WO2006046739A1 - 炎症性疾患治療剤 - Google Patents

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Yoshikazu Kuboi
Toshio Imai
Miyuki Nishimura
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory diseases.
  • Chemokines are the main cell migration factors in vivo and regulate tissue infiltration of lymphocytes through enhancement of cell motility and activation of cell adhesion molecules. Chemokines are classified into one of four subfamilies, CC, CXC, C, and CXXXC, based on the sequence of their first two cysteine residues. Members of CC, CXC, and C chemokines are secreted proteins of about 70 amino acids, and are not themselves active as adhesion molecules, but can induce cell adhesion. Secreted chemokines bind to the 7-transmembrane receptor on the target cell surface and activate integrins via the trimeric G protein to induce cell adhesion and migration
  • Fractal force-in is the only member of the CXXXC chemokine and, due to its structure and function, has distinctive features not found in other chemokines. Fractal force-in is expressed on the cell surface as a membrane-bound type having a chemokine domain, a mucin domain, a transmembrane region, and an intracytoplasmic region.
  • Membrane-bound fractal force-in binds to C X3CR1 and can mediate strong adhesion alone without the intervention of selectins and integrins even in the presence of physiological blood flow rates.
  • the fractalkin-CX3CR1 cell invasion system mediates a function similar to that of multistage cell invasion via selectins and integrins in a single step.
  • secretory fractal force-in secreted by membraneing fractal force inca and other seeding binds to CX3CR1 and induces integrin activation and cell migration in the same manner as conventional chemokines.
  • Fractal force-in treats vascular endothelial cells with inflammatory site-powered TNF and IL-1. Then expression is induced. On the other hand, CX3CR1 is not expressed on monocytes, most NK cells, and force neutrophils expressed on some T cells. Thus, the fractal force-in-CX 3CR1 cell invasion system appears to be a highly efficient mechanism for mobilizing certain immune cells on or in the endothelial cells of damaged tissues. . As described above, fractal force-in is induced in vascular endothelial cells during inflammation and CX3CR1 is present in many types of white blood cells. Therefore, the fractal force-in-CX3CR1 cell infiltration system is used for pathogenesis and inflammatory disease.
  • Non-patent Document 1 inflammatory bowel diseases represented by ulcerative colitis and Crohn's disease
  • Patent Document 2 Psoriasis and Atopic Dermatitis
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 4
  • Asthma Non-patent Document 5
  • Arteriosclerosis Non-patent Document 6
  • Acute Respiratory Distress Syndrome Non-patent Document 7
  • the classification of leukocytes has been categorized into various groups of lymphocytes, monocytes, and condyles by a number of cell surface markers. Recently, a more detailed classification has been made based on the distribution of chemokine receptors, and it is becoming clear that the group that was considered to be a single group is a group formed by several sub-groups.
  • the analysis power of the mouse is also CX As described above, 3CR1 has been reported to be expressed on monocytes, NK cells, and a part of T cells.
  • monocytes express CX3CR1 strongly and do not express CCR2 (CX3CR l high It is becoming clear that there are two populations (CX3CR1 1 ⁇ > W CCR2 +) with low expression of CCR2-) and CX3CR1 and high expression of CCR2.
  • CX3CR1 1 ⁇ > W CCR2 + is induced at the site of inflammation during inflammation, and TNF a, which is an inflammatory site force in, and iNOS (a potent NO (—nitrogen oxide) synthase) inducible nitrogen oxide synthetase) has been suggested to contribute to tissue damage (Non-Patent Document 12, Non-Patent Document 13). Therefore, it does not mention the function and importance during inflammation, but rather is necessary for the supply of macrophages, a non-inflammatory constituent tissue, and it is not desirable to inhibit the function of these cells. It is said.
  • CD16 + C D62L- monocytes has been reported to increase in peripheral blood in inflammatory diseases, and its involvement in disease progression has been strongly suggested. It has been reported that monocytes of CD16 + CD62L- express CX3CR1 highly, and the same properties as those of mouse CX3CRl high CCR2- mentioned above are more expected (Non-patent Document 14).
  • CD16 + CD62L- monocytes have been reported to produce TNF a and iN OS strongly, and are thought to be strongly involved in the progression of the disease, coupled with increased calories in peripheral blood in inflammatory diseases. It is done. However, there is no specific report as to whether inhibition of CX3CR1 function can suppress TNFa and iNOS production from these cells.
  • iNOS which has the highest NO synthesis ability, is not steadily expressed like eNOS (endothelial NOS) and nNOS (neura 1 NOS). Z or lipopolysaccharide), and is transiently produced in large quantities and is involved in biological defense reactions such as elimination of bacteria, viruses, fungi, and parasites.
  • eNOS endothelial NOS
  • nNOS neuroa 1 NOS
  • Z or lipopolysaccharide Z or lipopolysaccharide
  • iNOS in the lesion is considered to be a major factor in the progression of the disease.
  • Diseases in which NO is actually thought to be involved in pathogenesis and progression include inflammatory diseases (eg, rheumatic inflammation, arthritis).
  • shock eg, endotoxic shock, hemorrhagic shock, or cardiac shock
  • pathological blood pressure reduction E.g., decreased blood pressure in cancer therapy using cytoforce in, or decreased blood pressure in sep
  • Non-patent document 15 rheumatoid arthritis
  • osteoarthritis Non-patent document 16
  • ulcerative colitis Crohn's disease based on the inhibition of iNOS activity in pathological models or analysis of iNOS knockout mice.
  • Non-patent document 17 Inflammatory bowel disease (Non-patent document 17, Non-patent document 18), Concanapalin A-induced liver injury (Non-patent document 19 ), Asthma (Non-patent document 20), Endotoxin-induced acute lung injury (Non-patent document 21), Atherosclerosis (Non-patent document 22), ischemic disorder (Non-patent document 23, Non-patent document 24, Non-patent document 25), transplant rejection (Non-patent document 22), etc.! Being!
  • Non-patent Document 26 Especially in the analysis of myocardial function in sepsis using iNOS knockout mice, the role of iNOS depending on the type of cells produced is pointed out.
  • INOS expressed in cardiomyocytes is essential for shortening of myocardial cells by adrenergic stimulation during sepsis and beneficial responses, while iNOS expressed in inflammatory cells infiltrated in the vicinity of cardiomyocytes It is involved in disorders and adverse reactions (Non-patent Document 27).
  • Non-patent document 1 Arthritis Rheum. 2002 Nov; 46 (ll): 2878-83
  • Non-Patent Document 2 Am J Pathol. 2001 Mar; 158 (3): 855-66
  • Non-Patent Document 3 J Allergy Clin Immunol. 2004 May; 113 (5): 940-8
  • Non-Patent Document 4 J Clin Invest. 2001 May; 107 (9): 1173-81
  • Non-Patent Document 5 J Allergy Clin Immunol. 2003 Dec; 112 (6): 1139- 46
  • Non-Patent Document 6 J Clin Invest. 2003 Apr; l 11 (8): 1241- 50
  • Non-Patent Document 7 Clin Exp Immunol. 1999 Nov; 118 (2): 298-303
  • Non-Patent Document 8 Circulation. 2003 Feb 25; 107 (7): 1009-16
  • Non-Patent Document 9 J Neuroimmunol. 2002 Apr; 125 (l-2): 59-65
  • Patent Document 1 Japanese Patent Laid-Open No. 2002-345454
  • Non-Patent Document 10 Kidney Int. 1999 Aug; 56 (2): 612-20
  • Non-Patent Document 11 J Clin Invest. 2001 Sep; 108 (5): 679-88
  • Non-Patent Document 12 Immunity. 2003 Jul; 19 (l): 71-82
  • Non-Patent Document 13 Immunity. 2003 Jul; 19 (l): 59-70
  • Non-Patent Document 14 J Exp Med. 2003 Jun 16; 197 (12): 1701-7
  • Non-Patent Document 15 Eur J Pharmacol. 2002 Oct 18; 453 (1): 119-29
  • Non-Patent Document 16 Arthritis Rheum. 1998 Jul; 41 (7): 1275-86
  • Non-Patent Document 17 J Pharmacol Exp Ther. 2001 Sep; 298 (3): 1128-32
  • Non-Patent Document 18 Eur J Pharmacol. 2001 Jan 19; 412 (1): 91-9
  • Non-Patent Document 19 J Clin Invest. 2001 Feb; 107 (4): 439-47
  • Non-Patent Document 20 J Pharmacol Exp Ther. 2003 Mar; 304 (3): 1285-91
  • Non-Patent Document 21 Anesth Analg. 2003 Dec; 97 (6): 1751-5
  • Non-Patent Document 22 Eur J Pharmacol. 2000 Mar 10; 391 (1-2): 31-8
  • Non-Patent Document 23 Br J Pharmacol. 1999 May; 127 (2): 546-52
  • Non-Patent Document 24 Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002 Jun; 282 (6): H1996-2003
  • Non-Patent Document 25 Nitric Oxide. 2004 May; 10 (3): 170-7
  • Non-Patent Document 26 Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2002 Mar; l (l): 89-108
  • Non-Patent Document 27 Circulation. 2003 Sep 2; 108 (9): 1107-12
  • the present invention relates to a therapeutic agent for inflammatory diseases based on a new concept, specifically inflammatory bowel disease (especially ulcerative colitis, Crohn's disease), psoriasis, atopic dermatitis, asthma, arteriosclerosis
  • inflammatory bowel disease especially ulcerative colitis, Crohn's disease
  • psoriasis especially atopic dermatitis
  • asthma arteriosclerosis
  • the purpose is to provide therapeutic agents for tissue damage in acute ischemia reperfusion and acute respiratory distress syndrome.
  • iNO S production was suppressed as a result of studies on various pathological models described in Examples below, using antibodies that inhibit the interaction between fractal force-in and CX3CR1 and inhibit the function of CX3CR1. It was also found for the first time that the condition was improved. Furthermore, it has been reported that antibodies that inhibit the interaction between fractalkine and CX3CR1 and inhibit CX3CR1 function are effective against ConA hepatitis. It was found for the first time that iNOS production in inflammatory cells is suppressed.
  • CX3CR1 antagonist antibodies that inhibit the interaction between fractal force-in and CX3CR1 and inhibit the function of CX3CR1 or compounds that inhibit the function of CX3CR1 (hereinafter sometimes abbreviated as “CX3CR1 antagonist”) are used as fractals.
  • the present invention was clarified to be useful for the treatment of psoriasis, atopic dermatitis, asthma, arteriosclerosis, tissue damage in ischemia-reperfusion, acute respiratory distress syndrome, etc.].
  • the present invention is as follows.
  • An inflammatory disease therapeutic agent comprising an antibody or CX3CR1 antagonist that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1.
  • the agent according to any one of (1) to (4), V, which is an inflammatory disease is a tissue disorder in ischemia-reperfusion.
  • Treatment of inflammatory diseases also includes administering a therapeutically effective amount of an antibody or CX3CR1 antagonist that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 to a patient in need of treatment of the inflammatory disease.
  • an antibody or CX3CR1 antagonist that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 to a patient in need of treatment of the inflammatory disease.
  • FIG. 1 shows an improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) in weight loss of mouse CD4 positive CD45RB strong positive T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 2 shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on bowel stool property score and colon thickening in mouse CD4-positive CD45RB strong-positive T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 3 Mouse CD4 + CD45RB strong positive T lymphocyte transfer in inflammatory bowel disease model, 2 shows the effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on morphological changes in the large intestine (photo of organ morphology).
  • FIG. 4 shows an improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on colonic tissue damage in a mouse CD4 positive CD45RB strong positive T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease model (micrograph).
  • FIG. 5 shows the effect of an anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on the mRNA expression of various factors in a mouse CD4-positive CD45RB-positive T lymphocyte transferred inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 6 shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) against DAI in a mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model.
  • [7] Shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on colon thickening and colon shortening in a mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model.
  • [8] Shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on the morphological changes of the large intestine in the mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model (photograph of organ morphology).
  • [10] Shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (# 126) on colon thickening and colon shortening in a mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model (micrograph).
  • FIG. 11 shows the effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on the expression of various factors in liver tissue in ConA hepatitis.
  • FIG. 14 shows the ratio of each positive cell in CX3CR1-positive cells or iNOS-positive cells in ConA hepatitis liver tissue.
  • FIG. 15 shows the results of flow cytometry of CX3CR1-positive cells.
  • ⁇ 16 Shows the results of tissue staining in liver tissue of ConA hepatitis (micrograph).
  • FIG. 17 shows chemokine expression in ConA hepatitis and the effect of anti-fractal force-in antibody (5H8-4) on chemokine expression.
  • FIG. 18 shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on mRNA expression of leukocyte marker in mouse CD4 positive CD45RB strong positive T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease model.
  • Normal means a negative control
  • dgG means a control antibody administration group
  • @FKN means an anti-fractal force in administration group (the same applies to FIGS. 19 to 25).
  • FIG. 19 shows an improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on chemokine and chemokine receptor mRNA expression in a mouse CD4-positive CD45RB-positive T lymphocyte-transferred inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 20 shows the improvement effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on chemokine and chemokine receptor mRNA expression in a mouse CD4-positive CD45RB-positive T lymphocyte-transferred inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 21 shows the improved action of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on the expression of cytoforce-in mRNA in mouse CD4-positive CD45RB strong-positive T lymphocyte-transferred inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 22 shows an improvement effect of anti-mouse fractalkine antibody (5H8-4) on mRNA expression of angiogenic molecules and tissue destruction protease in a mouse CD4 positive CD45RB strong positive T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease model.
  • FIG. 23 Improvement of anti-mouse fractal force in antibody (5H8-4) on mRNA expression of rod-shaped cells and T-cell activity in inflammatory bowel disease model in mouse CD4-positive CD45RB-positive T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease Show.
  • FIG. 24 Improving effect of anti-mouse fractal force-in antibody (5H8-4) on cytodynamic in, chemokine and chemokine receptor mRNA expression 24 hours after intestinal oxazolone infusion in mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model Indicates.
  • FIG. 25 Anti-mouse fractal force-in antibody (5H8) against mRNA expression of neutrophil markers, cyto force-in, chemokine and chemokine receptor 3 days after infusion of oxazolone in a mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model -4).
  • Hybridoma Ham ® mFKN5H8-4 is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center on September 29, 2004 (1st, 1st, Tsukuba, Higashi 1-chome, Ibaraki, Japan) (Deposit number: FERM P-20236) and the deposit was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty (deposit number: FERM BP-10372).
  • Hybridoma Ham ® mFKN # 126.1.1 was issued on September 29, 2004 (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan), Patent Biological Depositary Center (Tsukuba Sakaihigashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan) 1 (No. 6) (deposit number: FERM P-20235), the deposit was transferred to an international deposit under the Budapest Treaty (deposit number: FERM BP-10371).
  • An antibody that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 can be prepared as follows.
  • a mammal eg, mouse, hamster or rabbit
  • CX3CR1 or a fractal force-in or protein fragment eg, peptide fragment
  • a fractal force-in or protein fragment eg, peptide fragment
  • An expression vector incorporating a gene for CX3CR1 or fractal force-in (see, for example, GenBank NM_001337 or NM_00 2996) is expressed in a host cell such as a bacterium, a mammalian cell line, or an insect cell line, Cell force CX3C R1 or fractal force-in can be purified according to standard methods. Further, for example, it may be expressed as a fusion protein with GST or the like, and in the case of a fusion protein with GST, it may be purified with a dartathione column.
  • the peptide of CX3CR1 or fractal force-in can be synthesized from a known method (for example, F-moc or T-boc chemical synthesis) based on the amino acid sequence of CX3CR1 or fractal force-in. Is allowed to increase immunogenicity by conjugation with a suitable carrier such as KLH.
