WO2006032711A1 - Uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo i y de interferón alfa en el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, kit y composiciones que los comprenden - Google Patents

Uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo i y de interferón alfa en el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, kit y composiciones que los comprenden Download PDF

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alpha
insulin
growth factor
hepatitis
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Inma CASTILLA DE CORTÁZAR
Jesús PRIETO VALTUEÑA
Alberto CASTILLA DE CORTÁZAR
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Instituto Científico Y Tecnológico De Navarra S.A.
Universidad De Málaga
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/30—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics

Definitions

  • the present invention is encompassed in the area of liver disease treatments, preferably liver cirrhosis and chronic liver disease with a predominance of oxidative damage (alcoholic hepatitis and C virus).
  • liver disease treatments preferably liver cirrhosis and chronic liver disease with a predominance of oxidative damage (alcoholic hepatitis and C virus).
  • Cirrhosis is a diffuse process of fibrosis and formation of regeneration nodules, whose pathophysiology is not well known. Liver cirrhosis is a disease of high social prevalence, with few therapeutic possibilities, in which the use of liver transplantation is the only therapeutic strategy in advanced stages.
  • Type I insulin-like growth factor is an anabolic hormone, which is synthesized primarily in the liver by the stimulation of growth hormone, GH.
  • IGF-I plasma concentrations are of hepatic origin.
  • the hepatic parenchyma has reduced its biosynthetic capacity, as a consequence, plasma concentrations of IGF-I are decreased.
  • IGF-I deficiency has been linked to the severe malnutrition process suffered by the cirrhotic patient, which overshadows the prognosis and decreases the chances of successful liver transplantation.
  • IFN alpha inhibits the production of collagen.
  • IFN- ⁇ therapy can suppress the progression of liver fibrosis by inhibiting fibrogenesis (12-16) and accelerating fibrolysis in chronic liver disease.
  • the present invention is therefore aimed at improving the therapy used so far in said liver diseases.
  • the present invention relates to the use of insulin-like growth factor type I (IGF-I) and interferon-alpha (iFN- ⁇ ), in which type I insulin-like growth factor (IGF-I) ) and interferon-alpha are used in the manufacture of drugs useful in combined administration for the treatment of chronic liver disease.
  • IGF-I insulin-like growth factor type I
  • iFN- ⁇ interferon-alpha
  • liver cirrhosis Especially said chronic liver disease is liver cirrhosis, alcoholic hepatitis, viral hepatitis and simultaneous occurrences thereof, and particularly particularly said chronic liver disease is liver cirrhosis.
  • insulin-like growth factor type I and interferon-alpha preferably between 20 and 200 ⁇ g / kg body weight of the patient of factor of insulin-like growth type I, per day.
  • the chronic liver disease is hepatitis C virus, and for the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha, 2 to 6 MUI are used (MUI, millions of international units) of interferon-alpha three times per week.
  • interferon-alpha for the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha, between 6 and 15 MUI of interferon-alpha are used per week. This amount of interferon-alpha can be given distributed on alternate days or in a single weekly dose.
  • the disease is hepatitis C virus and for the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha, 0.2 to 1.2 ⁇ g / kg of Interferon-alpha patient's body weight per week.
  • the chronic liver disease is virus hepatitis
  • insulin-like growth factor type I and interferon-alpha 1.5 to 10 MUI of interferon-alpha is used three times per week.
  • the chronic liver disease is hepatitis B virus
  • insulin-like growth factor type I and interferon-alpha between 4.5 and 35 MUI of interferon are employed.
  • -alfa per week This amount of interferon-alpha can be given distributed on alternate days or in a single weekly dose.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical kit for the treatment of chronic liver disease, wherein the kit comprises a first component comprising insulin-like growth factor type I (IGF-I); Y a second component comprising interferon-alpha (IFN- ⁇ ).
  • IGF-I insulin-like growth factor type I
  • IFN- ⁇ interferon-alpha
  • liver cirrhosis Especially the chronic liver disease is liver cirrhosis, alcoholic hepatitis, viral hepatitis and simultaneous occurrences thereof.
  • liver cirrhosis is liver cirrhosis.
  • the first component comprises insulin-like growth factor type I in an amount sufficient to provide a dose of between 20 and 200 ⁇ g insulin-like growth factor type I, per kilogram of the patient's body weight, and per day.
  • the chronic liver disease is hepatitis C virus
  • the second component comprises interferon-alpha in an amount sufficient to provide a dose of 2 to 6 MUI of interferon-alpha three times per week.
  • the second component comprises interferon-alpha in an amount sufficient to provide a dose of 6 to 15 MUI of interferon-alpha per week.
  • the disease is hepatitis C virus
  • the second component comprises interferon-alpha in an amount sufficient to provide a dose of 0.2 to 1.2 ⁇ g of interferon-alpha per kilogram of weight. body of the patient, per week.
  • the chronic liver disease is hepatitis B virus
  • the second component comprises interferon-alpha in an amount sufficient to provide a dose of 1.5 to 10 MUI of interferon-alpha 3 times per week.
  • Pharmaceutical chronic liver disease is hepatitis B virus
  • the second component comprises interferon-alpha in an amount sufficient to provide a dose of 4.5 to 35 MUI of interferon-alpha per week.
  • said kit further comprises a third component comprising one or more pharmaceutically compatible excipients with insulin-like growth factor type I and with interferon-alpha.
  • this further comprises a third component comprising one or more pharmaceutically compatible carrier agents with insulin-like growth factor type I and with interferon-alpha.
  • the first component further comprises one or more pharmaceutically acceptable excipients and compatible with insulin-like growth factor type I and with interferon-alpha.
  • the second component further comprises one or more pharmaceutically acceptable excipients compatible with interferon-alpha and with insulin-like growth factor type I.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical composition for the treatment of a chronic liver disease, which comprises a pharmaceutically acceptable amount of insulin-like growth factor type I (IGF-I) and a pharmaceutically acceptable amount of interferon-alpha (IFN- ⁇ ).
  • IGF-I insulin-like growth factor type I
  • IFN- ⁇ interferon-alpha
  • liver cirrhosis Especially the chronic liver disease is liver cirrhosis, alcoholic hepatitis, viral hepatitis and simultaneous occurrences thereof, particularly preferably said disease is liver cirrhosis.
  • pharmaceutical composition This comprises between 20 and 200 ⁇ g of insulin-like growth factor type I per kilogram of the patient's body weight.
  • the chronic liver disease is hepatitis C virus and said composition comprises an amount of 2 to 15 MUI of interferon-alpha.
  • the chronic liver disease is hepatitis C virus
  • said composition comprises an amount of 0.2 to 1.2 ⁇ g of interferon-alpha, per kilogram of the patient's body weight.
  • the chronic liver disease is hepatitis B
  • said composition comprises an amount of 1.5 to 35 MUI of interferon-alpha.
  • this further comprises a pharmaceutically compatible excipient with insulin-like growth factor type I and with interferon-alpha.
  • the insulin-like growth factor type I and interferon-alpha are vehiculized in two vehicular agents.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be administered parenterally, preferably subcutaneously, transdermally or percutaneously.
  • Parenteral administration forms can be obtained in a conventional manner by mixing the active ingredient or ingredients with buffers, stabilizers, preservatives, solubilizing agents, toning agents and suspending agents. These mixtures are sterilized by known techniques and packaged to be administered as injections.
  • the composition may be a sterile solution, emulsion or dispersion.
  • Said composition may be an injectable preparation may be prepared by dissolving, emulsifying or dispersing the active ingredient or ingredients together with one or more excipients, in water for injection.
