JPWO2006038460A1 - エレメント、液体クロマトグラフおよび液体クロマトグラフィー - Google Patents

Abstract

試料の分離低下を防止することができる液体クロマトグラフ用のエレメント等を提供する。プレカラムと、該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムとを有する、液体クロマトグラフ用エレメント。

Description

本発明は、新規なエレメント等に関する。特に、液体クロマトグラフィーに用いるための、分離能に優れたエレメント、および該エレメントを有する液体クロマトグラフおよび本発明の液体クロマトグラフを用いる、液体クロマトグラフィーに関する。

技術背景

従来から、溶液試料の分離に、液体クロマトグラフが広く採用されている。液体クロマトグラフとしては、例えば、分離カラムと、該分離カラムに接続した管(ループ)と、六方二位置切り換えバルブを有しているものが知られている。そして、この種の液体クロマトグラフでは、試料は管から、または、管に接続した導入部から導入される。そして、管（ループ）に溜められた試料は、六方二位置切り換えバルブを切り換えることによって、一定量が分離カラムに導入される。しかしながら、試料の体積が分離カラムの体積（容積）に比して大きすぎる場合、試料の体積が適当な場合に比して分離能が損なわれる。また、塩などの夾雑物質が多く含まれている試料を用いると、分離カラム自体の性能が劣化して分離能が損なわれることもある。

そこで、液体クロマトグラフにおいて、カラムの体積に比して大容量の試料を導入する場合、プレカラムによる試料の濃縮・脱塩が広く行われている。大容量の試料に対応可能な液体クロマトグラフの第一の例として、図４に示すようなプレカラムを設けたものが知られている（J Mass Spectrom. 1996 Sep;31(9):1021-7、Anal Chem. 1998 Sep 15;70(18):3742-51.）。図４中、３１は分離カラムを、３２はプレカラムを、３３は検出器を、３４はポンプを、３５は試料を導入する導入管を、３６は廃液が排出される排出管を、３７は六方二位置切り換えバルブを、それぞれ示している。ここで、試料は導入管３５から導入され、六方二位置切り換えバルブ３７を閉じた後、プレカラム３２で濃縮・脱塩が行われる。そして、濃縮・脱塩された試料は、ポンプ３４の圧力によって、分離カラム３１に送られ、分離が行われる。
しかしながら、この方法では、試料が直接にシリンジ等でプレカラム３２に導入されることになるため、背圧の高いものを用いることができず、プレカラムの設計が実質的に制限されてしまう。すなわち、カラム径が比較的大きく、カラム高が低く、充填材の粒子径が大きなものしか用いることができない。

そこで、このような問題点を解決するため、第二の液体クロマトグラフの例として、図５に示すような装置が検討されている。この装置では、予め試料を管（ループ）に導入しておき試料をプレカラムに送液する。図５中、４１は分離カラムを、４２はプレカラムを、４３は検出器を、４４ａ・４４ｂはそれぞれポンプを、４５ａは試料を導入する導入管を、４５ｂは管を、４６は廃液が排出される排出管を、４７ａ・４７ｂはそれぞれ六方二位置切り換えバルブを、それぞれ示している。ここで、試料は導入管４５ａから導入され、管４５ｂに導入される。そして、第一の六方二位置切り換えバルブ４７ｂを閉じた後、第一のポンプ４４ｂの力によって、管４５ｂからプレカラム４２に導入される。そして、第二の六方二位置切り換えバルブ４７ａを閉じた後、プレカラム４２で濃縮・脱塩が行われる。そして、濃縮・脱塩された試料は、第二のポンプ４４ａの力によって、分離カラム４１に送られ、分離が行われる。
このように、第二の液体クロマトグラフでは、分離用とは別のポンプ４４ｂを用いることができるため、自由にプレカラムの設計が行える。さらに、分離用のポンプ４４ａを常に一定条件で運転できることから安定した運用が可能である。

