WO2006038608A1

WO2006038608A1 - オリゴ二本鎖ｒｎａ及び医薬組成物

Info

Publication number: WO2006038608A1
Application number: PCT/JP2005/018331
Authority: WO
Inventors: Kazuko Hirabayashi; Haruna Naito
Original assignee: Nippon Shinyaku Co., Ltd.
Priority date: 2004-10-05
Filing date: 2005-10-04
Publication date: 2006-04-13
Also published as: EP1811024A1; JPWO2006038608A1

Abstract

　本発明の目的は、ＨＣＶの複製を抑制するオリゴ二本鎖ＲＮＡ及びＨＣＶに感染することにより引き起こされる疾患を治療及び／又は予防するための当該オリゴ二本鎖ＲＮＡを含む医薬組成物を提供することにある。　本発明は、ＨＣＶの複製を抑制する、配列番号３及び配列番号４の各塩基配列の３’末端から２塩基のデオキシチミジン一リン酸（以下、「ｄＴ」という）を除いた塩基配列からなるＲＮＡの対又は配列番号２及び配列番号５の各塩基配列の３’末端から２塩基のｄＴを除いた塩基配列からなるＲＮＡの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖ＲＮＡ及び当該オリゴ二本鎖ＲＮＡと適当な担体とを含む医薬組成物に関するものである。

Description

明細書

オリゴニ本鎖 RNA及び医薬組成物

技術分野

[0001] 本発明は、オリゴニ本鎖 RNA及び当該オリゴニ本鎖 RNAを含む医薬組成物に関するものである。

背景技術

[0002] C型肝炎ウィルス（以下、「HCV」という）は、その genotypeにより、 genotype la、 lb、 2a、 2b、 3a、 3bに分類される。 HCVの感染者数は、全 genotypeを合わせて、全世界で約 1. 7億人であり、日本では約 150〜200万人であると言われている。 HC V感染の約 80%が慢性化し、慢性肝炎を経て、約 20〜30年で肝硬変や肝細胞癌へと進行する。日本においては、 genotype lbの HCVに感染しており、かっ血清中に大量の当該ウィルスが存在する患者力全 HCV感染者の約 80%を占めている。また、肝細胞癌での死者は年間 3. 4万人であり、そのうち約 75%が HCV由来である。

[0003] HCV感染の治療としては、インターフェロンを中心とした抗ウィルス療法が行われており、当該療法による肝細胞癌の発生予防効果や延命効果等が証明されている。しかしながら、インターフェロン療法では、日本人患者の大多数を占める高ウィルス、 genotype lbの HCV感染者に対しての完全著効率 (治療終了後 24週間以上、血清中の HCV RNAが陰性である患者の割合を表す）が、全症例の内、 16%程度にしか過ぎず、その効果は限定されたものである。そのため、インターフェロンに次ぐ次世代の抗 HCV治療薬が期待されてヽる。 HCV感染及びその治療方法に関する総説については、以下の文献を参照されたい (例えば、非特許文献 1を参照)。

[0004] RNA干渉 [RNA interference (以下、「RNAi」という）]は、二本鎖 RNA (以下、「dsRNA」という）を細胞内に導入することにより、導入した dsRNAと相補的な RNA が特異的に分解され、したがって当該 RNAのコードする遺伝子産物の合成が抑制される現象である。また、 RNAiによるタンパク質発現抑制活性を有する短い二本鎖の RNAを、 short interfering RNA (以下、「siRNA」という）という。 siRNAを用いた RNAiに関する総説については、以下の文献を参照されたい（例えば、非特許文献 2ないし 3を参照)。

[0005] siRNAの細胞内への導入方法としては、カチオン性リボソーム又はその他のカチオン性担体等の担体をベクターとして用いる方法、リン酸カルシウム法、エレクトロボレーシヨン法又はマイクロインジェクション法等により細胞内に直接導入する方法等が用いられている。また、 siRNAを細胞内で発現するよう siRNAをコードする塩基配列を組み込んだ発現ベクターを細胞内に導入する方法も研究されている（例えば、非特許文献 4ないし 5を参照)。

[0006] 近年、 HCV RNAに対する siRNAに関してもいくつかの報告がされているが、いずれも充分満足できる効果は得られて!/ヽな、 (例えば、特許文献 1な!ヽし特許文献 2 、ならびに非特許文献 6ないし 7を参照)。