  • As buffers organophosphate-based salts can be used.
  • solubilizing agents are castor oil solidified with polyoxyethylene, polysorbate 80, nicotinamide, and macrogol.
  • solubilizing agents sodium sulfite, sodium metasulfite, - and as preservative agents, sorbic acid, cresol, paracresol and others can be used.
  • regulatory solutions such as citric acid-sodium citrate, acetic acid-sodium acetate, and monosodium carbonate-disodium carbonate, among others, can be mentioned.
  • excipients are sterilizing agents to prevent the presence of pyrogens and / or contaminants.
  • Another optional component of the pharmaceutical composition for subcutaneous administration is one or more vehicular agents, such as, for example, water, hydrocarbons, alcohols, polyols, ethers, vegetable oils, lanolin, methyl ketone, among others.
  • vehicular agents such as, for example, water, hydrocarbons, alcohols, polyols, ethers, vegetable oils, lanolin, methyl ketone, among others.
  • binders examples of such binders are polyvinylpyrrolidone, hydroxypropylmethylcellulose, alginic acid, sodium alginate, polymethacrylate, maltodextrin, liquid glucose, aluminum silicate, hydroxypropylcellulose, aluminum magnesium silicate, starch and others.
  • alginic acid sodium carboxymethylcellulose, colloidal silicon dioxide, croscaramellose sodium, crospovidone, alginate can be used sodium, cellulose powder, magnesium aluminum silicate, pregelatinized starch, and others.
  • An emulsion for the transdermal or percutaneous administration of the pharmaceutical composition can be obtained with the aid of one or more emulsifying agents, such as gum arabic, tragacanth, gelosa, carragaen, pectin and the like.
  • emulsifying agents such as gum arabic, tragacanth, gelosa, carragaen, pectin and the like.
  • an emulsion comprises preservatives, antifungal agents and especially antioxidants.
  • suspending agents for any preparation for parenteral administration are gums, alginate, methyl cellulose, hydroxyethyl cellulose, bentonite, non-ionic surfactants, acacia and carboxymethyl cellulose, among others.
  • the dose depends on the active ingredient or ingredients, the specific mode of administration, the therapeutic indication and the age of the patient.
  • composition of the present invention can also be administered percutaneously in the form of ointments, creams, gels, pastes.
  • ointments may comprise one or more excipients of natural or synthetic origin, and may comprise additives such as antimicrobial agents, stabilizers, antioxidants, emulsifiers and / or thickeners.
  • Creams are ointments of a polyphasic structure that can comprise emulsifiers such as sorbitan esters, or monoglycerides when they are hydrophobic creams, or they can comprise emulsifiers such as sodium soaps and triethanolamine, and / or mixtures of polysorbates with other emulsifiers, when they are hydrophilic creams.
  • emulsifiers such as sorbitan esters, or monoglycerides when they are hydrophobic creams, or they can comprise emulsifiers such as sodium soaps and triethanolamine, and / or mixtures of polysorbates with other emulsifiers, when they are hydrophilic creams.
  • the gels may comprise excipients such as liquid paraffin added to polyethylene, aluminum or zinc soaps, among others, or in the case of hydrogels, they may comprise excipients such as water, glycerol, propylene glycol, gum tragacanth, cellulose derivatives, among others.
  • the present invention further relates to a method for the treatment of a chronic liver disease.
  • the chronic liver disease can be liver cirrhosis, alcoholic hepatitis, viral hepatitis and simultaneous occurrences thereof.
  • Particularly special said disease is liver cirrhosis.
  • insulin-like growth factor type I and interferon-alpha are present in a pharmaceutical composition that is administered to said human individual.
  • the insulin-like growth factor type I and interferon-alpha are administered separately.
  • the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha between 20 and 200 ⁇ g / kg body weight of the patient of insulin-like growth factor type I is employed , per day.
  • the chronic liver disease is hepatitis C virus
  • 2 MUI to 6 MUI of interferon-alpha are used. three times per week.
  • the disease is hepatitis C virus, and for the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha, 0.2 to 1.2 ⁇ g / kg of weight are used body of the patient, of interferon-alpha per week.
  • chronic liver disease is hepatitis B virus, and for the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha, 1.5 MUI to 10 MUI of interferon-alpha are used three times a week.
  • the chronic liver disease is hepatitis B virus, for the administration of insulin-like growth factor type I and interferon-alpha, between 4.5 and 35 MUI of interferon-alpha per week.
  • interferon-alpha may be conjugated to a polymer, such as polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • Such conjugates can be obtained prepared by methods already known in the state of the art. Various processes for obtaining and formulations containing said conjugates are described, for example, in US-5382657, US-5762923, US-5908621, US-6250469, US-6524570 and EP-809996, the content of which is incorporated herein descriptive by reference.
  • the experimental design includes healthy controls (CO), untreated cirrhotic animals (IC), cirrhotic rats treated with IGF-I (CI + IGF, 2 ⁇ g-100g of patient's body weight -day "1 ), cirrhotic rats treated with IFN alpha (CI + IFN, 3,200 IU, three days / week) and cirrhotic rats treated with both factors (CI + IGF + IFN) for three weeks.
  • An advantage of the present invention is therefore that the co-administration of IGF-I + IFN- ⁇ enhances the hepatoprotective and antifibrogenic effects known only in IGF-I therapy. Both factors improve liver function tests, lipid peroxidation in cirrhotic liver and induce a remarkable histopathological recovery. These results suggest that IGF-I and IFN- ⁇ appear to act by different mechanisms, resulting in a more effective action on the cirrhotic liver.
  • Figure IA shows serum concentrations of total proteins on day 22, in the different groups of cirrhotic animals and in the group of healthy controls.
  • Figure IB shows serum concentrations of total proteins before and after treatment, on day 0 and day 22, in the groups of cirrhotic animals treated with
  • IGF-I or with IFN, or with both, demonstrating the anabolic effect of IGF-I, which is not observed only with IFN.
  • Figure 2A shows serum albumin concentrations in different groups of cirrhotic animals compared to control animals, on day 22.
  • Figure 2B shows the evolution of serum albumin concentrations in different groups of cirrhotic animals treated with IGF-I, or with IFN- ⁇ , or with both, on day 0 and day 22, and the effect of therapy with IGF-I. It is observed that IGF-I therapy increases serum albumin concentrations. This effect was not observed in cirrhotic animals treated with IFNa only.
  • Figure 3A shows the concentration of bilirubin in the day 22, for the groups of cirrhotic animals compared to the control animals, checking the efficacy of all treatments in reducing this cholestasis parameter.
  • Figure 3B shows the evolution before and after the bilirubinemia treatment, that is, on day 0 and day 22 for groups of cirrhotic animals treated with IGF-I, or with IFN- ⁇ , or with both.
  • Figure 4A shows serum cholesterol concentrations in all experimental groups on day 22. Hypercholesterolemia was tested in untreated cirrhotic animals, IFN- ⁇ did not modulate this parameter and co-administration of IGF-I + IFN- ⁇ was particularly effective.
  • Figure 4B shows cholesterol levels before and after treatment in animals treated with IGF-I, or with IFN- ⁇ , or both.
  • Figure 5A shows the alkaline phosphatase levels of cirrhotic animals and controls on day 22. A notable increase in this parameter of cholestasis was observed in animals only treated with IFN-alpha, while co-administration of both factors was able to normalize this parameter.
  • Figure 5B shows the evolution of alkaline phosphatase concentrations before and after treatment with IGF-I, or with IFN- ⁇ , or both.
