WO2006030792A1 - 非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物 - Google Patents

非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物 Download PDF

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WO2006030792A1
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mrna
fat
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PCT/JP2005/016854
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Jun Suzuki
Hisashi Iwaasa
Minoru Sasaki
Makoto Ito
Akio Kanatani
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Banyu Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • G—PHYSICS
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin

Definitions

  • the present invention relates to a non-alcoholic steatohepatitis model animal, a method for producing the animal, and a drug screening method using the animal.
  • non-alcoholic fatty liver (not caused by alcohol consumption, fatty liver) has been considered to be a condition that does not require any treatment that does not adversely affect the body.
  • non-alcoholic fatty livers develop into hepatitis due to stimuli such as oxidative stress and further cause fibrosis of the liver, resulting in cirrhosis or liver cancer.
  • NASH nonalcoholic steatohepatitis
  • MCD model a mouse (hereinafter referred to as “MCD model”) produced by ingesting an MCD (methionine- and choline-deficient) diet is currently known.
  • the MCD model is related to the development of steatohepatitis, increased alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in the blood, and increased triglyceride (TG) in the liver! ], Characteristic findings of non-alcoholic steatohepatitis, such as increased mRNA of inflammatory site force in the liver (tumor necrosis factor a (TNF ⁇ ), interleukin 1 j8 (IL-1 j8), etc.) In view of this, it is considered an excellent non-alcoholic fatty hepatitis model animal!
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor a
  • IL-1 j8 interleukin 1 j8
  • Non-Patent Literature l Rinella, M. E. et al., J. Hepatology, 40: 47-51 (2004)
  • the present invention overcomes the above-mentioned problems of the MCD model, and more accurately reflects the actual pathology of a patient with nonalcoholic steatohepatitis, a method for producing the same, and a nonalcoholic fat
  • the purpose is to provide a more effective drug screening method for the development of therapeutic drugs for hepatitis.
  • the present invention provides tetracycline antibiotics to animals whose body weight has been significantly increased by ingesting a high-fat diet compared to a group ingested a normal diet.
  • a non-alcoholic steatohepatitis model animal produced by continuous administration.
  • Such a non-alcoholic steatohepatitis model animal is a non-alcoholic steatohepatitis patient in that the body weight, blood insulin concentration and blood glucose concentration are normal values or higher. It becomes a disease state model animal that more accurately reflects the actual disease state.
  • the high-fat diet is preferably a diet containing at least protein, carbohydrate and fat, and is preferably a diet having a fat-derived calorie occupying 30% or more of the total calories of the diet.
  • Antibiotics should be administered continuously until blood ALT levels, blood AST levels, liver TG levels, liver TNF ⁇ mRNA levels, and liver IL lj8 mRNA levels are significantly higher than those of normal healthy animals. Good.
  • the non-alcoholic steatohepatitis disease model animal is a high-fat diet that contains at least protein, carbohydrates and fat, and that contains at least 30% fat-derived calories in the total calories of the diet Blood ALT concentration, blood AST concentration, liver TG content, liver TNF a mRNA content and liver IL l j8 mRNA content strength are continuously ingested until it becomes significantly higher than that of healthy animals of the same species. Animals can also be employed. Such pathological model animals also have positive body weight, blood insulin concentration and blood glucose concentration. In terms of showing normal or higher values, it is a more accurate reflection of the actual condition of patients with nonalcoholic steatohepatitis. Depending on the intake period of the high-fat diet, it becomes a model animal with more advanced non-alcoholic steatohepatitis accompanied by fibrosis of the liver.
  • a non-alcoholic steatohepatitis model animal is an animal whose body weight is significantly increased by feeding a high-fat diet compared to a group fed a normal diet. It can be prepared by continuously administering a tetracycline antibiotic.
  • a high-fat diet is a diet that contains at least protein, carbohydrate, and fat, and a diet that contains at least 30% fat-derived calories in the total calories of the diet.
  • Antibiotics should be administered continuously until blood ALT levels, blood AST levels, liver TG levels, liver TNF ⁇ mRNA levels, and liver IL lj8 mRNA levels are significantly higher than those of normal healthy animals. Prefer U ,.
  • a disease model animal that overcomes the problems of the MCD model and more accurately reflects the actual disease state of a non-alcoholic steatohepatitis patient, a method for producing the disease model animal, and a non-alcoholic fat It is possible to provide a more effective drug screening method for the development of therapeutic drugs for hepatitis.
