WO2006046689A1 - 子宮内膜症治療剤 - Google Patents

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WO2006046689A1
WO2006046689A1 PCT/JP2005/019871 JP2005019871W WO2006046689A1 WO 2006046689 A1 WO2006046689 A1 WO 2006046689A1 JP 2005019871 W JP2005019871 W JP 2005019871W WO 2006046689 A1 WO2006046689 A1 WO 2006046689A1
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human
interleukin
amino acid
receptor
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PCT/JP2005/019871
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Etsuo Ohshima
Hirokazu Kawasaki
Naoya Kimoto
Akihiko Watanabe
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for endometriosis containing an interleukin 5 (hereinafter abbreviated as IL-5) antagonist as an active ingredient.
  • IL-5 interleukin 5
  • Methods for treating endometriosis are mainly classified into drug therapy and surgical therapy.
  • Drug therapy includes symptomatic therapy such as analgesics and oral contraceptives, and administration of this drug such as hormonal therapy, and surgical therapy includes conservative surgery and radical surgery (Non-patent Document 1). ).
  • symptomatic therapy such as analgesics and oral contraceptives
  • administration of this drug such as hormonal therapy
  • surgical therapy includes conservative surgery and radical surgery (Non-patent Document 1). ).
  • surgical treatment is insufficient, and no drugs have been developed to cure endometriosis.
  • SB-240563 Smith's Klein Bee Cham
  • Sch-55700 CDP_835
  • Sch-55700 Schering's Plow / Celtech
  • SB-240563 shows a decrease in the number of eosinophils in peripheral blood in patients with mild asthma (10 0 Annual Meetings of the American Society for Clinical Pharmacology and herap eutics, March / 1999)
  • Sch_55700 It is known that the model suppresses eosinophilia in the lung due to antigen stimulation (Non-patent Document 2).
  • KM8399 As an antibody that reacts with the human IL-15 receptor chain, KM8399 (patent document 1), which is a humanized antibody, is known. KM8399 is expected to be useful as a therapeutic agent for allergic diseases including chronic bronchial asthma, and has the Fc region of the human IgGl subclass, which induces apoptosis specifically in human eosinophils and induces apoptosis. It is well known that the induction of phenotype is due to antibody-dependent cytotoxic activity (Patent Document 2).
  • Non-patent document 1 Tsutomu Doji et al .: Selection of treatment methods for endometriosis. Gynecology treatment 78: 179-182, 1999
  • Non-Patent Document 2 Arzneimitte ⁇ Kla, 49, 779 (1999) Disclosure of the Invention Problems to be Solved by the Invention
  • the present invention relates to the following (1) to (: 13).
  • a therapeutic agent for endometriosis comprising an interleukin-15 antagonist as an active ingredient.
  • Interleukin-1 5 antagonist is interleukin-1 and interleukin-1
  • the therapeutic agent according to (1) above which is an antibody or an antibody fragment thereof that inhibits binding to a receptor.
  • the therapeutic agent according to (2) above which is an antibody that binds to interleukin 5.
  • the therapeutic agent according to (2) above which is an antibody that binds to the interleukin 5 receptor.
  • recombinant antibody is a recombinant antibody selected from the group consisting of a human chimeric antibody, a human rabbit antibody and a human antibody.
  • the antibody fragment comprises Fab, Fa, F (ab ′), single chain antibody (scFv), dimerization variable region (
  • Diabody selected from peptides containing disulfide stabilization variable region (dsFv) and CDR
  • the present invention provides a therapeutic agent for endometriosis containing an IL-5 antagonist as an active ingredient.
  • FIG. 1 is a diagram showing the endometriosis lesion formation inhibitory action of an anti-mouse IL-5 receptor antibody in a mouse endometriosis model.
  • the vertical axis represents the lesion size (mm 2 ).
  • FIG. 2 is a graph showing the anti-endometrial disease degeneration inhibitory effect of anti-mouse IL-5 antibody in a mouse endometriosis model.
  • the vertical axis represents the lesion size (mm 2 ).
  • the IL-5 antagonist used in the present invention is any one that blocks signal transduction between IL-5 and the IL-5 receptor and inhibits the biological activity of IL-5. Regardless of whether it is a good low molecule or high polymer. Examples thereof include an antibody that inhibits the binding between IL-5 and IL-5 receptor, or an antibody fragment thereof.
  • An antibody that inhibits the binding between IL-5 and IL-5 receptor is an antibody that binds to IL-5 and inhibits the binding between IL-5 and IL-5 receptor. Examples thereof include an antibody that binds and inhibits the binding between IL-5 and IL-5 receptor.
  • IL-5 receptor includes IL-5 receptor chain, IL-5 receptor / 3 chain, and the like.
  • the antibody or antibody fragment used in the present invention may be either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and preferably a monoclonal antibody.
  • Monoclonal antibodies include antibodies produced by Hypridoma and genetically engineered antibodies.
  • Hypridoma is a monoclonal antibody with the desired antigen specificity obtained by cell fusion of B cells obtained by immunizing mammals other than humans with myeloma cells. A cell that produces an antibody.
  • Examples of the recombinant antibody include a human chimeric antibody, a humanized antibody, and a human antibody.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of a non-human animal antibody and CH and CL of a human antibody.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as “hlg”), but the hlgG class is preferable, and hIgGl, hIgG2, and hIgG3 belonging to the hlgG class are preferred. Any of the subclasses such as hIgG4 can be used.
  • CL of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to hlg, and those of ⁇ class or ⁇ class can be used.
  • animals other than humans refer to mice, rats, hamsters, rabbits, and the like.
  • a humanized antibody refers to an antibody obtained by grafting CDRs of VH and VL of an antibody from a non-human animal at an appropriate position of VH and VL of a human antibody, and is also called a human CDR-grafted antibody.
  • the humanized antibody of the present invention is a cDNA encoding a V region in which the CDR of VH and VL of an antibody from a non-human animal is linked to the VH and VL framework of any human antibody (hereinafter referred to as FR). Is constructed, constructed, and inserted into an animal cell expression vector having cDNA encoding human antibody CH and CL, respectively, to construct a humanized antibody expression vector, which is expressed and produced by introduction into an animal cell. be able to.
  • the CH of the humanized antibody may be any as long as it belongs to hlg, but the hlgG class is preferable, and any of the subclasses such as hIgGl, hIgG2, hIgG3, and hIgG4 belonging to the hlgG class. Can also be used.
  • the CL of human rabbit antibody any CL / class or class belonging to hlg can be used.
  • a human antibody originally refers to an antibody that naturally exists in the human body, but a human antibody phage library prepared by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental engineering techniques. Also included are antibodies obtained from human antibody-producing transgenic animals.
  • the antibodies present in the human body can be isolated from human peripheral blood lymphocytes, infected with EB virus, immortalized, and cloned to cultivate lymphocytes producing the antibody alone. The antibody can be purified from the supernatant.
  • a human antibody phage library can be obtained by inserting antibody genes prepared from human B cells into phage genes. A library in which antibody fragments such as are expressed on the phage surface.
  • phages expressing an antibody fragment having the desired antigen-binding activity on the surface can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal means an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into a mouse ES cell, transplanting the ES cell into an early mouse embryo, and generating it. Human antibody production from human antibody-producing transgenic animals is performed in normal non-human animals, and human antibody-producing hyperpridoma is obtained and cultured by the hyperidoma production method. Can generate and accumulate human antibodies.
  • Examples of antibodies or antibody fragments that can be preferably used in the present invention include IL-5, IL-5, and IL-5 produced by NO, iBRIDOMA A TCC HB 10959 (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-210097).
  • IL-5 receptor produced by monoclonal antibodies that inhibit binding to 5 receptors, such as Hypridoma KM 1259 (FERM BP-5134, WO97 / 10354), Hypridoma KM 1486 (FERM BP_5651, WO97 / 10354), etc.
  • IL-5 produced by Hypridoma BION-1 (ATCC HB-12525, WO00 / 0956 1), a monoclonal antibody that binds to the ⁇ chain and inhibits the binding of IL-5 to the IL-5 receptor Examples thereof include monoclonal antibodies that specifically bind to the receptor chain and inhibit the binding between IL-5 and IL-5 receptor, and antibody fragments thereof.
  • Anti-human IL-5R short chain chimeric antibody comprising CDR1, CDR2, CDR3 of VL consisting of amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 4, 5, and 6
  • An anti-HI-5R ⁇ -chain chimeric antibody comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 and the amino acid sequence of Z or VL represented by SEQ ID NO: 8, the VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7, and
  • Humanized antibodies that bind to the IL-5 receptor ⁇ chain and inhibit the binding between IL-5 and IL-5 receptor include the amino acids represented by SEQ ID NOs: 24, 25, and 26, respectively.
  • An antibody comprising CDR1, CDR2, CDR3 of VH consisting of amino acid sequences shown in 19, 20 and / or an amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 21, 22, and 23, respectively, and an antibody containing CDR1, CDR2, CDR3 of VL and
  • antibody VH CDR1, CDR2, CDR3 and / or VL CDR1 each consisting of amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 4, 5, and 6, respectively, consisting of amino acid sequences IJ represented by SEQ ID NOs: 1, 2, 3 CDR2, C
  • the VH of the antibody is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, or the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9, 40th Ala, 46th Glu, 67 Amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from No.
  • Arg, 72nd Ala, 74th Thr, 79th Ala, 95th Tyr and 97th Ala is substituted with another amino acid residue Among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 10 or the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10, the 7th Ser, the 8th Pro, the 22nd Thr, 37 At least one amino acid residue selected from the Gln, 38th Gln, 44th Pro, 45th Lys, 71st Phe, 77th Ser, 87th Tyr and 98th Phe Humanization involving amino acid sequences substituted with amino acid residues Among the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 9, the VH of the antibody preferred by the body is 40th Ala, 46th Glu, 67th Arg, 72nd Ala, 74th Thr, 79th Ala The amino acid residue force S selected from 95th Tyr and 97th Ala, an amino acid sequence substituted with another amino acid residue, and the VL of the antibody is represented by SEQ ID NO: 10.
  • a humanized antibody comprising an amino acid sequence in which at least one amino acid residue selected from the 87th Tyr and the 98th Phe is substituted with another amino acid residue.
  • the VH of the antibody is 40th Ala, 46th Glu, 67th Arg, 72nd Ala, 74th Thr, 79th Ala, 95th Tyr and 97th Ala at least one amino acid residue force S, substituted with another amino acid residue 7 of amino acid sequences selected from amino acid sequences and amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, 14, 15, 16, 17 and amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 10, respectively.
  • a humanized antibody comprising an amino acid sequence selected from the amino acid sequence substituted in the above, more specifically, a humanized antibody comprising an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 13 and VH represented by SEQ ID NO: 10, for example, KM8399 ( W 097/10354) and KM7399 (WO97 / 10354).
  • a humanized antibody that binds to IL-5 and inhibits the binding between IL-5 and the IL-5 receptor mepolizumab (SB-240563; manufactured by Glaxo'SmithKline) , Reslizumab [Sch-55700; Schering 'Blau / Celtech Corp.], etc.
  • mepolizumab SB-240563; manufactured by Glaxo'SmithKline
  • Reslizumab S-55700; Schering 'Blau / Celtech Corp.
  • An antibody or antibody fragment having substantially the same activity as the above-described antibody or antibody fragment is also encompassed by the antibody used in the present invention.
  • the number of amino acids to be deleted, substituted, inserted and / or added is one or more, and the number is not particularly limited, but the molecular 'cloning 2nd edition, current protocols' in 'molecular' biology Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci "USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985), etc.
  • the number is such that it can be deleted, substituted, or added by known techniques such as site-directed mutagenesis.
  • amino acid sequence of the above antibody one or more amino acid residues are deleted, substituted, inserted or The term “added” means that there is a deletion, substitution, insertion or addition of one or more amino acid residues in any and one or more amino acid sequences in the same sequence.
  • the amino acid residue to be substituted, inserted or added, which may be simultaneously substituted, inserted or added, may be a natural type or a non-natural type.
  • Natural amino acid residues include L-alanine, L-asparagine, L-aspartic acid, L-gnoretamine, L-gnoletamic acid, glycine, L-histidine, L-isoleucine, L-leucine, L-lysine, L -Methionine, L-phenylalanine, L-proline, L-serine, L-threonine, L-tryptophan, L-tyrosine, L-valine, L-cystine and the like.
  • amino acid residues that can be substituted with each other are shown below.
  • the amino acid residues contained in the same group can be substituted for each other.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, nonorevaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, _methylserine, t_butylglycine, t-butylalanine, cyclohexenolealanine
  • Group B aspartic acid, gnoretamic acid, isoaspartic acid, isognoletamic acid, 2-amino adipic acid, 2-aminosuberic acid
  • Group D lysine, arginine, ornithine, 2,4-dianaminobutanoic acid, 2,3-dianaminopropionic acid
  • Group E proline, 3-hydroxyproline, 4-hydroxyproline
  • Group F serine, threonine, homoserine
  • Group G phenylalanin, tyrosine
  • Examples of the antibody fragment used in the present invention include Fab, Fab ', F (ab'), scFv, diabody, dsFv, and a peptide containing CDR.
  • Fab is a fragment obtained by treating IgG-type antibody molecules with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain). It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000 bound by a disulfide bond.
  • the Fab used in the present invention can be obtained by treating an antibody with the proteolytic enzyme papain.
  • DNA encoding the Fab of the antibody is used as a prokaryotic expression vector or It can be inserted into a eukaryotic expression vector and introduced into prokaryotic or eukaryotic organisms for expression and production.
  • F (ab ') is a fragment obtained by treating an IgG antibody molecule with the proteolytic enzyme pepsin.
  • F (ab ′) used in the present invention is obtained by treating an antibody with the proteolytic enzyme pepsin.
  • Fab 'can be produced with a thioether bond or disulfide bond.
  • Fab ' is an antibody having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab').
  • Fab ′ used in the present invention can be obtained by treating F (ab ′) with a reducing agent dithiothreitol.
  • the DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to be expressed and produced. be able to.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P).
  • P an appropriate peptide linker
  • the scFv used in the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs the DNA encoding scF V, and inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector. It can be expressed and produced by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv, and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody used in the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs the DNA encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the linker is 8 residues or less, and DNA is inserted into prokaryotic expression vectors or eukaryotic expression vectors, It is possible to express and produce an expression vector by introducing it into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • dsFv is obtained by binding a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue can be selected based on the three-dimensional structure prediction of the antibody according to the method shown by Reiter et al. (Protein Enginee ring, 7, 697-704, 1994).
  • the dsFv used in the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs DNA encoding dsFV, and inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector. It can be expressed and produced by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is composed of at least one region of CDR of VH or VL. Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via an appropriate peptide linker.
  • the peptide containing CDR used in the present invention constructs DNA encoding antibody VH and VL CDRs, inserts the DNA into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the expression It can be expressed and produced by introducing the vector into prokaryotes or eukaryotes.
  • a peptide containing CDR can also be produced by chemical synthesis methods such as F moc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) and tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • An expression vector containing cDNA encoding a polypeptide that is an antigen can be introduced into E. coli, yeast, insect cells, animal cells, and expressed to obtain a recombinant protein, which can be used as an antigen.
  • a synthetic peptide having a partial amino acid sequence of the polypeptide of the antigen can be used as the antigen.
  • the partial peptide for antigen a protein partial sequence of about 5 to 30 residues is selected.
  • the partial amino acid sequence present on the surface in the three-dimensional structure of the protein is used as an antigen.
  • Select as a peptide As a method for analyzing the three-dimensional structure of a protein, there is a method for predicting a partially hydrophilic amino acid sequence having high hydrophilicity using commercially available protein sequence analysis software such as Geneticx Mac. Proteins generally have a low hydrophilic part in the protein in many cases due to the three-dimensional structure, and a high hydrophilic part often exists on the protein surface. In addition, the N- and C-termini of proteins often exist on the protein surface.
