WO2006038460A1

WO2006038460A1 - エレメント、液体クロマトグラフおよび液体クロマトグラフィー

Info

Publication number: WO2006038460A1
Application number: PCT/JP2005/017343
Authority: WO
Inventors: Hiroshi Nakayama; Naoshi Dohmae
Original assignee: Riken
Priority date: 2004-10-01
Filing date: 2005-09-21
Publication date: 2006-04-13
Also published as: JP4824572B2; JPWO2006038460A1

Abstract

試料の分離低下を防止することができる液体クロマトグラフ用のエレメント等を提供する。プレカラムと、該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムとを有する、液体クロマトグラフ用エレメント。

Description

明細書

エレメント、液体クロマトグラフおよび液体クロマトグラフィー

技術分野

[0001] 本発明は、新規なエレメント等に関する。特に、液体クロマトグラフィーに用いるための、分離能に優れたエレメント、および該エレメントを有する液体クロマトグラフおよび本発明の液体クロマトグラフを用いる、液体クロマトグラフィーに関する。

技術背景

[0002] 従来から、溶液試料の分離に、液体クロマトグラフが広く採用されている。液体クロマトグラフとしては、例えば、分離カラムと、該分離カラムに接続した管 (ループ)と、六方二位置切り換えバルブを有しているものが知られている。そして、この種の液体クロマトグラフでは、試料は管から、または、管に接続した導入部から導入される。そして、管 (ループ）に溜められた試料は、六方二位置切り換えバルブを切り換えることによつて、一定量が分離カラムに導入される。しカゝしながら、試料の体積が分離カラムの体積 (容積)に比して大きすぎる場合、試料の体積が適当な場合に比して分離能が損なわれる。また、塩などの夾雑物質が多く含まれている試料を用いると、分離カラム自体の性能が劣化して分離能が損なわれることもある。

[0003] そこで、液体クロマトグラフにおいて、カラムの体積に比して大容量の試料を導入する場合、プレカラムによる試料の濃縮'脱塩が広く行われている。大容量の試料に対応可能な液体クロマトグラフの第一の例として、図 4に示すようなプレカラムを設けたものが知られている（J Mass Spectrom. 1996 Sep;31(9): 1021-7、 Anal Chem. 1998 Se p 15;70(18):3742-51.) _o図 4中、 31は分離カラムを、 32はプレカラムを、 33は検出器を、 34はポンプを、 35は試料を導入する導入管を、 36は廃液が排出される排出管を、 37は六方二位置切り換えバルブを、それぞれ示している。ここで、試料は導入管 3 5から導入され、六方二位置切り換えバルブ 37を閉じた後、プレカラム 32で濃縮'脱塩が行われる。そして、濃縮'脱塩された試料は、ポンプ 34の圧力によって、分離力ラム 31に送られ、分離が行われる。

し力しながら、この方法では、試料が直接にシリンジ等でプレカラム 32に導入されることになるため、背圧の高いものを用いることができず、プレカラムの設計が実質的に制限されてしまう。すなわち、カラム径が比較的大きぐカラム高が低ぐ充填材の粒子径が大きなものしか用いることができな、。

[0004] そこで、このような問題点を解決するため、第二の液体クロマトグラフの例として、図 5 に示すような装置が検討されている。この装置では、予め試料を管 (ループ）に導入しておき試料をプレカラムに送液する。図 5中、 41は分離カラムを、 42はプレカラムを、 43は検出器を、 44a '44bはそれぞれポンプを、 45aは試料を導入する導入管を、 45bは管を、 46は廃液が排出される排出管を、 47a '47bはそれぞれ六方二位置切り換えバルブを、それぞれ示している。ここで、試料は導入管 45aから導入され、管 4 5bに導入される。そして、第一の六方二位置切り換えバルブ 47bを閉じた後、第一のポンプ 44bの力によって、管 45b力もプレカラム 42に導入される。そして、第二の六方二位置切り換えバルブ 47aを閉じた後、プレカラム 42で濃縮'脱塩が行われる。そして、濃縮'脱塩された試料は、第二のポンプ 44aの力によって、分離カラム 41に送られ、分離が行われる。

このように、第二の液体クロマトグラフでは、分離用とは別のポンプ 44bを用いることができるため、自由にプレカラムの設計が行える。さらに、分離用のポンプ 44aを常に一定条件で運転できることから安定した運用が可能である。

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] 本発明は、液体クロマトグラフに用いたときに、試料の分離低下を防止することができるエレメント等を提供する。課題を解決するための手段