  • FIG. 1 is a line graph showing the change in body weight in mice fed with HFD or a control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the plasma ALT concentration of mice that received HFD or a control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 3 is a bar graph showing the plasma AST concentration of mice fed with HFD or a control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 4 is a bar graph showing the plasma insulin concentration of mice that received HFD or a control diet for 8 weeks and were intraperitoneally administered with tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 5 is a bar graph showing plasma glucose concentration of mice fed with HFD or a control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • [8] A bar graph showing the amount of liver IL 1 j8 mRNA in mice in which tetracycline hydrochloride was intraperitoneally administered for 10 days after ingesting HFD or control food for 8 weeks.
  • FIG. 9 is a diagram corresponding to an optical micrograph showing the results of hematoxylin 'eosin staining on a section of a liver intermediate lobe of a mouse administered with HFD for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride 30 mg ZkgZ for 10 days.
  • FIG. 10 is a diagram corresponding to an optical micrograph in which a portion indicated by a black frame in FIG. 9 is enlarged.
  • FIG. 11 is a diagram corresponding to a photomicrograph showing the result of oil red O staining of a section of a liver intermediate lobe of a mouse that was fed with HFD for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride 30 mg ZkgZ for 10 days.
  • FIG. 12 is a line graph showing the change in body weight of mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 13 is a bar graph showing the plasma ALT concentration in mice that were ingested with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 14 is a bar graph showing the plasma AST concentration in mice in which HFD was ingested for 8 weeks and tetracycline hydrochloride was administered subcutaneously for 10 days.
  • FIG. 15 is a bar graph showing plasma insulin concentrations in mice administered with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 16 is a bar graph showing the plasma glucose concentration of mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 17 is a bar graph showing the amount of liver TG in mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 18 is a bar graph showing the amount of liver TNF a mRNA in mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 19 is a bar graph showing the amount of liver IL-1
  • FIG. 20 is a bar graph showing the body weight of mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 21 is a bar graph showing the plasma ALT concentration of mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 22 is a bar graph showing plasma AST concentration in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 23 is a bar graph showing plasma insulin concentrations in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks.
  • FIG. 24 is a bar graph showing plasma glucose concentration of mice fed with HFD or control diet for 50 weeks.
  • FIG. 25 is a bar graph showing the amount of liver TG in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 26 is a bar graph showing the amount of liver TNF a mRNA in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 27 is a bar graph showing the amount of liver IL-1
  • FIG. 28 is a view corresponding to an optical micrograph showing the result of staining with hematoxylin and eosin on a section of the liver middle lobe of a mouse fed with HFD for 50 weeks.
  • FIG. 29 is a view corresponding to an optical micrograph showing the results of hematoxylin-eosin staining of a section of the liver middle lobe of a mouse fed with a control diet for 50 weeks.
  • FIG. 30 is a bar graph showing the amount of liver type I collagen DmRNA in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 31 is a bar graph showing the amount of liver ⁇ -SMA mRNA in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • the animal used for producing the non-alcoholic steatohepatitis disease model animal of the present invention (hereinafter referred to as "NASH disease model animal") is generally used as a human disease disease model animal.
  • the body weight is significantly increased as compared to the group fed with a normal diet.
  • the high-fat food to be ingested should contain at least protein, carbohydrates and fat, and should have 30% or more of fat-derived calories in the total calories.
  • the lower limit for calories from fat is preferably 45%, more preferably 60%.
  • the upper limit is preferably 80%, more preferably 70%.
  • the significance level in the t-test is 1% or 5%, preferably 1%.
  • a NASH disease state model animal is produced by continuously administering tetracycline antibiotics to an animal whose body weight has significantly increased as described above.
  • continuous administration means that administration is performed a plurality of times, preferably at regular intervals.
  • tetracycline antibiotics administered continuously include tetracycline (TC), oxytetracycline (OTC), metacycline (MTC), doxycycline (DOXY), minocycline (MIN O), and salts thereof. (Hydrochloride, etc.).
  • Tetracycline antibiotic administration significantly increases blood ALT concentration, blood AST concentration, liver TG level, liver TNF a mRNA level, and liver IL lj8 mRNA level compared to healthy animals of the same species.
  • blood ALT concentration, blood AST concentration, liver TG amount, liver TNF a mRNA amount and liver IL l j8 mRNA amount are significantly higher than those of healthy animals of the same type, It is more preferable to continue until the presence of fatty liver and infiltration of inflammatory cells are observed in the histopathological examination of the liver.
  • whether or not the above values are significantly higher than that of healthy animals of the same species can be determined by a t-test with a significance level of 1% or 5% (preferably 1%).
  • a diet containing at least protein, carbohydrate, and fat, and a high-fat diet with a fat-derived calorie occupying 30% or more of the total calories of the diet, blood ALT Concentration, blood AST concentration, liver TG level, liver TNF a mRNA level and liver IL 1 mRNA level can be taken continuously for a certain period of time until they are significantly higher than those of healthy animals of the same species.
