WO2006064591A1 - 基板、及び標的物質の定量方法 - Google Patents

基板、及び標的物質の定量方法 Download PDF

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WO2006064591A1
WO2006064591A1 PCT/JP2005/015581 JP2005015581W WO2006064591A1 WO 2006064591 A1 WO2006064591 A1 WO 2006064591A1 JP 2005015581 W JP2005015581 W JP 2005015581W WO 2006064591 A1 WO2006064591 A1 WO 2006064591A1
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probe
target substance
substrate
concentration
group
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PCT/JP2005/015581
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Jun Kosaka
Junzo Sasaki
Original Assignee
National University Corporation Okayama University
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a substrate and a method for quantifying a target substance such as a gene clear transcript, and more particularly to a substrate that can be used for quantifying a target substance using affinity interaction and a method for quantification.
  • ISH in situ hybridization methods
  • the method comprises: culturing samples of two or more physically distinct cells on at least one substrate, and B. a fixative that preserves and retains nucleic acid within the cell morphology of the cells and the cells.
  • D quantifying the amount of target nucleic acid sequence in morphologically intact cells, which comprises the step of detecting the amount of said probe that hybridizes to said target nucleic acid sequence. Make it special.
  • Patent Document 1 Special Table 2001-509662 Disclosure of the invention
  • the latest use of the in-situ hybridisation protocol has the disadvantage of the technical disadvantage that its effectiveness is limited in the investigation of a large number of genes.
  • the PCR described above is a method that allows detection of nucleic acid in a small amount even if the starting material is used, and is a method that has the sensitivity to know the presence or absence of expression of any gene even at the individual cell level.
  • the quantitative comparison of products etc was difficult in the usual way. In other words, attempts to quantify gene products and transcripts have been reported, including the methods described in the above-mentioned JP-A-2000 1-5 0 9 6 6 2 etc.
  • Deviation was also a relative quantification method, and it was far from the absolute quantification method of how many copies of transcripts and gene products exist. Furthermore, the contents described above are mostly used for the quantification of nucleic acids, and a method for absolutely quantifying not only nucleic acids but also comprehensive target substances such as proteins has been desired.
  • an object of the present invention is to provide a substrate capable of quantifying a target substance as an absolute amount at cellular level, and to provide the quantitative method.
  • the substrate of the present invention is provided with a concentration gradient spot portion having a binding property with a probe and containing a fragment having a plurality of concentration gradients, and a sample containing a target substance having a binding property with the probe. And a sample placement unit.
  • the probe is at least one selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, antigens, antibodies, and peptides.
  • the probe is a nucleic acid.
  • the concentration gradient spot portion is constituted by a plurality of rows.
  • one of the plurality of rows is composed of a sense strand and the other is an antisense strand.
  • the substrate is characterized in that it is glass.
  • the sample is at least one selected from the group consisting of an organ, a tissue, an organ, a cell, an organ system and a cell group to be examined.
  • the target substance is at least one selected from the group consisting of a protein, an antigen, an antibody and a nucleic acid.
  • the target substance is a solid, 53, Ki-67, APC, RB, PTEN, INK4a, pl4, cadherin, ⁇ -catenin, ras, VEGF, NF K B It is characterized in that it is a transcript derived from at least one species selected from the group consisting of
  • a fragment having a binding property with a probe and having a plurality of concentration gradients, an affinity of the fragment and the probe, and an interaction between the fragment and the probe are provided.
  • the method is characterized in that the target substance present in a sample containing a target substance having a binding property to the labeled probe is quantified based on a calibration curve of concentration and intensity obtained by
  • the target substance is quantified by using a laser microscope, a fluorescence microscope, or a fluorescence detector.
  • the sample is at least one selected from the group consisting of an organ, a tissue, an organ, a cell, an organ system and a cell group to be examined. It is characterized by
  • the target substance is at least one selected from the group consisting of a protein, an antigen, an antibody, a peptide and a nucleic acid. .
  • the concentration and intensity obtained by interacting with a probe and a fragment having the plurality of concentration gradients is used to determine the target substance present in a sample containing a target substance having a binding property to the probe based on the standard curve.
  • the affinity interaction between the probe, the fragment having the plurality of concentration gradients and the target substance is carried out integrally. I assume.
  • the quantification method of the present invention there is an advantageous effect that quantification of the gene product is possible at the level of each cell.
  • cancer and tissue all cancer cells are not uniform, and it is considered to be diverse, including the characteristics such as morphology and metastasis. Since all of the diversity is considered to be defined by the gene expression diversity, it is very significant to be able to identify transcripts at each cell level.
  • absolute quantification is carried out for each sample, it is possible to compare with "numerical values" in past samples which were difficult in the conventional relative quantification method. It plays an advantageous effect. Until now, due to differences in conditions between experiments, comparison with past data was difficult because the fluorescence intensity obtained for the same sample was different. According to the method of the present invention, since it is possible to identify as a numerical value how many copies of transcripts are contained per cell, it is possible to make an absolute comparison with past data beyond the time axis.
  • FIG. 1 shows the detection (photograph) of 28S rRNA by ISH using antisense probe (a) and sense probe (b) in rat testis.
  • the bar is 1 mm at (la) and 0.2 mm at (lb)
  • Figure 2 shows the detection of 28S rRNA by ISH using an antisense probe in rat seminiferous tubules (a, c).
  • the image (b, d) (photograph) which divided and displayed each into five steps is shown.
  • bar is 0. lmnio
  • FIG. 3 shows the quantification of the signal.
  • Figure 3a shows the results of rs for rRNA.
  • the fluorescence was developed with TSA-fluorescein.
  • the fluorescence intensity was measured for one cell surrounded by a red line.
  • Fig. 3b shows the cells surrounded by red lines extracted and strongly magnified, and it can be seen that the fluorescence intensity in the cells is nonuniform.
  • the histogram in Figure 3c is on the horizontal axis
  • the intensity (0 to 255) is expressed on the vertical axis taking the absolute frequency. As shown in the table at the bottom of Fig. 3c, frequecny was determined for each intensity, and the range surrounded by the red line was added. It can be seen that intensityl23 has a frequency of 25 pixels. Measurement The conditions are as follows. Argon laser; wavelength 488 nm filter; BP505-5500 ptical Slice; .delta..mu...eta..theta..theta. Depth; 8 bits (0-255).
  • FIG. 4 shows the detection (photograph) of 28S rRNA in ISH using a tyramide signal amplification system in rat testis. antisense probe (a), sense probe (b).
  • FIG. 5 shows the quantitative analysis of 28S rRNA detected in rat spermatogenic cells.
  • the vertical axis shows the amount of rRNA expressed as relative fluorescence intensity, ie, pixel intensity.
  • the developmental process of cells is shown on the horizontal axis from left to right.
  • P-1 is a stagel, indicating a pachytene spermatocyte.
  • Arabic numerals indicate stages of sperm cell differentiation.
  • FIG. 6 shows one embodiment of the substrate of the present invention.
  • the spots were spotted on (1 pmol / xl, 5 pmol / ⁇ l 10 pmol / ⁇ l 50 pmol / u 1 N 100 pmol / ⁇ 1) on a slide glass, and the fluorescence intensity was measured with a microarray scanner, and a bar graph was formed. It shows that the difference in the fluorescence intensity of the spots can be detected as a numerical value on a slide glass. Furthermore, it is shown that the higher the concentration of oligonucleotide, the higher the fluorescence intensity.
  • FIG. 8 shows the correlation between labeling intensity and concentration obtained by affinity interaction of oligonucleotide fragments having multiple concentration gradients with the labeled probe.
  • Absolute Frequency indicates the number of pixels measured in the measurement range of each spot.
  • the fluorescence intensities of the four spots were measured in a circular area of 2209 pixels, which is the same area.
  • the fluorescence intensity (0 to 255) at each pixel is measured, and the value obtained by adding all over 2209 pixels becomes the value of Intensity x Absolute Frequency. 1.
  • FIG. 9 shows a fluorescent image (photograph) of the spot.
  • Fig. 10A for each fluorescence image (photograph) of the spot, the quantification range was selected (range enclosed by red line) to calculate the fluorescence intensity.
  • Fig. 10A shows the analysis range of the O / M oligonucleotide spot that is a blank.
  • Fig. 10B shows the analysis range (photograph) of 1 ⁇ M of oligonucleotide spot.
  • Fig. 10 C shows the analysis range (photograph) of 2 ⁇ M oligonucleotide spot.
  • Fig. 10D shows the analysis range (photograph) of 5 / i M oligonucleotide spot.
  • the oligonucleotide of the negative strand antisense strand is spotted at the same concentration.
  • the substrate of the present invention is a sample for placing a sample containing a concentration gradient spot portion which has a binding property with a probe and contains a fragment having a plurality of concentration gradients, and a target substance having a binding property with the probe. And an installation unit.
  • the concentration gradient spot portion containing fragments having multiple concentration gradients mainly functions to quantify the target substance in the sample. That is, using this concentration gradient spot portion, the interaction between a labeled probe using a fluorescent label or the like and a fragment having various concentration gradients (if the probe is a nucleic acid, hybridization may be performed.
  • the concentration and labeling by Since the correlation with the intensity due to H. can be obtained, the correlation enables absolute quantitation of the target substance extremely strictly as described below.
