WO2006038479A1

WO2006038479A1 - アリールアシルアミダーゼ遺伝子、およびその利用方法

Info

Publication number: WO2006038479A1
Application number: PCT/JP2005/017575
Authority: WO
Inventors: Noriyuki Kizaki; Noriyuki Ito; Yoshihiko Yasohara; Toru Nagasawa
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2004-10-04
Filing date: 2005-09-26
Publication date: 2006-04-13
Also published as: US20110236955A1; EP1811022A4; EP1811022A1; JPWO2006038479A1

Abstract

　本発明は、アリールアシルアミダーゼの効率的な製造方法を提供する。本発明の一つの特徴は、（ａ）配列表の配列番号１に示す塩基配列を含むＤＮＡ、または、（ｂ）配列表の配列番号１に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡである。本発明の別の特徴は、前記ＤＮＡにコードされアリールアシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド、前記ＤＮＡを含有するベクター、前記ＤＮＡ又はベクターで形質転換された形質転換体、並びに、当該形質転換体を培養し、培養液からアリールアシルアミダーゼを取得するアリールアシルアミダーゼの製造方法である。

Description

明細書

ァリールァシルアミダーゼ遺伝子、およびその利用方法

技術分野

[0001] 本発明は、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNA、および、当該 DNAを利用したァリールァシルアミダーゼの製造方法に関する。

関連出願の相互参照

[0002] 曰本国特許 2004— 291916号（2004年 10月 4曰出願）の明細書、請求の範囲、図面および要約を含む全開示内容は、これら全開示内容を参照することによって本出願に合体される。

背景技術

[0003] ァリールァシルアミダーゼは、インターナショナル ·ユニオン ·ォブ ·バイオケミストリ一（International union of biochemistry)により規定されており（酵素命名法（Enzyme Nomenclature) , 1978,アカデミー出版，ニューヨーク）、ァ -リドをァ-リンおよび脂肪酸陰イオンに加水分解する触媒活性を有することが示されて、る。ァリールァシルアミダーゼは、ァセトァミノフェン等のァ-リド類の定量に利用可能な、産業上有用な酵素である (特許文献 1)。

[0004] ァリールァシルアミダーゼは、哺乳類、高等植物、および、微生物中に存在することが知られている。しかし、哺乳類および高等植物由来の酵素は、 1)酵素源となる動植物の入手が困難である、 2)動植物からの単離操作が煩雑である、 3)遺伝子組換え技術を用いた微生物宿主による生産が困難である等の理由により、一般に工業的生産には不向きである。一方、微生物由来の酵素ではこのような問題が少なぐ工業的生産に有利な場合が多、。

[0005] 微生物より単離されたァリールァシルアミダーゼとしては、キャンディダ 'ウテイリス（ Candida utilis)由来のもの（非特許文献 1)、バシラス ·スファエリカス（Bacillus sphaeri cus)由来のもの（非特許文献 2)、シユードモナス'ァシドボランス（Pseudomonas acido vorans)由来のもの（非特許文献 3)、シユードモナス'フルォレツセンス（Pseudomonas fluorescens)由来のもの（非特許文献 4)、ロドコッカス'エリス口ポリス（Rhodococcus e rythropolis)由来のもの（特許文献 2)、コリネフオーム 'バタテリゥム（Coryneform bact erium)由来のもの（非特許文献 5)、シユードモナス'スピーシズ（Pseudomonas sp.)由来のもの（非特許文献 6)、および、ノカルディア 'グロべルーラ（Nocardia globerula) 由来のもの (特許文献 3、非特許文献 7)が報告されている。

非特許文献 1 :J. Gen. Microbiol, 59, 47-55 (1969)

非特許文献 2 :Appl. Microbiol, 26, 709-718 (1973)

非特許文献 3 : Eur. J. Biochem., 53, 357-369 (1975)

非特許文献 4 : Eur. J. Biochem., 132, 651-655 (1983)

非特許文献 5 Journal of Pesticide Science, 18, 211-216 (1993)

非特許文献 6 : Sanop Misaengmul Hakhoechi, 26, 413-419 (1998)

非特許文献 7 : Eur. J. Biochem., 199, 17-24 (1991)

特許文献 1：米国特許第 4999288

特許文献 2：特開昭 63 - 74484号公報

特許文献 3：特開平 3 - 277281号公報

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0006] 上記文献に開示されているァリールァシルアミダーゼはいずれも、由来する微生物の培養液力単離することが可能である。しかし、それらのァリールァシルアミダーゼの製造方法は、培養液量あたりの生産性が低ぐ実用的とは言い難い。また、これらのァリールァシルアミダーゼをコードする DNAに関する情報は開示されておらず、従つて、遺伝子組換え技術を利用して、これらのァリールァシルアミダーゼの生産性を向上させることもできない。このような状況の中、より効率の良いァリールァシルアミダーゼの製造方法が必要とされて、た。

