WO2006067847A1 - フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 - Google Patents

フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製方法 Download PDF

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WO2006067847A1
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antibody
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Masayuki Tsuchiya
Shigeyuki Iijima
Izumi Sugo
Yasuo Sekimori
Kiyoshi Habu
Masamichi Sugimoto
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Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a recombinant protein, particularly an antibody, using a cell in which the function of a fucose transporter is inhibited.
  • An antibody can exert an antitumor effect by ADCC (antibody dependent cytotoxicity) activity or CDC (complement dependent cytotoxicity) activity. It is known that an antibody is a glycoprotein to which a sugar chain is bound, and the strength of the cytotoxic activity of the antibody can vary depending on the type and amount of the sugar chain bound to the antibody. In particular, it has been reported that the amount of fucose bound to an antibody is strongly related to the strength of cytotoxic activity (see Non-Patent Document 1). Furthermore, in order to obtain an antibody with enhanced cytotoxic activity, a recombinant antibody that does not contain fucose is engineered so as not to express an enzyme that catalyzes the binding of fucose to a sugar chain during antibody production. There has been a report on a method for producing the film (see Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 1 Shields et al., J Biol Chem., 277 (30), 26733-26740, 2002
  • Patent Document 1 International Publication No. WO00 / 61739
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a recombinant protein in which fucose binding is lost or reduced easily and reliably.
  • an object of the present invention is to provide a method for producing an antibody in which fucose binding is lost or reduced and cytotoxic activity is enhanced.
  • Another object of the present invention is to provide a host cell for producing such a protein. Means for solving the problem
  • the present inventors By disrupting both fucose transporter genes on the chromosome, the present inventors inhibit uptake of fucose into the Golgi apparatus, resulting in inhibition of fucose attachment to the antibody.
  • the present invention was completed by preparing cells in which one gene of both fucose transporters on the chromosome was disrupted.
  • the present invention is as follows.
  • a method for inhibiting addition of fucose to a protein comprising artificially suppressing the expression of both fucose transporter genes on a chromosome when producing a recombinant protein using cells.
  • the present invention provides a cell in which the expression of both fucose transporter genes on a chromosome is artificially suppressed, and when the cell is used for protein production, it does not have fucose and is recombinant. Protein can be produced.
  • the fucose-free! / ⁇ recombinant protein has reduced cytotoxic activity and is particularly advantageous for recombinant antibodies used as antibody drugs.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structures of three types of targeting vectors.
  • FIG. 2 A diagram showing the structure of bands that appear after cleavage with Bgl II after the first knockout.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of Southern plot analysis of the first-stage knockout.
  • FIG. 4 is a graph showing the homologous recombination efficiency of the second-stage knockout.
  • FIG. 5 shows the results of Southern plot analysis of a fucose transporter gene-deficient strain.
  • FIG. 6 shows the results of fucose expression analysis of a fucose transporter gene-deficient strain (wild / KO).
  • FIG. 7 shows the results of fucose expression analysis of a fucose transporter gene-deficient strain (KO / KO). BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the fucose transporter refers to a polypeptide having fucose transport activity.
  • the fucose transporter when expressed on the cell membrane, the fucose transporter is usually intracellular.
  • the fucose transporter is expressed on the Golgi membrane, the fucose is usually taken into the Golgi body.
  • a preferred fucose transporter is a Chinese nominster fucose transporter, more preferably a fucose transporter having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 shows the base sequence of the Chinese nomstar fucose transporter gene.
  • the Golgi body mainly incorporates fucose into the Golgi body via the fucose transporter present on the Golgi membrane, the function of the fucose transporter is inhibited, so that the fucose into the Golgi body. Can be inhibited, and the amount of fucose incorporated into the Golgi body can be reduced.
  • Inhibiting the function of a fucose transporter of a cell means reducing or eliminating the fucose transport activity of the fucose transporter.
  • the function of the fucose transporter in the cell may be inhibited by any method.
  • the method of inhibiting the expression of the fucose transporter is preferred.
  • fucose transporter is not particularly limited as long as the number of fucose transporters having normal transport ability is decreased, but fucose transporter using a targeting vector targeting fucose transporter, etc. It is preferable to delete (knock out) the gene coding for (fucose transporter gene).
  • cells have fucose transporter genes on both chromosomes, but cells in which the function of the fucose transporter of the present invention is inhibited are deficient in both fucose transporter genes on the chromosome. is doing.
  • the cell in which the function of the fucose transporter of the present invention is inhibited is not particularly limited as long as two fucose transporter genes on the chromosome are deleted, but the fucose transporter gene present on the chromosome is not limited. It is preferred that all are deleted. For example, if there are 3 fucose transporter genes on a chromosome, 3 fucose transporter genes Is preferred to be missing,. Whether or not all fucose transporter genes on the chromosome are deleted can be determined by using, for example, the Southern plot analysis described in the Examples or the FISH method.
  • the protein produced by the production method of the present invention may be any protein, but is usually a glycoprotein, preferably an antibody.
  • the type of antibody produced by the method of the present invention is not particularly limited, and it is possible to reduce mouse antigens, rat antibodies, rabbit antibodies, Hedge antibodies, camel antibodies, human antibodies, etc., and heteroantigenicity against humans.
  • a recombinant antibody artificially modified for the purpose such as a chimeric antibody or a humanized antibody, can be used as appropriate.
  • the recombinant antibody can be produced using a known method.
  • a chimeric antibody is an antibody that has the constant regions of a heavy chain and a light chain of a human antibody, such as a heavy chain and a light chain of a mouse antibody, and a DNA encoding the variable region of a mouse antibody.
  • a human antibody is also referred to as a reshaped human antibody, which is a non-human mammal, for example, a complementarity determining region (CDR) of a mouse antibody transplanted to the complementarity determining region of a human antibody.
  • CDR complementarity determining region
  • the general genetic recombination method is also known. Specifically, a DNA sequence designed to link the CDR of a mouse antibody and the framework region (FR) of a human antibody was prepared with several overlapping regions at the end. Oligonucleotide force is also synthesized by PCR.
  • the obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the constant region of a human antibody, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European patent application publication number EP 239400, international patent application). Publication number WO 96/02576).
  • the human antibody FR to be ligated via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a good antigen-binding site. If necessary, amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al. , Cancer Res, 1993, 53, 851-856.).
  • a method for obtaining a human antibody is also known.
  • human lymphocytes are sensitized in vitro with the desired antigen or cells expressing the desired antigen, and the sensitized lymphocytes are fused with human myeloma cells, such as U266, to the antigen. It is also possible to obtain a desired human antibody having the binding activity (see Japanese Patent Publication No. 59878).
  • a desired human antibody can be obtained by immunizing a transgenic animal having all repertoires of human antibody genes with a desired antigen (International Patent Application Publication Nos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined. If the DNA sequence of scFv that binds to the antigen is clarified, an appropriate expression vector can be prepared based on the sequence to obtain a human antibody.
  • the antibody may be a low molecular weight antibody such as an antibody fragment or a modified antibody as long as it can bind to an antigen.
  • antibody fragments include Fab, F (ab '), Fv
  • a diabody is a dimer formed by linking two fragments (for example, scFv, etc.) in which a variable region and a variable region are linked with a linker (eg, a fragment constituting Diabody). Contains two VLs and two VHs (P. Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
  • Antibodies modified with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used as modified antibodies. It is also possible to bind a cytotoxic substance such as a radioisotope, a chemotherapeutic agent, or a bacterial-derived toxin to the antibody, and a radiolabeled antibody is particularly useful. Such a modified antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. Antibody modification methods have already been established in this field.
  • PEG polyethylene glycol
  • a recombinant polypeptide can be produced by a known method known to those skilled in the art.
  • a DNA encoding a polypeptide is incorporated into an appropriate expression vector, and this is introduced into an appropriate host cell.
  • the transformant obtained is recovered, and an extract is obtained.
  • Purified and prepared by subjecting to chromatography such as gel filtration, or affinity chromatography in which an antibody against the polypeptide of the present invention is immobilized on the column, or by combining a plurality of these columns. Is possible.
  • the protein when expressed in a host cell (eg, animal cell or E. coli) as a fusion polypeptide with dartathione S-transferase protein or as a recombinant polypeptide to which a plurality of histidines are added.
  • a host cell eg, animal cell or E. coli
  • the expressed recombinant polypeptide can be purified using a daltathion column or a nickel column. After purification of the fusion polypeptide, if necessary, a region other than the target polypeptide can be cleaved with thrombin or factor Xa to remove it.
  • the protein produced by the production method of the present invention is preferably an antibody whose cytotoxic activity is affected by bound fucose.
  • An antibody gene is incorporated into an appropriate vector, which is introduced into a host, and genetic recombination is performed.
  • Methods for producing antibodies using techniques are well known to those skilled in the art (eg Carl, AK Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL
  • the present invention includes a host cell capable of producing a foreign protein, wherein the expression of both fucose transporter genes present in the chromosome is artificially suppressed.
  • exogenous protein refers to a protein not derived from the cell itself.
  • the host cell is not particularly limited.
  • a cell in which a sugar is added to the recombinant protein when the recombinant protein is expressed can be used.
  • various animal cells can be used, and CHO cells are preferable.
  • CHO cells in which the fucose transporter gene has been knocked out can be preferably used.
  • Animal cells include mammalian cells such as CH0 (J.
  • CHO cells include dhfr-CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, 4216-4220) and CHO K-1 (Proc. Natl. Acad.), which are CHO cells deficient in the DHFR gene. Sci. USA (1968) 60, 1275) can be exemplified. In animal cells, CHO cells are particularly preferred for the purpose of mass expression.
  • vectors include mammalian-derived expression vectors (eg, For example, pcDNA3 (manufactured by Invitrogen), pEGF- BOS (Nucleic Acids. Res.
  • insect cells for example, “Bac-to- BAC baculovairus expression system "(manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV, pMV, pAdexLcw), retrovirus-derived expression vectors (eg, pZIPneo), yeast-derived expression vectors (for example, “Pichia Expression Kit J (manufactured by Invitrogen), pNVll, SP-Q01), Bacillus subtilis-derived expression vectors (for example, pPL608, pKTH50), etc.