  • an antiserum can be obtained. If desired, the antiserum can also be isolated from a polyclonal antibody. You can.
  • antibody-producing cells lymphocytes
  • myeloma cells by standard cell fusion methods to immortalize the cells to obtain cell nocibridoma cells. .
  • Such a technique is an established method in the art, and can be performed according to an appropriate manual (Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Manual, 1998, Cold Spring Harbor Laboratory).
  • monoclonal antibodies include human B cell hyperidoma method (Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983), EBV-hybridoma method (Cole et al., Monoclonal Anti body in Cancer) to produce human monoclonal antibodies. Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77-96), and combinatorial antibody library screening (Huse et al., Science, 246: 1275, 1989).
  • insect cells expressing CX3CR1 are immunized to mammals as they are to prepare hyperidomas from the lymphocytes of the mammals, and screening of the produced antibodies expresses CX3CR1.
  • the method is also allowed to be carried out with cultured mammalian cells (cells that do not bind to antibodies derived from insect cells that have low cross-immunity with insect cells). Moreover, it can also prepare by the method of Unexamined-Japanese-Patent No. 2002-345454.
  • Screening for an antibody that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 can be performed by the screening method described below.
  • the present invention is an antibody force that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1, fractal force-in-a disease involving the CX3CR1 cell invasion system, caused by iNOS activity or excessive NO production by inflammatory cells It was completed by finding it useful for the treatment of inflammatory diseases. Therefore, a compound that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 and inhibits the function of CX3CR1, CX3CR1 antagonist, can also be used in the present invention.
  • the compound is not particularly limited as long as it has the above-described action, and may be a known compound or a novel compound. Further, it may be a compound obtained by the screening method described later.
  • “compound” refers to, for example, an expression product of a gene library, a synthetic low molecular compound library, a nucleic acid (oligo DNA, oligo RNA), a synthetic peptide library, Bacterial release material, cell (microbe, plant cell, animal cell) extract, cell (microbe, plant cell, animal cell) culture supernatant, purified or partially purified polypeptide, extract from marine organisms, plants or animals, etc. , Soil, random phage peptide display library. Specific examples include compounds described in International Publication No. 03/018549 pamphlet, International Publication No. 00/09511 pamphlet, International Publication No. 02/076990 pamphlet, and the like.
  • a known compound is produced by a production method known per se, a natural compound is obtained by a known extraction method or a known purification method per se, or is commercially available! Obtainable.
  • Derivatives of known compounds can be modified by chemical means, physical means and Z or biochemical means.
  • An antibody or CX3CR1 antagonist that inhibits the interaction between CX3CR1 and fractal force-in can be screened based on the ability of CX3CR1-positive cells to migrate against cells expressing fractal force-in or membrane-bound fractal force-in.
  • the following is a description of a specific method for screening based on the ability of CX3CR1-positive cells to migrate. The present invention is not limited to this.
  • the migration against fractal force-in can be determined using, for example, Transwell Culture Insert (manufactured by Coaster).
  • Cells that do not express fractal force-in are cultured on the transuel culture insert, and a single cell layer is formed on the upper surface of the culture insert.
  • a transculture culture insert in which ECV304 cells are cultured is attached to a 24-well transwell, and an appropriate number, preferably 10 6 peripheral blood mononuclear cells suspended in the migration solution are loaded into the transculture culture insert. I'm barking.
  • Appropriate conditions preferably after culturing at 37 ° C for 4 hours, collect cells that have migrated to the well plate after passing through ECV304 cells, and identify them with cell surface markers and intracellular antigens.
  • the cells are fluorescently stained with an antibody against the cell surface marker or intracellular antigen that has been fluorescently labeled. Quantify using CScal3 ⁇ 4ur.
  • An antibody that binds to CX3CR1 or fractal force-in is included in the migration solution, and killer lymphocytes, preferably cells that express perforin and granzyme B or CX3CR1, and more preferably cells that express CX3CR1. If migration is suppressed, the antibody is assayed to inhibit the interaction between CX3CR1 and fractalkine.
  • suppression of iNOS production and “suppression of iNOS production” mean that the mRNA expression level of iNOS is suppressed or the production amount of iNOS protein is suppressed.
  • Inhibition of iNOS production can be measured using real-time PCR, Western blotting, ELISA (solid phase enzyme immunoassay), or iNOS enzyme activity assay.
  • real-time PCR is specifically performed as follows. Total RNA is purified from tissues and cells by conventional methods, and cDNA is prepared using reverse transcriptase and appropriate primers. Based on the prepared cDNA, each molecule can be amplified specifically by using primers specific to each molecule and DNA polymerase.
  • Each molecule can be monitored for amplification curves using a specific instrument (such as PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems)) by incorporating an appropriate fluorescent dye during amplification.
  • a specific instrument such as PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems)
  • an appropriate fluorescent dye during amplification.
  • an internal standard gene such as the dalyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene
  • the present invention provides an inflammatory disease therapeutic agent containing an antibody or CX3CR1 antagonist that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1.
  • the antibody preferably binds to fractal force in.
  • the therapeutic agent of the present invention containing an antibody is applied to humans, the following embodiments are preferred.
  • a chimeric antibody that is, an antibody from which the antigen-binding region is derived from a mouse monoclonal antibody and the other region is derived from a human antibody.
  • the antibody that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 in the present invention includes a chimeric antibody.
  • Chimeric antibodies include chimeric antibodies that use the entire variable region of a mouse monoclonal antibody as an antigen-binding region (Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1985, Takeda et al., Nature, 314: 452, 1985) and a chimeric antibody (Teng et al., Pro Natl. Acad.
  • the antibody that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 in the present specification also includes a fragment of an antibody that specifically binds to CX3CR1 or fractal force-in, such as a Fab or (Fab ') fragment. Is.
  • the therapeutic agent of the present invention is a disease in which a fractal force-in-CX3CR1 cell infiltration system is involved, and an inflammatory disease caused by iNOS activity or excessive NO production by inflammatory cells, specifically, For patients who need treatment for inflammatory bowel disease (especially ulcerative colitis, Crohn's disease), psoriasis, atopic dermatitis, asthma, arteriosclerosis, tissue damage in ischemia reperfusion, acute respiratory distress syndrome, etc. Can be administered.
  • the inflammatory disease may be an autoimmune disease or other inflammatory disease.
  • the inflammatory disease may also be nephritis, myocarditis, autoimmune liver injury, multiple sclerosis, rheumatism, or other inflammatory diseases.
  • the therapeutic agent of the present invention can be administered by a conventional method such as injection (subcutaneous, intravenous, etc.).
  • the form of the therapeutic agent is appropriately selected depending on the administration method, and may be a pharmaceutical composition in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutical composition suitable for injection use sterilization is possible.
  • Aqueous solutions (where water soluble) or dispersions and sterile powders for the extemporaneous preparation of sterile injectable solutions or dispersion are included.
  • Which pharmaceutical composition is suitable for injection use ? In this case, it must be sterilized and be as fluid as possible for easy syringe operation.
  • the composition must be stable under the conditions of manufacture and storage and must protect the potency of contaminating microorganisms such as bacteria and fungi.
  • the carrier can be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, polyol (eg, glycerol, propylene glycol, and polyethylene glycol, and the like), and suitable mixtures thereof.
  • the proper fluidity can be maintained, for example, by the use of a coating such as lecithin, by the maintenance of the required particle size in the case of dispersion and by the use of surfactants. Protection from the action of microorganisms can be achieved by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, ascorbic acid, thimerosal, and the like.
  • isotonic agents for example, sugars, polyalcohols such as man-tol, sorbitol, sodium chloride in the composition.
  • Sustained absorption of the injectable composition can be achieved by combining an agent that delays absorption, such as aluminum monostearate and gelatin, into the composition.
  • an injection solution if necessary, one or a combination of the above components and a necessary amount of an antibody that inhibits the interaction between flatatalcaine and CX3CR1 are mixed in an appropriate solvent, followed by sterile filtration. Can be performed.
  • dispersions are prepared by incorporating the active compound into a sterile medium containing the basic dispersion medium and the required other ingredients selected from above.
  • the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization, which gives a powder of the active ingredient and the desired additional ingredients previously sterile filtered.
  • the dosage of the therapeutic agent of the present invention may vary depending on the selection of the antibody, the subject to be administered, the age of the patient, sex difference, drug sensitivity, administration method, history of disease, etc., and the judgment of the doctor.
  • Appropriate dose ranges are, for example, about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 10 mg, per kg of patient body weight.
  • the required dosage is expected to vary widely.
  • oral administration is expected to require higher dosages than intravenous administration.
  • an immunotoxin containing an antibody against CX3CR1 and a cytotoxic substance bound to the antibody can also be used.
  • Examples of toxic substances include saborin, ricin, Pseudomonas exotoxin, diphtheria toxin, chemotherapeutic agents and the like.
  • the binding of the antibody and the toxic substance can be performed by a conventional method for producing immunotoxin. This immunotoxin shows growth suppression specifically for CX3CR1-expressing cells.
  • CX3CR1 antagonist includes salts with pharmaceutically acceptable acids or bases which may form salts. Therefore, a CX3CR1 antagonist or salt thereof is a disease involving the fractal force-in-CX3CR1 cell invasion system, which is caused by iNOS activity or excessive NO production by inflammatory cells, specifically, It can be used to treat inflammatory bowel disease (especially ulcerative colitis, Crohn's disease), psoriasis, atopic dermatitis, asthma, arteriosclerosis, tissue damage in ischemia reperfusion, acute respiratory distress syndrome, and so on. The obtained substance can be used alone.
  • the therapeutic agent can be administered by any route of administration, either oral or parenteral (eg, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration).
  • routes of administration either oral or parenteral (eg, intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous administration, rectal administration, transdermal administration).
  • a pharmaceutical composition containing a CX3CR1 antagonist or a salt thereof is in an appropriate dosage form depending on the route of administration, and specifically, it is an oral dosage form such as a tablet, capsule, granule, powder, or syrup.
  • oral dosage form such as a tablet, capsule, granule, powder, or syrup.
  • parenteral preparations such as injections, drops, ribosomes, suppositories and the like. These preparations are commonly used excipients, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, dispersants, buffers, preservatives, solubilizers, antiseptics. It can be produced by conventional methods using agents, flavoring agents, soothing agents, stabilizers and the like.
  • non-toxic additives examples include lactose, fructose, glucose, starch, gelatin, magnesium stearate, methylcellulose, or salts thereof, ethanol, citrate, sodium chloride sodium salt, sodium phosphate, and the like. It is done.
  • an appropriate dose is, for example, about 1.0 to 1,500 g, preferably about 10 to 500 g per kg body weight of the patient.
  • the required dosage is expected to vary widely. For example, oral administration is expected to require higher doses than intravenous administration.
  • treatment generally means obtaining a desired pharmacological effect and / or physiological effect.
  • the effect is prophylactic in terms of completely or partially preventing the disease and Z or symptoms, and therapeutic in terms of partial or complete cure of the disease and / or adverse effects caused by the disease.
  • treatment includes any treatment of diseases of mammals, particularly humans, and includes, for example, the following treatments (a) to (c):
  • the antibody or CX3CR1 antagonist that inhibits the interaction between fractal force-in and CX3CR1 used in the present invention has the action of suppressing iNOS production
  • iNOS production suppression using CX3CR1 antagonist as an active ingredient Agents are also provided.
  • the iNOS production inhibitor can be administered as a composition in the same manner as the above-mentioned therapeutic agents, and can be administered to patients who need to suppress iNOS production in the same manner as the above-mentioned therapeutic agents.
  • Example 1 Mouse CD4 positive CD45RB strong positive (CD4 + CD45RB high ) Effect of anti-fractal force-in antibody (5H8-4) in T lymphocyte transfer inflammatory bowel disease model
  • Anti-fractal force-in antibody (5H8-4) was prepared by the following method (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-345454). Mouse fractal force-in (R & D) was used as the antigen. Antigen was mixed with TiterMax adjuvant and then immunized to Armenian hamster, and boosted with antigen alone. The antibody titer in the serum was measured using ELISA. Lymphocytes were also separated by Armenian hamster force with increased antibody titer, mixed so that the ratio of lymphocytes to P3 myeloma cells was 1, and cell fusion was performed using PEG (Boehringer).
  • Hypridoma was cultured in 96-well plate for 1 week using RPMI-1640 / 10% FCS / HAT / 10% Origen HCF (ISGN). Then, ELISA was performed using the culture supernatant, and positive tools were identified. Hybridomas producing anti-mouse fractal force-in antibodies were cloned by limiting dilution twice. The monoclonal antibody was purified by using a protein A column from ascites produced by inoculating Hypridoma into SCID mice administered with incomplete Freund's adjuvant. Neutralizing activity was measured using as an index the inhibition of migration of CX3CR1-expressing cells against mouse fractal force-in to obtain a neutralizing antibody (5H8-4). The hybridoma producing this neutralizing antibody was named Ham®mFKN5H8-4.
  • CD4 positive CD45RB strong positive (CD4 + CD45RB high ) T lymphocyte transfer Inflammatory bowel disease model was prepared with reference to Powrie et al., Int. Immunol, 5, 1461-1471, 1993.
  • the spleen of a female, 10-10 week old Balb / c mouse (Charles Japan Ribaichi) was removed, and the tissue was ground on a cell strainer (Pharmingen) with a pore size of 100 ⁇ m to isolate spleen cells. .
  • the isolated spleen cells should be stored at room temperature for 15 minutes at room temperature with 5 ml of salt / ammonium solution (0.75% salt / ammonium, 16 mM Tris buffer, pH 7.4) per spleen.
  • salt / ammonium solution 0.75% salt / ammonium, 16 mM Tris buffer, pH 7.4
  • CD4 T lymphocytes were purified from the separated spleen cells using a CD4 T cell Isolation kit (Miltu).
  • a CD4 T cell Isolation kit Miltu
  • PE phycoerythrin
  • FITC recein isothiocyanate
  • CD4 positive CD45RB strong positive cells were sorted using FACSAria (Betaton Dickinson) to collect the target cells. After washing the recovered cells with PBS, and suspended in PBS to a cell concentration of 2xl0 6 / ml.
  • the CD4-positive CD45RB strongly positive cells prepared above were transferred into the peritoneal cavity of female, 8-10 week-old SCI D mice (Claire Japan) at a rate of 200 ⁇ l, that is, 4xl0 5 / mouse.
  • SCID mice transfected with 7 CD4 positive CD45RB strong cells in each group 500 ⁇ g of control antibody (Nomster IgG), 500 ⁇ g of anti-fractal force-in antibody (5-8-4) (the antibody is in PBS solution) ) was administered once every 3 days from the second week after cell transfer. In addition, administration was performed by tail vein force.
  • control antibody Nomster IgG
  • anti-fractal force-in antibody 5-8-4 (the antibody is in PBS solution)
  • administration was performed by tail vein force.
  • CD4 T cell Isolation kit Miruteyu Co.
  • the thickening of the large intestine was measured using a dial thickness gauge (Peacock Co., Ltd.), excluding the contents about 1.5 cm from the anus.
  • the large intestine was observed histopathologically by morphological observation and tissue section staining with Meyer's hematoxylin eosin staining.
  • RNA expression of iNOS, etc. was performed using total RNA (500 ng) purified from the large intestine using RNeasy mini kit (Qiagen) and AMV reverse transcriptase (TAKARA) and random hexamer (TAK).
  • CDNA obtained by reverse transcription using ARA was used as a template and analyzed by real-time PCR.