[0006] 上記第二の液体クロマトグラフは、低流速で分離を行うと十分な分離能が得られないことが分力つた。これは、第二の液体クロマトグラフに設けられているプレカラムと分離カラムの間の管 (配管)やバルブの体積、試料拡散等によると考えられた。すなわち、この管の体積 (容積）は液体クロマトグラフとして余分なものであり、高感度化のためにカラム体積を微小化し流速を低化させると、この余分な体積の存在が問題となる。例えば、現在、市販品として入手できる最小の管とバルブでこの部分の体積を計算すると約 50nL (プレカラムの体積の 1Z10〜1Z2)である。ここで、流速が： LZ分であれば滞留時間は 3秒程度であるため、典型的なピーク半値幅 10〜 15秒と比較して問題とはならない。しかし、現状での実用最低流速である lOOnLZ分程度であれば滞留時間は 30秒となるので分離に大きく影響する。特に、液体クロマトグラフィ一一質量分析法 (LC-MS)の感度は流速を下げれば下げるほど向上することが確認されているため、将来的に、より微量な試料を分離するとさらに低流速での分離が必要になると考えられる。従って、将来的にはプレカラムと分離カラムの間の体積による分離への悪影響がさらに大きな問題となる可能性がある。

そこで、本発明者は、プレカラムと分離カラムの間の体積を可能な限りなくすことを検討した。その結果、プレカラムと分離カラムを連続して直列に設けることにより、分離能の高い液体クロマトグラフが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明は、具体的には、下記手段により達成された。

(1)プレカラムと、該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムとを有する、液体クロマトグラフ用エレメント。

(2)プレカラムと、

該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムと、

前記プレカラムに設けられた、圧力付与手段を接続するための管および Zまたは前記プレカラム力廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部と、前記プレカラムに設けられた、前記プレカラムに試料を導入する導入管を接続するための第二の接続部とを有する、エレメント。

(3)前記第一の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側とは反対の側に設けられ、前記第二の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側に設けられている、 (2)に記載のエレメント。

(4)前記圧力付与手段を接続するための管を接続するための第一の接続部と、前記プレカラム力廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部とをそれぞれ有する、（2)または（3)に記載のエレメント。

(5)圧力付与手段を接続するための管と、排出管とが設けられており、かつ、前記圧力付与手段を接続するための管と前記排出管とは、同一の第一の接続部に設けられて、る、 (2)または（3)に記載のエレメント。

(6)前記第一の接続部には、管が設けられており、該管が分岐して、圧力付与手段および排出管が設けられている、（2)または（3)に記載のエレメント。

(7)前記排出管には、開閉切り換え部が設けられている、（4)〜（6)のいずれか 1項に記載のエレメント。

(8)前記第二の接続部に導入管が設けられて!/、る、 (2)〜（7)の、ずれか 1項に記載のエレメント。

(9)前記導入管には、開閉切り換え部が設けられている、（8)に記載のエレメント。

(10)前記導入管の体積が、 0. 3〜2 /z Lである、（8)または（9)に記載のエレメント。

(11)前記プレカラムの少なくとも前記分離カラム側には、メッシュ部が設けられている、（1)〜（10)のいずれ力 1項に記載のエレメント。

(12)前記プレカラムの前記分離カラム側およびその反対側に、それぞれ、メッシュ部が設けられて、る（1)〜（11)の!、ずれ力 1項に記載のエレメント。

(13)分離カラムに対して線速度 0. 1〜 lOmmZsecで送流する圧力付与手段を有する、 (2)〜（12)のいずれ力 1項に記載のエレメント。

(14)前記プレカラム力直径 0. 1〜： Lmm、高さ l〜20mmの円筒形である、（1)〜（ 13)のいずれ力 1項に記載のエレメント。

(15)前記分離カラムは、直径20〜250 111、高さ 20〜150mmの円筒形である、 ( 1)〜（14)の!、ずれ力 1項に記載のエレメント。

(16)前記プレカラムの体積は、前記分離カラムの体積の 0. 3〜： L0倍である、（1)〜 (15)のいずれ力 1項に記載のエレメント。

(17)液体クロマトグラフに用いる、（2)〜（16)のいずれか 1項に記載のエレメント。

(18) (2)〜（16)のいずれか 1項に記載のエレメントを有する液体クロマトグラフ。

(19) (17)または（18)に記載の液体クロマトグラフを用いる、液体クロマトグラフィー

(20)プレカラムに連続して直列に分離カラムを設ける工程と、前記プレカラムに接続して設けられた導入管から試料を導入する工程と、前記プレカラムの前記分離カラムとは反対の側から圧力を付与する工程と、前記プレカラムの前記分離カラムとは反対の側に接続してまたは前記プレカラムに接続した管力分岐して設けられた排出管力も廃液を排出する工程とを含み、かつ、前記分離カラムの背圧を前記プレカラムの背圧の 20倍以上とする、液体クロマトグラフの分離能を高める方法。

