture formant une paire de liaison spécifique
avec l'un des analytes recherchés, et ladite zone de CMR comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec un réactif de contrôle portant un marqueur détectable, b) mettre en contact l'échantillon avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable et avec un conjugué ou un mélange de conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif formant un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle, c) déposer l'échantillon mis en présence du réactif de contrôle et du conjugué ou du mélange de conjugués sur la zone d'application du support, d) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre à ou aux analytes recherchés de former des paires de liaison avec le ou les conjugués spécifiques et pour permettre le transport par capillarité le long du support solide du ou des analytes recherchés et du réactif de contrôle jusqu'à chacune des zones de capture spécifiques du ou des analytes recherchés et jusqu'à la zone de CMR, e) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre en outre la liaison du ou des analytes recherchés avec le ou les réactifs de capture au niveau de la ou des zones de capture, et la liaison du réactif de contrôle avec le réactif de capture de contrôle au niveau de la zone de CMR, f) mesurer l'intensité du signal test produit par le conjugué fixé sur l'analyte recherché au niveau de chacune des zones de capture et celle du signal contrôle CMR produit par le réactif de contrôle au niveau de la zone de CMR, dans laquelle la quantité (ou taux) de chaque analyte d'intérêt dans l'échantillon est directement proportionnelle au rapport de chaque signal test sur le signal contrôle CMR.
La présente invention a également pour objet un dispositif d'immunochromatographie pour l'analyse quantitative d'un ou plusieurs analytes dans un échantillon selon la méthode de l'invention, comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), dans lequel la zone de CMR comprend un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif étant capable de former une paire par liaison spécifique avec un réactif de contrôle portant un marqueur détectable.
Selon la présente invention, le réactif de contrôle qui migre le long de la membrane d'immunochromatographie et qui est ensuite capturé par le réactif de capture de contrôle immobilisé dans la zone CMR ne possède pas de réactivité croisée avec les analytes recherchés. Il fournit ainsi un signal dont l'intensité est indépendante de la concentration de l'analyte recherché dans l'échantillon. Par ailleurs, le réactif de capture de contrôle peut être choisi pour n'avoir pas d'interférence, notamment de réactivité croisée dans le cas d'anticorps, avec les autres réactifs du dosage, notamment celui pour la capture d'analytes.
Le signal qui se développe à ce niveau permet donc de sécuriser les résultats observés grâce à une pondération des influences de certaines conditions expérimentales, telles que la viscosité et la composition de l'échantillon, les variations des propriétés physico-chimiques de la membrane, etc.
Les signaux obtenus selon Ia méthode de l'invention sont avantageusement mesurés par un appareil de lecture de signal, ce qui permet de fournir des résultats chiffrés et d'éliminer toute subjectivité.
Dans le cadre de la méthode de l'invention, le conjugué ou mélange de conjugués spécifiques du ou des analytes recherchés, ainsi que le réactif de contrôle CMR peuvent être ajoutés à l'échantillon préalablement au dépôt sur la zone d'application du support. Dans ce mode de réalisation, le mélange échantillon / conjugué(s) / réactif CMR est ensuite déposé sur la zone d'application conformément aux étapes b) et c) de la méthode annoncée ci-dessus.
Selon un second aspect préféré de l'invention, le conjugué ou mélange de conjugués, ainsi que le réactif de contrôle CMR sont utilisés sous forme sèche. Ils sont alors contenus dans un réservoir au niveau de la zone d'application de l'échantillon et la mise en contact de l'échantillon liquide avec le conjugué ou mélange de conjugués et avec le réactif de contrôle CMR se produit au moment du dépôt de l'échantillon sur la zone d'application du support. Le dépôt de l'échantillon va entraîner la solubilisation des conjugués et du réactif de contrôle CMR, la liaison du ou des conjugués sur leur(s) analyte(s) spécifique(s) et la migration par capillarité le long du support, des complexes formés entre chaque analyte et son conjugué spécifique, du réactif CMR et, éventuellement, des excès de conjugués qui n'auront pas réagi avec les analytes.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le dépôt de l'échantillon a lieu sur un réservoir préalablement saturé (par exemple dans une solution de saturation PBS - Régilait 1 % - Sucrose 5% (à raison de 0,5ml à 1 ml/test) dans le bac de saturation).
Ainsi, selon cette variante particulière, l'invention a pour objet : une méthode de mesure quantitative d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide par immunochromatographie, ladite méthode comprenant les étapes consistant à :
a) fournir un dispositif d'immunochromatographie comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration, une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), ladite zone d'application comprenant un réservoir contenant un réactif de contrôle portant un marqueur détectable et un conjugué ou un mélange de conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif capable de former un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle, et ladite zone de CMR comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable, b) déposer l'échantillon sur la zone d'application du support, c) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre à ou aux analytes recherchés de former des paires de liaison avec le ou les conjugués spécifiques et pour permettre le transport par capillarité le long du support solide du ou des analytes recherchés et du réactif de contrôle jusqu'à chacune des zones de capture spécifiques du ou des analytes recherchés et jusqu'à la zone de CMR, d) maintenir le dispositif dans des conditions suffisantes pour permettre en outre la liaison du ou des analytes recherchés avec le ou les réactifs de capture au niveau de la ou des zones de capture, et la liaison du réactif de contrôle avec le réactif de capture de contrôle au niveau de la zone de CMR, e) mesurer l'intensité du signal test produit par le conjugué fixé sur l'analyte recherché au niveau de chacune des zones de capture et celle du signal contrôle CMR produit par le réactif de contrôle au niveau de la zone de CMR,
dans laquelle la quantité de chaque analyte d'intérêt dans l'échantillon est directement proportionnelle au rapport de chaque signal test sur le signal contrôle CMR.
Selon un premier mode de réalisation, on procède pour un dosage de la façon suivante : un opérateur dépose l'échantillon à analyser sur la première extrémité de la bandelette, avec éventuellement un tampon de migration, puis déclenche un chronomètre. La bandelette est ensuite placée dans un dispositif de lecture des résultats et l'opérateur commande cette lecture lorsqu'une durée prédéterminée s'est écoulée depuis le déclenchement du chronomètre. La lecture des résultats est réalisée par détection des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle de la bandelette, après quoi on effectue le rapport des signaux captés et on détermine la quantité de substance présente dans l'échantillon liquide à partir de ce rapport au moyen d'une table ou d'une courbe de calibration. Le rapport des signaux détectés dans les zones de test et de contrôle permet de s'affranchir des variations dues à certaines caractéristiques de l'échantillon (sa nature, sa viscosité, son contenu protéique ou ionique etc.) et de la bandelette (telles notamment que des micro-variations de sa structure et de ses composants). Le rapport des signaux détectés dans les zones de test et de contrôle est essentiellement fonction de la concentration de la substance à doser dans l'échantillon et est, au moins en première approximation, indépendant des caractéristiques précitées de l'échantillon et de la bandelette. On a constaté toutefois que l'exactitude des dosages ainsi réalisés dépend beaucoup de l'opérateur qui doit en principe toujours respecter la même procédure pour chaque dosage afin de garantir la qualité et la fiabilité du résultat, ce qui n'est pas toujours possible en pratique. En particulier, si l'opérateur déclenche le chronomètre en avance ou en retard après le dépôt de l'échantillon et éventuellement du tampon de migration sur la bandelette, le résultat du dosage peut varier de façon relativement
importante.