本発明は、液体クロマトグラフに用いたときに、試料の分離低下を防止することができるエレメント等を提供する。

上記第二の液体クロマトグラフは、低流速で分離を行うと十分な分離能が得られないことが分かった。これは、第二の液体クロマトグラフに設けられているプレカラムと分離カラムの間の管（配管）やバルブの体積、試料拡散等によると考えられた。すなわち、この管の体積（容積）は液体クロマトグラフとして余分なものであり、高感度化のためにカラム体積を微小化し流速を低化させると、この余分な体積の存在が問題となる。例えば、現在、市販品として入手できる最小の管とバルブでこの部分の体積を計算すると約５０ｎＬ（プレカラムの体積の１／１０〜１／２）である。ここで、流速が１μＬ／分であれば滞留時間は３秒程度であるため、典型的なピーク半値幅１０〜１５秒と比較して問題とはならない。しかし、現状での実用最低流速である１００ｎＬ／分程度であれば滞留時間は３０秒となるので分離に大きく影響する。特に、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ‐ＭＳ）の感度は流速を下げれば下げるほど向上することが確認されているため、将来的に、より微量な試料を分離するとさらに低流速での分離が必要になると考えられる。従って、将来的にはプレカラムと分離カラムの間の体積による分離への悪影響がさらに大きな問題となる可能性がある。

そこで、本発明者は、プレカラムと分離カラムの間の体積を可能な限りなくすことを検討した。その結果、プレカラムと分離カラムを連続して直列に設けることにより、分離能の高い液体クロマトグラフが得られることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、具体的には、下記手段により達成された。
（１）プレカラムと、該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムとを有する、液体クロマトグラフ用エレメント。
（２）プレカラムと、
該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムと、
前記プレカラムに設けられた、圧力付与手段を接続するための管および／または前記プレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部と、
前記プレカラムに設けられた、前記プレカラムに試料を導入する導入管を接続するための第二の接続部とを有する、エレメント。
（３）前記第一の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側とは反対の側に設けられ、前記第二の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側に設けられている、（２）に記載のエレメント。
（４）前記圧力付与手段を接続するための管を接続するための第一の接続部と、前記プレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部とをそれぞれ有する、（２）または（３）に記載のエレメント。
（５）圧力付与手段を接続するための管と、排出管とが設けられており、かつ、前記圧力付与手段を接続するための管と前記排出管とは、同一の第一の接続部に設けられている、（２）または（３）に記載のエレメント。
（６）前記第一の接続部には、管が設けられており、該管が分岐して、圧力付与手段および排出管が設けられている、（２）または（３）に記載のエレメント。
（７）前記排出管には、開閉切り換え部が設けられている、（４）〜（６）のいずれか１項に記載のエレメント。
（８）前記第二の接続部に導入管が設けられている、（２）〜（７）のいずれか１項に記載のエレメント。
（９）前記導入管には、開閉切り換え部が設けられている、（８）に記載のエレメント。
（１０）前記導入管の体積が、０．３〜２μＬである、（８）または（９）に記載のエレメント。
（１１）前記プレカラムの少なくとも前記分離カラム側には、メッシュ部が設けられている、（１）〜（１０）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１２）前記プレカラムの前記分離カラム側およびその反対側に、それぞれ、メッシュ部が設けられている（１）〜（１１）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１３）分離カラムに対して線速度０．１〜１０ｍｍ／ｓｅｃで送流する圧力付与手段を有する、（２）〜（１２）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１４）前記プレカラムが、直径０．１〜１ｍｍ、高さ１〜２０ｍｍの円筒形である、（１）〜（１３）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１５）前記分離カラムは、直径２０〜２５０μｍ、高さ２０〜１５０ｍｍの円筒形である、（１）〜（１４）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１６）前記プレカラムの体積は、前記分離カラムの体積の０．３〜１０倍である、（１）〜（１５）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１７）液体クロマトグラフに用いる、（２）〜（１６）のいずれか１項に記載のエレメント。
（１８）（２）〜（１６）のいずれか１項に記載のエレメントを有する液体クロマトグラフ。
（１９）（１７）または（１８）に記載の液体クロマトグラフを用いる、液体クロマトグラフィー。

（２０）プレカラムに連続して直列に分離カラムを設ける工程と、前記プレカラムに接続して設けられた導入管から試料を導入する工程と、前記プレカラムの前記分離カラムとは反対の側から圧力を付与する工程と、前記プレカラムの前記分離カラムとは反対の側に接続してまたは前記プレカラムに接続した管から分岐して設けられた排出管から廃液を排出する工程とを含み、かつ、前記分離カラムの背圧を前記プレカラムの背圧の２０倍以上とする、液体クロマトグラフの分離能を高める方法。

