WO2006058919A1 - Verfahren zur aufkonzentrierung von biomolekülen - Google Patents

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WO2006058919A1
WO2006058919A1 PCT/EP2005/056414 EP2005056414W WO2006058919A1 WO 2006058919 A1 WO2006058919 A1 WO 2006058919A1 EP 2005056414 W EP2005056414 W EP 2005056414W WO 2006058919 A1 WO2006058919 A1 WO 2006058919A1
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crystalline structure
biomolecules
solvent
chip
ultraphobic
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Karsten Dr. Reihs
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Qiagen GmbH
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Qiagen GmbH
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding

Definitions

  • the present invention relates to a method for concentrating biomolecules near the surface of a crystalline structure comprising at least biomolecules and another substance. Furthermore, the present invention relates to chips and a method for performing a mass spectrometric analysis.
  • mass spectrometry For the analysis of samples, for example in drug chemistry or in biological research and production, mass spectrometry has become increasingly popular. For the analysis of biomolecules in the samples, mass spectrometry with ionization by matrix-assisted laser desorption and ionization (MALDI) is preferably used.
  • MALDI matrix-assisted laser desorption and ionization
  • a drop of liquid is usually applied to a cleaned sample carrier, for example pipetted, and then analyzed. Often, however, the analyzes are of poor quality.
  • the object is achieved with a method for concentrating biomolecules in the vicinity of the surface of a crystalline structure having at least biomolecules and a further substance in which preferably the crystalline structure is at least once briefly acted upon by a solvent reversibly.
  • biomolecules are enriched in the vicinity of the surface of a crystalline structure which comprises at least biomolecules and a further substance.
  • a biomolecule in the sense of the present patent application is any molecule which is produced by it during the life cycle of any virus or monocellular or multicellular organism.
  • Biomolecules contain at least one oxygen, nitrogen, sulfur, and / or phosphorus atom.
  • Exemplary of biomolecules may be mentioned: game gels, aptamers, ribozymes, peptides, polypeptides, proteins, antibodies, nucleic acids, nucleic acid analogs, DNA, double-stranded DNA, RNA, double-stranded RNA / DNA, vitamins, carbohydrates, hormones, glycopeptides, glycoproteins, lipids, Fatty acids and cholesterol.
  • they can also be large amounts of the same or different biomolecules. These can be unorganized next to each other or build functional units due to interactions. Examples include protein complexes, genomes, cell nuclei, ribosomes, cells, cell aggregates, tissues or whole organisms.
  • the crystalline structure has a further substance.
  • this substance is a MALDI matrix which is required for carrying out the MALDI mass spectrometry, which will be explained in more detail below.
  • Preferred MALDI matrices are 3-hydroxypicolinic acid, ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid, 2,5-dihydroxybenzoic acid, sinapinic acid, 2,4,6 trihydroxyacetophenone, nitrobenzyl alcohol, nicotinic acid, ferulic acid, caffeic acid, 2-aminobenzoic acid, picolinic acid, 3-aminobenzoic acid , 2,3,4-trihydroxyacetophenone, 6-aza-2-thiothymidine, urea, succinic acid, adipic acid, malonic acid or a mixture thereof.
  • MALDI Matrix as preferably crystalline Structure exists.
  • a biomolecule is embedded, which, however, often deposit in comparatively deep layers and not on the surface and thus are insufficiently available for a mass spectrometer analysis.
  • the biomolecules are concentrated near the surface; i.e. the biomolecules are enriched near the surface of the crystalline structure.
  • This enrichment preferably takes place in that the crystalline structure is at least once briefly subjected to a reversible reaction with a solvent.
  • a solvent is preferably applied to the crystalline structure for a short period of time, preferably for one to ten seconds, and then again preferably completely removed.
  • the residence time of the solvent on the crystalline structure it penetrates into the crystalline structure, with the concentration of the solvent being naturally largest at the surface and then decreasing.
  • Suitable solvents are any solvent which, on the one hand, can penetrate into the crystalline structure, whether it dissolves and / or dissolves the crystalline structure, or diffuses into the crystalline structure.
  • the solvent should be such that the biomolecules preferentially accumulate in it.
  • the solvent is water, acetonitrile and / or their mixture. As soon as the biomolecules have accumulated in the solvent, the solvent is removed as abruptly as possible, preferably evaporated, leaving the biomolecules enriched therein on the crystalline structure.