  • Figure 6A shows serum concentrations of aspartate aminotransferase (ASAT) in cirrhotic animals and control animals on day 22.
  • ASAT aspartate aminotransferase
  • Figure 6B shows the evolution of serum concentrations of ASAT before and after treatment with IGF-I, or with IFN- ⁇ , or both.
  • Figure 7A shows the levels of alanine aminotransferase (ALAT) of cirrhotic animals and controls on day 22, at the end of treatment.
  • ALAT alanine aminotransferase
  • FIG. 7B shows the evolution of concentrations in Alanine aminotransferase (ALAT) serum before and after treatment with IGF-I, or with IGF-I and IFN- ⁇ simultaneously.
  • Alanine aminotransferase AAT
  • Figure 8 shows the concentration of malonic dialdehyde as a marker of liver lipid peroxidation levels in cirrhotic animals not treated or treated with the three treatments studied, a significant reduction being observed in the two groups treated with IGF-I.
  • Figure 9 shows the degree of liver fibrosis expressed as a semi-quantitative index, where the symbols have the following meaning: *** p ⁇ 0.001 vs Healthy Controls (CO), &&& p ⁇ 0.001 vs untreated cirrhotic animals (IC), # p ⁇ 0.05 vs
  • Figure 10 shows liver cirrhosis confirmation
  • Figure 11 shows several fields of the liver histopathological appearance of cirrhotic animals treated with IFN- ⁇ for three weeks (group CI + IFN- ⁇ ). (sections 4 ⁇ m; staining with Masson's trichrome staining; various magnifications). A decrease in the number, length and thickness of the fibrous septa was found in this group treated with IFN. However, numerous areas of tissue damage were observed.
  • Figure 12 shows the histopathological appearance of the liver of cirrhotic rats treated with IGF-I for three weeks (group CI + IGF-I). (4 ⁇ m sections; Masson's trichrome staining; various magnifications). A reduction of the Fibrosis in cirrhotic rats treated with IGF-I, when compared with the untreated cirrhotic group (Fig. 1).
  • Figure 13 shows the histopathological results in animals that received co-administration of IGF-I and IFN- ⁇ (group CI + IGF + IFN). (4 ⁇ m sections; Masson's trichrome staining, - various magnifications). A very noticeable decrease in collagen deposits and a clear recovery of normal liver architecture was observed, with steatosis.
  • Figure 14 shows a comparative study including the four cirrhotic groups without treatment or treated with each of the proposed factors or with the co-administration of both. A clear improvement in liver histology was found with the three treatments (CI + IFN, CI + IGF and CI + IFN + IGF). Co-administration of the two factors induced a more effective response.
  • I IGGFF - II insulin-like growth factor I
  • MDA malonic dialdehyde
  • - rhIGF human recombinant factor IGF-I
  • the animals were sacrificed by decapitation 24 hours after receiving the last dose (day 22).
  • the biochemical parameters were determined on day 0 and on 22.
  • Blood was drawn from the retroocular venous plexus with capillary tubes (70 mm; Marienfeld, Germany), divided into aliquots, and stored at -20 0 C until use .
  • the livers were weighed and a sample of the left major lobe of the liver (fixed in Bouin solution) was processed to perform the histological examination Tissue samples were immediately frozen by immersion in liquid N 2 and stored at -80 0 C until assays. All animals included in the groups that received CCl 4 had liver function tests altered on day 0, before the start of treatments, and liver biopsy on day 22 confirmed the establishment of cirrhosis.
  • the malonic dialdehyde (MDA) was used as the lipid peroxidation index in liver homogenates, which was determined after heating the samples at 45 ° C for 60 minutes in an acid medium. It was quantified by a colorimetric assay using LPO-586 (Bioxytech; OXIS International Inc., Portland, OR), which after reacting with MDA, generates a chromophore, which can be measured at 586 nm (Hitachi U2000 Spectro; Boehringer Mannheim) . The titrations were performed in homogenates of liver tissue in Tris-HCl solution (1 g of liver tissue / 10 mL), centrifuged at 300Og- for 10 minutes at 4 ° C.
  • the width of the fibrous septa was calculated with a magnification of 150X adding: 4 points when the average value of the thickness of 9 septa (3 periportals, 3 perivenoses, and 3 perinodulars), measured in four different areas, ranged between 90-125 ⁇ m ; score 3, 70-50 ⁇ m; and score 2, ⁇ 40-30 ⁇ m.
  • the number of septa was scored as:
  • a semi-quantitative determination of fibrosis was made using a numerical scoring system, based on the number, length and thickness of the fibrous septa .
  • IFN- ⁇ therapy did not produce a clear hepatoprotection (histologically) because large areas of the parenchyma appear to be damaged.

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Abstract

La presente invención se refiere al uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) e interferón-alfa (IFN-α), caracterizado porque el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) y el interferón-alfa se emplean en la fabricación de medicamentos útiles en la administración combinada para el tratamiento de la enfermedad hepática crónica, antes y después del establecimiento de la cirrosis hepática, como por ejemplo cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica y ocurrencias simultáneas de las mismas. El tratamiento que se propone se considera particularmente indicado en la enfermedad hepática crónica de origen alcohólico y/o vírico, especialmente con predominio de daño oxidativo como en el caso de la hepatitis C que muchas veces coexiste con hepatitis alcohólica.

Description

USO DEL FACTOR DE CRECIMIENTO SEMEJANTE A LA INSULINA TIPO I Y DE INTERFERÓN ALFA EN EL TRATAMIENTO DE UNA ENFERMEDAD HEPÁTICA CRÓNICA, KIT Y COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN DICHO FACTOR Y DICHO
INTERFERÓN CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se engloba en el área de los tratamientos de enfermedades hepáticas, preferentemente de la cirrosis hepática y hepatopatía crónica con predominio de daño oxidativo (hepatitis alcohólica y por virus C) . ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR A LA INVENCIÓN
La cirrosis es un proceso difuso de fibrosis y formación de nodulos de regeneración, cuya fisiopatología no es bien conocida. La cirrosis hepática es una enfermedad de alta prevalencia social, con escasas posibilidades terapéuticas, en la que el recurso al transplante hepático es la única estrategia terapéutica en estadios avanzados.
El factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I), es una hormona anabolizante, que se sintetiza principalmente en el hígado por el estímulo de la hormona del crecimiento, GH. De hecho, el 90% de las concentraciones plasmáticas de IGF-I son de origen hepático. En la cirrosis, el parénquima hepático tiene reducida su capacidad biosintética, como consecuencia, las concentraciones plasmáticas de IGF-I están disminuidas. Recientemente, se ha vinculado la deficiencia de IGF-I con el grave proceso de desnutrición que sufre el paciente cirrótico, y que ensombrece el pronóstico y disminuye la posibilidades de éxito del transplante hepático. En efecto, se ha demostrado que el tratamiento sustitutivo con IGF-I en cirrosis hepática experimental inducida por tetracloruro de carbono, induce efectos beneficiosos en la cirrosis hepática experimental, mejorando la absorción intestinal (1-3) , el balance de nitrógeno y la eficacia de la dieta (4) , la osteopenia (5) y el hipogonadismo (6) , recupera el tono somatostatinérgico (7), aumenta las defensas antioxidantes (8,9) e induce un efecto antioxidante y antifibrogénico sobre el hígado cirrótico (9-11) , reduciendo la hipertensión portal y la translocación bacteriana.
Por otra parte, se sabe que el IFN alfa inhibe la producción de colágeno. La terapia IFN-α puede suprimir la progresión de fibrosis hepática mediante la inhibición de la fibrogénesis (12-16) y acelerando la fibrolisis en la enfermedad hepática crónica.