プレカラムと分離カラムを連続して直列に設けることにより、プレカラムを用いた液体クロマトグラフにおいて分解能が著しく改良された。特に、プレカラムの特徴である大容量導入性能は保ったまま分離カラムの分離能を損なうことのない低流速クロマトグラフィー（例えば、流速２００ｎＬ／分以下、さらには流速１０ｎＬ／分以下）が可能となった。
加えて、試料体積がカラム体積および流速に対して大きく、または脱塩が必須である物質（例えば、タンパク質、特に、タンパク質酵素消化物等）の液体クロマトグラフィー質量分離法の場合に、特に効果的に用いることができるものとなった。

本発明の好ましい実施形態の液体クロマトグラフの試料導入工程の概略図を示す。 本発明の好ましい実施形態の液体クロマトグラフの試料分析工程の概略図を示す。 本発明の液体クロマトグラフを用いたＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示す。 従来の液体クロマトグラフの第一の例の概略図を示す。 従来の液体クロマトグラフの第二の例の概略図を示す。 本発明において許容される、プレカラムと分離カラムの間の接続部の例を示す。 本発明の圧力付与手段接続部および排出管接続部の配置例を示す。 本発明の圧力付与手段接続部および排出管接続部の配置例（分岐型）を示す。

以下において、本発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において「〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。
本発明の「エレメント」とは、プレカラムと該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムを有するものをいう。より好ましい、本発明のエレメントは、プレカラムと、該プレカラムと連続して直列に設けられた分離カラムと、前記プレカラムと圧力付与手段（圧力付与部）を接続するための管および／または排出管を接続する第一の接続部と、前記プレカラムに試料（溶液試料）を導入する管を接続する第二の接続部（以下、導入管接続部という）とを有している。但し、本発明におけるエレメントは、該エレメントを構成する各構成部が接合したものの他、例えば、使用時には接合させるが通常の状態では、それぞれ分離した状態となっているものも本発明のエレメントに含む趣旨である。また、本発明のエレメントは、液体クロマトグラフに用いるのが好ましい。

ここで、本発明でいう連続とは、プレカラムと分離カラムの間に、他の管等が設けらずに接続していることをいう。但し、接続部材等であって、プレカラムと分離カラムの間に両カラムの体積からみて、無視できる程度（分離に影響を与えない程度、例えば、プレカラムの体積の１／５０以下、および／または、典型的なピークの半値幅の１／５以下）のものまでも排除する趣旨ではない。このような接続部材等はエレメントの性能という観点からは、無い方が好ましいが、通常の製法によって生じてしまうものや、製造コストを著しく削減する為にできてしまうものまでも排除する趣旨ではない。例えば、図６（ａ）または（ｂ）に示すようなものである。ここで、１１は分離カラムを、１２はプレカラムを、２１は接続部を示している。

また、直列にとは、本発明のエレメントを液体クロマトグラフに用いたときに、プレカラムと分離カラム間の試料の流路が妨げられないように配置されていることをいう。好ましくは、プレカラムと分離カラムの中心軸が平行または一直線上となる場合である。もちろん、角度を有して（例えば、±１５°以内のものが好ましい）配置されているもの、プレカラムおよび／または分離カラムが湾曲して設けられているもの（この場合、例えば、接合点の接線が±１５°以内のものが好ましい）も本発明でいう直列に含まれる。
そして、このようにプレカラムと分離カラムを連続させることにより、従来の方法を採用した場合にも得られる分離カラムへの夾雑物の流入を抑えられることは勿論、本発明では特に、大容量の試料を分解能高く分離することが可能になる。
また、本発明において、例えば、プレカラムにおける、「分離カラムが設けられた側とは反対の側」とは、プレカラムと分離カラムが連続している面（部位）に対応する面をいう。好ましくは、プレカラムと分離カラムが連続している面（部位）と、平行な面をいう。分離カラムにおける、「プレカラムが設けられた側とは反対側」も同様に考えることができる。