  • Cystine is added to the end of the partial peptide in order to crosslink with the protein. If the internal sequence of the protein is selected as a partial peptide, the N-terminus of the peptide is acetylated and the C-terminus is amidated as necessary. Partial peptides can be synthesized by a general liquid phase, solid phase peptide synthesis method, a combination method thereof, or a method according to them (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979). Vol. 2, 1980; Vol.
  • Synthesis should be performed on a commercially available peptide synthesizer such as a peptide synthesizer using Na a -Fmoc-amino acid or Na a-Boc-amino acid with appropriately protected side chains according to the respective synthesis program. Can do.
  • Protected amino acids and carrier resins as raw materials are obtained from ABI, Shimadzu Corporation, Kokusan Chemical Co., Ltd., Nova Biochem, Watanabe Chemical Co., ACT, or Peptide Research Institute Co., Ltd. That power S.
  • protected amino acids, protected organic acids and protected organic amines as raw materials can be synthesized according to or according to reported synthetic methods (The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1, 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981, Academic Press; Peptide Synthesis Fundamentals and Experiments, Maruzen, 1985; Development of Drugs, 14th, Peptide Synthesis, Yodogawa, 1991; International Journal of Peptide & Protein Research , 35, 161 -214, 1990).
  • Any animal can be used for immunization as long as it can produce a high-pridoma such as a mouse, rat, hamster, or rabbit.
  • a high-pridoma such as a mouse, rat, hamster, or rabbit.
  • mice and rats The following is an example of using mice and rats.
  • a mouse or rat aged 3 to 20 weeks is immunized with the antigen prepared in 1 (1) above, and antibody-producing cells are collected from the spleen, lymph nodes, and peripheral blood of the animal. Immunization is performed by administering the antigen several times with an appropriate adjuvant subcutaneously, intravenously or intraperitoneally in an animal.
  • adjuvants include Complete Freund's Adjuvant or aluminum hydroxide gel and pertussis vaccine.
  • a conjugate with a carrier protein such as ushi serum albumin (hereinafter referred to as BSA) or Keyhole Limpet Hemocyanin (hereinafter referred to as KLH) can be prepared and used as an immunogen.
  • blood is collected from the fundus venous plexus or tail vein of the immunized animal, and the reactivity to the antigen is confirmed by ELISA, etc.
  • a source of production cells Three to seven days after the final administration of the antigen, the spleen is removed from the immunized mouse or rat according to a known method (Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), and the antibody-producing cells and myeloma are removed. Fuse with cells.
  • any type of myeloma cells can be grown with iii idim, such as 5-497, 1975).
  • iii idim such as 5-497, 1975.
  • a cell number of 2 ⁇ 10 ⁇ or more is secured by the time of cell fusion.
  • a cell aggregating medium such as polyethylene glycol-1000 (hereinafter referred to as PEG-1000) is used to fuse the cells. Suspend in the medium.
  • PEG-1000 Polyethylene glycol-1000
  • MEM Modified Eagle's Medium
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • HAT medium normal medium [RPMI-1640 medium with 1.5 mM glutamine, 50 ⁇ M 2-mercaptoethanol, so that only the desired fused cells can be obtained selectively
  • FBS fetal bovine serum
  • the selection of a hyperidoma that produces an antibody that reacts with an antigen can be selected by ELISA according to a known method (Antibodies-A Laboratory Manual, old Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • ELISA Antibodies-A Laboratory Manual, old Spring Harbor Laboratory, 1988.
  • the antibody contained in the culture supernatant of a transformant producing a human chimeric antibody, CDR-grafted antibody or antibody fragment thereof described later, or an antibody purified from the culture supernatant is bound to the antigen. Activity can be measured.
  • the antigen is immobilized on a 96-well ELISA plate, and a culture supernatant such as hypridoma or a purified antibody is reacted as a primary antibody. After the first antibody reaction, wash the plate and add the second antibody.
  • a second antibody an antibody in which an antibody capable of recognizing the first antibody is labeled with biotin, enzyme, chemiluminescent substance or radioisotope is used. Specifically, if a mouse is used in the production of the hybridoma, an antibody capable of recognizing a mouse antibody is used as the second antibody.
  • a reaction according to the labeling substance of the second antibody is carried out to produce a hybridoma that produces a monoclonal antibody that reacts specifically with the antigen. To select.
  • Production hybridoma cells 5 ⁇ 10 6 to 2 ⁇ 10 7 cells / mouse are injected intraperitoneally.
  • Hypridoma becomes ascites tumor in 10-21 days.
  • Ascites is collected from the mouse or nude mouse, centrifuged, salted out with 40-50% saturated ammonium sulfate, force prillic acid precipitation method, DEAE-Sepharose column, Protein A-column or Cell mouth fine GSL2000 (Biochemical Industry).
  • the IgG or IgM fraction is collected using a column (manufactured by Kogyo Co., Ltd.) and used as a purified monoclonal antibody.
  • the subclass of the purified monoclonal antibody can be determined using a mouse monoclonal antibody typing kit or a rat monoclonal antibody typing kit.
  • the protein concentration can be calculated by the Raleigh method or the absorbance at 280 nm.
  • Antibody subclasses are isotypes within a class, including IgG1, IgG2a, IgG2b, and IgG3 in mice, and IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 in humans.
  • the binding activity of the monoclonal antibody purified in or from the culture supernatant to the antigen is measured by ELISA (1) (5) above and surface plasmon resonance (Journal of Immunologica 1 Methods, 145, 229-240, 1991) can do.
  • the reactivity with the antigen and the antigen epitope can be analyzed by competitive ELISA using the antigen peptide or a partial peptide thereof.
  • Whether or not the antibody recognizes the three-dimensional structure of the protein that is the antigen can be estimated by combining a three-dimensional structure analysis method or a variety of immunoassay methods that are usually performed. Examples of the three-dimensional structure analysis method include X-ray crystal analysis and nuclear magnetic resonance.
  • Examples of a method for combining various immunoassays include a method in which an ELISA method for a non-denatured antigen and an ELISA method for a denatured antigen are combined. At this time, it is presumed that an antibody that reacts only with a non-denatured antigen is likely to recognize the three-dimensional structure of the antigen. it can.
  • Examples of the ELISA method for a non-denatured antigen include an ELISA method in which a non-denatured antigen and an antibody are reacted in a liquid layer. Any ELISA method can be used for the denatured antigen, as long as the antigen does not retain its original conformation. For example, it can be immobilized directly on a hydrophobic reaction plate. ELISA methods for the antigens and partial peptides digested to an appropriate length.
  • Polyclonal antibodies can be prepared from the sera of animals that have been immunized by the method shown in 1. (2) above and whose sera showed sufficient antibody titers.
  • a serum fractionated by centrifugation from blood collected from the animal, or an immunoglobulin fraction can be purified from the serum according to a conventional method to prepare a polyclonal antibody.
  • the activity of the polyclonal antibody can be evaluated for the binding activity to the antigen by the method described in 1. (7) above.
  • Human-type chimeric antibodies and humanized antibody expression vectors are animal cells in which genes encoding CH and / or CL of human antibodies are incorporated. Any expression vector can be used.
  • a humanized antibody expression vector can be constructed by cloning genes encoding human antibody CH and CL into an animal cell expression vector, respectively.
  • the C region of the human antibody can be CH and CL of any human antibody, for example, the C region of the IgGl subclass of the H chain of the human antibody (hereinafter referred to as hC y 1) and the human antibody. C region of the ⁇ class of the L chain (hereinafter referred to as “hC ⁇ ”).
  • hC ⁇ C region of the ⁇ class of the L chain
  • chromosomal DNA consisting of exons and introns can be used, and cDNA can also be used.
  • any expression vector can be used as long as it can incorporate and express a gene encoding the C region of a human antibody.
  • pAGE107 (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990)
  • pAGE103 (Journal of Biochemistry, 101, 1307-131 0, 1987)
  • pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984)
  • pKCR Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531, 1981
  • pSGl ⁇ d2-4 (Cytotechnology, 4, 173-180, 1990).
  • Promoters and enhancers used for animal cell expression vectors include SV40 early promoter and enhancer (Journal of Biochemistry, 101, 1307-1310, 1987), Moroni mouse leukemia quinores LTR promoter and enhancer ( Biochemical & Biophysical Research Com munications, 149, 960-968, 1987), Immunoglobulin heavy chain promoter (Cell, 41, 47 9-487, 1985) and Enhancer (Cell, 33, 717-728, 1983) It is done.
  • tandem type the type in which the antibody H chain and L chain are on separate vectors or the type on the same vector (hereinafter referred to as tandem type) can be used. Capability to construct human chimeric antibody expression vector and humanized antibody expression vector, ease of introduction into animal cells, balance of expression levels of antibody H and L chains in animal cells, etc. In view of the above, a tandem humanized antibody expression vector is preferred (Journal of Immunological Methods, 167, 271-278, 1994). Examples of tandem humanized antibody expression vectors include pKANTEX93 (WO97 / 10354) and pEE18 (Hybridoma, H, 559-567, 1998).
  • the constructed humanized antibody expression vector can be used to express human chimeric antibodies and humanized antibodies in animal cells.
  • Non-human animal antibodies for example, cDNAs encoding mouse antibody VH and VL can be obtained as follows.
  • mRNA is extracted from Hypridoma, and cDNA is synthesized.
  • the synthesized cDNA is cloned into a vector such as a phage or plasmid to prepare a cDNA library.
  • the mouse region of the C region portion of the mouse antibody is a recombinant phage or cDNA having a cDNA encoding VH and a recombinant phage having a cDNA encoding VL or the V region portion as a probe. Isolate each recombinant plasmid.
  • any animal such as a mouse, rat, hamster, or rabbit can be used as long as it can produce a high-pridoma.
  • Methods for preparing total RNA from Hypridoma include guanidine thiocyanate-trifluoro-acetoacetate (Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987), and methods for preparing mRNA from total RNA include oligo (dT ) immobilized cellulose column method (Molecular Clo nmg:. ALaboratory Manual , and old spring Harbor Lab Press New York, 1989) and the like force 51.
  • kits for preparing mRNA with high predoma ability include Fast Track mRNA Isolation Kit (manufactured by Invitrogen), Quick Prep mRNA Purification Kit (manufactured by Pharmacia), and the like.
  • any vector can be used as a vector into which cDNA synthesized by using mRNA extracted from hypridoma as a saddle type can be incorporated.
  • ZAP Express (Strategies, 5, 58-61, 1992), pBlue script II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17,9494, 1989), ⁇ ⁇ II (Stratagene), ⁇ gtl0, ⁇ gtl l (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985), Lambda BlueMid (Clontech), ExCell, pT7T3 18U (Pharmacia), pcD2 (Molecular & Cellular Biology, 3, 280-289, 1983) And a phage or plasmid vector such as pUC18 (Gene, 33, 103-119, 1985) is used.
  • introducing a cDNA library constructed by a phage or a plasmid vector As long as E. coli can introduce, express and maintain the cDNA library, it can be used.
  • E. coli can introduce, express and maintain the cDNA library, it can be used.
  • XLl-Blue MRF '(Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992), C600 (Genetics, 59, 177-190, 1968), Y1088, Y1090 (Science, 222. 778-782, 1983), NM522 (Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983), K80 2 (Journal of Molecular Biology, 16, 118-133, 1966) and JM105 (Gene, 38, 275-27 6, 1985).
  • a cDNA clone encoding VH and VL of an antibody of a non-human animal from a cDNA library is selected by using a radioisotope or fluorescently labeled probe. Selection can be made by the Chillon method or the plaque hybridization method (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, old Spring Harbor Lab. Press New York, 1989). Primers are prepared and cDNA or cDNA library synthesized from mRNA is used as a template. Polymerase Chain Reaction (hereinafter referred to as PCR method and 3 ⁇ 4fEo; Molecular loning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34), cDNAs encoding VH and VL can also be prepared.
  • PCR method and 3 ⁇ 4fEo Polymerase Chain Reaction
  • the cDNA selected by the above method is cleaved with an appropriate restriction enzyme or the like, and then cloned into a plasmid vector such as pBluescript SK (-) (Stratagene), and a commonly used nucleotide sequence analysis method such as dideoxy The method (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74, 5463-5467, 1977) etc. is performed using an automated base sequence analyzer ABI PRISM 377 (ABI). By analysis, the nucleotide sequence of the cDNA can be determined.
  • the length of the signal sequence and the N-terminal amino acid sequence can be estimated, and further, the subgroup to which they belong can be known.
  • the amino acid sequences of CDRs of VH and VL should also be compared with the VH and VL amino acid sequences of known antibodies (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991). Can be found by: [0075]
  • the BLAST method Journal of Molecular Biology, 21 5, 403-410, 1990
  • the complete amino acid sequences of VH and VL such as SWISS-PROT and PIR-Protein. The novelty of the sequence can be examined by performing a homology search of such sequences.
  • the cDNA encoding the VH and VL of the non-human animal antibody is cloned upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the human antibody antibody expression vector described in 3 (1) above, and human Type chimeric antibody expression vectors can be constructed.
  • a cDNA encoding the VH and VL of a non-human animal antibody is obtained by using the nucleotide sequence of the 3 'end of the VH and VL of the non-human animal antibody and the base of the 5' end of CH and CL of the human antibody Each of which is linked to a synthetic DNA having a recognition sequence for an appropriate restriction enzyme at both ends, and each of them is linked to the human antibody CH and the humanized antibody expression vector described in 3 (1) above.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed by cloning it so that it is expressed in an appropriate form upstream of the gene encoding CL.
  • a plasmid containing cDNA encoding VH and VL of an antibody from a non-human animal is used as a template, and VH and VL are obtained by PCR using a primer having an appropriate restriction enzyme recognition sequence at the 5 'end. Amplify the encoded cDNA, and clone each so that they are expressed in an appropriate form upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the humanized antibody expression vector described in 3 (1) above.
  • a human chimeric antibody expression vector can be constructed.
  • the cDNA encoding the human rabbit antibody VH and VL can be constructed as follows. First, the VH and VL CDR amino acid sequences of the target non-human animal antibody VH and VL CDRs are selected. As the amino acid sequences of human antibody VH and VL FR, any amino acid sequence derived from a human antibody can be used. For example, human amino acid VH and VL FR amino acid sequences IJ and human antibody VH and VL FR amino acid sequences registered in databases such as Protein Data Bank (Sequences of Proteins of Proteins of Immunological Interest, US Dept.
  • Humanized antibodies can be obtained by transplanting only the VH and VL CDRs of the target non-human animal antibody into the VH and VL FRs of the human antibody, and their antigen-binding activity is comparable to that of the original non-human animal antibody. (BIO / TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). This is because the VH and VL of the original non-human animal antibody have not only CDRs but also FR residues and some amino acid residues directly or indirectly related to antigen-binding activity. These amino acid residues are considered to change to different amino acid residues of FR of human antibody VH and VL with CDR grafting.
  • humanized antibodies interact directly with the amino acid residues involved in antigen binding or CDR amino acid residues in the VH and VL FR amino acid sequences of human antibodies. Or the amino acid residues that maintain the three-dimensional structure of the antibody and are indirectly involved in antigen binding, They have been modified to amino acid residues found in the original non-human animal antibodies to increase the reduced antigen binding activity (BIO / TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991). In the production of humanized antibodies, the most important point is how to efficiently identify the FR amino acid residues involved in these antigen-binding activities.
  • Modification of FR amino acid residues of human antibody VH and VL can be achieved by performing the PCR method described in the above 3 (4) using the synthetic DNA for modification. Determine the nucleotide sequence of the amplified product after PCR by the method described in 3 (2) above, and confirm that the target modification has been performed.
  • VH and VL of the humanized antibody constructed in 3 (4) and (5) above are upstream of the gene encoding the human antibody CH and CL of the vector for expression of the human ⁇ antibody described in 3 (1) above.
  • the cDNA to be coded can be cloned to construct a human rabbit antibody expression vector.
  • human chimeric antibody expression vector and humanized antibody expression described in (3) and (6) above are used.
  • Human-type chimeric antibodies using vectors or modified expression vectors Transient expression of human and humanized antibodies can be performed.
