WO2006035770A1 - 誘導体の合成方法、化合物ライブラリー及びその作製方法、並びに、スクリーニング方法 - Google Patents

誘導体の合成方法、化合物ライブラリー及びその作製方法、並びに、スクリーニング方法 Download PDF

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microorganism
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culture solution
organic compound
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Masaya Imoto
Hiromichi Ohta
Kenji Miyamoto
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Keio University
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing a derivative of an organic compound produced by a microorganism, a compound library containing the derivative, a method for producing the compound library, and a screening method using the compound library.
  • libraries of natural compounds isolated and purified from microbial cultures are used in many pharmaceuticals and pharmaceutical lead compounds (eg, penicillin, tacrolimus (FK-506), pravastatin, etc.) ) has been found.
  • pharmaceutical lead compounds eg, penicillin, tacrolimus (FK-506), pravastatin, etc.
  • natural compounds have a variety of activities and unique structures. Therefore, a library of natural compounds is extremely useful in searching for lead compounds. It is thought that there is.
  • Naturally-derivative derivatives libraries are also considered to be useful in efficiently searching for excellent drugs, and there is a demand for the construction of libraries containing natural-derivative derivatives.
  • the present invention provides a method for synthesizing a derivative of a natural compound, which is useful for random screening by HTS (high throughput), search for pharmaceuticals or agricultural chemicals, and search for lead compounds of pharmaceuticals or agricultural chemicals.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a compound library containing a derivative of a natural compound, a compound library containing a derivative of a natural compound, and a screening method using a compound library.
  • Streptomyces sp. MK9 29-43F1 is cultured as a reaction reagent and oxidized with a dione reagent (Jone, s ) or a compound that oxidizes the compound.
  • Acetone Zoxone monopersulfate was added and reacted.
  • the extract obtained by extracting the culture fluid force with ethyl acetate is fractionated by high performance liquid chromatography (HPLC), while reacting with a reaction reagent, the extract of the culture fluid is fractionated by HPLC,
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the substances contained in the extract of the culture broth reacted with the reaction reagent, but not in the extract of the fermented broth culture solution reacted with the reaction reagent was identified and recovered.
  • the culture solution reacted with Diones reagent was found to be an acid compound of the compound represented by the following formula (1) (the following formula (2)).
  • a compound (the following formula (3)) in which the compound represented by the following formula (1) is epoxidized is obtained. I found.
  • the method according to the present invention is a method for synthesizing a derivative of an organic compound produced by a microorganism, wherein the microorganism is cultured using a predetermined culture solution, and the microorganism is obtained by culturing the microorganism.
  • the reaction between the organic compound and the reaction reagent may be performed by culturing the microorganism in the culture solution containing the reaction reagent, or the culture solution substantially free of the reaction reagent.
  • the organic compound may be produced by culturing the microorganism in the medium, and the reaction reagent may be added to a culture solution in which the microorganism is cultured.
  • the method according to the present invention is a method for producing a compound library containing a derivative of an organic compound synthesized by reacting an organic compound produced by a microorganism with a reaction reagent, the reaction Included in the culture broth of the microorganism containing the reagent! However, the method includes recovering the compound, which is substantially free of the reaction reagent and contained in the culture solution, as a component of the compound library.
  • the compound library according to the present invention is a compound library including a derivative of the organic compound synthesized by reacting an organic compound produced by a microorganism with a reaction reagent, and includes the reaction reagent. A force that can be contained in the culture medium in which the microorganism is cultured. A compound that is substantially free of the reaction reagent is collected and collected as a component of the compound library. Can do.
  • the screening method according to the present invention is a compound having a physiological activity using a compound library containing a derivative of the organic compound synthesized by reacting an organic compound produced by a microorganism with a reaction reagent.
  • the compound library is contained in a culture solution obtained by culturing the microorganism containing the reaction reagent, but is substantially free of the reaction reagent! /, Culture solution.
  • the method includes collecting the compound and making it as a component of the compound library.
  • the screening method according to the present invention is a method for screening a therapeutic agent using a compound library containing a derivative of the organic compound synthesized by reacting an organic compound produced by a microorganism with a reaction reagent.
  • Each compound in the compound library is administered to a disease model animal other than a human and the ability to improve the symptoms of the disease by administering the compound is evaluated.
  • the microorganism containing the reaction reagent is contained in the culture medium in which the microorganism is cultured! Although it is contained in the culture liquid that does not substantially contain the reaction reagent, the compound is recovered and the This includes making it as a component of a compound library.
  • the culture solution substantially free of the above-described reaction reagent is a culture solution for culturing the above-described microorganism, and may be a culture solution before culturing the above-mentioned microorganism. It may be a culture solution after culturing.
  • the above-described culture medium containing the reaction reagent contains a culture medium in which the reaction reagent is cultured, the recovery of the complex compound that is substantially contained in the culture medium and that contains the reaction reagent It is also possible to identify and carry out by fractionating the compound contained in the culture solution in which the microorganism containing sucrose is cultured and / or the compound contained in the culture solution substantially free of the reaction reagent.
  • a culture solution obtained by culturing the microorganism containing the above-mentioned reaction reagent may be obtained by reacting an organic compound with the reaction reagent by culturing the microorganism in a culture solution containing the reaction reagent.
  • Substantially contains reaction reagents The organic compound is produced by culturing the microorganism in the culture medium, and the reaction between the organic compound and the reaction reagent is performed by adding the reaction reagent to the culture liquid containing the organic compound produced by the microorganism. It is good as well.
  • the microorganism described above may be, for example, a mutant in which a gene involved in the organic compound production process is mutated.
  • the gene manipulation involved in the organic compound production process may be performed. It may be a transformant that has been applied!
  • Examples of the mutant in which a gene involved in the production process of the organic compound has been mutated include a mutant into which the mutation has been artificially introduced by ultraviolet irradiation, X-ray irradiation, or chemical administration. May be a spontaneous mutant! / ⁇ .
  • microorganism refers to a microscopic organism, for example, archaea, eubacteria, archaea, protozoa, chromistas, fungi (fungi), microbes Includes animals and plants.
  • Archaea are also known as archaea or metazoans, and include, for example, highly halophilic bacteria, thermophilic archaea, and methane bacteria (methane-producing archaea).
  • eubacteria include, for example, most bacteria such as Escherichia coli and actinomycetes.
  • Arcezoas means eukaryotes that can live without molecular enzymes (peroxynome), for example, Trichomonas.
  • Protozoa means mononuclear unicellular organisms, and includes, for example, algae, sphagnum fungi, deformed fungi (true slime molds), and cellular slime molds.
  • Chromistas refer to a group of organisms characterized in that chloroplasts have two more membranes outside the two chloroplast envelopes, and are enveloped by a total of four membranes. For example, Sakagebo mold, oomycete, Labyrinthura and the like are included.
  • Fungi include ascomycetes, zygomycetes, basidiomycetes, incomplete fungi, and the like, for example, fungi, mushrooms, and yeasts.
  • the microorganisms included in the technical scope of the present invention are not limited to the biological species shown here, and may be any biological species as long as the same treatment as the above biological species such as culture can be performed.
  • reaction reagents include oxidation reaction reagents, reduction reaction reagents, epoxidation reaction reagents, dihydroxylation reaction reagents, oxidative cleavage reaction reagents, hydrogenation reaction reagents, etherification reaction reagents, halogens.
  • Group consisting of sulfation reaction reagent, nitration reaction reagent, sulfonation reaction reagent, diazo reaction reagent, aldol reaction reagent, and alkyl reaction reagent Force is also selected Force that can use one or more reagents is not limited to these.
  • reaction reagent refers to a reagent that synthesizes a derivative by reacting with an organic compound produced by a microorganism.
  • oxidation reaction reagent "reduction reaction reagent”, “epoxidation reaction reagent”, “dihydroxylation reaction reagent”, “etherification reaction reagent”, “halogenation reaction reagent”, “nitration reaction reagent” ”,“ Sulfony reaction reagent ”,“ Diazo reaction reagent ”, and“ Alkylation reaction reagent ”refer to reaction substrates such as organic compounds produced by microorganisms by oxidation, reduction, epoxidation, dihydroxy, respectively.
  • Reagents that can be isomerized, etherified, halogenated, nitrated, sulfonated, diazotized or alkylated.
  • the "oxidative cleavage reagent” refers to a reagent that cleaves an organic compound by oxidation.
  • Hydrogenation reaction reagent refers to a reagent that substitutes a functional group of an organic compound produced by a microorganism with hydrogen, or adds hydrogen to an organic compound produced by a microorganism.