  • For real-time PCR prepare a reaction mixture of various primers, QuantiTect SYBR Green PCR kit (Qiagen) reagent, uracil-DNA-glycosylase (Invitrogen), and then ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems) I went to use it.
  • PCR was performed at 50 ° C. for 2 minutes and 95 ° C. for 15 minutes, followed by 35 cycles of 95 ° C. for 15 seconds and 60 ° C. for 1 minute.
  • the set of primers used is as follows.
  • the anti-fractal force-in antibody (5H8-4) administration group In contrast to the control antibody administration group, the anti-fractal force-in antibody (5H8-4) administration group The decrease was suppressed ( Figure 1). In addition, the anti-fractal force-in antibody (5H8-4) administration group showed an improvement in stool property score and colon thickening compared to the control antibody administration group (FIG. 2). In the morphological observation of the large intestine, thickening was observed from the colon to the rectum in the control antibody administration group, and improvement was observed by the administration of anti-fractal force-in antibody (5H8-4) (Fig. 3).
  • mice Iijima et al., J. Exp. Med., 199, 471-482, 2004 was referred to for the mouse oxazolone-induced inflammatory bowel disease model.
  • the abdomen of male 8- to 10-week-old Balb / c mice (Nippon Charles' Ribaichi) was shaved about 2 cm square.
  • Anti-fractal force-in antibody (5H8-4) was administered on the 5th day of sensitization (immediately before intestinal oxazolone injection). In addition, antibody administration also performed tail vein force. Evaluation items were Disease Activity Index (DAI; scored as DAI value by calculating stool hardness, blood content, and weight gain and loss), shortening of large intestine, thickening of colon and pathological observation Evaluation was performed. As shown in Table 3, DAI used was DAI (Cooper et al., Lab. Invest., 69, 238-249, 1993) used in dextran sulfate sodium-induced colitis.
  • DAI Disease Activity Index
  • the anti-fractal force-in antibody (5H8-4) administration group showed improvement in DAI from the second day of intestinal oxazolone injection (Fig. 6).
  • the thickening and shortening of the large intestine also showed improvement in the anti-fractal force-in antibody (5H8-4) administration group compared to the control antibody administration group (Fig. 7).
  • the colon force was also observed in the rectal region, and thickening was observed, and an improvement was observed by the administration of anti-fractal force-in antibody (5H8-4) (Fig. 8).
  • the fractal force-in-CX3CR1 cell infiltration system is expected to play an important role in the oxazolone-induced colitis model, and the fractal force-in-CX3CR1 cell infiltration system is expected to play an important role in inflammatory bowel disease. It was suggested that this is a useful treatment system.
  • Hybridomas producing anti-fractal force-in antibodies were cloned by two limiting dilutions. Monoclonal antibodies were purified using protein A columns from SCID and pristane-administered ascites produced by inoculating Hypridoma into nude mice. The neutralizing activity of the obtained antibody was measured using the inhibition of migration of CX3 CR1-expressing cells against mouse fractal force in as an index, and # 126 antibody having neutralizing activity was obtained. The Hypridoma producing this neutralizing antibody was named Ham®mFKN # 126.1.1.
  • Example 2 The same method as in Example 2 was used for examination.
  • the evaluation items were colon shortening and colon thickening.
  • 500 g of a control antibody (Nomstar IgG) and 500 g of an anti-fractal force-in antibody (# 126) (the antibody is a PBS solution) were administered to 7 mice each inoculated with oxazolone.
  • mice were intravenously administered with 500 ⁇ g of control antibody (Nomster IgG) and 500 g of anti-fractal force-in antibody (5H8-4) (the antibody was in PBS).
  • Conca Nanoculin A ConA, Sigma-Aldrich
  • PBS phosphate buffer
  • iNOS mRNA expression was measured by real-time PCR by collecting RNA, synthesizing cDNA in the same manner as in Example 1.
  • control antibody or anti-fractal force-in antibody and ConA, and PBS as a negative control group were intravenously administered, and the liver was removed 12 hours later to prepare frozen tissue sections. Immunohistochemical staining was performed with anti-iNOS antibody and anti-CX3CR1 antibody, and the number of iNOS and CX3CR1 positive cells was measured.
  • iNOS mRNA expression increased by the administration of ConA was significantly reduced by the administration of anti-fractal force-in antibody.
  • the expression of cytotoxic factors such as granzyme B and Fas, and mRNAs of cytoforce-ins such as IFN y, TNF a, and IL-4 are also increased by the administration of ConA, and anti-Flatalkine antibody (5H8-4) Decrease in expression was observed after administration of (Fig. 11).
  • iNOS-positive inflammatory cells increased with the administration of ConA, and decreased significantly with the administration of anti-fratarcaine antibody (Fig. 12).
  • CX3CR1-positive inflammatory cells were also increased by the administration of ConA and decreased significantly by the administration of the anti-fractal force-in antibody (5H8-4) (Fig. 12).
  • the above results force Fractal force in and CX3CR1 Inhibiting the use of inflammatory cells clearly suppresses the expression of iNOS mRNA in the liver and the suppression of iNOS production in inflammatory cells, which inhibits excessive NO production by inflammatory cells. This suggests that liver tissue damage is reduced.
  • CX3CR1-positive cells are mainly round and small, with the nucleus adjacent to the portal vein, central vein, and sinus oid, which have a horseshoe shape and little cytoplasm, and some are necrotic ( necrotic region).
  • the iNOS-positive cells are largely developed, the nucleus is horseshoe-shaped, and the cytoplasm is adjacent to a large sinusoidal site, and the force portal vein and central vein seen in the necrotic area in addition to the marginal area of the necrotic area It was not seen in the vicinity. In this way, since there were differences in the morphology and localization of CX3CR1-positive cells and iNOS-positive cells, the characteristics of CX3CR1 and iNOS-positive cells were analyzed in detail.
  • Example 4 In the same manner as in Example 4, a frozen tissue section was prepared using the liver (ConA hepatitis liver tissue) 12 hours after intravenous administration of ConA.
  • Anti-CX3CR1 antibody or anti-iNOS antibody (BD Bioscience) and anti-BM8 antibody (BMA), anti-0111) antibody (683 ( ⁇ 6), or anti-MCP-1 antibody (Gengyme Techne)
  • BMA anti-BM8 antibody
  • anti-0111 683 ( ⁇ 6)
  • anti-MCP-1 antibody Genegyme Techne
  • the above-mentioned anti-CX3CR1 antibody was an antibody prepared in Usagi using a mouse CX3CR1 C-terminal peptide (CSILSSFTHYT SEGDGSLLL (SEQ ID NO: 31)) as an antigen. Specifically, it was obtained as follows.
  • the synthetic peptide of SEQ ID NO: 31 was conjugated with KLH and immunized with rabbit (JW) with an adjuvant at 250 g / feather.
  • Adjuvant was Freund's complete adjuvant only for the first time and the rest was Freund's incomplete adjuvant. Immunization was performed a total of 5 times, and the increase in antibody titer was confirmed by ELISA using a solid phase peptide, and serum was collected.
  • CX3CR1-positive cells in peripheral blood (PBL) and C57BL / 6 male 9-week-old bone marrow cells were cultured in M-CSF (50 ng / ml) for 5 days, and the bone marrow cell force was also separated.
  • CX3CR1-positive cells in macrophages (B MM ⁇ ) were treated with anti-F4 / 80 antibody (CA LTAG) and F4 / 80 specific for macrophages and monocytes, and Ly6C, a surface marker for immature myeloid cells. Analysis was performed by flow cytometry (FACS) using an anti-Ly6C antibody (manufactured by BMA). In addition, tissue staining of ConA hepatitis tissue with anti-Ly6C antibody and tissue staining of anti-MCP-1 antibody of ConA hepatitis tissue infiltrated with fluorescently labeled macrophages were performed.
  • FACS flow cytometry
  • FIG. 14 shows the results of measuring the positive rate of each marker.
  • BM8 + means BM8 positive
  • CDllb + means CDllb positive
  • MCP1 + means MCP-1 positive.
  • MCP-1 a ligand for CCR2.
  • FIG. 15 shows the results of FACS analysis of CX3CR1-positive cells.
  • Figure 16 shows the results of tissue staining.
  • CX3CR1-positive cells in peripheral blood (PBL) by FACS showed that CX3CR1 was expressed in F4 / 80-positive monocytes, and the expression level was strong in Ly6C-mature monocytes and Ly6C + immature monocytes It was weak.
  • BMM ⁇ was fluorescently labeled with CFSE 10 ⁇
  • 2.5 ⁇ 10 6 cells / 250 1 cells were intravenously injected into the mouse
  • ConA (15 mg / kg) was intravenously injected 10 minutes later. Collected and examined for infiltration. ConA administration significantly increased ⁇ infiltration into the liver. The infiltrated fluorescently labeled cells produced MCP-1 by ConA administration. iNOS was not expressed in fluorescently labeled cells and was derived from the host
  • the chemokine mRNA expression was measured by real-time PCR in the same manner as in Example 1.
  • the primer sets used were as follows.
  • As a control gene the dalycel aldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH) gene was used.
  • ConA administration increased mRNA expression of MCP-1, KC, MIP-2, IP-10, MIP-1a, and MIP-1 ⁇ in the liver 2 hours later.
  • the mRNA expression of these chemokines was reduced by the administration of anti-fractal antibody. Based on the above results, by inhibiting the interaction between fractal force-in and CX3CR1, the production of many types of chemokines is suppressed, and a wide range of amplification circuits for inflammatory cell infiltration and activation, which are the initial induction reactions of inflammation, are observed. It was suggested that it would not work.
  • Example 2 Using the large intestine-derived cDNA prepared in Example 1 in the same manner as in Example 1, in more detail, leukocyte markers, cytodynamic ins, chemokines, cell activity, and mRNA expression of molecules involved in tissue destruction. Measured with TaqMan PCR.
  • the set of primers used is as follows.
  • CD4 sense 5 '-GOGCTGTGGCAGTGTCTACT -3, 32
  • Ishiichi 12a sense 5 '-GCCAGGTGTCTTAGCCAGTC-3, 48
  • I-12 ⁇ sense 5 '-ATCCAGCGCAAGAAAGAAAA -3, 50
  • MIP-2 sense 5 'TCCAGAGCTTGAGTGTGACG -3, 60
  • MCP-1 sense 5 'AGGTCCCTGTCATGCTTCTG -3, 62
  • IP-10 sense 5 '-TGAATCCGGAATCTAAGACCA ⁇ -3' 82
  • I-TAC sense 5 'CAAGCAAGCTCGCCTCATA--3' 84
  • CD40 sense 5 'TGGATCTGTGCTTTTTGCTG -3, 90
  • CD80 sense 5 'GCTGAACAGACCGTCTTCCT -3' 92
  • Class I I sense 5 '-TCTACACCTGCGTGGTTCAG -3' 96
  • T and R2 sense 5 'TAGGGGCTTCACTTCTCTGC -3, 98
  • VEGF Receptor 2 sense 5 'CCAAGCTCAGCACACAGAAA-3, 102
  • MMP-2 sense 5 ' ⁇ CCCCTGATGTCCAGCAAGTA -3' 104
  • MMP-14 sense 5 '-CTGGGAAGGAATCCCTGAAT -3' 108
  • Example 1 In the control antibody administration group, mRNA expression of various leukocyte markers such as CD4, T-beta, F4 / 80, M-CSF receptor (M-CSFR), Ly-6G, and CDllc was increased (FIG. 18). From these results, in the tissue section staining of Example 1, a large number of infiltrated leukocytes in the control antibody administration group were CD4 + T cells (especially Thl type CD4 + T cells), monocytes / macrophages, neutrophils. Possibility that many types of leukocyte power such as dendritic cells are also composed Was suggested.
  • chemokine-chemokine receptor KC, MIP-2, CXCR2, MC P—1, MCP—3, CCR2, MIP—1a, MIP—1 ⁇ , CCR5, IP—10, I—TAC, CXCR3, Since increased mRNA expression of TARC, MDC, and CCR4 was observed in the control antibody administration group, it was speculated that infiltrated leukocytes were infiltrated via these chemokine-chemokine receptor mechanisms (Figs. 19 and 20). ).
  • mRNA expression of bFGF and VEGF Receptor 2 involved in angiogenesis at the inflammatory site was also significantly increased in the control antibody administration group (FIGS. 21 and 22). It is also expressed in CD40, TLR2 and activated T cells, which are active receptors such as rod cells, and is expressed by CD40L, a molecule that activates rod cells, and CD80 whose expression is enhanced by the activity of rod cells.
  • An inflammatory bowel disease model was prepared in the same manner as in Example 2.
  • a control antibody and anti-fractal force-in antibody (5H8-4) were administered according to the method of Example 2.
  • Oxazolone intestine At 24 hours and 3 days after injection, autopsy was performed, the large intestine was removed, and RNA was extracted from the large intestine tissue using the same method as in Example 1.
  • the negative control group received an intestinal injection of 50% ethanol saline.
  • cDNA was synthesized using the same method as in Example 1, and mRNA expression of cytoforce-in and chemokine was measured by TaqMan PCR.
  • the set of primers used is as follows.
  • MIP-2 sense 5 '-TCCAGAGCTTGAGTGTGACG -3, 118
  • MCP-3 sense 5 '-CTGCTTTCAGCATCCAAGTG -3, 126
  • inflammatory site forces such as IL-1 ⁇ and IL-6, KC, MIP-2, MCP-1, MCP-3, MIP-1a, MIP- Increased mRNA expression of chemokines such as 1 ⁇ and chemokine receptor CXCR2 was observed, and this increased expression was remarkably suppressed by administration of anti-fractal force-in antibody (FIG. 24).
  • Oxazolone enteral injection Three days later, in addition to I-1 ⁇ , IL-6, KC, MIP-2, MCP-1, MCP-3, and CXCR2, increased expression of Ly-6G, a neutrophil marker, was observed.
  • the present invention provides a therapeutic agent for inflammatory diseases based on a new approach of selectively inhibiting excessive NO production by suppressing production of iNOS activity by inflammatory cells.