  • any cell that can express human chimeric antibodies and humanized antibodies can be used in any cell. Because of its high expression level, COS-7 cells ( ATCC C RL1651) is commonly used (Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991).
  • Methods for introducing expression vectors into C0_S_7 cells include the DEAE-dextran method (Met hods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991) and the lipofuxion method (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 741 3-7417, 1987).
  • the expression levels and antigen-binding activity of the human chimeric antibody and humanized antibody in the culture supernatant were determined by ELISA (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Aca demic Press Limited, 1996).
  • Transformed cells that stably express human chimeric antibody and humanized antibody by introducing the human chimeric antibody expression vector and humanized antibody expression vector described in 3 (3) and (6) above into an appropriate host cell Can be obtained.
  • An example of a method for introducing an expression vector into a host cell is the electoporation method (Cytotechnology, 3, 133-140, 1990).
  • a host cell into which the human chimeric antibody expression vector and humanized antibody expression vector are introduced any host cell capable of expressing the human chimeric antibody and humanized antibody can be used.
  • mouse SP2 / 0-Agl4 cells (ATCC CRL1581), mouse P3X63-Ag8.653 cells (ATCC CRL1580), dihydrofolate reductase gene (hereinafter referred to as CHO cells) (Proceedings of the National al Academy of Sciences of the United States of America, 77-4216-4220, 1980), rat YB2 / 3H and P2.Gl.16Ag.20 cells (ATCC CRL1662, hereinafter referred to as YB2 / 0 cells) can give.
  • CHO cells mouse SP2 / 0-Agl4 cells
  • ATCC CRL1580 mouse P3X63-Ag8.653 cells
  • CHO cells dihydrofolate reductase gene
  • rat YB2 / 3H and P2.Gl.16Ag.20 cells (ATCC CRL1662, hereinafter referred to as YB2 / 0 cells) can give.
  • a transformant that stably expresses the human chimeric antibody and the humanized antibody is prepared according to the method disclosed in JP-A-2-257891, G418 sulfate (hereinafter referred to as G41 8).
  • Animal cell culture media include RPMI1640 medium (manufactured by Nissui Pharmaceutical), GIT medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical), EX-CELL302 medium (manufactured by JRH), IMDM (GIBCO BRL), Hybridoma-SFM (GIBCO BRL) or a medium in which various additives such as FBS are added to these mediums can be used.
  • RPMI1640 medium manufactured by Nissui Pharmaceutical
  • GIT medium manufactured by Nippon Pharmaceutical
  • EX-CELL302 medium manufactured by JRH
  • IMDM GIBCO BRL
  • Hybridoma-SFM GIBCO BRL
  • FBS Hybridoma-SFM
  • the expression level and antigen binding activity of the human chimeric antibody and humanized antibody in the culture supernatant can be measured by ELISA.
  • Transformed cells can increase the expression levels of human chimeric antibodies and humanized antibodies using a di ⁇ amplification system according to the method disclosed in JP-A-2-257891.
  • Human chimeric antibodies and humanized antibodies can be purified from the culture supernatant of transformed cells using protein A columns (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 8, 1988). Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, A cademic Press Limited, 1996).
  • a purification method usually used in protein purification can be used. For example, it can be purified by a combination of gel filtration, ion exchange chromatography and ultrafiltration.
  • the molecular weight of the purified human chimeric antibody and humanized antibody H chain, L chain, or whole antibody molecule is expressed by polyacrylamide gel electrophoresis (hereinafter referred to as PAGE: Nature, 227, 680-685, 1970) and Western Prozaink method (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996).
  • the evaluation of the binding activity between the human chimeric antibody and the humanized antibody and the antigen can be performed using the EUSA described above.
  • Antibody fragments can be produced by genetic engineering techniques or protein chemistry techniques based on the antibodies described in 1 and 3 above.
  • a gene encoding a target antibody fragment should be constructed, and expressed and purified using an appropriate host such as an animal cell, plant cell, insect cell, or E. coli. Which method is given.
  • protein chemistry techniques include site-specific cleavage and purification methods using proteolytic enzymes such as pepsin and nopain.
  • a method for producing a peptide containing Fab, F (ab '), Fab'. ScFv, diabody, dsFv, and CDR as antibody fragments will be specifically described below.
  • Fab can be produced proteolytically by treating IgG with the proteolytic enzyme papain. After papain treatment, if the original antibody is an Ig G subclass with protein A binding properties, it can be separated from IgG molecules and Fc fragments by passing through a protein A column and recovered as a uniform Fab ( Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995). For IgG subclass antibodies that do not have protein A binding, Fab can be recovered in fractions eluted at low salt concentrations by ion exchange chromatography (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995) 0
  • Fab can be produced mostly using Escherichia coli, or using insect cells or animal cells.
  • DNA encoding the V region of the antibody described in 3 (2), 3 (4) and 3 (5) above can be cloned into a Fab expression vector to produce a Fab expression vector.
  • Any Fab expression vector can be used as long as it can incorporate and express Fab DNA.
  • An example is pIT106 (Science, 240, 1041-1043, 1988).
  • Fab expression vectors can be introduced into appropriate E. coli to produce and accumulate Fabs in inclusion bodies or periplasm.
  • Inclusion bodies can be made into active Fabs by the refolding method usually used in proteins, and when expressed in periplasm, active Fabs leak into the culture supernatant. . After refolding or from the culture supernatant, a uniform Fab can be purified by using a column to which an antigen is bound (Antibody Engineering, A Practical uide, W. H. Freeman and ompany, 1992).
  • F (ab ') is protein-chemically processed by treating IgG with the proteolytic enzyme pepsin. Can be produced. After treatment of the pepsin, by the same purification operation as Fab, can be force s recovered as uniform F (ab ') (Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, t hird edition, Academic Press, 1995).
  • Fab ′ described in 4 (3) below is treated with maleimide such as o-PDM or bismaleimide hexane and thioether bond, or DTNB [5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) It can also be prepared by the method of treating with SS and bonding with SS (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 199 6).
  • maleimide such as o-PDM or bismaleimide hexane and thioether bond
  • DTNB 5,5′-dithiobis (2-nitrobenzoic acid
  • Is Fab 'described in 4 (2) above? Can be obtained by treating with a reducing agent such as dithiothreitol.
  • Fab ' can be produced by genetic engineering, mostly using Escherichia coli, insect cells and animal cells.
  • DNA encoding the V region of the antibody described in 3 (2), 3 (4) and 3 (5) above can be cloned into a Fab ′ expression vector to produce a Fab or expression vector.
  • the Fab ′ expression vector any vector can be used as long as it can incorporate and express Fab ′ DNA.
  • An example is pAK19 (BIO / TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992).
  • Fab 'expression vectors can be introduced into appropriate E.
  • coli and Fab' can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm.
  • Inclusion bodies can be made into active Fab 'by the refolding method normally used for proteins.
  • treatment with partial lysozyme digestion, osmotic shock, sonication, etc. By using this method, the bacteria can be crushed and collected outside the cells.
  • Uniform Fab ' can be purified after refolding or from the bacterial lysate using a protein G column or the like (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
  • scFv can be prepared by genetic engineering using phage or E. coli, insect cells, animal cells, and the like.
  • a DNA encoding the V region of the antibody described in 3 (2), 3 (4) and 3 (5) above can be cloned into an scFv expression vector to prepare an scFv expression vector.
  • the scFv expression vector any vector can be used as long as it can incorporate and express scFv DNA.
  • pCANTAB5E Phar macia
  • HFA Human Antibodies & Hybridomas, 5, 48-56, 1994.
  • scFv By introducing the scFv expression vector into appropriate Escherichia coli and infecting the helper phage, it is possible to obtain a phage that expresses scFv fused to the phage surface protein on the phage surface.
  • scFv can be generated and accumulated in inclusion bodies or periplasm of E. coli into which the scFv expression vector has been introduced. Inclusion bodies can be converted into active scFv by the refolding method normally used for proteins.
  • treatments include partial digestion with lysozyme, osmotic shock, and sonication. The bacteria can be crushed and recovered outside the cells. Uniform scFv can be purified from lysates after refolding or from bacteria by using cation exchange chromatography (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PR ESS, 1996).
  • a diabody can be produced by genetic engineering, mostly using Escherichia coli, insect cells and animal cells.
  • a DNA in which VH and VL of the antibody described in 3 (2), 3 (4) and 3 (5) above are linked so that the amino acid residue encoded by the linker is 8 residues or less is prepared.
  • the diabody expression vector can be prepared by cloning into a diabody expression vector. Any diabody expression vector can be used as long as it can incorporate and express diabody DNA.
  • pCANTAB5E manufactured by Pharmacia
  • pHFA Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994
  • Inclusion bodies can be made into active diabodies by the refolding method usually used for proteins. When expressed in the periplasm, partial digestion with lysozyme, osmotic shock, sonication, etc. By this treatment, the bacteria can be crushed and recovered outside the cells. Uniform scFv can be purified after refolding or from the bacterial disruption solution by using cation exchange chromatography (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996).
  • dsFv is genetically engineered, mostly using Escherichia coli, insect cells and animal cells. Can be produced. First, mutations are introduced at appropriate positions in the DNAs encoding VH and VL of the antibodies described in 3 (2), 3 (4) and 3 (5) above, and the encoded amino acid residues are changed to cysteine. Make the substituted DNA. Each of the prepared DNAs can be cloned into a dsFv expression vector to prepare VH and VL expression vectors. Any dsFv expression vector can be used as long as it can incorporate and express dsFv DNA. For example, pULI9 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994). VH and VL expression vectors can be introduced into appropriate E.
  • coli and dsFv can be produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm.
  • Inclusion bodies or periplasmic force VH and VL can be obtained, mixed, and converted into active dsFv by the refolding method usually used for proteins. Refolding after, by an ion exchange chromatography and gel filtration, it can be further purified (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994) 0
  • Peptides containing CDRs can be produced by chemical synthesis methods such as Fmoc method or tBoc method.
  • a DNA encoding a peptide containing CDR can be prepared, and the prepared DNA can be cloned into an appropriate expression vector to prepare a CDR peptide expression vector.
  • Any expression vector may be used as long as it can incorporate and express DNA encoding the CDR peptide. Examples thereof include pLEX (manufactured by Invitrogen), pAX4a + (manufactured by Invitrogen), and the like.
  • the expression vector can be introduced into appropriate E. coli and produced and accumulated in inclusion bodies or periplasm.
  • CDR peptides can be obtained from inclusion bodies or periplasm and purified by ion exchange chromatography and gel filtration (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994).
  • the evaluation of the binding activity between the purified antibody fragment and the antigen can be performed using the ELISA described in 1 (7) above.
  • the therapeutic agent for endometriosis of the present invention may be any drug that contains an IL-5 antagonist as an active ingredient, but is usually one that is pharmacologically acceptable or It is desirable to provide it as a pharmaceutical preparation produced by any method well known in the pharmaceutical arts, mixed with further carriers.
  • a sterile solution dissolved in water or an aqueous carrier such as an aqueous solution of sodium chloride, glycine, gnolecose, human albumin or the like is used.
  • pharmacologically acceptable additives such as buffering agents and isotonic agents for bringing the formulation solution close to physiological conditions, such as sodium acetate, sodium chloride salt, sodium lactate, potassium chloride. Sodium quenate and the like can also be added. It can also be frozen and stored, and dissolved in an appropriate solvent before use.
  • the administration route of the therapeutic agent of the present invention is preferably the most effective in the treatment, orally, or intraoral, respiratory tract, rectal, subcutaneous, intramuscular and intravenous. Intravenous administration is preferred, although parenteral administration can be given.
  • Suitable formulations for oral administration include emulsions, syrups, capsules, tablets, powders, granules and the like.
  • Liquid preparations such as emulsions and syrups include saccharides such as water, sucrose, sorbitol and fructose, glycols such as polyethylene glycol and propylene glycol, oils such as sesame oil, olive oil and soybean oil, p- It can be produced using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, and flavors such as strawberry flavor and peppermint as additives.
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose and mannitol, disintegrants such as starch and sodium alginate, lubricants such as magnesium stearate and talc, polyvinyl alcohol It can be produced using a binder such as hydroxypropyl cellulose and gelatin, a surfactant such as fatty acid ester, and a plasticizer such as glycerin as additives.
  • Suitable preparations for parenteral administration include injections, suppositories, sprays and the like.
  • an injection is prepared using a carrier comprising a salt solution, a glucose solution, or a mixture of both.
  • Suppositories are prepared using a carrier such as cacao butter, hydrogenated fat or carboxylic acid.
  • the spray is prepared using a carrier that does not irritate the antagonist itself or the recipient's oral cavity and airway mucosa, and that disperses the antagonist as fine particles to facilitate absorption.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • preparations such as aerosols and dry powders are possible.
  • these parenteral agents are also exemplified as additives in oral agents. Ingredients can also be added.
  • the dose or frequency of administration of the therapeutic agent of the present invention varies depending on the intended therapeutic effect, administration method, treatment period, age, body weight, etc., but usually 10 ⁇ g / kg to 10 mg / kg per day for an adult It is.
  • the excised uterus (tubular) was longitudinally opened into a sheet while being washed in Dulbecco's 'Modified' Eagle 'medium (INVITROGEN) containing penicillin' streptomycin (INVITROGEN).
  • An endometrial piece with a sheet force of about 2 mm square was prepared.
  • the prepared endometrial pieces were autografted on the left and right peritoneum using sterilized suture needles (surgical weak heel needle No.12-black nylon No.6-0, Natsume Seisakusho). At this time, transplantation was performed so that the endometrial surface was in contact with the peritoneum.
  • adipose tissue of the same size as the endometrial segment was excised with the same individual strength and the peritoneum was removed. In the same way, it was autotransplanted. Finally, the transplantation site and the hysterectomy site were washed with physiological saline containing Sagamicin ( R ) injection solution (manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), and immediately the peritoneum and skin were carefully sutured with a suture needle with a sterile thread.
  • Sagamicin ( R ) injection solution manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
  • lmg / kg anti-mouse IL-5 receptor antibody and anti-mouse IL-5 antibody were used as test drugs, and lmg / kg rat IgG antibody was used as a control antibody. (ICN) were used. The antibody was used after diluting with a phosphate buffer (ICN) sterilized.
  • the results for graft size are shown in Table 1.
  • the graft size was calculated by multiplying the vertical diameter and horizontal diameter, and the left and right graft sizes were averaged.
  • Anti-IL-5 antibody 1 Intravenous Immediately before transplantation 14. 4 Sat 1. 1
  • the excised uterus (tubular) was longitudinally opened into a sheet while being washed in Dulbecco's 'Modified' Eagle 'medium (INVITROGEN) containing penicillin' streptomycin (INVITROGEN).
  • An endometrial piece with a sheet force of about 2 mm square was prepared.
  • the prepared endometrial pieces were autografted on the left and right peritoneum using sterilized suture needles (surgical weak heel needle No.12-black nylon No.6-0, Natsume Seisakusho). At this time, transplantation was performed so that the endometrial surface was in contact with the peritoneum.
  • an adipose tissue of the same size as the endometrial piece was excised by the same individual force and transplanted to the peritoneum in the same manner.
  • the transplantation site and the hysterectomy site were washed with physiological saline containing micronomycin (Sagamicin ( R ) injection solution, manufactured by Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.), and immediately the peritoneum and skin were carefully removed with a sterile suture needle. Sutured.
  • Adhesion score One week after autotransplantation, blood was lethal under ether anesthesia, the abdomen was opened, and a macroscopic evaluation (adhesion score) of endometrial lesions was performed. Adhesions were scored according to the following criteria.
  • the test was conducted with 5 animals per group. If necessary, follow the standard method for pathological specimens at the transplant site. And histopathological analysis was performed.
  • the results for the adhesion score at the lesion site are shown in Table 2.
  • the adhesion score was given as a score, and the adhesion scores of the left and right grafts were averaged.