以下、本発明の好ましい液体クロマトグラフの実施形態の一例を図１および図２に従って説明する。図１は本発明の液体クロマトグラフに試料を導入する工程の概略図を、図２は試料を分析する工程の概略図をそれぞれ示している。ここで、１１は分離カラムを、１２はプレカラムを、１３は検出器を、１４は圧力付与手段が接続されている管を、１５は試料を導入する導入管を、１６は廃液が排出される排出管を、１７ａおよび１７ｂは開閉切り替え部を、１８はメッシュ部を、１９は試料をそれぞれ示している。また、２０は、圧力付与手段とプレカラムを接続するための管を示している。
そして、図１に示すとおり、試料は導入管１５から導入され、プレカラム１２に導入される。試料が導入管１５に導入された後に開閉切り替え部１７ａを切換え、試料は管１５を通じてプレカラム１２へ送液される。ここで、送液された試料はプレカラム１２の入り口近傍で充填材に吸着して濃縮される。一方、夾雑物はプレカラム１２のもう一端に設けられた排出管１６から排出される。一方、分離カラム１１の背圧はプレカラム１２の背圧と比較して２０倍以上と高く設定してあるため、分離カラム１１への夾雑物の流入は極めて抑えられる。
一方、図２に示すとおり、試料の導入が終了した後、同じ流路を用いてプレカラム１２に残った塩などの夾雑物を洗浄できる。そして、試料導入と洗浄工程が終了したら、開閉切り替え部１７ａ・１７ｂを切換えて導入管１５と排出管１６を閉じることで、ポンプ１４によりプレカラム１２、分離カラム１１という方向に送液がなされる。そして、分離カラム１１で分離された試料が検出器１３で検出される。このようなエレメントにより、プレカラムシステムの大容量導入は可能なまま高分離可能な低流速液体クロマトグラフィーとすることが可能になった。尚、本実施例では、試料の分析を行っているが、試料の分離、分画、分取を目的とする液体クロマトグラフィーも本発明の意図するところであることは言うまでもない。
さらに、本実施形態では、プレカラムの両端にメッシュ部１８を設けている。充填材が粒子状の場合に、メッシュは特に有効である。

本発明のプレカラムは、主として、クロマトグラフィーの対象となる試料を濃縮する役割を果たす。
プレカラムは、絶対的な寸法や形状に制限は無く、分離カラムの形状や試料の種類等によって適宜定めることができる。例えば、プレカラムの形状は、従来用いられている円筒型の他、角柱型、楕円筒型、切頭円錐型、切頭角錐型等であってもよい。また、本発明のプレカラムは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において、湾曲等しているものであってもよい。
プレカラムの寸法も特に定めるものではないが、例えば、タンパク質などの微量分析・分離を行う場合の一例として、直径０．１〜１ｍｍ、高さ１〜２０ｍｍの円筒形のものが挙げられる。
プレカラムの素材も特に定めるものではないが、５０ｂａｒ以上の耐圧を有していることが好ましく、また、耐薬品性を有することが好ましい。例えば、ステンレス、チタンなどの金属、ポリエチルエーテルエーテル、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。液体クロマトグラフィーでは、しばしば、システム圧が５０ｂａｒ程度となることがあるため、５０ｂａｒ以上の耐圧性を有することが好ましい。

本発明のプレカラムには第一の充填材が充填されている。第一の充填材は、従来から液体クロマトグラフに広く採用されているものを採用することができる。例えば、後述する分離カラムに用いられる充填材と同一若しくは類似する性質のものが挙げられる。充填材の充填方法は、特に定めるものではなく、公知の技術を広く採用でき、スラリー法等が好ましい例として挙げられる。
さらに、本発明のプレカラムには、メッシュ部を設けてもよい。メッシュ部を設けることにより、例えば、試料の拡散を良くしたり、また、前記充填材が微粒子状のものの場合、充填材を安定に充填させるのに寄与するため好ましい。メッシュ部は、プレカラムにおける、分離カラムが設けられた側に、プレカラムにおける、分離カラムが設けられた側とは反対側に、または、両側に設けられていることが、好ましい。特に、少なくとも、プレカラムに設けられていることが好ましい。このようなメッシュ部は、その目的や充填材の種類、試料の種類によって適宜定めることができるが、少なくとも、試料の移動を妨げない程度のメッシュを有し、充填材や試料に影響を与えないものであることが必要である。このようなメッシュの例として、ステンレスを用いたメッシュが挙げられる。また、２種類以上の異なった素材からなるメッシュを積層したメッシュであってもよい。

本発明のプレカラムは、好ましくは、圧力付与手段を接続する管および／またはプレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部と、プレカラムに試料を導入する導入管を接続する第二の接続部（導入管接続部）とを有している。以下、これらについて説明する。尚、第一の接続部のうち、圧力付与手段を接続するための管の接続部を、圧力付与手段接続部と、プレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための接続部を、排出管接続部と称すことがある。さらに、「圧力付与手段を接続するための管および／またはプレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部」とは、例えば、第一の接続部を少なくとも二つ有し、そのうちの一つは、圧力付与手段接続部を、そのうちの別の一つは、排出管接続部である場合や、圧力付与手段接続部と排出管接続部とが兼ねる構成となっている場合のいずれも含む趣旨である。
また、圧力付与手段接続部と排出管接続部とが兼ねる構成となっている場合であっても、本発明の趣旨を逸脱しない限り、二つ以上の第一の接続部を有していてもよいことは言うまでも無い。