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Abstract

フラクタルカインとCX3CR1との相互作用を阻害する抗体を含有することを特徴とする、炎症性疾患治療剤を提供する。

Description

明 細 書
炎症性疾患治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、炎症性疾患治療剤に関する。
背景技術
[0002] ケモカインは生体内での主たる細胞遊走因子であり、細胞運動の亢進や細胞接着 分子の活性化を介して、リンパ球の組織浸潤を制御している。ケモカインは、その最 初の 2つのシスティン残基の配列により、 CC、 CXC、 C、 CXXXCの 4つのサブファミリ 一に分類される。 CC、 CXC、 Cケモカインのメンバーは、約 70アミノ酸力もなる分泌蛋 白質であり、それ自身には接着分子としての活性はないが、細胞接着を誘導すること ができる。分泌されたケモカインは、標的細胞表面上の 7回膜貫通型受容体に結合し て、三量体 G蛋白質を介してインテグリンを活性化し、細胞の接着や遊走を誘導する
[0003] 最近になって、従来の細胞遊走機構に加えて、新規の簡潔なリンパ球浸潤機構が 同定された。この機構は活性化された内皮細胞上に発現するフラクタル力インと、血 流中の単球、 NK細胞、そして T細胞の一部に発現する 7回膜貫通型受容体 CX3CR1 により媒介される。フラクタル力インは CXXXCケモカインの唯一のメンバーであり、そ の構造と機能にぉ 、て、他のケモカインには見られな 、際だった特徴を有して 、る。 フラクタル力インは、ケモカインドメイン、ムチンドメイン、細胞膜貫通領域、細胞質内 領域を有する膜結合型として細胞表面上に発現する。膜結合型フラクタル力インは C X3CR1と結合することで、生理的血流速存在下においても、セレクチンやインテグリ ンの介在なしに、単独で強固な接着を媒介することが可能である。すなわち、セレク チンやインテグリンを介する多段階の細胞浸潤機構と同様な機能を、フラクタルカイ ン -CX3CR1細胞浸潤系は一段階の反応で媒介する。さらに、膜結合型フラクタル力 インカゝらシエディングによって分泌される分泌型フラクタル力インは、 CX3CR1に結合 して、従来のケモカインと同様に、インテグリンの活性化や細胞遊走を誘導する。
[0004] また、フラクタル力インは、血管内皮細胞を炎症性サイト力インの TNFや IL-1で処理 すると発現が誘導される。一方 CX3CR1は単球や、 NK細胞のほとんどと、 T細胞の一 部に発現している力 好中球には発現していない。したがって、フラクタル力イン- CX 3CR1細胞浸潤系は、損傷を受けた組織の内皮細胞上、又は組織内に、ある種の免 疫細胞を動員するための、きわめて効率の良い機構であると考えられる。フラクタル 力インは上記のように炎症時に血管内皮細胞に誘導され、 CX3CR1は多種類の白血 球に存在していることから、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系は、炎症性疾患に おける病態形成および進展への関与も強く示唆されている。実際にフラクタル力イン -CX3CR1細胞浸潤系と炎症性疾患における関与については数多く報告されており、 関節リューマチ (非特許文献 1)、潰瘍性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸 疾患 (非特許文献 2)、乾癬およびアトピー性皮膚炎 (非特許文献 3、非特許文献 4)、 喘息 (非特許文献 5)、動脈硬化症 (非特許文献 6)、急性呼吸促迫症候群 (非特許 文献 7)、など数多くの疾患について報告がなされている。一方では CX3CR1ノックァ ゥトマウスを用いた解析 (動脈硬化症 (非特許文献 8)、虚血性再灌流による組織障 害 (非特許文献 9) )、抗フラクタル力インモノクローナル抗体を用いた炎症性疾患の 病態モデル解析 (マウス Π型コラーゲン誘発関節炎、実験的自己免疫性脳髄膜炎 ( 特許文献 1)、コンカナパリン A誘発肝障害 (特許文献 1)、抗 CX3CR1抗血清を用い た病態モデル解析 (WKYラット半月体形成性腎炎 (非特許文献 10)、ァロ心臓移植 片の拒絶 (非特許文献 11) )、あるいはフラクタル力イン抑制変異体を用いた炎症性 疾患の病態モデル解析 (MRL/lprループス腎炎（2004年 4月 日本リュウマチ学会）） から、炎症性疾患において、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系を阻害することで 病態進展抑制及び改善効果が期待され、炎症性疾患における新たな治療体系を構 築できるものと期待されている。し力しながらフラクタル力インと CX3CR1の相互作用を 阻害することにより発揮される、これら病態改善作用の詳細なメカニズムは未だ不明 であるのが現状である。
これまでに白血球の分類は、数多くの細胞表面マーカーによりリンパ球、単球、顆 粒球それぞれの集団が細力べ分類されてきている。最近ではケモカイン受容体の分 布から、さらに詳細な分類がなされてきており、単一集団と思われていた集団がいく つかの亜集団から形成される集合であることが判明しつつある。マウスの解析力も CX 3CR1は、上述のように単球、 NK細胞、そして T細胞の一部に発現することが報告され ているが、その中でも単球には CX3CR1を強発現し CCR2を発現しない集団（CX3CR lhighCCR2-)と CX3CR1が低発現で CCR2を強発現する集団（CX3CR11<>WCCR2 + )の 2 つが存在することが明らかとなりつつある。 CX3CR1ノックアウトマウスや CCR2ノックァ ゥトマウスの解析から、 CX3CR11<>WCCR2 +は炎症時に炎症部位に誘導され、炎症性 サイト力インである TNF aや強力な NO (—酸化窒素）合成酵素の iNOS (inducible Nitr ogen Oxide Synthetase)を産生し、組織障害に寄与することが示唆されている（非特 許文献 12、非特許文献 13)。
Figure imgf000004_0001
て、炎症時にお ける機能や重要性にっ ヽては言及されておらず、むしろ非炎症時の構成的な組織 マクロファージの供給に必要であり、これら細胞の機能を阻害することは好ましくない と言われている。
[0006] 一方、ヒト末梢血における単球においても細胞表面マーカー（CD16、 CD62Lなど） と CX3CR1の発現により詳細な分類がなされている。その一つの集団である CD16+C D62L-の単球は炎症性疾患において、末梢血中に増加することが報告されており、 病態進展との関与が強く示唆されて 、る。 CD16+CD62L-の単球は CX3CR1を高発 現していることが報告されており、先にあげたマウス CX3CRlhighCCR2-とほぼ同様の 性質をもっと予想される（非特許文献 14)。また CD16+CD62L-の単球は TNF aや iN OSを強く産生することがすでに報告されており、炎症性疾患における末梢血中の増 カロと相まって、病態進展に強く関与していることが考えられる。しかし CX3CR1の機能 を阻害することで、これら細胞からの TNF aや iNOS産生抑制が認められるかどうか具 体的な報告は存在しない。
[0007] 最も高 、NO合成能力を持つ iNOSは、 eNOS (endothelial NOS)および nNOS (neura 1 NOS)のように定常的には発現しておらず、刺激因子 (例えば炎症性サイト力イン及 び Z又はリポ多糖体など）によって誘導され、一過性に大量に産生されて細菌、ウイ ルス、真菌、寄生虫の排除などの生体防御反応に関わっている。しかしながら過剰な NOの産生は糸且織障害的に作用するため、病変部における iNOSの過剰な産生は病 態を進展させる大きな要因となると考えられている。実際に NOが病態形成や進行に 関わると考えられている疾患としては、炎症性疾患 (例えば、リウマチ性炎症、関節リ ユーマチ、変形性関節炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、乾癬、動脈硬化症、自己免 疫疾患、又は急性炎症など）、アレルギー疾患 (喘息、アトピー性皮膚炎）、虚血性障 害 (例えば、梗塞若しくは虚血などに起因する各種の心臓障害若しくは脳障害、又は 虚血後の再灌流障害など）、ショック (例えば、内毒性ショック、出血性ショック、又は 心臓性ショックなど）、病的な血圧低下 (例えば、サイト力インを用いる癌治療における 血圧低下、又は敗血症、出血性ショック、若しくは肝硬変において生じる血圧低下な ど）、移植拒絶反応、神経系障害 (例えば、アルツハイマー病、てんかん、又は片頭 痛など）、腫瘍、又はインシュリン依存性糖尿病などが挙げられる。
[0008] 一方では病態モデルにおける iNOS活性の阻害あるいは iNOSノックアウトマウスの 解析から、関節リューマチ (非特許文献 15)、変形性関節症 (非特許文献 16)、潰瘍 性大腸炎やクローン病に代表される炎症性腸疾患 (非特許文献 17、非特許文献 18 )、コンカナパリン A誘発肝障害 (非特許文献 19)、喘息 (非特許文献 20)、エンドトキ シン誘導急性肺障害 (非特許文献 21)、動脈硬化症 (非特許文献 22)、虚血性障害 (非特許文献 23、非特許文献 24、非特許文献 25)、移植拒絶反応 (非特許文献 22) などにお!、て病態の改善が報告されて!、る。
[0009] このように実際に数多くの疾患モデル動物にぉ 、て iNOS活性の阻害あるいは iNOS ノックアウトマウスによる病態改善の報告がなされている力 未だ有望な iNOS活性を 阻害する薬剤は上巿されて 、な 、。
[0010] さらに、 iNOSの酵素活性阻害剤による過剰な NO産生の抑制は、敗血症ショックに 典型的な血圧低下や血管神経麻痺などの組織破壊や臓器障害を改善する一方で、 血圧 ·血流の調節と!/ヽぅ NOの根幹的な生理機能を遮断する危険性が示唆されて ヽ る（非特許文献 26)。特に iNOSノックアウトマウスを用いた敗血症における心筋機能 の解析では、産生する細胞の種類による iNOSの役割の違いが指摘されている。心筋 細胞で発現する iNOSは敗血症時のアドレナリン作動性刺激による心筋細胞の短縮と V、う有益な反応に必須である一方、心筋細胞の近傍に浸潤した炎症性細胞で発現 する iNOSは心筋細胞の障害と 、う有害な反応に関与して 、る（非特許文献 27)。
[0011] したがって、細胞種選択的な iNOS活性の阻害という新しいアプローチ、例えば iNO Sの酵素阻害ではなく炎症性細胞における iNOSの酵素阻害や産生抑制などによる薬 剤の提供が待ち望まれて ヽる。
非特許文献 1 : Arthritis Rheum. 2002 Nov;46(ll):2878-83
非特許文献 2 : Am J Pathol. 2001 Mar;158(3):855- 66
非特許文献 3 : J Allergy Clin Immunol. 2004 May;113(5):940- 8
非特許文献 4:J Clin Invest. 2001 May;107(9): 1173-81
非特許文献 5 : J Allergy Clin Immunol. 2003 Dec; 112(6): 1139- 46
非特許文献 6 :J Clin Invest. 2003 Apr;l 11(8): 1241- 50
非特許文献 7 : Clin Exp Immunol. 1999 Nov;118(2):298- 303
非特許文献 8 : Circulation. 2003 Feb 25;107(7):1009-16
非特許文献 9 : J Neuroimmunol. 2002 Apr;125(l- 2):59- 65
特許文献 1：特開 2002— 345454号公報
非特許文献 10 : Kidney Int. 1999 Aug;56(2):612- 20
非特許文献 11 :J Clin Invest. 2001 Sep;108(5):679- 88
非特許文献 12 : Immunity. 2003 Jul;19(l):71-82
非特許文献 13 : Immunity. 2003 Jul;19(l):59-70
非特許文献 14:J Exp Med. 2003 Jun 16;197(12):1701-7
非特許文献 15 : Eur J Pharmacol. 2002 Oct 18;453(1): 119-29
非特許文献 16 : Arthritis Rheum. 1998 Jul;41(7): 1275-86
非特許文献 17 :J Pharmacol Exp Ther. 2001 Sep;298(3): 1128-32
非特許文献 18 : Eur J Pharmacol. 2001 Jan 19;412(1):91- 9
非特許文献 19 :J Clin Invest. 2001 Feb;107(4):439-47
非特許文献 20 : J Pharmacol Exp Ther. 2003 Mar;304(3): 1285-91
非特許文献 21 :Anesth Analg. 2003 Dec;97(6):1751-5
非特許文献 22 : Eur J Pharmacol. 2000 Mar 10;391(1- 2):31- 8
非特許文献 23 : Br J Pharmacol. 1999 May;127(2):546-52
非特許文献 24: Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2002 Jun;282(6):H1996- 2003 非特許文献 25 : Nitric Oxide. 2004 May; 10(3) :170-7
非特許文献 26 : Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2002 Mar;l(l):89- 108 非特許文献 27 : Circulation. 2003 Sep 2;108(9):1107- 12
発明の開示
[0012] 本発明は、新しい概念に基づぐ炎症性疾患治療剤、具体的には炎症性腸疾患（ 特に潰瘍性大腸炎、クローン病）、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、動脈硬化症、虚 血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群などの治療剤の提供を目的とす る。
[0013] 本発明者は、これまでの知見から、 CX3CR1の機能を阻害することで、 iNOSの産生 が抑制され病態の改善を示した報告がな力つたことに注目し、この機能解明により新 しい概念に基づく炎症性疾患治療剤の創出に成り得るとの仮説を構築し、鋭意検討 を行った。
[0014] その結果、フラクタル力インと CX3CR1の相互作用を阻害し、 CX3CR1の機能を阻害 する抗体を用いて、後述する実施例に記載の各種病態モデルで検討した結果、 iNO Sの産生が抑制され、かつ、病態が改善されることを初めて見出した。さらに、フラクタ ルカインと CX3CR1の相互作用を阻害し、 CX3CR1の機能を阻害する抗体が ConA肝 炎に有効であることは報告されている力 今般、 ConA肝炎での肝臓における iNOS m RNAの発現抑制と、炎症性細胞での iNOSの産生が抑制されることを初めて見出した 。これらのことから、フラクタル力インと CX3CR1の相互作用を阻害し、 CX3CR1の機能 を阻害する抗体または CX3CR1の機能を阻害する化合物（以下「CX3CR1アンタゴ- スト」と略記する場合もある）は、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系が関与する疾 患であって、 iNOS活性または炎症性細胞による過剰な NOの産生が原因となる炎症 性疾患 [炎症性腸疾患 (特に潰瘍性大腸炎、クローン病）、乾癬、アトピー性皮膚炎、 喘息、動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群など]の治 療に有用であることを明らかにし、本発明を完成した。
[0015] すなわち、本発明は以下のとおりである。
( 1)フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体または CX3CR1アンタゴ 二ストを含有することを特徴とする、炎症性疾患治療剤。
(2)抗体が、抗フラクタル力イン抗体であることを特徴とする、（1)記載の剤。
(3)抗フラクタル力イン抗体力 モノクローナル抗体であることを特徴とする、（2)記載 の剤。
(4)受託番号 FERM BP-10372のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル 抗体 5H8-4、または受託番号 FERM BP-10371のハイブリドーマによって産生される モノクローナル抗体 #126であることを特徴とする、 (3)記載の剤。
(5)炎症性疾患が炎症性腸疾患である（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の剤。
(6)炎症性疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である（5)記載の剤。
(7)炎症性疾患が乾癬である（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の剤。
(8)炎症性疾患がアトピー性皮膚炎である（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の剤。
(9)炎症性疾患が喘息である（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の剤。
(10)炎症性疾患が動脈硬化症である（1)〜 (4)のいずれか一項に記載の剤。
(11)炎症性疾患が虚血再灌流における組織障害である（1)〜 (4) V、ずれか一項に 記載の剤。
(12)炎症性疾患が急性呼吸促迫症候群である（1)〜 (4)の 、ずれか一項に記載の 剤。
(13)受託番号 FERM BP- 10371のハイブリドーマ Ham @mFKN#126.1.10
(14) (13)記載のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 #126。
また、治療上有効量の、フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体ま たは CX3CR1アンタゴ-ストを炎症性疾患の治療が必要な患者に投与することを含む 、炎症性疾患の治療方法、及び、炎症性疾患治療剤の製造における、フラクタル力 インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体または CX3CR1アンタゴ-ストの使用を 提供する。
図面の簡単な説明
[図 1]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルの体重減 少における、抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 2]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける大 腸内便性状のスコアと大腸肥厚に対する、抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の 改善作用を示す。