  • Troll antibody 1 Intravenous 1 time just before phlegm 1.4 4 0.5
  • Anti-IL-5 receptor antibody 1 Intravenous 1 time just before transplantation 1.0 0 0 4
  • Anti-mouse IL-5 receptor antibody inhibits endometriosis in mice with endometriosis model
  • mice (Nippon Tires' Riba Co., Ltd.), 8 weeks of age or older, that are considered to be sexually mature in mice, were used in the experiment. After a habituation period of 1 week after purchase, all individuals were exogenously administered with estrogen after left and right oophorectomy were performed in order to make the sex hormone environment uniform.
  • pentobarbital Somnopentyl (R) , Takeda Shilling 'Puraua Cut the dorsal skin of a mouse anesthetized by intraperitoneal injection of 50 mg / kg approximately 1 cm along the midline, and cut into the peritoneum at the location of the left and right ovaries (approximately 3 mm) ) After removing both ovaries from the cuts, the dorsal skin was quickly sewn and returned to the cage. Thereafter, estrogen (Proginon (R). Depot 10 mg, Japanese Schering, estradiol valerate injection solution) 100 xg / kg was injected into the left hind limb muscle. By this treatment, it was confirmed that the uterus was enlarged to the same weight as the mouse uterus in the early estrus, which is the high-strength strogen out of the sexual cycle observed in the 4-day cycle.
  • Somnopentyl (R) Takeda Shilling 'Puraua Cut the dors
  • an anti-mouse IL-5 receptor antibody (International Immunology, 3 (2 ⁇ : 135-9, 1991, 10 mg / kg, administered once a week) was used as a positive control group.
  • Rat IgG antibody (ICN, 10 mg / kg, once weekly administration) was used as a control antibody.
  • the solution was diluted with a physiological saline injection solution (manufactured by Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.).
  • the anti-mouse IL-5 receptor antibody showed a significant inhibitory action compared to the positive control group.
  • small intestinal mucosa pieces of the same weight were seeded instead of endometrial pieces, no lesions were formed even by administration of estrogen.
  • Anti-mouse IL-5 antibody showed a significant inhibitory effect in the 10 mg / kg administration group compared to the positive control group.
  • the present invention can provide a therapeutic agent for endometriosis containing an interleukin-5 antagonist as an active ingredient.
  • SEQ ID NO: 10 Description of artificial sequence: antibody light chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 11 Description of artificial sequence: antibody heavy chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 12-description of artificial sequence antibody heavy chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 13-description of artificial sequence antibody heavy chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 14-description of artificial sequence antibody light chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 15-Description of artificial sequence antibody light chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 16-Description of artificial sequence antibody light chain variable region amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 17-Description of artificial sequence antibody light chain variable region amino acid sequence

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Abstract

本発明により、インターロイキン－５アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治療剤が提供される。

Description

明 細 書
子宮内膜症治療剤
技術分野
[0001] 本発明は、インターロイキン 5 (以下、 IL-5と略記する）アンタゴニストを有効成分とし て含有する子宮内膜症治療剤に関する。
背景技術
[0002] 子宮内膜症を治療する方法としては主に薬物療法と外科的療法とに分類される。
薬物療法としては、鎮痛剤、経口避妊薬などの対症療法、ホルモン療法などの本 症治療薬による投与があげられ、外科的療法としては、保存手術、根治手術などが あげられる（非特許文献 1)。しかしながら、外科的療法も不十分な症例があり、また 子宮内膜症を根治させる薬剤はこれまでに開発されていない。
[0003] ヒト IL— 5に特異的に反応する抗体としては、 SB-240563 (スミス'クラインビーチャム 社）、 Sch-55700(CDP_835) (シエーリング 'プラウ/セルテック社）などが知られている 。 SB-240563は、軽度の喘息患者に対して末梢血中好酸球数の減少作用を示す (10 0th Annual Meetings of the American Society for Clinical Pharmacology and herap eutics, March/1999)0 Sch_55700もサルのアレルギーモデルにぉレ、て抗原刺激によ る肺の好酸球増多を抑制することが知られている（非特許文献 2)。
[0004] またヒト IL一 5受容体ひ鎖に反応する抗体としては、ヒト化抗体である KM8399 (特許 文献 1)が知られている。 KM8399は、慢性気管支喘息をはじめとするアレルギー疾患 治療剤としての有用性が期待されること、ヒト IgGlサブクラスの Fc領域を有しており、ヒ ト好酸球特異的にアポトーシスを誘導させ、アポトーシスの誘導が抗体依存性細胞傷 害活性によるものであること（特許文献 2)などが知られてレ、る。
[0005] し力、しながら、上述のヒ HL— 5に特異的に反応する抗体およびヒト IL—5受容体に 特異的に反応する抗体と、子宮内膜症との関連については知られていない。
非特許文献 1 :堂地勉ほか:子宮内膜症の治療法の選択.産婦人科治療 78: 179-182 ,1999
非特許文献 2 :Arzneimitte卜 Forschung, 49, 779 (1999) 発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0006] 子宮内膜症を治療するための有用な薬剤が求められている。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明は、以下の（1)〜（： 13)に関する。
[0008] (1) インターロイキン一 5アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治 療剤。
[0009] (2) インターロイキン一 5アンタゴニストがインターロイキン一 5とインターロイキン一
5受容体との結合を阻害する抗体またはその抗体断片である、上記（1)の治療剤。
[0010] (3) インターロイキン一 5とインターロイキン一 5受容体との結合を阻害する抗体が
、インターロイキン 5に結合する抗体である上記（2)記載の治療剤。
[0011] (4) インターロイキン 5がヒトインターロイキン 5である上記（3)記載の治療剤。
[0012] (5) インターロイキン 5とインターロイキン 5受容体との結合を阻害する抗体が
、インターロイキン 5受容体に結合する抗体である上記（2)記載の治療剤。
[0013] (6) インターロイキン 5受容体がインターロイキン 5受容体 α鎖である上記（5) 記載の治療剤。
[0014] (7) インターロイキン 5受容体がヒトインターロイキン 5受容体である上記（5)また は（6)記載の治療剤。
[0015] (8) 抗体がモノクローナル抗体である、上記（2)〜（7)のいずれか 1項に記載の治 療剤。
[0016] (9) モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、上記（8)項に記載の治療剤
[0017] (10) 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒトイ匕抗体およびヒト抗体からなる 群から選ばれる遺伝子組換え抗体である、上記（9)記載の治療剤。
[0018] (11) 抗体断片が、 Fab, Fa 、 F(ab ' )、一本鎖抗体（scFv)、二量体化可変領域（
2
Diabody)、ジスルフイド安定化可変領域（dsFv)および CDRを含むペプチドから選ば れる抗体断片である上記（2)〜（： 10)のいずれ力 1項に記載の治療剤。
[0019] (12) 子宮内膜症治療剤の製造のための上記（1)〜（： 11)のいずれ力 1項に記載 のインターロイキン 5アンタゴニストの使用。
[0020] (13) 上記（1)〜（： 11)のいずれか 1項に記載のインターロイキン一 5アンタゴニスト を投与することを特徴とする子宮内膜症の治療方法。
発明の効果
[0021] 本発明により、 IL-5アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症治療剤が 提供される。
図面の簡単な説明
[0022] [図 1]は、マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウス IL-5受容体抗体の子宮内膜症 病変形成抑制作用を示した図である。縦軸は、病変サイズ (mm2)を示す。
[図 2]は、マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウス IL-5抗体の子宮内膜症病変形 成抑制作用を示した図である。縦軸は、病変サイズ (mm2)を示す。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 本発明において用いられる、 IL-5アンタゴニストとしては、 IL-5と IL-5受容体との間 のシグナル伝達を遮断し、 IL-5の生物学的活性を阻害するものであればレ、かなるも のでもよぐ低分子であっても高分子であってもよレ、。例えば IL-5と IL-5受容体との結 合を阻害する抗体またはその抗体断片等があげられる。
IL-5と IL-5受容体との結合を阻害する抗体としては、 IL-5に結合し、かつ IL-5と IL- 5受容体との結合を阻害する抗体、 IL-5受容体に結合し、かつ IL-5と IL-5受容体との 結合を阻害する抗体などがあげられる。 IL-5受容体としては、 IL-5受容体ひ鎖、 IL-5 受容体 /3鎖等があげられる。
[0024] 本発明で使用される上記の抗体または抗体断片は、ポリクローナル抗体またはモノ クローナル抗体のいずれでもよレ、が、好ましくはモノクローナル抗体があげられる。 モノクローナル抗体としては、ハイプリドーマが産生する抗体、遺伝子組換え抗体な どがあげられる。
ハイプリドーマとは、ヒト以外の哺乳動物に抗原を免疫して取得された B細胞と、ミエ ローマ細胞とを細胞融合させて得られる所望の抗原特異性を有するモノクローナル 抗体を生産する細胞をいう。
[0025] 遺伝子組換え抗体としては、ヒト型キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体などがあげられ る。
ヒト型キメラ抗体とは、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLとヒト抗体の CHおよび C Lとからなる抗体をいう。ヒト型キメラ抗体の CHとしては、ヒトイムノグロブリン（以下、 hlg と表記する）に属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラスのものが好適であり、さら に hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブクラスのいずれも用 レ、ることができる。また、ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのもの でもよく、 κクラスあるいは λクラスのものを用いることができる。
[0026] また、ヒト以外の動物とは、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどをいう。
ヒト化抗体とは、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRをヒト抗体の VHおよび VLの適切な位置に移植した抗体をレ、い、ヒト型 CDR移植抗体ともいう。
本発明のヒト化抗体は、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRを任意のヒト 抗体の VHおよび VLのフレームワーク（以下、 FRと表記する）と連結した V領域をコー ドする cDNAを設計、構築し、ヒト抗体の CHおよび CLをコードする cDNAを有する動物 細胞用発現ベクターにそれぞれ挿入してヒト化抗体発現ベクターを構築し、動物細 胞へ導入することにより発現させ、製造することができる。
[0027] ヒト化抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよレ、が、 hlgGクラスのもの が好適であり、さらに hlgGクラスに属する hIgGl、 hIgG2、 hIgG3、 hIgG4といったサブク ラスのいずれも用いることができる。また、ヒトイ匕抗体の CLとしては、 hlgに属すればい ずれのものでもよぐ / クラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
[0028] ヒト抗体とは、元来、ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、最近の遺伝子工学的 、細胞工学的、発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリ 一およびヒト抗体産生トランスジヱニック動物から得られる抗体なども含まれる。ヒト体 内に存在する抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EBウィルスなどを感染さ せ不死化し、クローニングすることにより、該抗体を産生するリンパ球を単独で培養で き、培養上清中より該抗体を精製することができる。ヒト抗体ファージライブラリ一は、 ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に揷入することにより Fab、 scFv などの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。該ライブラリーより、 抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を有す る抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。該抗体断片は、 さらに、遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト 抗体分子へも変換することができる。ヒト抗体産生トランスジエニック動物は、ヒト抗体 遺伝子が細胞内に組込まれた動物を意味する。具体的には、例えば、マウス ES細胞 ヘヒト抗体遺伝子を導入し、該 ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、発生させることに よりヒト抗体産生トランスジヱニックマウスを作製することができる。ヒト抗体産生トランス ジヱニック動物からのヒト抗体の作製方法は、通常のヒト以外の動物で行われてレ、る ハイプリドーマ作製方法によりヒト抗体産生ハイプリドーマを取得し、培養することで 培養上清中にヒト抗体を生成蓄積させることができる。
[0029] 本発明において好ましく使用できる抗体または抗体断片としては、ノ、イブリドーマ A TCC HB 10959 (特開平 2000-210097)により生産された、 IL-5に結合し、かつ IL-5と I L-5受容体との結合を阻害するモノクローナル抗体、ハイプリドーマ KM 1259 (FERM BP-5134、 WO97/ 10354)、ハイプリドーマ KM 1486(FERM BP_5651、 WO97/ 10354)な どにより生産された、 IL-5受容体 α鎖に結合し、かつ IL-5と IL-5受容体との結合を阻 害するモノクローナル抗体、ハイプリドーマ BION- 1 (ATCC HB-12525, WO00/0956 1 )により生産された、 IL-5受容体 鎖に特異的に結合し、 IL-5と IL-5受容体との結 合を阻害するモノクローナル抗体およびそれらの抗体断片などがあげられる。
[0030] ヒ HL-5受容体に結合し、かつ IL-5と IL-5受容体との結合を阻害するヒト型キメラ抗 体の具体例としては、配列番号 1、 2および 3で示されるアミノ酸配列からなる VHの CD Rl、 CDR2、 CDR3および Zまたは配列番号 4、 5および 6で示されるアミノ酸配列から なる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3、を含む抗ヒト IL- 5Rひ鎖キメラ抗体、抗体の VHが配 列番号 7で示されるアミノ酸配列および Zまたは VLが配列番号 8で示されるアミノ酸 配列を含む抗ヒ HL-5R α鎖キメラ抗体、抗体の VHが配列番号 7で示されるアミノ酸 配列およびヒト抗体の CHが hlgG lサブクラスのアミノ酸配列からなり、抗体の VLが配 列番号 8で示されるアミノ酸配列およびヒト抗体の CLが / クラスのアミノ酸配列からな る抗ヒ HL-5R a鎖キメラ抗体などがあげられ、具体的には KM 1399 (WO97/ 10354)な どがあげられる。