[0007] 特許文献 1：国際公開第 03Z070750号パンフレット

特許文献 2 :国際公開第 02Z081494号パンフレット

非特許文献 1 :八橋弘、坪田昭人、泉並木、加藤直也、「PROGRESS IN MEDICINE」、 2003年、 4卷、 p. 1109— 1131

非特許文献 2 :森田隆及び吉田佳世、「タンパク質核酸酵素」、 2002年、 47卷、 p. 1939 - 1945

非特許文献 3 : Martinezら、 "Cell", 2002年 9月 6日、 110卷、 5号、 p. 563 - 57 4

非特許文献 4 : M. Miyagishiら、 "Nature Biotechnology", 2002年 5月、 20卷、 5号、 p. 497- 500

非特許文献 5 :T. R. Brummelkampら、 "Science", 2002年 4月 19日、 296卷、 p . 550- 553

非特許文献 6 : G. Randallら、 Proceedings of the National Academy of Sciences", 2003年、 100卷、 1号、 p. 235 - 240

特許文献 7 :J. A. Wilsonら、 "Proceedings of the National Academy of Sciences", 2003年、 100卷、 5号、 p. 2783 - 2788

発明の開示発明が解決しょうとする課題

[0008] 本発明は、主として、 HCVの複製を抑制することができるオリゴニ本鎖 RNA及び H CVに感染することにより引き起こされる疾患を治療及び Z又は予防するための当該オリゴニ本鎖 RNAを含む医薬組成物を提供することを目的としてヽる。

課題を解決するための手段

[0009] 本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、 HCVの複製を抑制する、配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3'末端から 2塩基のデォキシチミジン一リン酸 (以下、「d TJ t 、う）を除、た塩基配列力なる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除ヽた塩基配列からなる RNAの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴニ本鎖 RNAが上記目的を解決しうることを見出し、本発明を完成した。

[0010] 本発明としては、例えば、下記（1)〜（6)を挙げることができる。

(1)配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3'末端力 2塩基の dTを除いた塩基配列からなる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除、た塩基配列力なる RNAの対で形成されて、る二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴニ本鎖 RNA (以下、「本発明オリゴニ本鎖 RNA」という)。

(2)配列番号 2、配列番号 3又は配列番号 5のいずれ力 1つの塩基配列の 3'末端から 2塩基の dTを除、た塩基配列力なる RNAであって、かつその相補的な塩基配列からなる RNAとオリゴニ本鎖 RNAを構成したときに HCVの複製抑制活性を有することを特徴とする RNA (以下、「本発明 RNA」 t ヽぅ）。

(3)上記（2)の RNAを構成するリボヌクレオチドの糖が D— 2—デォキシリボースであり、かつ塩基の内、ゥラシル (U)がチミン (T)であることを特徴とする DNA (以下、「本発明 DNA」という）。

(4)上記（3)の本発明 DNAが挿入された、 RNAの発現ベクター。

(5)上記（1)のオリゴニ本鎖 RNAと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物（以下、「本発明組成物」という）。

(6)上記 (4)の発現ベクターと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。発明を実施するための最良の形態

[0011] I.本発明オリゴニ本鎖 RNA

本発明オリゴニ本鎖 RNAとして、配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3'末端から 2塩基の dTを除いた塩基配列力なる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除、た塩基配列力なる RNAの対で形成されている二重鎖形成部を有するオリゴニ本鎖 RNAを挙げることができる。

[0012] 配列番号 1及び配列番号 2の塩基配列の 3'末端力 2塩基の dTを除いた塩基配列からなる両 RNAは、 GenBankァクセッション番号 AB080299として登録されている塩基配列（配列番号 6)からなる HCV RNA中の internal ribosome entry sit e (IRES)の一部分と相同な塩基配列力なる RNA (センス鎖 RNA)である。配列番号 4及び配列番号 5の各塩基配列の 3 '末端力 2塩基の dTを除、た塩基配列からなる両 RNAは、それぞれ配列番号 1及び配列番号 2の各塩基配列の 3'末端から 2 塩基の dTを除、た塩基配列と相補的な塩基配列カゝらなる RNA (アンチセンス鎖 RN A)である。配列番号 3の塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除、た塩基配列からなる RNAは、配列番号 1の塩基配列の 3 '末端から 2塩基の dTを除、た塩基配列の 3，末端に位置する C塩基を A塩基に置換した塩基配列からなる RNAである。

[0013] 上記「二重鎖形成部」とは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを構成する核酸の対が二重鎖を形成している部分であって、 HCV RNAに相同な塩基配列を含む部分をいう。そして、それぞれの RNAの二重鎖形成部につづく 3 '側及び Z又は 5 '側に対を形成しない一本鎖がある場合には、これを突出部と呼ぶ。

[0014] 上記「HCVの複製抑制活性」とは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを細胞にトランスフエクシヨンした場合に、本発明オリゴニ本鎖 RNAが存在しな、場合に比べて HCVの複製を抑制する活性をいう。「HCVの複製抑制活性を有する」とは、具体的には、本発明オリゴニ本鎖 RNAを添カ卩した細胞の HCV RNA量が、陰性対照の HCV RNA 量と等しい場合を抑制率 (％)が 0%であるとして評価した場合に、その抑制率 (％) 力 0%以上、好ましくは 75%以上、さらに好ましくは 90%以上である場合をいう。