  • aldol reaction reagent means that the aldol or aldol power is easily derived by nucleophilic addition of ketones, aldehydes or esters having the same or different structure to the ketones or aldehydes of organic compounds produced by microorganisms. Reagents that produce compounds.
  • these reagents may be anything as long as they have the above-described effects.
  • these reagents may include a compound that directly reacts with a target organic compound or a compound having a catalytic action. Moreover, you may include both.
  • FIG. 1 In one example of the present invention, an extract (upper stage) of a culture solution of Streptomyces sp. MK929-43F1 that was not reacted with a diones reagent and acetone Zoxon monopersulfate was reacted with a diones reagent.
  • the separation pattern between the extract of the culture solution of Streptomyces sp. MK929-43F1 (middle) and the extract of the culture solution of Streptomyces sp. MK929-43F1 (lower) reacted with acetone Zoxone monopersulfate is shown.
  • FIG. FIG. 2 shows the result of 1 ! "I-NMR analysis of the structure of a substance contained in an extract of a culture solution of Streptomyces sp. M K929-43F1 reacted with Diones reagent in an example of the present invention.
  • FIG. 3 the structure of a substance contained in an extract of a culture solution of Streptomyces sp. MK929-43F1 reacted with acetone Zoxone monopersulfate is 1 ! ”I-NMR. It is a figure which shows the result analyzed by this.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of examining the cell migration ability inhibitory activity of migrastatin and acid migrastatin according to an example of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of examining the effects of migrastatin and acid migrastatin on ATP synthesis according to an example of the present invention.
  • a microorganism is used in a predetermined culture solution.
  • the organic compound obtained by culturing the microorganism and the reaction reagent for synthesizing the derivative of the organic compound are reacted in the culture solution.
  • Microorganisms used in the present invention are fungi (generally fungi 'mushrooms' yeast), bacteria (prokaryotic unicellular organisms), as long as they produce organic compounds as metabolites under culture conditions. Any of deformed fungi (true slime molds) may be used. For example, ascomycetous fungi (yeast, akapanbi koji mold, mushroom truffle, etc.), zygomycetes (mushroom, mushroom fungi, etc.), basidiomycetes (matsutake mushrooms, etc.), incomplete fungi (botrysis, etc.), fungi (Endemic fungi); eubacteria (eg, E.
  • mutant strains in which genes involved in the production process of organic compounds have been mutated.
  • This mutant is a transformant in which a gene that has been genetically manipulated is introduced into a gene involved in the production process of an organic compound, whether it is a mutant that has been artificially introduced by ultraviolet rays, X-rays, or chemical agents. However, it may be a spontaneous mutant.
  • Culture of these microorganisms may be performed by a culture method usually used for each microorganism.
  • a culture medium used for the culture a synthetic medium, a semi-synthetic medium, or a natural medium can be used as long as it is a medium in which the microorganism to be used can grow.
  • nutrients to be added to the culture medium those known as nutrient sources for microorganisms can be used.
  • the carbon source commercially available molasses, glucose, maltose, fructose, man-tol, potato starch, corn starch, dextrin, soluble starch, etc., or fats and oils, etc. are used as nitrogen sources.
  • peptones such as Na, K, Mg, Ca, Zn, Fe, Mn, Co and Cu
  • hydrochloride, nitrate, phosphate, carbonate and the like can be added as necessary.
  • amino acids such as palin, leucine, isoleucine, ferrolanine, tryptophan, methionine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, Secondary metabolite production-promoting substances or antifoaming agents such as tamins, oleic acid, methyl oleate, lard oil, silicone oil, and surfactants can be used as appropriate.
  • any additive can be used as long as it is used by microorganisms and is useful for the production of secondary metabolites.
  • the culture method may be the same as the microorganism culture method in the production of secondary metabolites, and the culture method may be solid culture or liquid culture. In the case of liquid culture, static culture, shaking culture, or stirring culture may be performed.
  • an organic compound that is a secondary metabolite is produced.
  • a derivative of the organic compound can be obtained by reacting a reaction reagent for synthesizing the derivative of the organic compound with the organic compound in the culture solution.
  • the derivative thus obtained is very likely to be a novel compound having a unique structure, and can also be expected to have an activity not found in nature.
  • reaction can be used as long as it can convert the functional group and skeleton of an organic compound that is a secondary metabolite. It is not limited to or reagents.
  • each reaction can be combined in two or more stages.
  • H H, H / catalyst (eg Rh, Ru, Pd)
  • Olephine dihydroxylation OsO, KMnO, R-CO H / H +, etc.
  • Olefin acid-cleavage reaction O, NalO, etc.
  • microorganisms can be cultured in a culture solution containing a reaction reagent added in advance, or the reaction reagent can be substantially It is also possible to cultivate the microorganisms in a culture solution that does not contain the reaction, and add a reaction reagent to the culture solution in which the microorganisms are cultured.
  • the latter method of adding a reaction reagent after culturing includes, for example, a method in which a synthetic reagent is added as it is to a microorganism culture solution, or a microorganism culture solution containing microorganisms or centrifugation.
  • a synthetic reagent is added to the extract obtained by adding an organic solvent that is not miscible with water, such as ethyl acetate, chloroform, benzene, toluene, or ether, to the culture filtrate obtained by filtration.
  • an organic solvent that is not miscible with water such as ethyl acetate, chloroform, benzene, toluene, or ether.
  • a compound library can be prepared by recovering derivatives of organic compounds synthesized by reacting organic compounds produced by microorganisms with various reaction reagents. For example, if a compound that is not contained in a culture solution that does not substantially contain a reaction reagent is identified and recovered, the derivative of the organic compound is concentrated. Libraries can be created.
  • the library contains not only derivatives of organic compounds produced by microorganisms but also organic compounds themselves. Can be made.
  • the reaction reagent is added, but the culture solution is used so that derivatives of organic compounds produced mainly by the microorganism can be obtained. Libraries that can be identified and that contain such derivatives at high frequency.
  • Methods for identifying and isolating organic compounds and Z or derivatives of organic compounds produced by microorganisms include, for example, column chromatography using silica gel, ODS, Toyopearl HW-40, and centrifugal liquid-liquid partition chromatography. There are conventional methods such as chromatography, thin layer chromatography, and high performance liquid chromatography (HPLC). Using these methods, the compound contained in the culture medium in which the microorganism containing the reaction reagent is cultured and the compound contained in the culture solution that does not substantially contain the reaction reagent! By comparing these fractionation patterns, the organic compound to be recovered and Z or a derivative of the organic compound can be identified, and isolation can be easily performed.
  • the recovered compounds may be mixed or used separately depending on the purpose.
  • the following method may be used when it takes time to identify individual compounds in order to identify compounds having physiological activity. First, divide the library into several pools, and identify the pools whose intermediate strength is also active. Furthermore, the compounds contained in the pool are divided into several subpools, and similarly, active subpools are identified. By repeating this, the target compound can be identified with a small number of times.
  • the compound constituting the library includes mass spectrum, multiple mass spectrum, ultraviolet and visible absorption spectrum, proton nuclear magnetic resonance spectrum, carbon 13 nuclear magnetic resonance spectrum.
  • the structure can be determined by a known structural analysis method using a tuttle, an infrared absorption spectrum, an X-ray crystal spectrum, or a combination of these methods.
  • the compound thus determined can be dried under reduced pressure and stored in a cool dark place such as a refrigerator.
  • various screenings can be performed for the purpose of obtaining a compound having physiological activity.
  • the compound having physiological activity include an enzyme inhibitor, a ligand Z receptor binding inhibitor, an angiogenesis inhibitor, a cell adhesion inhibitor, a gene expression inhibitor, a growth factor-like active substance, and the like.
  • the enzyme inhibitor include a tyrosine kinase inhibitor, a cycloxygenase (COX) inhibitor, a telomerase inhibitor, a matrix taroprotease inhibitor, a prostaglandin D synthesis inhibitor, a phosphodiesterase inhibitor, Cholinesterase inhibitors, viral protease inhibitors, reverse transcriptase inhibitors and the like.
  • the receptor is, for example, an adrenergic receptor, a histamine receptor, a lipotriene receptor, an opioid receptor, or the like.
  • nuclear magnetic resonance spectra (1H-NMR and 13 C-NMR) were measured using JNM-AL300 (manufactured by JEOL). Each reaction was performed in argon unless otherwise specified.
  • Streptomyces sp. MK 929-43F1 which synthesizes the compound represented by the above formula (1) (migrastatin), is cultured in 2% dextrin, 2% glycerol, 1% soypeptone, 0.3% yeast exoxide, 0.2% sulfuric acid. After culturing at 27 ° C for 4 days in ammonia, 0.2% calcium carbonate, pH 7.4), the supernatant was obtained by centrifugation. To the obtained culture supernatant 60 1, 164 mg / ml Diones reagent 30 1 was added and stirred at 25 ° C. for 1 minute. In addition, as a control, a filtrate that does not allow dione reagent to be prepared was prepared.