[0007] 本発明の課題は、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAを単離し、それを利用して、効率の良!、ァリールァシルアミダーゼの製造方法を提供することである。課題を解決するための手段

[0008] 本発明者らは、ァリールァシルアミダーゼ活性を有する微生物から、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAを単離し、その塩基配列を明らかにした。さらに、該 DN Aを用いてァリールァシルアミダーゼを産生する形質転換体を育種し、該形質転換体を用いた、効率の良いァリールァシルアミダーゼの製造方法を確立した。

[0009] 即ち、本発明の一つの特徴は、ァリールァシルアミダーゼ活性を有する微生物から単離された、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAである。また、本発明の別の特徴は、当該 DNAによってコードされ、かつ、ァリールァシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドである。また、本発明の別の特徴は、当該 DNAを含むベクターである。また、本発明の別の特徴は、当該ベクターを含む形質転換体である。さらに、本発明の別の特徴は、当該形質転換体を用いた、ァリールァシルアミダーゼの製造方法である。

発明の効果

[0010] 本発明により、ァリールァシルアミダーゼの実用的な製造方法が提供される。

発明を実施するための最良の形態

[0011] 以下、本発明を詳細に説明する。なお、本明細書において記述されている、 DNA の単離、ベクターの調製、形質転換等の遺伝子操作は、特に明記しない限り、 Molec ularし loning 2nd Edition (し old Spring Harbor Laboratory Press, 1989)等の成【こ記載されている方法により行うことができる。また、本明細書の記述に用いられる％は、特に断りのない限り、％(wZv)を意味する。

[0012] 1. DNA

本発明の DNAは、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内でァリールァシルアミダーゼを発現し得るものであれば、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。このような DNAは、ァリールァシルァミダーゼ活性を有する微生物から単離できる。本発明の DNAの起源となる微生物は特に限定されないが、例えばノカルディア 'グロべルーラ（Nocardia globerula) NBRC 13510株から、当該 DNAを単離できる。当該微生物は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部生物遺伝資源部門（NBRC :〒 292-0818 千葉県木更津巿かずさ鎌足 2-5-8)より入手できる。

[0013] 2. DNAの単離

本発明の DNAは、例えば、以下に示した方法で、当該 DNAの起源となる微生物力単離できる。

[0014] 第一に、本発明の DNAの起源となる微生物を、適当な培地を用いて培養する。当該微生物を培養するための培地としては、その微生物が増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いることができる。

[0015] 第二に、通常公知の蛋白質精製法を適当に組み合わせて用いることにより、当該微生物からァリールァシルアミダーゼを単離する。例えば、当該微生物の培養液から遠心分離、あるいは、濾過により菌体を集め、得られた菌体を、超音波破砕機あるいはグラスビーズ等を用いた物理的手法で破砕した後、遠心分離にて菌体残さを除ヽて無細胞抽出液を調製し、これを、分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲノレ濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、限外濾過等に供することにより、ァリールァシルアミダーゼを単離できる。

[0016] ァリールァシルアミダーゼの活性は、例えば、 10mMの 2—メチルァセトァ -リド（反応基質）を含有する lOOmMのグリシン緩衝液 (pH9. 5) 990 1に被験液 10 μ 1をカロえ、これを 35°Cで 20分間反応させた後、 1Mの塩酸 0. 2mlを添加して反応を停止し、反応液中に生成した 2—メチルァ-リンを HPLC (カラム： M&Sパック 018 ( φ 4. 6 X 150mm;ェムエス機器株式会社製）、移動相：ァセトニトリル Zl%リン酸二水素力リウム水溶液 = 3Z7、検出： 240nm、流速： lmlZ分)で定量することにより、測定できる。

[0017] 第三に、単離されたァリールァシルアミダーゼのアミノ酸配列の一部を決定する。例えば、単離されたァリールァシルアミダーゼを適当なエンドべプチダーゼを用いて消化した後、生じたペプチド断片を逆相 HPLCにより分取し、これを ABI492型プロテインシークェンサ一（Applied Biosystems社製）等を用いて解析することにより、ァリールァシルアミダーゼのアミノ酸配列の一部を決定できる。