[0015] 本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持してヽれば、二重鎖形成部の RNAの塩基配列中に、 1ないし複数 (例えば、 4以下）の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。

また、本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持していれば、二重鎖形成部の一方又は両方の RNAを構成するリボヌクレオチドの一部力デォキシリボヌクレオチド又は修飾デォキシリボヌクレオチドに置換されていてもよい。ここで、修飾デォキシリボヌクレオチドとは、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、デォキシリボヌクレオチドを構成するデォキシリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されているものを意味する。かかる修飾としては、例えば、デォキシリボースの 2，位の修飾、デォキシリボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。デォキシリボースの 2'位の修飾としては、例えば、デォキシリボースの 2，位の水素を OR、 R、 R，OR、 SH、 SR、 N H、 NHR、 NR、 N、 CN、 F、 Cl、 Br、 Iに置換する修飾を挙げることができる。ここ

2 2 3

で、 Rはアルキル又はァリールを表す。 Rのアルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n— プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 n— ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert—ペンチル、 n—へキシル、およびイソへキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよぐかかる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置換されていてもよい。力かるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。アルキルとしては上記のアルキルと同様のものを挙げることができる。アルコキシとしては直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロポキシ、 n—ブトキシ、イソブトキシ、 s ec—ブトキシ、 tert—ブトキシ、 n—ペンチルォキシ、イソペンチルォキシ、 n—へキシルォキシ、イソへキシルォキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数 1〜3のアルコキシが好ましい。 Rのァリールとしては、炭素数 6〜10のァリールが好ましい。具体的には、例えば、フエニル、 α—ナフチル、 j8—ナフチルを挙げることができる。とりわけフエ-ルが好ましい。また、 R，はアルキレンを表す。 R，のアルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、 2— (ェチル）トリメチレン、 1— (メチル)テトラメチレンを挙げることができる。デォキシリボースのその他の部分の修飾としては、例えば、 4'位をチォ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチォエート体、ホスホ口ジチォエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。

[0017] また、本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持してヽれば、二重鎖形成部の少なくとも一方の RNAの 3'末端又は 5'末端に突出部として 1ないし 4塩基のヌクレオチドを有していてもよい。突出部を有する場合には、突出部を構成するヌクレオチドはリボヌクレオチドかデォキシリボヌクレオチドかを問わな、。突出部としてヌクレオチドを 2塩基有する本発明オリゴニ本鎖 RNAが好ましぐその中でも、本発明オリゴニ本鎖 RNAに係るセンス鎖 RNA及び Z又はアンチセンス鎖 RNAの 3，末端に突出部として、 2塩基の dT若しくはゥリジン一リン酸 (以下、「U」という）を有するカゝ、本発明オリゴニ本鎖 RNAに係るセンス鎖 RNAの塩基配列と一致する HCV RNA上の塩基配列の 3'側に続く 2塩基の塩基配列を当該センス鎖 RNAの 3'末端側に有するカゝ、又は本発明オリゴニ本鎖 RNAに係るアンチセンス鎖 RNAと相補的な塩基配列と一致する HCV RNA上の塩基配列の 5 '側に続く 2塩基の塩基配列と相補的な塩基配列を当該アンチセンス鎖 RNAの 3'末端側に有する本発明オリゴニ本鎖 RNAがより好ましい。

[0018] さらに、本発明オリゴニ本鎖 RNAは、 HCVの複製抑制活性を保持してヽれば、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのリボヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。力かる修飾としては、例えば、リボースの 2，位の修飾、リボースのその他の部分の修飾、リン酸バックボーンの修飾を挙げることができる。リボースの 2'位の修飾としては、例えば、リボースの 2，位の水酸基を OR、 R、 R，OR、 SH、 SR、 NH、 NH