発明の効果

[0009] プレカラムと分離カラムを連続して直列に設けることにより、プレカラムを用いた液体クロマトグラフにおいて分解能が著しく改良された。特に、プレカラムの特徴である大容量導入性能は保ったまま分離カラムの分離能を損なうことのない低流速クロマトグラフィー（例えば、流速 200nLZ分以下、さらには流速 lOnLZ分以下）が可能となつた o

カロえて、試料体積がカラム体積および流速に対して大きぐまたは脱塩が必須である物質 (例えば、タンパク質、特に、タンパク質酵素消化物等）の液体クロマトグラフィ一質量分離法の場合に、特に効果的に用いることができるものとなった。

図面の簡単な説明

[0010] [図 1]本発明の好ましい実施形態の液体クロマトグラフの試料導入工程の概略図を示す。

[図 2]本発明の好ましい実施形態の液体クロマトグラフの試料分析工程の概略図を示す。

[図 3]本発明の液体クロマトグラフを用いた LC— MSクロマトグラムを示す。

[図 4]従来の液体クロマトグラフの第一の例の概略図を示す。

[図 5]従来の液体クロマトグラフの第二の例の概略図を示す。

[図 6]本発明において許容される、プレカラムと分離カラムの間の接続部の例を示す

[図 7]本発明の圧力付与手段接続部および排出管接続部の配置例を示す。

[図 8]本発明の圧力付与手段接続部および排出管接続部の配置例 (分岐型)を示す

発明を実施するための最良の形態

[0011] 以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。

本発明の「エレメント」とは、プレカラムと該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムを有するものをいう。より好ましい、本発明のエレメントは、プレカラムと、該プレカラムと連続して直列に設けられた分離カラムと、前記プレカラムと圧力付与手段 (圧力付与部)を接続するための管および Zまたは排出管を接続する第一の接続部と、前記プレカラムに試料 (溶液試料)を導入する管を接続する第二の接続部 (以下、導入管接続部という）とを有している。但し、本発明におけるエレメントは、該エレメントを構成する各構成部が接合したものの他、例えば、使用時には接合させるが通常の状態では、それぞれ分離した状態となっているものも本発明のエレメントに含む趣旨である。また、本発明のエレメントは、液体クロマトグラフに用いるのが好ましい。

[0012] ここで、本発明でいう連続とは、プレカラムと分離カラムの間に、他の管等が設けらずに接続していることをいう。但し、接続部材等であって、プレカラムと分離カラムの間に両カラムの体積力みて、無視できる程度 (分離に影響を与えない程度、例えば、プレカラムの体積の 1Z50以下、および Zまたは、典型的なピークの半値幅の 1Z5 以下）のものまでも排除する趣旨ではない。このような接続部材等はエレメントの性能という観点からは、無い方が好ましいが、通常の製法によって生じてしまうものや、製造コストを著しく削減する為にできてしまうものまでも排除する趣旨ではない。例えば

、図 6 (a)または（b)に示すようなものである。ここで、 11は分離カラムを、 12はプレカラムを、 21は接続部を示している。

[0013] また、直列にとは、本発明のエレメントを液体クロマトグラフに用いたときに、プレカラムと分離カラム間の試料の流路が妨げられな、ように配置されて、ることを、う。好ましくは、プレカラムと分離カラムの中心軸が平行または一直線上となる場合である。もちろん、角度を有して (例えば、 ± 15° 以内のものが好ましい)配置されているもの、プレカラムおよび/または分離カラムが湾曲して設けられているもの（この場合、例えば、接合点の接線が ± 15° 以内のものが好ましい)も本発明でいう直列に含まれる。そして、このようにプレカラムと分離カラムを連続させることにより、従来の方法を採用した場合にも得られる分離カラムへの夾雑物の流入を抑えられることは勿論、本発明では特に、大容量の試料を分解能高く分離することが可能になる。また、本発明において、例えば、プレカラムにおける、「分離カラムが設けられた側とは反対の側」とは、プレカラムと分離カラムが連続している面 (部位）に対応する面をいう。好ましくは、プレカラムと分離カラムが連続している面 (部位)と、平行な面をいう。分離カラムにおける、「プレカラムが設けられた側とは反対側」も同様に考えることができる。

以下、本発明の好ましい液体クロマトグラフの実施形態の一例を図 1および図 2に従って説明する。図 1は本発明の液体クロマトグラフに試料を導入する工程の概略図を、図 2は試料を分析する工程の概略図をそれぞれ示している。ここで、 11は分離力ラムを、 12はプレカラムを、 13は検出器を、 14は圧力付与手段が接続されている管を、 15は試料を導入する導入管を、 16は廃液が排出される排出管を、 17aおよび 17 bは開閉切り替え部を、 18はメッシュ部を、 19は試料をそれぞれ示している。また、 2 0は、圧力付与手段とプレカラムを接続するための管を示している。