  • the concentration gradient can be set by the tester according to the purpose of use and application. When this substrate is used for target substance quantification, it is necessary to set a concentration gradient so as to cover the concentration range of the target substance. If the concentration of the target substance is unknown, it is necessary to prepare a sufficiently wide range of concentration gradient spots.
  • probe searcher
  • probe searcher
  • probe means those consisting of nucleic acids, but for example, antibodies, antigens, etc. used in the immunoscreening method etc. are included in the probe in a broad sense. That is, the probe is not particularly limited as long as it can affinitylessly interact with the fragment or the target substance under certain conditions.
  • a substance that interacts with a probe fragment or a target substance a substance having a binding property
  • enzyme-substrate enzyme-substrate
  • coenzyme (coenzyme) -enzyme enzyme-substrate
  • antigen -A large number of antibodies
  • ligand-receptors DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, PNA-DNA, PNA-RNA etc.
  • these can be appropriately selected according to the purpose of use and application.
  • nucleic acid when used as a probe, it will be specifically described as follows.
  • nucleic acids such as synthetic oligonucleotides and naturally-occurring oligonucleotides can be used as the nucleic acid in the concentration gradient spot. It is also possible to use chemically synthesized RNA strands. In the case of DNA, it is usually possible to use a probe in this range, since it can be synthesized to about 120 base and shorter in the case of RNA.
  • the fragment used for the spot and the (labeled) probe are basically compatible with those having identical or complementary sequences, or those in which partial sequences are different. Can.
  • the fragment or target substance having the binding property with the probe if the probe is an enzyme, the fragment or target substance is a substrate, and if the probe is an antibody, the fragment or target
  • the substance may be an antigen protein or antigen peptide, and if the probe is RNA, the fragment or target substance may be RNA, DNA (which has been dissolved in a single strand), and the like.
  • the probe is at least one selected from the group consisting of a nucleic acid, a protein, an antigen, an antibody, a ligand, a receptor, an enzyme, a substrate, and a coenzyme.
  • target transcripts include, but are not limited to, P53 inhibitory oncogene, Ki-67, APC, RB, PTEN, INK4a, pl4, forceherin, 3 -A transcript from at least one species selected from the group consisting of catenin, ras, VEGF, NF / cB, and the like can be mentioned.
  • transcripts mean that all mRNAs as well as rRNAs, tRNAs, hnRNAs and snRAs are included. Furthermore, it also includes those before being processed, including the so-called intron part, before matured RNA is formed. In particular, if rRNA is used as a positive probe, it is preferable from the viewpoint of being able to detect a large amount of any cell type, like poly A and the like.
  • the fragment used for the spot may be a synthetic protein or a synthetic peptide instead of the nucleic acid.
  • in situ hybridization is subjected to immunohistochemical staining, quantification of protein antigens detectable in tissues is also possible.
  • the target substance is a group consisting of MMP, P53 inhibitory oncogene, Ki-67, APC, RB, PTEN, IN 4a, pl4, cadherin, ⁇ -force tenin, ras, VEGF, NF / cB Mention may be made of at least one type of molecule to be selected (in addition to the above transcripts, including proteins derived from such molecules).
  • the sample is not particularly limited, and, for example, ⁇ , tissues, organs, cells, organ systems, cell groups, etc., as well as sections of animals, plants and the like, as well as ⁇ , tissues, organs, cells, organ systems, cell groups and the like.
  • bacteria, fungi, etc., as well as relatively small ones, as well as one mouse and plants are included.
  • plants include fruits and agricultural products such as rice and wheat.
  • the sample placement unit is for fixing the above-mentioned sample to some extent.
  • the substrate of the present invention thus has a concentration gradient spot portion and a sample setting portion, but when the substrate is used for a quantitative method, the concentration gradient spot portion and the sample setting portion As described later, reaction of the fragment and the target substance with the (label) probe can be performed under almost the same reaction conditions, as described later, if Accurate absolute quantification can be ensured.
  • the concentration gradient spot portion is configured in a plurality of rows. When configured in multiple columns, more accurate quantification is possible. As such a row, from the viewpoint of more accurately confirming that the experimental system is operating properly, for example, one of the plurality of rows is composed of a sense strand and the other is an antisense strand. Force is preferred. In this case, for the antisense strand probe, in the spot of the antisense strand, even at high concentration, the fluorescence intensity approaches zero without limit.
  • the substrate body is also not particularly limited, and examples thereof include metals such as titanium, glass, plastics, and those treated with a cell, such as those having a cell adhesion action.
  • metals such as titanium, glass, plastics, and those treated with a cell, such as those having a cell adhesion action.
  • aminosilane forms a coat film by covalent bond with 0H group on the glass surface, and a positive charge is given to the glass surface by the chemically stable amino group. The positive charge allows the tissue sections and cells to adhere strongly.
  • silane treatment MAS coat, poly (1-L-lysine) coat, etc. can be used.
  • glass can be used as a substrate from the viewpoint of using a substrate that does not scatter fluorescence.
  • the method for quantifying a target substance of the present invention based on a calibration curve of concentration and intensity obtained by causing a fragment having a plurality of concentration gradients to interact with the fragment and the labeled probe.
  • the target substance present in the sample containing the target substance having binding properties with the probe is quantified.
  • probe and fragments having multiple concentration gradients interact with each other.
  • label probes and fragments with multiple concentration gradients As described above, for example, enzyme-substrate, coenzyme-enzyme, antigen-antibody, ligand-receptor, DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA, PNA-DNA, PNA-RNA, etc. It can be mentioned.
  • the labeled probe is a labeled probe, which can be labeled using an appropriate labeled substance or the like, and is not particularly limited.
  • labeling substances include fluorescein, digoxigenin (DIG), isotopes, and fluorescent substances such as Cy3 and Cy5. Rhodamine, fluorescein, Cy3, Cy5, Alexa 488, Alexa 546, etc. can be used as the final fluorescent coloring after that.
  • the target substance is quantified by a laser microscope, a fluorescence microscope, or a fluorescence detector.
  • a laser microscope a fluorescence microscope, or a fluorescence detector
  • At least one sample is selected from the group consisting of » tissues, organs, cells, organ systems and cell groups to be examined.
  • the description of the substrate of the present invention can also be referred to for the description of these specimens and the like.
  • the target substance is at least one selected from the group consisting of a protein, an antigen, an antibody, a peptide, a nucleic acid, and a target transcript.
  • the one described in the above-mentioned substrate of the present invention can be applied as it is.
  • the target substance present in a sample containing a target substance having a binding property with the labeled probe can be quantified.
  • substrate of the present invention refer to the above description.
  • the explanation of the method for quantifying a target substance of the present invention can be applied as it is except that the substrate of the present invention is used.
  • affinity interaction in the case of a nucleic acid, a hybridization reaction
  • affinity interaction with the labeled probe, the fragment having the plurality of concentration gradients, and the target substance is performed as one.
  • Can. By integrating in this way, it is possible to perform affinity interactions for calibration curves and affinity interactions between the target substance and the labeled probe under almost the same conditions, whereby Achieve more accurate quantification.
  • the substrate of the present invention is used for the method of quantifying a target substance as described above, for example, when using a nucleic acid as a probe, it is very difficult to make the conditions of ⁇ and ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ It is desirable from the viewpoint of more accurate quantification that tissue be hybridized under the same conditions, and be viewed under a confocal laser microscope under the same conditions. That is, in addition to the fact that the adjustment of the microscope is not easy to align, as the laser decreases its brightness day by day, strictly observing at the same time on the same day Is desirable from the viewpoint of making the condition constant.
  • tissue sample in the vicinity of the concentration gradient spot.
  • the tissue sample and the spot are integrated and in situ hybridized.
  • Normal in situ hybridization is performed on textile and tissue preparations.
  • Normal in situ hybridization In Zeission, the presence or absence of expression of a target gene (usually only gene A in this case) to be amplified to a probe for detection of gene A next to each cell, that is, the presence or absence of mRNA transcribed from DNA, is detected. When mRNA (transcript) is abundant, it is deeply stained, and when it is small, it is faintly stained.
  • the intensity for each can be obtained as a numerical value.
  • the intensity for each spot can also be obtained, and the spot has a concentration (that is, how many synthesized genes are present in the spot), so The number (absolute amount) of target genes present per individual or per dot in the cell is determined.
  • the amount of rRNA hybridized with the probe is highest in the first primary spermatocyte, and then the primary spermatocyte in the pachytene stage, and the spermatocyte in the diploten stage, the second spermatozoa in the final stage, the sperm cell Continue. The lowest levels were reached in the middle, late, late, and early stepl sperm cells of meiosis, and increased slightly during spermatogenesis. Staining rRNA with ISH was an effective parameter for quantitative analysis of mRNA in tissue sections and for evaluating the amount of hybridizable RNA. Therefore, in this experiment, first, for quantitative analysis of the ISH signal, a signal microscope system (PerkinElmer Japan) was used for detection of light signature detection with a light microscope.
  • rRA ribosomal RNA
  • Nucleotide sequence of rat 28S rRNA (Accession No. # V01270; nucleotide No. 6035-6068, 5 '-gccgccgcaggctgcagatcttggtggtagtagca-3', 34 mg), Yoshii et al, (1995) (Yoshii A) Journal of Histochemistry and Cytochemistry 43: 321-327.) rRNA previously reported by Ohji et al., Koji T, Ohsawa N, Nakane PK (1995) in situ localization of ribosomal RNAs is a reliable reference for hybridizable RNA in tissue sections.