2

R、 NR、 N、 CN、 F、 Cl、 Br、 Iに置換する修飾を挙げることができる。ここで、 Rは

2 3

アルキル又はァリールを表す。 Rのアルキルとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルキルが好ましい。具体的には、例えば、メチル、ェチル、 n—プロピル、イソプロピル、 n—ブチル、イソブチル、 sec—ブチル、 tert—ブチル、 n—ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、 tert—ペンチル、 n—へキシル、およびイソへキシルが挙げられる。当該アルキルは置換されていてもよぐ力かる置換基としては、例えば、ハロゲン、アルキル、アルコキシ、シァ入ニトロを挙げることができ、これらが 1〜3個置換されていてもよい。力かるハロゲンとしては、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素を挙げることができる。アルキルとしては上記のアルキルを挙げることができる。アルコキシとしては直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルコキシ、例えばメトキシ、エトキシ、 n—プロポキシ、イソプロポキシ、 n—ブトキシ、イソブトキシ、 sec—ブトキシ、 tert—ブトキシ、 n—ペンチルォキシ、イソペンチルォキシ、 n—へキシルォキシ、イソへキシルォキシ等を挙げることができる。とりわけ、炭素数 1〜3のアルコキシが好ましい。尺のァリールとしては、炭素数 6〜10のァリールが好ましい。具体的には、例えば、フエ二ル、 α—ナフチル、 j8—ナフチルを挙げることができる。とりわけフエ-ルが好ましい。また、 R'はアルキレンを表す。 R'のアルキレンとしては、直鎖状または分枝鎖状の炭素数 1〜6のアルキレンが好ましい。具体的には、例えば、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、へキサメチレン、 2— (ェチル）トリメチレン、 1—(メチル)テトラメチレンを挙げることができる。リボースのその他の部分の修飾としては、例えば、 4'位をチォ体とする修飾を挙げることができる。リン酸バックボーンの修飾としては、例えば、ホスホロチォエート体、ホスホロジチォエート体、アルキルホスホネート体、ホスホロアミデート体とする修飾を挙げることができる。

[0019] 本発明オリゴニ本鎖 RNAは、一方の RNA1モル当量に対して、他方を 0. 5〜2モル当量の範囲内で、好ましくは 0. 9〜1. 1モル当量の範囲内で、更に好ましくは等モル当量で混合した後に、アニーリングすることにより調製することができる。ァニーリングは、当業者に自明な方法により行うことができる。例えば、選択した 2つの RNAを混合し、 94°C程度で 5分程度加熱した後、室温まで徐冷することにより行うことができる。また、選択した 2つの RNAを混合した後、アニーリングする工程を省いても本発明オリゴニ本鎖 RNAを調製することができる。

[0020] 本発明オリゴニ本鎖 RNAは、後述する担体を用いて細胞内にトランスフエクシヨンしてもよい。また、リン酸カルシウム法、エレクト口ポレーシヨン法又はマイクロインジェクシヨン法等により、直接細胞内に導入することもできる。 [0021] II.本発明 RNA及び本発明 DNA

本発明 RNAとして、配列番号 2、配列番号 3又は配列番号 5のいずれか 1つの塩基配列の 3'末端から 2塩基の dTを除いた塩基配列からなる RNAであって、かつその相補的な塩基配列カゝらなる RNAとオリゴニ本鎖 RNAを構成したときに HCVの複製抑制活性を有する RNAを挙げることができる。

[0022] 本発明 RNAは、当該塩基配列中に、 1ないし複数 (例えば、 4以下）の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されていてもよい。

[0023] 本発明 RNAは、上述した本発明オリゴニ本鎖 RNAの場合と同様に、本発明 RNA を構成するリボヌクレオチドの一部力デォキシリボヌクレオチド又は修飾デォキシリボヌクレオチドに置換されて、てもよ！/、。

[0024] 本発明 RNAは、 3'末端又は 5'末端に更にヌクレオチドを 1ないし 4塩基有していてもよ、。当該ヌクレオチドはリボヌクレオチドかデォキシリボヌクレオチドかを問わない。当該ヌクレオチドを 2塩基有する本発明 RNAが好ましぐその中でも、当該ヌクレォチドとして、 2塩基の dT若しくは Uを有するカゝ、本発明 RNAがセンス鎖 RNAの場合は、本発明 RNAと一致する HCV RNA上の塩基配列の 3'側に続く 2塩基の塩基配列を本発明 RNAの 3'末端側に有するか、又は、本発明 RNAがアンチセンス鎖 RNAの場合は、本発明 RNAと相補的な塩基配列と一致する HCV RNA上の塩基配列の 5 '側に続く 2塩基の塩基配列と相補的な塩基配列を本発明 RNAの 3 '末端側に有する本発明 RNAがより好ま、。

[0025] 本発明 RNAは、上述した本発明オリゴニ本鎖 RNAの場合と同様に、例えば、ヌクレアーゼ耐性等、生体内における安定性を高めるために、そのリボヌクレオチドを構成しているリボース又はリン酸バックボーン等の、少なくとも一部が修飾されていてもよい。

[0026] 本発明 DNAとしては、本発明 RNAを構成するリボヌクレオチドの糖が D— 2—デォキシリボースであり、かつ塩基の内、ゥラシル (U)がチミン (T)であることを特徴とする DNAを挙げることができる。

[0027] 本発明 DNAは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを発現するためのプラスミドに組み込まれてもよぐ本発明オリゴニ本鎖 RNAをインビトロ転写反応で得るためのテンプレート DNAとして用いることができる。また、アンチセンスプローブとして用いることができる