  • the crystalline structure is charged with a gaseous or liquid solvent.
  • the solvent is in the form of vapor, which precipitates on the crystalline structure.
  • the solvent After the solvent has been applied to the crystalline structure and has remained there for a short time, it is again removed as completely as possible, which can be done in any manner known to those skilled in the art. Preferably, however, the solvent is removed by raising the temperature and / or by applying a sufficient vacuum in the region of the crystalline structure.
  • the temperature of the crystalline structure is changed.
  • the crystalline structure is particularly preferably cooled and reheated at least once.
  • cooling preferably very rapid cooling, for example with a pelitic element, particularly preferably to temperatures of colder -5 ° C., for example, the solvent vapor precipitates on the crystalline structure as a frost.
  • the frost melts and the solvent can penetrate into the crystalline structure.
  • the removal is then preferably carried out by applying a sufficient vacuum and optionally a further increase in the temperature of the crystalline structure. This process sequence is preferably repeated several times.
  • the loading of the solvent and its removal takes place at least once, but more preferably several times.
  • the following process steps are carried out: exposure of the crystalline structure with solvent, retention of the solvent on the crystalline structure for a short period of time, wherein the solvent penetrates into the crystalline structure and as complete as possible removal of the solvent.
  • the method according to the invention is particularly suitable for enriching the biomolecules in crystalline structures of chips.
  • Chips are sample carriers that have a variety of spots including biological material. These spots usually have a diameter between 1 ⁇ m 2 and 10 mm 2 . Preferably, a solvent amount of 0.05 to 2 .mu.l per spot is applied to the crystalline structure.
  • biomolecules are enriched near the surface, they are more amenable to mass spectrometric analysis than in the prior art. With the chip, therefore, better, in particular more accurate, analyzes can be achieved than with chips according to the prior art.
  • the chip is obtainable according to the invention by the method according to the invention.
  • the chip has a crystalline structure which comprises biomolecules and at least one further substance, the biomolecules being enriched in the vicinity of the surface.
  • the crystalline structure includes a MALDI matrix.
  • This preferred embodiment of the chip is particularly suitable for MALDI mass spectrometry, which will be described below.
  • the chip has an ultraphobic surface, particularly preferably with hydrophilic anchor points.
  • Ultraphob in the sense of the invention means that the contact angle of a drop of water and / or oil lying on an ultraphobic surface is more than 150 ° , preferably more than 160 ° and most preferably more than 170 ° and / or the rolling angle 10 ° does not exceed.
  • the roll-off angle is understood to be the angle of inclination of a basically flat but structured surface against the horizontal, in which a stationary drop of water and / or oil with a volume of 10 ⁇ l is moved due to gravity at an inclination of the surface.
  • ultraphobic surfaces are described, for example, in WO 98/23549, WO 96/04123, WO 96/21523, WO 99/10323, WO 99/10324, WO 99/101 11, WO 99/101 13, WO 99/101 12 and WO 96/34697, which are hereby incorporated by reference and thus part of the disclosure.
  • Such an ultraphobic surface is described in international patent application WO 99/10322, which is hereby incorporated by reference and thus forms part of the disclosure.
  • Hydrophilic and / or oleophilic anchor points in the context of the invention are areas on which a drop of water or oil can be deposited; i.e. a drop of water or oil, which is brought into contact with the hydrophilic and / or oleophilic area suspended from a pipetting system, remains attached to it and thus separates from the pipetting system.
  • a water or oil drop with a volume of 10 .mu.l on the hydrophilic and / or oleophilic areas assumes a contact angle ⁇ 120.degree., Preferably ⁇ 1.degree., Very preferably ⁇ 90.degree., And / or the contact angle of this droplet exceeds 10.degree ,
  • the surface of the hydrophilic and / or oleophilic areas is completely enclosed by an ultraphobic area.
  • the surface is substantially ultraphobic and has a plurality of hydrophilic and / or oleophilic anchor points.
  • the hydrophilic and / or oleophilic anchor points can be produced on the ultraphobic surface, for example by chemical and / or mechanical removal of at least part of the layer thickness of the ultraphobic layer, preferably by means of laser.
  • the hydrophilic and / or oleophilic regions are produced by a modification of only the uppermost molecular layer of the ultraphobic surface.
  • this modification is a mechanical and / or thermal ablation, but preferably only a maximum of one molecule layer of the ultraphobic surface is removed.