[0018] 第四に、 PCR (Polymerase Chain Reaction)によりァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの一部を増幅し、その塩基配列を決定する。この工程は、例えば、以下のように実施できる。まず、上記で得られたアミノ酸配列情報をもとにして、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの一部を増幅するための PCRプライマーを合成する。次に、通常の DNA単離法、例えば、 Visser等の方法（Appl. Microbiol. Biotechn ol.， 53, 415 (2000))により、当該 DNAの起源となる微生物の染色体 DNAを調製する。そして、この染色体 DNAを铸型として、先述の PCRプライマーを用いて PCRを行い、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの一部を増幅する。さらに、 ABI3 73A型 DNA Sequencer (Applied Biosystems社製）等を用いて、増幅された当該 DNAの塩基配列を決定する。

[0019] 第五に、上記で明ら力となったァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの一部の塩基配列を基に、例えば、 i PCR法（Nucl. Acids Res., 16,8186 (1988))により、その全体の配列を決定する。

[0020] このようにして得られる本発明の DNAの例としては、配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNAを挙げることができる。また、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列力もなる DNAと、ストリンジェントな条件下でノヽイブリダィズする DNAであって、かつ、ァリールァシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNAも、本発明の DNAに包含される。

[0021] 配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAとは、コ口-一'ハイブリダィゼーシヨン法、プラーク 'ハイブリダィゼーシヨン法、あるいはサザンノヽイブリダィゼーシヨン法等を実施した際、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列を有する DN A力特異的にハイブリッドを形成する DNAを言う。

[0022] ここで、ストリンジェントな条件とは、例えば、 75mMクェン酸三ナトリウム、 750mM 塩化ナトリウム、 0. 5%ドデシル硫酸ナトリウム、 0. 1%ゥシ血清アルブミン、 0. 1%ポリビュルピロリドン、および、 0. l%Ficoll 400 (アマシャムバイオサイエンス株式会社製)の組成からなる水溶液中、 65°Cでハイブリダィゼーシヨンを実施した後に、 15 mMクェン酸三ナトリウム、 150mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリゥムの組成力もなる水溶液を用いて、 60°Cで洗浄が行われる条件を言う。好ましくは、上記条件でノヽイブリダィゼーシヨンを実施した後に、 15mMクェン酸三ナトリウム、 1 50mM塩ィ匕ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が行われる条件であり、より好ましくは、上記条件でハイブリダィゼーシヨンを実施した後に、 1. 5mMクェン酸三ナトリウム、 15mM塩化ナトリウム、および 0. 1%ドデシル硫酸ナトリウムの組成力もなる水溶液を用いて、 65°Cで洗浄が行われる条件である。

[0023] 3.ポリペプチド

本発明のポリペプチドは、上述の本発明の DNAによってコードされ、かつ、ァリールァシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドである。本発明のポリペプチドの例としては、配列表の配列番号 1に示す塩基配列によってコードされる、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列力もなるポリペプチドを挙げることができる。しかし、本発明のポリペプチドはこれに限定されず、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAと、ストリンジェントな条件下でハイブリダィズする DNAによつてコードされ、かつ、ァリールァシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドは、本発明に包含される。

[0024] このようなポリペプチドは、例えば、先述の、配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列力なる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズする DN Aを、適当なベクターに連結した後、適当な宿主細胞に導入して発現させることにより得りれ。また、例ば、し urrent Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Son s, Inc., 1989)等に記載の公知の方法に従い、配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドに、アミノ酸の置換、挿入、欠失または付加を生じさせることによっても取得できる。ァリールァシルアミダーゼ活性が失われない限り、ポリペプチドにおいて、置換、挿入、欠失または付加するアミノ酸の個数は限定されないが、例えば、 20アミノ酸以下、好ましくは、 5個以下、さらに好ましくは 2または 1個である。

[0025] 4.ベクター

本発明のベクターは、本発明の DNAを含むベクターである。本発明の DNAを宿主微生物内に導入し、導入された宿主微生物内で発現させるために用ヽられるべクターは、適当な宿主微生物内で当該 DNAがコードする遺伝子を発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。このようなベクターは、通常、 lacU V5プロモーター、 trpプロモーター、 trcプロモーター、 tacプロモーター、 lppプロモ一ター、 tufBプロモーター、 recAプロモーター、 pLプロモーター等の制御因子を含み、本発明の DNAと作動可能に連結された発現単位を含む発現ベクターとして好適に使用できる。例えば、 pUCNT (国際公開第 WO94Z03613号公報）が好適に使用できる。

[0026] 本明細書で用いる用語「制御因子」は、機能的プロモーター及び、任意の関連する転写要素（例えばェンハンサー、 CCAATボックス、 TATAボックス、 SPI部位など）を有する塩基配列をいう。