プレカラムに試料を導入する導入管を接続する導入管接続部とは、プレカラムに試料を導入する導入管を接続する部位をいう。本発明の導入管接続部は、導入管が直接に接続していてもよいし、何らかの接続部品を介して間接的に接続してもよい。プレカラムと導入管の接続は、従来から液体クロマトグラフに採用されている公知の技術を広く採用できる。
導入管接続部は、プレカラムのいずれの位置に設けられていてもよく、分離カラムが設けられている側に設けられていることが好ましい。また、導入管接続部は、接続される導入管が、分離カラムと平行になるよう設けられていてもよいし、角度を有するよう設けられていてもよい。さらに、本発明の趣旨を逸脱しない限り、プレカラムの側面から導入管接続部が設けられていてもよい。
これらの導入管には、流れを止めるため、また、逆流を防ぐため、開閉切り換え部が設けられていることが好ましい。開閉切り換え部は、導入管もしくは該導入管から延長している外部に設けることが好ましい。ここでいう開閉切り換え部としては、バルブが好ましい例として挙げられる。バルブの種類としては、六方二位置切り換えバルブ、シャットアウトバルブ等が挙げられる。
また、導入管の体積は、特に定めるものではないが、例えば、０．３〜２μＬのものが挙げられる。
導入管の素材も特に定めるものではないが、５０ｂａｒ以上の耐圧を有しているものであることが好ましく、また、耐薬品性を有するものであることが好ましい。具体的には、ステンレス、チタンなどの金属、ＰＥＥＫ、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。
また、試料の導入方法は、試料の種類や液体クロマトグラフの大きさ等によって適宜定めることができ、シリンジやポンプを用いて導入する方法が好ましい例として挙げられる。また、導入管に接続して、試料導入部を設けてもよい。

本発明の圧力付与手段接続部とは、圧力付与手段をカラムに接続するための部位をいう。本発明の圧力付与手段接続部は、圧力付与手段が直接に接続していてもよいし、排出管等の管やその他の接続部品等を介して間接的に接続してもよい。プレカラムと圧力付与手段の接続は、従来から液体クロマトグラフに採用されている公知の技術を広く採用できる。
圧力付与手段接続部を設ける位置は、プレカラムの圧力付与手段を作動させた（圧力をかけた）ときに、試料がプレカラムから分離カラムへ導入されるような位置に設けられていれば特に定めるものではない。
圧力付与手段を接続する管は任意の角度で圧力付与手段接続部に接続できる。また、圧力付与手段は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、１つであっても２つ以上設けていてもよい。もちろん、本発明の趣旨を逸脱しない限り、圧力付与手段接続部も１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。
圧力付与手段から付与される圧力は、分離カラムに対して線速度０．１〜１０ｍｍ／ｓｅｃで送流するものがより好ましい。
尚、本発明でいう圧力付与手段とは、例えば、分離カラムに対し圧力を付与する機能を有するものをいい、例えば、ポンプのほか、人がシリンジ等によって圧力を付与する場合、このシリンジ導入部も含む趣旨である。圧力付与手段に用いるポンプは、従来から液体クロマトグラフに採用されているポンプを広く採用できる。例えば、ＤｉＮａ（ＫＹＡテクノロジーズ製）、１１００シリーズナノポンプ（Ａｇｉｌｅｍｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）等を採用できる。
また、圧力付与手段を接続するための管の例としては、直径２０〜１００μｍ、高さ１００〜４００ｍｍの円筒形のものが挙げられる。
管の素材も特に定めるものではないが、５０ｂａｒ以上の耐圧を有しているものであることが好ましく、また、耐薬品性を有するものであることが好ましい。具体的には、ステンレス、チタンなどの金属、ＰＥＥＫ、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。