  • oligonucleotide probe 34-mer
  • This product was obtained by asking Takara Bio Inc., Japan for synthesis. We will call this DIG probe.
  • DIG probe As a control experiment, was use ⁇ the random sequences are not labeled the probe and DIG-labeled / This oligonucleotide in 34mer 0
  • DIG labeled probe was prepared as follows using the multilabeling method previously reported by us (Sasaki et al. 1998; Mori et al. 2001).
  • the restriction enzyme recognition site of EcoRI or Hindlll is attached to the protruding end (all 40-mer) of ense (op-aattcgccgccgccagcgtaggcagatctggtggtggtagtaga-a-3) and antisense (5 p-agctt-tgctactaccagatagtctgcacctgcggggggg-353 Phosphorylated at the 5 'end with oligonucleotides and further annealed
  • I made an oligonucleotide. This was obtained by commissioning a vendor to synthesize as a freeze-dried product. These were ligated to plasmid pBluescriptl KS (-), ligated to pBluescript lKS (-), transformed E. coli DH5a strain, E. coli strain having the desired plasmid was subcloned, and plasmids were isolated and purified. ] Subcloning. The plasmid DNA obtained by this operation can be linearized with restriction enzymes EcoRI or Hindlll, and this is used as a template [template] for the synthesis of sense and antisense riboprobe which is labeled. Roche RNA Labeling Kit (Roche).
  • RNA synthetase T3 / T7 RNA polymerase was synthesized in the presence of DIG-UTP of Diagnostics; Mannheim Germany), and DIG-labeled riboprobe was synthesized by transcription in vitro. After DNase treatment, the product was ethanolol precipitated, and the precipitate DIG-labeled probe was resuspended in the hybridization mixture. The hydrolysis after DNase treatment was omitted because the probe is shorter than 100-mer. These probes are called ML probes here.
  • the antibody was synthesized by in vitro transcription using T3, T7 RNA polymerase in the presence of DIG-UTP according to the instructions enclosed in the product of Diagnostics; annheim, Germany). After DNase treatment, the product was ethanol precipitated, and the pellet was subjected to hybridization mixture.
  • Sections were deparaffinized with toluene and ethanol, followed by 1 ⁇ g / ml proteinase K addition in Tris-HC1 buffer (pH 7.5) containing 0.2 N HC1 treatment and 20 mM CaCl 2
  • the protein is treated with protein, followed by treatment with Dulbecco's PBS supplemented with 2 mg / ml glycine.
  • Acetylated was obtained by adding 0.25% acetic anhydride to triethanololamine ((8 ⁇ 0).
  • Hybridization It 50% formamide, 2 X SSC :, 1 mg / ml thigh, 0.5 mg / ml sonicated salmon sperm DNA, 2 mg / ml bovine serum albumin ⁇ 10% dextran sulfate ⁇ : ribop: robe ( 20 / i L of the hybridization mixture containing ⁇ 2 jU g / ml) was placed on a slide and carried out at 45 ° C. for 16 hours in a wet box. Next, the plate was washed three times for 20 minutes each at 45 ° C. with 2 ⁇ SSC and 50% formamide.
  • alkaline phosphatase-conjugated anti-DIG (1: 2500) was placed on the section and kept at room temperature for 2 hours.
  • enzyme-catalyzed color change was performed with 5-bromo-4-chloro-3-indyl phosphate and nitroblue tetrazolium salt as per kit instructions.
  • the sections were counterstained with methyl green and observed with a light microscope.
  • the stained sections were observed with a Zeiss Confocal Laser Scanning microscope (LSM510) using a Plan-Neofluor 40X / 0.75 lens.
  • the signal strength of the cytoplasm of each spermatogenic cell was measured by the software for LSM510. Histograms of signal intensity were obtained from the cytoplasmic region of the spermatogenic cells of interest. The area was bounded to limit the area (Fig. 3a), extracted (Fig. 3b), converted to a table (Fig. 3c), and then transferred to the Excel spread sheet. Signal intensities were calculated and calculated as the average of pixel intensities (0-255). The detector gain was reduced enough so that there was no pixel showing the maximum intensity.
  • Figure 4a shows a rat testis that has been hybridized with the rRNA antisense probe.
  • FIG. 4 b shows rat testis hybridized with rRNA sense probe, and no specific signal was observed.
  • RNA signal it is most important to quantify the RNA signal that the signal in the seminiferous tubules is uniform.
  • Spermatogenic cells of the same developmental stage adjacent to each other are required to express the same amount of rRNA.
  • the average value of intensity per pixel in each cytoplasm can be obtained, and the result is shown in FIG.
  • the signal intensity in the cytoplasm of each spermatogenic cell is It represents the average value of intensity per pixel.
  • the primary spermatocytes were 147-166, the spermatogonia in the diplothenic phase 125, the secondary spermatocytes 108, and the sperm cells 53-135. It was 68-70 in the middle, late, late, and early stepl sperm cells of meiosis. The amount of rRNA in these spermatogenic cells was consistent with previous data in this study. There were various problems to be overcome in quantifying mRNA in tissue sections. The first question is whether there is a continuous relationship (proportional relationship) between the probe concentration and the signal intensity of ISH. The next question is whether the number of probe molecules per unit area or cell accurately reflects the amount of cytoplasmic mRNA.
  • the substrate of the present invention was made.
  • a slide glass was used as a substrate.
  • a spotter spot the diluted series of DNA, RNA, and oligonucleotides with different concentration conditions on the slide glass for the gene you want to investigate, using the existing microarray slide. Since a circle of the same size (diameter 220 ⁇ ) can be spotted without 1 n L deviation, it is possible to calculate how many copies of the nucleic acid molecule are contained on the spot.
  • FIG. 6 shows one embodiment of the substrate of the present invention. Perform in situ hybridization with the dilution series spot and the section together. For the gene to be examined, we created a Digoxigenin-labeled c RNA probe, anti-digoxigenin, antibody-peroxidase conjugated and TSA—
  • Fluorescence intensities of sections and dilution series spots are measured with a confocal laser microscope (Carl Zeiss, LSM510, etc.). By comparing the fluorescence intensities of dilution series spots, the fluorescence intensities of the cells desired to know on the tissue section are compared, and it is identified how many copies of each cell have transcripts.
  • FIG. 7 shows the correlation between the labeled intensity and the concentration of the labeled fragment, which is a fragment having multiple concentration gradients. Such standard curve can be used to compare and examine the fluorescence intensity of one cell on the section.
  • Fig. 8 Force S shows a calibration curve obtained by affinity interaction of a fragment having multiple concentration gradients with a labeled probe.
  • Fig. 10 shows the analysis range of the blank 0 ⁇ m oligonucleotide spot.
  • Fig. 10 (2) shows the analysis range of 1 ⁇ m, Fig. 10 (3) shows 2 ⁇ m, and Fig. 10 (4) shows the analysis area of 5 ⁇ m oligonucleotide spot.
  • the oligonucleotide of the antisense strand as a negative control is spotted at the same concentration. These are not blank, and if the experiment is performed correctly, the antisense spot of any concentration does not show affinity interaction with the antisense labeled probe.
  • a concentration gradient slide was created according to the embodiment of the substrate of FIG. As a result of these, the following has become possible. That is, for quantification of transcripts of specimens such as cancer cells, sections of cancer tissues obtained by surgery and biopsy are considered to indicate the malignancy of cancer,
  • the expression levels of MMP, Dodherin, and P53-suppressed oncogene can be quantified at cell level as an absolute amount to predict the prognosis, or can be used for the determination of therapy as part of tailor-made medicine.
  • tissue sections has the advantage of being able to quantify the transcripts of any gene, in addition to conventional histopathological diagnosis.
  • the number of copies of can be made to correspond.
  • the diagnosis of malignancy of cancer that has been neglected in the hands of pathologists can be represented by numerical values such as quantification of gene products. That is, it is possible to determine the degree of evil 14 without training of a pathologist.
  • Pathological examination is not limited to the examination of cancer, and it is a technology that can not fail to diagnose many intractable diseases such as autoimmune diseases.
  • the number of pathologists is small, and it takes much time and effort for pathological diagnosis.
  • the expression status of genes involved in the pathological condition can be expressed at the cellular level as “numerical values” in addition to the histopathology examination of a pathologist, it is considered to be very socially significant.
  • the size of individual and fish may differ due to the difference in monthly age and the difference in the feed given. It has been difficult to perform quality assays by quantifying gene products in a method.
  • the size of individual or tissue is different, if the same species, the size of each cell is the same, tissue sections are prepared, and each cell is It is extremely advantageous to be able to quantify the difference between the absolute amounts of any gene product.