  • insect cells for example, “Bac-to- BAC baculovairus expression system "(manufactured by Gibco BRL), pBacPAK8), plant-derived expression vectors (eg, ⁇ 1, pMH2), animal virus-derived expression vectors (eg, pHSV,
  • a promoter usually required for expression in cells such as the SV40 promoter (Mulligan et al., Nature (1979) 277, 108), MMLV-LTR promoter, EF1 ⁇ promoter one (Mizushima et al., Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), CMV promoter, etc., and genes for selecting transformation into cells ( For example, it is more preferable if it has a drug (drug resistance gene that can be distinguished by neomycin, G418, etc.).
  • vectors having such characteristics include pMAM, pDR2, pBK-RSV, pBK-CMV, pOPRSV, and pOP13.
  • the gene when the gene is stably expressed and the purpose is to amplify the copy number of the gene in the cell, the DHFR gene that complements the CHO cell lacking the nucleic acid synthesis pathway is used. And a method of amplifying with methotrexate (MTX), and for the purpose of transient expression of the gene,
  • COS cells having a gene expressing SV40 T antigen on the chromosome can be used to transform with a vector having SV40 replication origin (such as pcD).
  • a replication origin such as a poliovirus, adenovirus, or ushipapilloma virus (BPV) can also be used.
  • the expression vector can be used as a selection marker for aminoglycoside transferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E.
  • the vector is introduced into the host cell by, for example, the calcium phosphate method, the DEAE dextran method, the method using the cationic ribosome DOTAP (manufactured by Boehringer Mannheim), the electoral position method, the lipofussion method, etc. Is possible.
  • the culture of the cells can be performed according to a known method.
  • DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as a culture medium for animal cells.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination, or serum-free culture may be performed.
  • FCS fetal calf serum
  • the pH during cultivation is preferably about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30-40 ° C for about 15-200 hours, with medium exchange, aeration, and agitation as necessary.
  • Examples of cells in which the expression of both fucose transporter genes on the chromosome is artificially suppressed include cells in which both of the fucose transporter genes present on the chromosome are disrupted.
  • Gene disruption refers to suppressing the expression of a gene by performing partial deletion, substitution, insertion, addition or the like on the base sequence of the gene.
  • suppression of gene expression includes the case where the gene itself is expressed but the gene encoding a protein having a normal function is not expressed.
  • a cell in which a gene encoding a fucose transporter is disrupted usually has a significant decrease in the amount of fucose present in the Golgi body as compared to the cell because the fucose transporter gene is disrupted.
  • the ability to transport fucose is reduced or lost, or the activity of fucose uptake into the Golgi apparatus in the cell is reduced or lost.
  • the amount of fucose in the Golgi body can be measured by isolating the Golgi body from cells and extracting sugar, followed by antigen-antibody reaction, sugar-lectin binding reaction, liquid chromatography, electrophoresis, and the like.
  • the fucose transport ability in the cell and the fucose uptake activity into the Golgi apparatus in the cell can be determined, for example, by using fucose labeled with a fluorescent substance or a radioisotope.
  • the gene can be disrupted, for example, by homologous recombination.
  • the homologous recombination method is a method in which only a target gene is arbitrarily modified by homologous gene recombination between a gene on a chromosome and foreign DNA, and the purpose of dividing a sequence encoding a protein is as follows. Then insert another DNA sequence into the exon of the gene.
  • a selectable marker such as a neomycin resistance gene derived from bacteria is generally used as the sequence that disrupts the gene.
  • a targeting vector may be designed and produced based on the sequence information of the fucose transporter gene described in the present specification, and the fucose transporter gene to be destroyed can be homologously recombined using the targeting vector.
  • a substitution vector has a homologous region linked to the 5 ′ and 3 ′ side of the mutation to be introduced, a marker for positive selection, a restriction enzyme site for linearizing the vector outside the homologous region, It may contain a marker for negative selection, a restriction enzyme cleavage site for mutation detection, etc., located outside the homologous region.
  • Targeting vector is Kenichi Yamamura et al., Transgenic Animal Kyoritsu Shuppan Co., Ltd. March 1, 1997, Shinichi Aizawa Gene of mutant mice using gene targeting ES cells Bio Manual Series 8 Yodosha 1995, Hogan et al.
  • the targeting vector may be either an insertion type or a substitution type.
  • Recombination can also be caused by targeting using the Cre-lox system. Targeting using the Cre-lox system can be performed, for example, according to the method described in JP-T-11-503015.
  • Homologous recombination As a method for selecting homologous recombinants that have undergone, known selection methods such as positive selection, promoter selection, negative selection, and poly A selection may be used. The identification of homologous recombinants can be carried out using either the PCR method or the Southern blotting method.
  • cells in which the fucose transporter gene of the present invention has been disrupted can be obtained by randomly introducing mutations into cells as long as both of the two pairs of fucose transporters of the chromosome are defective.
  • a gene disruption vector containing a marker is randomly introduced into the genome of a cell to screen for cells in which the fucose transporter gene is disrupted, and ENU (N-ethy (N-nitrosourea) and other chemical mutagens can be used to screen for cells in which the fucose transporter gene has been disrupted by introducing random mutations.
  • Screening of cells in which fucose transporter is no longer produced may be performed using the activity of fucose transporter as an indicator, or by transcription or expression of fucose transporter gene as an indicator by Western blotting or Northern blotting. It can also be done.
  • the cells in which the fucose transporter gene of the present invention is disrupted can also have animal power in which the fucose transporter gene is knocked out.
  • An animal in which the fucose transporter gene has been knocked out can be produced by disrupting the fucose transporter of ES cells by the above-mentioned method and using the ES cell force, for example, the method described in WO02 / 33054. Examples of animals used in this case include, but are not limited to, goats, pigs, hidges, ushis, mice, mice, musters, rats and the like.
  • the exogenous protein is an antibody
  • the two Hc Fc regions of one antibody molecule When fucose is bound to the N-glycoside-linked sugar chain bound to the sugar chain-binding site, a product is obtained. If such fucose is bound, the antibody has enhanced cytotoxic activity.
  • the present invention also includes animals (except humans) that are deficient in both of the fucose transporter genes on the chromosome. By using such an animal, a recombinant polypeptide can be produced in vivo.
  • DNA encoding a target protein is introduced into these animals, and the polypeptide is produced in the body of the animal and recovered.
  • the “host” in the present invention includes these animals. When animals are used, there are production systems using mammals and insects. Mammalian animals include goats, pigs, hidges, mice, and bushes (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • the target DNA is prepared as a fusion gene with a gene encoding a polypeptide inherently produced in milk such as goat / 3 casein.
  • the DNA fragment containing the fusion gene is then injected into a goat embryo and the embryo is transferred to a female goat.
  • the desired polypeptide can be obtained from the milk produced by the transgene goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • Hormones may be used in transgenes as appropriate to increase milk production, including polypeptides that are also produced by transgene caps (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699- 702).
  • the obtained polypeptide can be isolated in a host cell or extracellular (eg, medium), and purified as a substantially pure and homogeneous polypeptide. Separation and purification of polypeptides are not limited in any way as long as separation and purification methods used in normal polypeptide purification are used. For example, select chromatography column, filter, ultrafiltration, salting out, solvent precipitation, solvent extraction, distillation, immunoprecipitation, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, dialysis, recrystallization, etc. If combined, the polypeptide can be separated and purified. [0061] Examples of chromatography include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, reverse phase chromatography, adsorption chromatography, etc. (Strategies for Protein Purification and
  • polypeptide can be arbitrarily modified or the peptide can be partially removed by allowing an appropriate protein modifying enzyme to act before or after the polypeptide is purified.
  • protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, lysyl endobeptidase, protein kinase, darcosidase, and the like.
  • a known sequence can be used, or it can be obtained by a method known to those skilled in the art. It is. For example, it can be obtained by cloning a gene encoding a hybridoma-producing antibody that produces a monoclonal antibody, or can be obtained from an antibody library.
  • Nobridoma can be produced basically by using a known technique as follows. That is, a desired antigen or a cell expressing the desired antigen is used as a sensitizing antigen, and this is immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cell is fused with a known parent cell by a normal cell fusion method.
  • V region variable region cDNA of the antibody variable region (V region) from the obtained mRNA of the hybridoma using reverse transcriptase and ligating it with the DNA encoding the desired antibody constant region (C region).
  • C region DNA encoding the desired antibody constant region
  • Genes encoding H chains or L chains can be obtained.
  • the target full length protein, a partial peptide, etc. can be used.
  • Antigens can be prepared by methods known to those skilled in the art, for example, according to methods using baculovirus (eg, W098 / 46777).
  • Hypridoma can be prepared according to, for example, the method of Milstein et al. (Kohler, G., and Milstein, C, Methods Enzymol. 1981, 73, 3-46.).
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by a known method used in normal protein purification.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Ant3 ⁇ 4odies A Laboratory Manual. Ed (Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay can be used.
  • sugar chain structure of the protein produced using the cells of the present invention can be carried out by the two-dimensional sugar chain map method (Anal. Biochem, 171, 73, (1988), biochemical experiment method 23- Glycoprotein Glycan Research Method can be carried out by the method described in Etsuko Takahashi, Academic Publishing Center (1989) etc.
  • sugar chains can also be analyzed by mass spectrometry such as MALD TOF-MS.
  • the antibody produced by the method of the present invention is an antibody having increased cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity in the present invention refers to, for example, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • ADCC activity means cytotoxic activity by the complement system
  • ADCC activity means that when a specific antibody is attached to a cell surface antigen of a target cell, 1F ⁇ receptor-bearing cell (immune cell) Etc.) means an activity that binds via Fc ⁇ receptor and damages target cells.
  • Whether or not an antibody has ADCC activity or CDC activity can be determined by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
  • effector cells Specifically, first, effector cells, complement solutions, and target cells are prepared.
  • spleen remove the spleen from a mouse such as a CBA / N mouse and isolate the spleen cells in RPMI1640 medium (GIBCO). After washing with the same medium containing 10% urine fetal serum (FBS, manufactured by HyClone), adjust the cell concentration to 5 ⁇ 10 6 / ml to prepare effector cells.
  • FBS urine fetal serum
  • Baby Rabbit Complement (CEDARLANE) is diluted 10-fold with 10% FBS-containing medium (GIBCO) to prepare a complement solution.