[0027] 本明細書で用いる用語「作動可能に連結」は、遺伝子の発現を調節するプロモーター、ェンノヽンサ一等の種々の調節エレメントと遺伝子力宿主細胞中で作動し得る状態で連結されることをいう。制御因子のタイプ及び種類力宿主に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。

[0028] 本発明のベクターの例としては、後述する pNTNGを挙げることができる。 pNTNG は、上述の発現ベクター pUCNTに配列番号 1に示す DNAを挿入することにより得られる。

[0029] 5.形皙転橼体

本発明の形質転換体は、本発明のベクターを宿主細胞に導入して得られる。本発明のベクターを導入する宿主細胞としては、細菌、酵母、糸状菌、植物細胞、動物細胞などが挙げられる力大腸菌が特に好ましい。本発明のベクターは、公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販の E . coli HB101コンビテントセル (タカラバイオ社製）を用いることにより、当該べクタ一を宿主細胞に導入できる。

[0030] 本発明の形質転換体としては、後述する、 E. coli HB101 (pNTNG) FERM B P— 10416が挙げられる。この形質転換体は、前記の受託番号にて、 2005年 9月 1 5日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター ( τ 305-8566 茨城県つくば巿東 1 - 1 - 1 中央第 6)に寄託されて、る（原寄託日 2003年 10月 23日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管)。

[0031] 本発明の形質転換体を培養することにより、ァリールァシルアミダーゼを効率良く製造することができる。本発明の形質転換体の培養は、それが増殖する限り、通常の、炭素源、窒素源、無機塩類、有機栄養素などを含む液体栄養培地を用いて実施できる。また、必要に応じて、培地中に種々の誘導剤を添加することにより、培養液量あたりのァリールァシルアミダーゼの生成量を向上させる事もできる。本発明の形質転換体の培養液中に蓄積したァリールァシルアミダーゼは、当該培養液のままァリールァシルアミダーゼ含有物として使用することも可能である力通常公知の蛋白質精製手法を用いて、精製もしくは部分精製した後に使用することもできる。

実施例

[0032] 以下、実施例で本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。

[0033] (実施例 1) ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの塩某配列の決定

(PCRプライマーの作製）

Eur. J. Biochem., 199, 17-24 (1991)において開示されている、ノカルディア 'グロべルーラ（Nocardia globerula) NBRC13510株由来のァリールァシルアミダーゼ（HN G)の部分アミノ酸配列情報を基に、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの一部を PCRにより増幅するためのプライマー 1 : 5， - atggaygtngcngartaygc - 3 ' (配列表の配列番号 3)、および、プライマー 2 : 5， - acytcrcangcrctnacytg- 3 ' (配列表の配列番号 4)を合成した。

[0034] (ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの増幅）

Eur. J. Biochem., 199, 17-24 (1991)において開示されている方法に従って培養した、ノカルディア 'グロべルーラ NBRC13510株の菌体から、 Visser等の方法 (Appl. Microbiol. BiotechnoL, 53, 415 (2000))に従って染色体 DNAを抽出した。次に、上記で調製した DNAプライマー 1および 2を用い、得られた染色体 DNAを铸型として PCRを行ったところ、目的遺伝子の一部と考えられる約 80bpの DNA断片が増幅された。 PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa Ex Taq (タカラバイオ社製）を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。この DNA断片を、プラスミド p T7Blue T— Vector (Novagen社製）にクローユングし、 ABI PRISM Dye Ter mmator し ycle ¾eauencmg Readv Reaction Kit (Perkm Elmer社:^)および ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer社製）を用いてその塩基配列を決定した。その塩基配列を、配列表の配列番号 5に示した。

[0035] (i PCR法による HNG遺伝子の全長配列の決定）

ノカルディア ·グロべルーラ NBRC13510株の染色体 DNAを制限酵素 ApaLI、 Ec oRI、または Sphlを用いて完全消化し、得られた消化物を T4DNAリガーゼ (タカラノ^オ社製)を用いて各々分子内環化させた。これを铸型として用い、上記で判明したァリールァシルアミダーゼをコードする DN Aの部分塩基配列情報をもとに、 i PC R法（Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1988))〖こより、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAの全塩基配列を決定した。 i— PCRは、 DNAポリメラ一ゼとして TaKaRa E X Taq (タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従った。塩基配列の決定は上記と同様に行った。判明した塩基配列を配列表の配列番号 1 に示した。また、該塩基配列がコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号 2に示した。