そして、図 1に示すとおり、試料は導入管 15から導入され、プレカラム 12に導入される。試料が導入管 15に導入された後に開閉切り替え部 17aを切換え、試料は管 1 5を通じてプレカラム 12へ送液される。ここで、送液された試料はプレカラム 12の入り口近傍で充填材に吸着して濃縮される。一方、夾雑物はプレカラム 12のもう一端に設けられた排出管 16から排出される。一方、分離カラム 11の背圧はプレカラム 12の背圧と比較して 20倍以上と高く設定してあるため、分離カラム 11への夾雑物の流入は極めて抑えられる。

一方、図 2に示すとおり、試料の導入が終了した後、同じ流路を用いてプレカラム 12 に残った塩などの夾雑物を洗浄できる。そして、試料導入と洗浄工程が終了したら、開閉切り替え部 17a' 17bを切換えて導入管 15と排出管 16を閉じることで、ポンプ 14 によりプレカラム 12、分離カラム 11という方向に送液がなされる。そして、分離カラム 11で分離された試料が検出器 13で検出される。このようなエレメントにより、プレカラムシステムの大容量導入は可能なまま高分離可能な低流速液体クロマトグラフィーとすることが可能になった。尚、本実施例では、試料の分析を行っている力試料の分離、分画、分取を目的とする液体クロマトグラフィーも本発明の意図するところであることは言うまでもない。さらに、本実施形態では、プレカラムの両端にメッシュ部 18を設けている。充填材が粒子状の場合に、メッシュは特に有効である。

[0015] 本発明のプレカラムは、主として、クロマトグラフィーの対象となる試料を濃縮する役割を果たす。

プレカラムは、絶対的な寸法や形状に制限は無ぐ分離カラムの形状や試料の種類等によって適宜定めることができる。例えば、プレカラムの形状は、従来用いられている円筒型の他、角柱型、楕円筒型、切頭円錐型、切頭角錐型等であってもよい。また、本発明のプレカラムは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において、湾曲等しているものであってもよい。

プレカラムの寸法も特に定めるものではないが、例えば、タンパク質などの微量分析 '分離を行う場合の一例として、直径 0. 1〜： Lmm、高さ l〜20mmの円筒形のものが挙げられる。

プレカラムの素材も特に定めるものではな、が、 50bar以上の耐圧を有して!/、ることが好ましぐまた、耐薬品性を有することが好ましい。例えば、ステンレス、チタンなどの金属、ポリェチルエーテルエーテル、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。液体クロマトグラフィーでは、しばしば、システム圧が 50bar程度となることがあるため、 50bar以上の耐圧性を有することが好ましい。

[0016] 本発明のプレカラムには第一の充填材が充填されている。第一の充填材は、従来から液体クロマトグラフに広く採用されているものを採用することができる。例えば、後述する分離カラムに用いられる充填材と同一若しくは類似する性質のものが挙げられる。充填材の充填方法は、特に定めるものではなぐ公知の技術を広く採用でき、スラリ一法等が好まし、例として挙げられる。

さらに、本発明のプレカラムには、メッシュ部を設けてもよい。メッシュ部を設けることにより、例えば、試料の拡散を良くしたり、また、前記充填材が微粒子状のものの場合、充填材を安定に充填させるのに寄与するため好ましい。メッシュ部は、プレカラムにおける、分離カラムが設けられた側に、プレカラムにおける、分離カラムが設けられた側とは反対側に、または、両側に設けられていることが、好ましい。特に、少なくとも、プレカラムに設けられていることが好ましい。このようなメッシュ部は、その目的ゃ充填材の種類、試料の種類によって適宜定めることができるが、少なくとも、試料の移動を妨げな、、程度のメッシュを有し、充填材ゃ試料に影響を与えな、ものであることが必要である。このようなメッシュの例として、ステンレスを用いたメッシュが挙げられる。また、 2種類以上の異なった素材力もなるメッシュを積層したメッシュであってもよ、。

[0017] 本発明のプレカラムは、好ましくは、圧力付与手段を接続する管および Zまたはプレカラム力廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部と、プレカラムに試料を導入する導入管を接続する第二の接続部 (導入管接続部)とを有している。以下、これらについて説明する。尚、第一の接続部のうち、圧力付与手段を接続するための管の接続部を、圧力付与手段接続部と、プレカラム力廃液を排出するための排出管を接続するための接続部を、排出管接続部と称すことがある。さらに、「圧力付与手段を接続するための管および Zまたはプレカラム力廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部」とは、例えば、第一の接続部を少なくとも二つ有し、そのうちの一つは、圧力付与手段接続部を、そのうちの別の一つは、排出管接続部である場合や、圧力付与手段接続部と排出管接続部とが兼ねる構成となって、る場合の、ずれも含む趣旨である。