さらに、本発明の液体クロマトグラフは、プレカラムから廃液を排出する排出管を有する。排出管は、プレカラムに設けられた排出管接続部に直接に設けられていてもよいし、他の管等の接続部を介して間接的に設けられていてもよい。他の管を介して間接的に排出管が設けられている例として、前記圧力付与手段が有する管から分岐して排出管が設けられている態様が挙げられる。
排出管接続部に管を接続する場合、本発明の趣旨を逸脱しない限り、管は任意の角度で接続できる。また、排出管は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、１つであっても２つ以上設けていてもよい。もちろん、本発明の趣旨を逸脱しない限り、排出管接続部も１つであってもよいし、２つ以上であってもよい。
これらの排出管には、逆流を防ぐため、開閉切り換え部が設けられていることが極めて好ましい。開閉切り換え部としては、バルブが好ましい例として挙げられる。バルブは、導入管に記載のものを好ましく採用できる。
また、排出管の体積は、特に定めるものではないが、例えば、０．３〜２μＬのものが挙げられる。排出管の素材も特に定めるものではないが、好ましくは、導入管の素材と同様のものが好ましい例として挙げられる。

また、本発明の排出管接続部と、圧力付与手段接続部とは、同一の第一の接続部に接続していてもよい。ここでいう同一の第一の接続部とは、一の第一の接続部から直接的にまたは間接的に圧力付与手段と排出管が接続していることをいい、例えば、一つの第一の接続部から、管が設けられ、該管が分岐してその一方が圧力付与装置に接続し、他方が排出管に接続している場合も含まれる。この場合、分岐部（例えば、Ｔコネクタ）により分岐している構成とすることができる。

以下、図７および図８を参照して、本発明の好ましい圧力付与手段接続部および排出管接続部の配置例について説明する。尚、図７および図８中、１１は分離カラムを、１２はプレカラムを、１３は検出器を、１４は圧力付与手段が接続されている管を、１５は試料を導入する導入管を、１６は廃液が排出される排出管を、１７ａおよび１７ｂは開閉切り替え部をそれぞれ示している。
図７（ａ）は、圧力付与手段接続部が、プレカラム１２であって、分離カラム１１が設けられた側とは反対の側に、排出管接続部が、プレカラム１２の側面に設けられた例である。図７（ｂ）は、圧力付与手段接続部が、プレカラム１２の側面に、排出管接続部が、プレカラム１２であって、分離カラム１１が設けられた側とは反対の側に設けられた例である。図７（ｃ）は、圧力付与手段接続部および排出管接続部のいずれもがプレカラム１２の側面に設けられた例である。
図８は、１つの接続部が、圧力付与手段接続部および排出管接続部を兼ねる構成のものである。そして、図８（ａ）は、このような接続部が、プレカラム１２であって、分離カラム１１が設けられた側とは反対の側に設けられた例であり、（ｂ）はプレカラム１２の側面に設けられた例である。

分離カラムは、絶対的な寸法や形状に制限は無く、プレカラムの形状や試料の種類等によって適宜定めることができる。例えば、分離カラムの形状は、従来用いられている円筒型の他、角柱型、楕円筒型、切頭円錐型、切頭角錐型等であってもよい。また、本発明の分離カラムは、本発明の趣旨を逸脱しない範囲内において、湾曲等しているものであってもよい。
分離カラムの寸法も特に定めるものではないが、タンパク質などの微量分析・分離を行う場合の一例として、直径２０〜２５０μｍ、高さ２０〜１５０ｍｍの円筒形のものが挙げられる。
分離カラムの素材も特に定めるものではないが、５０ｂａｒ以上の耐圧を有しているものであることが好ましく、また、耐薬品性を有するものであることが好ましい。具体的には、ステンレス、チタンなどの金属、ＰＥＥＫ、ポリイミドなどのポリマー材料、ガラス、石英などおよびこれらを複合した材料等が挙げられる。

本発明の分離カラムには第二の充填材が充填されている。充填材は、従来から液体クロマトグラフに広く採用されているものを採用することができる。好ましい例としては、炭素原子数が、４、８、１８または２２の、化学結合球状シリカまたはモノリスシリカが挙げられる。特に、タンパク質を分離・分析する場合には炭素原子数が４または８の化学結合球状シリカまたはモノリスシリカが好ましく、ペプチドを分離・分析する場合には炭素原子数が８、１８または２２の化学結合球状シリカまたはモノリスシリカが好ましい。充填材の充填方法については、上記プレカラムと同様の方法が採用できる。