Il se peut aussi que l'opérateur commette une erreur, comme par exemple de ne pas déclencher le chronomètre ou de ne pas ajouter le tampon de migration, ce qui l'oblige à recommencer le dosage lorsqu'il a constaté son erreur, c'est-à-dire en général l'absence de résultat, ce qui se traduit par une perte de temps relativement importante.
Pour ces raisons, l'invention décrit, selon un autre mode de réalisation, un procédé et un dispositif de dosage quantitatif qui améliorent la précision et la fiabilité des résultats de dosage.
Selon ce mode de réalisation, l'invention a pour objet un procédé et un dispositif de dosage quantitatif du type précité, qui permettent d'éviter les erreurs de manipulations de l'opérateur et qui assurent une bonne répétabilité et une bonne fiabilité des dosages.
Elle propose à cet effet un procédé de dosage quantitatif par immunochromatographie d'une substance présente dans un échantillon liquide, conforme à la description de la présente demande et caractérisé en ce qu'il consiste également à détecter automatiquement le passage des marqueurs dans une zone donnée de la bandelette au début de la migration de l'échantillon, à déclencher automatiquement le décompte d'une période de temps prédéterminée à la détection de ce passage des marqueurs et, à la fin de cette période de temps, à déclencher automatiquement l'acquisition des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle de la bandelette.
En particulier, le procédé de dosage en question consiste à mettre en contact l'échantillon liquide d'une part avec un conjugué propre à réagir avec la substance à doser pour former un complexe, et d'autre part avec un produit de contrôle, le conjugué et le produit de contrôle comprenant des
marqueurs de détection, à faire migrer par capillarité l'échantillon avec le conjugué et le produit de contrôle dans une bandelette de matériau poreux comprenant une zone de test qui contient un réactif propre à réagir avec le complexe et une zone de contrôle qui contient un réactif propre à réagir avec le produit de contrôle, à détecter les signaux générés par les marqueurs dans la zone de test et dans la zone de contrôle, à faire le rapport de ces signaux et à déduire de ce rapport la quantité de substance présente dans l'échantillon, ledit procédé étant en outre caractérisé en ce qu'il consiste également à détecter automatiquement le passage des marqueurs dans une zone donnée de la bandelette au début de la migration de l'échantillon, à déclencher automatiquement le décompte d'une période de temps prédéterminée à la détection de ce passage des marqueurs et, à la fin de cette période de temps, à déclencher automatiquement l'acquisition des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle de la bandelette.
Le procédé décrit comprenant l'étape de détection automatique peut être réalisé en intégrant les différentes variantes des caractéristiques du procédé de mesure quantitative d'analyte ou du dispositif pour l'exécution de ce procédé.
Selon ce mode de réalisation incorporant une détection automatique de signal, le procédé selon l'invention prévoit donc de déclencher le décompte du temps lorsque l'échantillon a déjà migré sur une certaine distance dans la bandelette, c'est-à-dire après une phase préliminaire pendant laquelle des perturbations liées à la réaction de dosage peuvent se produire, à l'occasion du dépôt de l'échantillon ou du tampon de migration sur la bandelette ou de la solubilisation du conjugué ou de la formation du complexe. Le déclenchement du décompte de temps après cette phase préliminaire garantit un même temps de migration dans la bandelette pour tous les échantillons avant acquisition des résultats, ce qui ne serait pas le
cas si le décompte de temps commençait au début ou à la fin du dépôt de l'échantillon ou du tampon de migration ou au cours de la solubilisation du conjugué ou de la formation du complexe.
On améliore ainsi notablement la qualité des résultats et la fiabilité des dosages.
L'acquisition des résultats consiste dans un mode de réalisation préféré, à mesurer les aires des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle, à faire le rapport de ces aires, et à déduire de ce rapport et d'une courbe ou d'une table de calibration la quantité de la substance présente dans l'échantillon.
Selon une autre caractéristique de l'invention, les marqueurs ont une raie d'absorption lumineuse à une longueur d'onde donnée, et le procédé consiste à éclairer la bandelette à cette longueur d'onde, à mesurer l'intensité lumineuse réfléchie ou diffusée par les marqueurs à cette longueur d'onde au moyen d'au moins un photodétecteur, et à traiter les signaux de sortie de ce photodétecteur pour obtenir les aires des signaux générés par les marqueurs.
Avantageusement, ce photodétecteur est associé à des moyens de balayage de la bandelette pour capter les signaux générés par les marqueurs et déterminer les aires de ces signaux en fonction d'une distance de balayage.
L'invention a également pour objet, un dispositif d'immunochromatographie pour la mise en œuvre de la méthode définie ci-dessus, ledit dispositif comprenant un support solide sous forme de bandelette, ledit support comprenant une zone d'application de l'échantillon, une zone de migration,
une zone de capture spécifique pour chacun des analytes recherchés et une zone de contrôle de mesure ratiométrique (CMR), dans lequel la zone d'application comprend un réservoir contenant un réactif de contrôle portant un marqueur détectable et un conjugué ou mélange de conjugués sous forme sèche, chaque conjugué étant constitué par un réactif formant un partenaire de liaison spécifique avec l'un des analytes recherchés et portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du réactif de contrôle et la zone de CMR comprend un réactif de capture de contrôle immobilisé sur le support, ledit réactif formant une paire de liaison spécifique avec le réactif de contrôle portant un marqueur détectable. Un tel dispositif est représenté schématiquement sur la figure 2.
Selon un mode de réalisation du dispositif de l'invention, la membrane de la bandelette est réalisée en matériau inerte poreux de façon à permettre un flux capillaire compris entre 50 et 150 sec / 4 cm., en particulier inférieur à 100 sec / 4 cm, par exemple de 90 sec / 4 cm. La taille des pores du support formant la bandelette peut être de 10 μm.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, le conjugué capable de réagir spécifiquement pour former une liaison avec un analyte est un anticorps, par exemple un anticorps monoclonal dirigé contre un premier site antigénique de l'analyte. Le réactif de capture de l'analyte lié au conjugué peut aussi être un anticorps, par exemple un anticorps monoclonal dirigé contre un deuxième site de l'analyte.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le réactif (ou composé) de capture du contrôle CMR est aussi un anticorps, par exemple un anticorps polyclonal.
Les réactifs formant le conjugué de liaison avec l'analyte et le réactif de capture du contrôle peuvent être déposés par vaporisation sur la bandelette.
Dans le cadre de la méthode de l'invention exposée ci-dessus, l'utilisation d'un TBF devient accessoire. La fonction de ce type de témoin dans ce cas se limite à vérifier si tout le conjugué spécifique de l'analyte recherché a été complexé ou s'il reste après la réaction un excès de conjugué non utilisé.
La fourniture de conjugués dans un réservoir permet d'assurer d'une part un stockage, d'autre part un transfert uniforme des conjugués et de l'échantillon sur la membrane de migration. En effet, après addition de l'échantillon sur le dispositif de test comportant le réservoir de conjugués, il y a solubilisation du traceur. Ainsi, le traceur est "libéré" ou "relargué" du réservoir sur la membrane de migration. Ensuite, le reste des réactions aboutissant à la détection et/ou au dosage se déroule normalement dans les conditions optimales.
