DISPOSITIF DE TEST ET PROCEDE IMMUNOCHROMATOGRAPHIQUES
Il s'agit de protéger un procédé de production d'un dispositif de test original permettant de quantifier les résultats obtenus par des méthodes immunochromatographiques, c'est à dire affectant des valeurs ou plages de valeurs de l'élément recherché aux résultats obtenus par ces méthodes. Les méthodes immunochromatographiques auxquelles s'applique la présente invention sont caractérisées par le fait de comprendre au moins un contrôle interne de fonctionnement ou témoin de fonctionnement ou la détection d'un élément dit de référence présent dans l'échantillon. Le procédé de la présente invention consiste principεdement dans la définition d'une intensité de coloration de référence correspondant à une concentration de référence d'un analyte recherché, dans la procédure d'établissement d'un témoin de référence ou calibrage en fonction de l'intensité de référence et dans son utilisation pour la semi-quantification 5 de résultats avec la définition de domaines de valeurs.
Le dispositif de test, faisant appel à la lecture comparative du ou des résultats obtenus avec un ou des témoins de fonctionnement interne ou le résultat de la détection d'un élément de référence, permet d'établir une correspondance entre des intensités ou des variations de coloration de 0 signal ou de signaux et des valeurs ou plages de valeurs de résultats.
Ce dispositif de test permet en particulier d'affecter l'intensité de coloration d'un signal obtenu ou sa couleur, à une valeur ou plage ou domaine de valeurs quantitatives ou numériques, et donc de préciser le taux d'un élément dans un échantillon. 5 Ce dispositif est utilisable pour toute détection d'un élément susceptible d'intervenir dans une réaction d'affinité avec un contre-élément. Cette invention concerne principalement le procédé d'obtention et de mise au point d'un tel dispositif de test pour l'affectation de valeur(s) quantitative(s) à un résultat de nature qualitative: l'intensité de 0 coloration d'un signal ou sa couleur.
On entend par « élément », dans le cadre de cet exposé, toute substance, composition, particule capable d'intervenir dans un système ligand- afiinant, notamment dans une réaction affine avec un « contre-élément ».
La généralité donnée au mot « élément » s'étend donc également à l'expression « contre-élément ». De façon non limitative, « élément » et « contre-élément » peuvent être constitués par un antigène et un anticorps mutuellement complémentaires, affïns, ou vice - versa. Par exemple, ce dispositif de test permet d'estimer le taux d'une réponse humorale envers un ou des antigènes et /ou le taux d'un antigène présent dans un échantillon.
L'invention présente est applicable à la recherche en biologie et dans le domaine du diagnostic médical, ainsi que dans tous les domaines des sciences de diagnostic et d'analyse, tels les sciences vétérinaires, agricoles, agro-alimentaires, alimentaires et d'expertises, où il est nécessaire d'évaluer ou estimer le taux d'un élément, composé ou substance. Elle est également applicable dans l'industrie, et à tout processus de détection qualitative utilisé industriellement. Le procédé d'application de ce dispositif de test utilise la comparaison de l'intensité de coloration du signal du résultat avec celle(s) d'un ou de plusieurs témoins internes de calibrage que l'on aura ajustée lors d'essais antérieurs. La présente invention concerne un procédé dont le but est un dispositif de test permettant l'étalonnage interne de tests unitaires destinés à la détection d'un ou de plusieurs analytes dans un échantillon. Plus spécifiquement, l'invention concerne une méthode de fabrication d'un dispositif et la méthode utilisant le ou les contrôles de calibrage desdits tests dans le but d'obtenir un ou plusieurs indicateurs référencés de coloration ou d'abaque, lié(s) au fonctionnement des mêmes essais.
En particulier, ce procédé original a pour finalité de mettre au point et de produire un dispositif de test d'immunochromatographie par migration ou fïltration sur membrane permettant la quantification des résultats obtenus par l'utilisation d'un ou plusieurs indicateurs visuels colorés, appelés réactifs de révélation, qui peuvent comprendre de l'or colloïdal, des billes de latex, toute substance particulaire ou non, ou le produit d'une réaction enzymologique, et donnant une coloration pour l'indication du résultat. Le procédé, faisant appel à une méthodologie
précise et aux techniques précédemment citées, permet d'obtenir un dispositif de test établissant une correspondance entre l'intensité de coloration du signal obtenu ou sa coloration et des domaines de valeurs quantitatives de l'élément ou des éléments recherchés. Les analyses utilisant l'affinité spécifique de réactifs ont montré leur grande utilité ces dernières années, tant dans le domaine de l'analyse biologique que pour d'autres applications. Plusieurs techniques utilisent ainsi l'affinité spécifique existant entre deux ou plusieurs réactifs: il s'agit de la technique 'sandwich', et de la compétition. Ces méthodes utilisent un ou les deux membres de couple(s) d'affinité spécifique pour la détection et la détermination d'un ou plusieurs élément(s).
Toutes ces techniques ont la caractéristique d'utiliser un réactif fixé sur un support et un réactif de révélation libre. Selon la nature du test, le réactif fixé sur le support peut être un anticorps, un antigène ou toute substance membre d'un couple d'affinité spécifique. De même pour le réactif de révélation, qui présente de plus la particularité de ne pas être fixé à un support mais d'être composé au moins en partie d'une molécule indicatrice ou pouvant donné lieu à une réaction indicatrice. Les marqueurs les plus couramment utilisés sont les colorants, les substances radioactives, les enzymes, les colloïdes d'or et les billes de latex.