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Abstract

本発明は、細胞レベルで絶対量として標的物質を定量することを可能とする基板、及び当該定量方法を提供することにある。本発明の基板は、プローブと結合性を有し、かつ複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配スポット部と、前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本を設置するための標本設置部とを有することを特徴とする。

Description

基板、 及び標的物質の定量方法 技術分野
本発明は、 基板、 及び遺伝子明転写産物など標的物質の定量方法に関し、 特に、 ァフィ二ティ一相互作用を利用した標的物質の定量に用いることが可能な基板、 及び定量方法に関する。 田
背景技術
一般的に、 遺伝子発現の従来解析として、 ノーザンブロット、 スロットおよび ドットブロット、 R N a s eプロテクション定量法、 R T— P C Rなどを挙げる ことができる。 また、 一定のァフィ二ティー相互作用を利用した同定法として、 免疫スクリーニング法なども採用されている。
さらに、 組織学的および細胞学的試料について in situハイブリダィゼーシ ヨン法 （ISHともいう） は、 R NA発現の研究や正常おょぴ疾病状態における特 異的遺伝子の役割を認識するための有益な手段である。
このような例として、 細胞内の mRNAを定量するための in situハイブリダィ ゼーション法がある（特表 2001-509662)。 この方法は、 少なくとも 1つの基材 上で、 2以上の物理的に区別される細胞の試料を培養し、 B.該細胞の細胞形態内 に核酸を保存し保持する固定液と該細胞とを接触させ、 C.それにより、 標識化核 酸プローブが形態学的に無傷の細胞を透過し、 標的核酸配列とハイブリダィズす る条件下で、 該標識ィヒ核酸プローブに固定された細胞を暴露し、 ついで、 D. 該 標的核酸配列にハイプリダイズする該プローブの量を検出する、 工程を含むこと を特徴とする、 形態学的に無傷の細胞において、 標的核酸配列の量を定量するこ とを特 ί敫とする。
特許文献 1 特表 2001-509662 発明の開示
し力 しながら、 上記ノーザンブロット、 スロッ トおよびドットブロット、 R N a s eプロテクション定量法、 R T— P C Rなどの技術の各々は、 m R NA発現 レベルの変化を調べるための扱いにくいプロ トコルがあり、 定量性の欠如、 低感 受性および不適切な再現性の欠点を有している。 さらに、 これらのアプローチの 各々には、 解析前に標的 mR NAプールの単離と操作を必要とする。 これらの要 因は、 試料処理量を厳格に限り、 解析時間を増加させ、 信頼性を減少させるとい う問題点を有する。
また、 上述の i n s i t u ハイプリダイゼーシヨン法においては、 i n— s i t u ハイブリダィゼーシヨンプロトコルの最新の利用は、 多数の遺伝子の調 査において、 その有効性が限られるという技術的短所を欠点として有している。 上記 PCRは、 出発材料がもつとも少量で核酸検出が可能な方法であり、 細胞一 個一個のレベルでも任意の遺伝子の発現の有無を知る感度を備えている方法であ るが、 遺伝子産物、 転写産物等の量的な比較は通常の方法では難しかった。 すな わち、 上記特表 2 0 0 1 - 5 0 9 6 6 2などに記載の方法を含め、 遺伝子産物、 転写産物の定量化の試みはレ、くつか報告されているが、 レ、ずれも相対的な定量方 法であって、 転写産物が何コピーあるか、 遺伝子産物がいくつ存在するかという 絶対的な定量方法には程遠かった。 さらに、 上述の内容は、 核酸の定量に用いら れることがほとんどであり、 核酸のみならず、 タンパク質など総合的な標的物質 の定量を、 絶対的に行う方法が望まれていた。
そこで、 本発明の目的は、 細胞レベルで絶対量として標的物質を定量すること を可能とする基板、 及び当該定量方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
上記目的を達成するために、 発明者らは、 ァフィ二ティー相互作用について着 目し、 鋭意研究を重ねた結果、 本発明の基板、 及び定量方法を見出すに至った。 すなわち、 本発明の基板は、 プローブと結合性を有し、 かつ複数の濃度勾配を 有する断片を含む濃度勾配スポット部と、 前記プローブと結合性を有する標的物 質を含有する標本を設置するための標本設置部とを有することを特徴とする。 また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 前記プローブが、 核酸、 タ ンパク質、 抗原、 抗体、 ペプチドからなる群から選択される少なくとも 1種であ ることを特徴とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 前記プローブが、 核酸であ ることを特徴とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 前記濃度勾配スポット部が、 複数の列で構成されていることを特徴とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 前記複数の列のうち、 一方 がセンス鎖、 他方がアンチセンス鎖で構成されることを特徴とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 基板が、 ガラスであること を特敫とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 前記標本が、 調査したい臓 器、 組織、 器官、 細胞、 器官系、 細胞群からなる群から選択される少なくとも 1 種であることを特徴とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 前記標的物質が、 タンパク 質、 抗原、 抗体、 核酸からなる群から選択される少なくとも 1種であることを特 徴とする。
また、 本発明の基板の好ましい実施態様において、 標的物質が、 剛 Ρ、 Ρ 5 3、 Ki-67、 APC、 RB、 PTEN、 INK4a、 pl4、 カドヘリン、 β—カテニン、 ras、 VEGF、 NF K Bからなる群から選択される少なくとも 1種由来の転写産物であることを特 徴とする。
また、 本発明の標的物質の定量方法は、 プローブと結合性を有し、 かつ複数の 濃度勾配を有する断片と、 当該断片と前記プロ一ブとをァフィ二ティ一相互作用 させることにより得られた濃度と強度の検量線に基づき、 前記標識プロ一ブと結 合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量すること を特徴とする。
また、 本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、 前記標的物 質の定量を、 レーザー顕微鏡、 蛍光顕微鏡、 又は蛍光検出器により行うことを特 徴とする。
また、 本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、 標本が、 調 査したい臓器、 組織、 器官、 細胞、 器官系、 細胞群からなる群から選択される少 なくとも 1種であることを特徴とする。
また、 本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、 前記標的物 質が、 タンパク質、 抗原、 抗体、 ペプチド、 核酸からなる群から選択される少な くとも 1種であることを特徴とする。
また本発明の標的物質の定量方法の別の側面において、 上記本発明の基板を用 いて、 プローブと、 前記複数の濃度勾配を有する断片とァフィ二ティー相互作用 させることにより得られた濃度と強度との検量線を作成し、 当該検量線に基づき、 前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物 質を定量することを特徴とする。
また、 本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、 前記プロ一 ブと、 前記複数の濃度勾配を有する断片及び前記標的物質とのァフィ二ティー相 互作用を、 一体として行うことを特徴とする。
発明の効果
本発明の定量法によれば、 細胞一個一個のレベルで、 遺伝子産物の定量化が可 能であるという有利な効果を奏する。 癌糸且織では、 すべての癌細胞が均一ではな く、 形態や転移性などの性質を含めて多様性があるものとされている。 その多様 性は、 すべて、 遺伝子発現の多様性により規定されていると考えられるため、 細 胞一個一個のレべ で転写産物を同定できることは大変意義深い。 また、 本発明によれば、 標本一枚一枚について絶対的な定量化を行うことから、 従来の相対的な定量ィヒでは難しかった過去の標本における 「数値」 との比較も可 能となるという有利な効果を奏する。 これまでは、 実験ごとの条件の差により、 同じ標本でも得られた蛍光強度が異なるために、 過去のデータとの比較は困難で あった。 本発明の方法によれば、 細胞一個につき何コピーの転写産物が含まれる かが数値として同定できるため、 時間軸を超えて過去のデータとの絶対的比較も 可能となる。
すなわち、 従来型の相対的な定量方法においては、 1回 1回の実験により、 実 験条件が微妙に異なるので、 複数回の実験結果を比較することができない。 是に 対して、 本発明の標的物質の定量方法においては、 一枚一枚の標本について検量 線 (標準曲線）を作成して、 絶対量が定量化することができるので、 実験条件のば らつきの問題も克服することができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 ラット精巣における antisenseプローブ（a)、 senseプローブ（b)を用い た ISHでの 28S rRNAの検出（写真）を示す。 barは （la) で 1· 0mm、 （lb)で 0. 2mmo 図 2は、 ラット精細管における antisenseプローブを用いた ISHでの 28S rRNA の検出 (a，c)。 それぞれを 5段階に分けて表示した画像 (b，d) (写真）を示す。 bar は 0. lmnio
図 3は、 シグナルの定量化を示す。 図 3 aは、 rRNAの ISHの結果を示す。 TSA - fluoresceinで蛍光発色した。 赤線で囲った細胞一個について蛍光強度を測定し た。 図 3 bは赤線で囲った細胞を抜き出して強拡大にしたものであり、 細胞内の 蛍光強度は不均一であることが判る。 図 3 cのヒストグラムは、 横軸に
intensity (0〜255) を縦軸に absolute frequencyを取って表した。 図 3 cの下 の表で表すように、 各 intensityについて frequecnyを求め赤線で囲んだ範囲す ベてを加算した。 intensityl23は、 25pixelの frequencyがあることが判る。 測 定条件は以下のようである。 アルゴンレーザー；波長 488nmフィルター； BP505- 5500ptical Slice ; Ι. δ μ ιηΡίχθΙ depth; 8 bit (0—255)。
図 4は、 ラット精巣での tyramide signal amplification systemを用いた ISH での 28S rRNAの検出 （写真） を示す。 antisenseプローブ（a)、 senseプローブ (b)。
図 5は、 ラットの精子形成細胞で検出された 28S rRNAの定量解析を示す。 縦軸 は相対的な蛍光強度として発現された rRNAの量、 すなわちピクセル強度を示し ている。 細胞の発生過程は左から右へ横軸に示している。 P- 1は stagelでパキ テン期の精母細胞を示している。 アラビア数字は精子細胞の分化の段階を示して いる。
図 6は、 本発明の基板の 1実施態様を示す。
図 7は、 オリゴヌクレオチドに fluoresceinを直接ラベルし、 種々の濃度
(lpmol/ x l、 5 pmol/ μ l 10 pmol/ μ l 50 pmol/ u 1N 100 pmol/ μ 1) でスフ イドガラス上にスポットし、 マイクロアレイスキャナーで、 蛍光強度を計測し、 棒グラフにした。 スライドガラス上で、 スポットの蛍光強度の差が数値として検 出できることを示す。 さらに、 オリゴヌクレオチドの濃度が高くなればなるほど、 蛍光強度が大きくなることを示す。
図 8は、 複数の濃度勾配を有するオリゴヌクレオチド断片と、 標識プローブとの ァフィ二ティ一相互作用によつて得られた標識強度と濃度との相関関係を示す。 Absolute Frequency とは、 各スポッ トの測定範囲の測定画素数 （pixel) を示す。 4つのスポットは、 すべて同じ面積である 2209pixelの正円形の範囲で蛍光強度 が測定された。 各 pixelにおける蛍光強度 (0〜255) を測定し、 2209pixelにつ いてすベて加算した値が、 Intensity x Absolute Frequencyの値となる。 1.