  • the modification is carried out by the thermal or chemical change of the ultraphobic surface but without removal, as described for example in DE 199 10 809 A1, which is hereby incorporated by reference and thus applies as part of the disclosure.
  • this modification of the ultraphobic surface whose layer thickness remains essentially unchanged.
  • the hydrophilic and / or oleophilic regions are reversibly producible on parts of the ultraphobic surface.
  • Such surfaces or processes for the reversible hydro- or oleophilization of parts of the ultraphobic surfaces are described in the German patent application DE 102 07 615, which is hereby introduced as a reference and thus applies as part of the disclosure.
  • the hydrophilic and / or oleophilic areas may be of any shape and size. However, they preferably have an area of 1 ⁇ m 2 - 10 mm 2 . On such a surface, a drop of liquid with a diameter of 5 microns - 5 mm settle and preferably anchored so that it does not dissolve itself hanging down from the surface.
  • the ultraphobic surface is electrically conductive.
  • This embodiment of the present invention is particularly advantageous for MALDI mass spectrometry.
  • sample carriers are preferably made of glass, plastic or metal.
  • a further subject of the present invention is a method for carrying out a mass spectrometric analysis, in which the molecules to be analyzed are enriched in the vicinity of the surface of a crystalline structure before or during the mass spectrometric analysis of the biomolecules.
  • mass spectrometric analysis is MALDI mass spectrometry.
  • biomolecules are preferably mixed with a matrix substance and this sample is then metered onto sample carriers with preferably hydro- and / or oleophilic areas, for example pipetted. This sample is then dried on the surface. The resulting crystals are analyzed, for example, with a MALDI-TOF mass spectroscope in linear or in reflector operation. Details of this procedure can Nordhoff et. al.
  • MALDI-MS as a new method for the analysis of nucleic acid (DNA and RNA) with molecular mass up to 150,000 Dalton, Application of modern mass spectrometric methods to plan science research, Oxford University Press, (1996) page 86-101 which is hereby incorporated by reference and thus forms part of the disclosure.
  • MALDI method it is possible to record mass spectra of high quality.
  • the person skilled in the art knows that first of all the MALDI matrix can be metered onto the sample carrier and dried there, and then the sample to be analyzed is applied to the dried MALDI matrix and again dried and then analyzed.
  • the present invention is particularly useful in the field of drug discovery and biotechnology.
  • the uses of the inventions in this field is also an object of the present invention.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufkonzentration von Biomolekülen in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur, die zumindest Biomoleküle und eine weitere Substanz aufweist. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Chip und ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse.

Description

VERFAHREN ZUR AUFKONZENTRIERUNG VON BIOMOLEKÜLEN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufkonzentration von Biomolekülen in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur, die zumindest Biomoleküle und eine weitere Substanz aufweist. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Chips und ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse.
Für die Analyse von Proben beispielsweise in der Wirkstoffchemie oder in der biologischen Forschung und Produktion haben sich vermehrt die Massenspektromethe durchgesetzt. Für die Analyse von in den Proben befindlichen Biomolekülen wird vorzugsweise die Massenspektrometrie mit Ionisierung durch Matrix-unterstützte Laserdesorption und Ionisierung (MALDI) eingesetzt.
Bei der massenspektrometrischen Analyse wird in der Regel ein Flüssigkeitstropfen auf einen gereinigten Probenträger aufgebracht, beispielsweise pipettiert, und dann analysiert. Oftmals sind die Analysen jedoch von mangelhafter Qualität.
Es war deshalb die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem die Qualität massenspektrometrischer Analysen verbessert werden kann.
Gelöst wird die Aufgabe mit einem Verfahren zur Aufkonzentration von Biomolekülen in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur, die zumindest Biomoleküle und eine weitere Substanz aufweist, bei dem vorzugsweise die kristalline Struktur mindestens einmal kurzeitig mit einem Lösungsmittel im wesentlichen reversibel beaufschlagt wird.
Bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden in den Unteransprüchen 2 - 8 beschreiben.
Es war für den Fachmann überaus erstaunlich und nicht zu erwarten, dass es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gelingt die Qualität von massenspektrometrischen Analysen zu verbessern. Das erfindungsgemäße Verfahren ist einfach und kostengünstig durchzuführen.
Erfindungsgemäß werden Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur, die zumindest Biomoleküle und eine weitere Substanz aufweist, angereichert.