  • NASH disease model animals can be produced without continuous administration of tetracycline antibiotics.
  • continuous ingesting means ingesting multiple times.
  • fatty liver is formed during the high fat diet intake period prior to tetracycline antibiotic administration.
  • fatty liver is formed during the high fat diet intake period prior to tetracycline antibiotic administration.
  • it is preferably 6 to 10 weeks, and more preferably 7 to 9 weeks. It is preferable to take a high-fat diet even during administration of tetracycline antibiotics.
  • the dosage and administration period of the tetracycline antibiotic is preferably 20 to 20 for mice. : LOOmg / kg / day, 7 to 14 days, more preferably 20 to 40 mg ZkgZ day, 9 to: L 1 day. Fat liver may not develop hepatitis at 20 mg / kg / day for less than 7 days.On the other hand, if it exceeds lOOmgZkgZ day for 15 days, any of body weight, blood insulin concentration and blood glucose concentration is normal. May be lower than the value.
  • the administration method of the tetracycline antibiotic is preferably intraperitoneal administration or subcutaneous administration.
  • the tetracycline antibiotic may be administered in the form of a pharmacologically acceptable salt.
  • the intake period of the high fat diet should be sufficient to develop steatohepatitis.
  • it is 20 weeks or more, more preferably 40 weeks or more. In less than 20 weeks, steatohepatitis may not fully develop.
  • mice be fed a high-fat diet for 40 weeks or longer.
  • the occurrence of liver fibrosis is, for example, that the amount of liver type I collagen (a 1) mRNA or liver a-SMA (smooth muscle actin) mRNA is significantly higher than that of healthy animals of the same species. Can be confirmed.
  • type I collagen ( ⁇ 1) represents one chain of type I collagen.
  • a screening method for a drug for non-alcoholic steatohepatitis comprising the step of administering a candidate drug for non-alcoholic steatohepatitis to a NASH disease model animal is provided.
  • a step of determining whether the candidate drug is effective as a drug for nonalcoholic steatohepatitis can be provided after the step of administering the candidate drug.
  • blood ALT Concentration, blood AST concentration, liver TG level, liver TNF o; mRNA level and liver IL-1 ⁇ mRNA level are not significantly higher than those of healthy animals of the same type.
  • the effectiveness as a drug can be determined.
  • the effectiveness as a drug for non-alcoholic steatohepatitis can be determined based on the absence of inflammatory cell infiltration in the histopathological examination of the liver.
  • NASH disease model animal of the present invention and the drug screening method using the same are the same as the known disease model animal and the drug screening method using the same in screening tests and pharmacological tests for the purpose of drug development. Can be used.
  • C57B LZ6J male mice (CLEA Japan, Inc.) were used as animals for preparing pathological model animals.
  • HFD high fat diet
  • D12492 fat content: 60 kcal%) (Research Diet) was used.
  • CE-2 (CLEA Japan) used for normal breeding of mice was used.
  • Tetracycline hydrochloride tetracycline hydrochloride (Sigma) was used as a tetracycline antibiotic.
  • Tetracycline hydrochloride was administered by injection of 0, 10, 30 and lOOmg / lOmL solutions of tetracycline hydrochloride prepared with 0.5% saline.
  • “OmgZlOmL solution of tetracytalin hydrochloride” means 0.5% physiological saline.
  • HFD group 15 groups that received HFD
  • control group 14 groups that received control food
  • mice in the HFD group and the control group were allowed to freely ingest HFD and control food for 8 weeks, respectively.
  • the HFD group was divided into 3 groups (5 animals x 3) and the control group was divided into 3 groups (5 animals x 2, 4 animals x 1) so that the body weight and body fat percentage were equal among the groups.
  • the groups and control groups were given intraperitoneal administration of tetracycline hydrochloride 0, 10 and 30 mg ZkgZ for 10 days (hereinafter referred to as ⁇ TCO group '' and ⁇ TCIO Group "and" TC30 group ").
  • HFD or control food was given to mice ad libitum during the tetracycline hydrochloride administration period.
  • FIG. 1 is a line graph showing the change in body weight in mice fed with HFD or control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days. From Fig. 1, the body weight of the HFD group mice was significantly higher than that of normal mice (TC0 group mice in the control group) at the start of tetracycline hydrochloride administration, and this value was almost maintained during the administration period. You can see that In FIG. 1, “days” represents the number of days that have elapsed since the start of tetracycline hydrochloride administration.