のスポッ トの蛍光強度は、 Ι. Ο μ Μの蛍光強度から Ο μ Μの蛍光強度を引いた値 82042-34459=47583とした （表の右端のカラム） 。 2. 0 Μ、 5· 0 μ Μのスポットに ついても同様に計算し、 棒グラフとした。 1. 0 Mスポットについて計算を進め る。 1. O ju Mスポットの 2209pixelの蛍光強度の平均値は、 lpxelあたり
47583/2209=21. 5405となる、 1. Ο μ Μのオリゴヌクレオチドが、 2209pixelの範 囲にスポットされているので、 1· 0μ Μ/2209=0. 0004526 μ Μ=
0. 4526nM=453pM/pixelとなる。 従って、 21. 5405/pixelの蛍光強度は、
453pM/pixelの濃度の標的オリゴヌクレオチドの蛍光強度であると類推できる。 図 9は、 スポットの蛍光像 (写真）を示す。
図 1 0 Aは、 スポットの各蛍光像 (写真）について、 蛍光強度を計算によって求め るため、 定量化範囲を選択した （赤色の線で囲んだ範囲） 。 図 1 0 Aは、 ブラン クである O / Mのオリゴヌクレオチド ·スポットの解析範囲を示す。
図 1 0 Bは、 1 μ M、 のオリゴヌクレオチド ·スポットの解析範囲（写真）を示す。 図 1 0 Cは、 2 μ M、 オリゴヌクレオチド ·スポットの解析範囲（写真）を示す。 図 1 0 Dは、 5 /i Mのオリゴヌクレオチド ·スポットの解析範囲（写真）を示す。 各スポットの左隣には、 陰性対照であるアンチセンス鎖のオリゴヌクレオチドが 同じ濃度でスポットされている。 これらはブランクではなく、 実験が正しく行わ れていれば、 antisenseの標識プローブに対して、 あらゆる濃度の antisenseの スポットはァフィニティ一相互作用を示さない。 図 6の基板の実施形態により濃 度勾配スライ ドを作成した。 ，
発明を実施するための最良の形態
本発明の基板は、 プローブと結合性を有し、 かつ複数の濃度勾配を有する断片 を含む濃度勾配スポット部と、 前記プローブと結合性を有する標的物質を含有す る標本を設置するための標本設置部とを有する。 複数の濃度勾配を有する断片を 含む濃度勾配スポット部は、 主として、 標本中の標的物質を定量するために機能 する。 すなわち、 この濃度勾配スポット部を利用して、 蛍光標識などを使用した 標識プローブと種々の濃度勾配を有する断片とをァフィ二ティ一相互作用（プロ ーブが核酸であれば、 ハイブリダィゼーシヨン）させることにより、 濃度と標識 による強度との相関関係を得ることができるので、 当該相関関係から、 以下に述 ベるように極めて厳密に標的物質の絶対的定量が可能となる。
濃度勾配は、 使用目的、 及び用途に応じて、 適宜試験者が設定することができ る。 本基板を標的物質の定量に用いる場合には、 標的物質の濃度範囲を包括して 含まれるように濃度勾配を設定することが必要である。 標的物質の濃度が未知で ある場合、 十分広範な範囲の濃度勾配スポットを準備する必要がある。
ここで 「プローブ」 （探索子）とは、 広義の意味で使用する。 通常、 核酸から成 るものを意味するが、 例えば、 免疫スクリーニング法などにおいて、 使用される 抗体、 抗原などもプローブに含めて広義に解釈する。 つまり、 プローブとは、 断 片又は標的物質と、 一定の条件下で可逆的にァフィニティ一相互作用するもので あれば、 特に限定されない。 例えば、 このような組み合わせ、 すなわち、 プロ一 ブー断片又は標的物質とァフィ二ティー相互作用する物質 (結合性を有する物質） を例示すれば、 酵素—基質、 助酵素 (補酵素）—酵素、 抗原—抗体、 リガンドーレ セプター、 DNA— DNA、 DNA— RNA、 RNA— RNA、 PNA—DNA、 PNA— RNAなど多数挙げ ることができる。 本発明において、 これらを使用目的、 用途に応じて適宜選択す ることができる。
また、 プローブとして核酸を用いた場合に、 具体的に説明すると以下のようで める。
例えば、 濃度勾配スポット部の核酸は合成オリゴヌクレオチド、 天然由来のォ リゴヌクレオチドなど種々のものを用いることができる。 化学合成した RNA鎖を 使うことも可能である。 通常、 DNA の場合、 合成できるのは、 120base程度まで、 RNA の場合もっと短くなるので、 この範囲のプローブを用いることが可能である。 もし、 それより長いものをスポットするには、 自前の templateから、 R Aを酵 素反応によって、 in vitro transcriptionする力 DNAの場合は、 プラスミドの 形で増やして、 制限酵素で断片を直線ィ匕することにより、 行うことができる。 化学合成するのも、 また酵素で切り出したり、 in vitro transcriptionする 際に使う、 templateも、 プローブを DIGラベリングする際につかう templateそ のものを使用する場合が多いので、 スポット部に使用する核酸などの断片と標識 プローブとは、 同一であることが原則である。 この範囲のプローブを用いること が可能である。 ただし、 同一といっても、 RNAの場合、 合成オリゴヌクレオチド の場合は、 sense、 antisenseの違いがあるので、 同一とは、 厳密には 「相補 的」 を意味する。 また、 2本鎖 DNAの場合は、 denaturationして、 1本鎖にする 必要がある。
敢えて、 異なった配列を合成し、 スポットすると言うケースが想定されるのは、 例えば、 プローブにしている分子 Aと、 homologyのある分子を探す目的で、 stringencyを下げて、 ハイブリダィズするケースであるが、 in situハイプリ ダイゼーシヨンでは、 そのようなケースは稀である。
したがって、 本発明においては、 スポットに使用する断片と （標識） プローブ とは、 原則的に同一、 または相補的な配列をもったもの、 または、 一部配列が異 なっているものでも適応することができる。
そして、 プローブと結合性を有する断片又は標的物質とは、 上述の組み合わせ に記載したように、 プローブが酵素であれば、 断片又は標的物質は基質、 プロ一 ブが抗体であれば、 断片又は標的物質は抗原タンパク質又は抗原ペプチド、 プロ ーブが、 RNAであれば、 断片又は標的物質は、 RNA、 DNA (—本鎖に解いたもの）な どを挙げることができる。 好適には、 前記プローブが、 核酸、 タンパク質、 抗原、 抗体、 リガンド、 レセプター、 酵素、 基質、 補酵素からなる群から選択される少 なくとも 1種である。 プローブが、 核酸であれば、 標本からの組織切片などに含 まれる転写産物の定量が可能となる。 すなわち、 もしプローブとして、 RNAを用 いれば、 その標的転写産物の定量が可能となる。 例えば、 標的転写産物としては、 匿、 P 5 3抑制癌遺伝子、 Ki-67、 APC、 RB、 PTEN、 INK4a、 pl4、 力ドへリン、 3 —カテニン、 ras、 VEGF、 NF /c Bからなる群から選択される少なくとも 1種由来 の転写産物などを挙げることができる。
また、 転写産物とは、 mRNAはもちろんのこと、 rRNA、 tRNA、 hnRNA、 snR Aも すべて含むという意味である。 さらに言えば、 matured RNAが形成される前の、 いわゆるイントロンの部分も付いたプロセッシングされるまえのものをも包含す る。 特に、 rRNAを陽性のプローブとして使用すれば、 poly Aなどと同様に、 ほ ぼすベての細胞種で大量に検出できるという観点から、 好適である。
以上、 核酸を主として説明したが、 スポットに用いる断片は、 核酸ではなく、 合成タンパク質、 合成ペプチドを使ってもよい。 この場合、 in situハイブリダ ィゼーシヨンを、 免疫組織化学染色にすれば、 組織中で検出できる蛋白質抗原の 定量化も可能である。
また、 標的物質としては、 MMP、 P 5 3抑制癌遺伝子、 Ki- 67、 APC、 RB、 PTEN、 IN 4a、 pl4、 カドヘリン、 β—力テニン、 ras、 VEGF、 NF /c Bからなる群から選 択される少なくとも 1種の分子（上記転写産物のほか、 当該分子由来のタンパク 質等を含め）を挙げることができる。
ここで、 標本とは、 特に限定されるものではなく、 例えば、 調査したい β、 組織、 器官、 細胞、 器官系、 細胞群などの切片はもちろん、 動物、 植物個体その ものでもよレ、。 例えば、 細菌、 カビなど比較的小さいものから、 マウス一匹のほ か、 植物をも含まれる。 植物としては、 例えば果物や、 稲、 麦などの農業生産物 などを挙げることができる。 標本設置部は、 上記標本をある程度固定ィヒさせるた めのものである。 本発明の基板においては、 このように、 濃度勾配スポット部と、 標本設置部とを有しているが、 当該基板を定量方法に用いた場合に、 これ濃度勾 配スポット部及び標本設置部とが同一面 (平面である必要はない）上にあれば、 後 述するように、 断片及び標的物質の、 （標識） プローブとの反応を、 ほぼ同一の 反応条件下で行うことができ、 より精密な絶対的定量を確実にすることができる。 また、 本発明の基板の実施態様において、 前記濃度勾配スポット部が、 複数の 列で構成されている。 複数列で構成されていると、 より精密な定量を可能とする。 このような列として、 実験系が正常に動作していることをより正確に確認すると いう観点から、 例えば、 前記複数の列のうち、 一方がセンス鎖、 他方がアンチセ ンス鎖で構成されること力 好ましい。 この場合、 アンチセンス鎖のプローブに ついては、 アンチセンス鎖のスポットでは、 濃度が高いところでも蛍光強度は限 りなくゼロに近くなる。