Existía, por tanto, una necesidad de diseñar una estrategia terapéutica eficaz en la enfermedad hepática crónica (especialmente en las que predomina el daño oxidativo, como es la de origen alcohólico y por virus C) , que evite o ralentice la progresión de la enfermedad hasta el establecimiento de cirrosis hepática y una vez establecida disminuir la fibrosis (reduciendo la fibrogénesis y aumentando la fibrolisis) y aumentando la capacidad biosintética del hígado cirrótico, además de mejorar el estado nutricional general del paciente.
La presente invención tiene por lo tanto como objeto mejorar la terapia utilizada hasta ahora en dichas enfermedades hepáticas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere al uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) y del interferón-alfa (iFN-α) , en el que el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) y el interferón-alfa se emplean en la fabricación de medicamentos útiles en la administración combinada para el tratamiento de la enfermedad hepática crónica.
Especialmente dicha enfermedad hepática crónica es cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica y ocurrencias simultáneas de las mismas y, de manera especialmente particular dicha enfermedad hepática crónica es la cirrosis hepática.
Según una realización particular de la presente invención para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean preferentemente entre 20 y 200 μg / kg peso corporal del paciente de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I, por día.
Según una realización particular adicional de la presente invención, la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean de 2 a 6 MUI (MUI, millones de unidades internacionales) de interferón-alfa tres veces por semana.
Según otra realización particular adicional de la presente invención, para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean entre 6 y 15 MUI de interferón-alfa por semana. Esta cantidad de interferón-alfa se puede administrar repartida en días alternos o en una única dosis semanal.
Según una ulterior realización particular adicional de la presente invención, la enfermedad es hepatitis por virus C y para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean 0,2 a 1,2 μg/kg de peso corporal del paciente de interferón-alfa por semana.
Según otra realización particular adicional de la presente invención, la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus
B, y para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean de 1,5 a 10 MUI de interferón-alfa tres veces por semana.
Según otra realización particular adicional de la presente invención en que la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean entre 4,5 y 35 MUI de interferón-alfa por semana. Esta cantidad de interferón-alfa se puede administrar repartida en días alternos o en una única dosis semanal.
La presente invención también se refiere a un kit farmacéutico para el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, donde el kit comprende un primer componente que comprende factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) ; y un segundo componente que comprende el interferón-alfa (IFN-α) .
De manera especial la enfermedad hepática crónica es cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica y ocurrencias simultáneas de las mismas. De manera particularmente especial dicha enfermedad es la cirrosis hepática.
Según una realización particular del kit farmacéutico de la presente invención, el primer componente comprende factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de entre 20 y 200 μg de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I, por kilogramo de peso corporal del paciente, y por día.
Según una realización particular adicional del kit farmacéutico de la presente invención la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 2 a 6 MUI de interferón-alfa tres veces por semana.
Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico de la presente invención, el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 6 a 15 MUI de interferón-alfa por semana.
Según una ulterior realización particular adicional del kit farmacéutico la enfermedad es hepatitis por virus C, y el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 0,2 a 1,2 μg de interferón-alfa por kilogramo de peso corporal del paciente, por semana. Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, y el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 1,5 a 10 MUI de interferón-alfa 3 veces por semana. Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 4,5 a 35 MUI de interferón-alfa por semana. Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico, dicho kit comprende además un tercer componente que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente compatibles con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón-alfa. Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico, éste comprende además un tercer componente que comprende uno o más agentes vehiculizantes farmacéuticamente compatibles con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón-alfa. Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico, el primer componente comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón-alfa. Según otra realización particular adicional del kit farmacéutico, el segundo componente comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el interferón-alfa y con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I. La presente invención se refiere además a una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, que comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) y una cantidad farmacéuticamente aceptable de interferón-alfa (IFN-α) .
De manera especial la enfermedad hepática crónica es cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica y ocurrencias simultáneas de las mismas, de manera especialmente preferida dicha enfermedad es la cirrosis hepática. En una realización particular de composición farmacéutica ésta comprende entre 20 y 200 μg de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I por kilogramo de peso corporal del paciente.
Según otra realización particular de la composición farmacéutica, la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C y dicha composición comprende una cantidad de 2 a 15 MUI de interferón-alfa.
Según una ulterior realización particular adicional de la composición farmacéutica, la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y dicha composición comprende una cantidad de 0,2 a 1,2 μg de interferón-alfa, por kilogramo de peso corporal del paciente.
Según otra realización particular adicional de la composición farmacéutica, caracterizada porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis B, y dicha composición comprende una cantidad de 1,5 a 35 MUI de interferón-alfa.
Según otra realización particular de la composición farmacéutica, ésta comprende además un excipiente farmacéuticamente compatible con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón-alfa.
Según otra realización particular de la composición farmacéutica, en dicha composición el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y el interferón-alfa están vehiculizados en sendos agentes vehiculizantes . La composición farmacéutica de la invención se puede administrar por vía parenteral, preferentemente subcutánea, transdérmica o percutánea.
Las formas de administración parenteral se pueden obtener de manera convencional mezclando el ingrediente o ingredientes activos con tampones, estabilizantes, agentes conservantes, agentes solubilizantes, agentes tonificantes y agentes de suspensión. Estas mezclas son esterilizadas por técnicas conocidas y envasadas para ser administradas como inyecciones.
Como forma de administración particular, la composición puede ser una solución, una emulsión o una dispersión estéril. Dicha composición puede ser una preparación inyectable se puede preparar por disolución, emulsión o dispersión del ingrediente o ingredientes activos junto con uno o más excipientes, en agua para inyección. Como tampones se pueden usar sales basadas en organofosfatos.
Ejemplos de agentes solubilizantes son aceite de ricino solidificado con polioxietileno, polisorbato 80, nicotinamida, y macrogol . Como estabilizantes sulfito sódico, metasulfito sódico,- y como agentes conservantes se pueden usar ácido sórbico, cresol, paracresol y otros.
Entre los excipientes que puede comprender la preparación inyectable para administración parenteral se encuentran los tampones, dependiendo de la inyección en tejidos con poder tamponante o sin poder tamponante, y dependiendo de la estabilidad del, o de los ingredientes activos a pH fisiológico.
Entre los tampones se pueden citar las soluciones reguladoras como ácido cítrico-citrato sódico, ácido acético-acetato sódico, y carbonato monosódico-carbonato disódico entre otras.
Otros excipientes opcionales son agentes esterilizantes para evitar la presencia de pirógenos y/o contaminantes.
Otro componente opcional de la composición farmacéutica para administración por vía subcutánea es uno o más agentes vehiculizantes, tales como por ejemplo agua, hidrocarburos, alcoholes, polioles, éteres, aceites vegetales, lanolina, metilcetona, entre otros.
En el caso de necesidad de ligantes, ejemplos de tales ligantes son polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa, ácido algínico, alginato sódico, polimetacrilato, maltodextrina, glucosa liquida, silicato de aluminio, hidroxipropilcelulosa, silicato de aluminio y magnesio, almidón y otros.
En caso de necesidad de un agente desintegrante se puede utilizar ácido algínico, carboximetilcelulosa sódica, dióxido de silicio coloidal, croscaramelosa sódica, crospovidona, alginato sódico, celulosa en polvo, silicato de aluminio y magnesio, almidón pregelatinizado, y otros.