  • mice On the day after the end of tetracycline hydrochloride administration (11 days after the start of administration), the mice were inhaled with isoflurane and anesthetized. Blood was collected with a syringe containing henon. The collected blood was centrifuged at 4 ° C and 75 OOrpm for 10 minutes to separate plasma. The obtained plasma was stored frozen. After blood collection, the thorax was dissected quickly and forcefully to release blood, and then the liver was removed. One liver leaf was stored frozen. A part of the liver (about 50 mg) was excised and stored frozen in liquid nitrogen. Furthermore, the intermediate lobe of the liver was fixed with 10% neutral buffered formalin solution.
  • FIG. 2 is a bar graph showing the plasma ALT concentration of mice that received HFD or control food for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 3 is a bar graph showing the plasma AST concentration of mice that received HFD or control food for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 4 is a bar graph showing the plasma insulin concentration of mice that received HFD or control food for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 5 is a bar graph showing the plasma glucose concentration in mice fed with HFD or control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days. 4 and 5, it can be seen that in the plasma insulin concentration and plasma glucose concentration, the mice in the HFD group showed the same or higher values than the normal mice.
  • FIG. 6 is a bar graph showing the amount of liver TG in mice fed with HFD or control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 6 shows that the amount of liver TG was significantly higher in the HFD group of mice than in the normal mouse, and in particular, the TC30 group of mice was significantly higher.
  • liver TNF a mRNA level and liver IL 1 j8 mRNA level are measured by measuring liver TNF a mRNA level and liver IL 1 j8 mRNA level.
  • FIG. 7 is a bar graph showing the amount of liver TNF a mRNA in mice fed with HFD or control diet for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • liver TN liver TN It can be seen that in the amount of Fa mRNA and the amount of liver IL lj8 mRNA, the mice in the TC10 group and the TC30 group in the HFD group showed significantly higher values than the normal mice.
  • FIG. 9 is a diagram corresponding to an optical micrograph showing the result of hematoxylin 'eosin staining of a section of the liver intermediate lobe of a mouse that was ingested with HFD for 8 weeks and intraperitoneally administered 30 mgZkgZ day of tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 10 is a diagram corresponding to an optical micrograph in which the portion indicated by the black frame in FIG. 9 is enlarged.
  • FIG. 11 is a diagram corresponding to an optical micrograph showing the result of oil red O staining of a section of a liver mesenchyme of a mouse that was ingested with HFD for 8 weeks and intraperitoneally administered tetracycline hydrochloride 30 mgZkgZ for 10 days.
  • Fig. 9 ⁇ From L1, it can be seen that the presence of fatty liver and infiltration of inflammatory cells were observed in mice in the TC30 group in the HFD group.
  • mice were ingested with a high fat diet for 8 weeks, followed by intraperitoneal administration of tetracycline hydrochloride 30mgZkgZ for 10 days, so that body weight, blood insulin concentration and blood It was shown that NASH pathological model animals showing normal or higher glucose concentrations were produced.
  • mice Twenty mice (7 weeks old) were allowed free intake of HFD for 8 weeks. After that, it was divided into 4 groups (5 animals x 4) so that the body weight and body fat percentage were equal among the groups, and tetracycline hydrochloride 0, 30, 60 and 100 mg / kg / day were administered subcutaneously for 10 days (hereinafter referred to as hydrochloric acid).
  • the groups that received tetracycline 0, 30, 60, and lOOmgZkgZ day were referred to as “TC0 group”, “TC30 group”, “TC60 group”, and “TC100 group”, respectively).
  • HFD was freely taken by mice even during the administration of tetracycline hydrochloride.
  • mice The body weight of the mice was measured 3 days before the start of tetracycline hydrochloride administration, and further measured every day from the next day to the 11th day.
  • Figure 12 shows tetrassa hydrochloride ingested HFD for 8 weeks.
  • 2 is a line graph showing changes in body weight in mice administered with iclin subcutaneously for 10 days. From FIG. 12, all the groups of mice showed significantly higher values than normal mice at the start of tetracycline hydrochloride administration, and the body weight decreased according to the dose of tetracycline hydrochloride and the number of administration days. It can be seen that these mice showed the same strength and higher values as normal mice at the end of tetracycline hydrochloride administration (see Fig. 1). In FIG. 12, “days” represents the number of days that have elapsed since the start of tetracycline hydrochloride administration.
  • FIG. 13 is a bar graph showing the plasma ALT concentration of mice administered with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered with tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 14 is a bar graph showing plasma AST concentrations in mice that received HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days. 13 and 14, it can be seen that in the plasma ALT concentration and plasma AST concentration, mice in the TC30 group, TC60 group and TC100 group showed significantly higher values than normal mice (see FIGS. 2 and 3).