[図 3]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける、 大腸の形態的な変化に対する、抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用 を示す (器官の形態の写真)。
[図 4]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける、 大腸の組織障害に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す ( 顕微鏡写真)。
[図 5]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける、 各種因子の mRNA発現に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用 を示す。
[図 6]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、 DAIに対する抗マウス フラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
圆 7]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、大腸肥厚、大腸短縮化 に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
圆 8]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、大腸の形態的な変化 に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す (器官の形態の写 真)。
圆 9]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、大腸の組織障害に対 する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
圆 10]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、大腸肥厚、大腸短縮 化に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (#126)の改善作用を示す (顕微鏡写真)。
[図 ll]ConA肝炎における、肝組織での各種因子の発現に対する抗マウスフラクタル 力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 12]ConA肝炎における、肝実質内の iNOS及び CX3CR1陽性の炎症性細胞の増 加に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す (顕微鏡写真） 圆 13]ConA肝炎肝組織における蛍光二重染色の結果を示す (顕微鏡写真)。
[図 14]ConA肝炎肝組織における CX3CR1陽性細胞または iNOS陽性細胞中の各マ 一力一陽性細胞の割合を示す。
[図 15]CX3CR1陽性細胞のフローサイトメトリーの結果を示す。 圆 16]ConA肝炎肝組織における組織染色の結果を示す (顕微鏡写真)。
[図 17]ConA肝炎におけるケモカインの発現と抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)のケモ 力イン発現に対する効果を示す。
[図 18]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける 、白血球マーカーの mRNA発現に対する抗マウスフラクタル力イン抗体（5H8-4)の改 善作用を示す。「正常」は陰性対照、「dgG」はコントロール抗体投与群、「@FKN」は 抗フラクタル力イン投与群を意味する（図 19〜25においても同様である）。
[図 19]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける 、ケモカインおよびケモカイン受容体の mRNA発現に対する抗マウスフラクタル力イン 抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 20]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける 、ケモカインおよびケモカイン受容体の mRNA発現に対する抗マウスフラクタル力イン 抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 21]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける 、サイト力インの mRNA発現に対する抗マウスフラクタル力イン抗体（5H8-4)の改善作 用を示す。
[図 22]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける 、血管新生分子および組織破壊プロテアーゼの mRNA発現に対する抗マウスフラクタ ルカイン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 23]マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおける 、榭状細胞および T細胞活性ィ匕分子の mRNA発現に対する抗マウスフラクタル力イン 抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 24]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、ォキサゾロン腸注 24 時間後のサイト力イン、ケモカインおよびケモカイン受容体の mRNA発現に対する抗 マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。
[図 25]マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、ォキサゾロン腸注 3日 後の好中球マーカー、サイト力イン、ケモカインおよびケモカイン受容体の mRNA発 現に対する抗マウスフラクタル力イン抗体 (5H8-4)の改善作用を示す。 発明を実施するための最良の形態
[0017] < 1 >微生物の寄託
ハイブリドーマ Ham ®mFKN5H8-4は、 2004 (平成 16年）年 9月 29日付で独立行政法 人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 1中央第 6)に寄託され (受託番号: FERM P-20236)、その寄託は、ブタペスト条約 に基づく国際寄託に移管された (受託番号： FERM BP-10372)。
[0018] ハイブリドーマ Ham ®mFKN#126.1.1は、 2004 (平成 16年）年 9月 29日付で独立行政 法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター (日本国茨城県つくば巿東 1丁 目 1番 1中央第 6)に寄託され (受託番号: FERM P-20235)、その寄託は、ブダペスト 条約に基づく国際寄託に移管された (受託番号： FERM BP-10371)。
[0019] < 2>フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体
フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体は、以下のようにして作製 することができる。
[0020] 哺乳動物（例えばマウス、ハムスター又はゥサギ）は、該哺乳動物において免疫応 答を引き起こす免疫原の形態の CX3CR1又はフラクタル力イン又は蛋白質断片（例え ばペプチド断片）で免疫することができる。
[0021] CX3CR1又はフラクタル力インの遺伝子（例えば、 GenBank NM_001337又は NM_00 2996参照）を組み込んだ発現ベクターを宿主細胞、例えば細菌、哺乳類細胞株又は 昆虫細胞株中で発現させ、培養液又は菌体 ·細胞力 標準的な方法に従って CX3C R1又はフラクタル力インを精製することができる。また、例えば GST等との融合蛋白質 として発現させ、 GSTとの融合蛋白質の場合はダルタチオンカラムにより精製しても構 わない。
[0022] CX3CR1又はフラクタル力インのペプチドは CX3CR1又はフラクタル力インのアミノ酸 配列に基づき、公知の方法 (例えば、 F-moc又は T-boc化学合成）〖こより合成すること ができ、合成されたペプチドは適当な担体、例えば KLHと結合させることで免疫原性 を高めることち許される。
[0023] 精製された CX3CR1又はフラクタル力イン又はペプチド断片をアジュバントと共に免 疫後、抗血清を得ることができ、所望なら抗血清力もポリクローナル抗体を単離するこ とができる。また、モノクローナル抗体を産生するには、抗体産生細胞（リンパ球)を免 疫動物より回収し、標準的な細胞融合法によりミエローマ細胞と融合させて細胞を不 死化し、ノ、イブリドーマ細胞を得る。かかる技術は当該技術分野では確立された方法 であり、適当なマニュアル（Harlow et al, Antibodies: A Laboratory Mannual, 1998, C old Spring Harbor Laboratory)に準じて行うことができる。更に、モノクローナル抗体 はヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト B細胞ハイプリドーマ法（Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 72, 1983)、 EBV-ハイブリドーマ法（Cole et al., Monoclonal Anti body inCancer Therapy, 1985, Allen R. Bliss, Inc., pages 77— 96)、コンビナトリアル 抗体ライブラリーのスクリーニング（Huse et al., Science, 246: 1275, 1989)等他の方 法により作製しても良い。
[0024] また別法として、 CX3CR1を発現させた昆虫細胞をそのまま哺乳類動物に免疫して 、該哺乳動物のリンパ球よりハイプリドーマを作製し、産生される抗体のスクリーニン グを、 CX3CR1を発現させた哺乳類細胞 (昆虫細胞との交叉免疫性が低ぐ昆虫細 胞由来の蛋白質に対する抗体が結合しない細胞)で行う方法も許される。また、特開 2002-345454号公報の方法により調製することもできる。
[0025] フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体のスクリーニングは、後述 するスクリーニング方法によって行うことができる。
[0026] く 3 >CX3CR1アンタゴ-スト
本発明は、フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体力 フラクタル 力イン- CX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、 iNOS活性または炎症性細胞 による過剰な NOの産生が原因となる炎症性疾患の治療に有用であることを見出した ことにより完成したものである。したがって、フラクタル力インと CX3CR1の相互作用を 阻害し、 CX3CR1の機能を阻害する化合物、 CX3CR1アンタゴ-ストも本発明に使用 することができる。前記作用を有する化合物であれば特に限定されず、公知な化合 物であってもよぐ新規な化合物であってもよい。さらに、後述するスクリーニング方法 によって得られる化合物であってもよ 、。
[0027] 本明細書において「ィ匕合物」は、例えば遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分 子化合物ライブラリー、核酸 (オリゴ DNA、オリゴ RNA)、合成ペプチドライブラリー、 細菌放出物質、細胞 (微生物、植物細胞、動物細胞)抽出液、細胞 (微生物、植物細 胞、動物細胞)培養上清、精製または部分精製ポリペプチド、海洋生物、植物または 動物等由来の抽出物、土壌、ランダムファージペプチドディスプレイライブラリーであ る。具体的には、国際公開第 03/018549号パンフレット、国際公開第 00/09511号パン フレット、国際公開第 02/076990号パンフレットに記載された化合物などが挙げられる 。既知化合物はそれ自体公知の製造方法によって製造するか、天然化合物であれ ばそれ自体公知の抽出方法またはそれ自体公知の精製方法によって取得するか、 または市販されて!ヽる場合は購入することにより得ることができる。また既知化合物の 誘導体等は、化学的手段、物理的手段および Zまたは生化学的手段により改変し得 ることがでさる。
[0028] < 4 > CX3CR1とフラクタル力インの相互作用を阻害する抗体のスクリ一ユング方法
CX3CR1とフラクタル力インの相互作用を阻害する抗体または CX3CR1アンタゴニス トは、フラクタル力イン又は膜結合型フラクタル力インを発現する細胞に対し、 CX3CR 1陽性細胞が遊走する力否かによりスクリーニングできる。以下に CX3CR1陽性細胞 が遊走する力否かによりスクリーニングする具体的な方法について記載する力 本発 明はこれに限定されるものではない。
[0029] フラクタル力インに対する遊走は、例えばトランスゥエルカルチャーインサート（コー スター社製)を用いて、柳』定することができる。
[0030] トランスゥエルカルチャーインサートに、フラクタル力インを発現していない細胞例え ば ECV304細胞を培養し、カルチャーインサート上面に単層の細胞層を形成させる。 フラクタル力インを、適当な濃度好ましくは 10 nMの濃度になるように、遊走溶液 (例え ば RPMI- 1640: M199 = 1 : 1, 0.5% BSA, 20 mM HEPES, pH7.4)で希釈し、 24穴のゥ エルプレートに加える。 ECV304細胞を培養したトランスゥヱルカルチャーインサートを 24穴のトランスゥエルに取りつけ、遊走溶液に懸濁した適当な個数、好ましくは 106個 の末梢血単核球細胞をトランスゥエルカルチャーインサートにカ卩える。適当な条件好 ましくは 37°Cで 4時間培養した後、 ECV304細胞を通過して、ゥエルプレートに遊走し てきた細胞を回収し、細胞表面マーカーや細胞内抗原により同定する。好ましくは蛍 光標識した該細胞表面マーカーや細胞内抗原に対する抗体で蛍光染色した後、 FA CScal¾urを用いて定量する。
[0031] 遊走溶液中に、 CX3CR1又はフラクタル力インと結合する抗体をカ卩え、キラーリンパ 球、好ましくはパーフォリン及びグランザィム B又は CX3CR1を発現する細胞、更に好 ましくは CX3CR1を発現する細胞の遊走が抑制されれば、該抗体は CX3CR1とフラク タルカインの相互作用を阻害すると検定される。
[0032] また、 ECV304細胞に膜結合型フラクタル力インを発現させ、 MIP-1 βなどの他のケ モカインに遊走して来る末梢血単核球細胞を測定することによつても、抗体力 SCX3C R1とフラクタル力インの相互作用を阻害する力否かを検定可能である。
[0033] < 5 >iNOSの産生抑制
本明細書において「iNOSの産生抑制」、「iNOSの産生が抑制され」とは、 iNOSの mR NA発現量が抑制されること、もしくは iNOSタンパク質の産生量が抑制されることを意 味する。 iNOSの産生抑制は、リアルタイム PCR法、ウェスタンブロッテイング法、 ELISA 法（固相酵素免疫測定法)、 iNOS酵素活性測定法、いずれ力を用いて測定すること ができる。例えば、リアルタイム PCRは具体的には、以下の様に行う。トータル RNAを 組織及び細胞から常法により精製し、逆転写酵素と適当なプライマーを用いて cDNA を作製する。作製した cDNAをもとに、各分子に特異的なプライマーと DNAポリメラー ゼを用いることで各分子を特異的に増幅させることができる。各分子は、増幅させる 際に適当な蛍光色素を取り込ませることで、特定の機器 (PRISM 7700 Sequence Det ector (Applied Biosystems社製)など）を用いて増幅曲線をモニターすることができる。 内部標準遺伝子 (ダリセルアルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子など）により各 分子の補正を行うことで、各分子の組織及び細胞における mRNA発現量を定量的に 柳』定することができる。
[0034] < 6 >フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体または CX3CR1アンタ ゴニストの用途
本発明は、フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体または CX3CR1 アンタゴニストを含有する炎症性疾患治療剤を提供するものである。前記治療剤にお いては、前記抗体はフラクタル力インと結合するものであることが好ましい。抗体を含 有する本発明の治療剤をヒトに適用する場合には、以下の態様が好ましい。 [0035] ヒト以外の動物、例えばマウスを免疫動物として作製されたマウスモノクローナル抗 体は、ヒトに投与した場合異種蛋白質として認識されて、モノクローナル抗体に対す る免疫応答を生じさせてしまうことが多い。この問題点を回避する一つの方法はキメラ 抗体、すなわち抗原結合領域がマウスモノクローナル抗体由来、それ以外の領域が ヒト抗体由来の抗体である。本発明におけるフラクタル力インと CX3CR1との相互作用 を阻害する抗体はキメラ抗体も含むものである。キメラ抗体としては、抗原結合領域と してマウスモノクローナル抗体の可変領域全体を使ったキメラ抗体（Morrison et al.， Proc. Natl.Acad. Sci. USA, 81: 6851, 1985、 Takeda et al., Nature, 314: 452, 1985) 、また抗原結合領域としてヒト由来のフレームワーク領域とマウスモノクローナル抗体 由来の超可変領域を組み合わせて使ったキメラ抗体（Teng et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, 80: 7308-12, 1983、 Kozbar et al., Immunol. Today, 4: 7279, 1983)が挙 げられる力 本発明はこれに限定されるものではない。
[0036] また本明細書におけるフラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体は 、 CX3CR1又はフラクタル力インと特異的に結合する抗体のフラグメント、例えば Fab 又は (Fab')フラグメントをも包含するものである。
2