基板 体についても特に限定されず、 例えば、 チタン製などの金属製、 ガラス 製、 プラスチック製のもの、 シラン処理されたものなど、 細胞接着作用を有する ものを挙げることができる。 例えば、 アミノシランは、 ガラス表面の 0H基と共 有結合によりコート膜が形成され、 ガラス表面に化学的に安定なアミノ基による 正電荷が付与される。 その正電荷により組織切片や細胞を強力に接着させること ができる。 シラン処理のほか、 MASコート、 ポリ一 L一リジン 'コートなどを使 用することができる。 細胞標本の微細形態を蛍光顕微鏡で観察する場合に、 なる ベく蛍光が散乱しない基板を用いるという観点から、 基板としては、 ガラスを挙 げることができる。
次に、 本発明の標的物質の定量方法について説明する。
すなわち、 本発明の標的物質の定量方法は、 複数の濃度勾配を有する断片と、 当該断片と標識プローブとをァフィ二ティー相互作用させることにより得られた 濃度と強度の検量線に基づき、 前記標識プローブと結合性を有する標的物質を含 有する標本中に存在する前記標的物質を定量する。
ここで、 「複数の濃度勾配を有する断片」 、 「標的物質」 、 「標本」 など定量 方法で用いられる用語の定義、 説明については、 上記の本発明の基板において説 明したものをそのまま本定量方法において用いることができる。
プローブと、 複数の濃度勾配を有する断片とは、 両者がァフィ二ティ相互作用 することが前提となる。 （標識） プローブと複数の濃度勾配を有する断片との例 については、 上述したとおり、 すなわち、 例えば、 酵素—基質、 助酵素一酵素、 抗原一抗体、 リガンド—レセプタ一、 DNA— DNA、 DNA-RNA, RNA-RNA, PNA— DNA、 PNA-RNAなど多数挙げることができる。
標識プローブとは、 プローブを標識化したものであり適当な標識物質などを用 いて、 標識化することができ、 特に限定されることはない。 標識物質としては、 フルォレセイン、 ジゴキシゲニン（DIG)、 アイソトープ、 Cy 3、 Cy 5などの蛍光 物質を挙げることができる。 その後の最終的な蛍光発色として、 ローダミン、 フ ルォレセイン、 Cy 3、 Cy 5、 Alexa488、 Alexa546等を用いることができる。
また、 本発明の標的物質の定量方法において、 好適には、 前記標的物質の定量 を、 レーザー顕微鏡、 蛍光顕微鏡、 又は蛍光検出器により行う。 このような定量 をレーザー顕微鏡、 蛍光顕微鏡、 又は蛍光検出器により行うことで、 必ずしもァ イソトープを使用する必要がなく、 低コスト化を達成し、 例えば、 病院などにお いても利用することが可能である。 また、 これらを最終的に用いることにより、 定量ィ匕される細胞が、 組織上のどの位置に存在する細胞であるかといった 2次元 位置情報を含めたデータを得ることができる点、 有利である。 これは、 病理標本 の診断においても使用することができる。
また、 本発明の標的物質の定量方法の好ましい実施態様において、 標本が、 調 査したい »、 組織、 器官、 細胞、 器官系、 細胞群からなる群から選択される少 なくとも 1種を挙げる。 これらの標本に関する説明等についても、 上記本発明の 基板における説明を参照することができる。 また、 好ましい実施態様において、 前記標的物質が、 タンパク質、 抗原、 抗体、 ペプチド、 核酸、 標的転写産物から なる群から選択される少なくとも 1種である。 標的物質についても、 上述の本発 明の基板において説明したものをそのまま適用することができる。
本発明の標的物質の定量方法の別の側面において、 上記本発明の基板を用いて、 標識プローブを、 前記複数の濃度勾配を有するプローブとァフィ二ティー相互作 用させることにより得られた濃度と強度との検量線を作成し、 当該検量線に基づ き、 前記標識プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在する前 記標的物質を定量することができる。 「本発明の基板」 については、 上記説明を 参照されたい。 本発明の基板を使用すること以外は、 上記本発明の標的物質の定 量方法における説明をそのまま適用することができる。
好ましい実施態様において、 前記標識プローブと、 前記複数の濃度勾配を有す る断片、 及び前記標的物質とのァフィ二ティ相互作用 (核酸の場合には、 ノ、イブ リダィゼーシヨン）を、 一体として行うことができる。 このように一体として行 うことにより、 ほぼ同一の条件下で、 検量線用のァフィ二ティー相互作用と、 標 的物質と標識プローブとのァフイエティー相互作用とを行うことができ、 これに よって、 より精密な定量を実現する。
また、 上述のように本発明の基板を標的物質の定量方法に用いた場合には、 例 えば、 核酸をプローブとして用いた場合、 ノ、イブリダィズの条件を揃えることが 大変難しいので、 スポット部と組織を同じ条件で、 ハイブリダィズし、 同じ条件 で、 共焦点レーザー顕微鏡でみることが、 より正確な定量を行う観点から望まし レ、。 というのは、 顕微鏡の方の調節も揃えるのは簡単ではないことに加え、 レー ザ一は、 日に日に、 その明るさを減じていくので、 厳密には、 同日同時刻に観察 することが条件を一定にするという観点から望ましいからである。
以上、 プローブとして核酸を用いた場合の例を挙げて、 本発明の標的物質の定 量方法の一実施態様を説明すると以下のようである。
( 1 ) まず、 予め調査したい遺伝子 （ここでは遺伝子 Aとする） の遺伝子配列 (cDNA配歹 IJ)のうち、 一部分、 概ね 20〜50baseの長さのもの （他の遺伝子と相同 性のない、 特異性の高い部分） を化学合成し、 種々濃度で、 スライ ドガラスにス ポットする。 これを濃度勾配スポット部と呼ぶことができる。
( 2 ) 濃度勾配スポッ トの近傍に、 組織標本を貼り付ける。 その組織標本と、 ス ポットを一体として、 in situハイプリダイゼーシヨンする。 通常の in situハ ィブリダイゼーションは、 糸且織標本に対して行う。 通常の in situハイブリダイ ゼーシヨンでは、 細胞一個一個についで、 遺伝子 Aを検出ためのプローブにハイ プリする標的遺伝子 （ここでは通常、 遺伝子 Aのみ） の発現の有無、 つまり、 DNAから転写された mRNAの有無を検出し、 mRNA (転写産物） が多い場合は濃く 染まり、 少ない場合は薄く染まるようになつている。
( 3 ) in situハイプリダイゼーションの遺伝子発現の有無を検出する最後の発 色を、 蛍光発色に変更し、 たとえば、 共焦点レーザー顕微鏡で、 その蛍光強度を 測定することで、 一つ一つの細胞ごと、 あるいはデジタル情報測定の最小単位
(いわゆるドット） ごとの、 強度を数値として得ることが出来る。
( 4 ) 同じ操作をスポットについて行えば、 各スポットごとの強度も得ることが 出来、 そのスポットは予め濃度 （つまり、 何本の合成した遺伝子が、 そのスポッ トに存在する力 が判るので、 細胞一個一個あたり、 あるいは、 その細胞の中の ドットあたりの、 存在する標的遺伝子の数 （絶対量） が判明する。
実施例
以下、 本発明を実施例により更に具体的に説明するが、 本発明は、 下記実施例 に限定して解釈される意図ではない。
実施例 1
以前の基礎研究から、 ブアン固定液で固定し、 DIG標識プローブでハイプリさ せた標本 （図 1 -la) の取得画像を "posterization" することにより、 簡単に ISHシグナル強度の定量ィ匕の解析を行うことができた（図 2 )。
プローブとハイプリした rRNAの量は初期の第 1次精母細胞で最も多く、 以後 パキテン期の第 1次精母細胞、 そしてディプロテン期の精母細胞、 終期の第 2次 精母細胞、 精子細胞と続く。 減数分裂の中期、 後期、 終期、 そして初期の stepl 精子細胞で最低レベルに達し、 そして精子形成の間でわずかに増加した。 ISHで rRNAを染色することは、 組織切片における mRNAの定量的解析やハイブリできる RNA量を評価するのに有効なパラメーターであった。 そこで、 本実験において、 まず、 ISHシグナルの定量的解析には tyramide signal amplification system (PerkinElmer Japan)を用レヽて 光顕微鏡による シグナノレ検出を行った。
今回のモデル実験では、 パラフィン切片上でハイブリダイズする標的 RNAとし て rR A (ribosomal RNA)を選んだ。
((Materials and Methods;;
組織標本の作製
Adultの雄性 Wistarラット （CLEA Japan： Osaka, Japan) に 130IU/kgのへパ リンを腹腔内に投与し、 その後ペントバルビタール (50mg/kg)で麻酔した。 1 5 分後、 ブアン固定液 (375ml飽和ピクリン酸、 125ml 37%w/wホルムアルデヒド、 25ml氷酢酸）で左心室から灌流固定した。 精巣を注意深くはずし、 同じ固定液 (プアン固定液）で 6時間以上浸漬固定した。 標本はエタノールで脱水し、 ベンゼ ンで置換し、 パラフィンで包埋した。 パラフィン切片（5 Ai m厚）はシランコート のスライドガラス上に貼布 ·伸展させた。