また、圧力付与手段接続部と排出管接続部とが兼ねる構成となって!/、る場合であつても、本発明の趣旨を逸脱しない限り、二つ以上の第一の接続部を有していてもよいことは言うまでも無い。

[0018] プレカラムに試料を導入する導入管を接続する導入管接続部とは、プレカラムに試料を導入する導入管を接続する部位をいう。本発明の導入管接続部は、導入管が直接に接続していてもよいし、何らかの接続部品を介して間接的に接続してもよい。プレカラムと導入管の接続は、従来力も液体クロマトグラフに採用されて、る公知の技術を広く採用できる。

導入管接続部は、プレカラムのいずれの位置に設けられていてもよぐ分離カラムが設けられている側に設けられていることが好ましい。また、導入管接続部は、接続される導入管が、分離カラムと平行になるよう設けられていてもよいし、角度を有するよう設けられていてもよい。さらに、本発明の趣旨を逸脱しない限り、プレカラムの側面から導入管接続部が設けられて、てもよ、。

これらの導入管には、流れを止めるため、また、逆流を防ぐため、開閉切り換え部が設けられていることが好ましい。開閉切り換え部は、導入管もしくは該導入管から延長している外部に設けることが好ましい。ここでいう開閉切り換え部としては、ノレブが好ましい例として挙げられる。バルブの種類としては、六方二位置切り換えバルブ、シャットアウトバルブ等が挙げられる。

また、導入管の体積は、特に定めるものではないが、例えば、 0. 3〜2 /z Lのものが挙げられる。

導入管の素材も特に定めるものではないが、 50bar以上の耐圧を有しているものであることが好ましぐまた、耐薬品性を有するものであることが好ましい。具体的には、ステンレス、チタンなどの金属、 PEEK,ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。

また、試料の導入方法は、試料の種類や液体クロマトグラフの大きさ等によって適宜定めることができ、シリンジやポンプを用いて導入する方法が好まし、例として挙げられる。また、導入管に接続して、試料導入部を設けてもよい。

本発明の圧力付与手段接続部とは、圧力付与手段をカラムに接続するための部位をいう。本発明の圧力付与手段接続部は、圧力付与手段が直接に接続していてもよいし、排出管等の管やその他の接続部品等を介して間接的に接続してもよい。プレカラムと圧力付与手段の接続は、従来力液体クロマトグラフに採用されている公知の技術を広く採用できる。

圧力付与手段接続部を設ける位置は、プレカラムの圧力付与手段を作動させた (圧力をかけた）ときに、試料がプレカラム力も分離カラムへ導入されるような位置に設けられてヽれば特に定めるものではな！/、。

圧力付与手段を接続する管は任意の角度で圧力付与手段接続部に接続できる。また、圧力付与手段は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、 1つであっても 2つ以上設けていてもよい。もちろん、本発明の趣旨を逸脱しない限り、圧力付与手段接続部も 1 つであってもよいし、 2つ以上であってもよい。

圧力付与手段から付与される圧力は、分離カラムに対して線速度 0. 1〜： LOmmZs ecで送流するものがより好まし、。

尚、本発明でいう圧力付与手段とは、例えば、分離カラムに対し圧力を付与する機能を有するものをいい、例えば、ポンプのほか、人がシリンジ等によって圧力を付与する場合、このシリンジ導入部も含む趣旨である。圧力付与手段に用いるポンプは、従来力も液体クロマトグラフに採用されているポンプを広く採用できる。例えば、 DiN a (KYAテクノロジーズ製）、 1100シリーズナノポンプ（Agilemt technologies製）等を採用できる。

また、圧力付与手段を接続するための管の例としては、直径 20〜： ί00 /ζ πι、高さ 10 0〜400mmの円筒形のものが挙げられる。

管の素材も特に定めるものではないが、 50bar以上の耐圧を有しているものであること力子ましく、また、耐薬品性を有するものであることが好ましい。具体的には、ステンレス、チタンなどの金属、 PEEK、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。

さらに、本発明の液体クロマトグラフは、プレカラム力廃液を排出する排出管を有する。排出管は、プレカラムに設けられた排出管接続部に直接に設けられていてもよいし、他の管等の接続部を介して間接的に設けられていてもよい。他の管を介して間接的に排出管が設けられている例として、前記圧力付与手段が有する管から分岐して排出管が設けられて、る態様が挙げられる。