De nombreuses formes de supports solides sur lequel un des membres d'un couple d'affinité est fixé, ont été décrits. Actuellement, les supports les plus courants pour les RIAs et les ELISAs sont des tubes, plaques ou billes de polystyrène. Mais des filtres de papier, du verre et diverses matières plastiques ont été utilisé pendant longtemps. Les essais radioimmunologiques (RIAs) et enzymatiques (ELISAs) sont connus et utilisés dans le monde entier. Plus récemment développés, les tests immunochromatographiques ont pris et continuent à prendre une place de plus en plus importante dans le domaine du diagnostic. Ces tests utilisent principalement des membranes de diverses natures et compositions comme support solide.
Le développement de marqueurs non radioactifs et non enzymatiques ont facilité l'usage des procédures immunologiques de diagnostic en dehors des laboratoires spécialisés, jusqu'au cabinet du médecin et même au domicile des patients. Ces procédures doivent être rapides et simples, apportant presque instantanément une aide au diagnostic. Le développement de tels tests s'est donc concentré, outre la nécessité d'une sensibilité et d'une spécificité appropriées, sur l'amélioration de trois caractéristiques principales: la rapidité, la stabilité (à température ambiante), et la facilité d'emploi et de lecture des résultats. Cependant, il est parfois utile ou nécessaire d'avoir un résultat quantitatif pour la précision d'un diagnostic ou le suivi d'une thérapie. La seule avancée connue dans ce sens est l'apparition d'appareils de lecture par réflectométrie. Mais on perd alors deux caractéristiques intéressantes de ces tests: la simplicité, mais surtout l'absence d'instrumentation nécessaire pour la réalisation du test. De plus, le problème du choix d'une référence ou d'une courbe d'étalon permettant d'établir la corrélation entre l'intensité de coloration d'un résultat et une ou des valeurs reste posé. Dans Immunochemistry - Practical applications in pathology and biology (eds Polak J.M et Van Noorden S., 1986), il est décrit la préparation et l'utilisation d'or comme marqueur coloré. L'absorption d'une substance réactive sur des colloïdes d'or est décrite par Geoghegan W. et Ackerman G. dans J. Histochem. Cytochem. (1977), 25, 1187. L'utilisation des colloïdes d'or pour la visualisation de réactions antigène - anticorps dans des analyses utilisant le dépôt de réactifs immunologiques sur des membranes est décrit par Moeremans M. et coll. dans J. Immunol. Meth.(1984), 74, 353.
Les méthodes d'analyse immunochromatographique utilisent un support d'immunochromatographie à travers lequel va diffuser l'échantillon, soit de manière latérale et on parle de migration, soit de façon transversale et on parle alors de filtration. Dans le cas des tests d'immunochromatographie par migration, les colloïdes d'or et les billes de latex sont généralement utilisés pour la révélation optique (colorée) du
résultat, en tant que composants du réactif de révélation ou de coloration. Mais sont également utilisées des enzymes dont la réaction avec un substrat produit directement ou indirectement une coloration associée à un produit coloré insoluble. Selon la technique sandwich qui utilisent deux ligands de la molécule recherchée, un des ligands est fixé et l'autre couplé avec un indicateur permettant la visualisation du résultat, par coloration directe lorsqu'il s'agit d'une substance colorée ou par l'apparition d'une coloration après une réaction enzymologique lorsqu'il s'agit d'une enzyme. Selon la technique de compétition, un seul ligand est utilisé ainsi que la substance recherchée ou son analogue; le ligand est alors fixé ou libre et couplé avec l'indicateur coloré ou enzymatique, la substance recherchée ou son analogue étant inversement fixé ou couplé. L'immunochromatographie a fait l'objet de nombreux dépôts de brevets dont EP 0 306 772 et EP 0 262 328 d'Abbott (marque déposée), EP 0 286 371 et EP 0 183 442 de Syntex (marque déposée), EP 0 276 152 de Synbiotics Corporation (marque déposée), EP 0 296 724 de Quidel (marque déposée) et WO 88/00322 dTJnilever (marque déposée). On peut également cité les brevets US n° 4. 366.241 de Tom et al., US n° 4.632.901 de Valkirs et al., US n° 4.522.923 de Deutsch A. et Platt H.A., WO 8606488 de Barnett B., EP 0 022 669 de Graham H.A. et coll., US n°4. 094.647, 4. 235.601 et 4. 361.537 de Deutsch M.E. et Mead L.W., FR 2537724 de Friedenberg R.M., EP 0206779 de Lipp V. et Buck R.L., EP 0189925 de Deutsch A. et coll., WO 84/02397 de Friedenberg, US n° 3. 893.808 de Campbell, et US n°3.895.914 d'Alberty et coll.
L'immunochromatographie sur bandelette contenant un conjugué immunoréactif particulaire est décrit dans le brevet Rosenstein EP 284 232 de Becton Dickinson (marque déposée). L'immunochromatographe (bandelette) sous étui plastique à deux fenêtres: puits échantillon et fenêtre de lecture, est décrit dans le brevet EP 291 194 dTJnilever (marque déposée).