本発明のプレカラムと分離カラムの組み合わせは、背圧がプレカラムの背圧の２０倍以上、より好ましくは、３０倍以上であれば、特に制限は無い。このような背圧関係は、例えば、円筒型カラムの断面積と長さを調節することによって達成される。
プレカラムの体積は、分離カラムの体積の０．３〜１０倍であることが好ましく、０．５〜３倍であることがより好ましい。
また、プレカラムと分離カラムの断面比（試料の進行方向に垂直な断面）は、２：１以上であることが好ましい。このような構成とすることにより、圧力関係を保ちつつ、液体クロマトグラフの構造としてもより好ましいものとなる。尚、本発明では、プレカラムおよび／または分離カラムの断面が一定でないもの、例えば、切頭円錐形のもの等も採用できるが、この場合、断面の平均が該範囲内であることが好ましい。

上述したものの他、本発明のエレメントを液体クロマトグラフに用いる場合のプレカラム、分離カラム、導入管、圧力付与手段、排出管、その他液体クロマトグラフを構成する各種部品、ならびに、これらの接続部材等は、公知の液体クロマトグラフに用いるものを広く採用できる。例えば、High performance liquid chromatography, ed. by P. R. Brown, R. A.、Hartwick, John Wiley and sons, New York (1989)等に記載のものを採用できる。

本発明の液体クロマトグラフは、いわゆる濃度勾配溶出法で溶出されるものであれば特に定めるものではなく、特定の物質の分離、特定の物質の分析（質量分析等）に広く使用できる。
また、本発明の液体クロマトグラフで分離・分析できる試料は、一般的にこの種の液体クロマトグラフで分離・分析される試料であれば特に定めるものではなく、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、核酸等の生体分子分離・分析に好ましく用いることができる。また、試料の量は、通常のクロマトグラフィーにおいて用いられる量と同じ程度の量であってもよい。

本発明の液体クロマトグラフは、逆相クロマトグラフィーとして好ましく用いられる。
本発明で用いる溶離液は、プレカラムおよび分離カラムの充填材ならびに試料の種類に応じて適宜定めることができる。逆相液体クロマトグラフィーの場合には、ギ酸系、トリフルオロ酢酸系、ヘプタフルオロ酪酸系、酢酸系等が例として挙げられる。例えば、検出器が質量分析の場合、酢酸系、ギ酸系が好ましく、紫外線吸光検出器の場合、トリフルオロ酢酸系、ヘプタフルオロ酪酸系等が好ましい。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。

（１）カラム
分離カラムは、文献（Ｎａｔｓｕｍｅ，ｔ．ｅｔａｌ．Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４，４７２５−４７３３（２００２））に記載の方法に従って準備した。すなわち、ナノフロー用のＥＳＩカラム（分離カラム、内径０．２ｍｍ ｘ ５５ｍｍ）に、内径０．２ｍｍ、外経０．３７ｍｍの溶融シリカ細管をレーザープラーＰ−２０００（Sutter instruments製、Ｐ−２０００）で整形したカラム管にＭｉｇｈｔｙｓｉｌ Ｃ１８(１ｕｍ)（関東化学製）を充填して作製した。長めに充填して切り落としてすぐ接続した。
プレカラムは、ナノプレカラム(ＫＹＡテクノロジーズ製、内径０．５ｍｍ ｘ １ｍｍ)を用いた。充填材はＭｉｇｈｔｙｓｉｌ Ｃ１８(３ｕｍ) （関東化学製）を用いた。カラムパッキング用のスラリーＣＨ₂Ｃｌ₂とシクロヘキサノール（cyclohexanol）の混液に充填材を懸濁し、１０分間、超音波処理した。このスラリーを、ピークチューブを用いて自作したカラムパッカーに吸引して、１０ＭＰａで１５分間圧力を印加して充填した。
プレカラムと分離カラム、および配管の接続はＤｕａｌ−Ｌｕｍｅｎ Ｓｉｌｉｃａ ＳｅａｌＴｉｇｈｔ Ｔｕｂｉｎｇ Ｓｌｅｅｖｅ（Upchurch scientific製、Ｆ−２３５Ｘ）を用いた。また、プレカラム端であって分離カラム側に０．３μｍステンレスメッシュ（富士フィルター製）を設けた。
導入管および排出管は溶融シリカ細管（順に、内径７５μｍ、長さ１５０ｍｍ、内径７５μｍ、長さ１００ｍｍ、）を用いた。

（２）試料
試料は、牛血清アルブミントリプシン消化物（ＫＹＡテクノロジーズ製）を用いた。濃度１０ｆｍｏｌ／μＬのものを１０μＬ導入した(計１００ｆｍｏｌ)。
（３）溶離液系
Ａ溶液 ０．０７５％ ギ酸水溶液
Ｂ溶液 ８０％ アセトニトリル／０．０７５％ ギ酸水溶液
エレクトロスプレー法で効率的にイオン化するために、ギ酸系の溶離液を用いた。