  • the mixture was saturated, and 20 ⁇ g / ml oxon monopersulfate (dissolved in acetone) 100 ⁇ 1 was added, followed by stirring at room temperature for 3 hours.
  • a solution that did not contain acetone oxon monopersulfate was prepared.
  • the mixture was extracted with ethyl acetate 6001, the extract was concentrated under reduced pressure and dried, the dried product was dissolved in methanol 3001, and the resulting crude product was subjected to high performance liquid chromatography (column; SenshuPAK ODS C18 150).
  • RPMI 1640 medium containing 1% serum FBS; manufactured by Tissue Culture Biologicals
  • migrastatin or acid migrastatin was added and cultured at 37 ° C for 24 hours.
  • those cultured in a culture solution without adding migrastatin or acid mydalastatin were also prepared. After culturing, the cells were observed under a microscope to confirm how much the wounds damaged by the micropipette tip were filled with the cells that migrated by the surrounding force, and the cell migration ability was evaluated. The results are shown in Fig. 4.
  • acid migrastatin which is a derivative of migrastatin, can also inhibit the migration ability of tumor cells in the same manner as migrastatin. Further, it has become clear that a derivative of a certain compound may have the same activity as the original compound.
  • luciferase luciferin 40 ⁇ l of 4 mg / ml luciferase luciferin (Sigma) was added, and the ATP amount was immediately measured with a single photon monitor of a liquid scintillation counter (LS-5000TD: BECKMAN COULTER). The blank value was measured under the condition that the sample and luciferase luciferin were not added, and all data power was also subtracted. The results are shown in Fig. 5.
  • a derivative of a microbial product useful for random screening by HTS (high-throughput), search for pharmaceuticals or agrochemicals, and search for lead compounds of pharmaceuticals or agrochemicals is provided.
  • a synthesis method, a library containing a derivative of a microbial product, a preparation method, a compound library containing a derivative of a microbial product, and a screening method using the compound library can be provided.

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Abstract

【課題】ＨＴＳによるランダムスクリーニング、医薬品又は農薬品の探索、及び医薬品又は農薬品のリード化合物の探索などに有用な、天然化合物の誘導体を合成する方法、天然化合物の誘導体を含む化合物ライブラリーの作製方法、及び天然化合物の誘導体を含む化合物ライブラリー、並びに、化合物ライブラリーを用いたスクリーニング方法を提供すること。 【解決手段】有機化合物を生産する微生物を所定の培養液で培養し、培養により得られた有機化合物と、前記有機化合物の誘導体を合成するための反応試薬とを、前記培養液中で反応させることにより、前記有機化合物の誘導体を合成することができる。このようにして得られた有機化合物の誘導体をライブラリー化することにより、ＨＴＳ（ハイスループット）によるランダムスクリーニング、医薬品又は農薬品の探索、及び医薬品又は農薬品のリード化合物の探索などが可能になる。

Description

明 細 書
誘導体の合成方法、化合物ライブラリー及びその作製方法、並びに、スク リーニング方法
技術分野
[0001] 本発明は、微生物が生産する有機化合物の誘導体の合成方法、前記誘導体を含 む化合物ライブラリー及びその作製方法、並びに前記化合物ライブラリーを用いたス クリーニング方法に関する。 背景技術
[0002] 医薬品や農薬の開発において、リードィ匕合物などの生理活性物質を探索するため に、市販の化合物ライブラリーや、コンビナトリアルシンセシスによる化合物ライブラリ 一（例えば、特表 2001— 518053号公報及び特表 2002— 502393号公報参照）な どを用いたスクリーニングが行われている（例えば、特表 2002— 514612号公報、特 表 2002— 517474号公報、及び特表 2003— 521673号公報参照）が、有用な化 合物が効率よく見出されないのが現状である。
[0003] 一方、微生物の培養液から単離 ·精製された天然ィ匕合物のライブラリ一力 は、多く の医薬品や医薬品のリード化合物（例えば、ペニシリン、タクロリムス（FK-506)、プラ パスタチンなど）が見出されている。このように、天然ィ匕合物は活性の多様性や構造 のユニークさを有して 、ることから、天然ィ匕合物のライブラリ一はリードィ匕合物を探索 する上で、極めて有用であると考えられている。
[0004] また、天然ィ匕合物をィ匕学的に修飾した誘導体の中には、天然化合物より生理活性 が優れているものや、毒性が弱いもの、又は副作用が少ないものが見出されており、 天然ィ匕合物の誘導体のライブラリーも、優れた医薬品を効率よく探索する上で有用 であるとされており、天然ィ匕合物の誘導体を含むライブラリーの構築が求められてい る。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0005] し力しながら、天然ィ匕合物は単離 ·精製に時間が力かるだけでなぐ医薬品として有 用なリードィ匕合物を見出すことが困難であることから、天然ィ匕合物やその誘導体をラ イブラリー化することは困難であった。
[0006] また、ライブラリーを構築するための天然ィ匕合物の誘導体の合成においては、天然 化合物を単離した場合、その化合物に適した修飾方法を特定するため、その構造を 明らかにする必要があり、また、誘導体を合成する際の反応条件を検討する必要が あるため、誘導体の合成に時間が力かるという問題があった。そのため、迅速な誘導 体の合成方法の開発が求められている。
[0007] そこで、本発明は、 HTS (ハイスループット）によるランダムスクリーニング、医薬品 又は農薬品の探索、及び医薬品又は農薬品のリードィ匕合物の探索などに有用な、 天然化合物の誘導体を合成する方法、天然化合物の誘導体を含む化合物ライブラリ 一の作製方法、及び天然化合物の誘導体を含む化合物ライブラリー、並びに、化合 物ライブラリーを用いたスクリーニング方法を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0008] 本発明者らは、上記課題を解決すベぐ天然化合物やその誘導体をライブラリー化 することを試みた。まず、下式 (1)で表される化合物を合成する Streptomyces sp. MK9 29- 43F1を培養した培養液に、反応試薬として、化合物を酸化させるジヨーンズ (Jone ， s)試薬又は化合物をエポキシィ匕させるアセトン Zォキソンモノパーサルフェートを 添加して反応させた。その後、酢酸ェチルで培養液力も抽出した抽出物を高速液体 クロマトグラフィー（HPLC)で分画する一方、反応試薬と反応させて 、な 、前記培養 液の抽出物を HPLCで分画し、それらの分離パターンを比較することにより、反応試 薬を反応させた培養液の抽出物には含まれており、反応試薬を反応させて ヽな ヽ培 養液の抽出物には含まれていない物質を同定して回収した。この回収した物質の構 造を解析した結果、ジヨーンズ試薬を反応させた培養液カゝらは、下式 (1)で表される化 合物の酸ィ匕物（下式 (2))が得られ、アセトン Zォキソンモノパーサルフェートを反応さ せた培養液からは、下式 (1)で表される化合物がエポキシ化されたィ匕合物（下式 (3)) が得られることを見出した。