D'autres brevets concernent le réactif de révélation utilisé, comme les brevets Leuvering d'Akzona EP 7654 (US 4 313 734), EP 398 913 (WO
89/06801) de Nycomed (marque déposée), EP 0 250 137 et 0 258 963 d'Ortho Diagnostic System (marque déposée), EP 0 158 746 et 0 293 947 de Janssen Pharmaceutica (marque déposée), et EP 0 310 872 dΗygeia Sciences, pour l'utilisation de colloïdes d'or, les brevets pour l'utilisation de billes de latex étant également nombreux (US N°4.434.150, N°31.712, N° 4.478.914, N° 4.141.965, N° 4.210.622, N°4.331.649, N° 4.582.810). On peut aussi citer les brevets US N°4.803.154, N°4.446.232, N°4.752.572 pour la révélation enzymatique et l'utilisation d'un ligand couplé à une enzyme. Ces brevets concernent des dispositifs, méthodes et applications permettant de procéder à la détection d'un élément, et donc conduisant à l'obtention d'un résultat uniquement qualitatif, indiquant la présence ou l'absence dudit élément dans un échantillon. Ces méthodes immunochromatographiques sont principalement utilisées dans des tests unitaires permettant l'analyse rapide d'un seul échantillon. Ces tests présentent le résultat de l'analyse sous la forme d'un spot ou d'une ligne visible ou invisible selon le résultat après un temps généralement inférieur à 20 minutes. La validité du résultat est généralement assurée par un contrôle de fonctionnement interne. Ces tests sont composés de 3 parties distinctes:
1. Une première zone réactive, appelée réservoir, composée d'une membrane prévue pour recevoir un échantillon de fluide à tester et contenant une moitié de paire d'affinité spécifique du ligand recherché et couplée à un réactif permettant la mise en évidence de la présence du ligand recherché. Cette membrane est composée d'un matériau pouvant jouer le rôle de contenant (par exemple cellulose ou dérivés de cellulose, nylon, polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité par exemple, fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples) et présentant avec ou sans traitement des propriétés de faible adsorption des molécules biologiques.
2. Une deuxième zone réactive, appelée support de la réaction, composée d'une membrane activée présentant des propriétés d'adsorption sélective
de molécules (par exemple par interactions ioniques, par interactions hydrophobes, par affinité, par immunoaffinité) et des propriétés de migration et de capillarité permettant à l'échantillon à tester de se déplacer et ainsi d'entraîner l'élément à doser à travers les zones réactives. Cette membrane peut ou non être composée de deux parties distinctes et contiguës ayant ou non les propriétés énoncées ci-dessus. Cette membrane peut être composé d'un ou plusieurs matériaux présentant les propriétés énoncées ci-dessus (par exemple cellulose ou dérivés de cellulose, nylon, polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité par exemple, fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples).
3. Une troisième partie, appelée absorbant, dont le rôle est de provoquer et/ ou de favoriser le flux à travers les deux parties précédentes. Cet élément peut être composé d'un matériau ayant des propriétés hygroscopiques (par exemple ouate de cellulose ou de dérivés de cellulose, nylon, polymères fibreux ou microporeux de type polyester haute densité par exemple, fibres d'origine végétale, animale, minérale ou synthétique, sous forme de poudre, de comprimés ou de couches multiples)
Ces trois parties sont placés de façon contiguë et sans discontinuité, souvent dans un module en matière plastique laissant apparaître deux zones de la membrane réactive par l'intermédiaire d'une fenêtre: . la première zone constitue la zone test montrant le résultat de l'analyse. . la deuxième constitue la zone contrôle prouvant que le test a été réalisé dans de bonnes conditions: témoin de fonctionnement. Dans le cas des tests de séries, il est généralement fourni un ou des échantillons positifs et négatifs permettant de vérifier le bon fonctionnement des tests en fournissant simultanément une courbe de calibrage/ étalonnage ou au minimum un point de référence. Cela permet de quantifier les résultats obtenus.
Cette méthode de calibrage n'est pas utilisable pour les tests unitaires. Il n'est en effet pas envisageable d'utiliser un test pour l'établissement d'un
référentiel pour chaque test d'analyse, dont un des intérêts est d'être pratiqué de façon unitaire.
Ces tests unitaires ont donc la particularité de présenter un contrôle de fonctionnement interne. Sur le même test, on obtient le résultat de l'analyse et le résultat du contrôle de fonctionnement. Ces résultats, de nature qualitative et à lecture le plus souvent visuelle, se présentent sous forme de lignes, points ou caractères colorés, par exemple de couleur rouge pour les tests utilisant l'or colloïdal. Généralement ces tests utilisent la capture directe du réactif de révélation (complexe composé d'une substance affine et d'un indicateur coloré ou d'une enzyme) pour le contrôle du fonctionnement du test. Dans le but d'assurer l'utilisateur du fonctionnement correct du test, le signal est généralement prévu pour avoir une intensité maximale, et donc une visibilité optimale. Certains producteurs de tels tests unitaires ont tenté de fournir sans succès des gammes étalon ou des abaques d'intensité de couleur afin de quantifier les résultats obtenus. L'utilisation de tels abaques se heurte à la difficulté d'une part de son établissement dans des conditions données, mais surtout à la variabilité des conditions opératoires et des échantillons. En effet, les réactions immunologiques de part leur nature varient en fonction des conditions opératoires (température, dépôt de l'échantillon, etc.), mais surtout de la nature et qualité de l'échantillon (pH, viscosité, présence de substances plus ou moins interférentes, inhibitrices ou accélératrices de réactions d'affinité, etc.). Or la réaction du contrôle de fonctionnement étant de même nature que celle de l'analyse, elle est donc affectée de manière analogue par ces variables.