Ein Biomolekül im Sinne der vorliegenden Patentanmeldung ist ein beliebiges Molekül das im Laufe des Lebenszyklus eines beliebigen Virus oder ein- oder mehrzelligen Organismus von diesem hergestellt wird. Biomoleküle enthalten mindestens ein Sauerstoff-, Stickstoff, Schwefel-, und/oder Phosphoratom. Beispielhaft für Biomoleküle seien genannt: Spielgelmere, Aptamere, Ribozyme, Peptide, Polypeptide, Proteine, Antikörper, Nukleinsäuren, Nukleinsäureanaloga, DNA, Doppelstrang-DNA, RNA, Doppelstrang-RNA/DNA, Vitamine, Kohlenhydate, Hormone, Glycopeptide, Glycoproteine, Lipide, Fettsäuren und Cholesterin. Es kann sich aber auch um große Mengen desselben oder verschiedener Biomoleküle handeln. Diese können unorganisiert nebeneinander vorliegen oder aufgrund von Wechselwirkungen funktionale Einheiten aufbauen. Beispiele hierfür sind Proteinkomplexe, Genome, Zellkerne, Ribosomen, Zellen, Zellverbände, Gewebe oder vollständige Organismen.
Weiterhin erfindungsgemäß weist die kristalline Struktur eine weitere Substanz auf. Vorzugsweise ist diese Substanz eine MALDI-Matrix die zur Durchführung der MALDI-Massenspektrometrie benötigt wird, die weiter unten noch eingehender erläutert wird. Bevorzugte MALDI-Matrices sind 3-Hydroxypicolinsäure, α-Cyano-4- hydroxyzimtsäure, 2,5 Dihydroxybenzoesäure, Sinapinsäure, 2, 4, 6 Tri- hydroxyacetophenon, Nitrobenzylalkohol, Nikotinsäure, Ferulasäure, Kaffeesäure, 2- Aminobenzoesäure, Picolinsäure, 3-Aminobenzoesäure, 2,3,4- Trihydroxyacetophenon, 6-Aza-2-thiothymidine, Harnstoff, Bernsteinsäure, Adipinsäure, Malonsäure oder deren Mischung. Diese MALDI-Matrices werden beispielsweise in Acetonitril oder einem Acetonithl-Wasser-Gemisch mit einem Mischungsverhältnis von vorzugsweise 50:50 - 60:40, gelöst und als Flüssigkeit, vorzugsweise als Flüssigkeitstropfen auf einen Probenträger aufgetragen und das Lösungsmittel dort verdampft, so daß die MALDI-Matrix als vorzugsweise kristalline Struktur vorliegt. In diese Struktur wird ein Biomolekül eingebettet, die sich jedoch oftmals in vergleichsweise tiefen Schichten und nicht an der Oberfläche ablagern und somit für eine massenspektromethsche Analyse nur unzureichend zur Verfügung stehen.
Erfindungsgemäß werden die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche aufkonzentriert; d.h. die Biomoleküle werden in der Nähe der Oberfläche der kristallinen Struktur angereichert.
Diese Anreicherung erfolgt vorzugsweise dadurch, dass die kristalline Struktur mindestens einmal kurzeitig mit einem Lösungsmittel im wesentlichen reversibel beaufschlagt wird. Ein Lösungsmittel wird demnach für einen kurzen Zeitraum vorzugsweise für eine bis zehn Sekunden auf die kristalline Struktur aufgetragen und dann wieder vorzugsweise vollständig entfernt. Während der Verweilzeit des Lösungsmittel auf der kristallinen Struktur dringt es in die kristalline Struktur ein, wobei die Konzentration des Lösungsmittel im Bereich der Oberfläche natürlicherweise am größten ist und dann abnimmt.
Als Lösungsmittel eignet sich jedes Lösungsmittel, das zum einen in die kristalline Struktur eindringen kann, sei es dass es die kristalline Struktur an- und/oder auflöst, sei es dass es in die kristalline Struktur hineindiffundiert. Zum anderen sollte das Lösungsmittel so beschaffen sein, dass die Biomoleküle sich bevorzugt darin anreichern. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel Wasser, Acetonitril und/oder deren Gemisch. Sobald sich die Biomoleküle in dem Lösungsmittel angereichert haben, wird das Lösungsmittel möglichst schlagartig entfernt, vorzugsweise verdampft, wobei die darin angereicherten Biomoleküle auf der kristallinen Struktur zurückbleiben. Da die Konzentration des Lösungsmittels im Bereich der Oberfläche am größten ist, sind sammeln sich dort auch die meisten Biomolekül an, so dass die Biomoleküle dadurch in der Nähe der Oberfläche, vorzugsweise innerhalb eines μm unterhalb der Oberfläche, besonders bevorzugt innerhalb der oberen 200 nm und ganz besonders bevorzugt innerhalb der oberen 50 nm angereichert werden 1 mum 200 nm 50 nm Vorzugsweise wird die kristalline Struktur mit einem gasförmigen oder flüssigen Lösungsmittel beaufschlagt. Vorzugsweise liegt das Lösungsmittel als Dampf vor, der sich auf der kristallinen Struktur niederschlägt.