[0009] このことから、培養液に誘導体を合成するための反応試薬を添加すれば、微生物 が生産する有機化合物の誘導体を迅速に得られることが明らかとなり、こうして、本発
Figure imgf000004_0001
[0010] すなわち、本発明に係る方法は、微生物が生産する有機化合物の誘導体を合成 する方法であって、前記微生物を所定の培養液を用いて培養し、前記微生物の培養 により得られた有機化合物と、前記有機化合物の誘導体を合成するための反応試薬 とを、前記培養液中で反応させることを含む。なお、前記有機化合物と前記反応試薬 との反応は、前記反応試薬を含む前記培養液中で前記微生物を培養することにより 行うこととしてもよいし、前記反応試薬を実質的に含まない前記培養液中で前記微生 物を培養することにより前記有機化合物を生産させ、前記微生物を培養した培養液 に前記反応試薬を添加することにより行うこととしてもよい。
[0011] また、本発明に係る方法は、微生物が生産する有機化合物を反応試薬と反応させ ることにより合成される前記有機化合物の誘導体を含む化合物ライブラリーの作製方 法であって、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて！/ヽるが、 前記反応試薬を実質的に含まな 、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を回収し、前記 化合物ライブラリーの構成要素とすることを含む。 [0012] さらに、本発明に係る化合物ライブラリ一は、微生物が生産する有機化合物を反応 試薬と反応させることにより合成される前記有機化合物の誘導体を含む化合物ライブ ラリーであって、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて ヽる 力 前記反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれていない化合物を回収し、前 記化合物ライブラリーの構成要素とすることにより作製することができる。
[0013] また、本発明に係るスクリーニング方法は、微生物が生産する有機化合物を反応試 薬と反応させることにより合成される前記有機化合物の誘導体を含む化合物ライブラ リーを用いた生理学的活性を有する化合物のスクリーニング方法であって、前記化 合物ライブラリ一は、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて V、るが、前記反応試薬を実質的に含まな!/、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を回収し 、前記化合物ライブラリーの構成要素とすることにより作製されることを含む。
[0014] さらに、本発明に係るスクリーニング方法は、微生物が生産する有機化合物を反応 試薬と反応させることにより合成される前記有機化合物の誘導体を含む化合物ライブ ラリーを用いた治療薬のスクリーニング方法であって、前記化合物ライブラリーの個々 の化合物をヒト以外の疾患モデル動物に投与し、前記化合物の投与により前記疾患 の症状が改善された力どうかを評価する工程を含み、前記化合物ライブラリ一は、前 記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ゝるが、前記反応試薬 を実質的に含まな 、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を回収し、前記化合物ライブラ リーの構成要素とすることにより作製されることを含む。
[0015] なお、上述の反応試薬を実質的に含まない培養液は、上述の微生物を培養するた めの培養液であって、上述の微生物の培養を行う前の培養液であっても、培養した 後の培養液であってもよい。また、上述の、反応試薬を含む微生物を培養した培養 液に含まれて ヽるが、反応試薬を実質的に含まな ヽ培養液に含まれて ヽな ヽィ匕合 物の回収は、反応試薬を含む微生物を培養した培養液に含まれて!/ヽる化合物及び 反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれている化合物をそれぞれ分画すること により同定して行うこととしてもよい。また、上述の反応試薬を含む前記微生物を培養 した培養液は、反応試薬を含む培養液中で微生物を培養することにより有機化合物 と反応試薬との反応を行うことにより得ることとしてもよいが、反応試薬を実質的に含 まない培養液中で微生物を培養することにより有機化合物を生産させ、微生物が生 産した有機化合物を含む培養液に反応試薬を添加することにより有機化合物と反応 試薬との反応を行うことにより得ることとしてもよい。
[0016] また、上述の微生物としては、例えば、有機化合物の生産過程に関与する遺伝子 に変異を生じさせた変異体であってもよいが、有機化合物の生産過程に関与する遺 伝子操作を施した形質転換体であってもよ!ヽ。前記有機化合物の生産過程に関与 する遺伝子に変異が生じた変異体としては、例えば、紫外線照射、 X線照射、若しく は化学薬品投与により、人為的に変異が導入された変異体であってもよいが、自然 突然変異体 (spontaneous mutant)であってもよ!/ヽ。
[0017] なお、本明細書において「微生物」とは、微小な生物のことであり、例えば、古細菌 類、真正細菌類、ァーケゾァ類、原生動物類、クロミスタ類、菌類 (真菌類)、微小な 動植物などを含む。古細菌類は、別名、始原菌ゃ後生細菌とも呼ばれ、例えば、高 度好塩菌、好熱古細菌、メタン菌 (メタン生成古細菌)などを含む。また、真正細菌類 は、例えば、大腸菌、放線菌など殆どの細菌がここに含まれる。ァーケゾァ類とは、分 子酵素（ペルォキシノーム)なしで生きられる真核生物を意味し、例えば、トリコモナス
、ェンテロモナス、ォキシモナス、微胞子虫、ネグレリア、ディプロモナスなどが含まれ る。原生動物類とは単核単細胞生物を意味し、例えば、藻類、ミズカビ類、変形菌（ 真正粘菌）、細胞性粘菌などが含まれる。クロミスタ類とは、葉緑体が 2枚の葉緑体膜 (chloroplast envelope)の外側にさらに 2枚の膜があって、合計 4枚の膜に包まれるこ とを特徴とする生物群を意味し、例えば、サカゲッボカビ、卵菌、ラビリンチユラなどが 含まれる。菌類 (真菌類)は、子嚢菌、接合菌、担子菌、不完全菌などを含み、例え ば、カビ類、キノコ類、酵母類力これに含まれる。なお、本発明の技術的範囲に含ま れる微生物とは、ここに示された生物種に限られず、培養など上記生物種と同様な処 理ができれば、どのような生物種であってもよい。
[0018] 上述の反応試薬としては、例えば、酸化反応試薬、還元反応試薬、エポキシ化反 応試薬、ジヒドロキシ化反応試薬、酸化的解裂反応試薬、水素添加反応試薬、エー テル化反応試薬、ハロゲン化反応試薬、ニトロ化反応試薬、スルホン化反応試薬、ジ ァゾィ匕反応試薬、アルドール反応試薬、及びアルキルィ匕反応試薬カゝらなるグループ 力も選ばれる 1又は 2以上の試薬を用いることができる力 これらに限定されるもので はない。
[0019] ここで、「反応試薬」とは、微生物が生産する有機化合物に反応し、誘導体を合成 する試薬をいう。
[0020] 特に、「酸化反応試薬」、「還元反応試薬」、「エポキシ化反応試薬」、「ジヒドロキシ 化反応試薬」、「エーテル化反応試薬」、「ハロゲン化反応試薬」、「ニトロ化反応試薬 」、 「スルホンィ匕反応試薬」、「ジァゾィ匕反応試薬」、「アルキル化反応試薬」とは、微生 物が生産する有機化合物のような反応基質を、それぞれ、酸化、還元、エポキシ化、 ジヒドロキシ化、エーテル化、ハロゲン化、ニトロ化、スルホン化、ジァゾ化、アルキル 化する試薬をいう。
[0021] また、「酸化的開裂反応試薬」とは、有機化合物を酸ィ匕して開裂させる試薬をいう。
「水素添加反応試薬」とは、微生物が生産する有機化合物の官能基を水素に置換し たり、微生物が生産する有機化合物に水素を付加したりする試薬をいう。また、「アル ドール反応試薬」とは、微生物が生産する有機化合物のケトンやアルデヒドに、同一 または異なる構造を有するケトンやアルデヒドまたはエステル等を求核付加させて、 アルドールまたはアルドール力 容易に導かれる化合物を生成させる試薬を 、う。
[0022] なお、これらの試薬は、上記作用を有する試薬であれば何でもよぐ例えば、対象と する有機化合物と直接反応する化合物を含んでいても、触媒作用を有する化合物を 含んでいても、また両方含んでいてもよい。
[0023] 関連文献とのクロスリファレンス
本願は、 2004年 9月 27日付けで出願した日本国特願 2004-279597号に基づく優先 権を主張する。この文献を本明細書に援用する。
図面の簡単な説明
[0024] [図 1]本発明の一実施例において、ジヨーンズ試薬及びアセトン Zォキソンモノパー サルフェートを反応させていない Streptomyces sp. MK929-43F1の培養液の抽出物（ 上段）と、ジヨーンズ試薬を反応させた Streptomyces sp. MK929-43F1の培養液の抽 出物（中段）と、アセトン Zォキソンモノパーサルフェートを反応させた Streptomyces sp. MK929-43F1の培養液の抽出物（下段）との分離パターンを示す図である。 [図 2]本発明の一実施例において、ジヨーンズ試薬を反応させた Streptomyces sp. M K929-43F1の培養液の抽出物に含まれている物質の構造を1!" I- NMRにより解析した 結果を示す図である。
[図 3]本発明の一実施例において、アセトン Zォキソンモノパーサルフェートを反応 させた Streptomyces sp. MK929-43F1の培養液の抽出物に含まれている物質の構造 を1!" I-NMRにより解析した結果を示す図である。
[図 4]本発明の一実施例にぉ 、て、マイグラスタチン及び酸ィ匕マイグラスタチンの細 胞遊走能の阻害活性を調べた結果を示す図である。
[図 5]本発明の一実施例にぉ ヽて、マイグラスタチン及び酸ィ匕マイグラスタチンが ATP 合成に対して及ぼす影響を調べた結果を示す図である。
発明を実施するための最良の形態