排出管接続部に管を接続する場合、本発明の趣旨を逸脱しない限り、管は任意の角度で接続できる。また、排出管は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、 1つであっても 2つ以上設けていてもよい。もちろん、本発明の趣旨を逸脱しない限り、排出管接続部も 1つであってもよいし、 2つ以上であってもよい。

これらの排出管には、逆流を防ぐため、開閉切り換え部が設けられていることが極めて好ましい。開閉切り換え部としては、バルブが好ましい例として挙げられる。バルブは、導入管に記載のものを好ましく採用できる。

また、排出管の体積は、特に定めるものではないが、例えば、 0. 3〜2 /z Lのものが挙げられる。排出管の素材も特に定めるものではないが、好ましくは、導入管の素材と同様のものが好ましい例として挙げられる。 [0021] また、本発明の排出管接続部と、圧力付与手段接続部とは、同一の第一の接続部に接続していてもよい。ここでいう同一の第一の接続部とは、一の第一の接続部から直接的にまたは間接的に圧力付与手段と排出管が接続していることをいい、例えば、一つの第一の接続部から、管が設けられ、該管が分岐してその一方が圧力付与装置に接続し、他方が排出管に接続している場合も含まれる。この場合、分岐部 (例えば、 Tコネクタ）により分岐している構成とすることができる。

[0022] 以下、図 7および図 8を参照して、本発明の好ましい圧力付与手段接続部および排出管接続部の配置例について説明する。尚、図 7および図 8中、 11は分離カラムを、 12はプレカラムを、 13は検出器を、 14は圧力付与手段が接続されている管を、 15 は試料を導入する導入管を、 16は廃液が排出される排出管を、 17aおよび 17bは開閉切り替え部をそれぞれ示して！/ヽる。

図 7 (a)は、圧力付与手段接続部が、プレカラム 12であって、分離カラム 11が設けられた側とは反対の側に、排出管接続部が、プレカラム 12の側面に設けられた例である。図 7 (b)は、圧力付与手段接続部が、プレカラム 12の側面に、排出管接続部が、プレカラム 12であって、分離カラム 11が設けられた側とは反対の側に設けられた例である。図 7 (c)は、圧力付与手段接続部および排出管接続部のいずれもがプレカラム 12の側面に設けられた例である。

図 8は、 1つの接続部が、圧力付与手段接続部および排出管接続部を兼ねる構成のものである。そして、図 8 (a)は、このような接続部力プレカラム 12であって、分離カラム 11が設けられた側とは反対の側に設けられた例であり、 (b)はプレカラム 12の側面に設けられた例である。

[0023] 分離カラムは、絶対的な寸法や形状に制限は無ぐプレカラムの形状や試料の種類等によって適宜定めることができる。例えば、分離カラムの形状は、従来用いられている円筒型の他、角柱型、楕円筒型、切頭円錐型、切頭角錐型等であってもよい。また、本発明の分離カラムは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において、湾曲等して!、るものであってもよ!/、。

分離カラムの寸法も特に定めるものではないが、タンパク質などの微量分析 ·分離を行う場合の一例として、直径 20〜250 m、高さ 20〜150mmの円筒形のものが挙げられる。

分離カラムの素材も特に定めるものではな、が、 50bar以上の耐圧を有して、るものであることが好ましぐまた、耐薬品性を有するものであることが好ましい。具体的には、ステンレス、チタンなどの金属、 PEEK、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。

[0024] 本発明の分離カラムには第二の充填材が充填されている。充填材は、従来から液体クロマトグラフに広く採用されているものを採用することができる。好ましい例としては、炭素原子数が、 4、 8、 18または 22の、化学結合球状シリカまたはモノリスシリカが挙げられる。特に、タンパク質を分離'分析する場合には炭素原子数が 4または 8 の化学結合球状シリカまたはモノリスシリカが好ましぐペプチドを分離 ·分析する場合には炭素原子数が 8、 18または 22の化学結合球状シリカまたはモノリスシリカが好ましい。充填材の充填方法については、上記プレカラムと同様の方法が採用できる。

[0025] 本発明のプレカラムと分離カラムの組み合わせは、背圧がプレカラムの背圧の 20 倍以上、より好ましくは、 30倍以上であれば、特に制限は無い。このような背圧関係は、例えば、円筒型カラムの断面積と長さを調節することによって達成される。

プレカラムの体積は、分離カラムの体積の 0. 3〜 10倍であることが好ましぐ 0. 5〜 3倍であることがより好まし、。

また、プレカラムと分離カラムの断面比 (試料の進行方向に垂直な断面）は、 2 : 1以上であることが好ましい。このような構成とすることにより、圧力関係を保ちつつ、液体クロマトグラフの構造としてもより好ましいものとなる。尚、本発明では、プレカラムおよび Zまたは分離カラムの断面が一定でないもの、例えば、切頭円錐形のもの等も採用できるが、この場合、断面の平均が該範囲内であることが好ましい。