[0031] IL-5受容体 α鎖に結合し、かつ IL-5と IL-5受容体との結合を阻害するヒト化抗体と しては、それぞれ配列番号 24、 25、 26で示されるアミノ酸配列からなる VHの CDR1、 C DR2、 CDR3および Zまたはそれぞれ配列番号 27、 28、 29で示されるアミノ酸配列か らなる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3を含む抗体、より好ましくは、それぞれ配列番号 18、 19, 20で示されるアミノ酸配列からなる VHの CDR1、 CDR2、 CDR3および/またはそ れぞれ配列番号 21、 22および 23で示されるアミノ酸配列力 なる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3を含む抗体、さらに好ましくは、それぞれ配列番号 1、 2、 3で示されるアミノ酸配 歹 IJからなる抗体 VHの CDR1、 CDR2、 CDR3および/またはそれぞれ配列番号 4、 5、 6 で示されるアミノ酸配列からなる VLの CDR1、 CDR2、 CDR3を含むヒト化抗体または該 抗体断片などがあげられる。
[0032] これらのヒトイ匕抗体組成物のなかでも、抗体の VHが配列番号 9で示されるアミノ酸 配列、または配列番号 9で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 46番目の Glu、 67番目の Arg、 72番目の Ala、 74番目の Thr、 79番目の Ala、 95番目の Tyrおよび 97番 目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換された アミノ酸配列を含むヒト化抗体組成物、抗体の VLが配列番号 10で示されるアミノ酸配 列または配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 7番目の Ser、 8番目の Pro、 22番 目の Thr、 37番目の Gln、 38番目の Gln、 44番目の Pro、 45番目の Lys、 71番目の Phe、 77番目の Ser、 87番目の Tyrおよび 98番目の Pheから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸 残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含むヒト化抗体が好ましぐ抗体 の VHが配列番号 9で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 46番目の Glu、 67番 目の Arg、 72番目の Ala、 74番目の Thr、 79番目の Ala、 95番目の Tyrおよび 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基力 S、他のアミノ酸残基に置換されたアミ ノ酸配列を含み、かつ、抗体の VLが配列番号 10で示されるアミノ酸配列のうち、 7番 目の Ser、 8番目の Pro、 22番目の Thr、 37番目の Gln、 38番目の Gln、 44番目の Pro、 45 番目の Lys、 71番目の Phe、 77番目の Ser、 87番目の Tyrおよび 98番目の Pheから選ば れる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミノ酸配列を含 むヒト化抗体がより好ましい。 [0033] 具体的には、抗体の VHがそれぞれ配列番号 9、 11、 12、 13で示されるアミノ酸配列 、および配列番号 9で示されるアミノ酸配列のうち、 40番目の Ala、 46番目の Glu、 67番 目の Arg、 72番目の Ala、 74番目の Thr、 79番目の Ala、 95番目の Tyrおよび 97番目の Alaから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基力 S、他のアミノ酸残基に置換されたアミ ノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列、および Zまたは抗体の VLがそれぞれ配列番号 10、 14、 15、 16、 17で示されるアミノ酸配列、および配列番号 10で示されるアミノ酸配 列のうち、 7番目の Ser、 8番目の Pro、 22番目の Thr、 37番目の Gln、 38番目の Gln、 44 番目の Pro、 45番目の Lys、 71番目の Phe、 77番目の Ser、 87番目の Tyrおよび 98番目 の Pheから選ばれる少なくとも 1つのアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換されたアミ ノ酸配列から選ばれるアミノ酸配列を含むヒト化抗体、より具体的には VHが配列番号 13、 VLが配列番号 10で示されるアミノ酸配列を含むヒト化抗体、例えば、 KM8399 (W 097/10354)、 KM7399 (WO97/10354)などがあげられる。
[0034] さらに、 IL-5に結合し、かつ IL-5と IL-5受容体との結合を阻害するヒト化抗体として は、メポリズマブ（mepolizumab) [SB-240563;グラクソ 'スミスクライン社製]、レスリズマ ブ（reslizumab) [Sch-55700;シエーリング 'ブラウ/セルテック社製]などがあげられる 上述の抗体または抗体断片を構成するアミノ酸配列において、 1以上のアミノ酸が 欠失、付カロ、置換または挿入され、かつ上述の抗体または抗体断片と実質的に同一 の活性を有する抗体または抗体断片も本発明で使用される抗体に包含される。
[0035] 欠失、置換、挿入および/または付加されるアミノ酸の数は 1個以上でありその数 は特に限定されないが、モレキュラー 'クローニング第 2版、カレント.プロトコールズ' イン'モレキュラー 'バイオロジー、 Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982)、 Proc. N atl. Acad. Sci" USA, 79, 6409(1982)、 Gene, 34, 315 (1985)、 Nucleic Acids Research ， 13, 4431 (1985)、 Proc. Natl. Acad. Sci USA,82, 488 (1985)等に記載の部位特異的 変異導入法等の周知の技術により、欠失、置換もしくは付加できる程度の数であり、 例えば、 1〜数十個、好ましくは 1〜20個、より好ましくは 1〜： 10個、さらに好ましくは ：!〜 5個である。
[0036] 上記の抗体のアミノ酸配列において 1以上のアミノ酸残基が欠失、置換、揷入また は付加されたとは、同一配列中の任意かつ 1もしくは複数のアミノ酸配列中におレ、て 、 1または複数のアミノ酸残基の欠失、置換、挿入または付加があることを意味し、欠 失、置換、挿入または付加が同時に生じてもよぐ置換、挿入または付加されるァミノ 酸残基は天然型と非天然型とを問わない。天然型アミノ酸残基としては、 L-ァラニン 、 L-ァスパラギン、 L-ァスパラギン酸、 L-グノレタミン、 L-グノレタミン酸、グリシン、 L-ヒス チジン、 L-イソロイシン、 L-ロイシン、 L-リジン、 L-メチォニン、 L-フヱニルァラニン、 L -プロリン、 L-セリン、 L-スレオニン、 L -トリプトファン、 L-チロシン、 L -バリン、 L -システ インなどがあげられる。
[0037] 以下に、相互に置換可能なアミノ酸残基の好ましい例を示す。同一群に含まれるァ ミノ酸残基は相互に置換可能である。
A群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノノレバリン、ァラニン、 2-アミノブ タン酸、メチォニン、〇_メチルセリン、 t_ブチルグリシン、 t -ブチルァラニン、シクロへ キシノレァラニン
B群：ァスパラギン酸、グノレタミン酸、イソァスパラギン酸、イソグノレタミン酸、 2-ァミノ アジピン酸、 2-アミノスべリン酸
C群：ァスパラギン、グノレタミン
D群：リジン、アルギニン、オル二チン、 2,4-ジァミノブタン酸、 2,3-ジァミノプロピオ ン酸
E群：プロリン、 3-ヒドロキシプロリン、 4-ヒドロキシプロリン
F群：セリン、スレオニン、ホモセリン
G群：フエ二ルァラニン、チロシン
[0038] 本発明で使用される抗体断片としては、 Fab、 Fab'、 F(ab')、 scFv、 diabody, dsFvお よび CDRを含むペプチドなどがあげられる。
Fabは、 IgG型抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち（ H鎖の 224番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジ スルフイド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 本発明で使用される Fabは、抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることが できる。または、該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは 真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入 することにより発現させ、製造すること力 Sできる。
[0039] F(ab')は、 IgG型抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のう
2
ち（H鎖の 234番目のアミノ酸残基で切断される）、 Fabがヒンジ領域のジスルフイド結 合を介して結合されたものよりやや大きい、分子量約 10万の抗原結合活性を有する 抗体断片である。
本発明で使用される F(ab')は、抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ること
2
ができる。または、下記の Fab'をチォエーテル結合あるいはジスルフイド結合させ、作 製すること力 Sできる。
[0040] Fab'は、上記 F(ab')のヒンジ領域のジスルフイド結合を切断した分子量約 5万の抗
2
原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用される Fab'は、 F(ab')を還元剤ジチオスレィトール処理して得ることが
2
できる。または、該抗体の Fab'断片をコードする DNAを原核生物用発現ベクターある いは真核生物用発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ 導入することにより発現させ、製造することができる。
[0041] scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なペプチドリンカ一（以下、 Pと表記する）を用 いて連結した、 VH-P-VLないしは VL-P-VHポリペプチドで、抗原結合活性を有する 抗体断片である。
本発明で使用される scFvは、抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 scF Vをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用 発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入するこ とにより発現させ、製造することができる。
[0042] diabodyは、 scFvが二量体化した抗体断片で、二価の抗原結合活性を有する抗体 断片である。二価の抗原結合活性は、同一とすることもできるし、一方を異なる抗原 結合活性とすることもできる。
本発明で使用される diabodyは、抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 s cFvをコードする DNAをリンカ一のアミノ酸配列の長さが 8残基以下となるように構築し 、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現ベクターに揷入し、該 発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、製造する こと力 Sできる。
[0043] dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリ ペプチドを該システィン残基間のジスルフイド結合を介して結合させたものをレ、う。シ スティン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法（Protein Enginee ring, 7, 697-704, 1994)に従って、抗体の立体構造予測に基づいて選択することが できる。
本発明で使用される dsFvは、抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを取得し、 dsF Vをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用 発現ベクターに揷入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入するこ とにより発現させ、製造することができる。
[0044] CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも 1領域以上を含んで構成 される。複数の CDRを含むペプチドは、直接または適当なペプチドリンカ一を介して 結合させることができる。本発明で使用される CDRを含むペプチドは、抗体の VHおよ び VLの CDRをコードする DNAを構築し、該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは 真核生物用発現ベクターに挿入し、該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ 導入することにより発現させ、製造すること力 Sできる。また、 CDRを含むペプチドは、 F moc法（フルォレニルメチルォキシカルボニル法）、 tBoc法（t-ブチルォキシカルボ二 ル法）などの化学合成法によって製造することもできる。
[0045] 以下に、本発明で使用される抗体または抗体断片の作製方法ならびに活性評価に ついて記す。
1.モノクローナル抗体の作製
(1)抗原の調製
抗原であるポリペプチドをコードする cDNAを含む発現ベクターを大腸菌、酵母、昆 虫細胞、動物細胞などに導入、発現させ、組換え型蛋白質を得、これを抗原に用い ること力 Sできる。あるいは、抗原のポリペプチドの部分アミノ酸配列を有する合成ぺプ チドを抗原に用いることもできる。
[0046] 抗原用部分ペプチドとしては、 5〜30残基程度の蛋白質部分配列が選択される。変 性してレ、なレ、天然の構造を有してレ、る状態の該蛋白質を認識する抗体を取得するた めには、蛋白質の立体構造において表面に存在している部分アミノ酸配列を抗原べ プチドとして選択する。蛋白質の立体構造を解析する方法としては、ジェネティック' マック（Genetyx Mac)など市販の蛋白質配列解析ソフトを用いて、親水性の高い部 分アミノ酸配列を予測する方法があげられる。蛋白質は、一般的に親水性の低い部 分は立体構造上蛋白質の内部に存在する場合が多く、親水性の高レ、部分は蛋白質 表面に存在する場合が多い。また、蛋白質の N末端、 C末端は蛋白質表面に存在す る場合が多い。
[0047] 部分ペプチドには蛋白質と架橋するために、システィンを末端に付加する。蛋白質 の内部配列を部分ペプチドとして選択した場合には、必要に応じてペプチドの N末端 をァセチル化、 C末端をアミド化する。部分ペプチドは、一般的な液相、固相ペプチド 合成法およびそれらを適宜組み合わせる方法、またはそれらに準じる方法により、合 成することができる（The Peptides, Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 , 1979; Vol. 2， 1980; Vol. 3, 1981 , Academic Press;ペプチド合成の基礎と実験、丸善、 1985;続医 薬品の開発、第 14卷、ペプチド合成、廣川書店、 1991 ; International Journal of Pept ide &ProteinResearch, 35, 161-214， 1990)。また、 自動ペプチド合成機を用いること もできる。ペプチド合成機によるペプチドの合成は、島津製作所製ペプチド合成機、 Applied Biosystems, Inc.社（以下、 ABI社と表記する）製ペプチド合成機、 Advanced ChemTech Inc.社（以下、 ACT社と表記する）製ペプチド合成機などの市販のぺプチ ド合成機上で、適当に側鎖を保護した N a -Fmoc-アミノ酸あるいは N a -Boc-ァミノ 酸などを用いて、それぞれの合成プログラムに従って合成することができる。
[0048] 原料となる保護アミノ酸および担体樹脂は、 ABI社、島津製作所、国産化学 (株)、 N ova Biochem社、渡辺化学 (株）、 ACT社またはペプチド研究所 (株）などから入手す ること力 Sできる。また、原料となる保護アミノ酸、保護有機酸、保護有機アミンは報告さ れている合成法に従って、あるいはそれに準じて合成することができる（The Peptides ， Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 1 , 1979; Vol. 2, 1980; Vol. 3, 1981， Academic P ress;ペプチド合成の基礎と実験、丸善、 1985 ;続医薬品の開発、第 14卷、ペプチド 合成、廣川 店、 1991 ; International Journal of Peptide &Protein Research, 35, 161 -214, 1990)。
[0049] (2)動物の免疫と抗体産生細胞の調製
免疫に用いる動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなどハイプリドーマを 作製することが可能であれば、いかなるものでもよい。下記に、マウスおよびラットを用 レ、る例について説明する。
[0050] 3〜20週令のマウスまたはラットに、上記 1 (1)で調製した抗原を免疫し、その動物の 脾臓、リンパ節、末梢血より抗体産生細胞を採取する。免疫は、動物の皮下、静脈内 または腹腔内に適当なアジュバントとともに抗原を数回投与することにより行う。アジ ュバントとしては、フロインドの完全アジュバント（Complete Freund's Adjuvant)または 、水酸化アルミニウムゲルと百日咳菌ワクチンなどがあげられる。また、ゥシ血清アル ブミン（以下、 BSAと表記する）や Keyhole Limpet Hemocyanin (以下、 KLHと表記する )などのキャリア蛋白質とコンジュゲートを作製し、これを免疫原として用いることがで きる。各抗原の投与後 3〜7日目に免疫動物の眼底静脈叢あるいは尾静脈より採血 し、抗原に対する反応性を ELISAなどで確認し、その血清が十分な抗体価を示した マウスまたはラットを抗体産生細胞の供給源とする。抗原の最終投与後 3〜7 日目に 、免疫したマウスまたはラットより公知の方法（Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)に準じて脾臓などを摘出し、抗体産生細胞と骨髄 腫細胞とを融合させる。
[0051] (3)骨髄腫細胞の調製
骨髄腫細胞としては、マウスから得られた株化細胞である 8-ァザグァニン耐性骨髄 腫細胞株 P3- X63Ag8-Ul (P3- Ul) (European Journal of Immunology, 6, 511-519， 1 976)、 SP2/0_Agl4 (SP_2) (Nature, 276, 269-270, 1978)、 P3_X63_Ag8653 (653) (J ournal of Immunology, 12^ 1548-1550, 1979)、 P3_X63_Ag8 (X63) (Nature, 256.49
5-497, 1975)など、 iii idimで増殖可能な骨髄腫細胞であればいかなるものでもよい 。これらの細胞株の培養および継代については公知の方法（Antibodies_A Laborato ry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)に従レ、、細胞融合時までに 2 X 10? 個以上の細胞数を確保する。
[0052] (4)細胞融合 上記で得られた抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを洗浄したのち、ポリエチレングリコ ール -1000 (以下、 PEG-1000と表記する）などの細胞凝集性媒体をカ卩え、細胞を融 合させ、培地中に懸濁する。細胞の洗浄には Modified Eagle's Medium (以下、 MEM と表記する）または Phosphate Buffered Saline (以下、 PBSと表記する）などを用いる。 また、融合細胞を懸濁する培地としては、 目的の融合細胞のみを選択的に得られる ように、 HAT培地 {通常培地 [RPMI-1640培地に 1.5mMグルタミン、 50 μ M 2-メルカプ トエタノール、 10 z g/mLジヱンタマイシンおよび 10%牛胎児血清（以下、 FBSと表記す る）を加えた培地]に O. lmMヒポキサンチン、 15 μ Mチミジンおよび 0.4 μ Μアミノプ テリンをカ卩えた培地 }を用いる。
[0053] 培養後、培養上清の一部を取り、 ELISAにより抗原蛋白質に反応し、非抗原蛋白質 に反応しないサンプノレを選択する。次いで、限界希釈法により単一細胞化を行レ、、 Ε LISAにより安定して高い抗体価の認められたものをモノクローナル抗体産生ハイブリ ドーマとして選択する。