Una emulsión para la forma de administración transdérmica o percutánea de la composición farmacéutica puede obtenerse con ayuda de uno o más agentes emulsionantes, tal como goma arábiga, tragacanto, gelosa, carragaen, pectina y similares. De manera habitual una emulsión comprende agentes conservantes, antifúngicos y especialmente antioxidantes.
Ejemplos de agentes de suspensión para cualquier preparación para administración parenteral son gomas, alginato, metilcelulosa, hidroxietilcelulosa, bentonita, tensioactivos no iónicos, acacia y carboximetilcelulosa, entre otros.
La dosis depende del ingrediente o ingredientes activos, del modo de administración concreto, de la indicación terapéutica y de la edad del paciente.
La composición de la presente invención se puede administrar además por vía percutánea en forma de pomadas, cremas, geles, pastas. Las pomadas pueden comprender uno o más excipientes de origen natural o sintético, y pueden comprender aditivos como agentes antimicrobianos, estabilizantes, antioxidantes, emulgentes y/o espesantes.
Las cremas son pomadas de estructura polifásica que pueden comprender emulgentes como esteres de sorbitano, o monoglicéridos cuando son cremas hidrófobas, o pueden comprende emulgentes como jabones de sodio y trietanolamina, y/o mezclas de polisorbatos con otros emulgentes, cuando son cremas hidrófilas.
Los geles pueden comprender excipientes como parafina líquida adicionada de polietileno, jabones de aluminio o de zinc entre otros, o en el caso de hidrogeles pueden comprender excipientes como agua, glicerol, propilenglicol, goma de tragacanto, derivados de celulosa entre otros.
Otra forma de administración de la composición farmacéutica es la vía rectal, como supositorios. Para la preparación de supositorios, el ingrediente o los ingredientes activos se pueden mezclar de manera conocida con un componente base adecuado, tal como polietilenglicol o glicéridos semisintéticos. La presente invención se refiere además a un método para el tratamiento de una enfermedad hepática crónica Particularmente, la enfermedad hepática crónica puede ser cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica y ocurrencias simultáneas de las mismas. De manera particularmente especial dicha enfermedad es la cirrosis hepática.
Según una realización particular de dicho método el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y el interferón- alfa están presentes en una composición farmacéutica que se administra a dicho individuo humano.
Según otra realización particular de dicho método, el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y el interferón-alfa se administran por separado.
Según otra realización particular adicional de dicho método, para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean entre 20 y 200 μg / kg peso corporal del paciente de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I, por día.
Según todavía otra realización particular adicional de dicho método, la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean 2 MUI a 6 MUI de interferón-alfa tres veces por semana.
Según una ulterior realización particular adicional de dicho método, para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean entre 6 y 15 MUI de interferón-alfa por semana. Según otra realización particular adicional de dicho método, la enfermedad es hepatitis por virus C, y para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean 0,2 a 1,2 μg/kg de peso corporal del paciente, de interferón-alfa por semana. Según otra realización particular adicional de dicho método, la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, y para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean 1,5 MUI a 10 MUI de interferón-alfa tres veces por semana. Según una ulterior realización particular adicional de dicho método, en que la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, para la administración de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I e interferón-alfa, se emplean entre 4,5 y 35 MUI de interferón-alfa por semana.
En una realización ventajosa de la invención, el interferón-alfa puede estar conjugado con un polímero, como polietilenglicol (PEG) . Tales conjugados pueden ser obtenidos preparados mediante procedimientos ya conocidos en del estado de la técnica. Diversos procesos de obtención y las formulaciones que contienen dichos conjugados se describen por ejemplo en las patentes US-5382657, US-5762923, US-5908621, US-6250469, US-6524570 y EP-809996, cuyo contenido se incorpora en la presente memoria descriptiva por referencia.
Para el desarrollo de la presente invención se investigó el efecto de la co-administración de IGF-I+IFNα a ratas Wistar con cirrosis inducida por CCl4, estudiando la evolución de las pruebas de función hepática, peroxidación de lípidos en homogeneizados hepáticos y la histopatología. El diseño experimental incluye controles sanos (CO) , animales cirróticos sin tratamiento (CI) , ratas cirróticos tratadas con IGF-I (CI+IGF, 2μg-100g de peso corporal del paciente -día"1), ratas cirróticas tratadas con IFN alfa (CI+IFN, 3.200 UI, tres días/semana) y ratas cirróticas tratadas con ambos factores (CI+IGF+IFN) durante tres semanas.
Con la presente invención se ha logrado obtener mejores resultados que los obtenidos con la administración de cada factor, IGF-I e IFN-α, por separado, potenciándose la acción antifibrogénica, fibrolítica y hepatoprotectora. También se ha logrado introducir el IFN-α en el tratamiento de la cirrosis, con la posibilidad de reducir las dosis al asociarlo con IGF-I, pauta que puede incrementar la tolerancia de los pacientes a este fármaco.
Una ventaja de la presente invención es por lo tanto, que la co-administración de IGF-I+IFN-α potencia los efectos hepatoprotectores y antifibrogénicos conocidos únicamente en la terapia con IGF-I. Ambos factores mejoran las pruebas de función hepática, la peroxidación lipídica en el hígado cirrótico e inducen una recuperación histopatológica notable. Estos resultados sugieren que IGF-I e IFN-α parecen actuar mediante mecanismos diferentes, dando como resultado una acción más eficaz sobre el hígado cirrótico. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura IA muestra las concentraciones en suero de proteínas totales en el día 22, en los distintos grupos de animales cirróticos y en el grupo de controles sanos.
La figura IB muestra las concentraciones en suero de proteínas totales antes y después del tratamiento, en el día 0 y en el día 22, en los grupos de animales cirróticos tratados con
IGF-I, o con IFN, o con ambos, demostrando el efecto anabolizante de IGF-I, que no se observa sólo con IFN.
La figura 2A muestra las concentraciones de albúmina sérica en los distintos grupos de animales cirróticos comparados con los animales control, en el día 22.
La figura 2B muestra la evolución de las concentraciones de albúmina sérica en distintos grupos de animales cirróticos tratados con IGF-I, o con IFN-α, o con ambos, en el día 0 y en el día 22, y el efecto de la terapia con IGF-I. Se observa que la terapia con IGF-I aumenta las concentraciones de albúmina en suero. Este efecto no se observó en animales cirróticos tratados sólo con IFNa.
La figura 3A muestra la concentración de bilirrubina en el día 22, para los grupos de animales cirróticos comparados con los animales control, comprobándose la eficacia de todos los tratamientos en la reducción de este parámetro de colestasis.
La figura 3B muestra la evolución antes y después del tratamiento de bilirrubinemia, es decir, en el día 0 y en el día 22 para grupos de animales cirróticos tratados con IGF-I, o con IFN-α, o con ambos.
La figura 4A muestra las concentraciones de colesterol en suero todos los grupos experimentales en el día 22. Se comprobó la hipercolesterolemia en los animales cirróticos sin tratamiento, el IFN-α no moduló este parámetro y la co¬ administración de IGF-I+IFN-α se mostró particularmente eficaz.
La figura 4B muestra los niveles de colesterol antes y después del tratamiento en animales tratados con IGF-I, o con IFN-α, o con ambos.
La figura 5A muestra los niveles de fosfatasa alcalina de los animales cirróticos y los controles en el día 22. Se observó un incremento notable en este parámetro de colestasis en los animales únicamente tratados con IFN-alfa, mientras que la coadministración de ambos factores fue capaz de normalizar este parámetro.