Il s'agit ici de la description d'un procédé de mise au point et de production d'un dispositif de test utilisant un témoin de calibrage qui peut être le contrôle de fonctionnement ou la détection d'un élément autre que l'analyte recherché pour l'établissement d'un indicateur d'intensité ou de coloration ou élément d'abaque.
Par référence à l'intensité de coloration du signal du témoin de calibrage, on peut définir trois niveaux d'intensité de coloration du signal du résultat correspondant à trois domaines de valeurs positives du résultat d'analyse: supérieures à, équivalentes ou voisines de, et inférieures à une valeur ou plage de valeurs choisie. La méthode du choix de l'intensité de coloration du signal du témoin de calibrage servant de référence est incluse dans la présente invention, ainsi que la détermination des conditions de production permettant d'obtenir cette intensité de référence. L'utilisation d'un indicateur interne pour le calibrage assure la validité de la correspondance. En effet, l'indicateur étant interne et faisant intervenir une réaction d'affinité, donc de même nature que la détection de l'analyte recherché, il est influencé de façon identique au résultat par le mode opératoire, la qualité de la pratique opératoire, la qualité du lot de production, la nature de l'échantillon et ses caractéristiques, les conditions de lecture ainsi que les caractéristiques de vision de l'opérateur ou du lecteur.
Le taux de référence correspondant à l'intensité de coloration de référence indiquée par la coloration du témoin de calibrage est déterminé en fonction des caractéristiques désirées et nécessaires du test et des valeurs de l'élément recherché. Il en va de même lorsque plusieurs intensités de référence sont indiquées par plusieurs témoins de fonctionnement. Par contre, et surtout lorsque la lecture est effectuée visuellement, l'étendue de la plage de valeurs correspondant à l'intensité de coloration de référence doit être déterminée expérimentalement selon la procédure décrite dans la présente invention et est dépendante de la nature du test, des réactifs le composants, en particulier le réactif de révélation, et des paramètres de production du test concerné. Cette remarque est bien sûr également valable pour chaque intensité de référence lorsqu'il y en a plusieurs.
Dans une première version, le dispositif de test obtenu selon la présente invention comprend un témoin de fonctionnement donnant une intensité
A de coloration lors de la réalisation de l'analyse. Cette même intensité A observée pour la coloration du signal du résultat (signal obtenu dans la zone test) indique que l'élément recherché est présent dans l'échantillon à un taux de x +- y ng/ml, ou encore indique que l'élément recherché est présent dans échantillon à un taux compris entre η et p ng/ml. Lorsque l'intensité du signal coloré du résultat est supérieure, on peut affirmer que l'élément recherché est présent dans l'échantillon à un taux supérieur à p ng/ml. Lorsque l'intensité du signal coloré du résultat est inférieur, on peut affirmer que le taux dans l'échantillon de l'élément recherché est inférieur à η ng/ml.
Dans une seconde version, le dispositif de test obtenu selon la présente invention comprend deux témoins de fonctionnement donnant deux intensités différentes, A et B, de coloration pour chaque témoin de fonctionnement lors de la réalisation de l'analyse. Arbitrairement et pour la compréhension de cette version, l'intensité B est dite supérieure à l'intensité A.
Si la coloration du signal du résultat présente une intensité égale ou voisine de A, le taux dans l'échantillon de l'élément recherché est compris entre χ et φ ng/ml. Lorsque que le signal coloré du résultat présente une intensité voisine de B, le taux de l'élément recherché est compris entre o et θ ng/ml. Lorsque le signal coloré du résultat présente une intensité inférieure à A, le taux de l'élément est inférieur à χ ng/ml. Lorsque la coloration du signal du résultat présente une intensité comprise entre les intensités A et B, le taux de l'élément recherché est compris entre φ et o.
Lorsque le signal coloré du résultat présente une intensité supérieure à B, le taux de l'élément est supérieur à θ. On a ainsi défini 5 plages de valeurs de résultats auxquelles correspondent des intensités de coloration du signal du résultat. Ce qui donne le tableau d'interprétation des résultats présenté dans la figure 1 de la planche 1.
Dans des versions dérivées de celle-ci, le nombre de témoins de fonctionnement présentant des intensités de coloration du signal différentes peut être augmenté dans la mesure du souhaitable ou du nécessaire et dans les limites du possible tant dans la réalisation que dans la possibilité de lecture différentielle.
Dans une autre version applicable principalement aux tests utilisant l'immunochromatographie latérale et dont la zone de résultat est en amont du ou des témoins de fonctionnement par rapport au sens de migration, le réactif de révélation n'est pas présent en large excès, mais en quantité juste suffisante pour donner une faible intensité de coloration du témoin de fonctionnement en présence de taux très élevés de l'élément recherché dans l'échantillon, c'est à dire avec une intensité maximale de coloration du signal du résultat. Cette disposition entraîne un système de compétition pour le réactif de révélation entre les zones test et contrôle.