[0026] 上述したものの他、本発明のエレメントを液体クロマトグラフに用いる場合のプレカラム、分離カラム、導入管、圧力付与手段、排出管、その他液体クロマトグラフを構成する各種部品、ならびに、これらの接続部材等は、公知の液体クロマトグラフに用いるもの仏用できる。 f列 X·は、 High performance liquid chromatography, ed. by P. R. Brown, R. A.、 Hartwick, John Wiley and sons, New York (1989)等に記載のものを採用できる。 [0027] 本発明の液体クロマトグラフは、いわゆる濃度勾配溶出法で溶出されるものであれば特に定めるものではなぐ特定の物質の分離、特定の物質の分析 (質量分析等）に広く使用できる。

また、本発明の液体クロマトグラフで分離 ·分析できる試料は、一般的にこの種の液体クロマトグラフで分離 ·分析される試料であれば特に定めるものではなぐタンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸等の生体分子分離'分析に好ましく用いることができる。また、試料の量は、通常のクロマトグラフィーにおいて用いられる量と同じ程度の量であってもよい。

[0028] 本発明の液体クロマトグラフは、逆相クロマトグラフィーとして好ましく用いられる。

本発明で用いる溶離液は、プレカラムおよび分離カラムの充填材ならびに試料の種類に応じて適宜定めることができる。逆相液体クロマトグラフィーの場合には、ギ酸系、トリフルォロ酢酸系、ヘプタフルォロ酪酸系、酢酸系等が例として挙げられる。例えば、検出器が質量分析の場合、酢酸系、ギ酸系が好ましぐ紫外線吸光検出器の場合、トリフルォロ酢酸系、ヘプタフルォロ酪酸系等が好ましい。

実施例

[0029] 以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。

[0030] (1)カラム

分離カラムは、文献（Natsume, t. etal. Anal. Chem. 74, 4725-4733 (2002 ) )に記載の方法に従って準備した。すなわち、ナノフロー用の ESIカラム (分離カラム、内径 0. 2mm X 55mm)に、内径 0. 2mm、外経 0. 37mmの溶融シリカ細管をレ一ザープラー P— 2000 (Sutter instruments製、 P— 2000)で整形したカラム管に Mi ghtysil C18(lum) (関東ィ匕学製)を充填して作製した。長めに充填して切り落としてすぐ接続した。

プレカラムは、ナノプレカラム (KYAテクノロジーズ製、内径 0. 5mm X 1mm)を用いた。充填材は Mightysil C18(3um) (関東ィ匕学製)を用いた。カラムパッキング用のスラリー CH CIとシクロへキサノール（cyclohexanol)の混液に充填材を懸濁し、 10分

2 2

間、超音波処理した。このスラリーを、ピークチューブを用いて自作したカラムパッカ一に吸引して、 lOMPaで 15分間圧力を印加して充填した。

プレカラムと分離カラム、および配管の接続は Dual— Lumen Silica SealTight Tubing Sleeve (Upchurch scientific製、 F— 235X)を用いた。また、プレカラム端であって分離カラム側に 0. 3 μ mステンレスメッシュ（富士フィルター製)を設けた。導入管および排出管は溶融シリカ細管 (順に、内径 75 ;ζ ΐη、長さ 150mm、内径 75 m、長さ 100mm、）を用いた。

[0031] (2)試料

試料は、牛血清アルブミントリプシン消化物 (KYAテクノロジーズ製)を用いた。濃度 lOfmolZ μ Lのものを 10 μ L導入した (計 100fmol)。

(3)溶離液系

A溶液 0. 075% ギ酸水溶液

B溶液 80% ァセトニトリル Z0. 075% ギ酸水溶液

エレクトロスプレー法で効率的にイオンィ匕するために、ギ酸系の溶離液を用いた。

[0032] (4)液体クロマトグラフィー質量分離

液体クロマトグラフは、 Agilentl 100シリーズのナノフローポンプ（Agilent techno logios製）をマイクロフローモードで用いた。質量分離計はサーモエレクトロン社の L CQにナノフロー用のイオン源 (自家製)を装着して用いた。ペプチドの溶離条件は流速 200nLZ分、 B溶液濃度を 1〜50%まで 50分で直線的に上昇させた。測定質量範囲は mZz500 800とした。典型的なスキャン時間は 0. 5秒であった。