  • FIG. 13 is a bar graph showing the plasma ALT concentration of mice administered with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered with tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • FIG. 15 is a bar graph showing plasma insulin concentrations in mice administered with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days. From Fig. 15, it can be seen that in the plasma insulin concentration, mice in the TCO group, TC30 group and TC60 group showed higher values than normal mice, and mice in the TC100 group showed similar values to normal mice (Fig. 15). 4).
  • FIG. 16 is a bar graph showing the plasma glucose concentration of mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days. From Fig. 16, it can be seen that the plasma glucose concentration of each group of mice was higher than that of normal mice (see Fig. 5).
  • FIG. 17 is a bar graph showing the amount of liver TG in mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days. From Fig. 17, the liver TG level was significantly higher in all groups of mice than in normal mice. However, it can be seen that the TC30 group of mice showed extremely high values (see Fig. 6).
  • liver TNF a mRNA level and liver IL 1 j8 mRNA level are measured by measuring liver TNF a mRNA level and liver IL 1 j8 mRNA level.
  • FIG. 18 is a bar graph showing the amount of liver TNF a mRNA in mice in which HFD was ingested for 8 weeks and tetracycline hydrochloride was administered subcutaneously for 10 days.
  • FIG. 19 is a bar graph showing the amount of liver IL-1 ⁇ mRNA in mice fed with HFD for 8 weeks and subcutaneously administered tetracycline hydrochloride for 10 days.
  • Figures 18 and 19 show that mice with TC30, TC60 and TC100 showed significantly higher levels of liver TNF a mRNA and liver IL 1 j8 mRNA than normal mice, including TC30 mice. However, the amount of mRNA in the gap is extremely high! ⁇ ⁇ ⁇ It can be seen that the values were shown (see Figures 7 and 8).
  • the histopathological examination of the liver was carried out in the same manner as in Example 1. Presence of fatty liver and infiltration of inflammatory cells were observed in the mice of TC30 group, TC60 group and TC100 group.
  • mice were ingested with a high fat diet for 8 weeks, and tetracycline hydrochloride was administered subcutaneously for 10 days, so that body weight, blood insulin concentration and blood glucose concentration were normal or higher. It was shown that NASH pathological model animals exhibiting values were produced.
  • Example 3 Twelve mice (7 weeks old) were divided into 6 HFD groups and 6 control groups.
  • the following experiments on the HFD group (6 animals) and the control group (6 animals) are referred to as Example 3 and Comparative Example 2, respectively.
  • mice in the HFD group and the control group were allowed to freely take HFD and control food for 50 weeks, respectively.
  • FIG. 20 is a bar graph showing the body weight of mice fed HFD or control diet for 50 weeks. From Fig. 20, it can be concluded that the mice in the HFD group showed significantly higher values than normal mice in terms of body weight (see Fig. 1). [0048] Blood collection and dissection:
  • FIG. 21 is a bar graph showing plasma ALT concentrations in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks.
  • FIG. 22 is a bar graph showing plasma AST concentrations in mice fed HFD or control diet for 50 weeks. 21 and 22, it can be seen that the plasma ALT concentration and the plasma AST concentration were significantly higher in the HFD group than in the normal mouse (see FIGS. 2 and 3).
  • FIG. 23 is a bar graph showing plasma insulin concentrations in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks. From FIG. 23, it can be seen that the plasma insulin concentration was higher in the HFD group of mice than in the normal mice (see FIG. 4).
  • Figure 24 is a bar graph showing plasma glucose concentrations in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks. From FIG. 24, it can be seen that in the plasma glucose concentration, the mice in the HFD group showed similar values to the normal mice (see FIG. 5).
  • FIG. 25 is a bar graph showing the amount of liver TG in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • FIG. 25 shows that the amount of liver TG was significantly higher in the HFD group of mice than in normal mice (see FIG. 6).
  • liver TNF a mRNA level and liver IL 1 j8 mRNA level Measurement of liver TNF a mRNA level and liver IL 1 j8 mRNA level:
  • FIG. 26 is a bar graph showing the amount of liver TNF a mRNA in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks.
  • FIG. 27 is a bar graph showing the amount of liver IL- ⁇ mRNA in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks. 26 and 27, it can be seen that the liver TNF a mRNA level and the liver IL 1 j8 mRNA level were significantly higher in the HFD group of mice than in the normal mice (see FIGS. 7 and 8).
  • FIG. 28 is a diagram corresponding to an optical micrograph showing the results of hematoxylin and eosin staining of a section of the liver intermediate lobe of a mouse fed with HFD for 50 weeks.
  • FIG. 29 is a diagram corresponding to an optical micrograph showing the result of staining with hematoxylin 'eosin on a section of a liver intermediate lobe of a mouse fed with a control diet for 50 weeks. From FIGS. 28 and 29, it can be seen that the presence of fatty liver and infiltration of inflammatory cells were observed in mice in the HFD group.