プローブの作製
ラットの 28S rRNAの DNA配列中、 完全に保存された部分（accession番号 #V01270; ヌクレオチド番号 6035 - 6068， 5' - gccgccgcaggtgcagatcttggtggtagtagca-3' ,王 34mer)を、 Yoshii et al, (1995) (Yoshii A, Koji T, Ohsawa N, Nakane PK (1995) . In situ localization of ribosomal RNAs is reliable reference for hybridizable RNA in tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 43: 321 - 327. )によつ て以前報告された rRNAの検出に用いた。 上記の 28S rRNAに対応する相補的な oligonucleotideは、 5 末 ¾sを digoxygeninで標識し oligonucleotide probe (34- mer)とした。 本品は Takara Bio Inc.， Japanに合成を依頼して得た。 ここではこれを DIG probeと呼ぶことにする。 対照実験として、 34merでランダムな配列の標識していない probeや DIG標識 し/こ oligonucleotideを用 ヽた 0
もうひとつ別の DIG標識 probeは、 以前我々が報告した multilabeling法 (Sasaki et al. 1998 ;Mori et al. 2001)を用いて次のとおりに準備した。 EcoRIも しくは Hindlllの制限酵素認識部位を突出した終末 (全 40- mer)につけた ense (o p-aattcgccgccgcaggtgcagatcttggtggtagtagca-a-3 )および antisense (5 p-agctt-tgctactaccaccaagatctgcacctgcggcggc-g-3 )の¾ 歹リをもっ oligonucleotideで 5'末端をリン酸化し、 さらにァニールした 2本鎖
oligonucleotideを作成した。 これは凍結乾燥製品として業者に合成を依頼して 得た。 これらをプラスミ ド pBluescriptlKS (—）に結合させ pBluescriptlKS (—） にライゲーシヨンし、 大腸菌 DH5 a株を形質転換後、 目的とするプラスミ ドをも つ大腸菌株をサブクローニングし、 プラスミ ドを単離精製した。 ]サブクロー二 ングした。 この操作で得た plasmid DNAは、 制限酵素 EcoRIもしくは Hindlllで 線状にでき、 これをラベノレする senseおよび antisense riboprobeの合成のため の template [铸型]として使つた。 Roche社製の RNA標識キット（Roche
Diagnostics ; Mannheim Germany)の DIG- UTP存在下で RNA合成酵素 T3/T7 RNA polymeraseを用レ、、 DIG標識 riboprobeを in vitroで転写することにより合成 した。 DNase処理後、 生成物を ethanol沈殿させ、 沈殿物である DIGラベル ·プ άーブを Hybridization混合液の中で再懸濁した。 DNase処理後の加水分解は、 probeが 100-merよりも短いので省略した。 これらの probeをここでは ML probe と呼ぶ。
rRNAの検出に用いたラットの 28S rRNAの生物種間でよく保存された部分 (.accession number #V01270 ;.6035 - 6068， 5 -gccgccgcagg- tgcagatcttggtggtagtagca-3' , total 34- mer)は、 以 Yoshii et al (Yoshii A, Koji T, Ohsawa N, Nakane PK (1995) . In situ localization of ribosomal RNAs is reliable reference for hybridizable RNA in tissue sections. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 43： 321— 327. ) fこ報告されてレヽ る。 DIG標識したリボプローブは、 使用した RNA Labeling Kit (Roche
Diagnostics； annheim, Germany)の製品に同封されてレ、る使用説明書に従って、 DIG-UTPの存在下で T3, T7 RNA polymeraseを用いて in vitro transcriptionに より合成した。 DNase処理後、 生成物をエタノール沈殿し、 ペレットを hybridization mixture【こ再溶角 ¥した。
ハイブリダィゼ一ション
切片を tolueneおよび ethanolで脱パラフィンし、 続けて 0. 2 N HC1処理、 20 mM CaCl2を加えた Tris- HC1 buffer (pH7. 5)中で 1 μ g/ml proteinase Kを添カロし たものによるタンパク分解処理、 続いて Dulbecco PBSに 2 mg/ml glycineを添 加したもので処理をし、 probeの非特異的結合を防ぐため 0. 1
triethanolamine (ρΗ 8· 0)に 0. 25 % acetic anhydrideを添加したものでァセチ ル化した。 スライドを 2 X SSC (1 X SSC=0. 15 M NaCl, 0. 015 M sodium citrate)で 洗浄し、 50 % formamideおよび 2 X SSC含有液中で 45°C、 1時間以上あらかじめ Hybridizationを行った。 Hybridization It 50 % formamide, 2 X SSC：、 1 mg/ml t腿、 0. 5 mg/ml 超音波処理した salmon sperm DNA、 2 mg/ml bovine serum albumin^ 10 % dextran sulfate^ ： ribop:robe (〜2 jU g/ml)を含む Hybridization 混合液 20 /i Lをスライドに載せ、 湿箱内で 45°C、 16時間行った。 次に、 2 XSSC および 50 % formamideで 45°C、 20分間 3回それぞれ洗浄した。 さらに 1 X SSC でスライドを洗浄した後、 alkaline phosphatase結合 anti-DIG (1 : 2500)を切片 に載せ、 室温で 2時間おいた。 スライ ドをさらに洗浄してから、 キットの説明書 通りに 5-br omo-4-ch loro-3-indolyl phosphateおよび nitroblue tetrazolium saltで酵素触媒色調変化をー晚行った。 切片を methyl greenで対比染色し、 光 学顕微鏡で観察した。
ラット精巣における精子形成過程の細胞の分化の分類のため、 連続切片を Periodoc Acid- Schiff (PAS) -hematoxylin染色した。 ハイブリ後、 スライドガラスを RNase溶液、 TNB blocking bufferで処理した。 その後 Anti- DIG- POD conjugate (1： 1500)を切片上にかけて 4°Cで overnight反応 させた。 TNT washing bufferで十分スライドを洗った後、 Fluorophare— tyramide (TSA) を室温で 15 分反応させ、 洗浄した後、 anti-fade で封入した。 ラット精巣の精子形成過程の分類のために連続切片を PAS-へマトキシリンで染 色した。
シグナルの定量
染色した切片は Plan-Neofluor 40 X /0. 75レンズを用いた Zeiss Confocal Laser Scanning顕微鏡 (LSM510)で観察した。 それぞれの精子形成細胞（第 1次、 第 2次精母細胞と精子細胞）の細胞質のシグナル強度は LSM510用のソフトウェア で測定した。 シグナル強度のヒストグラムは着目した精子形成細胞の細胞質の領 域から得た。 領域を囲んで範囲を限定し（図 3 a)、 抽出し（図 3 b)、 そして表に換 算し（図 3 c)、 それから Excelの spread sheetに移しかえた。 シグナル強度を計 算し、 ピクセル強度の平均として算出された（0-255)。 detector gainは最大の 強度を示すピクセルがないように充分に低下させた。
《Result and Discussion》
図 4 aは rRNAの antisenseプローブでハイプリさせたラット精巣を示してい る。 図 4 bは rRNAの senseプローブでハイプリさせたラット精巣を示していて、 特異的なシグナルは観察されなかつた。