Les types de matériaux utilisés pour servir de réservoir de conjugué sont surtout des matériaux non-tissés. On peut citer : les fibres de verre ou Glass Fiber (GF) qui sont les plus couramment utilisées, puis les filtres de cellulose et les polyesters hydrophiles.
Les réservoirs de conjugués sont généralement prétraités ; le traitement étant une saturation préalable par des agents saturants dont les protéines et/ou les surfactants. Après cette saturation suivie d'un séchage rapide à température de 37 0C (en général), le conjugué est déposé par immersion ou par "printing".
L'utilisation d'un réservoir permet de contrôler la quantité de conjugués relargués, la vitesse de relargage et de migration des conjugués sur la membrane.
L'emplacement de la zone CMR sur le support n'a pas d'importance pour réaliser la méthode de l'invention, dès lors que celui-ci est distinct de celui de chacune des zones de capture. L'éloignement des zones CMR d'une part et de capture d'autre part, peut être dans un intervalle de 3 à 10 mm, avantageusement autour de 5+ 0,5 mm. Pour des raisons de simplification d'utilisation, la zone de CMR est de préférence située en aval des autres zones de capture test.
La méthode de l'invention peut avantageusement être mise en œuvre pour la quantification simultanée de plusieurs analytes, chaque analyte étant alors arrêté dans sa migration sur le support au niveau d'une zone de capture spécifique, et révélé par un conjugué spécifique.
La quantification des concentrations de chaque analyte est avantageusement réalisée avec un seul CMR. Il suffit dans ce cas de calculer le rapport de chacun des signaux test sur le signal CMR.
Comme cela l'a déjà été indiqué, le réactif de contrôle capturé au niveau de la zone de CMR et les analytes recherchés ne possèdent pas de réactivité croisée, ce qui garantit une intensité de signal CMR indépendante de la concentration et de la nature des analytes recherchés.
Par exemple, dans le cas d'un dosage réalisé sur un échantillon d'origine humaine, le CMR est choisi parmi les molécules d'origine animale, sans réactivité croisée avec le type d'analytes recherchés.
Ainsi, le réactif dθ contrôle peut être choisi parmi certaines immunoglobulines d'origines animales telles que les immunoglobulines de poule.
Le réactif de capture est dans ce cas un anticorps dirigé contre l'espèce animale dudit réactif de contrôle, à savoir un anticorps anti- immunoglobuline de poule.
La paire de liaison formée par le réactif de contrôle CMR et son réactif de capture spécifique est préférentiellement de type antigène / anticorps.
Toutefois, elle peut être constituée par d'autres partenaires d'affinité par exemple de type latex ou liposomes ou des paires telles que: Avidine (streptavidine)/biotine, Protéine A/Immunoglobuline (Ig), Protéine G/lg, Lectines/Concanavaline A (Con A), anti-Haptoglobine/Hémoglobine.
Le marqueur utilisé sur les conjugués et sur le réactif CMR est généralement de deux types :
- direct, comme les marqueurs particulaires (particules d'or, de latex, de carbone, de polycarbonate) et les colorants, le dextran coloré, les traceurs fluorescents, etc.... Ces marqueurs sont détectables en soi, sans autre réaction supplémentaire,
-indirect, comme les marqueurs enzymatiques qui nécessitent une réaction de révélation dont le produit est détecté et/ou mesuré.
Préférentiellement, le marqueur sur le conjugué ou mélange de conjugués est identique à celui utilisé sur le réactif de contrôle CMR. Néanmoins, il est possible d'utiliser des marqueurs différents, à la condition que ceux-ci absorbent dans la même longueur d'onde, de façon à pouvoir toujours établir une corrélation lors de la mesure.
De préférence, le marqueur utilisé est de type particulaire, en l'occurrence des particules d'or, telles que de l'or colloïdal.
Comme cela a déjà été souligné, la mesure quantitative de la concentration de l'analyte recherché est avantageusement effectuée à l'aide d'un lecteur de bandelette qui peut mesurer, par exemple par réflectance ou transmittance, les signaux test et CMR en unités arbitraires. La mesure finale à laquelle on se réfère est le rapport signal test/CMR (également dénommé "ratio" dans les exemples ci-après). Ainsi pour chaque test réalisé correspond un ratio mesuré.
Dans un premier temps, une courbe standard est établie à partir du dosage de l'analyte de référence à plusieurs concentrations. Cette courbe standard sert, pour un analyte donné, de référence pour déterminer la quantité d'un analyte de l'échantillon, correspondant au ratio signal test / signal CMR mesuré. Les valeurs de la courbe standard correspondent de même aux ratios signal obtenu avec l'analyte de référence à une concentration donnée / signal CMR unique. Le signal CMR est choisi par l'homme du métier pour établir la courbe standard et correspond à une valeur du complexe formé entre le réactif de capture de CMR-CMR qui donne un signal (dit signal CMR) se situant dans la partie ascendante de la courbe signal/complexe, par opposition à une valeur qui se situerait dans la partie plateau de la courbe.
Dans un second temps, le ratio mesuré pour un dosage réalisé est reporté sur cette courbe standard. Ainsi, il est possible de traduire le ratio mesuré en concentration d'analyte recherché.
Tout dosage d'un échantillon est ainsi réalisé par rapport à une courbe standard qui est tracée ou mémorisée par le lecteur sous une forme de présentation adéquate (courbe, code barres...).
Le dispositif décrit est avantageusement réalisé de façon telle que le support solide constitué par la bandelette est contenu dans un boîtier. Le boîtier intervient dans l'écoulement de l'échantillon au niveau du réservoir et de la membrane, en prévenant les fuites de liquides. Il peut en outre être adapté au système de lecture.
L'agent de détection généralement utilisé dans les tests d'immunochromatographie est l'or colloïdal qui a son pic d'absorption autour de 535 nm. Dans ce cas, pour la détection, le lecteur peut être équipé de deux sources de lumière LED (Light Emitting Diode) émettant à 530 nm.
Pour cette utilisation, les deux types de lumière (transmise et réfléchie) ont des caractéristiques différentes:
- la réflectance est plus ou moins indépendante de l'environnement et il n'y a pas d'influence du matériel utilisé à part la bandelette elle-même,
- la transmittance dépend très fortement du matériel et plus particulièrement du matériau dans lequel la bandelette réactive est insérée. Ce qui implique que selon la nature et l'épaisseur du matériau utilisé, il est plus ou moins possible de mesurer la transmittance.
Les mesures des lumières réfléchies et transmises sont proportionnelles à la concentration d'analyte capturé par un réactif spécifique couplé aux particules d'or colloïdal (conjugué).
Pour les illustrations de l'invention, c'est la réflectance qui a été préférentiellement retenue.
L'invention a aussi pour objet un procédé de fabrication du dispositif de mesure décrit et un dispositif obtenu par ce procédé comprenant les étapes suivantes :
- le coating (ou immobilisation) sur une membrane permettant l'écoulement d'un liquide par capillarité, au moyen d'une part du réactif de dosage de l'anàlyte recherché dans un échantillon, d'autre part du réactif de capture de contrôle ;
- le séchage, par exemple à une température comprise entre 35 et 400C, notamment 37°C, par exemple pendant 30 minutes, par exemple dans une étuve ventilée de la membrane préalablement coatée.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé de fabrication du dispositif de mesure ne comprend pas d'étape de saturation ni de lavage de la membrane après le coating.