On aura alors une variation inverse des intensités de coloration des signaux de la ou des zones de résultat et des signaux du ou des témoins de fonctionnement. Cette version a l'avantage d'augmenter la variation du rapport des intensités de coloration des signaux résultat(s)/témoin(s), ce qui conduit à une facilitation de la lecture et de l'interprétation des résultats. En effet, en présence de faibles quantités d'élément recherché, l'intensité du signal du résultat sera faible et celui du témoin sera forte. Il sera alors d'autant plus visible et évident que l'intensité du résultat est inférieure au témoin.
En présence de quantités intermédiaires de l'élément recherché, les deux intensités seront identiques.
En présence de quantités élevées de l'élément, non seulement l'intensité du résultat sera élevée mais celle du témoin de fonctionnement sera diminuée d'autant.
Cette version a non seulement pour effet de faciliter la lecture comparative et donc l'interprétation, mais également de réduire l'étendue
de la plage de valeurs où l'intensité des signaux résultat et témoin est identique.
Dans une autre version qui peut d'ailleurs être couplée à l'une des versions précédentes, une substance non marquée et pour laquelle le ligand fixé du réactif de révélation utilisé pour le témoin de fonctionnement présente une affinité, est incorporée au dispositif de test. On aura alors au niveau du témoin de fonctionnement, une réaction de compétition entre le réactif de révélation et cette substance non révélatrice. Ce qui permet de diminuer et fixer à une intensité voulue la coloration dudit témoin de fonctionnement.
Le procédé préconisé pour obtenir un témoin de fonctionnement présentant une intensité de coloration déterminée lors de la réalisation de l'essai ou analyse est la suivante: Tous les autres paramètres du test sont optimisés et fixés en fonction des caractéristiques souhaitées du test. En particulier, les paramètres concernant le réactif de révélation d'une part, et ceux concernant la zone test auront été définitivement établis auparavant, étant entendu que le réactif de révélation est en large excès. Lors d'études antérieures et par analyse des données scientifiques disponibles, les taux critiques de l'élément recherché, correspondant à des seuils d'interprétation de résultats quantitatifs ont été déterminés. Par exemple et de façon non limitative, il est fréquent de pouvoir distinguer trois domaines de valeurs correspondant à trois types d'indication: valeurs faibles, valeurs moyennes, valeurs élevés correspondant respectivement à une suspicion de pathologie, à une pathologie confirmée et enfin à une pathologie aiguë. C'est la moyenne des valeurs moyennes qui est utilisée comme valeur ou taux de référence. Il est également possible dans certains cas d'utiliser la médiane des valeurs moyennes. On détermine alors l'intensité désirée pour le témoin de calibrage en procédant au test avec une gamme d'échantillons présentant divers taux de l'élément recherché, dont la valeur de référence précédemment
définie.. Celle-ci va alors donner une coloration du signal du résultat dont l'intensité sera appelée intensité de référence.
On déterminera ainsi la correspondance entre l'intensité de référence et une valeur de référence ou plage de valeurs et d'autre part on s'assurera que cette intensité est bien située dans un domaine de variation d'intensité du signal coloré du résultat en fonction du taux de l'élément recherché présent dans l'échantillon, c'est à dire que l'on observe bien une intensité moindre pour un taux moindre et une intensité supérieure pour un taux supérieur. Les caractéristiques du dépôt de la zone de contrôle de fonctionnement seront alors déterminées lors d'essais faisant varier la concentration du ligand fixé capturant le réactif de révélation, jusqu'à l'obtention de l'intensité de référence. Ces essais seront conduits d'une part avec des échantillons contenant l'élément recherché au taux de référence produisant l'intensité de référence pour la coloration du signal du résultat (zone test), ce qui permet la comparaison directe et d'autre part avec des échantillons négatifs ne contenant pas l'élément recherché et des échantillons fortement positifs afin de s'assurer que le contrôle de fonctionnement est bien opérationnel dans tous les cas. Lorsque plusieurs témoins de référence ou calibrage sont souhaités, on procédera de même en ajustant les divers témoins de fonctionnement un par un, et en commençant par le témoin de fonctionnement devant présenter la plus faible intensité de signal coloré, ou plus faible intensité de référence, et en le plaçant de préférence en amont du ou des autres témoins de fonctionnement dans le cas de test utilisant immunochromatographie latérale.
Il est nécessaire de préciser qu'il est important de respecter une certaine régularité et symétrie pour obtenir une concordance suffisante entre l'interprétation visuelle des résultats et les taux effectifs des échantillons. En particulier, il est préférable de définir les domaines d'intensité de résultats selon la règle suivante:
Si le seuil de détection du dispositif d'analyse est le taux X, le taux de référence étant nX, la limite entre le domaine de taux faibles et celui de taux moyens doit être défini comme (n+l)X/2. La limite supérieure du domaine de taux moyens est alors au maximum de (n+(n- l)/2)X afin de respecter la symétrie du domaine de valeurs moyennes, mais il est possible d'abaisser cette limite en limitant la quantité de réactif de révélation du dispositif de façon à entraîner un phénomène de compétition entre le résultat et le témoin de fonctionnement pour des taux élevés d'analyte. Lorsque le nombre de domaines de valeurs positives est supérieur à trois, la limite entre deux domaines se suivant est définie comme étant la moyenne des taux de référence des deux domaines. Par exemple, si le taux de référence d'un domaine est Y et celui du domaine immédiatement supérieur ou inférieur est Z, la limite entre ces domaines est (Y+Z)/2.