  • GEBCO FBS-containing medium
  • Spleen cancer cell lines (AsPC-1, Capan-2, etc.) are cultured with 0.2mCi of 51 Cr-sodium chromate (Amersham Pharmacia Biotech) in DMEM medium containing 10% FBS for 1 hour at 37 ° C. Radiolabel. After radiolabelling, the cells are washed 3 times with RPMI1640 medium containing 10% FBS, and the cell concentration is adjusted to 2 ⁇ 10 5 / ml to prepare target cells.
  • ADCC activity or CDC activity is measured.
  • To measure ADCC activity add 50 ⁇ l of target cells and antibody to a 96-well U-bottom plate (Beckton Dickinson) and allow to react for 15 minutes on ice. Then add effector cells 100 1 and incubate in a carbon dioxide incubator for 4 hours. The final antibody concentration is 0 or 10 g / ml. After incubation, 100 ⁇ l of the supernatant is collected, and the radioactivity is measured with a gamma counter (COBRAIIAUTO-GMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company). Cytotoxic activity (%) can be determined by (A-C) / (B-C) X 100.
  • A is the radioactivity (cpm) in each sample
  • B is the radioactivity (cpm) in the sample with 1% NP-40 (manufactured by Hanai)
  • C is the radioactivity (cpm) of the sample containing only the target cells. Show.
  • a target cell and an anti-PepT antibody are added one by one to a 96-well flat bottom plate (manufactured by Becton Dickinson) and allowed to react on ice for 15 minutes. afterwards, Add complement solution 100 1 and incubate in carbon dioxide incubator for 4 hours. The final antibody concentration should be 0 or 3 g / ml. After incubation, collect 1001 supernatant and measure radioactivity with a gamma counter. Cytotoxic activity can be determined in the same manner as ADCC activity measurement.
  • Hyg5-BH and Hyg3-NT primers from pcDNA3.1 / Hygro (Invitrogen)
  • the BamH I site and TGCGC sequences were added to the 5th side of the start codon of the Hygromycin resistance gene (Hyg 1 ").
  • Hyg 1 Hygromycin resistance gene
  • HyG 1 was extracted by adding Not I site to the 3 'side including the region up to the SV40 polyA addition signal.
  • Ver targeting vector fucose transporter .l (hereinafter, referred to as K01 vector) is PMClDT- A vector (Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87,
  • the mouse pgk-1 gene promoter was excised with EcoR I-Pst I from the pKJ2 vector (Popo H, Biochemical Genetics vol.28, p299—308, 1990) and placed on the EcoR I-Pst I site of pBluescript (Stratagene). Cloning was performed to prepare pBSK-pgk-1.
  • Hyg 1 is obtained from pcDNA3.1 / Hygro by PCR with Hyg5- AV and Hyg3- BH primers, and the EcoT22 I site and Kozak sequence are attached to the 5th side of Hyg"".
  • Hyg 1 was extracted by adding a BamHI site on the 3 'side including the region up to the signal.
  • Hyg r (EcoT22 I- BamH I) fragment pBSK- pgk- 1 of Pst I- BamH I ⁇ enter City site, to produce a pBSK- pgk- 1- Hyg 1 ".
  • Targeting vector ver .2 fucose transporter (hereinafter, referred to as K02 vector) from Sma I of No.2,780 the base sequence shown in the 5 'side (SEQ ID NO: 1 of the fucose transporter on pMClDT-A vector No. It was constructed by inserting 4,232 BamHI), 3 side (Sac from No.4,284 to No.10,934), and pgk-to Hyg f fragment, respectively (FIG. 1).
  • the K02 vector has Hyg 1 "with the promoter of the pgk-1 gene, so even if only one copy of the vector is introduced into the cell by homologous recombination, it gains resistance to hyalomycin B
  • the K02 vector was cleaved with Not I and introduced into the cell.
  • the K02 vector caused the fucose transporter to lose 46 base pairs of exon 1 including the start codon and lose its function. It is done.
  • pPUR vector (BD Biosciences Inc.) was cleaved with Pst I and BamH I, and inserting the Furagume down HPunZ) cut out PBSK- PGK-1 of Pst I- BamH I site, the pBSK- pgk- 1- Puro r Produced.
  • K03 vector Targeting vector ver .3 fucose transporter (hereinafter, referred to as K03 vector) from Sma I of No.2,780 the base sequence shown in the 5 'side (SEQ ID NO: 1 of the fucose transporter on pMClDT-A vector No. 4,232 (BamHI), 3, side (from Sac from No.4,284 to No.10,934), and pgk-1-Puro 1 "fragments were inserted respectively (Fig. 1). -A sequence to which the screening primer shown below was bound was attached in advance to the 3 'end of Puro 1 ".
  • the K03 vector was cut with Not I and introduced into cells.
  • the K03 vector causes the fucose transporter to lose 46 base pairs in exon 1 including the start codon and lose function.
  • CHO-S-SFMII HT- (Invitrogen, cat 12052-098) and HT Supplement (lOOX) (Invitrogen cat. 11067-030) and penicillin streptomycin (Invitrogen cat. 15140-122) were mixed with CHO-S-SFMII HT -1/100 amount of calorie for each capacity. This was subcultured through the DXB11 strain of CHO cells as a culture medium (hereinafter referred to as SFMII (+)), and further cultured after this gene transfer with this SFMIK +). 8 ⁇ 10 6 CHO cells were suspended in 0.8 mL Dulbecco's phosphate buffer (hereinafter abbreviated as PBS; Invitrogen cat 14190-144).
  • PBS Dulbecco's phosphate buffer
  • the targeting vector was added to the cell suspension, and the cell suspension was transferred to Gene Pulser Cuvette (4 mm) (Bio-Rad cat. 1652088). After standing for 10 minutes on ice, the vector was introduced into the cells by the electoral position method with GENE-PULSER II (BioRad code No. 340BR) under conditions of 1.5 kV and 25 FD. . After the vector was introduced, the cells were suspended in 200 ml of SFMII (+) medium, and the cells were seeded at 100 ⁇ 1 / well in 20 96-well flat-bottom plates (Iwaki cat. 1860-096). CO in the plate
  • K01 vector and K02 vector were introduced into CHO cells, respectively, and the vector introduction ability was selected with hygromycin B (Invitrogen cat. 10687-010) 24 hours later.
  • Hygromycin B was dissolved in SFMII (+) to 0.3 mg / ml, and 100 1 / well was added.
  • CHO cells used for screening are cultured in 96-well flat-bottom plates, and after removing the culture supernatant, add 50 ⁇ l / well of cell lysis buffer and warm to 55 ° C for 2 hours, followed by 95 ° C, 15 By heating for a few minutes, proteinase K was inactivated to form a PCR kit.
  • Buffer for cell lysis is 10 X LA buffer per well (attached to Takara LA Taq) 5 1, 10% NP-40 (Roche cat. 1 332 473) 2.5 ⁇ 1, proteinase K (20 mg / ml, Takara cat. 9033) 4 1, and distilled water (Nacala Tester cat. 36421-35) 38.5 ⁇ 1
  • PCR reaction mixture is the above PCR sample 1 1, 10 X LA buffer II 51, MgCl
  • TP-F4 and THygro-Rl were used as screening primers for screening cells transfected with K01 vector, and TP-F4 and THygro-F1 were used as PCR primers for screening cells transfected with K02 vector.
  • PCR of cells into which K01 vector was introduced was pre-heated at 95 ° C for 1 minute, amplified at 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, and 60 ° C for 2 minutes. The cycle was 40 cycles and double heating at 72 ° C for 7 minutes.
  • Primers are as follows. In a sample of cells that have undergone homologous recombination, about 1.6 kb of DNA is amplified for the K01 vector and about 2.0 kb of DNA for the K02 vector.
  • TP-F4 was set on the outside of the vector and in the genomic region of the fucose transporter on the 5th side, and THygro-Fl and THygro-Rl were set in Hyg in the vector.
  • a total of 918 cells into which the K01 vector had been introduced were analyzed, of which one cell was considered to be a homologous recombinant (the homologous recombination efficiency was approximately 0.1%).
  • 537 cells transfected with the K02 vector were analyzed, of which 17 cells were considered to be homologous recombinants.
  • Genomic DNA was adjusted to 10 / zg according to the cultured cell strength method, and Southern blotting was performed. Of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • a 387 bp probe was prepared and used for confirmation by Southern blotting. Genomic DNA was cut with Bgl II.
  • Bgl-F 5 '-TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC -3 (SEQ ID NO: 11) Reverse primer
  • Bgl-R 5 '-CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C -3' (SEQ ID NO: 12)
  • Cleavage with Bgl II results in a band of approximately 3.0 kb from the fucose transporter chromosome, approximately 4.6 kb from the chromosome that has undergone homologous recombination with the KOI vector, and approximately 5.0 kb of chromosomal force that has undergone homologous recombination with the K02 vector.
  • Fig. 2 shows the structure of the band that appears after cutting out with Bgl II after the first stage of knockout.
  • Fig. 3 shows the data when the Southern plot was actually performed.
  • TPS- F1 5,-CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3 (SEQ ID NO: 13) Reverse primer
  • SHygro- R1 5,-TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC -3 (SEQ ID NO: 1 4)
  • TP-F4 was used as the forward primer and RSGR-A was used as the reverse primer.
  • PCR conditions include preheating at 95 ° C for 1 minute, 95 ° C for 30 seconds, 60 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes, 35 cycles of amplification cycle, and 72 ° C 7 minutes double heating.
  • approximately 1.6 kb of DNA is amplified. This PCR detected cells that had undergone homologous recombination with the K03 vector, and confirmed that homologous recombination with the K02 vector remained.
  • Method 1 616 cells were analyzed, of which 18 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was 2.9%) ( Figure 4).
  • Method 2 524 cells were analyzed, of which 2 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was approximately 0.4%).
  • Method 3 analyzed 382 cells, of which 7 cells were considered to be homologous recombinants (homologous recombination efficiency was approximately 1.8%).
  • FIG. 5 shows the Southern blot analysis (Fig. 5) of the obtained clones and the expression of fucose.
  • Figure 6 shows the results for wild / KO, and Figure 7 shows the results for KO / KO.