[0037] 本発明の治療剤は、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であつ て、 iNOS活性または炎症性細胞による過剰な NOの産生が原因となる炎症性疾患、 具体的には炎症性腸疾患 (特に潰瘍性大腸炎、クローン病）、乾癬、アトピー性皮膚 炎、喘息、動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群など の治療が必要な患者に対して投与できる。炎症性疾患は、自己免疫疾患またはその 他の炎症性疾患であってもよい。また、炎症性疾患は、腎炎、心筋炎、自己免疫性 肝障害、多発性硬化症、リウマチ、または、その他の炎症性疾患であってもよい。
[0038] 本発明の治療剤の投与は、注射 (皮下、静脈内など)などの常法により行うことがで きる。
[0039] 治療剤の形態は、投与方法により適宜選択され、医薬的に許容可能な担体と組み 合わせた医薬組成物であってもよぐ例えば、注射用途に適した医薬組成物としては 、滅菌水溶液 (水溶性の場合)又は分散液および滅菌注射溶液又は分散液を即座 に調製するための滅菌粉末が挙げられる。注射用途に適した医薬組成物はいずれ の場合にぉ 、ても滅菌されて 、なければならず、容易な注射器操作が可能な程度に 流体でなければならな 、。該組成物は製造および貯蔵条件下で安定でなければな らず、細菌や真菌などの混入微生物の作用力も保護されていなければならない。担 体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコー ル、およびポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適当な混合物を含む溶媒で あるか又は分散媒体であってよい。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーテ イングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、 および界面活性剤を使用することによって維持することができる。微生物の作用から の保護は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フエ ノール、ァスコルビン酸、チメロサールなどにより行うことができる。多くの場合等張剤 、例えば糖、ポリアルコール、例えばマン-トール、ソルビトール、塩化ナトリウムなど が組成物中に含まれているのが好ましいであろう。注射用組成物の持続吸収は、吸 収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどを組成物中に 酉己合すること〖こより行うことができる。
[0040] 注射用溶液の調製は、必要なら上記成分の 1又はその組合せとともに所要量のフ ラタタルカインと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体を適当な溶媒中に配合し、つ いで滅菌濾過することにより行うことができる。一般に分散液の調製は、基本的な分 散媒体と上記から選ばれた必要な他の成分を含む滅菌媒体中に活性化合物を配合 することにより行う。滅菌注射溶液調製のための滅菌粉末の場合は、好ましい調製法 は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分と前もって滅菌濾過した所望 の追加成分との粉末が得られる。
[0041] 本発明の治療剤の投与量は、抗体の選択、投与対象、患者の年齢、性差、薬剤に 関する感受性、投与方法、疾患の履歴など、そして医師の判断に変化し得るが、適 当な投与量範囲は患者の体重 lkgあたり例えば約 0. 01〜30mg、好ましくは約 0. 1 〜10mg程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異なることを考 慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例えば経口投 与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こうした投与量 レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最適化手順を 用いて調整することができる。
[0042] さらに、 CX3CR1に対する抗体と、その抗体に結合した細胞毒性物質とを含むィムノ トキシンとすることもできる。
[0043] 毒性物質としては、サボリン、リシン、 Pseudomonas外毒素、ジフテリア毒素、化学療 法剤などが挙げられる。抗体と毒性物質の結合は、従来のィムノトキシンの作製に用 いられる方法によって行うことができる。このィムノトキシンは、 CX3CR1発現細胞特異 的に増殖抑制を示す。
[0044] CX3CR1アンタゴニストを含有する炎症性疾患治療剤を、ヒトに適用する場合には、 以下の態様が好ましい。 CX3CR1アンタゴ-ストは塩を形成してもよぐ薬学的に許容 し得る酸または塩基などとの塩が挙げられる。従って、 CX3CR1アンタゴニストまたは その塩は、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系が関与する疾患であって、 iNOS活 性または炎症性細胞による過剰な NOの産生が原因となる炎症性疾患、具体的には 炎症性腸疾患 (特に潰瘍性大腸炎、クローン病）、乾癬、アトピー性皮膚炎、喘息、 動脈硬化症、虚血再灌流における組織障害、急性呼吸促迫症候群などの治療に用 いることができる。得られた物質を単独で用いることも可能である力 薬学的に許容さ れ得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の 担体に対する割合は、 1〜90重量％の間で変動され得る。また当該治療剤は、経口 または非経口（例えば静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与)のい ずれかの投与経路で投与することができる。
[0045] 従って、 CX3CR1アンタゴニストまたはその塩を含有する医薬組成物は、投与経路 に応じて適当な剤形とされ、具体的には錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいは シロップ剤等による経口剤、または注射剤、点滴剤、リボソーム剤、坐薬剤等による非 経口剤を挙げることができる。これらの製剤は通常用いられている賦形剤、増量剤、 結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性化剤、滑沢剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶 解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤等を用いて常法により製造す ることができる。使用可能な無毒性の上記添加剤としては、例えば乳糖、果糖、ブドウ 糖、デンプン、ゼラチン、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、またはその塩 、エタノール、クェン酸、塩ィ匕ナトリウム、リン酸ナトリウムなどが挙げられる。 [0046] それらの投与形態としては、また、必要な投与量範囲は、得られる化合物の選択、 投与対象、投与経路、製剤の性質、患者の状態、そして医師の判断に左右される。 しかし、適当な投与量は患者の体重 lkgあたり例えば約 1. 0〜1, 500 g、好ましく は約 10〜500 g程度を投与するのが好ましい範囲である。投与経路の効率が異な ることを考慮すれば、必要とされる投与量は広範に変動することが予測される。例え ば経口投与は静脈注射による投与よりも高い投与量を必要とすると予想される。こう した投与量レベルの変動は、当業界でよく理解されているような、標準的経験的な最 適化手順を用いて調整することができる。
[0047] 本明細書において「治療」とは、一般的に、所望の薬理学的効果及び/または生理 学的効果を得ることを意味する。効果は、疾病および Zまたは症状を完全にまたは 部分的に防止する点では予防的であり、疾病および/または疾病に起因する悪影響 の部分的または完全な治癒と 、う点では治療的である。本明細書にぉ 、て「治療」と は、哺乳動物、特にヒトの疾病の任意の治療を含み、例えば以下の（a)〜(c)の治療 を含む：
(a)疾病または症状の素因を持ちうるが、まだ持って!/、ると診断されて 、な 、患者に おいて、疾病または症状が起こることを防止すること；
(b)疾病症状を阻害する、即ち、その進行を阻止すること；
(c)疾病症状を緩和すること、即ち、疾病または症状の後退を引き起こすこと。
[0048] 本発明で用いられるフラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体また は CX3CR1アンタゴ-ストは、 iNOSの産生抑制の作用を有するので、 CX3CR1アンタ ゴニストを有効成分とする iNOS産生抑制剤も提供される。 iNOS産生抑制剤は、上述 した治療剤と同様に組成物としてもよぐ iNOS産生抑制が必要な患者に、上述した治 療剤と同様に投与することができる。
[0049] 続いて実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。なおこれらは実施の一例 をして示すものであり、本発明はこれらにより何ら限定されるものではない。また以下 の記載に用いる略号は当該分野において慣例として用いられる略号に基づくもので ある。
実施例 1 [0050] マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 (CD4+CD45RBhigh) Tリンパ球移入炎症性腸疾患モ デルにおける抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)の効果
(1)抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)の調製
抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)は、以下の方法により調製した (特開 2002-345454 号公報)。抗原にはマウスフラクタル力イン (R&D社製）を用いた。抗原は TiterMaxァ ジュバンドと混合した後、アルメニアハムスターに免疫し、以降抗原のみで追加免疫 を行った。血清中の抗体価は ELISAを用いて測定した。抗体価が上昇したアルメニア ハムスター力もリンパ球を分離し、リンパ球： P3ミエローマ細胞の比率力 1になるよう に混合し、 PEG (ベーリンガー社製)を用いて細胞融合を行った。ハイプリドーマは、 R PMI-1640/10% FCS/HAT/10% Origen HCF (ISGN社製)を用いて、 96-ゥエルプレー トで 1週間培養した。そして、培養上清を用いて、 ELISAを実施し、陽性ゥヱルを同定 した。抗マウスフラクタル力イン抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈を 2回行 い、クロー-ングを行った。モノクローナル抗体は、不完全フロイントアジュバントを投 与した SCIDマウスにハイプリドーマを接種して作製した腹水から、プロテイン Aカラム を用いて精製した。中和活性は、 CX3CR1発現細胞のマウスフラクタル力インに対す る遊走を抑制することを指標にして測定し、中和抗体 (5H8-4)を得た。この中和抗体 を産生するハイブリドーマを Ham ®mFKN5H8-4と名づけた。
[0051] (2)方法
CD4陽性 CD45RB強陽性 (CD4+CD45RBhigh) Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデル の作製については Powrie et al. , Int. Immunol, 5, 1461-1471, 1993を参考にした。 雌性、 8〜10週齢の Balb/cマウス（日本チャールズ 'リバ一）の脾臓を摘出し、孔径 100 μ mのセルストレーナ一 (ファーミンジェン社製)上で組織をすり潰し脾臓細胞を分離 した。分離した脾臓細胞は、脾臓一個あたり 5mlの塩ィ匕アンモ-ゥム溶液 (0.75%塩ィ匕 アンモ-ゥム、 16mMトリス緩衝液、 pH7.4)をカ卩ぇ 15分室温に放置し赤血球を溶解し た。脾臓細胞溶液に PBSを 2倍容量加え、 1500rpmで 5分遠心して沈殿を回収した。 分離した脾臓細胞から CD4 T cell Isolation kit (ミルテュー社製）により CD4 Tリンパ 球を精製した。 CD4陽性 CD45RB強陽性 Tリンパ球を分離するために、精製した CD4 Tリンパ球に対して、フィコエリスリン (PE)標識抗 CD4抗体 (eBioscience社製）、フルォ レセインイソチオシァネート（FITC)標識抗 CD45RB抗体（eBioscience社製）を用い二 重染色を行った。二重染色の後、 FACSAria (ベタトンディッキンソン社製）を用い CD4 陽性 CD45RB強陽性細胞をソーティングし目的の細胞を回収した。回収された細胞 は PBSで洗浄後、 2xl06/mlの細胞濃度に PBSにて懸濁した。雌性、 8〜10週齢の SCI Dマウス（日本クレア）の腹腔に、上記で調製した CD4陽性 CD45RB強陽性細胞を 200 μ 1ずつ、すなわち 4xl05/mouseで移入を行った。各群 7匹の CD4陽性 CD45RB強陽 性細胞を移入した SCIDマウスに、 500 μ gのコントロール抗体（ノヽムスター IgG)、 500 μ gの抗フラクタル力イン抗体 (5Η8-4) (抗体は PBS溶液)を、細胞移入後 2週間目より、 3日に 1回投与した。なお投与は尾静脈力も行った。また陰性対照群として、 CD4 T cell Isolation kit (ミルテュー社製）により精製し、 CD45RBの発現強度による分離をし て ヽな 、マウス CD4 Tリンパ球（トータル CD4)を 1.2xl06/mouseで移入した SCIDマウ ス 4匹を用いた。各抗体投与後 2週間後に剖検を行い体重減少、大腸内便性状をス コア化したもの、大腸肥厚、 iNOS mRNA発現解析、病理学的観察により評価を行つ た。便性状のスコアは表 1に示すようにデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用い られている便性状のスコア（Cooper et al., Lab. Invest., 69, 238-249, 1993)を使用し た。
[0052] [表 1] 表 1 便性状スコア
Figure imgf000020_0001
[0053] また大腸肥厚はダイヤルシックネスゲージ (ピーコック社製)を用い、肛門部から約 1 .5cmの部位を内容物を除き測定した。また大腸は形態的観察とマイヤーのへマトキ シリン 'ェォジン染色による組織切片染色にて病理組織学的観察を行った。
[0054] また iNOS等の mRNA発現は、大腸より RNeasy mini kit (キアゲン社製)を用いて精製 した全 RNA (500 ng)を AMV逆転写酵素（TAKARA社製)とランダムへキサマー（TAK ARA社製)を用いて逆転写して得た cDNAをテンプレートとして、リアルタイム PCRにて 解析した。リアルタイム PCRは、各種プライマーと QuantiTect SYBR Green PCR kit ( Qiagen社製)の試薬、ゥラシル- DNA-グリコシラーゼ（Invitrogen社製)を混合した反応 液を調製し、 ABI PRISM 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems社製)を用レヽ て行った。 PCRは、 50°C 2分、 95°C 15分の反応を行った後、 95°C 15秒および 60°C 1 分の反応を 35サイクル実施した。使用したプライマーのセットは以下のとおりである。
[0055] [表 2]
表 2
プライマー名 配列 配列番号 miNOS sense 5' - AGCTGAACTTGAGCGAGGAG-3' 1 mi OS anti- sense 5'- TGCCCCATAGGAAAAGACTG-3' 2 mfractalkine (FKN) sense 5'- GGCAAGATGACCTCACGAAT-3' 3 mfractalkine (FKN) anti- sense 5'- CTGTGTCGTCTCCAGGACAA-3' 4 mIFN- y sense 5'- GCTTTAACAGCAGGCCAGAC-3' 5 mIFN- y anti-sense 5'- GGAAGCACCAGGTGTCAAGT-3' 6 mTNF sense 5'- CCAGTGTGGGAAGCTGTCTT-3' 7 mTNF a anti-sense 5'- AAGCAAAAGAGGAGGCAACA-3' 8 mIL-4 sense 5'- GGCATTTTGAACGAGGTCAC-3' 9 mIL-4 anti-sense 5'- AAATATGCGAAGCACCTTGG-3' 1 0 mPerforin sense 5'- TGCAAGCAGAAGCACAAGTT-3' 1 1 mPerforin anti-sense 5'· TGTGTGTTCACTGGGAAGGA-3' 1 2 mGranzymeB (GrB) sense 5'- CCATCGTCCCTAGAGCTGAG-3' 1 3 mGranzymeB (lirB) anti-sense 5'- GCTGGTCCTTGTGAATGGAT-3' 1 4 mFasL sense 5'· CTGTGGCTACCGGTGGTATT-3' 1 5 mFasL anti- sense 5'- GTTCTGCCAGTTCCTTCTGC-3' 1 6 mFas sense 5'- GGAGACAGGATGACCCTGAA-3' 1 7 mFas anti- sense 5，- TTCAGCAATTCTCGGGATGT-3' 1 8
[0056] (3)結果
コントロール抗体投与群に対して、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投与群は、体重 減少が抑制された（図 1)。またコントロール抗体投与群に対して、抗フラクタル力イン 抗体 (5H8-4)投与群は、大腸内便性状スコアおよび大腸肥厚にぉ 、て改善を示し た（図 2)。大腸部位の形態的観察においても、コントロール抗体投与群では結腸か ら直腸部位において肥厚が観察され、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投与により改 善が認められた（図 3)。組織切片染色にお!ヽてコントロール抗体群では大腸粘膜層 に非常に多くの白血球 (Tリンパ球、単球、マクロファージなど）が浸潤し、粘液を産生 する杯細胞の消失や大腸上皮組織の損傷、過形成が認められるのに対し、抗フラタ タルカイン抗体 (5H8-4)投与群では、白血球の浸潤が抑制され大腸上皮細胞の損 傷も僅かであった（図 4)。一方 mRNA発現に関してもコントロール抗体投与群では iN OSの発現が上昇し、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)によりその発現が顕著に抑制さ れた。また、パーフォリン、 Fas、 FasLなどの細胞障害性因子、 IFN y , TNF aなどの サイト力インの mRNAに関してもコントロール抗体投与群では発現が上昇し、抗フラタ タルカイン抗体 (5H8-4)投与群では発現の抑制が認められた（図 5)。以上の結果か ら、フラクタル力イン- CX3CR1経路力 CD4陽性 CD45RB強陽性（CD4+CD45RBhigh) Tリ ンパ球移入炎症性腸疾患モデルにおいて重要な役割を果たすことが明らかとなった 。その作用は iNOS産生を抑制することで過剰な NOの産生を抑制し、組織障害を軽 減しているものと推察された。つまりフラクタル力イン- CX3CR1の相互作用阻害に基 づく iNOS産生抑制は、炎症性腸疾患に有用な治療体系であることが示唆された。 実施例 2
マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける抗フラクタル力イン抗体 (5H8- 4)の効果
(1)方法
マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルについては Iijima et al. , J. Exp. Med. , 199, 471-482, 2004を参考にした。雄性 8〜10週齢 Balb/cマウス（日本チャールズ' リバ一）の腹部を約 2cm四方剃毛した。 3% 4-エトキシメチレン- 2-フエ-ル- 2-ォキサ ゾリン- 5-オン（以下ォキサゾロン、シグマ社製）を含む 100%エタノール溶液を 150 μ 1 ずつ各マウスに塗布した。ォキサゾロン感作して力も 4日目に絶食し、 5日目にジェチ ルエーテル麻酔下のマウスの肛門力 約 3cmの部位に、 0.5%ォキサゾロンを含む 50% エタノール生理食塩水溶液を 100 1ずつマウスに腸注した。なお陰性対照群として 正常 Balb/cマウスに 50%エタノール生理食塩水溶液を 100 μ 1ずつ腸注したマウス 5匹 を設定した。各群 7匹のォキサゾロン腸注したマウスに、 500 /z gのコントロール抗体（ ハムスター IgG)、 500 /z gの抗フラクタル力イン抗体（5H8-4) (抗体は PBS溶液）を投与 した。なお抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投与は感作 5日目（ォキサゾロン腸注直前 )に行った。なお抗体投与は尾静脈力も行った。評価項目は疾患活動指数 [Disease Activity Index] (以下 DAI ;便の硬度、血の含有度合い、そして体重増減をスコア化し て DAI値として算出）、大腸の短縮化、大腸肥厚および病理学的観察により評価を行 つた。なお DAIは表 3に示すようにデキストラン硫酸ナトリウム誘発大腸炎で用いられ ている DAI (Cooper et al.， Lab. Invest., 69, 238-249, 1993)を使用した。
[0058] [表 3] 表 3 DAI
Figure imgf000023_0001
[0059] またォキサゾロン腸注 2日目より下痢および軟便が認められるため、 DAIについては 経時的に観察を行った。また大腸は形態的観察とマイヤーのへマトキシリン'ェォジ ン染色による組織切片染色にて病理組織学的観察を行つた。
[0060] (2)結果
コントロール抗体投与群に対して、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投与群は、 DAI においてォキサゾロン腸注 2日目より改善を示した（図 6)。また大腸の肥厚および短 縮化もコントロール抗体投与群に対して、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投与群は 改善を示した（図 7)。大腸部位の形態的観察において、コントロール抗体投与群で は結腸力も直腸部位にぉ 、て肥厚が観察され、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投 与により改善が認められた（図 8)。組織切片染色においてコントロール抗体群では大 腸粘膜層に非常に多くの白血球 (Tリンパ球、単球、マクロファージなど）が浸潤し、 粘液を産生する杯細胞の消失や大腸上皮組織の損傷、過形成が認められるのに対 し、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)投与群では、白血球の浸潤が抑制され大腸上 皮細胞の損傷も僅かであった（図 9)。以上の結果力もフラクタル力イン- CX3CR1細 胞浸潤系がォキサゾロン誘発大腸炎モデルにぉ 、ても重要な役割を果たして 、るこ とが予想され、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系が炎症性腸疾患において有用 な治療体系であることが示唆された。
実施例 3
[0061] マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける抗フラクタル力イン抗体 (#126 )の効果
(1)抗フラクタル力イン抗体 (#126)の調製
マウスフラクタル力イン（Genzyme社製）と TiterMax™Goldアジュバンドを混合した後 、アルメニアハムスターに複数回免疫し、さらに最終免疫をマウスフラクタル力インの みで行った。血清中の抗体価を固相化したフラクタル力インを用いた ELISAで測定し 、抗体価が上昇したアルメニアハムスター力 リンパ球を分離し、リンパ球: P3ミエロー マ細胞の比率が 5:1になるように混合し、 PEG (Rosh社製)を用いて細胞融合を行った 。 ノヽイブリドーマは、 RPMI— 1640/10% FCS/HAT/10% Origen HCF (ISGN社製)を用い て、プレートで 1週間培養した。そして、培養上清を用いて固相化したフラクタルカイ ンを用いた ELISAを実施し、陽性ゥエルを同定した。抗フラクタル力イン抗体を産生す るハイブリドーマは、 2回の限界希釈によりクローユングを行った。モノクローナル抗体 は、プリスタンを投与した SCIDおよびヌードマウスにハイプリドーマを接種して作製し た腹水から、プロテイン Aカラムを用いて精製した。得られた抗体の中和活性は、 CX3 CR1発現細胞のマウスフラクタル力インに対する遊走を抑制することを指標にして測 定し、中和活性を有する #126抗体を得た。この中和抗体を産生するハイプリドーマを Ham ®mFKN#126.1.1と名づけた。
[0062] (2)方法
実施例 2と同様の方法を用い検討を行った。評価項目は大腸短縮および大腸肥厚 とした。各群 7匹のォキサゾロンを腸注したマウスに、 500 gのコントロール抗体（ノヽム スター IgG)、 500 gの抗フラクタル力イン抗体 (#126) (抗体は PBS溶液）を投与した。
[0063] (3)結果 抗フラクタル力イン抗体 (#126)は抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)と同様に、コント ロール抗体投与群に比較し、大腸短縮および大腸肥厚を改善した（図 10)。以上の 結果から、異なる 2種類の抗フラクタル力イン抗体がォキサゾロン誘発大腸炎モデル において効果を示したことは、フラクタル力イン- CX3CR1細胞浸潤系の阻害が炎症 性腸疾患治療に有用であることが強く示唆された。
実施例 4
[0064] ConA肝炎における iNOSの発現と抗フラクタル力イン抗体（5H8-4)の iNOS産生に対 する効果
(1)方法
1群 4匹の C57BL/6マウスに、 500 μ gのコントロール抗体（ノヽムスター IgG)、 500 g の抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4) (抗体は PBS溶液)を静脈内投与し、直後にコンカ ナノくリン A(ConA、シグマアルドリッチ社製)を 12 mg/kgで静脈内投与した。その 2時 間後に肝臓を摘出し、 RNA抽出を行った。なお陰性対照群として C57BL/6マウスに P BS (リン酸バッファー）を静脈内投与したマウス 4匹を設定した。 iNOSの mRNA発現は 、実施例 1と同様の方法にて RNAを回収し、 cDNAを合成し、リアルタイム PCRにて測 定した。また、コントロール抗体あるいは抗フラクタル力イン抗体と ConA、陰性対照群 として PBSを静脈内投与して 12時間後の肝臓を摘出し、凍結組織切片を作製した。 抗 iNOS抗体と抗 CX3CR1抗体で免疫組織染色を行い、 iNOS, CX3CR1の陽性細胞 の数を測定した。
[0065] (2)結果
ConAの投与により上昇した iNOS mRNA発現は抗フラクタル力イン抗体の投与によ り顕著に減少した。また、グランザィム B、 Fasなどの細胞障害性因子、 IFN y , TNF a 、 IL-4などのサイト力インの mRNAに関しても、 ConAの投与により発現が上昇し、抗フ ラタタルカイン抗体 (5H8-4)の投与により発現の減少が認められた（図 11)。また、免 疫組織染色の結果から、 iNOS陽性の炎症性細胞は ConAの投与により増加し、抗フ ラタタルカイン抗体の投与により顕著に減少していた (図 12)。また、 CX3CR1陽性の 炎症性細胞も ConAの投与により増加し、抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)の投与によ り顕著に減少していた (図 12)。以上の結果力 フラクタル力インと CX3CR1の相互作 用を阻害することで、 ConA肝炎での肝臓における iNOS mRNAの発現抑制と、炎症 性細胞での iNOS産生が抑制されることが明ら力となり、炎症性細胞による過剰な NO の産生が阻害されることで、肝臓の組織障害が軽減されることが示唆された。
実施例 5
[0066] ConA肝炎における CX3CR1および iNOS発現細胞の解析
免疫組織染色の結果を詳細に解析した。 CX3CR1陽性細胞は主に丸く小型で、核 は馬蹄形で細胞質は少なぐ門脈 (portal vein)や中心静脈 (central vein),類洞 (sinus oid)に隣接しており、一部は壊死部 (necrotic region)の辺縁部でも認められた。 iNOS 陽性細胞は、主に大きく進展しており、核は馬蹄形で細胞質は大きぐ類洞に隣接し ており、壊死部の辺縁部に加え壊死部の中でも見られた力 門脈や中心静脈近傍で は見られなかった。このように、 CX3CR1陽性細胞と iNOS陽性細胞の形態や局在に は異なる点が見られたので、 CX3CR1および iNOS陽性細胞の特徴を詳細に解析した
[0067] (1)方法
実施例 4と同様に ConA静脈内投与 12時間後の肝臓 (ConA肝炎肝組織)を用い、 凍結組織切片を作製した。抗 CX3CR1抗体あるいは抗 iNOS抗体（BD Bioscience社 製）と抗 BM8抗体（BMA社製）、抗じ0111)抗体（68 3(^^6社製）、あるいは抗 MCP- 1 抗体（Gengyme Techne社製）で蛍光二重染色を行い、 CX3CR1陽性細胞および iNO S陽性細胞における BM8、 CDllb、 MCP- 1の陽性率を測定した。
[0068] 上記の抗 CX3CR1抗体は、抗原としてマウス CX3CR1 C末ペプチド（CSILSSFTHYT SEGDGSLLL (配列番号 31))を用いてゥサギで作製した抗体であった。具体的には 以下のようにして得た。配列番号 31の合成ペプチドを KLHと結合させ、ゥサギ (JW) にアジュバントと共に 1回あたり 250 g/羽免疫した。アジュバントは、初回のみフロイ ンド完全アジュバントを使用し、残りはフロインド不完全アジュバントを用いた。計 5回 免疫し、抗体価の上昇を、ペプチドを固相化した ELISAにより確認し、血清を回収し た。上記の配列のペプチドを Thiopropyl Sepharose 4B(Amersham Bioscience社製） に結合させたものを用いてァフィユティー精製を行 、、回収した血清カも抗 CX3CR1 抗体を得た。 [0069] さらに、末梢血（PBL)おける CX3CR1陽性細胞、および、 C57BL/6雄 9週令の骨髄 細胞を M-CSF (50ng/ml)で 5日間培養し、骨髄細胞力も分ィ匕させたマクロファージ (B MM φ )における CX3CR1陽性細胞を、マクロファージおよび単球に特異的な F4/80、 ならびに、未熟骨髄系細胞の表面マーカーである Ly6Cについて、抗 F4/80抗体 (CA LTAG社製)および抗 Ly6C抗体 (BMA社製)を用いて、フローサイトメトリー (FACS)に より解析した。また、抗 Ly6C抗体による ConA肝炎肝組織の組織染色、および、蛍光 標識したマクロファージを浸潤させた ConA肝炎肝組織の、抗 MCP-1抗体による組織 染色を行った。
[0070] (2)結果
代表的な染色像を図 13に示す。図中、写真の左および上の文字は、蛍光染色に 用いた抗体が認識するマーカーを示す。また、バーの長さは 20 /z mである。また、各 マーカーの陽性率の測定結果を図 14に示す。図中、 BM8+は BM8陽性、 CDllb+は CDllb陽性、 MCP1+は、 MCP- 1陽性を意味する。
[0071] CX3CR1陽性細胞は、丸く小型の CDllb陽性が 68.9 ±2.7% (n=3)、大型で進展した BM8陽性が 53.4±2.0% (n=3)であった。一方、 iNOS陽性細胞は、大型で進展した BM 8陽性が 81.6± 1.8% (n=3)、 CDllb陽性が 12.6±3.0% (n=3)であった。したがって、 CX 3CR1陽性細胞は iNOS陽性細胞と必ずしも同じ細胞ではなぐ一部は別の細胞集団 で発現していることが明ら力となった。最近、 iNOS産生細胞の浸潤には、 CCR2が関 与することが細菌感染モデルマウスにおいて報告されている（非特許文献 13)。そこ で、 CCR2のリガンドである MCP-1の発現を解析した。 MCP-1陽性細胞は、 CX3CR1 と同様に丸く小型であった。 CX3CR1陽性細胞の 72.5±3.7% (n=3)が MCP-1を発現し ており、逆に MCP-1陽性細胞のほとんどが CX3CR1陽性であった。したがって、 ConA 肝炎では、 CX3CR1陽性細胞は、 MCP-1を発現する主な細胞であることが明ら力とな つた。一方、 MCP- 1陽性細胞と iNOS陽性細胞は、形態が異なることから予想されるよ うに、 iNOS陽性細胞の 14.6±2.2% (n=3)しか MCP-1を発現しておらず、ほとんど一致 しなかった。したがって、 iNOS陽性細胞の多くは、 CX3CR1/MCP-1陽性細胞と異な ることが明ら力となった。興味深いことに、肝臓の類洞血管 (sinusoidal vessel)や壊死 部では、 iNOS陽性細胞と MCP-1陽性細胞は高頻度で隣接して存在して 、た。 [0072] CX3CR1陽性細胞の FACSによる解析結果を図 15に示す。また、組織染色の結果 を図 16に示す。
[0073] 末梢血（PBL)で CX3CR1陽性細胞を FACSで解析した結果、 CX3CR1は F4/80陽性 の単球で発現しており、発現量は Ly6C-成熟単球で強ぐ Ly6C+未熟単球で弱かつ た。 ConA投与 12時間後の肝臓を未熟骨髄系細胞の表面マーカーである Ly6Cで組 織染色した結果、 iNOS陽性の F4/80陽性細胞は Ly6C陽性であり、未熟単球由来で あることが示唆された。次に、 C57BL/6雄 9週令の骨髄細胞を M- CSF (50ng/ml)で 5 日間培養し、骨髄細胞力も分ィ匕させたマクロファージ (BMM φ )を得た。付着した BM M φを ImM EDTA/PBSで回収し FACSで解析を行った結果、末梢血成熟型単球と同 様の CX3CR1W F4/80+ Ly6C- /lowであった。そこで、 BMM φを CFSE 10 μ Μで蛍光 標識して 2.5χ106個/ 250 1の細胞をマウスに静注し、さらに 10分後に ConA (15mg/k g)を静注して 12時間後に肝臓を回収して浸潤を検討した。 ConA投与により、 ΒΜΜ の肝臓への浸潤は著しく増加した。また、浸潤した蛍光標識細胞は、 ConA投与によ り MCP-1を産生していた。 iNOSは、蛍光標識細胞では発現せず、宿主由来であった
[0074] 以上の結果から、炎症時には CX3CR1陽性成熟型単球は炎症局所に浸潤して MC P-1を発現し、 iNOS産生未熟型単球の炎症局所への浸潤を誘導することで病態を形 成することが示唆された。
実施例 6
[0075] ConA肝炎におけるケモカインの発現と抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)のケモカイン 発現に対する効果
(1)方法
実施例 4で作製した ConAを静脈内投与 2時間後の肝臓由来 cDNAを用い、実施例 1と同様の方法にて、ケモカインの mRNA発現をリアルタイム PCRにて測定した。使用 したプライマーのセットは以下のとおりであった。コントロール遺伝子として、ダリセル アルデヒド- 3-リン酸デヒドロゲナーゼ (G3PDH)遺伝子を用いた。
[0076] [表 4] 表 4
プライマ一名 配列 配列番号 mMCP- 1 sense 5' - AGGTCCCTGTCATGCTTCTG-3' 1 9 mMCP- 1 anti-sense 5'· TCATTGGGATCATCTTGCTG-3' 2 0 mKC sense 5'- CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG-3' 2 1 mKC &nti' sense 5'- TGGGGACACCTTTTAGCATC-3' 2 2 mMIP-2 sense 5'- TCCAGAGCTTGAGTGTGACG-3' 2 3 mMIP-2 anti-sense 5'- GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC-3' 2 4 mIP-10 sense 5'- TGAATCCGGAATCTAAGACCA-3' 2 5 mIP-10 anti-sense 5'- GAGGCTCTCTGCTGTCCATC-3' 2 6 mMIP- 1 a sense 5'- ACCATGACACTCTGCAACCA-3' 2 7 mMIP- 1 a anti-sense 5'- GATGAATTGGCGTGGAATCT-3' 2 8 mMIP- 1 β sense 5'- CCCACTTCCTGCTGTTTCTC-3' 2 9 mMIP- 1 β anti-sense 5'- CTCACTGGGGTTAGCACAGA-3' 3 0
[0077] (2)結果
結果を図 17に示す。図中、「normal」は陰性対照、「control」はコントロール抗体投 与群、「ant卜 FKN」は抗フラクタル力イン投与群を意味する。
ConAの投与により 2時間後に肝臓での MCP- 1、 KC、 MIP- 2、 IP- 10、 MIP-1 a、 MIP -1 βの mRNAの発現が上昇した。これらのケモカインの mRNA発現は抗フラクタル力 イン抗体の投与により減少した。以上の結果から、フラクタル力インと CX3CR1の相互 作用を阻害することで、多種類のケモカインの産生が抑制され、炎症の初期誘導反 応である炎症性細胞浸潤と活性化の増幅回路が広範囲に作動しなくなることが示唆 された。