Une seconde méthode est utilisable pour obtenir l'intensité de coloration de référence pour le témoin de fonctionnement:
Au lieu et place, ou en complément, de la modification des caractéristiques de dépôt du ligand capturant le réactif de révélation, une substance non révélatrice car sans coloration, et compétitive pour ce ligand est incorporé au dispositif. On détermine alors la quantité de cette substance nécessaire pour obtenir l'intensité désirée de coloration du témoin de fonctionnement. Cette substance est choisie pour son absence d'interférence avec l'analyte recherché, en particulier pour sa détection. Dans une autre version de la présente invention, l'intensité de référence n'est pas donnée par un témoin de fonctionnement mais par la détection d'un autre élément (dit de référence) présent dans l'échantillon. Des études antérieures ayant défini le taux de référence, sa détection est alors optimisée pour donner une intensité de coloration avec ce taux de référence égale à l'intensité de référence pour la détection de l'analyte recherché. Il est alors possible de procéder à une interprétation des résultats selon les ratios des taux de l'analyte recherché et de l'élément de référence. L'obtention d'un tel dispositif peut être utile par exemple et
de façon non exhaustive dans le cas de l'antigène spécifique de la prostate, l'élément de référence étant l'alpha-chymotrypsine, ou dans le cas d'infection virale tel le virus d'immunodéficience humaine pour suivre le taux d'anticorps spécifiques d'un antigène viral en référence avec le ou les taux d'anticorps spécifiques d'un ou plusieurs autres antigènes viraux ou non.
La lecture peut être également effectuée par une machine ou à l'aide d'un outil ou instrument. Cet appareil de lecture utilise alors l'intensité de coloration du signal du témoin de fonctionnement comme référence pour la lecture et l'interprétation du signal du résultat de la détection de l'élément ou des éléments recherchés. L'utilisation d'un tel instrument de lecture permet de limiter la correspondance de l'intensité de référence à une valeur relativement précise de l'élément recherché. La procédure de détermination du taux de référence et donc de l'intensité de référence est décrite dans la présente invention. De même, lorsque plusieurs intensités de référence sont indiquées par plusieurs témoins de fonctionnement, chaque intensité peut être mise en correspondance avec une valeur numérique de l'élément recherché. On peut obtenir alors une interprétation beaucoup plus précise des résultats, en affectant à toute intensité, une valeur numérique. Cette valeur peut être calculée selon la formule suivante: Ve = Vr x Ie/Ir Ve = Valeur de l'élément recherché dans l'échantillon Vr = Valeur de l'élément recherché donnant l'intensité de référence Ir de coloration du signal du résultat. Ir = Intensité de coloration de référence = Intensité de coloration du témoin de fonctionnement, lue lors de la réalisation de l'essai, le = Intensité de coloration observée pour le signal du résultat. De même, lorsque plusieurs témoins de fonctionnement indiquent plusieurs intensités de coloration de référence, il est possible de tracer une courbe étalon, permettant d'établir la correspondance entre toute intensité de coloration du signal de résultat observée et la valeur ou le taux de l'élément recherché.
Par exemple, dans le cas où deux témoins internes de fonctionnement donnent deux intensités de référence de coloration Irl et Ir2, correspondant à deux valeurs Vrl et Vr2 de l'élément recherché produisant chaque intensité correspondante pour la coloration du signal du résultat, on obtiendra la courbe étalon suivante permettant d'affecter une valeur Ve à une intensité observée le de coloration du signal du résultat. Un modèle de courbe étalon est décrit dans la figure 2 de la planche 1 , dont voici la légende: Vrl = Valeur de l'élément recherché donnant l'intensité de référence Irl de coloration du signal du résultat.
Vr2 = Valeur de l'élément recherché donnant l'intensité de référence Ir2 de coloration du signal du résultat.
Irl = Intensité de coloration de référence N° l = Intensité de coloration du témoin de fonctionnement N°l, lue lors de la réalisation de l'essai. Ir2 = Intensité de coloration de référence N°2 = Intensité de coloration du témoin de fonctionnement N°2, lue lors de la réalisation de l'essai, le = Intensité de coloration observée pour le signal du résultat. Ve = Valeur de l'élément recherché dans l'échantillon
Dans une autre version, qui peut être complémentaire d'une quelconque des versions précédentes, une variation de couleur soit du résultat, soit du témoin de calibrage, soit des deux est utilisée pour définir différents domaines de résultats.
Par exemple, le témoin de calibrage qui peut être le témoin de fonctionnement capture deux molécules colorés ou couplées avec un agent coloré, dont l'une est le réactif de révélation de l'analyte recherché. Le ligand fixé du témoin de calibrage présente une affinité pour deux éléments mobiles colorés dont l'un présente une affinité pour l'analyte recherché, dans une réaction sandwich, ou un ligand fixé de l'analyte recherché, pour une analyse par compétition. Les deux agents colorés possédant deux couleurs différentes, leur capture différentielle donnera des couleurs finales différentes. La lecture est alors de nature spectrographique ou colorimétrique avec ou sans comparaison entre le résultat et le témoin de calibrage.