La figura 5B muestra la evolución de las concentraciones de fosfatasa alcalina antes y después del tratamiento con IGF-I, o con IFN-α, o con ambos. La figura 6A muestra las concentraciones en suero de aspartato aminotransferasa (ASAT) en los animales cirróticos y los animales control en el día 22.
La figura 6B muestra la evolución de las concentraciones en suero de ASAT antes y después del tratamiento con IGF-I, o con IFN-α, o con ambos.
La figura 7A muestra los niveles de alanina aminotransferasa (ALAT) de los animales cirróticos y los controles en el día 22, al finalizar el tratamiento.
La figura 7B muestra la evolución de las concentraciones en suero de alanina aminotransferasa (ALAT) antes y después del tratamiento con IGF-I, o con IGF-I e IFN-α simultáneamente.
La figura 8 muestra la concentración de dialdehído malónico como marcador de los niveles de peroxidación de lípidos hepática, en animales cirróticos no tratados o tratados con los tres tratamientos estudiados, observándose una reducción significativa en los dos grupos tratados con IGF-I.
La figura 9 muestra el grado de fibrosis hepática expresado como un índice semicuantitativo, donde los símbolos tienen el significado siquiente: ***p<0,001 vs Controles sanos (CO), &&& p<0,001 vs animales cirróticos sin tratamiento (CI), # p<0,05 vs
CI+IGF+IFN.
La figura 10 muestra la confirmación de cirrosis hepática
(grupo cirrótico no tratado, CI) . Los resultados histopatológicos en biopsias de hígado de ratas que recibieron
CCl4 y que no recibieron ningún tratamiento (secciones de 4μm,- tinción con tricrómico de Masson; magnificación de 15Ox) . En particular, se muestran los resultados histopatológicos en biopsias de hígado de ratas que recibieron CCl4 y no recibieron ningún tratamiento (secciones de 4 μm,- tinción tricrómico de
Masson; magnificación original 15Ox) . Se observa el establecimiento de la cirrosis hepática con septo.
La figura 11 muestra varios campos del aspecto histopatológico del hígado de los animales cirróticos tratados con IFN-α durante tres semanas (grupo CI+IFN-α) . (secciones 4μm; tinción con coloración tricrómica de Masson; varias magnificaciones) . Se encontró una disminución del número, de la longitud y el grosor de los septa fibrosos en este grupo tratado con IFN. Sin embargo, se observaron numerosas áreas de daño tisular.
La figura 12 muestra el aspecto histopatológico del hígado de ratas cirróticas tratadas con IGF-I durante tres semanas (grupo CI+IGF-I) . (secciones 4μm; tinción con tricrómico de Masson; varias magnificaciones) . Se observó una reducción de la fibrosis en ratas cirróticas tratadas con IGF-I, cuando se compararon con el grupo cirrótico no tratado (Fig. 1) .
La figura 13 muestra los resultados histopatólogicos en animales que recibieron la coadministración de IGF-I e IFN-α (grupo CI+IGF+IFN) . (secciones de 4μm; tinción tricrómico de Masson,- varias magnificaciones) . Se observó una disminución muy notable de los depósitos de colágeno y una recuperación clara de la arquitectura hepática normal, con esteatosis.
La figura 14 muestra un estudio comparativo incluyendo los cuatro grupos cirróticos sin tratamento o tratados con cada uno de los factores propuestos o con la co-administración de ambos. Se encontró una clara mejoría de la histología hepática con los tres tratamientos (CI+IFN, CI+IGF y CI+IFN+IGF) . La co¬ administración de los dos factores indujo una respuesta más eficaz.
MODO DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
En las figuras anexas y en el siguiente texto aparecen leyendas que tienen los siguientes significados:
CI: grupo cirrótico; C CII ++ I IGGFF--II:: grupo cirrótico tratado con IGF-I;
CI + IFN-α: grupo cirrótico tratado con IFM-α2a,-
CI + IGF-I + IFN ratas cirróticas tratadas con IGF-I e IFN- α2a;
CO: controles sanos; I IGGFF--II: : factor de crecimiento I semejante a la insulina;
MDA: dialdehido malónico,- rhIGF : factor recombinante humano IGF-I
UI: unidad internacional
Materiales y métodos Inducción de cirrosis hepática
Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo según lo establecido por The Guiding Principies for Research Involving Animáis (17) . Se indujo cirrosis hepática a 40 ratas Wistar macho (3+1 semanas de edad, 110-120 g) mediante inhalación de CCl4 (Merck, Darmstadt, Germany) 2 veces por semana durante 11 semanas, con un tiempo de exposición creciente desde 1 hasta 5 minutos (18) , y se añadió fenobarbital (Luminal; Bayer, Leverkusen, Germany) al agua de beber (400 mg/L) (18-19) . Se estudiaron paralelamente ratas control sanas que no recibieron fenobarbital, ni CCl4. Las ratas se dispusieron en jaulas, colocadas en una habitación con un ciclo de luz- oscuridad de 12 horas, y humedad y temperatura constantes (200C) . Tanto el alimento como el agua fueron suministrados ad libitum (dieta semipurificada para roedores; B. K. Universal, Sant Vicents deis Horts, Spain) .
Diseño del estudio
El periodo de estudio (periodo de administración de suero salino o con los factores de crecimiento) se inició 5 días después de detener la administración de CCl4 (día 0) . Las ratas cirróticas fueron aleatoriamente distribuidas para recibir, o bien suero salino (grupo CI, n=10) , o factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I, recombinante, humano, IGF-I (rhIGP-I; 2μgIGF-I-100 g de peso corporal"1 -día"1 en dos dosis se; grupo CI + IGF, n=10) , IFN-α2a (3.200 UI-100 g de peso corporal"1 tres veces por semana, se; grupo CI + IFN-α, n=10) o ambos IGF-I e IFN-α2a; grupo CI + IGF + IFN-α, n=10) subcutáneamente durante 21 días.
Los animales fueron sacrificados por decapitación 24 horas después de recibir la última dosis (día 22) . Los parámetros bioquímicos fueron determinados en el día 0 y en el 22. La sangre se extrajo del plexo venoso retroocular con tubos capilares (70 mm; Marienfeld, Germany) , se dividieron en alícuotas, y se almacenaron a -20 0C hasta su uso. Los hígados fueron pesados y se procesó una muestra del lóbulo mayor izquierdo del hígado (fijado en solución Bouin) para realizar el examen histológico. Las muestras de tejido fueron congeladas inmediatamente por inmersión en N2 líquido y almacenadas a -800C hasta el momento de los ensayos. Todos los animales incluidos en los grupos que recibieron CCl4 tenían alteradas las pruebas de función hepática el día 0, antes del inicio de los tratamientos, y la biopsia hepática en el día 22 confirmó el establecimiento de la cirrosis.
Métodos analíticos Las pruebas de función hepática fueron realizadas en suero mediante métodos de laboratorio rutinarios, usando un autoanalizador Hitachi 747 (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) .
Se utilizó como índice de peroxidación de lípidos en homogeneizados de hígado el dialdehido malónico (MDA) , que se determinó después de calentar las muestras a 45°C durante 60 minutos en medio ácido. Se cuantificó mediante un ensayo colorimétrico usando LPO-586 (Bioxytech; OXIS International Inc., Portland, OR), el cual después de reaccionar con MDA, genera un cromóforo, que puede ser medido a 586 nm (Hitachi U2000 Spectro; Boehringer Mannheim) . Las valoraciones fueron realizadas en homogeneizados de tejido hepático en solución Tris-HCl (1 g de tejido hepático/10 mL) , centrifugado a 300Og- durante 10 minutos a 4°C.