実施例 7
[0078] マウス CD4陽性 CD45RB強陽性 (CD4+CD45RBhigh) Tリンパ球移入炎症性腸疾患モデ ルにおける、細胞表面マーカー、サイト力イン、ケモカイン、細胞活性ィ匕および細胞 障害性分子の mRNA発現と抗フラクタル力イン抗体 (5H8-4)の細胞表面マーカー、サ イト力イン、ケモカイン、細胞活性化および細胞障害性分子の mRNA発現に対する効 果
( 1)方法
実施例 1で作製した大腸由来 cDNAを用い、実施例 1と同様の方法にて、さらに詳 細に白血球マーカー、サイト力イン、ケモカイン、細胞活性ィ匕および組織破壊に関与 する分子の mRNA発現を TaqMan PCRにて測定した。使用したプライマーのセットは 以下のとおりである。
[表 5-1] 表 5
プライマ一名 配列 配列番号
CD4 sense 5' - GOGCTGTGGCAGTGTCTACT -3， 32
CD4 ant i-sense 5' ― CTGGTTCACCCCTCTGGATA -3， 33
F4/80 sense 5' - TGCCTCCCTGACTTTCAAAT -3' 34
F4/80 ant i-sense 5' - TGGCATTGCTGTATCTGCTC -3, 35
T-bet sense 5' - GGGAAGCTAAAGCTCACCAA -3， 36
T一 bet anti-sense 5' - CCTCTGGCTCTCCATCATTC -3' 37
CDl lc sense 5' - CTTATCGTGGGCAGCTCAGT -3' 38
CDl lc anti-sense 5' - CCATTTGCTTCCTCCAACAT -3' 39
M— CSF receptor sense 5' - CGACTTCTTCAAGTGACTCCTTC - 3' 40
M-CSF receptor ant i-sense 5' - CTACGTCCCGGTGGATGC -3' 41 し y - 6G sense 5' - GATGGATTTTGCGTTGCTCT -3' 42
Ly-6G anti-sense 5' - GTCCAGAGTAGTGGGGCAGA -3， 43
IL-Ιβ sense 5' - GCTGAAAGCTCTCCACCTCA -3, 44
Iし一 1β ant i-sense 5' - AGGCCACAGGTATTTTGTCG -3' 45
IL-6 sense 5' - CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG - 3' 46
IL一 6 ant i-sense 5' - GCCACTCCTTCTGTGACTCC -3, 47
Iし一 12a sense 5' - GCCAGGTGTCTTAGCCAGTC - 3, 48
Iし一 12ct ant i-sense 5' - TCTTCAATGTGCTGGTTTGG -3, 49
Iし - 12β sense 5' - ATCCAGCGCAAGAAAGAAAA -3, 50
Ιί-12β anti-sense 5' - AATAGCGATCCTGAGCTTGC - 3， 51
IL一 23α sense 5' - CAACAGCCAGTTCTGCTTGC -3, 52
IL— 23α ant i-sense 5' - GATCCTCTGGCTGGAGGAG - ■3' 53
IL一 17 sense 5' - TCCAGAAGGCCCTCAGACTA -3' 54
IL-17 ant i-sense 5' - TGAGCTTCCCAGATCACAGA -3， 55
RANKL sense 5' - CATTTGCACACCTCACCATC -3' 56
RANKL ant i-sense 5'一 TCCGTTGCTTAACGTCATGT -3, 57 [0080] [表 5- 2] 表 5 (続き)
プライマー名 配列 配列番号
KC sense 5' ― CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG -3, 58
KC anti-sense 5' TGGGGACACCTTTTAGCATC -3, 59
MIP- 2 sense 5' TCCAGAGCTTGAGTGTGACG -3, 60
MIP - 2 anti-sense 5' GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC ： -3' 61
MCP-1 sense 5' AGGTCCCTGTCATGCTTCTG -3， 62
MCP-1 anti-sense 5' TCATTGGGATCATCTTGCTG -3' 63
MCP-3 sense 5' CTGCTTTCAGCATCCAAGTG -3' 64
MCP— 3 ant i-sense 5' CCCAGGGACACCGACTACT - 3' 65
CXCR2 sense 5' - GCTCACAAACAGCGTCGTAG -3' 66
CXCR2 ant i-sense 5' - AGGGCATGCCAGAGCTATAA -3， 67
CCR2 sense 5' CTTTGCAACTGCCTCTTTCC -3， 68
CCR2 ant i-sense 5' - TTCCCAGGAAGAGGTTGAGA -3， 69
MIP— la sense 5' ACCATGACACTCTGCAACCA -3' 70
MIP - la anti-sense 5' ― GATGAATTGGCGTGGAATCT -3' 71
MIP-Ιβ sense 5' - CCCACTTCCTGCTGTTTCTC -3' 72
MIP - 1β anti-sense 5'一 CTCACTGGGGTTAGCACAGA -3, 73
CC 5 sense 5' GCCAGAGGAGGTGAGACATC -3, 74
CCR5 anti-sense 5' GCCAGAGGAGGTGAGACATC -3' 75
TARC sense 5' TGCTTCTGGGGACTTTTCTG -3， 76
TARC anti-sense 5' CATCCCTGGAACACTCCACT -3' 77
MDC sense 5' TTCTTGCTGTGGCAATTCAG -3, 78
MDC anti-sense 5' GCAGGATTTTGAGGTCCAGA -3, 79
CCR4 sense 5' TGTCCTCAGGATCACTTTCAGA -3' 80
CCR4 ant i-sense 5' - AGCAGGAGAAGCCAATGAGA -3' 81
IP - 10 sense 5' - TGAATCCGGAATCTAAGACCA ■ - 3' 82
IP— 10 ant i-sense 5' - GAGGCTCTCTGCTGTCCATC -3， 83
[0081] [表 5-3] 表 5 (続き)
プライマー名 配列 配列番号
I - TAC sense 5' CAAGCAAGCTCGCCTCATA - -3' 84
I一 TAし ant sense 5' - GCATGTTCCAAGACAGCAGA - 3' 85
CXCR3 sense 5' - GTTCTGCTGGTCTCCAGAGG - 3' 86
CXCR3 ant i-sense 5' - TGCCACCACCACTACCACTA -3' 87
CD40 sense 5' - GTCGGCTTCTTCTCCAATCA -3' 88
CD40 ant i-sense 5' GCATCCGGGACTTTAAACC - ■3' 89
CD40し sense 5' TGGATCTGTGCTTTTTGCTG -3， 90
CD40し ant i - sense 5' - CCTTCTCCTTTGTTGCATCTC -3' 91
CD80 sense 5' GCTGAACAGACCGTCTTCCT -3' 92
CD80 anti-sense 5' GTTTGCAGAGCCAGGGTAGT -3, 93
CD86 sense 5' - TTCAGCAAAACCAAATGCAG -3' 94
CD86 anti-sense 5' - TGCACTTCTTATTTCAGGCAAA -3' 95
Class I I sense 5' - TCTACACCTGCGTGGTTCAG -3' 96
Class II anti-sense 5' GCCAACACAGAAGATGATGAAG -3' 97
Tし R2 sense 5' TAGGGGCTTCACTTCTCTGC -3, 98
TLR2 anti-sense 5' ― CCAAAGAGCTCGTAGCATCC -3, 99
bFGF sense 5' - CCAACCGGTACCTTGCTATG -3， 100 bFGF anti-sense 5' GTGCCACATACCAACTGGAG -3, 101
VEGF Receptor 2 sense 5' CCAAGCTCAGCACACAGAAA - 3， 102
VEGF Receptor 2 anti-sense 5' TCAGAATCACGCTGAGCATT - 3, 103
MMP-2 sense 5' ― CCCCTGATGTCCAGCAAGTA -3' 104
MMP-2 anti-sense 5' ― TGCGATGAGCTTAGGGAAAC - 3' 105
MMP-9 sense 5' - AGACGACATAGACGGCATCC -3' 106
MMP-9 ant i-sense 5' - GTGGTTCAGTTGTGGTGGTG -3' 107
MMP-14 sense 5' - CTGGGAAGGAATCCCTGAAT -3' 108
MMP-14 anti-sense 5' CTGGGAAGGAATCCCTGAAT -3' 109 (2)結果
コントロール抗体投与群では CD4、 T- bet、 F4/80、 M-CSF receptor (M-CSF R)、 L y-6G、 CDllcなどの各種白血球マーカーの mRNA発現が亢進していた（図 18)。これ らの結果から、実施例 1の組織切片染色における、コントロール抗体投与群でのおび ただしい数の浸潤した白血球は CD4 + T細胞（特に Thlタイプ CD4+ T細胞)や単球/ マクロファージ、好中球、樹状細胞など多種類の白血球力も構成されている可能性 が示唆された。また各々のケモカイン-ケモカイン受容体、 KC、 MIP- 2、 CXCR2、 MC P— 1、 MCP— 3、 CCR2、 MIP— 1 a、 MIP— 1 β、 CCR5、 IP— 10、 I— TAC、 CXCR3、 TARC、 MDC、 CCR4の mRNA発現亢進がコントロール抗体投与群において認められたことか ら、浸潤した白血球はこれらケモカインーケモカイン受容体機構を介して浸潤したも のと推察された（図 19、図 20)。さらに一連の炎症性サイト力イン、 IL-1 β、 IL-6、 IL- 12 a、 11-12 β、 11-23 a、 11-17, RANKLや組織破壊に関与するプロテアーゼ MMP- 2 、 MMP-9、 MMP-14さらに炎症部位での血管新生に関与する bFGFや VEGF Recepto r 2の mRNA発現もコントロール抗体投与群にお 、て顕著な亢進が認められた（図 21 、図 22)。また榭状細胞などの活性ィ匕受容体である CD40や TLR2、活性化 T細胞で 発現し、榭状細胞などを活性化する分子 CD40L、榭状細胞の活性ィ匕により発現が増 強する CD80、 CD86などの T細胞活性化補助シグナル分子群および MHC Class IIの 発現亢進が認められたことから、 T細胞および榭状細胞などの抗原提示細胞が病変 部位において活性化され、抗原特異的な獲得免疫系が作動している可能性が示唆 された（図 23)。これら一連の白血球マーカー、ケモカインーケモカイン受容体、サイ トカイン、組織破壊分子、血管新生関連分子、 T細胞 '榭状細胞活性化分子の mRNA 発現は、抗フラクタル力イン抗体投与により顕著に抑制されていた（図 18〜図 23)。 以上の結果から、フラクタル力インと CX3CR1の相互作用を阻害することで、炎症性サ イトカインゃケモカインの産生が抑制され、炎症性細胞浸潤と活性ィ匕の増幅回路が 広範囲に作動しなくなり、炎症性腸疾患の病態進展が抑制される可能性が示唆され た。
実施例 8
マウスォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける、細胞表面マーカー、サイト力 イン、ケモカイン、細胞活性化および細胞障害性分子の mRNA発現と抗フラクタル力 イン抗体 (5H8-4)の細胞表面マーカー、サイト力イン、ケモカイン、細胞活性化および 細胞障害性分子の mRNA発現に対する効果
( 1)方法
実施例 2と同様の方法により炎症性腸疾患モデルを作製した。コントロール抗体、 坑フラクタル力イン抗体 (5H8-4)を実施例 2の方法に従 ヽ投与した。ォキサゾロン腸 注後 24時間および 3日目に剖検を行い、大腸を摘出後、大腸組織より実施例 1と同様 の方法を用い RNAを抽出した。陰性対照群には 50%エタノール生理食塩水を腸注し た。 RNAを抽出後、実施例 1と同様の方法を用い cDNAを合成しサイト力イン、ケモカ インの mRNA発現を TaqMan PCRにて測定した。使用したプライマーのセットは以下 のとおりである。
[表 6] 表 6
プライマー名 配列 配列番号
Iし一 1β sense 5' - GCTGAAAGCTCTCCACCTCA -3， 110
IL一 1β ant i-sense 5' - AGGCCACAGGTATTTTGTCG -3， 111
IL~6 sense 5' - CAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG - 3' 112
IL一 6 anti-sense 5' - GCCACTCCTTCTGTGACTCC -3' 113
Ly-6G sense 5' - GATGGATTTTGCGTTGCTCT - 3， 114
Ly~6G ant i-sense 5' - GTCCAGAGTAGTGGGGCAGA -3' 115
KC sense 5' - CTTGAAGGTGTTGCCCTCAG -3' 116
KC ant i-sense 5' - TGGGGACACCTTTTAGCATC -3' 117
MIP-2 sense 5' - TCCAGAGCTTGAGTGTGACG -3， 118
MIP-2 ant i-sense 5' - GCCTTGCCTTTGTTCAGTATC - 3' 119
CP-1 sense 5' - GGTCCCTGTCATGCTTCTG - 3' 120
CP-1 anti-sense 5' - TCATTGGGATCATCTTGCTG -3' . 121
IP-la sense 5' - ACCATGACACTCTGCAACCA -3， 122
MIP-la anti-sense 5' - GATGAATTGGCGTGGAATCT -3， 123
MIP- 1β sense 5' - CCCACTTCCTGCTGTTTCTC -3' 124
MIP— 1β anti-sense 5' - CTCACTGGGGTTAGCACAGA -3， 125
MCP-3 sense 5' - CTGCTTTCAGCATCCAAGTG -3， 126
MCP-3 anti-sense 5' - CCCAGGGACACCGACTACT ― 3' 127
CXCR2 sense 5' - GCTCACAAACAGCGTCGTAG -3, 128
CXCR2 anti-sense 5' - AGGGCATGCCAGAGCTATAA -3' 129
(2)結果
ォキサゾロン腸注 24時間後において、コントロール抗体投与群では IL-1 β、 IL-6な どの炎症性サイト力イン、 KC、 MIP-2, MCP-1 , MCP-3, MIP- 1 a、 MIP-1 βなどのケ モカイン、ケモカイン受容体 CXCR2の mRNA発現の亢進が認められ、この発現亢進 は抗フラクタル力イン抗体の投与により顕著に抑制された（図 24)。ォキサゾロン腸注 3日後においては、 Iし- 1 β、 IL- 6、 KC、 MIP- 2、 MCP- 1、 MCP- 3、 CXCR2に加え、好 中球のマーカーである Ly-6Gの mRNA発現の亢進が認められ、この発現亢進は抗フ ラタタルカイン抗体の投与により顕著に抑制された（図 25)。以上の結果から、坑フラ クタルカイン抗体のォキサゾロン誘発炎症性腸疾患モデルにおける病態改善効果の 一部は、 IL-1 βや IL-6の炎症性サイトカインゃケモカインの産生が抑制されること、 好中球の浸潤が抑制されることで発揮されることが示唆された。
産業上の利用の可能性
炎症性細胞による iNOS活性の産生抑制による、過剰な NO産生を選択的に阻害す るという新しいアプローチに基づく炎症性疾患治療剤が提供される。

Claims

請求の範囲
[I] フラクタル力インと CX3CR1との相互作用を阻害する抗体または CX3CR1アンタゴニス トを含有することを特徴とする、炎症性疾患治療剤。
[2] 抗体が、抗フラクタル力イン抗体であることを特徴とする、請求項 1記載の剤。
[3] 抗フラクタル力イン抗体力 モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項 2記 載の剤。
[4] 抗フラクタル力イン抗体が、受託番号 FERM BP-10372のハイブリドーマによって産 生されるモノクローナル抗体 5H8-4、または受託番号 FERM BP-10371のハイブリド 一マによって産生されるモノクローナル抗体 #126であることを特徴とする、請求項 3記 載の剤。
[5] 炎症性疾患が炎症性腸疾患である請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の剤。
[6] 炎症性疾患が潰瘍性大腸炎またはクローン病である請求項 5記載の剤。
[7] 炎症性疾患が乾癬である請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の剤。
[8] 炎症性疾患がアトピー性皮膚炎である請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の剤。
[9] 炎症性疾患が喘息である請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の剤。
[10] 炎症性疾患が動脈硬化症である請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の剤。
[II] 炎症性疾患が虚血再灌流における組織障害である請求項 1〜4のいずれか一項に 記載の剤。
[12] 炎症性疾患が急性呼吸促迫症候群である請求項 1〜4の 、ずれか一項に記載の剤
[13] 受託番号 FERM BP- 10371のハイブリドーマ Ham @mFKN#126.1.10
[14] 請求項 13に記載のハイプリドーマによって産生されるモノクローナル抗体 #126。
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