Nachdem die kristalline Struktur mit dem Lösungsmittel beaufschlagt wurde und dort eine kurze Zeit lang verweilt hat, wird es wieder möglichst vollständig entfernt, was auf jede dem Fachmann geläufige Art erfolgen kann. Vorzugsweise wird das Lösungsmittel jedoch durch eine Temperaturerhöhung und/oder durch Anlegen eines hinreichenden Vakuums im Bereich der kristallinen Struktur wieder entfernt.
Vorzugsweise wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Temperatur der kristallinen Struktur verändert. Besonders bevorzugt wird die kristalline Struktur mindestens einmal abgekühlt und wieder aufgeheizt. Durch Abkühlen, vorzugsweise sehr schnelles Abkühlen, beispielweise mit einem Pelitier-Element, besonders bevorzugt auf Temperaturen kälter -5°C schlägt sich beispielsweise der Lösungsmitteldampf als Reif auf der kristallinen Struktur nieder. Durch eine Temperaturerhöhung schmilzt der Reif und das Lösungsmittel kann in die kristalline Struktur eindringen. Das Entfernen erfolgt dann vorzugsweise durch Anlegen eines hinreichenden Vakuums und ggf. einer weiteren Erhöhung der Temperatur der kristallinen Struktur. Diese Prozessfolge wird vorzugsweise mehrfach wiederholt.
Vorzugsweise erfolgt die Beaufschlagung des Lösungsmittels und dessen Entfernung mindestens einmal, besonders bevorzugt jedoch mehrfach. Vorzugsweise werden dabei folgende Verfahrensschritte durchlaufen: Beaufschlagung der kristallinen Struktur mit Lösungsmittel, Verweilen des Lösungsmittels auf der kristallinen Struktur für einen kurzen Zeitraum, wobei das Lösungsmittel dabei in die kristalline Struktur eindringt und möglichst vollständiges Entfernen des Lösungsmittels.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Anreicherung der Biomoleküle in kristallinen Strukturen von Chips.
Weitere Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind deshalb Chips. Chips sind Probenträger, die eine Vielzahl von Spots u.a. mit biologischem Material aufweisen. Diese Spots haben in der Regel einen Durchmesser zwischen 1 μm2 und 10 mm2. Vorzugsweise wird eine Lösungsmittelmenge von 0,05 - 2 μl pro Spot auf die kristalline Struktur aufgetragen.
Da die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche angereichert sind, sind sie für eine massenspektrometrische Analyse besser zugänglich als beim Stand der Technik. Mit dem Chip lassen sich demnach bessere, insbesondere genauere, Analysen erzielen als bei Chips gemäß dem Stand der Technik.
Der Chip ist erfindungsgemäß durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlich.
Weiterhin erfindungsgemäß weist der Chip eine kristallinen Struktur, die Biomoleküle und mindestens eine weitere Substanz aufweisen, auf, wobei die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche angereichert sind.
Vorzugsweise beinhaltet die kristalline Struktur eine MALDI-Matrix. Diese bevorzugte Ausführungsform des Chips eignet sich insbesondere zur MALDI- Massenspektrometrie, die weiter unten beschrieben wird.
Vorzugsweise weist der Chip eine ultraphobe Oberfläche, besonders bevorzugt mit hydrophilen Ankerpunkten auf.