  • liver type I collagen ⁇ 1 mRNA level and liver ⁇ -SMA mRNA level:
  • liver fibrosis occurred was confirmed by using liver type I collagen ( ⁇ 1) mRNA level and liver ex-SMA mRNA level as indicators.
  • FIG. 30 is a bar graph showing the amount of liver type I collagen 1) mRNA in mice fed with HFD or control diet for 50 weeks.
  • FIG. 31 is a bar graph showing the amount of liver ⁇ -SMA mRNA in mice fed with HFD or control food for 50 weeks.
  • mice were allowed to ingest a high fat diet for 50 weeks, whereby body weight, blood insulin concentration and blood glucose concentration showed normal values or higher values, and It has been shown that NASH pathological model animals can be produced in which fibrosis occurs.
  • the present invention can be used for the development of a drug for non-alcoholic steatohepatitis.

Abstract

　本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎患者の病態をより正確に反映した病態モデル動物を提供することを目的として、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物を提供する。

Description

非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物
技術分野
[0001] 本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物、その作製方法、及びその 動物を用いる薬物スクリーニング方法に関する。
背景技術
[0002] 従来、非アルコール性脂肪肝 (アルコール摂取を原因としな 、脂肪肝)は、身体に 悪影響を与えるものではなぐ治療の必要のない状態と考えられていた。しかし、近 年、非アルコール性脂肪肝の中に、酸化ストレス等の刺激によって肝炎に進展し、更 に肝臓の線維化を引き起こして肝硬変又は肝癌に発展するものがあることが分かつ てきた。現在では、非アルコール性脂肪肝力も進展した肝炎は、非アルコール性脂 肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis： NASH)と呼ばれ、治療の対象となって!/、る
[0003] 非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発を目的とするスクリーニングテストや薬理 試験においては、健常動物でなぐ非アルコール性脂肪性肝炎患者の病態をできる だけ多く具備する病態モデル動物を用いるのが好まし 、。そのような病態モデル動 物としては、現在、 MCD (methionine- and choline- deficient)ダイエットを摂取させる こと〖こよって作製されるマウス（以下「MCDモデル」と 、う。）が知られて 、る（非特許 文献 1)。
[0004] MCDモデルは、脂肪性肝炎の発症、血中におけるァラニンアミノトランスフェラー ゼ (ALT)及びァスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ (AST)の増加、肝臓における トリグリセリド (TG)の増力！]、肝臓における炎症性サイト力イン (腫瘍壊死因子 a (TNF α )、インターロイキン 1 j8 (IL— 1 j8 )等）の mRNAの増加といった、非アルコール 性脂肪性肝炎に特徴的な所見が認められる点で、優れた非アルコール性脂肪性肝 炎病態モデル動物と考えられて!/、る。
非特許文献 l : Rinella, M. E. et al., J. Hepatology, 40: 47-51 (2004)
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0005] し力しながら、多くの非アルコール性脂肪性肝炎患者では体重、血中インスリン濃 度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示すのに対し、 MCDモ デルではそれらの値がいずれも正常値よりも低ぐこの点で、 MCDモデルは非アル コール性脂肪性肝炎患者の実際の病態を正確に反映するものではない。
[0006] そこで、本発明は、 MCDモデルの上記問題点を克服し、非アルコール性脂肪性肝 炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物、その作製方法、及び非 アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発のためのより有効な薬物スクリーニング方法 を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 上記目的を達成するため、本発明は、高脂肪食を摂取させることにより、通常食を 摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物 質を連続投与して作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物を提供す る。
[0008] このような非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物は、体重、血中インスリン濃 度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高 、値を示す点で、非アルコール 性脂肪性肝炎患者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物となる。
[0009] 上記高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌 であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが 30%以上の食餌が 好ましぐまた、上記テトラサイクリン系抗生物質は、血中 ALT濃度、血中 AST濃度、 肝臓 TG量、肝臓 TNF α mRNA量及び肝臓 IL l j8 mRNA量が、同種の健常動 物に比べて有意に高くなるまで連続投与するのがよい。
[0010] 非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物としては、少なくともタンパク質、炭水 化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来の カロリーが 30%以上の高脂肪食を、血中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量、肝 臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL l j8 mRNA量力 同種の健常動物に比べて有 意に高くなるまで連続的に摂取させて作製される動物も採用することができる。このよ うな病態モデル動物もまた、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正 常値又はそれより高 、値を示す点で、非アルコール性脂肪性肝炎患者の実際の病 態をより正確に反映したものとなる。また、高脂肪食の摂取期間によっては、肝臓の 線維化を伴う、より進行した非アルコール性脂肪性肝炎の病態モデル動物となる。