Grado histológico de fibrosis
Se llevó a cabo una valoración semicuantitativa de la fibrosis, a doble ciego, en secciones de hígado teñidas con tricrómico de Masson, estableciendo un índice según una puntuación basada en el número, longitud, y grosor de los septos fibrosos. La longitud de los septos (examinada con una magnificación de 80X) fue valorada como sigue:
1 punto, fibrosis de grado mínimo que puede ser observada en hígados normales,- 4 puntos, septos confluentes entre tractos portales y entre tractos portales y venas centrales; y
2 y 3 puntos, longitud intermedia de los septos.
La anchura de los septos fibrosos fue calculada con una magnificación de 150X sumando: 4 puntos cuando el valor medio del grosor de 9 septa (3 periportales, 3 perivenosos, y 3 perinodulares) , medido en cuatro áreas diferentes, oscilaba entre 90-125 μm; puntuación 3, 70-50 μm; y puntuación 2, ~40-30 μm.
El número de septos se puntuó como:
4 puntos, cuando había numerosos septos que se extendían dentro los nodulos, delimitando así un pequeño número de hepatocitos formando micronódulos;
2-3 puntos, cuando los septos que penetraron en los nodulos fueron menos numerosos estableciéndose nodulos mayores,- y
1 punto cuando no hubo formación de micronódulos dentro de los macronódulos.
Se evaluaron a ciegas cuatro áreas de cada preparación dos veces, por dos observadores distintos, recibiendo un máximo de 12 puntos cada vez . La media aritmética de las dos puntuaciones se consideró como puntuación final.
Análisis estadístico
Los datos están expresados como la media ± SEM. Para valorar la homogeneidad entre los cinco grupos de ratas, se utilizó un análisis de Kruskall-Wallis, seguido de múltiples comparaciones post hoc usando ensayos de Mann-Whitney U con ajuste de Bonferroni. Se aplicó el test de Student T, para determinar las diferencias entre antes y después del tratamiento en cada animal. Cualquier valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo. Los cálculos se realizaron con un programa SPSSWin v.6.0. (SPSS Inc., Chicago, IL) .
Resultados
En el día 0 (5 días después de la interrupción de la administración de CCl4) , antes de empezar los diferentes tratamientos, las ratas que habían recibido el tóxico (ahora subdivididas en los grupos CI, CI+IGF y CI+IGF+IFN) tenían valores similares en suero de aspartato amino-transaminasa (ASAT) , alanina amino transferasa (ALAT) , bilirrubina, fosfatasa alcalina, glucosa, albúmina, colesterol y proteínas totales (Tabla 1, p=ns entre los grupos de animales cirróticos, CI) .
Tabla 1
Figure imgf000019_0001
*p<0,05, **p<0,001, ***p<0,001 vs grupo controles sanos (CO) 1. Pruebas de función hepática.
Se realizaron en suero los siguientes ensayos para evaluar la función hepática:
1.1. Proteínas totales en suero
En el grupo cirrótico no tratado (CI) no mostró una reducción significativa, como suele ser habitual, de las proteínas totales (C0=6, 91±0, 12; CI=6, 61±0, 18, g/dL) , tal como se muestra en la Figura IA. Sin embargo, se observó un efecto anabolizante de la terapia con IGF-I de nuevo en esta serie (CI+IGF=6,94±0,19, p<0,05 CI+IFN VS CI+IGF; CI+IFN=6, 73+0, 10; CI+IGF+IFN=6, 84+0, 13, g/dL) (ver Figura IB, datos antes y después del tratamiento) .
1.2. Concentraciones de albúmina en suero
En el día 22, los animales cirróticos mostraron una reducción de la albúmina sérica con respecto a los controles sanos (C0=3, 64±0, 06; CI=3, 15+0, 14, g/dL), tal como se muestra en la figura 2A.
El efecto de IGF-I sobre este parámetro se observó sólo cuando se compararon los datos antes y después del tratamiento en cada animal (CI+IGF= 3,26+0,11; CI+IFN= 3,23±0,08; CI+IGF+IFN=3,31+0, 06, g/dL) (ver Figura. 2B) .
1•3.Concentraciones de bilirrubina en suero
En el día 22, los animales cirróticos sin tratamiento mostraron elevados niveles de bilirrubina (CI=O, 48±0, 18, mg/dL) con respecto a los controles sanos (CO=O, 1+0, 01) . Todos los tratamientos redujeron este parámetro de colestasis (CI+IGF= 0,26±0,l; CI+IFN=0,13±0,02, p<0,01 VS CI; CI+IGF+IFN= 0,14±0,03 mg/dL, p<0,05 vs CI) (ver figura 3A) .
Cuando se estudiaron la evolución de las concentraciones de bilirrubina antes y después del tratamiento, se observó que la co-administración de IGF+IFN fue más útil que la administración de cada factor por separado (figura 3B) .
1.4. Concentraciones de colesterol en suero Los animales cirróticos no tratados (grupo CI) mostraron hipercolesterolemia con respecto a los controles, tal como se observa en la figura 4A (CO=49,55+3, 60, vs,- CI=69, 72+4,50, mg/dL, p<0,01 vs CO) . El tratamiento con IGF-I indujo una reducción de este marcador de colestasis (CI+IGF=62, 62+5,53) , mientras que el tratamiento con IFN-α no indujo cambios
(CI+IFN=67,33+3,54, p<0,05 vs CO) (figura 4A) . Se observó de nuevo que la co-administración fue más eficaz que la administración por separado de IGF e IFN (CI+IGF+IFN=48,44+3, 89, p<0,01 vs CI), (figura 4B) .
1.5. Fosfatasa alcalina
Los animales cirróticos sin tratamiento presentaron un incremento significativo de las concentraciones de fosfatasa alcalina en suero con respecto al grupo control (CO=65,44+4,32 UI/L, CI=98,22+9,48, p<0,05) El tratamiento con IFN indujo un incremento todavía mayor de este parámetro de colestasis (CI+IFN=205,45+31, 59 UI/L), p<0,001 vs CO y p<0,01 vs CI) . El tratamiento con IGF-I no moduló este parámetro (CI+IGF=90,50+6,49, p=ns vs CI, p>0,05 vs CO, y p<0,01 vs CI+IFN) . Sin embargo, la coadministración de IGF+IFN indujo una normalización de las concentraciones séricas de fosfatasa alcalina (CI+IGF+IFN=62, 33+7, 16 p=ns vs CO, y p<0,01 vs los otros grupos de animales cirróticos) (FIGURA 5) .
1.6. Aspartato-aminotransferasa (ASAT)
Los animales cirróticos sin tratamiento (CI) presentaron un aumento significativo de ASAT cuando se compararon con los controles (CO=80, 22+6, 83; CI=163, 25±42, 75, UI/L, p<0,05 vs CO)
(figura 6A) . Ni los animales tratados con IGF-I ni los tratados con IGF-I+IFN mejoraron significativamente este parámetro (CI+IGF=123, 75+21, 09 p<0,05 vs CO; CI+IGF+IFN=104, 77±7, 24 p<0,05 vs CO) . Sólo animales cirróticos tratados con iFN-α normalizaron las concentraciones de ASAT (CI+IFN=91,12+16, 84) (figura 5A) . Aunque el tratamiento con IFN-α tuvo un efecto claro, cuando se compararon los datos antes y después del tratamiento, se observó que la co-administración de IGF-I+IFN mostró una reducción de los niveles de aspartato aminotransferasa en todos los animales de este grupo (figura 6B) .