（４）液体クロマトグラフィー質量分離
液体クロマトグラフは、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズのナノフローポンプ（Ａｇｉｌｅｎｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｏｓ製）をマイクロフローモードで用いた。質量分離計はサーモエレクトロン社のＬＣＱにナノフロー用のイオン源（自家製）を装着して用いた。ペプチドの溶離条件は流速２００ｎＬ／分、Ｂ溶液濃度を１〜５０％まで５０分で直線的に上昇させた。測定質量範囲はｍ／ｚ５００−８００とした。典型的なスキャン時間は０．５秒であった。

実験結果
図３に、本発明の液体クロマトグラフを用いた牛血清アルブミントリプシン消化物のＬＣ−ＭＳクロマトグラムを示した。表１に図３中の矢印で示した２０種類のピークのピーク半値幅（ピーク高の５０％高さでのピーク幅）を示した。表１に示すとおり、本発明の液体クロマトグラフを用いた場合、典型的なピーク幅は４．８〜１０．２秒の範囲であった。
これに対し、試料や充填材については、同じものを採用した同じ濃度勾配溶離条件で図４に記載の装置で分離すると、典型的なピーク幅は１５秒程度であった。
以上より、本発明の液体クロマトグラフは、高い分解能を有することが認められた。
特に、試料が微量しかないものについて、本発明の液体クロマトグラフは有効であることが示唆される。

Claims (19)

1. プレカラムと、該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムとを有する、液体クロマトグラフ用エレメント。
2. プレカラムと、
   該プレカラムに連続して直列に設けられた分離カラムと、
   前記プレカラムに設けられた、圧力付与手段を接続するための管および／または前記プレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部と、
   前記プレカラムに設けられた、前記プレカラムに試料を導入する導入管を接続するための第二の接続部とを有する、エレメント。
3. 前記第一の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側とは反対の側に設けられ、前記第二の接続部が、前記プレカラムに、前記分離カラムが設けられた側に設けられている、請求項２に記載のエレメント。
4. 前記圧力付与手段を接続するための管を接続するための第一の接続部と、前記プレカラムから廃液を排出するための排出管を接続するための第一の接続部とをそれぞれ有する、請求項２または３に記載のエレメント。
5. 圧力付与手段を接続するための管と、排出管とが設けられており、かつ、前記圧力付与手段を接続するための管と前記排出管とは、同一の第一の接続部に設けられている、請求項２または３に記載のエレメント。
6. 前記第一の接続部には、管が設けられており、該管が分岐して、圧力付与手段および排出管が設けられている、請求項２または３に記載のエレメント。
7. 前記排出管には、開閉切り換え部が設けられている、請求項４〜６のいずれか１項に記載のエレメント。
8. 前記第二の接続部に導入管が設けられている、請求項２〜７のいずれか１項に記載のエレメント。
9. 前記導入管には、開閉切り換え部が設けられている、請求項８に記載のエレメント。
10. 前記導入管の体積が、０．３〜２μＬである、請求項８または９に記載のエレメント。
11. 前記プレカラムの少なくとも前記分離カラム側には、メッシュ部が設けられている、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のエレメント。
12. 前記プレカラムの前記分離カラム側およびその反対側に、それぞれ、メッシュ部が設けられている請求項１〜１１のいずれか１項に記載のエレメント。
13. 分離カラムに対して線速度０．１〜１０ｍｍ／ｓｅｃで送流する圧力付与手段を有する、請求項２〜１２のいずれか１項に記載のエレメント。
14. 前記プレカラムが、直径０．１〜１ｍｍ、高さ１〜２０ｍｍの円筒形である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のエレメント。
15. 前記分離カラムは、直径２０〜２５０μｍ、高さ２０〜１５０ｍｍの円筒形である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のエレメント。
16. 前記プレカラムの体積は、前記分離カラムの体積の０．３〜１０倍である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のエレメント。
17. 液体クロマトグラフに用いる、請求項２〜１６のいずれか１項に記載のエレメント。
18. 請求項２〜１６のいずれか１項に記載のエレメントを有する液体クロマトグラフ。
19. 請求項１７または１８に記載の液体クロマトグラフを用いる、液体クロマトグラフィー。

Images