[0054] (5)ハイプリドーマの選択
抗原に反応する抗体を産生するハイプリドーマの選択は、公知の方法 (Antibodies- A Laboratory Manual,し old Spring Harbor Laboratory, 1988)に ¾tい、以 r"に述へる ELISAにより選択することができる。本方法により、後述するヒト型キメラ抗体、 CDR移 植抗体またはそれらの抗体断片を産生する形質転換株の培養上清中に含まれる抗 体あるいは培養上清より精製された抗体の抗原に対する結合活性を測定することが できる。
[0055] ELISA
抗原を 96穴 ELISAプレートに固定化し、ハイプリドーマなどの培養上清あるいは精 製抗体を第一抗体として反応させる。第一抗体反応後、プレートを洗浄して第二抗 体を添加する。第二抗体としては、第一抗体を認識することができる抗体を、ビォチ ン、酵素、化学発光物質あるいは放射性同位元素などで標識した抗体を用いる。具 体的にはハイブリドーマ作製の際にマウスを用いたのであれば、第二抗体としてはマ ウス抗体を認識できる抗体を用いる。反応後、第二抗体の標識物質に応じた反応を 行ない、抗原に特異的に反応するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマとし て選択する。
[0056] (6)モノクローナル抗体の精製
0.5mLのプリスタン（2， 6, 10， 14-テトラメチルペンタデカン）を腹腔内投与し、 2週間 飼育した 8〜 10週令のマウスまたはヌードマウスに、 1 (4)で得られたモノクローナル抗 体産生ハイブリドーマ細胞 5 X 106〜2 X 107細胞/匹を腹腔内に注射する。 10〜21日 間でハイプリドーマは腹水癌化する。該マウスまたはヌードマウスから腹水を採取し、 遠心分離、 40〜50%飽和硫酸アンモニゥムによる塩析、力プリル酸沈殿法、 DEAE- セファロースカラム、プロテイン A-カラムあるいはセル口ファイン GSL2000 (生化学ェ 業社製）のカラムなどを用いて、 IgGあるいは IgM画分を回収し、精製モノクローナル 抗体とする。
[0057] 精製モノクローナル抗体のサブクラスの決定は、マウスモノクローナル抗体タイピン グキットまたはラットモノクローナル抗体タイピングキットなどを用いて行うことができる 。蛋白質濃度は、ローリー法あるいは 280nmでの吸光度より算出することができる。 抗体のサブクラスとは、クラス内のアイソタイプのことで、マウスでは、 IgGl、 IgG2a、 I gG2b、 IgG3、ヒトでは、 IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4があげられる。
[0058] (7)モノクローナル抗体の活性評価
(7-1)抗原への結合活性評価
培養上清中あるいは培養上清から精製されたモノクローナル抗体の抗原に対する 結合活性は、上記 1 (5)の ELISAおよび表面プラズモン共鳴（Journal of Immunologica 1 Methods, 145, 229-240， 1991)などにより測定することができる。また、抗原ペプチド またはその部分ペプチドを用いた競合 ELISAにより、抗原との反応性および抗原ェピ トープを解析することができる。抗体が抗原である蛋白質の立体構造を認識している か否かは、通常行われる立体構造的解析法、あるいは種々の免疫学的測定法を組 み合わせることにより、推測すること力できる。立体構造解析法としては、例えば、 X線 結晶解析、核磁気共鳴法などがあげられる。種々の免疫学的測定法を組み合わせ る方法としては、例えば、非変性状態の抗原に対する ELISA法と変性状態の抗原に 対する ELISA法を組み合わせる方法があげられる。このとき、非変性状態の抗原にの み反応性を示す抗体は、抗原の立体構造を認識している可能性が高レ、ものと推測 できる。非変性状態の抗原に対する ELISA法とは、液層中で非変性抗原と抗体を反 応させる ELISA法などがあげられる。変性状態の抗原に対する ELISA法としては、抗 原がもとの立体構造を保持していない状態で抗体を反応させる ELISA法であればい ずれでもよぐ例えば、疎水性の反応プレート上に直接固定化した抗原や、適当な長 さに消化した部分ペプチドなどに対する ELISA法があげられる。
[0059] 2.抗原に対するヒト以外の動物のポリクローナル抗体の作製
ポリクローナル抗体は、上記 1.(2)に示された方法で免疫を施した動物のうち、その 血清が十分な抗体価を示した動物の血清から調製することができる。
[0060] 即ち、該動物から回収した血液から遠心分離法により分画した血清、あるいは該血 清から常法に従って免疫グロブリン画分を精製し、ポリクローナル抗体を調製すること ができる。該ポリクローナル抗体の活性は、上記 1.(7)に記載の方法により、抗原に対 する結合活性を評価することができる。
[0061] 3.ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の作製
(1)ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体発現用ベクターの構築
ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体発現用ベクター（以下、両者をまとめてヒト化抗体 発現用ベクターとレ、う）としては、ヒト抗体の CHおよび/または CLをコードする遺伝子 が組み込まれた動物細胞用発現ベクターであればレ、かなるものでもよい。ヒト化抗体 発現用ベクターは、動物細胞用発現ベクターにヒト抗体の CHおよび CLをコードする 遺伝子をそれぞれクローニングすることにより構築することができる。
[0062] ヒト抗体の C領域は任意のヒト抗体の CHおよび CLであることができ、例えば、ヒト抗 体の H鎖の IgGlサブクラスの C領域（以下、 hC y 1と表記する）およびヒト抗体の L鎖の κクラスの C領域（以下、 hC κと表記する）などがあげられる。ヒト抗体の CHおよび CL をコードする遺伝子としてはェキソンとイントロンからなる染色体 DNAを用いることがで き、また、 cDNAを用レ、ることもできる。
[0063] 動物細胞用発現ベクターとしては、ヒト抗体の C領域をコードする遺伝子を組込み 発現できるものであればいかなるものでも用いることができる。例えば、 pAGE107 (Cyt otechnology, 3, 133-140, 1990)、 pAGE103 (Journal of Biochemistry, 101 , 1307-131 0， 1987)、 pHSG274 (Gene, 27, 223-232, 1984)、 pKCR (Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 78, 1527-1531， 1981)、 pSGl β d2-4 (Cytotechnology, 4, 173-180， 1990)などがあげられる。動物細胞用発現べク ターに用いるプロモーターとェンハンサ一としては、 SV40の初期プロモーターとェン ハンサー（Journal of Biochemistry, 101, 1307—1310, 1987)、モロニ一マウス白血病ゥ イノレスの LTRプロモーターとェンハンサー (Biochemical &Biophysical Research Com munications, 149, 960-968， 1987)、ィムノグロブリン H鎖のプロモーター（Cell, 41, 47 9-487, 1985)とェンハンサー（Cell, 33, 717-728, 1983)などがあげられる。
[0064] ヒト化抗体発現用ベクターは、抗体 H鎖および L鎖が別々のベクター上に存在する タイプあるいは同一のベクター上に存在するタイプ（以下、タンデム型と表記する）の どちらでも用いることができる力 ヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現 ベクターの構築の容易さ、動物細胞への導入の容易さ、動物細胞内での抗体 H鎖お よび L鎖の発現量のバランスが均衡するなどの点からタンデム型のヒト化抗体発現用 ベクターの方が好ましい（Journal of Immunological Methods, 167, 271-278， 1994)。 タンデム型のヒト化抗体発現用ベクターとしては、 pKANTEX93 (WO97/10354)、 pEE 18 (Hybridoma, H, 559-567， 1998)などがあげられる。
[0065] 構築したヒト化抗体発現用ベクターは、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の動物細 胞での発現に使用できる。
[0066] (2)ヒト以外の動物の抗体の V領域をコードする cDNAの取得およびアミノ酸配列の解 析
ヒト以外の動物の抗体、例えば、マウス抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは以 下のようにして取得することができる。
[0067] ハイプリドーマより mRNAを抽出し、 cDNAを合成する。合成した cDNAをファージある いはプラスミドなどのベクターにクローユングして cDNAライブラリーを作製する。該ラ イブラリーより、マウス抗体の C領域部分あるレ、は V領域部分をプローブとして用いて 、 VHをコードする cDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドおよび VLを コードする cDNAを有する組換えファージあるいは組換えプラスミドをそれぞれ単離す る。組換えファージあるいは組換えプラスミド上の目的とするマウス抗体の VHおよび VLの全塩基配列を決定し、塩基配列より VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定する。 [0068] ヒト以外の動物としては、マウス、ラット、ハムスター、ラビットなど、ハイプリドーマを 作製することが可能であれば、いかなるものも用いることができる。
ハイプリドーマから全 RNAを調製する方法としては、チォシアン酸グァニジン一トリフ ノレォロ酢酸セシウム法（Methods in Enzymology, 154, 3-28, 1987)、また全 RNAから mRNAを調製する方法としては、オリゴ (dT)固定化セルロースカラム法（Molecular Clo nmg: ALaboratory Manual,し old spring Harbor Lab. Press New York, 1989)など力51 あげられる。また、ハイプリドーマ力も mRNAを調製するキットとしては、 Fast Track mR NA Isolation Kit (Invitrogen社製)、 Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia社 製）などがあげられる。
[0069] cDNAの合成および cDNAライブラリ一作製法としては、常法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Proto cols in Molecular Biology, Supplement 1-34) ,あるレヽは市販のキット、例えば、 Super Script™Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (GIBCO BRL社製；） や ZAP-cDNA Synthesis Kit (Stratagene社製）を用いる方法などがあげられる。
[0070] cDNAライブラリーの作製の際、ハイプリドーマから抽出した mRNAを铸型として合成 した cDNAを組み込むベクターは、該 cDNAを組み込めるベクターであればいかなるも のでも用いることができる。例えば、 ZAP Express (Strategies, 5, 58-61， 1992)、 pBlue script II SK (+) (Nucleic Acids Research, 17,9494, 1989)、 λ ΖΑΡ II (Stratagene社製） 、 λ gtl0、 λ gtl l (DNA Cloning: A Practical Approach, I, 49, 1985)、 Lambda BlueM id (Clontech社製）、 え ExCell、 pT7T3 18U (Pharmacia社製）、 pcD2 (Molecular &Cellu lar Biology, 3, 280-289, 1983)および pUC18 (Gene, 33, 103-119， 1985)などのファ ージあるいはプラスミドベクターが用いられる。
[0071] ファージあるいはプラスミドベクターにより構築される cDNAライブラリーを導入する 大腸菌としては該 cDNAライブラリーを導入、発現および維持できるものであればレ、か なるものでも用レヽること力 Sできる。例えば、 XLl-Blue MRF' (Journal of Biotechnology, 23, 271-289, 1992)、 C600 (Genetics, 59, 177-190， 1968)、 Y1088、 Y1090 (Science, 222. 778-782, 1983)、 NM522 (Journal of Molecular Biology, 166, 1-19, 1983)、 K80 2 (Journal of Molecular Biology, 16, 118-133， 1966)および JM105 (Gene, 38, 275-27 6， 1985)などが用いられる。
[0072] cDNAライブラリーからのヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAク ローンの選択法としては、放射性同位元素あるいは蛍光標識したプローブを用いた コロ二' ~ .ハイブリダィゼーシヨン法あるいはプラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法（Mole cular Cloning: A Laboratory Manual, し old Spring Harbor Lab. Press New York, 198 9)により選択すること力できる。また、プライマーを調製し、 mRNAから合成した cDNA あるいは cDNAライブラリーを錡型として、 Polymerase Chain Reaction (以下、 PCR法と ¾fE o； Molecular し loning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. Press New York, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-34)により V Hおよび VLをコードする cDNAを調製することもできる。
[0073] 上記方法により選択された cDNAを、適当な制限酵素等で切断後、 pBluescript SK( -) (Stratagene社製）などのプラスミドベクターにクローユングし、通常用いられる塩基 配列解析方法、例えば、ジデォキシ法（Proceedings of the National Academy of Scie nces of the United States of America, 74, 5463-5467， 1977)などの反応を行レヽ、塩 基配列自動分析装置 ABI PRISM 377 (ABI社製)などを用いて解析することで該 cDN Aの塩基配列を決定することができる。
[0074] 決定した塩基配列力 VHおよび VLの全アミノ酸配列を推定し、既知の抗体の VH および VLの全アミノ酸酉己歹 IJ (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US De pt. Health and Human Services, 1991)と比較することにより、取得した cDNAが分泌 のためのシグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なアミノ酸配列をコードして レ、るかを確認することができる。シグナル配列を含む抗体の VHおよび VLの完全なァ ミノ酸配列に関しては、既知の抗体の VHおよび VLの全アミノ酸配列（Sequences of P roteins or immunological Interest, US Dept. Health ana Human bervices, 1991)と];匕 較することにより、シグナル配列の長さおよび N末端アミノ酸配列を推定でき、さらに はそれらが属するサブグループを知ることができる。また、 VHおよび VLの各 CDRのァ ミノ酸配列についても、既知の抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列（Sequences of Prot eins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)と 匕 ¾ することによって見出すことができる。 [0075] さらに、 VHおよび VLの完全なアミノ酸配列を用いて任意のデータベース、例えば、 SWISS- PROTや PIR- Proteinなどに対して BLAST法（Journal of Molecular Biology, 21 5, 403-410, 1990)などの配列の相同性検索を行い、配列の新規性を検討することが できる。
[0076] (3)ヒト型キメラ抗体発現ベクターの構築
上記 3 (1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードす る遺伝子の上流に、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAをクロー ユングし、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。例えば、ヒト以外の 動物の抗体の VHおよび VLをコードする cDNAを、ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの 3'末端側の塩基配列とヒト抗体の CHおよび CLの 5'末端側の塩基配列とから成 り、かつ適当な制限酵素の認識配列を両端に有する合成 DNAとそれぞれ連結し、そ れぞれを上記 3 (1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコ ードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングし、ヒト型キ メラ抗体発現ベクターを構築することができる。また、ヒト以外の動物の抗体の VHおよ び VLをコードする cDNAを含むプラスミドを铸型として、 5'末端に適当な制限酵素の 認識配列を有するプライマーを用いて PCR法により VHおよび VLをコードする cDNAを 増幅し、それぞれを上記 3 (1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHお よび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニング し、ヒト型キメラ抗体発現ベクターを構築することができる。
[0077] (4)ヒト化抗体の V領域をコードする cDNAの構築
ヒトイ匕抗体の VHおよび VLをコードする cDNAは、以下のようにして構築すること ができる。まず、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列 を移植するヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列を選択する。ヒト抗体の VHお よび VLの FRのアミノ酸配列としては、ヒト抗体由来のものであれば、いかなるものでも 用いることができる。例えば、 Protein Data Bankなどのデータベースに登録されてい るヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配歹 IJ、ヒト抗体の VHおよび VLの FRの各サ フグノレーフの共通アミノ酸酉己列 (Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and HumanServices, 1991)などがあげられる力 その中でも、十分な 活性を有するヒト化抗体を作製するためには、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHお よび VLの FRのアミノ酸配列とできるだけ高い相同性（少なくとも 60%以上）を有するァ ミノ酸配列を選択することが望ましい。次に、選択したヒト抗体の VHおよび VLの FRの アミノ酸配列に目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのアミノ酸配列を 移植し、ヒトイ匕抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列を設計する。設計したアミノ酸配列 を抗体の遺伝子の塩基配列に見られるコドンの使用頻度（Sequences of Proteins of I mmunological Interest, US Dept. Health and Human Services, 1991)を考慮し飞¾ 配列に変換し、ヒトイ匕抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を設 計する。設計した塩基配列に基づき、 100塩基前後の長さからなる数本の合成 DNA を合成し、それらを用いて PCRを行う。この場合、 PCRでの反応効率および合成可能 な DNAの長さから、 VH、 VLとも 6本の合成 DNAを設計することが好ましい。