Abstract

　フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタンパク質、特に抗体の作製方法に関し、相同染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されている細胞を提供する。

Description

明 細 書
フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた抗体の作製 方法
技術分野
[0001] 本発明は、フコーストランスポーターの機能が阻害された細胞を用いた組換えタン パク質、特に抗体の作製方法に関する。
背景技術
[0002] 抗体は、 ADCC (抗体依存性細胞障害)活性や CDC (補体依存性細胞障害)活性 により抗腫瘍効果を発揮しうる。抗体は糖鎖が結合した糖タンパク質であり、抗体の 細胞障害活性の強さは抗体に結合する糖鎖の種類および量により変化しうることが 知られている。特に、抗体と結合したフコースの量が細胞障害活性の強さに強く拘わ つていることが報告されている (非特許文献 1参照)。さらに、細胞障害活性が増強さ れた抗体を得るために抗体産生の際に糖鎖へのフコースの結合を触媒する酵素を 発現させな ヽように操作し、フコースを有しな ヽ組換え抗体を作製する方法が報告さ れている (特許文献 1参照)。
非特許文献 1 : Shields et al., J Biol Chem., 277(30),26733-26740, 2002
特許文献 1 :国際公開公報 WO00/61739号公報
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0003] 本発明は、容易かつ確実にフコースの結合が消失または低下した組換えタンパク 質を製造する方法の提供を目的とする。特にフコースの結合が消失または低下し、 細胞障害活性が増強された抗体を製造する方法の提供を目的とする。本発明は、さ らにこのようなタンパク質を産生するための宿主細胞を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0004] 抗体産生細胞中で抗体にフコースが結合する機構として、細胞内に取り込まれたフ コースに GDPが結合し、その後 GDP-フコ一スがゴルジ体中に取り込まれゴルジ体中 で GDP-フコースのフコースがタンパク質に糖鎖として付加されている N-ァセチルダ ルコサミンに転移することが知られている。具体的には、抗体分子の Fc領域には、 N- グリコシド結合糖鎖が結合する部位が 2箇所あり、 N-グリコシド結合糖鎖の N-ァセチ ルグルコサミン部分にフコースが結合する（pate L. Smith etal. J.Cell Biol. 2002, 158, 801-815)。
[0005] 本発明者らは、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子を破壊すること により、ゴルジ体へのフコースの取り込みが阻害され、結果として抗体にフコースが付 カロされるのを阻害することができると考え、染色体上の両方のフコーストランスポータ 一遺伝子を破壊した細胞を作製することにより、本発明を完成させるに至った。
[0006] 本発明にお 、て、抗体へのフコースの付加を阻害するとは、製造される抗体全てが フコースが付加されていないことは必要ではなぐ抗体組成物中のフコースが付加さ れて 、るタンパク質の割合が減少して 、ればよ!/、。
[0007] すなわち、本発明は以下の通りである。
[0008] [1] 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制され ている細胞。
[0009] [2] フコーストランスポーター遺伝子が破壊されていることを特徴とする [1]の細胞。
[0010] [3] 動物細胞である [1ほたは [2]の細胞。
[0011] [4] 動物がチャイニーズハムスター細胞である、 [3]の細胞。
[0012] [5] 動物細胞が CHO細胞である [4]の細胞。
[0013] [6] 遺伝子の破壊がジーンターゲテイングベクターを用いた相同組換えにより行わ れる、 [2]から [5]のいずれかの細胞。
[0014] [7] 外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする [1]から [6] のいずれかの細胞。
[0015] [8] 外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である [7]の細胞 [0016] [9] [1]から [8]のいずれかの細胞を培養することを特徴とするタンパク質の製造方法 [0017] [10] タンパク質が抗体である [9]の製造方法。
[0018] [11] フコースが付加されていないタンパク質を製造することを特徴とする [10]の製 造方法。
[0019] [12] 細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、染色体上の両方のフコースト ランスポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、タンパク質への フコース付加阻害方法。
[0020] [13] 遺伝子の発現の人為的抑制が、遺伝子を欠損することによる行われることを特 徴とする [12]のタンパク質へのフコース付カ卩阻害方法。
[0021] [14] タンパク質が抗体である [12ほたは [13]のタンパク質へのフコース付加阻害方 法。
[0022] [15] 細胞力 CHO細胞である [12]力 [14]のいずれかのタンパク質へのフコース付 加阻害方法。
発明の効果
[0023] 本発明は、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に 抑制されている細胞を提供し、該細胞をタンパク質の製造に用いた場合、フコースを 有しな 、組換えタンパク質を製造することができる。フコースを有しな!/ヽ組換えタンパ ク質は、細胞障害活性が低減されており、特に抗体医薬として用いる組換え抗体に おいて有利である。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1] 3種類のターゲッティングベクターの構造を示す図である。
[図 2]第一段階のノックアウト後、 Bgl IIによる切断で、出現するバンドの構造を示す図 である。
[図 3]第一段階のノックアウトのサザンプロット解析の結果を示す図である。
[図 4]第二段階のノックアウトの相同組み換え効率を示す図である。
[図 5]フコーストランスポーター遺伝子欠損株のサザンプロット解析の結果を示す図で ある。
[図 6]フコーストランスポーター遺伝子欠損株 (wild/KO)のフコースの発現解析の結 果を示す図である。
[図 7]フコーストランスポーター遺伝子欠損株（KO/KO)のフコースの発現解析の結 果を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0025] 本発明にお 、てフコーストランスポーターとはフコース輸送活性を有するポリべプチ ドのことをいい、例えば、フコーストランスポーターが細胞膜上に発現している場合に は通常、フコースを細胞内に取り込み、フコーストランスポーターがゴルジ膜上に発 現している場合には通常、フコースをゴルジ体内に取り込む。本発明においては好ま しいフコーストランスポーターはチャイニーズノヽムスターフコーストランスポーターであ り、より好ましくは配列番号 2に記載されたアミノ酸配列を有するフコーストランスポー ターである。配列番号 1にはチャイニーズノヽムスターフコーストランスポーター遺伝子 の塩基配列を示す。
[0026] ゴルジ体は主にゴルジ膜上に存在するフコーストランスポーターを介して、フコース をゴルジ体内に取り込んでいることから、該フコーストランスポーターの機能を阻害す ることにより、ゴルジ体内へのフコースの取り込みを阻害することができ、ゴルジ体内 に取り込まれるフコースの量を減少させることが可能である。
[0027] 細胞のフコーストランスポーターの機能を阻害するとは、フコーストランスポーターの フコース輸送活性を低下または消滅させることを 、う。
[0028] 細胞のフコーストランスポーターの機能の阻害はどのような方法で行われてもよい 力 フコーストランスポーターの発現を阻害する方法が好ましい。
[0029] フコーストランスポーターの発現阻害は、正常な輸送能を有するフコーストランスポ 一ターの数が減少する限り、特に制限はされないが、フコーストランスポーターを標的 としたターゲティングベクターなどを用いてフコーストランスポーターをコードする遺伝 子 (フコーストランスポーター遺伝子）を欠失 (ノックアウト)する方法が好まし 、。
[0030] 通常、細胞は染色体上の両方にフコーストランスポーター遺伝子を有しているが、 本発明のフコーストランスポーターの機能が阻害された細胞は、染色体上の両方の フコーストランスポーター遺伝子が欠失している。又、本発明のフコーストランスポー ターの機能が阻害された細胞は、染色体上の 2つのフコーストランスポーター遺伝子 が欠失していれば特に限定されないが、染色体上に存在するフコーストランスポータ 一遺伝子の全てが欠失していることが好ましい。例えば、染色体上に 3つのフコースト ランスポーター遺伝子が存在する場合には、 3つのフコーストランスポーター遺伝子 が欠失して 、ることが好まし 、。染色体上の全てのフコーストランスポーター遺伝子が 欠失している力否かは、例えば、実施例記載のサザンプロット解析や、あるいは FIS H法などを用いて調べることが可能である。
[0031] 本発明の製造方法により作製されるタンパク質はどのようなタンパク質でもよいが、 通常、糖タンパク質であり、好ましくは抗体である。
[0032] 本発明の方法により作製する抗体の種類は特に制限されず、マウス抗体、ラット抗 体、ゥサギ抗体、ヒッジ抗体、ラクダ抗体、ヒト抗体等や、ヒトに対する異種抗原性を低 下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ 抗体、ヒト化抗体等を適宜用いることができる。遺伝子組換え型抗体は、既知の方法 を用いて製造することができる。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物、例えば、マウス 抗体の重鎖、軽鎖の可変領域とヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域力 なる抗体であり 、マウス抗体の可変領域をコードする DNAをヒト抗体の定常領域をコードする DNAと 連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得ること ができる。ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体とも称され、ヒト以外の哺乳動物、 たとえばマウス抗体の相補性決定領域（CDR; complementarity determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手 法も知られている。具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（ framework region ; FR)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラッ プする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチド力も PCR法により合成す る。得られた DNAをヒト抗体定常領域をコードする DNAと連結し、次いで発現べクタ 一に組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願 公開番号 EP 239400、国際特許出願公開番号 WO 96/02576参照）。 CDRを介して 連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するもの が選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部 位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよ い（Sato, K.et al.， Cancer Res, 1993, 53, 851-856.)。また、ヒト抗体の取得方法も知 られている。例えば、ヒトリンパ球を in vitroで所望の抗原または所望の抗原を発現す る細胞で感作し、感作リンパ球をヒトミエローマ細胞、例えば U266と融合させ、抗原へ の結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる (特公平ト 59878参照)。また、 ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジエニック動物を所望の抗原で 免疫することで所望のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735参照)。さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンユングによりヒト抗体を取 得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体 (scFv)として ファージディスプレイ法によりファージの表面に発現させ、抗原に結合するファージを 選択することができる。選択されたファージの遺伝子を解析すれば、抗原に結合する ヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定することができる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を基に適当な発現ベクターを作製し、 ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は既に衆知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