[0025] 以下、上記知見に基づき完成した本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳 細に説明する。実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、 J. Sambrook, E . F. Frits ch & T. Maniatis (Εα. , Molecular cloning, a laboratory manual \0ra edition ), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロ トコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、 市販の試薬キットや測定装置を用いている場合には、特に説明が無い場合、それら に添付のプロトコ一ルを用 、る。
[0026] なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、 当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を 再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発 明の好まし 、実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されて 、るので あって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発 明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾がで きることは、当業者にとって明らかである。
[0027] まず、目的となる有機化合物の誘導体を合成するために、微生物を所定の培養液 を用いて培養し、微生物の培養により得られた有機化合物と、有機化合物の誘導体 を合成するための反応試薬とを、前記培養液中で反応させる。
[0028] 本発明で使用する微生物は、培養条件下で代謝産物として有機化合物を生産す る微生物であれば、真菌類 (広くカビ 'キノコ'酵母の類)、細菌類 (原核単細胞生物） 、変形菌類 (真正粘菌)のいずれでもよい。例えば、子嚢菌類 (酵母、ァカパン力ビ' ァォカビ 'コウジカビ、チヤワンタケ'トリュフなど）、接合菌類 (ケカビ、ミズタマカビなど )、担子菌類 (マツタケ、キクラゲなど）、不完全菌類 (ボトリシスなど）、ッボカビ類 (以 上、真菌類）；真正細菌類 (例えば、大腸菌、放線菌など)、古細菌類 (以上、細菌類 )；変形菌類 (ムラサキホコリカビなど）、などに含まれる種であれば、属ゃ種を問わな い。また、野生株の他、有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に変異が生じた変 異株を用いることにより、微生物が生産する有機化合物に多様性を与えることもでき る。この変異株は、紫外線、 X線、化学薬剤などにより人為的に変異を導入した変異 体でもよぐ有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に対し、遺伝子操作を施した 遺伝子を導入した形質転換体でもよぐ自然突然変異体 (spontaneous mutant)であ つてもよい。
[0029] これら微生物の培養は、それぞれの微生物に対して通常用いられている培養方法 によって行えばよい。培養に用いられる培養液は、使用する微生物が生育可能な培 地であればよぐ合成培地、半合成培地あるいは天然培地を用いることができる。培 地に添加する栄養物としては、微生物の栄養源として公知のものを使用できる。例え ば，炭素源としては，市販されている糖蜜、グルコース、マルトース、フルクトース、マ ン-トール、ポテトスターチ、コーンスターチ、デキストリン、可溶性デンプン等の炭水 化物あるいは油脂、脂肪類などが、窒素源としては、市販されているペプトン類、肉 エキス類、コーンスティープリカ一、綿実柏、落花生粉、大豆粉、酵母エキス、 NZ- ァミン、小麦胚芽、カゼイン類、魚粉、及び硝酸ナトリウム、硝酸アンモ-ゥム等の無 機又は有機の窒素源が用いられる。また金属塩としては、 Na、 K、 Mg、 Ca、 Zn、 Fe、 M n、 Co、 Cu等の硫酸鉛、塩酸塩、硝酸塩、燐酸塩、炭酸塩等を必要に応じて添加で きる。さらに必要に応じてパリン、ロイシン、イソロイシン、フエ-ルァラニン、トリプトファ ン、メチォニン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、ァスパラギン酸等のアミノ酸や、ビ タミン類、ォレイン酸、ォレイン酸メチル、ラード油、シリコン油、界面活性剤等の二次 代謝物生産促進物質又は消泡剤を適宜使用できる。これらのもの以外でも微生物が 利用し、 2次代謝産物の生産に役立つものであれば、いずれの添加物も使用するこ とができる。培養法としては、 2次代謝産物の製造等における微生物培養法と同様に 行えば良ぐその培養方法は固体培養でも液体培養でも良い。液体培養の場合は 静置培養、振とう培養、攪拌培養のいずれを実施してもよい。
[0030] このような培養条件下で、微生物を培養することにより、 2次代謝産物である有機化 合物が生産する。そして、培養液中で有機化合物の誘導体を合成するための反応 試薬をこの有機化合物と反応させることにより、有機化合物の誘導体を得ることがで きる。このようにして得られる誘導体は、ユニークな構造を保持した新規化合物の可 能性が極めて高ぐまた、天然にはない活性を有することも期待できる。
[0031] 以下に反応の種類とその反応に用いられる試薬の例を挙げる力 2次代謝産物で ある有機化合物の官能基や骨格を変換できるものであれば良ぐここに記載した反 応の種類や試薬に限定されるものではない。また、それぞれの反応を 2段階以上組 み合わせることも出来る。
Figure imgf000010_0001
1)アルコールの酸化反応（CrO - H SO One' s試薬)、 KMnO , Na CrO , NaOCFTE
3 2 4 4 2 7
MPOなど）
2)ベンジル位やまたはァリル位の酸化反応（CrO -AcOH, 0 /触媒など）
3 2
3) Baeyer- Villiger反応（過酸化物など）
4)カルボ-ル化合物（アルデヒドまたはケトン）の還元反応（NaBH , NaBH CN, LiAl
4 3
H , H /触媒 (例えば Rh, Ru, Pd)など）
4 2
エポキシ化 ] ^ (試靠）
5)ォレフィンのエポキシィ匕反応 (過酸 (過酢酸，メタクロ口過安息香酸など)、 H 0 /cat
2 2 alyst,ォキソン アセトンなど）
ヒドロキシ化 ] ^ (試靠）
6)ォレフィンのジヒドロキシ化反応（OsO , KMnO , R- CO H/H+など） 7)ォレフィンの酸ィ匕的開裂反応（O , NalOなど）
3 4
8)ォレフィンの水素添カ卩反応（H I Pd or Pt, RaneyNiなど）
2
ヱ一テル化反 (試蓉）
9)アルコールのエーテル化反応（(CH ) SO , ICH CO H, N-ethylmaleimide)
3 2 4 2 2
ハロゲン化反応 (試薬）
10)芳香環ゃォレフインのハロゲン化反応（F , XeF , CI , Br , I , HC1, HBr, HOC1)
2 2 2 2 2
ュトロ化反応 (試薬）
11)芳香環のニトロ化（HNO /H SO )
3 2 4
スルホン化反]^ (試蓉）
12)芳香環のスルホンィ匕反応 (SO /H SO )
3 2 4
ジァゾ化 ]
13)ァミンのジァゾ化反応（NaNO /H+)
2
アルド'ール反]^試蓉
14)アルドール反応（ルイス酸/シリルエノールエーテル）
アルキル化反]^試蓉
15)ケトンのアルキル化反応（R- MgX, RLi)
16)カルボニルの a位のアルキル化反応（塩基/ R-X)
これらの反応試薬と 2次代謝産物である有機化合物とを培養液中で反応させるに は、あらかじめ添加された反応試薬を含む培養液中で微生物を培養してもよぐまた 、反応試薬を実質的に含まない培養液中で微生物を培養し、この微生物を培養した 培養液に反応試薬を添加してもよ ヽ。培養後に反応試薬を添加する後者の方法に は、例えば、微生物培養液にそのまま合成試薬を添加する方法や、微生物を含む微 生物培養液又は遠心分離ある ヽは培養物に濾過助剤を加えて濾過して得られた培 養濾液に酢酸ェチル、クロ口ホルム、ベンゼン、トルエン、エーテル等の水と混和しな い有機溶剤を加えて得られた抽出液に合成試薬を添加して合成反応を行う方法等 がある。 [0034] このように、微生物が生産する有機化合物を、様々な反応試薬と反応させることに より合成される有機化合物の誘導体を回収することにより、化合物ライブラリーを作製 することができる。例えば、反応試薬を含む微生物を培養した培養液に含まれている 力 反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれていない化合物を同定して回収 すれば、有機化合物の誘導体が濃縮されたライブラリーを作製することができる。特 に、反応試薬を実質的に含まない培養液として、微生物を培養する前の培養液を用 いることにより、ライブラリーに、微生物が生産する有機化合物の誘導体のみならず、 有機化合物自体を含ませることができる。また、反応試薬を実質的に含まない培養液 として、微生物を培養した後ではあるが反応試薬を添加して 、な 、培養液を用いるこ とにより、主に微生物が生産する有機化合物の誘導体を同定することができ、そのよ うな誘導体を高頻度に含むライブラリーを作製することができる。
[0035] 微生物の生産した有機化合物及び Z又は有機化合物の誘導体を同定し、単離す る方法としては、例えば、シリカゲル、 ODS、トヨパール HW-40等を用いたカラムクロ マトグラフィー、遠心液々分配クロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー、高速液体ク 口マトグラフィー（HPLC)等の常法がある。これらの方法を用いて、反応試薬を含む 微生物を培養した培養液に含まれている化合物と、反応試薬を実質的に含まない培 養液に含まれて!/ヽる化合物をそれぞれ分画し、それらの分画パターンを比較すること により、回収すべき有機化合物及び Z又は有機化合物の誘導体を同定することがで き、また単離も容易に行うことができる。