[0078] また、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配歹を導入す ることで、上記 3 (1)で構築したヒト化抗体発現用ベクターに容易にクローニングするこ とができる。 PCR反応後、増幅産物を pBluescript SK (-) (Stratagene社製）などのプラ スミドにクローユングし、上記 3 (2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、所望のヒ ト化抗体の VHおよび VLのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有するプラスミドを取 得する。
[0079] (5)ヒトイヒ抗体の V領域のアミノ酸配列の改変
ヒト化抗体は、 目的のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRのみをヒト抗体の VHおよび VLの FRに移植しただけでは、その抗原結合活性は元のヒト以外の動物の 抗体に比べて低下してしまうことが知られている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 1991)。この原因としては、元のヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLでは、 CDRのみ ならず、 FRのレ、くつかのアミノ酸残基が直接的あるいは間接的に抗原結合活性に関 与しており、それらアミノ酸残基が CDRの移植に伴レ、、ヒト抗体の VHおよび VLの FR の異なるアミノ酸残基へと変化してしまうことが考えられている。この問題を解決する ため、ヒト化抗体では、ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸配列の中で、直接抗原 との結合に関与しているアミノ酸残基や CDRのアミノ酸残基と相互作用したり、抗体 の立体構造を維持し、間接的に抗原との結合に関与しているアミノ酸残基を同定し、 それらを元のヒト以外の動物の抗体に見出されるアミノ酸残基に改変し、低下した抗 原結合活性を上昇させることが行われている（BIO/TECHNOLOGY, 9, 266-271, 19 91)。ヒト化抗体の作製においては、それら抗原結合活性に関わる FRのアミノ酸残基 を如何に効率よく同定するかが、最も重要な点であり、そのために X線結晶解析 (Jour nal of Molecular Biology, 112, 535-542, 1977)あるいはコンピューターモデリング（Pr otein Engineering, 7, 1501-1507， 1994)などによる抗体の立体構造の構築および解 析が行われている。これら抗体の立体構造の情報は、ヒトイ匕抗体の作製に多くの有 益な情報をもたらして来たが、その一方、あらゆる抗体に適応可能なヒト化抗体の作 製法は未だ確立されておらず、現状ではそれぞれの抗体について数種の改変体を 作製し、それぞれの抗原結合活性との相関を検討するなどの種々の試行錯誤が必 要である。
[0080] ヒト抗体の VHおよび VLの FRのアミノ酸残基の改変は、改変用合成 DNAを用いて上 記 3 (4)に記載の PCR法を行うことにより、達成できる。 PCR後の増幅産物について上 記 3 (2)に記載の方法により、塩基配列を決定し、 目的の改変が施されたことを確認 する。
[0081] (6)ヒト化抗体発現ベクターの構築
上記 3 (1)に記載のヒトイ匕抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードす る遺伝子の上流に、上記 3 (4)および (5)で構築したヒト化抗体の VHおよび VLをコー ドする cDNAをクローニングし、ヒトイ匕抗体発現ベクターを構築することができる。
[0082] 例えば、上記 3 (4)および（5)でヒト化抗体の VHおよび VLを構築する際に用いる合 成 DNAのうち、両端に位置する合成 DNAの 5'末端に適当な制限酵素の認識配列を 導入することで、上記 3 (1)に記載のヒト化抗体発現用ベクターのヒト抗体の CHおよび CLをコードする遺伝子の上流にそれらが適切な形で発現するようにクローニングする こと力 Sできる。
[0083] (7)ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の一過性発現
作製した多種類のヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の抗原結合活性を効率的に評 価するために、上記 3 (3)および (6)に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト 化抗体発現ベクター、あるいはそれらを改変した発現ベクターを用いてヒト型キメラ抗 体およびヒト化抗体の一過性発現を行うことができる。発現ベクターを導入する宿主 細胞としては、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を発現できる宿主細胞であれば、い かなる細胞でも用いることができる力 その発現量の高さから、 COS-7細胞（ATCC C RL1651)が一般に用いられる（Methods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991)。 C〇S_7細胞への発現ベクターの導入法としては、 DEAE-デキストラン法（Met hods in Nucleic Acids Research, CRC press, 283, 1991)、リポフエクシヨン法（Procee dings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84, 741 3-7417， 1987)などがあげられる。
[0084] 発現ベクターの導入後、培養上清中のヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の発現量 及び抗原結合活十生は ELISA (Antibodies: ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Aca demic Press Limited, 1996)などにより測定できる。
[0085] (8)ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の安定発現
上記 3 (3)および (6)に記載のヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現 ベクターを適当な宿主細胞に導入することによりヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を 安定に発現する形質転換細胞を得ることができる。宿主細胞への発現ベクターの導 入法としては、エレクト口ポレーシヨン法（Cytotechnology, 3, 133-140， 1990)などがあ げられる。ヒト型キメラ抗体発現ベクターおよびヒト化抗体発現ベクターを導入する宿 主細胞としては、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を発現させることができる宿主細胞 であれば、いかなる細胞でも用いることができる。例えば、マウス SP2/0-Agl4細胞（A TCC CRL1581)、マウス P3X63-Ag8.653細胞（ATCC CRL1580)、ジヒドロ葉酸還元 酵素遺伝子（以下、 と表記する）が欠損した CHO細胞（Proceedings of the Nation al Academy of Sciences of the United States of America, 77- 4216-4220, 1980)、ラッ ト YB2/3Hし P2.Gl l.16Ag.20細胞（ATCC CRL1662、以下、 YB2/0細胞と表記する） などがあげられる。
[0086] 発現ベクターの導入後、ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を安定に発現する形質 転換体は、特開平 2-257891に開示されている方法に従レ、、 G418 sulfate (以下、 G41 8と表記する）などの薬剤を含む動物細胞培養用培地で培養することにより選択でき る。動物細胞培養用培地としては、 RPMI1640培地（日水製薬社製）、 GIT培地（日本 製薬社製）、 EX-CELL302培地（JRH社製）、 IMDM (GIBCO BRL社製）、 Hybridoma- SFM (GIBCO BRL社製）、またはこれら培地に FBSなどの各種添加物を添加した培地 などを用いることができる。得られた形質転換細胞を培地中で培養することで培養上 清中にヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体を発現蓄積させることができる。培養上清中 のヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の発現量および抗原結合活性は、 ELISAにより測 定できる。また、形質転換細胞は、特開平 2-257891に開示されている方法に従レ、、 d i±増幅系などを利用してヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体の発現量を上昇させること ができる。
[0087] ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体は、形質転換細胞の培養上清よりプロテイン Aカラ ムを用いて精製することができる（Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Har bor Laboratory, Chapter 8, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, A cademic Press Limited, 1996)。また、その他に通常、蛋白質の精製で用いられる精 製方法を使用することができる。例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィーおよ び限外濾過等を組み合わせて行い、精製することができる。精製したヒト型キメラ抗 体およびヒト化抗体の H鎖、 L鎖あるいは抗体分子全体の分子量は、ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動（以下、 PAGEと表記する： Nature, 227, 680-685, 1970)やウェスタン プロツァインク法 (Antibodies: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Chapter 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996)などで測定することができる。
[0088] (9)ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体と抗原との結合活性評価
ヒト型キメラ抗体およびヒト化抗体と抗原との結合活性評価は、上記に記載の EUSA を用いて行うことができる。
[0089] 4.抗体断片の作製
抗体断片は、上記 1および 3に記載の抗体をもとに遺伝子工学的手法あるいは蛋白 質化学的手法により、作製することができる。
[0090] 遺伝子工学的手法としては、 目的の抗体断片をコードする遺伝子を構築し、動物 細胞、植物細胞、昆虫細胞、大腸菌などの適当な宿主を用いて発現、精製を行うな どの方法があげられる。
蛋白質化学的手法としては、ペプシン、ノ パインなどの蛋白質分解酵素を用いた 部位特異的切断、精製などの方法があげられる。
[0091] 抗体断片として、 Fab, F(ab')、 Fab'. scFv、 diabody, dsFv、 CDRを含むペプチドの 製造法について以下に具体的に説明する。
[0092] (1) Fabの作製
Fabは、蛋白質化学的には IgGを蛋白質分解酵素パパインで処理することにより、作 製すること力 Sできる。パパインの処理後は、元の抗体がプロテイン A結合性を有する Ig Gサブクラスであれば、プロテイン Aカラムに通すことで、 IgG分子や Fc断片と分離し、 均一な Fabとして回収することができる（Monoclonal Antibodies: Principles and Practi ce, third edition, 1995)。プロテイン A結合性を持たない IgGサブクラスの抗体の場合 は、イオン交換クロマトグラフィーにより、 Fabは低塩濃度で溶出される画分中に回収 すること でさる (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, third edition, 1995 ) 0
[0093] また、 Fabは遺伝子工学的には、多くは大腸菌を用いて、また、昆虫細胞や動物細 胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 3 (2)、 3 (4)および 3 (5)に記載の 抗体の V領域をコードする DNAを、 Fab発現用ベクターにクローニングし、 Fab発現べ クタ一を作製することができる。 Fab発現用ベクターとしては、 Fab用の DNAを組み込 み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pIT106 (Scien ce, 240, 1041-1043, 1988)などがあげられる。 Fab発現ベクターを適当な大腸菌に導 入し、封入体あるいはペリプラズムに Fabを生成蓄積させることができる。封入体から は、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、活性のある Fabとすることが でき、また、ペリブラズムに発現させた場合は、培養上清中に活性を持った Fabが漏 出する。リフォールデイング後あるいは培養上清からは、抗原を結合させたカラムを用 レヽることにより、均一な Fabを精製することができる（Antibody Engineering, A Practical uide, W. H. Freeman andし ompany, 1992)。
[0094] (2) F(ab')の作製
F(ab')は、蛋白質化学的には IgGを蛋白質分解酵素ペプシンで処理することにより 、作製することができる。ペプシンの処理後は、 Fabと同様の精製操作により、均一な F(ab')として回収すること力 sできる (Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, t hird edition, Academic Press, 1995)。また、下記 4 (3)に記載の Fab'を o-PDMやビス マレイミドへキサンなどのようなマレイミドで処理し、チォエーテル結合させる方法や、 DTNB[5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)]で処理し、 S-S結合させる方法によっても 作製することができる（Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 199 6)。
[0095] (3) Fab'の作製
Fab'は、上記 4 (2)に記載の？ ）をジチオスレィトールなどの還元剤で処理して得 ること力 Sできる。また、 Fab'は遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動 物細胞などを用いて作製することができる。例えば、上記 3 (2)、 3 (4)および 3 (5)に記 載の抗体の V領域をコードする DNAを、 Fab'発現用ベクターにクローユングし、 Fab， 発現ベクターを作製することができる。 Fab'発現用ベクターとしては、 Fab'用の DNAを 組み込み発現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pAK19 (BIO/TECHNOLOGY, 10, 163-167, 1992)などがあげられる。 Fab'発現ベクターを 適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリブラズムに Fab'を生成蓄積させることが できる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、活性の ある Fab'とすることができ、また、ペリブラズムに発現させた場合は、リゾチームによる 部分消化、浸透圧ショック、ソニケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、菌体外へ回 収させることができる。リフォールデイング後あるいは菌の破碎液からは、プロテイン G カラムなどを用いることにより、均一な Fab'を精製することができる（Antibody Engineer ing, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
[0096] (4) scFvの作製
scFvは遺伝子工学的には、ファージまたは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞な どを用いて作製することができる。例えば、上記 3 (2)、 3 (4)および 3 (5)に記載の抗体 の V領域をコードする DNAを、 scFv発現用ベクターにクローニングし、 scFv発現べクタ 一を作製することができる。 scFv発現用ベクターとしては、 scFvの DNAを組み込み発 現できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCANTAB5E (Phar macia社製）、 HFA (Human Antibodies &Hybridomas， 5, 48-56， 1994)などがあげら れる。 scFv発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、ヘルパーファージを感染させるこ とで、ファージ表面に scFvがファージ表面蛋白質と融合した形で発現するファージを 得ること力 Sできる。また、 scFv発現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリプ ラズムに scFvを生成蓄積させることができる。封入体からは、通常蛋白質で用いられ るリフォールデイング法により、活性のある scFvとすることができ、また、ペリプラズムに 発現させた場合は、リゾチームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーシヨンなど の処理により菌を破砕し、菌体外へ回収することができる。リフォールデイング後ある いは菌の破砕液からは、陽イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一 な scFvを精製すること力できる (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PR ESS, 1996)。
[0097] (5) diabodyの作製
diabodyは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用 いて作製することができる。例えば、上記 3 (2)、 3 (4)および 3 (5)に記載の抗体の VH と VLをリンカ一がコードするアミノ酸残基が 8残基以下となるように連結した DNAを作 製し、 diabody発現用ベクターにクローニングし、 diabody発現ベクターを作製すること ができる。 diabody発現用ベクターとしては、 diabodyの DNAを組み込み発現できるも のであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pCANTAB5E (Pharmacia社製 )、 pHFA (Human Antibodies Hybridomas, 5, 48, 1994)などがあげられる。 diabody発 現ベクターを導入した大腸菌の封入体あるいはペリブラズムに diabodyを生成蓄積さ せること力 Sできる。封入体からは、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法によ り、活性のある diabodyとすることができ、また、ペリプラズムに発現させた場合は、リゾ チームによる部分消化、浸透圧ショック、ソニケーシヨンなどの処理により菌を破砕し、 菌体外へ回収することができる。リフォールデイング後あるいは菌の破砕液からは、陽 イオン交換クロマトグラフィーなどを用いることにより、均一な scFvを精製することがで さる (Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL PRESS, 1996)。
[0098] (6) dsFvの作製