[0028] 本発明 RNA及び本発明 DNAは、当業者に既知のホスホアミダイト法又はトリエステル法による固相合成法で、または液相合成法で得ることがきる。最も一般的な態様は、ホスホアミダイト法による固相合成法であり、核酸自動合成機又は手動にて合成することができる。固相での合成が終了した後は、固相からの脱離、保護基の脱保護及び目的物の精製等を行う。最終的に得られた本発明 RNA及び本発明 DNAの純度は、 90%以上が適当であり、 95%以上が好ましい。

[0029] III.本発明組成物

本発明組成物として、本発明オリゴニ本鎖 RNAと担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。当該担体とは、本発明オリゴニ本鎖 RNAを細胞内へ移行させるのに有効な担体をいう。本発明組成物は HCVに感染することにより引き起こされる疾患の治療及び Z又は予防のために用いることができる。 HCVに感染することにより引き起こされる疾患としては、例えば、慢性肝炎、肝硬変、肝細胞癌を挙げることができる。

[0030] 本発明組成物に係る担体としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、カチオン性リボソーム、カチオン性ポリマー等のカチオン性担体、またはウィルスエンベロープを利用した担体を挙げることができる。カチオン性リボソームとしては、例えば、 2-0- (2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3— 0—ジォレオイルグリセロールとリン脂質とを必須構成成分として形成されるリボソーム（以下、「リボソーム A」という）、オリゴフエクトァミン (登録商標）（Invitrogen社製）、リボフエタチン (登録商標）（Invitrogen社製）、リボフヱクトァミン (登録商標）（Invitrogen社製 )、リボフヱクトァミン 2000 (登録商標）（Invitrogen社製）、 DMRIE— C (登録商標） (Invitrogen社製）、 GeneSilencer (登録商標）（Gene Therapy Systems社製）、 TransMessenger (登録商標）（QIAGEN社製）、 TransIT TKO (登録商標）（M irus社製）を挙げることができる。それらの中で、リボソーム Aが好ましい。カチオン性ポリマーとしては、例えば、 JetSI (登録商標）（Qbiogene社製）、 Jet-PEI (登録商標）（ポリエチレンィミン、 Qbiogene社製）を挙げることができる。ウィルスェンベロープを利用した担体としては、例えば、 GenomeOne (登録商標）（HVJ—Eリボソーム、石原産業社製)を挙げることができる。

[0031] 本発明組成物中に含まれる本発明オリゴニ本鎖 RNAの濃度は、担体の種類等によって異なるが、 0. 1ηΜ〜100 /ζ Μの範囲内が適当であり、 1ηΜ〜10 /ζ Μの範囲内が好ましぐ 10ηΜ〜1 μ Μの範囲内がより好ましい。また、本発明組成物中に含まれる本発明オリゴニ本鎖 RNAと担体との重量比（担体 Ζ本発明オリゴニ本鎖 RN Α)は、本発明オリゴニ本鎖 RNAの性質、担体の種類等によって異なる力 0. 1〜1 00の範囲内が適当であり、 1〜50の範囲内が好ましぐ 10〜20の範囲内がより好ましい。

[0032] 本発明組成物には、本発明オリゴニ本鎖 RNAと上述した担体以外に、任意に医薬上許容される添加剤を配合することができる。カゝかる添加剤として、例えば、乳化補助剤 (例えば、炭素数 6〜22の脂肪酸やその医薬上許容される塩、アルブミン、デキストラン）、安定化剤（例えば、コレステロール、ホスファチジン酸）、等張化剤（例えば、塩ィ匕ナトリウム、グルコース、マルトース、ラタトース、スクロース、トレハロース）、 ρ Η調整剤（例えば、塩酸、硫酸、リン酸、酢酸、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、トリエタノールァミン)を挙げることができる。これらを一種又は二種以上使用することができる。本発明組成物中の当該添加剤の含有量は、 90重量％以下が適当であり、 70 重量％以下が好ましぐ 50重量％以下がより好ましい。

[0033] 本発明組成物は、担体の分散液に本発明オリゴニ本鎖 RNAを加え、適当に攪拌すること〖こより調製することができる。また、添加剤は、本発明オリゴニ本鎖 RNAの添加前でも添加後でも適当な工程で添加することができる。本発明オリゴニ本鎖 RNA を添加させる際に用い得る水性溶媒としては、医薬上許容されるものであれば特に制限されず、例えば、注射用水、注射用蒸留水、生理食塩水等の電解質液、ブドウ糖液、マルトース液等の糖液を挙げることができる。また、力かる場合の ρΗ及び温度等の条件は、当業者が適宜選択することができる。

[0034] 本発明組成物は、例えば、液剤やその凍結乾燥製剤とすることができる。当該凍結乾燥製剤は、常法により、液剤の形態を有している本発明組成物を凍結乾燥処理すること〖こより調製することができる。例えば、液剤の形態を有している本発明組成物を適当な滅菌を行った後、所定量をバイアル瓶に分注し、約— 40〜― 20°Cの条件で予備凍結を 2時間程度行い、約 0〜10°Cで減圧下に一次乾燥を行い、次いで、約 1 5〜25°Cで減圧下に二次乾燥して凍結乾燥することができる。そして、一般的にはノィアル内部を窒素ガスで置換し、打栓して本発明組成物の凍結乾燥製剤を得ることがでさる。