[0036] なお、回収したィ匕合物は、目的により、混合して用いてもよぐまた、別々に用いても よい。例えば、生理活性のある化合物を同定するのに、個々の化合物をアツセィする のに手間が力かる場合、以下のような方法を用いればよい。まず、ライブラリーをいく つかのプールに分け、その中力も活性を有するプールを同定する。さらに、そのプー ルにふくまれる化合物をいくつかのサブプールに分け、同様に、活性のあるサブプー ルを同定する。これを繰り返すことにより、少ないアツセィ回数で目的の化合物を同定 することが可能となる。
[0037] ライブラリーの構成要素とする化合物は、マススペクトル、多重マススペクトル、紫外 および可視吸収スペクトル、プロトン核磁気共鳴スペクトル、炭素 13核磁気共鳴スぺ タトル、赤外部吸収スペクトル、 X線結晶スペクトルなどを用いた公知の構造解析方 法、あるいはこれらを組み合わせた方法によって構造を決定できる。こうして構造を決 定した化合物は、減圧下で乾固して冷暗所たとえば冷蔵庫で保存できる。
[0038] このライブラリーを用いて、生理学的活性を有する化合物を得ることを目的に様々 なスクリーニングを行うことができる。前記生理学的活性を有する化合物としては、例 えば、酵素阻害剤、リガンド Z受容体結合阻害剤、血管新生作用阻害剤、細胞接着 阻害剤、遺伝子発現阻害剤、増殖因子様活性物質などを挙げることができるが、こ れらに限定されるものではない。なお、前記酵素阻害剤は、例えば、チロシンキナー ゼ阻害剤、サイクロォキシゲナーゼ (COX)阻害剤、テロメァーゼ阻害剤、マトリックス タロプロテアーゼ阻害剤、プロスタグランジン D合成阻害剤、ホスホジエステラーゼ阻 害剤、コリンエステラーゼ阻害剤、ウィルスプロテアーゼ阻害剤、逆転写酵素阻害剤 などである。また、前記受容体は、例えば、アドレナリン受容体、ヒスタミン受容体、口 ィコトリェン受容体、ォピオイド受容体などである。
実施例
[0039] 以下、実施例及び図を用いてより詳細に説明する。なお、実施例において、核磁気 共鳴スペクトル（1H- NMRおよび13 C- NMR)は JNM- AL300 (日本電子製）を用いて測 定した。また、各反応は特に記載のない限り、アルゴン中で反応を行った。
[0040] [実施例 1]
上述の式 (1)で表される化合物（マイグラスタチン）を合成する Streptomyces sp. MK 929-43F1を培養液（2%デキストリン、 2%グリセロール、 1%ソィペプトン、 0.3%酵母ェ キス、 0.2%硫酸アンモ-ゥム、 0.2%炭酸カルシウム、 pH 7.4)中で 27°C, 4日間培養し 、遠心分離により上清を得た。得られた培養上清 60 1に 164 mg/mlジヨーンズ試薬 30 1を加え、 25°Cで 1分間撹拌した。なお、コントロールとして、ジヨーンズ試薬をカロ えない濾液を準備した。撹拌後、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 180 /z l加え、中和し 、酢酸ェチル 720 1で抽出した。その後、抽出物を減圧濃縮して乾燥させ、乾固物 をメタノール 300 1に溶解し、得られた粗生成物を高速液体クロマトグラフィー (カラ ム； SenshuPAK ODS C18 150 mm X 4.6 ,溶出系；ァセトニトリル：水 = 50:50)にて 分離し、 UV検出器 (島津制作所社製， UV 220應)で分離パターンを得た (図 1参照 )。これらの分離パターンを比較して、ジヨーンズ試薬を反応させた培養液の抽出物 には含まれており、ジヨーンズ試薬を反応させていない培養液の抽出物には含まれ て!、な 、物質を同定して回収し、この物質の構造を NMRにより解析したところ（図 2参 照）、式 (1)で表される化合物の酸化物（上述の式 (2)で表される化合物：酸ィ匕マイダラ スタチン)であることがわ力 た。このように、ジヨーンズ試薬を用いることにより、有機 化合物の酸ィ匕物を得ることができた。
[0041] [実施例 2]
実施例 1の濾液 60 μ 1から酢酸ェチル 720 μ 1により抽出した抽出物を減圧濃縮して 乾燥させ、得られた乾固物をアセトン 100 1に溶解した。その後、 NaHCO lmgを加
3 えて飽和させ、さらに、 20mg/mlォキソンモノパーサルフェート（アセトンに溶解） 100 μ 1を加え、室温で 3時間撹拌した。なお、コントロールとして、アセトン Ζォキソンモノ パーサルフェートをカ卩えない溶液を準備した。撹拌後、酢酸ェチル 600 1で抽出し、 抽出物を減圧濃縮して乾燥させ、乾固物をメタノール 300 1に溶解し、得られた粗 生成物を高速液体クロマトグラフィー（カラム； SenshuPAK ODS C18 150 mm X 4.6 ,溶出系；ァセトニトリル:水 = 50:50)にて分離し、 UV検出器 (島津制作所社製， UV 2 20應)で分離パターンを得た（図 1参照)。これらの分離パターンを比較して、ァセト ン Zォキソンモノパーサルフェートを反応させた培養液の抽出物には含まれており、 アセトン Zォキソンモノパーサルフェートを反応させていない培養液の抽出物には 含まれて 、な 、物質を同定して回収し、この物質の構造を NMRにより解析したところ（ 図 3参照）、式 (1)で表される化合物がエポキシ化されたィ匕合物（上述の式 (3)で表され る化合物：エポキシマイグラスタチン)であることがわ力つた。このように、アセトン/ォ キソンモノパーサルフェートを用いることにより、有機化合物がエポキシィ匕されたィ匕合 物を得ることができた。
[0042] [実施例 3]
従来、マイグラスタチンが腫瘍細胞の遊走能を阻害することが知られている。そこで 、実施例 1で得られた酸ィ匕マイグラスタチンが腫瘍細胞の遊走能を阻害することがで きるかどうかを確認するために以下の実験を行った。
[0043] 48ゥヱルプレートの各ゥエルに、ヒト食道癌由来 EC17細胞の懸濁液（1.5 X 105個/ ml ； RPMI1640培地 (二ッスィ)）を 500 /z lずつ添カ卩し、 37°Cで 24時間培養した。その後、 各ゥエルの底面の中央を一直線にマイクロピペットチップで傷をつけ、細胞を直線上 にはがした。その後、直ちに培養液上清を除去し、 PBS— (8 g/1 NaCl, 0.2 g/1 KC1, 0. 916 g/1 Na HPO , 0.2 g/1 KH PO ) 300 μ 1で細胞をはがさないように注意しながら洗
2 4 2 4
浄して 1%の血清（FBS ;Tissue Culture Biologicals社製）を含む RPMI 1640培地 500 μ 1 を静かに注入した。それから、マイグラスタチン又は酸ィ匕マイグラスタチンを添加し、 3 7°Cで 24時間培養した。なお、コントロールとして、マイグラスタチン又は酸ィ匕マイダラ スタチンを添加しない培養液で培養したものも準備した。培養後、顕微鏡下で観察し 、マイクロピペットチップで傷つけた傷が周囲力 遊走してきた細胞によってどの程度 埋められたかを確認し、細胞の遊走能を評価した。その結果を図 4に示す。
[0044] 図 4に示すように、コントロールでは EC17細胞の培養プレートに傷を付け（0 h)、 24 時間培養すると細胞が遊走して傷が埋まるが、傷を付けると同時に (0 h)マイグラスタ チンを添加すると、濃度依存的に細胞の遊走能が阻害され、 g/mlの濃度では完 全に阻害されることがわ力つた。また、傷を付けると同時に酸ィ匕マイグラスタチンを添 カロした場合もほぼ同じ濃度域でマイグラスタチンと同様の阻害効果を示した。
[0045] 以上のことから、マイグラスタチンの誘導体である酸ィ匕マイグラスタチンもマイグラス タチンと同様に腫瘍細胞の遊走能を阻害することができることが明らかになった。また 、ある化合物の誘導体が、もとの化合物と同様の活性を有する場合があることが明ら カゝになった。
[0046] [実施例 4]
次に、マイグラスタチンが有する ATP合成の抑制作用を、酸ィ匕マイグラスタチンも有 する力否かを確認するために以下の実験を行った。
[0047] 24ゥヱルプレートの各ゥヱルに、ヒト大腸癌由来の HT- 29細胞の懸濁液（4 X 105個/ ml;RPMI1640培地）を 1 mlずつ添カ卩し、 37°Cで 24時間培養した。その後、マイグラス タチン又は酸ィ匕マイグラスタチンを添加し、 3時間培養した。なお、コントロールとして 、マイグラスタチン又は酸ィ匕マイグラスタチンを添加しな 、で培養した培養液も準備し た。培養後、氷冷した PBS—で 2回洗浄した後、 2%トリクロ口酢酸を 200 1カ卩え、 4°Cで 3 0分静置した。この上清 160 μ 1に対し、 0.5Ν NaOHを 36.8 μ 1添カ卩して中和させたもの をサンプルとした。 4mM MgClを含む PBS— 3 mlにこのサンプルを 160 μ 1加え、これに
2
4 mg/mlルシフェラーゼールシフェリン（Sigma)を 40 μ 1加えて、直ちに液体シンチレ ーシヨンカウンター（LS-5000TD: BECKMAN COULTER)のシングルフオトンモニタ 一で ATP量を測定した。なお、ブランク値は、サンプル及びルシフェラーゼールシフ エリンを加えない条件で測定し、全てのデータ力も差し引いた。その結果を図 5に示 す。
[0048] 図 5に示すように、マイグラスタチンが細胞遊走を阻害する濃度域で ATP合成を抑 制するが、酸ィ匕マイグラスタチンはその濃度域で ATP合成を全く抑制しないことが明 らかになつた。このこと力ゝら、マイグラスタチンのヒドロキシル基を酸化させると、 ATP合 成の抑制作用がなくなることがわ力つた。また、マイグラスタチンのヒドロキシル基の部 分が ATP合成の抑制作用に重要であることが示唆された。以上のことから、ある化合 物の誘導体が、もとの化合物の活性を有しない場合があることが明らかになり、このこ とは、本発明に係るスクリーニング方法が、例えば、副作用を有しない化合物を得る 等、異なる活性を有する化合物を得るのに役立つことが示唆された。
産業上の利用の可能性