1.7. Alanina-aminotransferasa (ALAT)
Los animales cirróticos mostraron concentraciones significativamente altas de ALAT, con respecto a los controles (CO=34,55+1,30, CI=57, 63±9,36) . El tratamiento con IFN no moduló este parámetro (CI+IFN=60, 16+6, 76) (figura 7A) . Sin embargo los tratamientos con IGF-I y IGF-I+IFN-α normalizaron este marcador de citolisis (CI+IGF=47, 52+6,82, CI+IGF+IFN=39,95+3,27) .
Un resultado similar se observó entre las series de animales tratados con IGF-I e IGF-I+IFN-α, cuando se compararon los datos antes y después del tratamiento.
2. Marcador de peroxidación de lípidos en homogeneizados de hígado (dialdehido malónico) (MDA)
Los niveles hepáticos de los productos de peroxidación de lípidos (expresados como nanomoles de MDA por gramo de tejido) se elevaron en los cuatro grupos cirróticos (CI=116, 17+14, 59 vs
CO=38, 75+0, 56 nmol/g, p<0,001) . Resultado este esperable por el efecto tóxico del CCl4 que produce daño oxidativo en el hígado.
El tratamiento con IGF-I o con IGF-I+IFN redujo significativamente la peroxidación en tejido hepático
(CI+IGF=62,16±5,39, p<0,01 VS CI; CI+IGF+IFN=71, 95+8, 62, p<0,05 vs CI) (figura 8) . Sin embargo, el grupo tratado sólo con IFN- α2a mostró una reducción de las concentraciones hepáticos de peróxidos lipídicos, que no alcanzó significación estadística. 3. Resultados anatomopatológicos. índice semicuantitativo de fibrosis.
El estudio histológico demostró el establecimiento de la cirrosis hepática (Fig. 10) . Tanto el tratamiento con IFN-α (Fig.ll) como con IGF-I (Fig. 12) por separado indujeron una reducción evidente de la fibrosis cuando se compararon con los animales cirróticos no tratados. Sin embargo, el efecto antifibrogénico más eficaz fue observado en animales tratados con la co-administración de IGF-I+IFN (Fig. 13 y 14) .
Como se ha descrito previamente (11) , en cortes histológicos de hígado teñidas con tricrómico de Masson, se hizo una determinación semicuantitativa a ciegas de la fibrosis, usando un sistema de puntuación numérico, basado en el número, longitud y grosor de los septos fibrosos. La puntuación histológica de la fibrosis fue significativamente más baja en el grupo CI+IGF+IFN (índice: 4,81+0,37, p<0,001 vs CI y p<0,05 vs CI+IFN y CI+IGF p<0,05 vs CI+IFN+IGF, p=ns vs CI+IFN, y p<0,001 vs CI) que en los otros grupos cirróticos CI+IGF (6,56+0,49), CI+IFN (6,04±0,26, p<0,05 vs CI+IFN+IGF, p=ns vs CI+IGF, y p<0,001 vs CI) y CI (9,89+0,51, p<0,001 vs los grupos tratados con IGF, IFN o con ambos) (ver Fig. 9)
La terapia con IFN-α, reduciendo la fibrosis (ver Fig. 11) , no produjo una hepatoprotección clara (desde el punto de vista histológico) porque extensas áreas del parénquima parecen estar dañadas.
El tratamiento con IGF-I parece inducir una recuperación en la arquitectura hepática (ver Fig 12) . Este efecto fue más evidente en animales tratados con ambos factores (ver Fig. 13) . REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Uso del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) e interferón-alfa (IFN-α) , caracterizado porque el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) y el interferón-alfa se emplean en la fabricación de medicamentos útiles en la administración combinada para el tratamiento de una enfermedad hepática crónica.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica o una ocurrencia simultánea de al menos dos de las mismas.
3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es la cirrosis hepática.
4. Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el medicamento está diseñado para la administración entre 20 y 200 μg / kg peso corporal del paciente, del factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I, por día.
5. Uso según una de las reivindicaciones 1, 2 y 4, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y el medicamento está diseñado para la administración de 2 a 6 MUI de interferón-alfa, tres veces por semana.
6. Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el medicamento está diseñado para la administración de entre 6 y 15 MUI de interferón-alfa por semana.
7. Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la enfermedad es hepatitis por virus C, y porque el medicamento está diseñado para la administración de 0,2 a 1,2 μg / kg de peso corporal del paciente de interferón-alfa por semana.
8. Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, y porque el medicamento está diseñado para la administración de 1,5 a 10 MUI de interferón-alfa, tres veces por semana.
9. Uso según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, y porque el medicamento está diseñado para la administración de 4,5 a 35 MUI de interferón-alfa, por semana.
10. Un kit farmacéutico para el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, caracterizado porque comprende un primer componente que comprende factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) ; y un segundo componente que comprende el interferón-alfa (IFN-α) .
11. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica o una ocurrencia simultánea de al menos dos de las mismas.
12. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque el primer componente comprende factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de entre 20 y 200 μg de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I, por kilogramo de peso corporal de paciente, y por día.
13. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y porque el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 2 a 6 MUI de interferón-alfa tres veces por semana.
14. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque el segundo componente comprende interferón- alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 6 y 15 MUI de interferón-alfa por semana.
15. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque la enfermedad es hepatitis por virus C, y porque el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 0,2 a 1,2 μg de interferón-alfa por kilogramo de peso corporal del paciente, por semana.
16. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque la enfermedad"hepática crónica es hepatitis por virus B, y porque el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 1,5 a 10 MUI de interferón-alfa, tres veces por semana.
17. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10 o 11, caracterizado porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus B, y porque el segundo componente comprende interferón-alfa en una cantidad suficiente para proporcionar una dosis de 4,5 a 35 MUI de interferón-alfa, por semana.
18. Un kit farmacéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, caracterizado porque comprende además un tercer componente que comprende uno o más excipientes farmacéuticamente compatibles con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón-alfa.
19. Un kit farmacéutico según una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17, caracterizado porque comprende además un tercer componente que comprende uno o más agentes vehiculizantes farmacéuticamente compatibles con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón- alfa.
20. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10, caracterizado porque el primer componente comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable y compatible con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón-alfa.
21. Un kit farmacéutico según la reivindicación 10, caracterizado porque el segundo componente comprende además uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el interferón-alfa y con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I.
22. Una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad hepática crónica, caracterizada porque comprende una cantidad farmacéuticamente aceptable de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I (IGF-I) y una cantidad farmacéuticamente aceptable de interferón-alfa (IFN-α) .
23. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22, caracterizada porque la enfermedad hepática crónica es cirrosis hepática, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica o una ocurrencia simultánea de al menos dos de las mismas.
24. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22, caracterizada porque comprende entre 20 y 200 μg de factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I por kilogramo de peso corporal de paciente.
25. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22 o 23, caracterizada porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C y porque comprende una cantidad de 2 a 15 MUI de interferón-alfa.
26. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22 o 23, caracterizada porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis por virus C, y porque comprende una cantidad de 0,2 a 1,2 μg de interferón-alfa, por kilogramo de peso corporal de paciente.
27. Una composición farmacéutica según la reivindicación 22 o 23, caracterizada porque la enfermedad hepática crónica es hepatitis B, y porque comprende una cantidad de 1,5 a 35 MUI de interferón-alfa.
28. Una composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 22 a 27, caracterizada porque comprende además un excipiente farmacéuticamente compatible con el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y con el interferón- alfa.
29. Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 28, caracterizada porque el factor de crecimiento semejante a la insulina tipo I y el interferón-alfa están vehiculizados en sendos agentes vehiculizantes.
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