Dans un mode de réalisation de l'invention, le procédé de fabrication du dispositif de mesure est réalisé au moyen de réactifs de coating qui sont des anticorps de capture, par exemple de réactifs déposés doit être déterminée de façon à réaliser des lignes de coating bien définies.
La température de séchage post-coating est déterminée en fonction des molécules constituant les réactifs de capture de l'anàlyte et les réactifs de capture de contrôle.
Les marqueurs (ou traceurs) des réactifs de capture d'analyte test et de capture de contrôle, sont utilisés sans qu'il soit requis de les lier à une matrice (telle que des particules de latex). En d'autres termes, les réactifs de capture sont marqués à l'issue d'un procédé de couplage par exemple
par adsorption du marqueur sur le réactif de capture pour former un conjugué qui peut ensuite être purifié, par exemple par centrifugation.
L'invention propose en particulier un dispositif pour l'exécution du procédé, comprenant un support de bandelette formé avec au moins un orifice de dépôt d'échantillon et une fenêtre de lecture d'un résultat au niveau des zones de test et de contrôle de la bandelette, répondant aux caractéristiques énoncées dans la présente demande et des moyens de captation des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle, ce dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend des moyens de détection du passage des marqueurs dans une zone donnée de la bandelette au début de la migration de l'échantillon, des moyens de comptage de temps, et des moyens de commande de ces moyens de comptage de temps à partir de la détection du passage des marqueurs dans la zone donnée de la bandelette et de commande des moyens de captation des signaux après comptage d'une période de temps prédéterminée.
Un tel dispositif peut être également constitué en incorporant les variantes décrites dans le cadre de la présente demande.
Avantageusement, les moyens de détection du passage des marqueurs dans cette zone de la bandelette sont constitués par les moyens de captation des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle.
Ces moyens de détection et de captation comprennent un moyen d'éclairage de la bandelette à une longueur d'onde donnée et au moins un photodétecteur associé à des moyens de balayage de la zone éclairée de la bandelette.
Ce dispositif comprend également des moyens de détermination de l'aire des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle, de calcul du rapport de ces aires et de détermination de la quantité de substance recherchée dans l'échantillon à partir d'une table ou d'une courbe de calibration préalablement enregistrée en mémoire.
Le support de bandelette comprend un boîtier dans lequel la bandelette est logée et immobilisée et dont la face supérieure comporte au moins une ouverture pour la détection du passage des marqueurs au début de la migration de l'échantillon et pour la captation des signaux générés par les marqueurs dans les zones de test et de contrôle.
Cette ouverture est allongée dans le sens de la migration de l'échantillon et l'une de ses extrémités recouvre la zone précitée de passage des marqueurs au début de la migration, tandis que son autre extrémité recouvre les zones de test et de contrôle.
Comme cela sera plus précisément exposé au niveau des exemples, la méthode de l'invention fournit une aide au diagnostic médical réalisé dans des conditions d'urgence pour l'exclusion de certaines pathologies, en permettant de limiter le recours à certaines explorations invasives ou à des analyses onéreuses.
C'est par exemple le cas, dans le domaine de l'hémostase, du diagnostic de la maladie thromboembolique veineuse qui regroupe les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires.
On estime qu'en France, la seule embolie pulmonaire pourrait concerner près de 100 000 patients par an, et être responsable de 10 000 à 20 000 décès. Il s'agit donc d'une pathologie grave qui peut concerner toutes les catégories de patients qu'ils soient hospitalisés ou ambulatoires. Ne
pouvant être porté uniquement sur l'examen clinique, son diagnostic implique le recours à des examens complémentaires d'imagerie lourds (et parfois invasifs) tels que l'angioscanner, l'angiographie ou la scintigraphie, le plus souvent associés à un Doppler des membres inférieurs. Ce diagnostic requiert donc un matériel coûteux et un personnel spécialisé, pas toujours disponible dans les établissements de soins. De plus, la réalisation de plusieurs examens peut être nécessaire pour exclure avec certitude le diagnostic d'embolie pulmonaire où à l'inverse pour le confirmer, justifiant alors l'instauration d'un traitement anti-coagulant efficace. Il faut cependant noter que le diagnostic d'embolie pulmonaire n'est confirmé aux termes de l'exploration que chez moins d'un tiers des patients ambulatoires admis dans un service d'urgence. D'où l'intérêt pour le développement de tests biologiques non invasifs permettant de confirmer ou au contraire d'infirmer le diagnostic d'embolie pulmonaire et plus généralement de maladie thromboembolique veineuse. La plupart des tests ont concerné des marqueurs d'activation de la coagulation et surtout de la fibrinolyse, en particulier les D-Dimères, des produits de dégradation spécifiques de la fibrine. L'intérêt du dosage des D-Dimères pour exclure un diagnostic d'embolie pulmonaire a été clairement identifié.
Les D-Dimères apparaissent comme produits de dégradation du caillot de fibrine sous l'action de la plasmine. En effet, la thrombine générée lors de l'activation de la coagulation clive la molécule de fibrinogène entraînant, après libération de deux petits peptides (FPA et FPB), la génération de monomères de fibrine qui se polymérisent ensuite (caillot soluble). La stabilisation du caillot (caillot insoluble) est sous la dépendance du facteur XIII, dont la forme activée est une transglutaminase qui permet la liaison (cross-link) des molécules de fibrine impliquées par l'intermédiaire de leurs domaines D. L'activation du système fibrinolytique va ensuite entraîner, via la génération de plasmine, une lyse du thrombus constitué. L'action protéasique de la plasmine sur la fibrine aboutit à la libération de nombreux
fragments de clivage de taille variable dont les D-Dimères qui apparaissent relativement tardivement par rapport au processus initial thrombotique. Il s'agit néanmoins d'un ensemble de produits de dégradation hétérogène sur le plan biochimique. Il est à noter que la plasmine est également capable de cliver le fibrinogène, ainsi que d'autres facteurs de coagulation lors d'une activation pathologique du système fibrinolytique. Les produits issus de la de gradation du fibrinogène ou de la fibrine sont regroupés sous le terme générique de PDF (Produits de Dégradation de la Fibrine/Fibrinogène). Les D-Dimères sont donc le reflet d'une lyse par la plasmine de molécules de fibrine polymérisées ayant subi l'action du facteur XIII.
Le taux de D-Dimère plasmatique est considéré comme un bon reflet de la formation d'un caillot de fibrine et de sa lyse. Il augmente dans plusieurs cas cliniques : thromboses veineuses profondes, embolie pulmonaire, coagulation intra vasculaire disséminée (C.I.V.D.), chirurgie, cancers et cirrhoses, etc Le dosage des D-Dimères est donc devenu un outil très précieux utilisé comme aide au diagnostic d'exclusion de la maladie thromboembolique veineuse (MTEV) que ce soit la thrombose veineuse profonde (TVP) ou l'embolie pulmonaire (EP).
De ce fait, la mise au point d'un test rapide de dosage quantitatif suffisamment fiable et indépendant de l'expérience de l'utilisateur ainsi que des conditions environnementales s'avère particulièrement utile pour limiter le recours à des examens tels que l'angiographie pulmonaire, la phlébographie ou les scintigraphies pulmonaires.