[0035] 本発明組成物の凍結乾燥製剤は、一般には任意の適当な溶液 (再溶解液)の添加によって再溶解し使用することができる。このような再溶解液としては、注射用水、生理食塩水、その他一般輸液を挙げることができる。この再溶解液の液量は、用途等によって異なり特に制限されないが、凍結乾燥前の液量の 0. 5〜2倍量、又は 50 OmL以下が適当である。

[0036] 本発明組成物は、投与単位形態で投与することが望ましぐヒトを含む動物に対し、静脈内投与、動脈内投与、経口投与、組織内投与、経皮投与、経粘膜投与又は経直腸投与することができる。特に静脈内投与、経皮投与、経粘膜投与が望ましい。これらの投与に適した剤型、例えば、各種の注射剤、経口剤、点滴剤、吸入剤、点眼剤、軟膏剤、ローション剤、座剤で投与されるのはもちろんである。

[0037] 本発明組成物を投与する際の用量としては、含有される本発明オリゴニ本鎖 RNA の種類、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度を考慮した上で調製することが望ましいが、成人に対して本発明オリゴニ本鎖 RNA量として、 1日当たり 0. lmg〜10gZヒトの範囲内力好ましくは lmg〜500mgの範囲内が一般的である。この数値は標的とする疾患の種類、投与形態、標的分子によっても異なる場合がある。従って、場合によってはこれ以下でも十分であるし、また逆にこれ以上の用量を必要とするときもある。また 1日 1回力も数回の投与又は 1日力も数日間の間隔で投与することができる。

[0038] 本発明組成物の別の態様として、本発明 DNAが挿入された、 RNAの発現べクタ一と上述した担体とを含む医薬組成物を挙げることができる。かかる発現ベクターは、複数の本発明 DNAが挿入されていてもよいし、また、公知の DNAを含んでいてもよい。具体的には、例えば、本発明オリゴニ本鎖 RNAを構成するセンス鎖 RNAとァンチセンス鎖 RNAの両方を発現することができる DNAが挿入された発現ベクターを挙げることができる。当該組成物には、本発明オリゴニ本鎖 RNAを含有する本発明組成物と同様に、医薬上許容される添加剤を添加することができる。当該組成物中に含まれる発現ベクターの濃度は、担体の種類等によって異なる力 0. InM〜： LOO μ Μの範囲内が適当であり、 1ηΜ〜10 μ Μの範囲内が好ましぐ 10ηΜ〜1 μ Μの範囲内がより好ましい。当該組成物中に含まれる発現ベクターと担体との重量比（担体 Ζ発現ベクター）は、発現ベクターの性質、担体の種類等によって異なるが、 0. 1 〜100の範囲内が適当であり、 1〜50の範囲内が好ましぐ 10〜20の範囲内がより好ましい。また、当該組成物中に含まれる担体の含有量は、本発明オリゴニ本鎖 RN Αを含有する本発明組成物の場合と同様であり、その調製方法等に関しても、本発明組成物の場合と同様である。更に、投与形態及び投与経路は、本発明組成物の場合と同様に、患者の症状に合わせた適切な方法により投与してよぐ用量もまた同様に、薬物、剤型、年齢や体重等の患者の状態、投与経路、疾患の性質と程度等を考慮した上で決定することが望ま、。

実施例

[0039] 以下に、実施例及び試験例を掲げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は実施例に示される範囲に限定されるものではない。

[0040] 実施例医蓉組成物の調製

(1)オリゴニ本鎖 RNAを構成する RNAの合成

オリゴニ本鎖 RNAを構成する RNAの合成は、日本バイオサービス (埼玉県）に依頼した。

(2) 130番に係るオリゴニ本鎖 RNAの調製

130番に係るオリゴニ本鎖 RNAの水溶液は、上記（1)で合成した配列番号 1及び配列番号 4の塩基配列を有する本発明 RNAをそれぞれの濃度が 120 μ Μになるように注射用水に溶解し、その後、それぞれ 16. 6 1を試験管中で混合した。これ〖こ 9 66. 8 1の注射用水を添加することにより、調製した。

(3) 130A番に係るオリゴニ本鎖 RNAの調製

130A番に係るオリゴニ本鎖 RNAの水溶液は、上記（1)で合成した配列番号 3及び配列番号 4の塩基配列を有する本発明 RNAを用い、上記 (2)と同様に調製した。

(4) 258番に係るオリゴニ本鎖 RNAの調製 258番に係るオリゴニ本鎖 RNAの水溶液は、上記（1)で合成した配列番号 2及び配列番号 5の塩基配列を有する本発明 RNAを用い、上記 (2)と同様に調製した。 (5)医薬組成物の調製