Dans une analyse en réaction sandwich, lorsque le réactif de révélation est rouge, en présence d'une quantité égale d'un second élément de couleur bleu, la capture équimolaire de ces deux agents colorés donnera une coloration marron du témoin de calibrage. En présence de l'analyte recherché, des complexes analyte-réactif de coloration se formeront et seront capturés dans la zone de détection de l'analyte par un ligand spécifique de l'analyte. Le ligand du témoin de calibrage capturera des quantités différentes des agents colorés puisqu'une partie d'un deux agents colorés, le réactif de révélation aura été capturé dans la zone de détection de l'analyte. Plus l'analyte recherché sera présent dans l'échantillon en quantité importante, plus la quantité de réactif de révélation capturé dans la zone de détection sera grande, plus faible sera la quantité de ce même réactif capturé dans la zone de calibrage, et plus la couleur du témoin de calibrage se rapprochera d'un bleu pur. Dans une analyse de type compétition, l'évolution de la coloration sera inverse de celle précédemment décrite.
Il est également possible en adaptant le taux respectif des différents agents colorés d'obtenir une coloration à prédominante rouge en l'absence ou en présence dans l'échantillon de faible quantité de l'analyte recherché, une coloration marron pour un taux de référence et une coloration bleu en présence de quantités élevées de l'analyte. Différentes couleurs et différentes quantités respectives d'agents colorés, ainsi que différents nombres de ces agents, peuvent être utilisés. Le témoin de calibrage peut être composé d'un seul ligand fixé possédant une affinité égale ou différente pour chacun des agents colorés ou être composé de plusieurs ligands présentant chacun une affinité pour un ou plusieurs des agents colorés.
Une autre variation de cette version consiste dans l'utilisation d'un réactif de révélation composé de différents ligands de l'analyte recherché, chacun présentant une couleur différente ou chacun couplé avec une molécule de couleur différente. Si ces différents ligands présentent des différences d'affinité pour l'analyte recherché différentes et ne sont pas présents en excès, en présence de faible quantité de cet analyte, le ligand
présentant la plus forte affinité donnera sa couleur au résultat. En présence de quantités importantes de l'analyte recherché, la couleur du résultat de détection de l'analyte sera la résultante des différentes couleurs des différents ligands de l'analyte. Une autre variation de cette version consiste dans une coloration de la zone de détection de l'analyte ou du témoin de calibrage préalable à la réalisation de l'analyse. Cette coloration peut être indépendante des ligands fixés ou les ligands fixés peuvent être couplés avec une molécule coloré. Le ou les réactifs mobiles de révélation sont alors d'une autre couleur et leur capture qui est fonction de la présence de l'analyte recherché, soit dans la zone de détection soit dans la zone de calibrage modifie la coloration préexistante.
Voici des exemples d'application de l'invention auxquels cette dernière ne se limite en aucune façon. Exemple 1: Cet exemple concerne un test rapide d'immunochromatographie latérale de détection des IgE totales dans du sérum humain, selon la méthode sandwich.
Le réactif de révélation est un anticorps spécifique des IgE humaines couplé avec de l'or colloïdal. Dans la zone test (du résultat de l'analyse), est fixé un anticorps spécifique des IgE humaines.
Dans la zone de contrôle, témoin de fonctionnement, est fixé un anticorps présentant une affinité pour l'anticorps de révélation couplé à l'or colloïdal. Concernant le taux des IgE totales dans le séru , on peut distinguer les domaines de valeurs suivants:
Les valeurs inférieures à 100 kUI/1 ne sont pas pathologiques.
Les valeurs comprises entre 100 et 400 kUI/1 peuvent être ou non pathologiques. Les valeurs comprises entre 400 et 1000 kUI/1 sont pathologiques, indicatrices soit d'atopie, soit de pathologies en développement, soit de parasitoses.
Les valeurs supérieures à 1000 kUI/1 sont pathologiques et indiquent une certaine gravité, soit d'allergie, soit d'autres pathologies. La moyenne des valeurs moyennes est de 700 kUI/1 soit (400+ 1000)/2. Il s'agit là du taux de référence. L'intensité de coloration du résultat pour un taux dlgE d'environ 700 kUI/1 a donc été choisie comme intensité de référence. Il a été confirmé que des taux plus faibles (inférieurs à 400 kUI/1) et plus élevés (supérieurs à 1000 kUI/1) donnaient bien des intensités de coloration que l'on peut aisément distinguer de celle choisie comme référence. Tous les autres paramètres du test ayant été auparavant définis, il a été procédé à divers dépôts avec diverses concentration de l'anticorps présentant une affinité pour l'anticorps de révélation couplé à l'or colloïdal et qui est fixé dans la zone de contrôle. Il a été ainsi déterminé la concentration de dépôt qui permettait d'obtenir une intensité de coloration du témoin de fonctionnement équivalente à celle obtenue pour le signal de résultat de détection dlgE au taux de 700 kUI/1 dans un échantillon de sérum. La quantité du réactif de révélation a alors été ajustée, diminuée, pour obtenir une intensité de coloration du témoin de fonctionnement inférieure à celle du résultat lorsque le taux dlgE totales dans l'échantillon était égal ou légèrement supérieur à 1000 kUI/1.