Le dosage du D-Dimère dans un échantillon sanguin selon la méthode de l'invention est illustré dans les exemples ci-après.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, illustré dans les exemples, la méthode de dosage offre une performance caractérisée par un coefficient de variation de la mesure (CV) autour du seuil de 500 ng/ml de D-Dimère, qui est de l'ordre de 10%, voire de 6 à 8 %, si l'on écarte les lignes de lecture du signal de 1 mm supplémentaire.
L'échantillon sanguin dosé quantitativement selon l'invention, est par exemple, un échantillon de plasma. Une quantité d'environ 30 μl de plasma peut être déposée sur la bandelette pour réaliser le test. La lecture du test conduit à un taux de D-Dimère, résultant du ratio obtenu entre la mesure du signal de l'anlyte test et celle du signal du contrôle CMR.
L'invention a aussi pour objet un kit pour la mise en œuvre d'une méthode de mesure quantitative par immunochromatographie d'au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide, comprenant :
- un support inerte sur lequel ont été immobilisés en des zones distinctes, différents types de composés dits de capture permettant (i) d'une part, s'agissant de chaque composé de capture de l'analyte, la capture d'un analyte déterminé de l'échantillon testé par une réaction de liaison spécifique entre ledit composé de capture et un analyte contenu dans l'échantillon, lorsque ledit analyte forme un partenaire de liaison spécifique avec un conjugué constitué par un réactif portant un marqueur détectable, et (ii) d'autre part, s'agissant du composé de capture du réactif de contrôle, la capture d'un réactif de contrôle portant un marqueur détectable ;
- un conjugué ou un mélange de différents conjugués, chaque conjugué étant constitué par un réactif capable de former une liaison spécifique avec un analyte déterminé, recherché dans un échantillon biologique, ledit conjugué portant en outre un
marqueur détectable, ledit (lesdits) conjugué(s) étant contenu(s) dans un réservoir de conjugués saturé ;
- un réactif de contrôle (dit CMR : contrôle de mesure ratiométrique) portant un marqueur détectable absorbant dans la même longueur d'onde que le marqueur du (des) conjugué(s) ;
- pour chaque analyte une courbe standard; spécifique dudit analyte, établie à partir du dosage à plusieurs concentrations de l'analyte de référence associé à un conjugué et du dosage du réactif de contrôle (CMR) à une concentration donnée, dans les mêmes conditions, chaque point de la courbe correspondant au rapport du signal produit par le conjugué associé à l'analyte et capturé par le composé de capture de l'analyte, et du signal produit par le réactif de contrôle capturé par le composé de capture du réactif de contrôle;
- un ou plusieurs supports (backing) destinés à contenir les supports inertes pour la réalisation du test ;
- le cas échéant un boîtier pouvant contenir les supports inertes et leurs accessoires pour constituer une cartouche à placer dans le lecteur de signal,
- le cas échéant, des directives pour l'utilisation du kit aux fins de réalisation de la mesure de la quantité d'analyte ou des analytes.
En particulier, les composés de capture sont immobilisés (coatés) sur une membrane inerte ayant la forme d'une bandelette, par exemple, une membrane de nitrocellulose.
Les différentes parties du dispositif comportant les bandelettes sont illustrées dans les exemples et à la figure 4.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode ou du kit de l'invention, les composés de capture sont des anticorps de capture, en particulier des anticorps monoclonaux pour la capture de l'analyte et des anticorps polyclonaux pour la capture du CMR.
L'anticorps de capture d'analyte est par exemple immobilisé sur le support inerte à une concentration de 1 ,5 à 4mg/ml, par exemple autour de 2+ 0,1 mg/ml.
L'anticorps de capture de réactif de contrôle est par exemple immobilisé sur le support inerte à une concentration de 0,5 à 2 mg/ml, par exemple autour de 1+ 0,05 mg/ml.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, faite à titre d'exemple en référence aux dessins annexés, dans lesquels :
- la figure 1 représente très schématiquement une bandelette d'immunochromatographie ;
- la figure 2 illustre ie principe général du dosage selon l'invention ;
- la figure 3 illustre schématiquement l'utilisation d'un appareil de lecture de résultat ;
- la figure 4 représente schématiquement un mode d'assemblage d'une bandelette d'immunochromatographie ; - la figure 5 représente une courbe standard de calibration ;
- la figure 6 représente les composants essentiels d'un dispositif de dosage selon l'invention ;
- la figure 7 est un graphe de variation de l'intensité d'un signal lumineux capté par un photo détecteur en fonction du temps ;
- ia figure 8 est un graphe illustrant l'acquisition d'un signal généré par les marqueurs dans une zone de test ou de contrôle de la bandelette.
La figure 1 est un rappel du principe d'une bandelette d'immunochromatographie. Cette bandelette comprend respectivement :
- une zone de dépôt 1 sur laquelle est déposée l'échantillon ; la zone de dépôt est représentée avec un réservoir contenant le conjugué sous forme sèche ;
- une zone de capture 2 comprenant un anticorps de capture immobilisé, spécifique de l'analyte recherché ;
- une zone de TBF 3 comprenant un anticorps de capture immobilisé, spécifique du conjugué. L'excès de conjugué qui n'a pas réagi avec l'analyte de l'échantillon migre le long de la membrane jusqu'à la zone de TBF1 où il est arrêté par l'anticorps de capture ;
- un absorbant 4 qui sert à la fois de "pompe" et de "poubelle" des réactions immunologiques déclenchées par le passage de l'analyte de l'échantillon sur la bandelette réactive. Il a en effet pour fonction d'augmenter la capacité d'absorption de tout le dispositif pour finalement bien "nettoyer" la membrane de migration sur laquelle ont eu lieu les réactions immunologiques aboutissant au dosage.
La figure 2 schématise le principe général du dispositif selon l'invention. Dans ce schéma, on considère que l'on ne recherche qu'un seul analyte. La membrane 5 comprend respectivement :
- une zone de dépôt 1 sur laquelle est déposée l'échantillon. Sur cet exemple, le conjugué et le réactif de contrôle CMR sont présents sous forme sèche dans un réservoir 6 au niveau de la zone de dépôt. - une zone de capture 2 comprenant un réactif de capture immobilisé spécifique de l'analyte recherché,
- une zone de CMR 7, comprenant un réactif de capture de contrôle immobilisé, spécifique du réactif de contrôle marqué. Ce réactif de contrôle rendu soluble par le dépôt de l'échantillon sur la zone de dépôt migre par capillarité le long de la membrane jusqu'à la zone de CMR où il est spécifiquement capturé par le réactif de capture de contrôle. Au niveau de cette zone CMR se développe ainsi un signal totalement indépendant de la concentration de l'analyte à , doser.
- un absorbant 4 qui sert à la fois de "pompe" et de "poubelle" des réactions immunologiques déclenchées par le passage de l'analyte de l'échantillon sur la bandelette réactive. Il a en effet pour fonction d'augmenter la capacité d'absorption de tout le dispositif pour finalement bien "nettoyer" la membrane de migration sur laquelle ont eu lieu les réactions immunologiques aboutissant au dosage. L'excès de conjugué qui n'a pas réagi avec l'analyte de l'échantillon ou avec le réactif de capture pour le CMR, migre le long de la membrane puis est aspiré par absorbant.