RNAシグナルを定量することは精細管の中でシグナルにムラのないことが最も 重要である。 隣接した同じ発生段階の精子形成細胞が、 同じ rRNA量を発現する ことが要求される。 我々は今までの研究において同じ前処理のいくつかの切片で 再現性のある結果を得ている。 精袓細胞や第 1次精母細胞での rRNAの総量の解 析は、 細胞数も少なく細胞のサイズが小さすぎるため行わなかった。 それぞれの 細胞質におけるピクセルあたりの強度の平均値を得ることができ、 その結果につ いては図 5に示している。 それぞれの精子形成細胞の細胞質でのシグナル強度は、 ピクセルあたりの強度の平均値を表している。 第 1次精母細胞で 147-166、 ディ プロテン期の精母細胞で 125、 第 2次精母細胞で 108、 精子細胞で 53-135であつ た。 減数分裂の中期、 後期、 終期、 そして初期の stepl精子細胞では 68- 70であ つた。 これらの精子形成細胞での rRNA量は今回の研究で、 以前のデータと一致 した。 組織切片での mRNAの定量ィ匕には種々の克服しなければならない問題があ つた。 第 1の問題としてはプローブ濃度と ISHのシグナル強度に連続的な関連性 (比例関係） があるかどうかである。 次の問題としては単位面積あたり、 または 細胞あたりのプローブの分子数が正確に細胞質の mRNA量を反映しているかどう かである。 そしてその他にも細胞の体積や組織の体積、 そしてラベルされた細胞 数の変化の正確な測定が、 与えられた組織の遺伝子発現の変化をも正確に評価し ているかどうかと言う点を吟味することが必要不可欠であった。 蛍光検出システ ムを用いた今回のモデル実験は、 これらの組織切片でのシグナル定量化のための さまざまな根本的問題を解決するための新しい見解をもたらすかもしれない。 実施例 2
上記実施例 1の結果から、 プローブ濃度とシグナル強度との間に何らかの相関 関係があることが示唆されたので、 このような観点から、 再度検討を加えた。 まず、 本発明の基板を作成した。 基板としてスライドガラスを用いた。
既存のマイクロアレイ ·スライド作成の要領で、 調査したい遺伝子について、 濃度条件を振った希釈系列の DNA、 RNA，オリゴヌクレオチドを、 スポッターによ り、 スライドガラス上にスポットする。 同じ大きさ（直径 220 μ πι)の円形状に 1 n L狂いなくスポットできるので、 スポット上に、 核酸分子が何コピー含まれる かを計算することができる。
次に、 希釈系列スポットを作成した同じスライドガラスの半面を、 定法により シランコートし、 調査したい臓器、 組織、 器官のパラフィン切片、 又は凍結切片 を貼り付ける。 濃度勾配スポッ ト部には、 センス鎖及びアンチセンス鎖の複数列 を採用した。 結果を図 6に示す。 図 6は、 本発明の基板の 1実施態様を示す。 希釈系列スポットと、 切片を一体として、 in situ ハイブリダィゼーシヨン を行う。 調査したい遺伝子について、 Digoxigeninラベルの c RNAプローブを作 成し、 anti - digoxigenin, antibody- peroxidase conjugated と、 TSA—
fluorescein, TSA- Alexa等の蛍光発色を行う。
切片、 及び希釈系列スポッ トの蛍光強度は、 共焦点レーザー顕微鏡 (Carl Zeiss, LSM510等） で行う。 希釈系列スポットの蛍光強度と比較することにより、 組織切片上の知りたい細胞の蛍光強度を比較し、 それぞれの細胞が、 何コピーの 転写産物を有しているか同定する。 図 7は、 複数の濃度勾配を有する断片であつ て、 標識ィ匕した断片の標識強度と濃度との間の相関関係を示す。 このような検量 線を用いて上記切片上の 1の細胞の蛍光強度を比較検討することができる。
実施例 3
次に、 実際に複数の濃度勾配を有する断片と、 標識プローブとのァフィ二ティ 一相互作用により検量線を得て、 これによつて、 標的物質の定量を行った。
図 8力 S、 複数の濃度勾配を有する断片と、 標識プローブとのァフィ二ティー相 互作用により得られた検量線を示す。
図 1 0は、 スポットの各蛍光像について、 蛍光強度を計算によって求めるため、 定量化範囲を選択した （赤色の線で囲んだ範囲） 。 図 1 0 (1) は、 ブランクで ある 0 μ Μ のオリゴヌクレオチド .スポッ トの解析範囲を示す。 図 1 0 ( 2 ) は、 1 μ Μ、 図 1 0 ( 3 ) は、 2 μ Μ、 図 1 0 ( 4 ) は、 5 μ Μのオリゴヌクレオチド · スポッ トの解析範囲を示す。 各スポットの左隣には、 陰性対照であるアンチセン ス鎖のオリゴヌクレオチドが同じ濃度でスポットされている。 これらはブランク ではなく、 実験が正しく行われていれば、 antisenseの標識プローブに対して、 あらゆる濃度の antisenseのスポットはァフィニティー相互作用を示さない。 図 6の基板の実施形態により濃度勾配スライ ドを作成した。 これらの結果、 次のよ うなことが可能となった。 すなわち、 癌細胞などの標本の一個一個の転写産物の定量については、 手術や 生検によって得られた癌組織の切片を作成し、 癌の悪性度を示すと考えられる、
MMPや力ドヘリン、 P53抑制癌遺伝子の発現量を細胞レベルで絶対量として定量 化し、 予後を推測したり、 テーラーメイド医療の一環としての治療法の決定にも 用いることができる。
特に、 この定量化が組織切片上でできるということは、 従来の病理組織的診断 に加えて、 任意の遺伝子の転写産物を定量化できる利点があり、 病理組織学的悪 性度と、 遺伝子産物のコピー数を対応させることが出来る。
つまり、 病理専門医の手にゆだねちれてきた癌の悪性度の診断が、 遺伝子産物 の定量ィ匕という数値で表すことができる。 つまり、 病理診断医のトレーニングな しに悪' 14度を判定することができる。
産業上の利用可能性
病理学的検査は、 癌の検査に留まらず、 自己免疫疾患等、 現在でも多くの難病 の診断に欠力せない技術である。 し力 しながら、 病理医の数は少なく、 病理診断 に多くの時間と労力を要している。 本発明の方法の普及により、 病理医の組織診 断に加えて、 「数値」 として、 病態に関わる遺伝子の発現状況が細胞レベルで表 せれば、 社会的にも大変意義深いと考えられる。
また、 農林水産物の品質検定において、 養殖魚、 家畜は、 同じ種であっても、 月週齢の差や、 与えられた餌の違いにより、 個体や»の大きさが異なるために、 従来の方法で遺伝子産物の定量化により品質検定を行うことが難しかつた。 しか し、 本発明においては、 個体や組織の大きさが異なっても、 同じ種であれば、 細 胞一個一個の大きさは同じであるので、 組織切片を作成し、 細胞一個一個のレべ ルで任意の遺伝子産物の絶対量の差を定量化できるので、 極めて有利である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . プローブと結合性を有し、 かつ複数の濃度勾配を有する断片を含む濃度勾配 スポット部と、 前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本を設置す るための標本設置部とを有する基板。
2 . 前記プローブが、 核酸、 タンパク質、 抗原、 抗体、 ペプチドからなる群から 選択される少なくとも 1種である請求項 1記載の基板。
3 . 前記プローブが、 核酸である請求項 1又は 2記載の基板。
4 . 前記濃度勾配スポット部が、 複数の列で構成されている請求項 1記載の基板。
5 . 前記複数の列のうち、 一方がセンス鎖、 他方がアンチセンス鎖で構成される 請求項 3又は 4記載の基板。
6 . 基板が、 ガラスである請求項 1〜 5項のいずれか 1項に記載の基板。
7 . 前記標本が、 調査したい臓器、 組織、 器官、 細胞、 器官系、 細胞群からなる 群から選択される少なくとも 1種である請求項 1〜 6項のいずれか 1項に記載の 基板。
8 . 前記標的物質が、 タンパク質、 抗原、 抗体、 核酸からなる群から選択される 少なくとも 1種である請求項 1〜7項のいずれか 1項に記載の基板。
9 .標的物質が、 MMP、 P 5 3、 カドヘリン、 β—カテニン、 ras、 VEGF、 NF /c B力、 らなる群から選択される少なくとも 1種由来の分子である請求項 8記載の基板。
10.プローブと結合性を有し、 かつ複数の濃度勾配を有する断片と、 当該断片と プローブとをァフィ二ティ一相互作用させることにより得られた濃度と強度の検 量線に基づき、 前記プローブと結合性を有する標的物質を含有する標本中に存在 する前記標的物質を定量することを特徴とする標的物質の定量方法。
11.前記標的物質の定量を、 レーザー顕微鏡、 蛍光顕微鏡、 又は蛍光検出器によ り行う請求項 1 0記載の方法。
12.標本が、 調査したい臓器、 組織、 器官、 細胞、 器官系、 細胞群からなる群か ら選択される少なくとも 1種である請求項 1 0又は 1 1項に記載の方法。
13.前記標的物質が、 タンパク質、 抗原、 抗体、 核酸からなる群から選択される 少なくとも 1種である請求項 1〜7項のいずれか 1項に記載の方法。
14.請求項 1〜 9項のいずれか 1項に記載の基板を用いて、 プローブを、 前記複 数の濃度勾配を有する断片とァフィ二ティ一相互作用させることにより得られた 濃度と強度との検量線を作成し、 当該検量線に基づき、 前記プローブと結合性を 有する標的物質を含有する標本中に存在する前記標的物質を定量することを特徴 とする標的物質の定量方法。
15.前記プローブと、 前記複数の濃度勾配を有する断片及び前記標的物質と、 の ァフィ二ティー相互作用を、 一体として行う請求項 1 5記載の方法。
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