[0033] 実験結果

図 3に、本発明の液体クロマトグラフを用いた牛血清アルブミントリプシン消化物の L C MSクロマトグラムを示した。表 1に図 3中の矢印で示した 20種類のピークのピーク半値幅 (ピーク高の 50%高さでのピーク幅）を示した。表 1に示すとおり、本発明の液体クロマトグラフを用いた場合、典型的なピーク幅は 4. 8-10. 2秒の範囲であつた。

これに対し、試料や充填材については、同じものを採用した同じ濃度勾配溶離条件で図 4に記載の装置で分離すると、典型的なピーク幅は 15秒程度であった。

以上より、本発明の液体クロマトグラフは、高い分解能を有することが認められた。特に、試料が微量しかないものについて、本発明の液体クロマトグラフは有効であることが示唆される。

[表 1] ί容離 B寺間苣量 (m/z) ピ '一ク半值幅 (sec) ピ 'ーク強度 (raunts)

3.0 733. .66 G. e 1. 94E7

e.o 537. .76 7. 8 7. 90E7

7.2 749. .18 7. 1 3. 58E7

1Q.S 512. .98 8. A 1■ 52E8

1Q.9 723. .31 9. 0 2. 01E8

12.2 706. .89 7. 2 1■ 03E8

12.5 571. .45 8. 4 9. 39E7

14.4 635. .52 4. 8 2. 87E8

15. D 653. .81 7. 2 3. 94E8

1S.B G59. .89 8. 4 3. 07E8

1B.E 572. .43 7. 2 1■ 42E8

20. S GOO. .28 1. 8 2. B4E8

20. B 582. .78 10. 2 3. 81E8

22.1 711. .37 7. 2 1■ 89E8

22.6 758. .91 7. 2 1. 4E8

23.7 708. .8G 7. 2 1■ 8E8

24.4 637. .61 9. 6 1. G2E8

24.9 740. .95 10. 2 5. 21E8

27.3 746. .91 7. 8 8. G5E7

35.1 784. .85 7. 8 1. 72E8

Claims

請求の範囲

[I] プレカラムと、該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムとを有する、液体クロマトグラフ用エレメント。

[2] プレカラムと、

該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムと、

[3] 前記第一の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側とは反対の側に設けられ、前記第二の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側に設けられて、る、請求項 2に記載のエレメント。

[4] 前記圧力付与手段を接続するための管を接続するための第一の接続部と、前記プレカラム力廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部とをそれぞれ有する、請求項 2または 3に記載のエレメント。

[5] 圧力付与手段を接続するための管と、排出管とが設けられており、かつ、前記圧力付与手段を接続するための管と前記排出管とは、同一の第一の接続部に設けられている、請求項 2または 3に記載のエレメント。

[6] 前記第一の接続部には、管が設けられており、該管が分岐して、圧力付与手段および排出管が設けられている、請求項 2または 3に記載のエレメント。

[7] 前記排出管には、開閉切り換え部が設けられている、請求項 4〜6のいずれか 1項に記載のエレメント。

[8] 前記第二の接続部に導入管が設けられている、請求項 2〜7のいずれか 1項に記載のエレメント。

[9] 前記導入管には、開閉切り換え部が設けられている、請求項 8に記載のエレメント。

[10] 前記導入管の体積が、 0. 3〜2 μ Lである、請求項 8または 9に記載のエレメント。

[II] 前記プレカラムの少なくとも前記分離カラム側には、メッシュ部が設けられている、請求項 1〜10のいずれ力 1項に記載のエレメント。

[12] 前記プレカラムの前記分離カラム側およびその反対側に、それぞれ、メッシュ部が設けられて、る請求項 1〜： L 1の、ずれ力 1項に記載のエレメント。

[13] 分離カラムに対して線速度 0. 1〜： LOmmZsecで送流する圧力付与手段を有する、請求項 2〜 12のいずれ力 1項に記載のエレメント。

[14] 前記プレカラム力直径 0. l〜lmm、高さ l〜20mmの円筒形である、請求項 1〜1

3の!、ずれか 1項に記載のエレメント。

[15] 前記分離カラムは、直径 20〜250 m、高さ 20〜 150mmの円筒形である、請求項

1〜14のいずれか 1項に記載のエレメント。

[16] 前記プレカラムの体積は、前記分離カラムの体積の 0. 3〜： LO倍である、請求項 1〜1

5の!、ずれか 1項に記載のエレメント。

[17] 液体クロマトグラフに用いる、請求項 2〜16のいずれか 1項に記載のエレメント。

[18] 請求項 2〜 16のいずれか 1項に記載のエレメントを有する液体クロマトグラフ。

[19] 請求項 17または 18に記載の液体クロマトグラフを用いる、液体クロマトグラフィー。