Le principe de fonctionnement du lecteur de résultats est résumé sur la figure 3.
Selon le schéma, le lecteur 8 mesure la lumière réfléchie 9 et transmise 10 par une bandelette d'immunochromatographie 5.
Deux sources de lumière distinctes 11 et 11' sont utilisées pour éclairer la bandelette 5.
La figure 4 est un schéma d'assemblage de la bandelette d'immunochromatographie, en coupe transversale.
Les dimensions réelles des supports entrant dans la composition de la bandelette (dimension 7cm+ 5mm) sont :
.12= Backing (support adhésif) (70mm) 13= Membrane de nitrocellulose coatée (40mm) 14= Réservoir des conjugués (7mm) 15 Filtre (16mm) 16= Absorbant (18mm)
Positionnement des recouvrements :
Absorbant/membrane de nitrocellulose= AB = 4mm
Réservoir des conjugués / membrane de nitrocellulose= CD = 1 mm Filtre / réservoir des conjugués = DE = 6mm
La figure 5 illustre un exemple de courbe standard pour la calibration, donnant la concentration en D-Dimère en fonction du rapport test/CMR.
Le dispositif de la figure 6 comprend essentiellement un boîtier 20 en matière plastique dans lequel est positionnée et maintenue une bandelette 22 de matériau poreux, dont le contour est représenté en pointillé, la face supérieure du boîtier 20 comportant une ouverture 24 de dépôt d'un
échantillon liquide et éventuellement d'un tampon de migration au niveau d'une extrémité de la bandelette 22, et une fenêtre de lecture 26 de forme allongée qui s'étend par exemple sur la moitié environ de la longueur de la bandelette 22 jusqu'au voisinage de son extrémité opposée à celle sur laquelle est déposé l'échantillon liquide.
La bandelette 22 est réalisée en matériau à base de nitrocellulose par exemple, dans lequel l'échantillon liquide déposé à travers l'orifice 24 peut migrer par capillarité.
Comme déjà décrit ci-dessus, la bandelette 22 peut comporter, entre l'orifice 24 et la première extrémité 28 de la fenêtre 26, une zone 30 sur laquelle ont été déposés, d'une part, un conjugué destiné à former un complexe avec la substance à doser dans l'échantillon liquide et, d'autre part, un produit de contrôle de migration.
La partie de la bandelette apparaissant dans la fenêtre 26, au voisinage de la seconde extrémité 32 de celle-ci, comprend une zone de test 34 et une zone de contrôle 36, matérialisées par des lignes transversales de la bandelette sur lesquelles ont été déposés un réactif de capture de test et un réactif de capture de contrôle, respectivement.
Le réactif de la zone ou ligne de test 34 est destiné à capturer le complexe formé par le conjugué et la substance à doser. Le réactif de la ligne de contrôle 36 est destiné à capturer le produit de contrôle déposé dans la zone précitée 30 de la bandelette.
Par exemple, dans le cas du dosage de D-Dimère, le conjugué déposé dans la zone 30 sous forme sèche est un fragment F(ab)'2 anti-D- Dimère/F(ab)'29C3 de l'anticorps désigné 9C3 ou 8D2 dans le kit Liatest®
D-Dl de la société Diagnostica Stago (France), et le produit de contrôle,
déposé également sous forme sèche, est un anticorps anti-biotine ou un anticorps IgG de poule, le réactif de capture de la zone de test 34 étant un anticorps anti-D-Dimère/2.1.16 et le réactif de capture de la zone de contrôle 36 étant une gamma biotine ou anti-lgG de poule, le produit de contrôle et le réactif de capture de ce produit n'ayant pas de réactivité croisée avec la substance à doser.
Le conjugué et le produit de contrôle déposés dans la zone 30 comportent des marqueurs de détection ou de repérage qui peuvent être d'un type quelconque, comme des marqueurs particulaires (des particules d'or, de latex, de carbone, de polycarbonate, ..) ou des colorants, des traceurs fluorescents ou encore des marqueurs enzymatiques.
Dans un exemple de réalisation préféré de l'invention, les marqueurs utilisés pour le conjugué et le produit de contrôle sont des particules d'or colloïdal qui ont une raie d'absorption lumineuse à une longueur d'onde de
530 nm de sorte que ces marqueurs peuvent être détectés par éclairage de la bandelette par une source lumineuse 38 émettant sur la longueur d'onde de 530 nm ou sur une longueur d'onde très proche et par formation d'une image de la zone éclairée sur un photodétecteur ou un ensemble de photodétecteurs 40 sensibles à cette longueur d'onde.
De préférence, la source lumineuse 38 et le photodétecteur 40 sont du même côté de la bandelette au-dessus de la fenêtre 28 du boîtier 20, la mesure de l'intensité lumineuse étant faite par réflexion. En variante, la source lumineuse 38 et le photodétecteur 40 pourront être de part et d'autre de la bandelette, la mesure se faisant alors en transmission.
Le photodétecteur 40 ou l'ensemble de photodétecteurs est commandé par des moyens 42 de traitement de l'information, qui commandent également le fonctionnement de la source lumineuse 48 et qui reçoivent les signaux
de sortie des moyens de détection 40. Lorsqu'un seul photodétecteur est utilisé, ou une barrette de photodétecteurs alignée sur une zone de test ou de contrôle 34,36, ces moyens de photodétection sont associés à des moyens de balayage qui leur permettent de viser successivement les différentes zones de la bandelette parcourues par l'échantillon liquide lors de sa migration. Par exemple, ces moyens de balayage peuvent comprendre des moyens de déplacement du boîtier 20 dans le sens indiqué par la flèche 44 par rapport aux moyens de détection 40. On peut également utiliser des moyens de balayage optique ou encore un ensemble matriciel de photodétecteurs, ce qui rend alors inutile l'utilisation d'un moyen de balayage.
Le procédé de dosage selon l'invention est le suivant, dans le cas du dosage du D-Dimère dans un échantillon de plasma sanguin :
Un volume fixe d'échantillon de plasma est déposé dans l'orifice 24 du support 20, puis un volume fixe d'un tampon de migration est déposé dans cet orifice. Le liquide déposé dans l'orifice 20 se déplace par capillarité dans la bandelette 22 en direction de son extrémité opposée et passe d'abord par la zone 30 qui comporte le conjugué servant au test et le produit de contrôle. Le conjugué est solubilisé par l'échantillon et par le tampon de migration et réagit avec le D-Dimère pour former un complexe. Ce complexe migre dans la bandelette 22 avec le produit de contrôle par capillarité et se déplace donc vers la première extrémité 28 de la fenêtre 26.
Le boîtier 20 est pendant ce temps placé dans un lecteur équipé de la source lumineuse 38, des moyens de détection 40, des moyens 42 de traitement de l'information et éventuellement des moyens de balayage associés aux moyens de détection 40.
Dans ce lecteur, la première extrémité 28 de la fenêtre 26 est éclairée par la source lumineuse 38 et observée par les moyens de détection 40. Lorsque, au début de la migration dans la bandelette 22, le complexe et le produit de contrôle atteignent la première extrémité 28 de la fenêtre 26, leurs marqueurs sont détectés par les moyens de détection 40.