また、抗体は抗原に結合することができれば、抗体断片等の低分子化抗体や抗体 の修飾物などであってもよい。例えば、抗体断片としては、 Fab、 F(ab')、 Fv
2 又は H鎖 と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv(scFv) (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883)、 Diabodyなどが挙げられる 。このような抗体断片を得るには、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これ を発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させればよい（例えば、 Co, M. S. et al" J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976； Better, M. and Horwitz, A. H., Methods Enzymol. (1989) 178, 476-496； Pluckthun, A. and Skerra, A., Methods Enzymol. (1989) 178, 497-515； Lamoyi, E., Methods Enzymol. (1986) 121,
652-663； Rousseaux, J. et al" Methods Enzymol. (1986) 121, 663—669； Bird, R. E. and Walker, B. W" Trends Biotechnol. (1991) 9, 132- 137参照）。 Diabodyは、可変 領域と可変領域をリンカ一等で結合したフラグメント (例えば、 scFv等）（以下、 Diabodyを構成するフラグメント）を 2つ結合させて二量体ィ匕させたものであり、通常、 2 つの VLと 2つの VHを含む (P.Holliger et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90, 6444-6448 (1993)、 EP404097号、 W093/11161号、 Johnson et al., Method in Enzymology, 203, 88-98, (1991)、 Holliger et al., Protein Engineering, 9, 299—305, (1996)、 Perisic et al., Structure, 2, 1217-1226, (1994)、 John et al., Protein Engineering, 12(7), 597-604, (1999)、 Holliger et al,. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 90, 6444-6448, (1993)、 Atwell et al., Mol. Immunol.33, 1301-1312, (1996》。
[0034] 抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体 を使用することもできる。又、抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシ ン等の細胞傷害性物質などを結合することも可能であり、特に放射性標識抗体は有 用である。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによつ て得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されてい る。
[0035] <本発明の方法によるタンパク質の製造方法 >
組み換えポリペプチドの製造方法は、当業者に知られている公知の方法で行うこと が可能である。一般的にはポリペプチドをコードする DNAを、適当な発現ベクターに 組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して得た形質転換体を回収し、抽出物を得 た後、イオン交換、逆相、ゲル濾過などのクロマトグラフィー、あるいは本発明のポリ ペプチドに対する抗体をカラムに固定したァフィユティークロマトグラフィーにかけるこ とにより、または、さらにこれらのカラムを複数組み合わせることにより精製し、調製す ることが可能である。
[0036] また、タンパク質をダルタチオン S-トランスフェラーゼ蛋白質との融合ポリペプチドと して、あるいはヒスチジンを複数付加させた組み換えポリペプチドとして宿主細胞 (例 えば、動物細胞や大腸菌など）内で発現させた場合には、発現させた組み換えポリ ペプチドはダルタチオンカラムある 、はニッケルカラムを用いて精製することができる 。融合ポリペプチドの精製後、必要に応じて融合ポリペプチドのうち、 目的のポリぺプ チド以外の領域を、トロンビンまたはファクター Xaなどにより切断し、除去することも可 能である。
[0037] 本発明の製造方法において製造されるタンパク質としては、結合したフコースにより 細胞傷害活性が影響を受ける抗体が好まし 、。
[0038] 抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え 技術を用いて抗体を産生させる方法は当業者によく知られている（例えば、 Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL
ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
[0039] く本発明のタンパク質の製造方法において用いる細胞および該細胞を用いてのタン パク質の製造 >
さらに、本発明は外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、染色体に存在 するフコーストランスポーター遺伝子の両方の発現が人為的に抑制されている細胞 を包含する。
[0040] このような、染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に 抑制されている細胞を宿主細胞として外来タンパク質を発現させることにより、フコー スの結合していないタンパク質を得ることができる。ここで、外来のタンパク質とはその 細胞自体に由来しないタンパク質をいう。宿主細胞には特に制限はなぐ例えば、組 換えタンパク質を発現させた際に該タンパク質に糖が付加される細胞等を用いること ができる。より具体的には種々の動物細胞などを用いることができ、好ましくは CHO 細胞である。本発明にお ヽては特にフコーストランスポーター遺伝子がノックアウトさ れた CHO細胞を好適に使用することができる。動物細胞としては、哺乳類細胞、例え ば、 CH0 (J. Exp. Med. (1995) 108, 945)、 COSゝ 3T3、ミエローマ、 BHK(baby hamster kidney)、 HeLa、 Vero、両生類細胞、例えばアフリカッメガエル卵母細胞（ Valle, et al.， Nature (1981) 291, 358- 340)、あるいは昆虫細胞、例えば、 S19、 Sf21、 Tn5が知られている。 CHO細胞としては、例えば、 DHFR遺伝子を欠損した CHO細胞 である dhfr— CHO (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980)77, 4216— 4220)や CHO K— 1 ( Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1968) 60, 1275)などを例示することができる。動物細胞 において、大量発現を目的とする場合には特に CHO細胞が好ましい。
[0041] 上記の外来のタンパク質を産生し得る宿主細胞であって、フコーストランスポーター の機能が阻害されている細胞に産生させようとする抗体等の外来タンパク質をコード する遺伝子を組込んだ発現ベクターを組込めば、フコースの結合して ヽな 、タンパク 質を得ることができる。ベクターとしては、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例 えば、 pcDNA3 (インビトロゲン社製)や、 pEGF— BOS (Nucleic Acids. Res.1990, 18(17),p5322)、 pEF、 pCDM8)、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac- to- BAC baculovairus expression system」（ギブコ BRL社製）、 pBacPAK8)、植物由来の発現 ベクター（例えば ρΜΗ1、 pMH2)、動物ウィルス由来の発現ベクター（例えば、 pHSV、 pMV、 pAdexLcw)、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、 pZIPneo)、酵母由来 の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression KitJ (インビトロゲン社製）、 pNVll、 SP-Q01)、枯草菌由来の発現ベクター（例えば、 pPL608、 pKTH50)等が挙げられる 力 宿主細胞を CHO細胞とする場合には哺乳動物由来のベクターを使用することが 好ましい。
[0042] CHO細胞、 COS細胞、 NIH3T3細胞等の動物細胞での発現を目的とする場合には 、通常、細胞内で発現させるために必要なプロモーター、例えば SV40プロモーター（ Mulliganら， Nature (1979) 277, 108)、 MMLV-LTRプロモーター、 EF1 αプロモータ 一（Mizushimaら， Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)、 CMVプロモーターなどを持 つており、細胞への形質転換を選抜するための遺伝子 (例えば、薬剤 (ネオマイシン 、 G418など）により判別できるような薬剤耐性遺伝子)を有すればさらに好ましい。こ のような特性を有するベクターとしては、例えば、 pMAM、 pDR2、 pBK-RSV、 pBK-CMV, pOPRSV、 pOP13などが挙げられる。
[0043] さらに、遺伝子を安定的に発現させ、かつ、細胞内での遺伝子のコピー数の増幅を 目的とする場合には、核酸合成経路を欠損した CHO細胞にそれを相補する DHFR遺 伝子を有するベクター（例えば、 pCHOIなど）を導入し、メトトレキセート (MTX)により 増幅させる方法が挙げられ、また、遺伝子の一過性の発現を目的とする場合には、
SV40 T抗原を発現する遺伝子を染色体上に持つ COS細胞を用いて SV40の複製起 点を持つベクター (pcDなど)で形質転換する方法が挙げられる。複製開始点として は、また、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウィルス（BPV)等の由 来のものを用いることもできる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発 現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドトランスフェラーゼ (APH)遺伝子、 チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニンホスホリボシルトランスフエ ラーゼ (Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝子等を含むことができる。 [0044] 宿主細胞へのベクターの導入は、例えば、リン酸カルシウム法、 DEAEデキストラン 法、カチォニックリボソーム DOTAP (ベーリンガーマンハイム社製）を用いた方法、ェ レクト口ポレーシヨン法、リポフエクシヨンなどの方法で行うことが可能である。
[0045] 細胞の培養は、公知の方法に従 、行うことができる。例えば、動物細胞の培養液と して、例えば、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができる。その際、牛 胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできるし、無血清培養してもよい。培 養時の pHは、約 6— 8であるのが好ましい。培養は、通常、約 30— 40°Cで約 15— 200 時間行い、必要に応じて培地の交換、通気、攪拌を加える。
[0046] 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されて いる細胞として、染色体に存在するフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊さ れた細胞を挙げることができる。
[0047] 「遺伝子の破壊」とは、遺伝子の塩基配列に部分的な欠失、置換、挿入、付加等を 行い、該遺伝子の発現を抑制することをいう。ここで「遺伝子の発現を抑制」には、遺 伝子自体は発現するが、正常な機能を有する蛋白質をコードする遺伝子が発現され ない場合も含まれる。
[0048] 又、遺伝子の発現が完全に抑制されて!、る場合だけでなぐ部分的に抑制されて いる場合も本発明の「遺伝子の破壊」に含まれる。「遺伝子の欠損（ノックアウト）」およ び「遺伝子の不活性化」も「遺伝子の破壊」と同等の意味として用いられる。さらに、ジ ーンターゲティングを用いた相同組換えにより遺伝子が破壊された細胞を遺伝子が ノックアウトされた細胞と 、う。フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した 細胞は、フコーストランスポーターの発現が人為的に抑制されている細胞の 1つであ る。