Ultraphob im Sinne der Erfindung bedeutet, dass der Kontaktwinkel eines Wasser- und/oder Öltropfens, der auf einer ultraphoben Oberfläche liegt, mehr als 150°, vorzugsweise mehr als 160° und am meisten bevorzugt mehr als 170° beträgt und/oder der Abrollwinkel 10° nicht überschreitet. Als Abrollwinkel wird der Neigungswinkel einer grundsätzlich planen aber strukturierten Oberfläche gegen die Horizontale verstanden, bei dem ein stehender Wasser- und/oder Öltropfen mit einem Volumen von 10 μl aufgrund der Schwerkraft bei einer Neigung der Oberfläche bewegt wird. Solche ultraphoben Oberflächen sind zum Beispiel in der WO 98/23549, WO 96/04123, WO 96/21523, WO 99/10323, WO 99/10324, WO 99/101 11 , WO 99/101 13, WO 99/101 12 und WO 96/34697 offenbart, die hiermit als Referenz eingeführt werden und somit als Teil der Offenbarung gelten. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen die ultraphoben Bereiche eine Oberflächentopographie auf, bei der die Ortsfrequenz der einzelnen Fourier- komponenten und deren Amplitude a (f) ausgedrückt durch das Integral S (log(f)) = a(f) • f errechnet zwischen den Integrationsgrenzen log (fi/μm~1) = -3 und log (f2/μm"1) = 3 mindestens 0,5 beträgt und die aus einem hydrophoben oder insbesondere oleophoben Material besteht oder mit einem haltbar hydrophobierten und/oder insbesondere haltbar oleophobierten Material beschichtet sind. Eine solche ultraphobe Oberfläche ist in der internationalen Patentanmeldung WO 99/10322 beschrieben, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt.
Hydrophile und/oder oleophile Ankerpunkte im Sinne der Erfindung sind Bereiche, auf denen ein Wasser- oder Öltropfen ablegbar ist; d.h. ein Wasser- oder Öltropfen, der an einem Pipettiersystem hängend mit dem hydrophilen und/oder oleophilen Bereich in Kontakt gebracht wird, bleibt daran hängen und löst sich somit von dem Pipettiersystem. Vorzugsweise nimmt ein Wasser- oder Öltropfen mit einem Volumen von 10 μl auf den hydrophilen und/oder oleophilen Bereichen einen Randwinkel < 120°, vorzugsweise < 1 10°, ganz besonders bevorzugt < 90° ein und/oder der Abrollwinkel dieses Tropfens überschreitet 10°.
Vorzugsweise wird die Oberfläche der hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche jeweils von einem ultraphoben Bereich vollständig umschlossen. Durch diese Ausführungsform ist es möglich einen Flüssigkeitstropfen an einem ganz bestimmten Ort abzulegen und dort vergleichsweise fest zu verankern.
Bevorzugt ist die Oberfläche im wesentlichen ultraphob und weist eine Vielzahl von hydrophilen und/oder oleophilen Ankerpunkten auf. Die hydrophilen und/oder oleophilen Ankerpunkte können auf der ultraphoben Oberfläche beispielsweise durch chemische und/oder mechanische Abtragung zumindest eines Teils der Schichtdicke der ultraphoben Schicht, vorzugsweise mittels Laser, erzeugt werden. Vorzugsweise werden die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche jedoch durch eine Modifikation lediglich der obersten Moleküllage der ultraphoben Oberfläche erzeugt. Vorzugsweise ist diese Modifikation eine mechanische und/oder thermische Ablation, bei der vorzugsweise jedoch nur maximal eine Moleküllage der ultraphoben Oberfläche abgetragen wird. Weiterhin bevorzugt erfolgt die Modifikation durch die thermische oder chemische Veränderung der ultraphoben Oberfläche jedoch ohne Abtragung, wie sie beispielsweise in der DE 199 10 809 A1 beschrieben ist, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt. Bei dieser Modifikation der ultraphoben Oberfläche bleibt deren Schichtdicke im wesentlichen unverändert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche auf Teilen der ultraphoben Oberfläche reversibel erzeugbar. Derartige Oberflächen bzw. Verfahren zur reversiblen Hydro- oder Oleophilierung von Teilen der ultraphoben Oberflächen sind in der deutschen Patentanmeldung DE 102 07 615 beschrieben, die hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt.
Die hydrophilen und/oder oleophilen Bereiche können jede beliebige Form und Größe aufweisen. Vorzugsweise haben sie jedoch eine Fläche von 1 μm2 - 10 mm2. Auf einer derartigen Fläche läßt sich ein Flüssigkeitstropfen mit einem Durchmesser von 5 μm - 5 mm absetzen und vorzugsweise so verankern, dass er sich selbst nach unten hängend nicht von der Oberfläche löst.