[0036] 施例 2) 現ベクターの構篛

プライマー 3 : 5， - gtgcatatggatgtcgccgaatacgc - 3 ' (配列表の配列番号 6)と、プラィマー 4： 5 ― gacggatccttactaccggcccacgtgcacgg― 3 (酉己列表の酉己列番号 7)を用い、実施例 1で得たノカルディア ·グロべルーラ NBRC13510株の染色体 DNAを铸型として PCRを行った。その結果、配列表の配列番号 1に示す塩基配列からなる DNA の開始コドン部分に Ndel認識部位が付加され、かつ終始コドンの直後に BamHI認識部位が付加された二本鎖 DNAを得た。 PCRは、 DNAポリメラ—ゼとして TaKaRa

LA Taq (タカラバイオ社製)を用いて行い、反応条件はその取り扱い説明書に従つた。この DNAを Ndel及び BamHIで消化し、プラスミド pUCNT (国際公開第 WO 94Z03613号公報）の lacプロモーターの下流の Ndel認識部位と BamHI認識部位の間に挿入し、糸且換えベクター pNTNGを構築した。

[0037] (実施例 3) 形皙転椽体の作製

実施例 2で構築した組換えベクター pNTNG用いて、 E. coli HB101コンビテントセル (タカラバイオ社製)を形質転換し、 E. coli HBlOl (pNTNG)を得た。この形質転換体は、受託番号 FERM BP— 10416として、 2005年 9月 15日付けで独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託されている (原寄託日

2003年 10月 23日の国内寄託株を、ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管)。

[0038] (実施例 4) 形質転換体によるァリールァシルアミダーゼの生産

実施例 3で得た形質転換体 E. coli HBlOl (pNTNG)を 200 g/mlのアンピシリンを含む 2 XYT培地（トリプトン 1. 6%、イーストエキス 1. 0%, NaClO. 5%、 pH7 . 0)に接種し、 37°Cで 24時間培養した。この培養液 lml力も遠心分離により菌体を集め、 lOOmMリン酸緩衝液 (pH6. 5) lmlに懸濁した。これを、 UH— 50型超音波ホモゲナイザー（SMT社製)を用いて破砕した後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を調製した。この無細胞抽出液のァリールァシルアミダーゼ活性とタンパク質濃度を測定した結果、蛋白質 lmgあたり 0. 43Uの当該活性を示した。一方、ァリールァシルアミダーゼをコードする DNAを含まな!/、ベクタープラスミドを導入した形質転換体である E. coli HBlOl (pUCNT)の無細胞抽出液について、同様に測定したところ、蛋白質 lmgあたりの当該活性は 0. 01U未満であった。

[0039] ァリールァシルアミダーゼの活性は、 10mMの 2—メチルァセトァ -リド (反応基質）を含有する lOOmMのグリシン緩衝液 (pH9. 5) 990 1に被験液 10 1を加え、これを 35°Cで 20分間反応させた後、 1Mの塩酸 0. 2mlを添加して反応を停止し、反応液中に生成した 2—メチルァ-リンを HPLC (カラム： M&Sパック C18 ( φ 4. 6 X 150 mm；ェムエス機器株式会社製）、移動相：ァセトニトリル Z1 %リン酸二水素カリウム水溶液 = 3Z7、検出： 240nm、流速： lmlZ分)で定量することにより、測定した。この活性測定条件において、 1分間に 1 μ molの 2—メチルァ-リンを生成する活性を、 1Uと定義した。また、タンパク質濃度は、プロテインアツセィキット（BIO— RAD社製)を用いて測定した。

Claims

請求の範囲

[1] 以下の（a)又は（b)の DNA:

(a)配列表の配列番号 1に示す塩基配列を含む DNA、

(b)配列表の配列番号 1に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなる DNAとストリンジヱントな条件下でハイブリダィズし、かつ、ァリールァシルアミダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする DNA。

[2] 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする DNA。

[3] 請求項 1に記載の DNAにコードされ、かつ、ァリールァシルアミダーゼ活性を有するポリペプチド。

[4] 配列表の配列番号 2に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド。

[5] 請求項 1又は 2に記載の DNAを含むベクター。

[6] プラスミド pNTNGである請求項 5に記載のベクター。

[7] 請求項 1又は 2に記載の DNA、又は、請求項 5又は 6に記載のベクターにより、宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。

[8] 前記宿主細胞が大腸菌である、請求項 7記載の形質転換体。

[9] E. coli HB101 (pNTNG) FERM BP— 10416である、請求項 8記載の形質転換体。

[10] 請求項 7〜9のいずれかに記載の形質転換体を栄養培地中で培養し、得られた培養液からァリールァシルアミダーゼを取得することを特徴とする、ァリールァシルアミダーゼの製造方法。