[0049] フコーストランスポーターをコードする遺伝子を破壊した細胞は、通常、ゴルジ体内 に存在するフコースの量がフコーストランスポーター遺伝子が破壊されて 、な 、細胞 に比べ有意に減少する、または、細胞内におけるフコース輸送能が低下または欠損 する、または、細胞内のゴルジ体へのフコース取込み活性が低下または欠損する。
[0050] 特に、相同染色体の 2対のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損した細胞 は、片方のみのフコーストランスポーターが欠損した細胞と比較して、上記の性質が より顕著に現れる。
[0051] ゴルジ体中のフコースの量は細胞よりゴルジ体を単離し糖を抽出し、抗原抗体反応 、糖とレクチンの結合反応、液体クロマトグラフィー、電気泳動等により測定することが できる。また、細胞内におけるフコース輸送能および細胞内のゴルジ体へのフコース 取込み活性は例えば、蛍光物質やラジオアイソトープ等で標識したフコースを用いて 柳』定することができる。
[0052] 遺伝子の破壊は、例えば、相同組換え法により行うことが可能である。
[0053] 相同組換え法は、染色体上の遺伝子と外来 DNAとの間で相同的遺伝子組換え〖こ よって目的の遺伝子だけを任意に改変する方法をいい、タンパク質をコードする配列 を分断する目的で、その遺伝子のェクソンに別の DNA配列を挿入する。ジーンター ゲティングベクターを持つ細胞を同定しやすくするため、遺伝子を分断する配列には 一般にバクテリア由来のネオマイシン耐性遺伝子のような選択マーカーを用いる。本 明細書に記載のフコーストランスポーター遺伝子の配列情報を基にターゲテイングべ クタ一を設計'作製し、該ターゲティングベクターを用いて破壊しょうとするフコースト ランスポーター遺伝子を相同組換えすればよい。例えば、置換型ベクターは、導入 する変異の 5'および 3'側に連結された相同領域、ポジティブセレクション用のマーカ 一、相同領域の外側でベクターを直鎖状ィ匕するための制限酵素部位、相同領域の 外側に配置されたネガティブセレクション用のマーカー、変異検出用の制限酵素切 断部位等を含むことができる。ターゲテイングベクターは、山村研一ら編 トランスジェ ニック動物 共立出版株式会社 1997年 3月 1日、相沢慎一 ジーンターゲティング ES細胞を用いた変異マウスの作製 バイオマニュアルシリーズ 8 羊土社 1995、 Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, し old Spring Hoarbor Laboratory Press (1944)、 Joyner, A.L., Gene Targeting, A Practical Approach Series, IRL Press (1993)、松村正實ら編 実験医学別冊 新遺伝子工学ハンドブック (改定第 3版） 羊 土社 1999 等に記載の方法に従って作製することができる。ターゲテイングベクター は挿入型および置換型のどちらを用いてもよい。また、 Cre-lox系を用いたターゲティ ングにより組換えを起こさせることもできる。 Cre-lox系を用いたターゲティングは、例 えば特表平 11-503015号公報に記載の方法に従って行うことができる。相同組換え を起こした相同組換え体の選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、 ネガティブ選択、ポリ A選択等の公知の選択方法を用いればよい。相同組換え体の 同定は、 PCR法でもサザンブロッテイング法の 、ずれの方法をも用いることができる。
[0054] さらに、本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、染色体の 2 対のフコーストランスポーターの両方が欠損する限り、細胞にランダムに変異を導入 しても得ることができる。ランダムに変異を導入する方法として、マーカーの入った遺 伝子破壊ベクターを細胞のゲノムにランダムに導入してフコーストランスポーター遺 伝子が破壊された細胞をスクリーニングする方法と、 ENU(N-ethy卜 N- nitrosourea)等 の化学変異原でランダムな変異を導入してフコーストランスポーター遺伝子が破壊さ れた細胞をスクリーニングする方法が挙げられる。フコーストランスポーターが産生さ れなくなった細胞のスクリーニングは、フコーストランスポーターの活性を指標に行つ てもよいし、ウェスタンブロッテイングやノーザンブロッテイングによりフコーストランスポ 一ター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
[0055] さらに本発明のフコーストランスポーター遺伝子が破壊された細胞は、フコーストラ ンスポーター遺伝子をノックアウトした動物力も得ることができる。フコーストランスポー ター遺伝子をノックアウトした動物は、 ES細胞のフコーストランスポーターを前記方法 で破壊し、該 ES細胞力 例えば、 WO02/33054号公報に記載の方法で作出すること ができる。この際用いる動物としては、限定されないがャギ、ブタ、ヒッジ、ゥシ、マウ ス、ノ、ムスター、ラット等が挙げられる。フコーストランスポーター遺伝子をノックアウト した動物から株化細胞を作製することにより、フコーストランスポーター遺伝子を有し な 、株化細胞を得ることができる。
[0056] 本発明の染色体上の 2つのフコーストランスポーター遺伝子の両方が破壊された宿 主細胞で外来の組換えタンパク質を産生させた場合、細胞中のフコースがゴルジ体 中にトランスポートされないためタンパク質へのフコースの付カ卩が阻害される。フコー ストランスポーター遺伝子が破壊された宿主細胞で産生した組換えタンパク質は、フ コーストランスポーター遺伝子が破壊されて 、な 、宿主細胞で産生した組換えタンパ ク質に比較して結合しているフコース量が有意に少なぐ好ましくは検出できない。外 来タンパク質が抗体の場合、抗体 1分子の 2つの H鎖の Fc領域に存在する 2箇所の 糖鎖結合部位に結合した N-グリコシド結合糖鎖にフコースが結合して 、な 、ものが 得られる。このようなフコースが結合して 、な 、抗体は細胞傷害活性が増強されて ヽ る。なお、本発明の細胞を用いて、抗体へのフコースの付加が阻害された抗体を製 造する場合、製造される抗体全てがフコースが付加されて 、な 、ことは必要ではなく 、抗体組成物中のフコースが付加されているタンパク質の割合が減少していればよ い。
[0057] さらに、本発明は、染色体上のフコーストランスポーター遺伝子の両方が欠損した 動物（ヒトを除く）も包含する。このような動物を用いることにより in vivoで組換えポリべ プチドを産生することができる。
[0058] これらの動物に目的とするタンパク質をコードする DNAを導入し、動物の体内でポリ ペプチドを産生させ、回収する。本発明における「宿主」とは、これらの動物などを包 含する。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系がある。哺乳類動 物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシを用いることができる（Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。
[0059] 例えば、目的とする DNAを、ャギ /3カゼインのような乳汁中に固有に産生されるポリ ペプチドをコードする遺伝子との融合遺伝子として調製する。次いで、この融合遺伝 子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚を雌のャギへ移植する。胚を受容し たャギから生まれるトランスジエニックャギ又はその子孫が産生する乳汁から、目的の ポリペプチドを得ることができる。トランスジ ニックャギカも産生されるポリペプチドを 含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用しても よい（Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702)。
[0060] 得られたポリペプチドは、宿主細胞内または細胞外 (培地など)力 単離し、実質的 に純粋で均一なポリペプチドとして精製することができる。ポリペプチドの分離、精製 は、通常のポリペプチドの精製で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ 何ら限定されるものではない。例えば、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾 過、塩析、溶媒沈殿、溶媒抽出、蒸留、免疫沈降、 SDS-ポリアクリルアミドゲル電気 泳動、等電点電気泳動法、透析、再結晶等を適宜選択、組み合わせればポリべプチ ドを分離、精製することができる。 [0061] クロマトグラフィーとしては、例えばァフィユティークロマトグラフィー、イオン交換クロ マトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、吸着ク 口マトグラフィ一等が挙げられる（Strategies for Protein Purification and
Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed Daniel R. Marshak et al" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。これらのクロマトグラフィーは、液ネ目クロマト グラフィー、例えば HPLC、 FPLC等の液相クロマトグラフィーを用いて行うことができる
[0062] なお、ポリペプチドを精製前又は精製後に適当な蛋白質修飾酵素を作用させること により、任意に修飾を加えたり部分的にペプチドを除去することもできる。蛋白質修飾 酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリブシン、リシルエンドべプチダーゼ、プロテ インキナーゼ、ダルコシダーゼなどが用いられる。
[0063] 本発明の製造方法により製造される抗体の H鎖又は L鎖をコードする遺伝子は既 知の配列を用いることも可能であり、又、当業者に公知の方法で取得することも可能 である。例えば、モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ力 抗体をコードする 遺伝子をクローユングして取得することも可能であるし、抗体ライブラリから取得するこ とも可能である。ノ、イブリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにして 作製できる。すなわち、所望の抗原や所望の抗原を発現する細胞を感作抗原として 使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の 細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノク ローナルな抗体産生細胞 (ノヽイブリドーマ）をスクリーニングすることによって作製でき る。得られたノ、イブリドーマの mRNAから逆転写酵素を用いて抗体の可変領域 (V領 域)の cDNAを合成し、これを所望の抗体定常領域 (C領域)をコードする DNAと連結 することにより H鎖又は L鎖をコードする遺伝子を得ることができる。免疫の際の感作 抗原としては特に限定されないが、例えば、 目的の全長タンパク質や、部分ペプチド などを用いることができる。抗原の調製は、当業者に公知の方法により行うことができ 、例えば、バキュロウィルスを用いた方法 (例えば、 W098/46777など）などに準じて 行うことができる。ハイプリドーマの作製は、たとえば、ミルスティンらの方法（Kohler, G., and Milstein, C, Methods Enzymol. 1981, 73, 3- 46.)等に準じて行うことができ る。抗原の免疫原性が低い場合には、アルブミン等の免疫原性を有する巨大分子と 結合させ、免疫を行えばよい。
[0064] 抗体ライブラリについては既に多くの抗体ライブラリが公知になっており、又、抗体 ライブラリの作製方法も公知であるので、当業者は適宜抗体ライブラリを入手すること が可能である。
[0065] 上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている 公知の方法により精製することができる。例えば、プロテイン Aカラムなどのァフィニテ ィーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選 択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる (Ant¾odies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)
[0066] 抗体の抗原結合活性 (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)の測定には公知の手段を使用することができ る。例えば、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法)、 EIA (酵素免疫測定法)、 RIA (放射 免疫測定法)あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
[0067] 本発明の細胞を用いて産生させたタンパク質の糖鎖構造の解析は、 2次元糖鎖マ ップ法 (Anal.Biochem,, 171, 73,(1988)、生物化学実験法 23-糖タンパク質糖鎖研究法 高橋禮子編 学会出版センター （1989)等に記載の方法により行うことができる。さ らに、糖鎖を MALDト TOF- MS等の質量分析により解析することもできる。
[0068] 抗体の細胞障害活性
本発明の方法で製造される抗体は細胞障害活性が増加した抗体である。
[0069] 本発明における細胞障害活性とは、例えば抗体依存性細胞介在性細胞障害