[0011] 上述のように、非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物は、高脂肪食を摂取さ せることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させた動物に、 テトラサイクリン系抗生物質を連続投与することにより、作製することができる。この場 合において、高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有す る食餌であって、当該食餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが 30%以上の 食餌がよぐまた、テトラサイクリン系抗生物質は、血中 ALT濃度、血中 AST濃度、 肝臓 TG量、肝臓 TNF α mRNA量及び肝臓 IL l j8 mRNA量が、同種の健常動 物に比べて有意に高くなるまで連続投与するのが好ま U、。
発明の効果
[0012] 本発明によれば、 MCDモデルの問題点を克服し、非アルコール性脂肪性肝炎患 者の実際の病態をより正確に反映した病態モデル動物、その作製方法、及び非アル コール性脂肪性肝炎治療薬の開発のためのより有効な薬物スクリーニング方法を提 供することが可能となる。
図面の簡単な説明
[0013] [図 1]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである。
[図 2]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの血漿 ALT濃度を示す棒グラフである。
[図 3]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの血漿 AST濃度を示す棒グラフである。
[図 4]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。
[図 5]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。
[図 6]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの肝臓 TG量を示す棒グラフである。
圆 7]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの肝臓 TNF a mRNA量を示す棒グラフである。
圆 8]HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの肝臓 IL 1 j8 mRNA量を示す棒グラフである。
[図 9]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン 30mgZkgZ日を 10日間腹腔内 投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するへマトキシリン'ェォジン染色の結果を 示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
圆 10]図 9の黒枠で示された部分を拡大した光学顕微鏡写真に対応する図である。
[図 11]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン 30mgZkgZ日を 10日間腹腔 内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するオイルレッド O染色の結果を示す光 学顕微鏡写真に対応する図である。
[図 12]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスに おける体重の推移を示す折れ線グラフである。
[図 13]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 血漿 ALT濃度を示す棒グラフである。
[図 14]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 血漿 AST濃度を示す棒グラフである。
[図 15]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。
[図 16]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。
[図 17]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 肝臓 TG量を示す棒グラフである。
[図 18]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 肝臓 TNF a mRNA量を示す棒グラフである。
[図 19]HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの 肝臓 IL— 1 |8 mRNA量を示す棒グラフである。 [図 20]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの体重を示す棒グラフである。
[図 21]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの血漿 ALT濃度を示す棒グラフ である。
[図 22]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの血漿 AST濃度を示す棒グラフ である。
[図 23]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グ ラフである。
[図 24]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの血漿グルコース濃度を示す棒 グラフである。
[図 25]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 TG量を示す棒グラフであ る。
[図 26]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 TNF a mRNA量を示す 棒グラフである。
[図 27]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 IL—l |8 mRNA量を示 す棒グラフである。
[図 28]HFDを 50週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するへマトキシリン •ェォジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
[図 29]対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するへマトキシリ ン ·ェォジン染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。
[図 30]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 I型コラーゲン DmR NA量を示す棒グラフである。
[図 31]HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 α— SMA mRNA量を 示す棒グラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0014] 以下、本発明の好適な実施形態を説明する。