担体として、 2— 0—（2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3— 0—ジォレオイルグリセロール 6重量部と精製卵黄レシチン 10重量部とを必須構成成分として形成される 16mgZmlのリボソーム A分散液を文献記載の方法 (W094Z19314号公報参照）に従い調製した。このリボソーム A分散液 26. 6 1に注射用水 973. 4 1を添加してリボソーム A分散液 lmlを調製した。このリボソーム分散液 lmlに上記（2)〜 (4)で調製したオリゴニ本鎖 RNA水溶液 lmlを、撹拌しながら徐々に添加し、その後、 600Wのバス型超音波装置を用いて 2分間分散処理することにより、混合した本発明 RNAが完全に二本鎖を形成した場合のオリゴニ本鎖 RNAの終濃度が 1 μ Μ である医薬組成物を調製した。

試験例オリゴニ本鎖 RNAのスクリーニング

(1)使用細胞株

下記（2)のスクリーニングでは、ヒト肝癌由来の細胞株である HuH— 7 # 50— 1細胞を用いた。 HuH— 7 # 50—1細胞の詳細については、文献（Biochemical and Biophysical Research Communications, 2000年、 293卷、 p. 993— 999)を参照されたい。スクリーニング時の当該細胞の培地としては、 DMEM培地（二ッスィ社製）に 10%の FBS (三光純薬社製)を含有する培地を用いた。なお、スクリーニング時以外は、上記培地に、更に 400 μ gZmlの G418 (Gibco BRL社製）を含有する培地を用いた。

(2)スクリーニング方法及びその評価方法

6cm径のシャーレに細胞を 3 X 10⁵cellsZdishで播種し、 37°C、 5%CO条件下

2 でー晚培養した。翌日、培養ディッシュ力も培地を吸引し、 2. 7mlの培地を加えて培地交換を行った。そこに、本発明オリゴニ本鎖 RNAの最終濃度として 100nMとなるように、実施例にて調製した医薬組成物を 0. 3ml添加し、終量を 3mlとした。当該医薬組成物を添加後、 COインキュベーター内にて 96時間培養した。細胞を PBSで 2

2

回洗浄した後、セルスクレーパーにて細胞を回収し、常法に従いトータル RN Aを単離した。

得られたトータル RNA2.5;zgを铸型に、 Thermoscript RT—PCR System (I nvitrogen社製)を用いて逆転写反応を行い、 cDNAを作成した。この逆転写反応液中に含まれる cDNAを PCR反応の铸型に用い、リアルタイム PCR法による検出定量システム（ABI Prism7000)を用いて HCV RNA及び構成的発現遺伝子である GAPDH(D— glyceraldehyde— 3— phosphate dehydrogenase) mRNA特異的な PCR増幅を行い、それぞれの RNA量の準定量を行った。 HCV RNAの PC R増幅には、 lOOngのトータル RNA由来の cDNAを、 GAPDHの PCR増幅には 0. 5ngのトータル RNA由来の cDNAをそれぞれ铸型に用、た。陰性対照としては蒸留水を添カ卩した細胞より単離したトータル RNA由来の cDNAを用いた。 HCV RNA 量は、 GAPDH mRNAの量を 1としたときの相対的な割合として算出した。得られた結果は、医薬組成物を添カ卩した細胞の HCV RNA量が、陰性対照の HCV RN A量と等ヽ場合を抑制率 0%として評価した。

(3)試験結果

上記スクリーニングの結果を表 1に示す。その結果、 130A番 (配列番号 3及び配列番号 4)及び 258番（配列番号 2及び配列番号 5)の 2つのオリゴニ本鎖 RNAに顕著な HCV複製抑制活性が認められた。また、 130A番 (配列番号 3及び配列番号 4)のオリゴニ本鎖 RNAは、 130番 (配列番号 1及び配列番号 4)のオリゴニ本鎖 RNAと比ベて、非常に高い HCV複製抑制活性を有していた。

[表 1] オリゴ .本鎖抑制率

配列（ 5 ' → 3 ' )

R N Λ {%)

CGGGAGAGCCAUAGUGGUC- d T d T (配列番号 1 ) i 30 6 3

GACCACUAUGG CUCUCCCG- d T d ^r (配列番^ 4 )

CGGG AG AGCCAUAGUG GUA- d T d T (配列番号 3 )

1 3 O A 9 3

GAC CACUAUGGCUCUCC C G- d T d T (配列番 )

G U A G U G U U G G G U C G C G A A A - d T d T (配列番^ 2 )

2 53 1

U UUCGCGACC CAACACUAC- d T d T (配列番号 5 )