(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity: ADCC)活性、補体依存性細胞障害 (complement-dependent cytotoxicity: CDC)活性などを挙げることができる。本発明 において、 CDC活性とは補体系による細胞障害活性を意味し、 ADCC活性とは標的 細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、その Fc部分に 1¾ γ受容体保有 細胞 (免疫細胞等）が Fc γ受容体を介して結合し、標的細胞に障害を与える活性を 意味する。 [0070] 抗体が ADCC活性を有する力否力 又は CDC活性を有するか否かは公知の方法 により測定することができる（例えば、 Current protocols in Immunology, Chapter7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc.,(1993)等）。
[0071] 具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製を行う。
[0072] (1) エフェクター細胞の調製
CBA/Nマウスなどカゝら脾臓を摘出し、 RPMI1640培地 (GIBCO社製)中で脾臓細胞を 分離する。 10%ゥシ胎児血清 (FBS、 HyClone社製)を含む同培地で洗浄後、細胞濃 度を 5 X 106/mlに調製し、エフェクター細胞を調製する。
[0073] (2)補体溶液の調製
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE社製)を 10% FBS含有培地 (GIBCO社製） にて 10倍希釈し、補体溶液を調製する。
[0074] (3)標的細胞の調製
脾臓癌細胞株（AsPC- 1、 Capan- 2等）を 0.2mCiの51 Cr- sodium chromate(Amersham Pharmacia Biotech社製)とともに、 10% FBS含有 DMEM培地中で 37°Cにて 1時間培 養することにより放射性標識する。放射性標識後、細胞を 10% FBS含有 RPMI1640培 地にて 3回洗浄し、細胞濃度を 2 X 105/mlに調製して、標的細胞を調製する。
[0075] 次 、で、 ADCC活'性、又は CDC活性の測定を行う。 ADCC活性の測定の場合は、 96ゥヱル U底プレート (Beckton Dickinson社製)に、標的細胞と、抗体を 50 μ 1ずつ加 え、氷上にて 15分間反応させる。その後、エフェクター細胞 100 1を加え、炭酸ガスィ ンキュベータ一内で 4時間培養する。抗体の終濃度は 0または 10 g/mlとする。培養 後、 100 μ 1の上清を回収し、ガンマカウンター (COBRAIIAUTO-GMMA、 MODEL D5005、 Packard Instrument Company社製)で放射活性を測定する。細胞障害活性 (%)は (A-C)/(B-C) X 100により求めることができる。 Aは各試料における放射活性 (cpm)、 Bは 1% NP- 40(半井社製)を加えた試料における放射活性 (cpm)、 Cは標的細 胞のみを含む試料の放射活性 (cpm)を示す。
[0076] 一方、 CDC活性の測定の場合は、 96ゥヱル平底プレート (Becton Dickinson社製)に 、標的細胞と、抗 PepT抗体を 1ずつ加え、氷上にて 15分間反応させる。その後、 補体溶液 100 1を加え、炭酸ガスインキュベーター内で 4時間培養する。抗体の終濃 度は 0または 3 g/mlとする。培養後、 100 1の上清を回収し、ガンマカウンターで放 射活性を測定する。細胞障害活性は ADCC活性の測定と同様にして求めることがで きる。
実施例
[0077] CHO細胞におけるフコーストランスポーター遺伝子の破壊
1.ターゲッティングベクターの構築
(1) K01ベクターの作製
pcDNA3.1/Hygro (インビトロジェン社）より Hyg5- BHと Hyg3- NTのプライマーで PCR することによって、 Hygromycin耐性遺伝子（Hyg1")の開始コドンの 5，側に BamH Iサイト と TGCGCの配列を付加することで、フコーストランスポーター遺伝子の開始コドンの 5
'側と同じ配列にし、 SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む 3'側には Not Iサイト を付加して Hyg1"を抜き出した。
[0078] フォワードプライマー
Hyg5-BH 5， - GGA TCC TGC GCA TGA AAA AGC CTG AAC TCA CC -3' ( 配列番号 3)
リバースプライマー
Hyg3-NT 5， - GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG - 3' (配列番 号 4)
フコーストランスポーターのターゲッティングベクター ver.l (以下、 K01ベクターと称 する）は pMClDT— Aベクター（Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA vol.87,
P9918-9922, 1990)に、フコーストランスポーターの 5'側（配列番号 1に示す塩基配列 の No.2,780の Sma Iから No.4,232の BamH I)、 3，側（No.4,284から No.10,934の Sac Iま で）、及び Hyg1"フラグメントを各々挿入することで構築した（図 1)。ベクターの特徴とし ては、 Hyg1"にプロモーターが付加されていないことから、相同組み換えを起こしたとき にフコーストランスポーターのプロモーターによって、 Hygが発現することとなる。しか しながら、相同組み換えによって 1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグ ロマイシン Bに対する耐性を獲得するほど Hyg1"が発現するとは限らない。なお、 K01 ベクターは Not Iで切断して細胞に導入した。 K01ベクターによって、フコーストランス ポーターは開始コドンを含むェクソン 1の 41塩基対を欠損することになり、機能を失う ものと考えられる。
[0079] (2) pBSK- pgk- 1- Hygrの作製
pKJ2ベクター（Popo H, Biochemical Genetics vol.28, p299— 308, 1990)よりマウス pgk-1遺伝子のプロモーターを EcoR I-Pst Iによって切り出し、 pBluescript (ストラタジ ーン社)の EcoR I-Pst Iサイトにクローユングして pBSK- pgk- 1を作製した。 Hyg1"は pcDNA3.1/Hygroより Hyg5- AVと Hyg3- BHのプライマーで PCRすることによって、 Hyg"" の 5，側に EcoT22 Iサイトと Kozak配列を付カ卩し、 SV40 polyA付カ卩シグナルまでの領域 を含む 3 '側には BamH Iサイトを付加して Hyg1"を抜き出した。
[0080] フォワードプライマー
Hyg5-AV 5， - ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC - 3 ' ( 配列番号 5)
リバースプライマー
Hyg3-BH 5 ' - GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C -3 ' (配列番号 6)
この Hygr(EcoT22 I- BamH I)フラグメントを pBSK- pgk- 1の Pst I- BamH Iサイトに揷 入し、 pBSK- pgk- 1- Hyg1"を作製した。
[0081] (3) K02ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクター ver.2 (以下、 K02ベクターと称 する）は pMClDT-Aベクターにフコーストランスポーターの 5'側（配列番号 1に示す塩 基配列の No.2,780の Sma Iから No.4,232の BamH I)、 3，側（No.4,284から No.10,934の Sacほで）、及び pgk-ト Hygfフラグメントを各々挿入することで構築した（図 1)。 K01 ベクターと異なり、 K02ベクターは Hyg1"に pgk-1遺伝子のプロモーターが付カ卩されて いることから、相同組み換えによって 1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハ イダロマイシン Bに対する耐性を獲得する。なお、 K02ベクターは Not Iで切断して細 胞に導入した。 K02ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含む ェクソン 1の 46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。 [0082] (4) pBSK- pgk- 1- Purorの作製
pPURベクター（BD Biosciences社）を Pst Iと BamH Iで切断し、切り出されたフラグメ ン HPunZ)を pBSK- pgk- 1の Pst I- BamH Iサイトに挿入し、 pBSK- pgk- 1- Purorを作製 した。
[0083] (5) K03ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクター ver.3 (以下、 K03ベクターと称 する）は pMClDT-Aベクターにフコーストランスポーターの 5'側（配列番号 1に示す塩 基配列の No.2,780の Sma Iから No.4,232の BamH I)、 3，側（No.4,284から No.10,934の Sacほで）、及び pgk-1- Puro1"フラグメントを各々挿入することで構築した（図 1)。なお 、 pgk-1- Puro1"の 3'末端には、以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する 配列を予め付カ卩しておいた。なお、 K03ベクターは Not Iで切断して細胞に導入した 。 K03ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むェクソン 1の 46 塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
[0084] リバースプライマー
RSGR-A 5， - GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C -3，（配列番号 7) 以上の 3種類のターゲッティングベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子 のノックアウトを試みた。
[0085] 2. CHO細胞へのベクターの導入
CHO-S-SFMII HT- (インビトロジェン社、 cat 12052- 098)に HT Supplement(lOOX) ( インビトロジェン社 cat. 11067- 030)とペニシリンストレプトマイシン (インビトロジェン 社 cat. 15140- 122)を CHO- S- SFMII HT-の容量に対して、それぞれ 1/100量をカロ えた。これを培養用の培地（以下、 SFMII (+)と称する）として CHO細胞の DXB11株を 継代し、さらに遺伝子導入後の培養もこの SFMIK+)で行った。 8 X 106個の CHO細胞 を 0.8mLのダルベッコリン酸緩衝液 (以下、 PBSと略す。インビトロジェン社 cat 14190-144)に懸濁した。細胞懸濁液に 30 gのターゲッティングベクターをカロえ、 Gene Pulser Cuvette(4mm) (バイオラッド社 cat. 1652088)に細胞懸濁液を移した。 氷上で 10分間放置した後に、 GENE-PULSER II (バイオラッド社 code No. 340BR)で 1.5kV, 25 FDの条件で、エレクト口ポレーシヨン法によりベクターを細胞に導入した 。ベクターを導入後、細胞を 200mlの SFMII(+)培地に懸濁して 20枚の 96穴平底プレー ト（イワキ社 cat. 1860-096)に 100 μ 1/ゥエルで細胞を播きこんだ。プレートを COイン
2 キュベータ内で、 24時間、 37°Cで培養した後、薬剤を添加した。
[0086] 3.ノックアウトの第一段階
K01ベクター、もしくは K02ベクターをそれぞれ CHO細胞に導入し、ベクター導入 力も 24時間後にハイグロマイシン B (インビトロジェン社 cat. 10687-010)による選抜 を行った。ハイグロマイシン Bは 0.3mg/mlになるように SFMII(+)に溶解し、 100 1/ゥェ ル添加した。
[0087] 4. PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
(1) PCR用のサンプルの調整
相同組み換え体は PCR法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いる CHO 細胞は 96穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を 50 μ 1/ゥエル加えて 55°C、 2時間加温し、続いて 95°C、 15分加熱することで、プロティナ一 ゼ Kを失活させて PCRの铸型とした。細胞溶解用の緩衝液は、 1ゥエルあたり 10 X LA 緩衝液 Π (タカラ社 LA Taqに添付） 5 1、 10% NP- 40 (ロッシュ社 cat. 1 332 473) 2.5 μ 1、プロティナーゼ K (20mg/ml、タカラ社 cat. 9033) 4 1、及び蒸留水（ナカラ ィテスタ社 cat. 36421-35) 38.5 μ 1で構成されて 、る。
[0088] (2) PCRの条件
PCR反応混合物は上記の PCRサンプル 1 1、 10 X LA緩衝液 II 5 1、 MgCl