Le signal de sortie des moyens de détection 40 correspondant à la détection des marqueurs est représenté schématiquement en figure 7 qui est un graphe représentant la variation de l'intensité lumineuse captée par les moyens de détection 40 en fonction du temps. L'intensité lumineuse I captée par les moyens 40 diminue dès que les marqueurs apparaissent à la première extrémité 28 de la fenêtre 26, passe par un minimum et augmente ensuite progressivement jusqu'à un plateau pendant lequel on effectue les mesures sur les zones de test 34 et de contrôle 36.
Le front de descente de ce signal au moment où les marqueurs apparaissent à la première extrémité 28 de la fenêtre est assez raide et peut être utilisé pour le déclenchement d'un comptage de temps, réalisé par les moyens 42 de traitement de l'information, qui, de façon classique, sont équipés d'une horloge générant une base de temps.
Le signal de mesure généré par les moyens de détection 40 observant la zone de test 34 ou la zone de contrôle 36 est représenté schématiquement en figure 8, où la courbe C correspond à la variation de l'intensité lumineuse en fonction d'une distance de balayage d. Ce signal est transmis aux moyens 42 de traitement de l'information qui calculent l'aire A du signal, représentée par la partie hachurée en figure 8.
La quantité de D-Dimère présente dans l'échantillon est déterminée à partir du rapport R de l'aire du signal mesuré dans la zone de test 34 et de l'aire du signal mesuré dans la zone de contrôle 36, et d'une table ou d'une
courbe de calibration préalablement établie donnant directement la concentration en D-Dimère à partir du rapport R (figure 5).
La détection des marqueurs à la première extrémité 28 de la fenêtre 26 présente un certain nombre d'avantages :
- la mesure est effectuée dans les zones de test et de contrôle 34, 36 un certain temps (par exemple 10 minutes) après détection de l'apparition des marqueurs à l'extrémité 28 de la fenêtre 26, cet intervalle de temps étant le même pour tous les échantillons et ne dépendant pas des conditions de solubilisation du conjugué dans la zone 30 de la bandelette et de la formation du complexe entre ce conjugué et la substance à doser,
- une erreur de l'opérateur, comme par exemple l'oubli du dépôt du tampon de migration dans l'orifice 24 du boîtier 20, ou l'utilisation d'une bandelette 22 qui a déjà servi, est détectable rapidement dans la mesure où le signal I de la figure 7 ne présente pas le front descendant caractéristique de la présence des marqueurs.
Exemple 1
Procédé de coating ou d'immobilisation sur la membrane de nitrocellulose.
Matériel
Anticorps de capture anti-D-Dimères à immobiliser: monoclonal 2.1.16 (Stago, France) à une concentration de 2 mg/ml.
Anticorps de capture CMR à immobiliser: Anticorps de chèvre anti-lg de poule (Goat anti-Chicken antibody (Sigma, France) à une concentration de 1 mg/ml).
Membrane de coating : Nitrocellulose SHF0900405 (Millipore, USA)
Tampon de coating: Tampon Phosphate 0.15 M pH 7,4.
Matériel de distribution des solutions d'anticorps: Linomat IV (Camag, Suisse) ou Bio Jet Quanti 3000 (Bio dot, USA).
Méthode
Le coating (ou immobilisation) des anticorps et protéines de capture sur un support inerte est réalisé selon la méthode qui est brièvement rappelée. Sur la membrane de nitrocellulose prédécoupée en format utile pour le test (par exemple 40mm x 200mm), distribué (par vaporisation) à l'aide d'un appareil de dépôt de type Linomat ou Bio Jet Quanti les anticorps de capture à raison de 1 μg par test pour l'anticorps de capture Test 2.1.16 et 0,25 μg par test pour l'anticorps de capture CMR anti-lg de poule produite par la chèvre.
Après le dépôt des anticorps sur la membrane conduisant à l'absorption des anticorps sur la membrane, sécher immédiatement dans une étuve ventilée pendant 30 minutes à 37 0C. La membrane ainsi coatée avec les anticorps est gardée dans un sachet en aluminium fermé, à température ambiante (22-25 0C).
Exemple 2
Procédé de couplage anticorps particules d'or colloïdal.
Matériel
Anticorps monoclonal anti-D-Dimères : Fragments F(ab)'2 9C3 (Stago, France).
Anticorps de révélation CMR: Ig G poule (Sigma, France)
Acide Tétrachloroaurique (Sigma, France)
Tri sodium citrate (Prolabo, France)
PEG 20 ooo (Prolabo, France)
Tampon Borate 2 mM.
Solution de K2CO30,2 M.
Réservoir de conjugué: PT-R5 (MDI, Inde).
Méthode
Préparation des Particules d'or colloïdal
Les particules d'or colloïdal de taille 50 nm sont préparées selon lune légère modification de la méthode de Frens - Tinglu. Cette méthode est brièvement rappelée.
Ajouter 2 ml de solution d'acide tétrachloroaurique 1 % à 198 ml d'eau ultra pure dans le ballon propre.
Mettre un agitateur magnétique dans le ballon et chauffer à ébullition.
Ajouter 275 μl de la solution de Tri sodium citrate 10 %, toujours sous agitation magnétique. Continuer à chauffer.
Après l'apparition de la couleur violette, chauffer encore 10 minutes.
Laisser refroidir à température ambiante (22-25 0C).
Garder les particules d'or colloïdal à 4° C et à l'abri de la lumière dans une bouteille en verre ambré.
Les particules ainsi préparées sont caractérisées: mesure de la longueur d'onde maximale et de la DO à cette longueur d'onde, mesure du pH.
Préparation du conjugué Test anti-D-Dimères - Particules d'or colloïdal
Cette préparation comprend plusieurs étapes.
a) Préparation de l'anticorps au couplage
L'anticorps anti-D-Dimères 9C3 (Fragment F(ab)'2, Stago) est couplé aux particules d'or selon le protocole suivant.
Diluer l'anticorps dans du Borate 2 mM pH 6,5 afin d'avoir une concentration finale de 1 mg/ml puis le dialyser contre ce tampon pendant 3 heures à température ambiante (22-25 0C).
Centrifuger la solution d'anticorps 15 minutes à 5 000 rpm à 4 0C. Après avoir récupéré le surnageant contenant l'anticorps, vérifier sa concentration par mesure spectrophotométrique à 280 nm, avant le couplage.
b) Préparation des particules d'or colloïdal pour le couplage
Ajuster à 1 la DO 530 nm des particules d'or colloïdal par addition d'eau MiIIi-Q.
Ajuster le pH de la solution de particules d'or colloïdal à 6,5 +/- 0,1 en ajoutant du K2CO3 0,2 M.
c) Couplage par adsorption
Mélanger la solution d'anticorps à 0,2 mg/ml à la solution de particules d'or colloïdal, à raison d'un rapport de 1/10 (volume Anticorps/volume particules d'or), soit par exemple, 1 ,85 ml d'anticorps pour 18,5 ml de particules d'or colloïdal.
Agiter pendant deux minutes à température ambiante (22-25 0C).
d) Stabilisation après couplage et récupération du conjugué
Ajouter 1.2 ml de PEG 2o ooo 1 % et vortexer pendant 2 minutes température ambiante (22-25 0C).
Ajouter 2.4 ml de BSA 1 % et vortexer pendant 2 minutes à température ambiante (22-25 0C).
Centrifuger pendant 1 heure à 9 000 rpm, à 40C.