On a ainsi obtenu un test dont l'interprétation des résultats est la suivante:
• lorsqu'aucun signal n'est détecté dans la zone du résultat ou zone test, le taux dlgE totales est inférieur à 100 kUI/1. • lorsque le signal du résultat a une intensité de coloration inférieure à celle du témoin de fonctionnement, le taux dlgE totales est compris entre 100 et 400 kUI/1,
• lorsque le signal de résultat a une intensité voisine de celle du témoin de fonctionnement, le taux dlgE est compris entre 400 et 1000 kUI/1, • lorsque le signal de résultat a une intensité de coloration supérieure à celle du témoin, le taux dlgE est supérieur à 1000 kUI/1, Ce dispositif a pu être ainsi validé sur un échantillon de sérums tout venant, avec l'obtention d'une concordance satisfaisante entre
l'interprétation des résultats (lecture) et les valeurs des taux d'IgE déterminées par une méthode quantitative reconnue.
Exemple 2:
Les analytes recherchés sont des immunoglobulines humaines de type G spécifiques de l'antigène spécifique de Chlamydia trachomatis.
Les échantillons sont des sérums humains.
Le réactif de révélation est composé de deux ligands couplés à des substances de couleurs différentes. Le premier est un anticorps polyclonal murin qui présente une affinité pour les immunoglobulines humaines de type G. Il est couplé avec des billes de latex de couleur rouge. Le deuxième ligand, une immunoglobuline de souris, ne présente pas d'affinité pour l'antigène spécifique de Chlamydia, est couplé avec des billes de latex de couleur bleue. Ce deuxième ligand est présent dans le dispositif de test en quantité très inférieure au premier ligand. La zone de détection comprend l'antigène spécifique de Chlamydia fixé sur le support, et le témoin de fonctionnement qui est également le témoin de calibrage comprend un ligand spécifique des immunoglobulines de souris.
Lorsque l'analyse a été réalisée, la zone de résultat présente une coloration rouge dont l'intensité dépend de la quantité d'analyte recherché.
Le témoin de calibrage présente une coloration variable selon la quantité d'analyte recherché dans l'échantillon analysé.
Lorsque l'échantillon contient peu ou pas d'analyte, titre d'anticorps inférieur à 100, le témoin de calibrage est de couleur rouge.
Lorsque l'échantillon contient le taux de référence d'analyte, correspondant à un titre compris entre 100 et 1000, le témoin de calibrage est marron.
Lorsque l'échantillon contient un taux élevé d'analyte, correspondant à un titre supérieur à 1000, le témoin de calibrage est bleu.
Exemple 3:
Les analytes recherchés sont des immunoglobulines humaines de type G spécifiques de l'antigène spécifique de Chlamydia trachomatis.
Les échantillons sont des sérums humains.
Le réactif de révélation est composé d'un anticorps polyclonal murin qui présente une affinité pour les immunoglobulines humaines de type G. Il est couplé avec des billes d'or colloïdal de couleur rouge. La zone de détection comprend l'antigène spécifique de Chlamydia fixé sur le support. Une proportion de cet antigène est couplée avec des billes de latex de couleur bleue.
Le témoin de fonctionnement qui est également le témoin de calibrage comprend un ligand spécifique des immunoglobulines de souris, dont une proportion est couplée avec des billes de latex de couleur bleue.
Lorsque l'échantillon ne contient pas ou ne contient que très peu d'analyte, la zone de résultat reste de couleur bleue.
Lorsque l'échantillon contient un taux d'analytes correspondant à un titre compris entre 100 et 1000, le résultat est de couleur marron. Lorsque le titre d'analytes présent dans l'échantillon est supérieur à 1000, le résultat est de couleur rouge.
La couleur du témoin de calibrage varie en proportion inverse du résultat. Il est rouge pour des titres faibles, marron pour le titre de référence, et bleu pour des titres élevés. Le procédé décrit dans la présente invention est applicable à tout test utilisant une réaction affine, comprenant un contrôle de fonctionnement interne, et caractérisé par la présence d'un réactif fixé sur un support, qui peut être de façon non limitative une membrane, et l'utilisation d'un réactif de révélation. Ce réactif de révélation peut comprendre des composants particulaires donnant une coloration ou des molécules réactives, par exemple et de façon non limitative, des enzymes, dont la réaction permet d'obtenir une coloration, ou une absence de coloration, indicatrice de la nature du résultat. L'élément recherché par le dispositif de test peut-être de nature biologique, un anticorps ou un antigène, de nature chimique ou biochimique.
La présente invention est applicable pour des dispositifs de test destinés à la détection de tout marqueur biologique d'une ou de plusieurs
pathologies infectieuses, par exemple et de façon non exhaustive les tests de sérologie, et les tests de détection d'antigène.
La présente invention est également applicable lorsque l'élément recherché est un seul type d'anticorps ou plusieurs types, classes ou sous-classes. Un exemple précis auquel les revendications du présent brevet ne se limite en aucune façon est la sérologie Chlamydia, et pour lequel cette invention permet d'obtenir un dispositif de détermination ou évaluation du taux d'anticorps anti-chlamydia présent dans le sérum ou des échantillons d'autre nature de patients. Cette invention est également applicable lorsque l'élément recherché est un ou plusieurs antigènes spécifiques d'une ou de plusieurs pathologies.
Elle est aussi applicable dans le cadre de suivi thérapeutique.
Le dispositif de test obtenu selon cette invention peut être utiliser soit avec une lecture visuelle, effectuée par un opérateur humain, soit avec un appareil de lecture couplé ou non à un appareil de traitement de données.