[0049] 本発明によれば、 HTS (ハイスループット）によるランダムスクリーニング、医薬品又 は農薬品の探索、及び医薬品又は農薬品のリードィ匕合物の探索などに有用な、微 生物産生物質の誘導体を合成する方法、微生物産生物質の誘導体を含むライブラリ 一の作製方法、及び微生物産生物質の誘導体を含む化合物ライブラリー、並びに、 化合物ライブラリーを用いたスクリーニング方法を提供することができる。

Claims

請求の範囲
[I] 微生物が生産する有機化合物の誘導体を合成する方法であって、
前記微生物を所定の培養液を用いて培養し、
前記微生物の培養により得られた有機化合物と、前記有機化合物の誘導体を合成 するための反応試薬とを、前記培養液中で反応させることを特徴とする方法。
[2] 前記反応試薬を含む前記培養液中で前記微生物を培養することにより、前記有機 化合物と前記反応試薬とを反応させることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
[3] 前記反応試薬を実質的に含まない前記培養液中で前記微生物を培養することによ り前記有機化合物を生産させ、
前記微生物を培養した培養液に前記反応試薬を添加することにより、前記有機化 合物と前記反応試薬とを反応させることを特徴とする請求項 1に記載の方法。
[4] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に変異が生じた変 異体であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。
[5] 前記微生物が、紫外線照射、 X線照射、若しくは化学薬品投与により、人為的に変 異を導入した変異体であることを特徴とする請求項 4に記載の方法。
[6] 前記微生物が、自然突然変異体 (spontaneous mutant)であることを特徴とする請 求項 4に記載の方法。
[7] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子操作を施した形質 転換体であることを特徴とする請求項 1〜3のいずれかに記載の方法。
[8] 前記微生物が、古細菌類、真正細菌類、原生生物類、菌類からなるグループから 選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする請求項 1〜7のいずれかに記載の 方法。
[9] 前記微生物が、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、不完全菌類、変形菌類、及び細 胞性粘菌類力もなるグループ力も選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする 請求項 1〜7のいずれかに記載の方法。
[10] 前記微生物が、放線菌であることを特徴とする請求項 1〜7のいずれかに記載の方 法。
[I I] 前記反応試薬が、酸化反応試薬、還元反応試薬、エポキシ化反応試薬、ジヒドロキ シ化反応試薬、酸化的解裂反応試薬、水素添加反応試薬、エーテル化反応試薬、 ハロゲン化反応試薬、ニトロ化反応試薬、スルホン化反応試薬、ジァゾ化反応試薬、 アルドール反応試薬、及びアルキルィ匕反応試薬カゝらなるグループカゝら選ばれる 1又 は 2以上の試薬であることを特徴とする請求項 1〜： LOのいずれかに記載の方法。
[12] 微生物が生産する有機化合物を反応試薬と反応させることにより合成される前記有 機化合物の誘導体を含む化合物ライブラリーの作製方法であって、
前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ゝるが、前記反応 試薬を実質的に含まな ヽ培養液に含まれて ヽな ヽィ匕合物を回収し、前記化合物ライ ブラリーの構成要素とすることを特徴とする方法。
[13] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液が、前記微生物を培養した培養液である ことを特徴とする請求項 12に記載の方法。
[14] 前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ゝる化合物及び前 記反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれている化合物をそれぞれ分画する ことにより、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれているが、前 記反応試薬を実質的に含まな 、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を同定して回収す ることを特徴とする請求項 12または 13に記載の方法。
[15] 前記反応試薬を含む前記培養液中で前記微生物を培養することにより前記有機化 合物と前記反応試薬との反応を行!ヽ、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した 培養液を得ることを特徴とする請求項 12〜 14のいずれか〖こ記載の方法。
[16] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液中で前記微生物を培養することにより前 記有機化合物を生産させ、
前記微生物が生産した前記有機化合物を含む培養液に前記反応試薬を添加する ことにより前記有機化合物と前記反応試薬との反応を行い、前記反応試薬を含む前 記微生物を培養した培養液を得ることを特徴とする請求項 12〜 14に記載の方法。
[17] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に変異が生じた変 異体であることを特徴とする請求項 12〜16のいずれかに記載の方法。
[18] 前記微生物が、紫外線照射、 X線照射、若しくは化学薬品投与により、人為的に変 異を導入した変異体であることを特徴とする請求項 17に記載の方法。
[19] 前記微生物が、自然突然変異体 (spontaneous mutant)であることを特徴とする請 求項 17に記載の方法。
[20] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子操作を施した形質 転換体であることを特徴とする請求項 12〜16のいずれかに記載の方法。
[21] 前記微生物が、古細菌類、真正細菌類、原生生物類、菌類からなるグループから 選ばれる!/ヽずれかの類に属することを特徴とする請求項 12〜20の ヽずれかに記載 の方法。
[22] 前記微生物が、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、不完全菌類、変形菌類、及び細 胞性粘菌類力もなるグループ力も選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする 請求項 12〜20のいずれかに記載の方法。
[23] 前記微生物が、放線菌であることを特徴とする請求項 12〜20のいずれかに記載の 方法。
[24] 前記反応試薬が、酸化反応試薬、還元反応試薬、エポキシ化反応試薬、ジヒドロキ シ化反応試薬、酸化的解裂反応試薬、水素添加反応試薬、エーテル化反応試薬、 ハロゲン化反応試薬、ニトロ化反応試薬、スルホン化反応試薬、ジァゾ化反応試薬、 アルドール反応試薬、及びアルキルィ匕反応試薬カゝらなるグループカゝら選ばれる 1又 は 2以上の試薬であることを特徴とする請求項 12〜23のいずれかに記載の方法。
[25] 微生物が生産する有機化合物を反応試薬と反応させることにより合成される前記有 機化合物の誘導体を含む化合物ライブラリーであって、
前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ゝるが、前記反応 試薬を実質的に含まな ヽ培養液に含まれて ヽな ヽィ匕合物を回収し、前記化合物ライ ブラリーの構成要素とすることにより作製することを特徴とする化合物ライブラリー。
[26] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液が、前記微生物を培養した培養液である ことを特徴とする請求項 25に記載の化合物ライブラリー。
[27] 前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ヽる化合物及び前 記反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれている化合物をそれぞれ分画する ことにより、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれているが、前 記反応試薬を実質的に含まな 、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を同定して回収す ることを特徴とする請求項 25または 26に記載の化合物ライブラリー。
[28] 前記反応試薬を含む前記培養液中で前記微生物を培養することにより前記有機化 合物と前記反応試薬との反応を行!ヽ、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した 培養液を得ることを特徴とする請求項 25〜27のいずれかに記載の化合物ライブラリ
[29] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液中で前記微生物を培養することにより前 記有機化合物を生産させ、
前記微生物が生産した前記有機化合物を含む培養液に前記反応試薬を添加する ことにより前記有機化合物と前記反応試薬との反応を行い、前記反応試薬を含む前 記微生物を培養した培養液を得ることを特徴とする請求項 25〜27のいずれか〖こ記 載の化合物ライブラリー。
[30] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に変異が生じた変 異体であることを特徴とする請求項 25〜29のいずれかに記載の化合物ライブラリー
[31] 前記微生物が、紫外線照射、 X線照射、若しくは化学薬品投与により、人為的に変 異を導入した変異体であることを特徴とする請求項 30に記載の化合物ライブラリー。
[32] 前記微生物が、自然突然変異体 (spontaneous mutant)であることを特徴とする請 求項 30に記載の化合物ライブラリ一。