Vorzugsweise ist die ultraphobe Oberfläche elektrisch leitend. Diese Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist insbesondere für die MALDI- Massenspektrometrie vorteilhaft.
Diese Probenträger bestehen vorzugsweise aus Glas, Kunststoff oder Metall.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Durchführung einer massenspektromethschen Analyse, bei dem die zu analysierenden Moleküle vor der oder bei der massenspektrometrischen Analyse die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur angereichert werden.
Bezüglich der Anreicherung und der kristallinen Struktur wird auf das oben Gesagte verwiesen. Es war für den Fachmann überaus erstaunlich und nicht zu erwarten, dass sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Massenspektren hoher Qualität erzielen lassen. Da die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche angereichert sind, sind sie für eine massenspektrometrische Analyse besser zugänglich als beim Stand der Technik. Das Verfahren ist einfach und kostengünstig durchführbar.
Vorzugsweise ist die massenspektrometrische Analyse eine MALDI- Massenspektrometrie. Bei diesem Verfahren werden insbesondere Biomoleküle vorzugsweise mit einer Matrixsubstanz versetzt und diese Probe dann auf Probenträger mit vorzugsweise hydro- und/oder oleophilen Bereichen dosiert, beispielsweise pipettiert. Diese Probe wird sodann auf der Oberfläche getrocknet. Die sich dabei bildenden Kristalle werden beispielsweise mit einem MALDI-TOF Massenspektroskop im linearen- oder im Reflektor-Betrieb untersucht. Details zu diesem Verfahren können Nordhoff et. al. „ MALDI-MS as a new method for the analysis of nucleic acid (DNA and RNA) with molecular masses up to 150,000 Dalton, Application of modern mass spectrometric methods to plant science research, Oxford University press, (1996) Seite 86- 101 entnommen werden, das hiermit als Referenz eingeführt wird und somit als Teil der Offenbarung gilt. Durch die erfindungsgemäße Verwendung bei dem MALDI-Verfahren ist es möglich, Massenspektren hoher Qualität aufzunehmen. Der Fachmann weiß, dass auch zunächst die MALDI-Matrix auf den Probenträger dosiert und dort getrocknet werden kann und dass sodann die zu analysierende Probe auf die getrocknete MALDI-Matrix aufgetragen und wiederum getrocknet und dann analysiert wird.
Die vorliegenden Erfindungen eignet sich insbesondere im Bereich der Wirkstofforschung und im Bereich der Biotechnologie. Die Verwendungen der Erfindungen in diesem Bereich ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Aufkonzentration von Biomolekülen in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur, die zumindest Biomoleküle und eine weitere Substanz aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die kristalline Struktur mindestens einmal kurzeitig mit einem Lösungsmittel im wesentlichen reversibel beaufschlagt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die kristalline Struktur mit einem gasförmigen oder flüssigen Lösungsmittel beaufschlagt wird.
3. Verfahren nach Anspruch einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösemittel die kristalline Struktur zumindest teilweise zumindest anlöst und dann wieder entfernt wird.
4. Verfahren nach Anspruch einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Lösungsmittel mit Temperatur und/oder Vakuum wieder entfernt wird.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur der kristallinen Struktur verändert wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzichnet, dass die kristalline Struktur mindestens einmal abgekühlt und wieder aufgeheizt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur beim oder nach dem Kühlen mit Dampf, vorzugsweise Wasserdampf, beaufschlagt wird, der sich als Feststoff auf der kristallinen Struktur niederschlägt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Struktur nach dem Niederschlag aufgeheizt wird, zumindest bis der Niederschlag flüssig wird und der Niederschlag dann entfernt wird.
9. Chip erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8.
10. Chip mit einer kristallinen Struktur, die Biomoleküle und mindestens eine weitere Substanz aufweisen, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche angereichert sind.
1 1. Chip nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die kristalline Struktur eine MALDI-Matrix aufweist.
12. Chip, nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass er eine ultraphobe Oberfläche, vorzugsweise mit hydrophilen Ankerpunkten aufweist.
13. Chip nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die ultraphobe Oberfläche elektrisch leitend ist.
14. Verfahren zur Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse, dadurch gekennzeichnet, dass die zu analysierenden Moleküle vor der oder bei der massenspektrometrischen Analyse die Biomoleküle in der Nähe der Oberfläche einer kristallinen Struktur angereichert werden
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch geknnzeichnet, dass die massenspektrometrische Analyse MALDI-Massenspektrometrie ist.
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