dsFvは遺伝子工学的には、多くは大腸菌、また、昆虫細胞や動物細胞などを用い て作製すること力できる。まず、上記 3 (2)、 3 (4)および 3 (5)に記載の抗体の VHおよ び VLをコードする DNAの適当な位置に変異を導入し、コードするアミノ酸残基がシス ティンに置換された DNAを作製する。作製した各 DNAを dsFv発現用ベクターにクロ 一ユングし、 VHおよび VLの発現ベクターを作製することができる。 dsFv発現用べクタ 一としては、 dsFv用の DNAを組み込み発現できるものであればいかなるものも用いる こと力 Sできる。例えば、 pULI9 (Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)などがあげら れる。 VHおよび VLの発現ベクターを適当な大腸菌に導入し、封入体あるいはペリプ ラズムに dsFvを生成蓄積させることができる。封入体あるいはペリプラズム力 VHお よび VLを得、混合し、通常蛋白質で用いられるリフォールデイング法により、活性のあ る dsFvとすること力 Sできる。リフォールデイング後は、イオン交換クロマトグラフィーおよ びゲル濾過などにより、さらに精製することができる（Protein Engineering, 7, 697-704 ， 1994) 0
[0099] (7) CDRペプチドの作製
CDRを含むペプチドは、 Fmoc法あるいは tBoc法等の化学合成法によって作製する こと力 Sできる。また、 CDRを含むペプチドをコードする DNAを作製し、作製した DNAを 適当な発現用ベクターにクローユングし、 CDRペプチド発現ベクターを作製すること ができる。発現用ベクターとしては、 CDRペプチドをコードする DNAを組み込み発現 できるものであればいかなるものも用いることができる。例えば、 pLEX (Invitrogen社 製）、 pAX4a+ (Invitrogen社製）などがあげられる。発現ベクターを適当な大腸菌に導 入し、封入体あるいはペリプラズムにを生成蓄積させることができる。封入体あるいは ペリプラズムから CDRペプチドを得、イオン交換クロマトグラフィーおよびゲル濾過な どにより、精製することができる（Protein Engineering, 7, 697-704, 1994)。
[0100] (8)抗体断片と抗原との結合活性評価
精製した抗体断片と抗原との結合活性評価は、上記 1(7)に記載の ELISAを用いて 行うことができる。
[0101] 5.本発明の治療剤
本発明の子宮内膜症の治療剤としては、 IL-5アンタゴニストを有効成分として含む 医薬であればレ、かなるものでもよいが、通常は薬理学的に許容される一つあるいは それ以上の担体と一緒に混合し、製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方 法により製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。好ましくは水、あるいは食塩 、グリシン、グノレコース、ヒトアルブミン等の水溶液等の水性担体に溶解した無菌的な 溶液が用いられる。また、製剤溶液を生理的条件に近づけるための緩衝ィ匕剤や等張 化剤のような、薬理学的に許容される添加剤、例えば、酢酸ナトリウム、塩ィ匕ナトリウム 、乳酸ナトリウム、塩化カリウム、クェン酸ナトリウム等を添加することもできる。また、凍 結乾燥して貯蔵し、使用時に適当な溶媒に溶解させて用レ、ることもできる。
[0102] 本発明の治療剤の投与経路は、治療に際し最も効果的なものを使用するのが望ま しぐ経口投与、あるいは口腔内、気道内、直腸内、皮下、筋肉内および静脈内等の 非経口投与をあげることができるは、静脈内投与が好ましレ、。
経口投与に適当な製剤としては、乳剤、シロップ剤、カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒 剤等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、水、ショ糖、 ソルビトール、果糖等の糖類、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール等のグリ コール類、ごま油、ォリーブ油、大豆油などの油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル 類等の防腐剤、ストロベリーフレーバー、ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤と して用いて製造できる。カプセル剤、錠剤、散剤、顆粒剤等は、乳糖、ブドウ糖、ショ 糖、マンニトール等の賦形剤、デンプン、アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、ステアリ ン酸マグネシウム、タルク等の滑沢剤、ポリビエルアルコール、ヒドロキシプロピルセル ロース、ゼラチン等の結合剤、脂肪酸エステル等の界面活性剤、グリセリン等の可塑 剤等を添加剤として用いて製造できる。
[0103] 非経口投与に適当な製剤としては、注射剤、座剤、噴霧剤等があげられる。例えば 、注射剤は、塩溶液、ブドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて 調製する。座剤はカカオ脂、水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製さ れる。また、噴霧剤は該アンタゴニストそのもの、ないしは受容者の口腔および気道 粘膜を刺激せず、かつ該アンタゴニストを微細な粒子として分散させ吸収を容易にさ せる担体等を用いて調製する。担体として具体的には乳糖、グリセリン等が例示され る。該アンタゴニストおよび用いる担体の性質により、エアロゾル、ドライパウダー等の 製剤が可能である。また、これらの非経口剤においても経口剤で添加剤として例示し た成分を添加することもできる。
[0104] 本発明の治療剤の投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、投与方法、治 療期間、年齢、体重等により異なるが、通常成人 1日当たり 10 μ g/kg〜10mg/kgであ る。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例 1
[0105] ラット子宮内膜症自家移植モデルに対する抗 IL-5受容体抗体および抗 IL-5抗体の 抑制作用
ラット子宮内膜症自家移植モデルを用いた抗 IL-5受容体抗体および抗 IL-5抗体の 抑制効果について、以下の実験を行った。
方法としては、公知の方法 [ファーティリティ'アンド'ステリリティ（Fertility and sterili ty)、 44卷、 684〜694ページ（1985年）]を改変して行った。
[0106] ラットにおいて性成熟するとされる 8週齢以上の SD系雌性ラット（日本チヤ一ルス 'リ バー社製)を購入し、性周期をラット用膣インピーダンス ·チェッカ (MK-10B、室町機 械社製)を用いて毎日測定した。 4〜5日周期の性周期が 2回以上観察されたラットの うち、発情前期にあるラットを選別し、以下のようにして子宮内膜組織の自家移植を 行った。
被験薬物をラットに静脈内投与した後、ペントバルビタール (ソムノペンチル (R)、武田 シェリング 'ブラウアニマルヘルス社製)の腹腔内投与により全身麻酔したラットの腹部 を剃毛し、正中線に沿って約 6センチメートル開腹した。双角に存在する子宮のうち、 右側の子宮の根元部位より約 1センチメートノレ上部ならびに卵巣より約 2センチメート ル下部を結索し、その間にある子宮を摘出した。摘出子宮 (管状)はペニシリン'ストレ プトマイシン (INVITROGEN社製)を含有するダルベッコ 'モディファイド'イーグル'メ ディウム (INVITROGEN社製)中で洗いながら、縦に開列しシート状にした。このシート 力 約 2ミリメートル四方の子宮内膜片を作製した。作製した子宮内膜片は、左右腹 膜にそれぞれ滅菌糸付縫合針 (外科用弱弯角針 No.12-黒ナイロン No.6-0、夏目製 作所製)を用いて自家移植した。この際、子宮内膜面が腹膜に接するように移植した 。また、対照として、子宮内膜片と同サイズの脂肪組織を同一個体力 摘出し、腹膜 に同様に自家移植した。最後に、移植部位ならびに子宮摘出部位を サガミシン (R)注射液、協和発酵工業社製)を含有する生理食塩水で洗い、直ちに腹 膜および皮膚を滅菌糸付縫合針により丁寧に縫合した。
[0107] 自家移植の 1週間後に、エーテル麻酔下で放血致死させ、腹部を開腹して、子宮 内膜病変の肉眼的評価 (移植片のサイズ測定)を実施した。移植片のサイズは金型ノ ギスを用いて縦'横それぞれの直径を測定した (最小目盛り 0.5mm)。試験は一群 5匹 で実施した。また、必要に応じて、移植部位の病理標本を定法に従って作製し、病理 組織学的な解析を行った。
[0108] 被験薬物として lmg/kg抗マウス IL-5受容体抗体および抗マウス IL-5抗体 (Intemati onallmmunology, 3(2):135~9. 1991)を、コントロール抗体として lmg/kgラット IgG抗体 (I CN社製)をそれぞれ用いた。抗体はレ、ずれも滅菌したリン酸緩衝液 (ICN社製)で希釈 して使用した。
移植片サイズについての結果を表 1に示した。移植片サイズは縦径と横径を乗じて 算出した値とし、左右の移植片サイズを平均して示した。
[0109] 表 1に示したように、移植 1週間後に増大する移植片のサイズが、抗 IL-5抗体およ び抗 IL-5受容体抗体を投与することにより、縮小した (抑制率;抗 IL-5抗体 : 14%、抗 I
L-5受容体抗体 :15%)。
[0110] [表 1] 投与群 用量 . 投与 投与回数 移植片サイズ
(mg/kg) ( ) コントロール抗体 1 静脈内 移植直前に 1回 16. 8 ± 3. 3 抗 IL- 5受容体抗体 1 静脈内 移植直前 1回 14. 3 ± 2. 3
抗 IL - 5抗体 1 静脈内 移植直前に 1回 14. 4 土 1. 1
実施例 2
ラット子宮内膜症自家移植モデルに対する抗 IL-5受容体抗体の癒着抑制 ラット子宮内膜症自家移植モデルを用いて、抗 IL-5受容体抗体が子宮内膜の癒着 を抑制していることを確認するために、以下の実験を行った。実験方法は、実施例 1 に記載された方法に準じて行った。
[0112] ラットにおいて性成熟するとされる 8週齢以上の SD系雌性ラット（日本チヤ一ルス 'リ バー社製)を購入し、性周期をラット用膣インピーダンス ·チェッカ (MK-10B、室町機 械社製)を用いて毎日測定した。 4〜5日周期の性周期が 2回以上観察されたラットの うち、発情前期にあるラットを選別し、以下のようにして、子宮内膜組織の自家移植を 行った。
被験薬物をラットに静脈内投与した後、ペントバルビタール (ソムノペンチル (R)、武田 シェリング 'ブラウアニマルヘルス社製)の腹腔内投与により全身麻酔したラットの腹部 を剃毛し、正中線に沿って約 6センチメートル開腹した。双角に存在する子宮のうち、 右側の子宮の根元部位より約 1センチメートノレ上部ならびに卵巣より約 2センチメート ル下部を結索し、その間にある子宮を摘出した。摘出子宮 (管状)はペニシリン'ストレ プトマイシン (INVITROGEN社製)を含有するダルベッコ 'モディファイド'イーグル'メ ディウム (INVITROGEN社製)中で洗いながら、縦に開列しシート状にした。このシート 力 約 2ミリメートル四方の子宮内膜片を作製した。作製した子宮内膜片は、左右腹 膜にそれぞれ滅菌糸付縫合針 (外科用弱弯角針 No.12-黒ナイロン No.6-0、夏目製 作所製)を用いて自家移植した。この際、子宮内膜面が腹膜に接するように移植した 。また、対照として、子宮内膜片と同サイズの脂肪組織を同一個体力 摘出し、腹膜 に同様に自家移植した。最後に、移植部位ならびに子宮摘出部位をミクロノマイシン ( サガミシン (R)注射液、協和発酵工業社製)を含有する生理食塩水で洗い、直ちに腹 膜および皮膚を滅菌糸付縫合針により丁寧に縫合した。
[0113] 自家移植の 1週間後に、エーテル麻酔下で放血致死させ、腹部を開腹して、子宮 内膜病変の肉眼的評価 (癒着スコア)を実施した。癒着は以下の基準に従レ、スコア化 した。
癒着が認められなレ、もの；スコア 0
癒着が認められるが軽度のもの；スコア 1
強い癒着が認められるが剥離性であるもの；スコア 2
強い癒着が認められ非剥離性であるもの；スコア 3
試験は一群 5匹で実施した。また、必要に応じ、移植部位の病理標本を定法に従つ て作製し、病理組織学的な解析を行った。
[0114] 被験薬物として抗マウス IL-5受容体抗体 (International Immunology., 3(2): 135~9, 1 991)を用いた。ラッ HgG抗体 (ICN社製)をコントロール抗体として使用した。抗体はい ずれも滅菌したリン酸緩衝液 (ICN社製)で希釈して使用した。
病変部位における癒着スコアについての結果を表 2に示した。癒着スコアはそれぞ れを点数とし、左右の移植片の癒着スコアを平均化して示した。
[0115] [表 2] 投与群 用量 投与経路 投与回数 癒着スコア
(mg/kg) ントロール抗体 1 静脈内 雜直前に 1回 1. 4 士 0. 5 抗 IL- 5受容体抗体 1 静脈内 移植直前に 1回 1. 0 士 0. 4
[0116] 表 2に示したように、本ラット子宮内膜自家移植モデルでは臨床で観察される子宮 内膜症患者病変部に観察される癒着が明らかに認められた。その癒着スコアに対し 、抗 IL-5受容体抗体投与群で抑制する傾向が示された (抑制率 29%)。なお、対照と して脂肪組織を移植した場合には癒着はほとんど観察されなかった。
実施例 3
[0117] マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウス IL-5受容体抗体の子宮内膜症病変形 成抑制作用
抗 IL-5受容体抗体の子宮内膜症に対する有効性を検証するために、以下の実験 を行った。
方法としては、公知の方法 [ヒューマン'リプロダクション (Human Reproduction), 14 卷、 2944〜2950ページ (1999年)]を改変して行った。
[0118] マウスにおいて性成熟するとされる 8週齢以上の Balbん系雌性マウス（日本チヤール ス 'リバ一社)を実験に供した。購入後 1週間の馴化期間の後、性ホルモン環境を均一 にするため、全ての個体に左右卵巣摘出術を施したのち、ェストロジェンを外因性に 投与した。すなわち、ペントバルビタール (ソムノペンチル (R)、武田シヱリング'プラウア 二マルへルス社製) 50 mg/kgの腹腔内投与により全身麻酔したマウスの背部皮膚を 正中線に沿って約 1 cm切開し、そこから左右卵巣のある位置の腹膜に切り込み (約 3 mm)を入れた。その切り込みより、両側卵巣を摘出したのち、速やかに背部皮膚を縫 合し、飼育ケージに戻した。その後、ェストロジェン (プロギノン (R) .デポー 10 mg、 日 本シエーリング、吉草酸エストラジオール注射液） 100 x g/kgを左後肢筋肉内に注射 した。この処置により、マウスでは 4日周期で認められる性周期のうち高工ストロジェン 期である発情前期のマウス子宮と同程度の重量まで子宮が膨大することを確認した。
[0119] 次いで、卵巣摘出の 1週間後、全ての個体をドナーマウスとレシピエントマウスに 1 : 2 の構成比で分け、ドナーマウスの子宮を摘出して調製した子宮内膜片をレシピエント マウスの腹腔内に播種した。すなわち、放血致死させたドナーマウスから摘出した左 右の子宮から、周囲の脂肪組織や子宮頸部を取り除き、内膜が含まれる子宮体部を 小型手術用ハサミで細切して調製した。子宮内膜片は抗生物質を含む滅菌 HBSS液 (Hank' s Balanced Salt Solution,シグマ社製)に浮遊させ、全ドナーマウス分をプール した。この、子宮内膜片浮遊液 0.8 mL (子宮内膜片として約 50 mg相当)をペントバノレ ビタール 40 mg/kgで全身麻酔したレシピエントマウスに 19G注射針 (テルモ社製)をつ けたシリンジにより腹腔内投与して播種した。子宮内膜片浮遊液のシリンジへの充填 ならびに投与は、浮遊液をよく撹拌し、不均一にならぬよう実施した。その後、陽性対 照群ならびに薬物評価群にはエストロジヱン 100 /i g/kgを、陰性対照群にはエストロ ジェンの溶媒であるゴマ油を週 1回筋肉内投与した。
[0120] 子宮内膜片播種の 3週間後、放血致死させたのち開腹し、子宮内膜病変の肉眼的 評価 (形成される嚢胞サイズの測定)を実施した。病変サイズは金型ノギスを用いて縦 •横それぞれ直径を測定し (最小目盛り 0.5 mm)、縦径と横径を乗じて算出した面積と して評価した。病変が複数形成される場合には、その総和を総面積として評価し、試 験は一群 10匹で実施した。また、必要に応じて、病変部位の病理標本を定法にした 力 Sつて作製し、病理組織学的な解析を行った。
[0121] 被験薬物として、抗マウス IL- 5受容体抗体 (International Immunology, 3(2}: 135-9, 1991、 10 mg/kg,週 1回投与)を使用した。また、陽性対照群にはコントロール抗体と してラット IgG抗体 (ICN社製、 10 mg/kg,週 1回投与)を用いた。抗体はいずれも滅菌 生理食塩注射液 (大塚製薬工業社製)で希釈して使用した。
病変サイズについての結果を図 1に示した。
[0122] 子宮内膜片播種 3週間後において、陽性対照群では 100%の病変発症率であった が、陰性対照群では 1匹の個体でのみ発症が認められた。また、形成された病変は、 いずれも子宮内膜上皮で内張りされている嚢胞であり、子宮内膜症病変であることを 病理組織学的に確認した。すなわち、本実験モデルはエストロジヱン依存性に成長 するとされる子宮内膜症を反映している有用なモデルであると考えられた。
[0123] 本モデルにおいて、抗マウス IL-5受容体抗体は、図 1に示すように、陽性対照群に 比べ有意な抑制作用を示した。なお、子宮内膜片のかわりに同重量の小腸粘膜片を 播種した場合には、エストロジヱンの投与によっても病変は全く形成されなかった。 実施例 4
[0124] マウス子宮内膜症モデルにおける抗マウス IL-5抗体の子宮内膜症病変形成抑制 作用
実施例 3に記載された方法に準じ、抗 IL-5抗体の子宮内膜症に対する有効性を検 証した。
[0125] 実験方法は、被験薬物として抗マウス IL-5受容体抗体の代わりに、抗マウス IL-5抗 体 (International Immunology, 3(2): 135~9. 1991、 1および 10 mg/kg、週 1回投与)を使 用する以外は、実施例 3に記載された方法と同様に行った。
病変サイズについての結果を図 2に示した。
[0126] 抗マウス IL-5抗体は 10 mg/kg投与群において陽性対照群に比べ有意な抑制作用 を示した。
産業上の利用可能性
[0127] 本発明により、インターロイキン 5アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内 膜症治療剤を提供することができる。
配列フリーテキスト
[0128] 配列番号 9-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 10-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列
配列番号 11-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列 配列番号 12-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列 配列番号 13-人工配列の説明：抗体重鎖可変領域アミノ酸配列 配列番号 14-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列 配列番号 15-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列 配列番号 16-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列 配列番号 17-人工配列の説明：抗体軽鎖可変領域アミノ酸配列

Claims

請求の範囲
[I] インターロイキン一 5アンタゴニストを有効成分として含有する子宮内膜症の治療剤。
[2] インターロイキン _ 5アンタゴニストがインターロイキン _ 5とインターロイキン _ 5受容 体との結合を阻害する抗体またはその抗体断片である、請求項 1の治療剤。
[3] インターロイキン _ 5とインターロイキン _ 5受容体との結合を阻害する抗体力 S、インタ 一ロイキン一 5に結合する抗体である請求項 2記載の治療剤。
[4] インターロイキン一 5がヒトインターロイキン一 5である請求項 3記載の治療剤。
[5] インターロイキン 5とインターロイキン 5受容体との結合を阻害する抗体力 インタ 一ロイキン 5受容体に結合する抗体である請求項 2記載の治療剤。
[6] インターロイキン 5受容体がインターロイキン 5受容体 α鎖である請求項 5記載の 治療剤。
[7] インターロイキン 5受容体がヒトインターロイキン 5受容体である請求項 5または 6記 載の治療剤。
[8] 抗体がモノクローナル抗体である、請求項 2〜7のいずれ力 1項に記載の治療剤。
[9] モノクローナル抗体が遺伝子組換え抗体である、請求項 8項に記載の治療剤。
[10] 遺伝子組換え抗体が、ヒト型キメラ抗体、ヒトイ匕抗体およびヒト抗体からなる群から選 ばれる遺伝子組換え抗体である、請求項 9記載の治療剤。
[II] 抗体断片が、 Fab, Fa 、 F(ab' )、一本鎖抗体（scFv)、二量体化可変領域（Diabody
)、ジスルフイド安定化可変領域（dsFv)および CDRを含むペプチドから選ばれる抗体 断片である請求項 2〜： 10のいずれか 1項に記載の治療剤。
[12] 子宮内膜症治療剤の製造のための請求項 1〜： 11のいずれ力 4項に記載のインター ロイキン一 5アンタゴニストの使用。
[13] 請求項 1〜： 11のいずれか 1項に記載のインターロイキン _ 5アンタゴニストを投与する ことを特徴とする子宮内膜症の治療方法。
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