2
(25mM) 5 1、 dNTP(2.5mM) 5 1、プライマー（各 10 Μ) 2 1、 LA Taq(5 IU/ μ 1 cat.RR002B) 0.5 μ 1、及び蒸留水 29.5 μ 1(全 50 μ 1)とした。 K01ベクターを導入した 細胞のスクリーニングには、 TP- F4と THygro- Rl、 K02ベクターを導入した細胞のスク リー-ングには、 TP- F4と THygro- F1を PCRプライマーに用いた。
[0089] K01ベクターを導入した細胞の PCRは、 95°Cにて 1分間の前加熱、 95°Cにて 30秒間 、 60°Cにて 30秒間、及び 60°Cにて 2分間の増幅サイクル 40サイクル、並びに 72°Cにて 7分の複加熱とした。 K02ベクターを導入した細胞のスクリーニングには 95°Cにて 1分 間の前加熱、 95°Cにて 30秒間、及び 70°Cにて 3分間の増幅サイクル 40サイクル、並 びに 70°Cにて 7分の複加熱とした。 [0090] プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、 K01ベ クタ一では、約 1.6kb、 K02ベクターでは約 2.0kbの DNAが増幅される。プライマーは TP-F4がベクターの外側で、かつ 5，側のフコーストランスポーターのゲノム領域に設 定し、 THygro-Fl,及び THygro-Rlはベクター内の Hygの中に設定した。
[0091] フォワードプライマー（KOI, K02)
TP-F4 5' - GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACT CGC - 3，（配列番 号 8)
リバースプライマー (KO 1)
THygro-Rl 5，- TGC ATC AGG TCG GAG ACG CTG TCG AAC -3，（配列番号 9)
リバースプライマー (K02)
THygro-Fl 5，- GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGG AAT AGC - 3，（配 列番号 10)
5. PCR ^クリーニング結果
K01ベクターを導入した細胞は 918個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えら れる細胞は 1個であった (相同組み換え効率は約 0.1%)。また、 K02ベクターを導入し た細胞は 537個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は 17個であった
(相同組み換え効率は約 3.2%)。
[0092] 6.サザンブロット解析
さらに、サザンプロット法によっても確認を行った。培養した細胞力 定法に従って ゲノム DNAを 10 /z g調整し、サザンブロットを行った。配列番号 1に示す塩基配列の
No.2,113- No.2,500の領域から、以下の二種類のプライマーを用いて PCR法により
387bpのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノム DNA は Bgl IIで切断した。
[0093] フォワードプライマー
Bgl-F: 5' - TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC -3，（配列番号 11) リバースプライマー
Bgl-R: 5' - CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C -3' (配列番号 12) Bgl IIによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体からは約 3.0kb、 KOI ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約 4.6kb、 K02ベクターで相同組み 換えを起こした染色体力もは約 5.0kbのバンドがそれぞれ出現する。図 2は第一段階 のノックアウト後、 Bgl IIによる切断で、出現するバンドの構造を示す図であり、図 3は 実際にサザンプロットを行ったときのデータを示したものである。 K01ベクター、及び K02ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のそれぞれ 1、 7種類を実験に用 いた。 K01ベクターで唯一獲得された細胞は 5C1と名づけた力 その後の解析により 複数の細胞集団から構成されることが明らかになつたので、限界希釈によってクロー ン化し、その後の実験に用いることにした。また、 K02ベクターで獲得された細胞の一 つを 6E2と名付けた。
[0094] 7.ノックアウトの第二段階
K01ベクター、及び K02ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し、 3 種類のベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞株 の榭立を試みた。ベクターと細胞の組み合わせは、以下の通りである。方法 1. K02 ベクターと 5C1細胞（K01)、方法 2. K02ベクターと 6E2細胞 (K02)、方法 3. Κ03ベタ ターと 6Ε2細胞 (Κ02)。ベクターをそれぞれの細胞に導入し、ベクター導入力も 24時 間後にハイグロマイシン Β、ピューロマイシン（ナカライテスタ社、 cat.29455-12)による 選抜を開始した。ハイグロマイシン Bは方法 1では最終濃度が lmg/ml、方法 2では最 終濃度が 7mg/mlになるようにした。さらに方法 3では、ハイグロマイシン Bの最終濃度 力 .15mg/ml、ピューロマイシンの最終濃度が 8 g/mlになるように添カ卩した。
[0095] 8. PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。方法 1に関するスクリーニングは、前述の K01ベクタ 一、及び K02ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出する PCRを両方行った 。方法 2に関しては、下記の PCRプライマーを設計した。配列番号 1に示す塩基配列 の No.3,924- 3,950の領域に TPS- F1を、 No.4,248- 4,274に SHygro- R1を設定した。こ の PCRプライマーによって、 K02ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの 遺伝子領域の 350bpが増幅される。従って、方法 2における PCR ^クリーニングにおい ては、 350bpが増幅されないものを、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損し た細胞とみなすことにした。 PCRの条件は、 95°Cにて 1分間の前加熱、 95°Cにて 30秒 間、 70°Cにて 1分間の増幅サイクル 35サイクル、並びに 70°Cにて 7分の複加熱とした。
[0096] フォワードプライマー
TPS- F1 : 5，- CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC -3，（配列番号 13) リバースプライマー
SHygro- R1 : 5，- TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC -3，（配列番号 1 4)
方法 3に関しては、フォワードプライマーに TP-F4、リバースプライマーに RSGR-Aを 用いた。 PCRの条件は、 95°Cにて 1分間の前加熱、 95°Cにて 30秒間、 60°Cにて 30秒 間、 72°Cにて 2分間の増幅サイクル 35サイクル、並びに 72°Cにて 7分の複加熱とした。 K03ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、約 1.6kbの DNA が増幅される。この PCRで K03ベクターによって相同組み換えを起こした細胞を検出 するとともに、 K02ベクターでの相同組み換えが残っていることも確認した。
[0097] 9. PCR ^クリーニング結果
方法 1では 616個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は 18個であ つた (相同組み換え効率は 2.9%) (図 4)。方法 2では 524個を解析し、そのうち相同組 み換え体と考えられる細胞は 2個であった (相同組み換え効率は約 0.4%)。さらに、方 法 3では 382個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は 7個であった（ 相同組み換え効率は約 1.8%)。
[0098] 10.サザンブロット解析
前述の方法に準じて解析を行った。その結果、解析できた細胞のうち、フコーストラ ンスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を 1つ見出した。第一段階のノック アウトでは、 PCRとサザンブロットの解析結果が一致した力 この第二段階のノックァゥ トでは、一致しなかった。この原因としては、 1.例えば、方法 1で K01、 Κ02のそれぞ れ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在している、 2.フコーストランスポーター 遺伝子が一対 (2遺伝子)ではなく複数対 (あるいは 3遺伝子以上)存在する、 3.第一 段階のノックアウトが成功した細胞株を培養していると、継代中に残ったフコーストラ ンスポーター遺伝子がコピー数を増やすことなどの可能性が考えられた。 [0099] 11.フコースの発現解析
さらに、 PCRで相同組み換え体と判断された 26の細胞におけるフコースの発現を解 析した。 5 μ g/mLの Lens culinans Agglutinin, FITC Conjugate ヽクタ1 ~~フホフトリ ~~ 社 cat. FL- 1041)、 2.5%の FBS、 0.02%のアジ化ナトリウムを含む PBS (以下、 FACS溶 解液と称する） 100 μ 1で 1 X 106個の細胞を氷冷中で 1時間染色した。その後、 FACS 溶解液で細胞を 3回洗浄して FACSCalibur (ベタトンディッキンソン社)で測定を行つ た。その結果、サザンプロット解析でフコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損 していると判断された細胞のみ、フコースの発現が低下していることが明らかになった 。図 5から 7は得られたクローンのサザンブロット解析（図 5)と、フコースの発現を示し た図である。図 6は、 wild/KOの結果を示し、図 7は、 KO/KOの結果を示す。
[0100] 以上の結果より以下のことが判明した。
[0101] フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠失している細胞は 1株しかなぐスクリ 一ユングした数が 616個であったことを考えると、相同組み換えの頻度は約 0.16%と低 い結果になった。第二段階のノックアウトで、 PCRとサザンブロットの解析結果が一致 しなかった理由は、前述のようにいくつか考えられる力 方法 3においては、 2種類の 薬剤で選抜しているため、得られた細胞株が K02ベクター、 K03ベクターのそれぞれ 単独で相同組み換えを起こした細胞が混在しているとは考えられない。また、その他 の PCRで相同組み換えを起こしたと判断された細胞株もすベて、複数の細胞集団か ら構成されて 、るとは考えにく 、。前述のようにフコーストランスポーター遺伝子が 3以 上存在した場合には、細胞におけるターゲッティングは格段に難しくなり、 K01ベクタ 一のような Hyg1"が発現しにくいもの使用し、なおかつ数多くのスクリーニングを行わな V、と相同組み換え体が得られな 、ものと考えられた。
[0102] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[I] 染色体上の両方のフコーストランスポーター遺伝子の発現が人為的に抑制されてい る細胞。
[2] フコーストランスポーター遺伝子が破壊されて 、ることを特徴とする請求項 1記載の細 胞。
[3] 動物細胞である請求項 1または 2記載の細胞。
[4] 動物がチャイニーズノ、ムスター細胞である、請求項 3記載の細胞。
[5] 動物細胞が CHO細胞である請求項 4記載の細胞。
[6] 遺伝子の破壊がジーンターゲテイングベクターを用いた相同組換えにより行われる、 請求項 2から 5のいずれか 1項に記載の細胞。
[7] 外来タンパク質をコードする遺伝子が導入されていることを特徴とする請求項 1から 6 の！ヽずれ力 1項に記載の細胞。
[8] 外来タンパク質をコードする遺伝子が抗体をコードする遺伝子である請求項 7記載の 細胞。
[9] 請求項 1から 8のいずれか 1項に記載の細胞を培養することを特徴とするタンパク質 の製造方法。
[10] タンパク質が抗体である請求項 9記載の製造方法。
[I I] フコースが付加されて 、な 、タンパク質を製造することを特徴とする請求項 10記載の 製造方法。
[12] 細胞を用いて組換えタンパク質を製造する際に、染色体上の両方のフコーストランス ポーター遺伝子の発現を人為的に抑制することを特徴とする、タンパク質へのフコー ス付加阻害方法。
[13] 遺伝子の発現の人為的抑制が、遺伝子を欠損することによる行われることを特徴とす る請求項 12記載のタンパク質へのフコース付加阻害方法。
[14] タンパク質が抗体である請求項 12または 13に記載のタンパク質へのフコース付カロ阻 害方法。
[15] 細胞が CHO細胞である請求項 12から 14のいずれか 1項に記載のタンパク質へのフ コース付加阻害方法。
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