[33] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子操作を施した形質 転換体であることを特徴とする請求項 25〜29のいずれかに記載の化合物ライブラリ
[34] 前記微生物が、古細菌類、真正細菌類、原生生物類、菌類からなるグループから 選ばれる!/ヽずれかの類に属することを特徴とする請求項 25〜33のヽずれかに記載 の化合物ライブラリー。
[35] 前記微生物が、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、不完全菌類、変形菌類、及び細 胞性粘菌類力もなるグループ力も選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする 請求項 25〜33のいずれかに記載の化合物ライブラリー。
[36] 前記微生物が、放線菌であることを特徴とする請求項 25〜33のいずれかに記載の 化合物ライブラリー。
[37] 前記反応試薬が、酸化反応試薬、還元反応試薬、エポキシ化反応試薬、ジヒドロキ シ化反応試薬、酸化的解裂反応試薬、水素添加反応試薬、エーテル化反応試薬、 ハロゲン化反応試薬、ニトロ化反応試薬、スルホン化反応試薬、ジァゾ化反応試薬、 アルドール反応試薬、及びアルキルィ匕反応試薬カゝらなるグループカゝら選ばれる 1又 は 2以上の試薬であることを特徴とする請求項 25〜36のいずれかに記載の化合物ラ イブラリー。
[38] 微生物が生産する有機化合物を反応試薬と反応させることにより合成される前記有 機化合物の誘導体を含む化合物ライブラリーを用いた生理学的活性を有する化合 物のスクリーニング方法であって、
前記化合物ライブラリ一は、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に 含まれて ヽるが、前記反応試薬を実質的に含まな ヽ培養液に含まれて ヽな ヽィ匕合 物を回収し、前記化合物ライブラリーの構成要素とすることにより作製されることを特 徴とするスクリーニング方法。
[39] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液が、前記微生物を培養した培養液である ことを特徴とする請求項 38に記載のスクリーニング方法。
[40] 前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ゝる化合物及び前 記反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれている化合物をそれぞれ分画する ことにより、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれているが、前 記反応試薬を実質的に含まな 、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を同定して回収す ることを特徴とする請求項 38または 39に記載のスクリーニング方法。
[41] 前記反応試薬を含む前記培養液中で前記微生物を培養することにより前記有機化 合物と前記反応試薬との反応を行!ヽ、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した 培養液を得ることを特徴とする請求項 38〜40のいずれかに記載のスクリーニング方 法。
[42] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液中で前記微生物を培養することにより前 記有機化合物を生産させ、
前記微生物が生産した前記有機化合物を含む培養液に前記反応試薬を添加する ことにより前記有機化合物と前記反応試薬との反応を行い、前記反応試薬を含む前 記微生物を培養した培養液を得ることを特徴とする請求項 38〜40のいずれか〖こ記 載のスクリーニング方法。
[43] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に変異が生じた変 異体であることを特徴とする請求項 38〜42のいずれかに記載のスクリーニング方法
[44] 前記微生物が、紫外線照射、 X線照射、若しくは化学薬品投与により、人為的に変 異を導入した変異体であることを特徴とする請求項 43に記載のスクリーニング方法。
[45] 前記微生物が、自然突然変異体 (spontaneous mutant)であることを特徴とする請 求項 43に記載のスクリーニング方法。
[46] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子操作を施した形質 転換体であることを特徴とする請求項 38〜42のいずれかに記載のスクリーニング方 法。
[47] 前記微生物が、古細菌類、真正細菌類、原生生物類、菌類からなるグループから 選ばれる!/ヽずれかの類に属することを特徴とする請求項 38〜46の ヽずれかに記載 のスクリーニング方法。
[48] 前記微生物が、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、不完全菌類、変形菌類、及び細 胞性粘菌類力もなるグループ力も選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする 請求項 38〜46のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[49] 前記微生物が、放線菌であることを特徴とする請求項 38〜46のいずれかに記載の スクリーニング方法。
[50] 前記反応試薬が、酸化反応試薬、還元反応試薬、エポキシ化反応試薬、ジヒドロキ シ化反応試薬、酸化的解裂反応試薬、水素添加反応試薬、エーテル化反応試薬、 ハロゲン化反応試薬、ニトロ化反応試薬、スルホン化反応試薬、ジァゾ化反応試薬、 アルドール反応試薬、及びアルキルィ匕反応試薬カゝらなるグループカゝら選ばれる 1又 は 2以上の試薬であることを特徴とする請求項 38〜49のいずれかに記載のスクリー ユング方法。
[51] 微生物が生産する有機化合物を反応試薬と反応させることにより合成される前記有 機化合物の誘導体を含む化合物ライブラリーを用いた治療薬のスクリーニング方法 であって、
前記化合物ライブラリーの個々の化合物をヒト以外の疾患モデル動物に投与し、 前記化合物の投与により前記疾患の症状が改善されたかどうかを評価する工程を 含み、
前記化合物ライブラリ一は、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に 含まれて ヽるが、前記反応試薬を実質的に含まな ヽ培養液に含まれて ヽな ヽィ匕合 物を回収し、前記化合物ライブラリーの構成要素とすることにより作製されることを特 徴とするスクリーニング方法。
[52] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液が、前記微生物を培養した培養液である ことを特徴とする請求項 51に記載のスクリーニング方法。
[53] 前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれて!/ゝる化合物及び前 記反応試薬を実質的に含まない培養液に含まれている化合物をそれぞれ分画する ことにより、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した培養液に含まれているが、前 記反応試薬を実質的に含まな 、培養液に含まれて 、な 、ィ匕合物を同定して回収す ることを特徴とする請求項 51または 52に記載のスクリーニング方法。
[54] 前記反応試薬を含む前記培養液中で前記微生物を培養することにより前記有機化 合物と前記反応試薬との反応を行!ヽ、前記反応試薬を含む前記微生物を培養した 培養液を得ることを特徴とする請求項 51〜53のいずれかに記載のスクリーニング方 法。
[55] 前記反応試薬を実質的に含まない培養液中で前記微生物を培養することにより前 記有機化合物を生産させ、
前記微生物が生産した前記有機化合物を含む培養液に前記反応試薬を添加する ことにより前記有機化合物と前記反応試薬との反応を行い、前記反応試薬を含む前 記微生物を培養した培養液を得ることを特徴とする請求項 51〜53のいずれか〖こ記 載のスクリーニング方法。
[56] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子に変異が生じた変 異体であることを特徴とする請求項 51〜55のいずれかに記載のスクリーニング方法
[57] 前記微生物が、紫外線照射、 X線照射、若しくは化学薬品投与により、人為的に変 異を導入した変異体であることを特徴とする請求項 56に記載のスクリーニング方法。
[58] 前記微生物が、自然突然変異体 (spontaneous mutant)であることを特徴とする請 求項 56に記載のスクリーニング方法。
[59] 前記微生物が、前記有機化合物の生産過程に関与する遺伝子操作を施した形質 転換体であることを特徴とする請求項 51〜55のいずれかに記載のスクリーニング方 法。
[60] 前記微生物が、古細菌類、真正細菌類、原生生物類、菌類からなるグループから 選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする請求項 51〜59のいずれかに記載 のスクリーニング方法。
[61] 前記微生物が、子嚢菌類、接合菌類、担子菌類、不完全菌類、変形菌類、及び細 胞性粘菌類力もなるグループ力も選ばれるいずれかの類に属することを特徴とする 請求項 51〜59のいずれかに記載のスクリーニング方法。
[62] 前記微生物が、放線菌であることを特徴とする請求項 51〜59のいずれかに記載の スクリーニング方法。
[63] 前記反応試薬が、酸化反応試薬、還元反応試薬、エポキシ化反応試薬、ジヒドロキ シ化反応試薬、酸化的解裂反応試薬、水素添加反応試薬、エーテル化反応試薬、 ハロゲン化反応試薬、ニトロ化反応試薬、スルホン化反応試薬、ジァゾ化反応試薬、 アルドール反応試薬、及びアルキルィ匕反応試薬カゝらなるグループカゝら選ばれる 1又 は 2以上の試薬であることを特徴とする請求項 51〜62のいずれかに記載のスクリー ユング方法。
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