Eliminer le surnageant et récupérer le culot dans du tampon Tris 20 mM pH 8,2, PEG 20 ooo, BSA 1 %, Azide de sodium 0,09 %.
Filtrer ensuite le conjugué récupéré sur 0,2 μm.
Le conjugué est caractérisé sur le plan spectral.
Mesurer la λ max. et la DO max.
Préparation du conjugué CMR IgG Poule -Particules d'or colloïdal.
La même démarche est suivie pour la préparation de ce conjugué CMR. La différence porte essentiellement sur la concentration de couplage et le pH de couplage : 0,1 mg /ml et pH 9,5.
Exemple 3
Saturation du réservoir conjugué et dépôt du conjugué
Immerger la feuille de PTR5 (MDI, Inde) dans la solution de saturation (PBS, Lait 1 % Sucrose 5 %), à raison de 1 ml de solution par test. Laisser 1 heure à température ambiante, sous agitation.
Après élimination de la solution de saturation, faire sécher la feuille de réservoir pendant 3 h à 37 0C dans une étuve ventilée.
Le mélange des deux conjugués (Test et CMR) est déposé sur le réservoir conjugué saturé à raison de 8 μl par cm, soit 4 μl par test, la largeur du réservoir de conjugué étant de 0, 5 cm. Le dépôt est fait par le système Air Jet (Bio dot).
Après Ie dépôt, le réservoir du conjugué est séché 1 heure à 37°C dans une étuve ventilée.
Exemple 4
Cartouche de test de dosage du D-Pimère : Bandelette d'immunochromatoqraphie.
Les différents éléments constitutifs de la bandelette utilisés sont les suivants:
- absorbant (17CHR1 Whatman, USA)
- filtre échantillon (GF 3596, Schleicher & Schϋell, Allemagne),
- membrane de nitrocellulose (SHF0900405, Millipore, USA) coatée,
- réservoir (PT-R5, MDI, Inde) de conjugué déposé.
Ils sont assemblés sur un support inerte rigide appelé "backing" (010 "white polyester" GL-187, G&L, USA).
Le schéma d'assemblage est représenté sur la figure 4.
Après assemblage, des bandelettes de 5 mm de large et 70 mm de long sont découpées avec un cutter (Bio dot, USA).
Chaque bandelette est insérée dans un boîtier plastique dont le schéma est donné à type d'illustration sur la figure 6. Après insertion de la bandelette, le boîtier plastique est fermé et emballé dans un sachet en aluminium (Soplaril, France) avec un dessicant (BO54/lndice 1 , Airsec, France) puis gardé à 2-8°C.
Exemple 5
Dosage du D-Dimère selon ia méthode de l'invention.
Matériel
Tampon de migration : PBS Caséine 0,5% Triton X100 0,1 %
Calibrant D-Dimères: D-Dimères préparés à partir de plasmas humains (Stago, France).
Lecteur de bandelettes: Lecteurs : Rapi-kit (77 Elektronika, Hongrie).
Méthode Protocole opératoire
Le protocole suivant est utilisé:
• Laisser stabiliser les bandelettes, les tampons, les échantillons à température ambiante (22-25 0C).
• Déposer 15 μl de calibrant D-Dimères ou d'échantillon de plasma sur le puits échantillon du boîtier plastique.
• Ajouter 150 μl de tampon de migration.
• Laisser 10 minutes à température ambiante
• Lire le résultat avec un lecteur de bandelette d'immunochromatographie (77 Elektronika).
Tous les essais sont faits en duplicate.
Obtention et interprétation des résultats
Dans un premier temps, la courbe standard est établie à partir du dosage du calibrant D-Dimères stabilisé après reconstitution à différentes concentrations de 0 à 4 000 ng/ml. Pour chaque dosage, les deux signaux Test et CMR sont mesurés par le lecteur et le ratio Test/CMR est calculé. En reportant ce ratio en fonction de la concentration en calibrant D- Dimères, la courbe standard est construite. Elle est valable pour un lot donné de cartouche de test. Le signal CMR est choisi par l'homme du métier dans la partie ascendante de la courbe signal/ complexe formé entre le réactif de capture de CMR et le CMR située autour de 4000±500.
Dans un second temps, le ratio mesuré pour chaque dosage de plasma de concentration en D-Dimères inconnue est reporté sur cette courbe standard. Ainsi, il est possible de traduire le ratio mesuré en concentration d'analyte recherché.
Les étapes de réalisation de la courbe de calibration sont les suivantes :
a) reconstituer le calibrant approximativement (4500 ng/ml) avec de I1H2O-MiIIi-Q, b) laisser le calibrant se stabiliser 30 minutes. Le calibrant est stable 4 heures à TA une fois qu'il est reconstitué, c) diluer le calibrant dans du tampon de migration de façon à obtenir les taux en D-Dimères suivants :
- 250, 500, 1000, 2000 et 4000 ng/ml, d) les tests sont réalisés en duplicate, e) déposer 15 μl d'échantillon dans le puits échantillon (pour le point 0 de la calibration, on dépose 15 μl de tampon de migration), f) ajouter 150 μl de tampon de migration (PBS 1OmM - Caséine 0,5% - Triton x100 0,1% - Azide de sodium 0,095%), g) attendre 10 minutes à température ambiante, h) lire les résultats sur lecteur, i) reporter les résultats sur les fiches de résultats, j) tracer la courbe de calibration [taux en D-Dimère = f (Ratio Test /
CMR)], k) doser les plasmas et le contrôle en suivant le protocole de a à i.
Exemple de résultats pour la courbe standard
Exemple de dosage de plasmas
Les résultats de dosage obtenus avec la méthode de l'invention sont comparés par rapport à ceux obtenus avec une méthode de référence qui est basée sur I
1ELISA, Asserachrom DDimère (Stago, France). Nous pouvons voir que les résultats obtenus avec la méthode de l'invention sont tout à fait très proches de ceux de la méthode de référence.
Il s'agit donc d'une méthode qui permet une détermination quantitative pouvant fournir des résultats équivalents à ceux de la méthode de référence. C'est l'objet de l'invention, le CMR, qui permet de pondérer les variations inhérentes à la technique de l'immunochromatographie (variations dues aux supports et à l'échantillon, etc.).
Il est possible d'avoir une estimation de cette pondération à partir des résultats obtenus.
Effet de pondération du CMR
Chaque dosage est fait en duplicate. L'effet de la pondération due au CMR est estimé à partir de l'écart absolu entre les deux valeurs obtenues pour chaque dosage. Pour un système de pondération théorique parfait, l'écart entre les deux valeurs d'un même dosage doit être égal à 0.
Avec ces résultats, on démontre que les écarts les plus faibles sont obtenus uniquement avec le système de l'invention. En revanche, en l'absence du CMR, donc en n'utilisant que le seul signal Test, le dosage est possible mais avec une plus grande incertitude sur sa mesure.
L'effet de pondération est encore démontré avec les essais de répetabilité. Dans ce cas, c'est le même échantillon qui est dosé 21 fois selon la méthode de l'invention.
ESSAI DE REPETABILITE
Plasma 1
Avec ces dosages faits en répetabilité, la méthode de l'invention permet de pondérer les variations. En effet, un gain de 4 à 6% de variation est observé, par comparaison avec le signal Test uniquement.