Claims

請求の範囲

[1] 配列番号 3及び配列番号 4の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基のデォキシチミジン一リン酸 (dT)を除、た塩基配列からなる RNAの対又は配列番号 2及び配列番号 5 の各塩基配列の 3 '末端から 2塩基のデォキシチミジン一リン酸 (dT)を除いた塩基配列からなる RNAの対で形成されている二重鎖形成部を有することを特徴とするオリゴ二本鎖 RNA。

[2] 二重鎖形成部の塩基配列中に、 1ないし複数の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有する、請求項 1に記載のオリゴニ本鎖 RNA。

[3] 二重鎖形成部を構成するリボヌクレオチドの一部力デォキシリボヌクレオチドないし修飾デォキシリボヌクレオチドに置換されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有する、請求項 1に記載のオリゴニ本鎖 RNA。

[4] 二重鎖形成部の少なくとも一方の RNAの 3'末端又は 5'末端に突出部としてヌクレォチドが 1ないし 4塩基付加されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有する、請求項 1に記載のオリゴニ本鎖 RNA。

[5] 突出部としてのヌクレオチドがデォキシリボヌクレオチドである、請求項 4に記載のォリゴニ本鎖 RNA。

[6] 突出部としてのヌクレオチドがデォキシチミジン一リン酸 (dT)であって、これが二重鎖形成部を構成する少なくとも一方の RNAの 3'末端に 2塩基付加されている、請求項 4に記載のオリゴニ本鎖 RNA。

[7] 二重鎖形成部を構成する一部のヌクレオチドのリボース又はリン酸バックボーンが修飾されており、かつ C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有する、請求項 1に記載のオリゴニ本鎖 RNA。

[8] リボース又はリン酸バックボーンの修飾力リボースの 2，位の水酸基を OR、 R、 R， OR、 SH、 SR、 NH、 NHR、 NR、 N、 CN、 F、 Cl、 Br及び Iから選択される置換基

2 2 3

に置換する修飾 (Rはアルキル又はァリールを表し、 R'はアルキレンを表す）、リボースの 4，位をチォ体とする修飾、及び、リン酸バックボーンをホスホロチォエート体、ホスホロジチォエート体、アルキルホスホネート体又はホスホロアミデート体とする修飾力も選択される 1又は複数の修飾である、請求項 7に記載のオリゴニ本鎖 RNA。

[9] 配列番号 2、配列番号 3又は配列番号 5の塩基配列の 3 '末端から 2塩基のデォキシチミジン一リン酸（dT)を除、た塩基配列力もなる RNAであって、かつその相補的な塩基配列カゝらなる RNAとオリゴニ本鎖 RNAを構成したときに C型肝炎ウィルスの複製抑制活性を有することを特徴とする RNA。

[10] 塩基配列中に、 1ないし複数の核酸塩基が欠失、置換、挿入又は付加されている、請求項 9に記載の RNA。

[11] RNAを構成するリボヌクレオチドの一部がデォキシリボヌクレオチドないし修飾ヌクレオチドに置換されて、る、請求項 9に記載の RNA。

[12] RNAの 3 '末端又は 5'末端にヌクレオチドが 1ないし 4塩基付加されている、請求項 9に記載の RNA。

[13] 付加されているヌクレオチド力デォキシリボヌクレオチドである、請求項 12に記載の RNA。

[14] 3 '末端に 2塩基のヌクレオチドが付加されており、かかるヌクレオチドがデォキシチミジン一リン酸 (dT)である、請求項 12に記載の RNA。

[15] ヌクレオチドを構成するリボース又はリン酸バックボーンの少なくとも一部が修飾されている、請求項 9に記載の RNA。

[16] 請求項 9〜 15のいずれかに記載の RNAを構成するリボヌクレオチドの糖が D— 2

—デォキシリボースであり、かつ塩基の内、ゥラシル (U)がチミン (T)であることを特徴とする DNA。

[17] 請求項 16に記載の DNAが挿入された、 RNAの発現ベクター。

[18] 請求項 1〜8のいずれかに記載のオリゴニ本鎖 RNAと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。

[19] 請求項 17に記載の発現ベクターと担体とを含むことを特徴とする医薬組成物。

[20] 担体がカチオン性担体である、請求項 18又は 19に記載の医薬組成物。

[21] カチオン性担体が、 2— 0—（2—ジェチルアミノエチル）力ルバモイルー 1, 3-0 ジォレオイルグリセロール及びリン脂質を必須構成成分として形成されるリボソームである、請求項 20に記載の医薬組成物。

[22] リン脂質がレシチンである請求項 21に記載の医薬組成物。

[23] C型肝炎ウィルスの複製抑制が所望される疾患の治療及び Z又は予防のための請求項 18又は 19のいずれかに記載の医薬組成物。

[24] C型肝炎ウィルスの複製抑制が所望される疾患が、慢性肝炎、肝硬変又は肝細胞癌である、請求項 21に記載の医薬組成物。