[0015] 本発明の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物（以下「NASH病態モデル 動物」という。）を作製するために用いられる動物としては、ヒトの疾患の病態モデル 動物として一般的に用いられている、ラット、マウス、モルモット、ノ、ムスター、ゥサギ、 ィヌ、サル等が挙げられる力 これらの中ではマウスが好ましい。雄は性周期によるホ ルモン量の変化がなぐ病態のばらつきを抑えることができることから、動物は雄であ ることが好ましい。
[0016] NASH病態モデル動物を作製するには、まず、このような動物に対して、高脂肪食 を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を増加させる 。摂取させる高脂肪食としては、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有して おり、その全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが 30%以上のものがよい。脂肪由 来のカロリーの下限は 45%が好ましぐ 60%がより好ましい。一方、上限は 80%が好 ましぐ 70%がより好ましい。
[0017] なお、高脂肪食を摂取させた結果、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重 が増加したかどうかは、 t検定により判断することができる。ここで、 t検定における有 意水準は、 1%又は 5%であり、好ましくは 1%である。
[0018] NASH病態モデル動物は、上述のようにして有意に体重が増加した動物に対して 、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される。ここで、「連続投与」すると は、投与を複数回、好ましくは等間隔をもって行うことを意味する。連続投与されるテ トラサイクリン系抗生物質としては、例えば、テトラサイクリン (TC)、ォキシテトラサイク リン（OTC)、メタサイクリン（MTC)、ドキシサイクリン（DOXY)、ミノサイクリン（MIN O)、及びこれらの塩 (塩酸塩等）が挙げられる。
[0019] テトラサイクリン系抗生物質の投与は、血中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量 、肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL l j8 mRNA量が、同種の健常動物に比べ て有意に高くなるまで続けるのが好ましぐまた、血中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝 臓 TG量、肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL l j8 mRNA量が、同種の健常動物 に比べて有意に高くなり、かつ、肝臓の病理組織学的検査において脂肪肝の存在 及び炎症細胞の浸潤が認められるまで続けるのがより好ましい。ここで、上記の値が 同種の健常動物に比べて有意に高いかどうかは、有意水準を 1%又は 5% (好ましく は 1%)とした t検定により判断することができる。
[0020] なお、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有する食餌であって、当該食 餌の全カロリーに占める脂肪由来のカロリーが 30%以上の高脂肪食を、血中 ALT 濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量、肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL 1 mRN A量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで、ある程度の期間連続的に摂 取させれば、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与しなくても、 NASH病態モデル 動物を作製することができる。ここで、「連続的に摂取」するとは、摂取を複数回行うこ とを意味する。
[0021] 高脂肪食を摂取させた後、テトラサイクリン系抗生物質を投与することにより NASH 病態モデル動物を作製する場合、テトラサイクリン系抗生物質投与前の高脂肪食摂 取期間は、脂肪肝が形成されるのに十分な期間であればよぐ例えば、マウスでは、 好ましくは 6〜 10週間であり、より好ましくは 7〜9週間である。高脂肪食は、テトラサ イクリン系抗生物質の投与中も摂取させるのが好ましい。
[0022] 高脂肪食を摂取させた後、テトラサイクリン系抗生物質を投与することにより NASH 病態モデル動物を作製する場合、テトラサイクリン系抗生物質の投与量及び投与期 間は、マウスでは、好ましくは 20〜： LOOmg/kg/日、 7〜14日間であり、より好ましく は 20〜40mgZkgZ日、 9〜： L 1日間である。 20mg/kg/日、 7日間未満では、脂 肪肝が肝炎に進展しないことがあり、他方、 lOOmgZkgZ日、 15日間を超えると、 体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度のいずれかが正常値よりも低くな る可能性がある。テトラサイクリン系抗生物質の投与方法は、好ましくは腹腔内投与 又は皮下投与である。ここで、テトラサイクリン系抗生物質は、薬理学的に許容される 塩の形態で投与してもよ 、。
[0023] 高脂肪食を連続的に摂取させることにより NASH病態モデル動物を作製する場合 、高脂肪食の摂取期間は、脂肪性肝炎を発症させるのに十分な期間であればよぐ マウスでは、好ましくは 20週間以上であり、より好ましくは 40週間以上である。 20週 間未満では、脂肪性肝炎が十分に発症しない可能性がある。また、肝臓の線維化が 生じている NASH病態モデル動物を作製するには、マウスでは、 40週間以上高脂 肪食を摂取させるのが好ましい。肝臓の線維化が生じていることは、例えば、肝臓 I型 コラーゲン（ a 1) mRN A量又は肝臓 a—SMA (smooth muscle actin) mRNA量が、 同種の健常動物に比べて有意に高いことをもって確認することができる。ここで、「I型 コラーゲン（ α 1)」は I型コラーゲンの 1鎖を表す。 [0024] 上述した NASH病態モデル動物を用いて、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物の スクリーニングが可能になる。すなわち、 NASH病態モデル動物に非アルコール性 脂肪性肝炎用候補薬物を投与するステップを備える、非アルコール性脂肪性肝炎用 薬物のスクリーニング方法が提供される。このスクリーニング方法においては、候補薬 物を投与するステップの後に、候補薬物が非アルコール性脂肪性肝炎用薬物として 有効かどうかを判定するステップを設けることができ、このステップでは、例えば、血 中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量、肝臓 TNF o; mRNA量及び肝臓 IL— 1 β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなつていないことをもって、非 アルコール性脂肪性肝炎用薬物としての有効性を判断することができる。また、肝臓 の病理組織学的検査において炎症細胞の浸潤が認められなくなつたことをもって、 非アルコール性脂肪性肝炎用薬物としての有効性を判断することもできる。
[0025] 本発明の NASH病態モデル動物、及びこれを用いる薬物スクリーニング方法は、 医薬品の開発を目的とするスクリーニングテストや薬理試験において、公知の病態モ デル動物、及びこれを用いる薬物スクリーニング方法と同様に用いることができる。 実施例
[0026] 以下、実施例及び比較例に基づ!/、て、本発明をより具体的に説明する。但し、本発 明は、以下の実施例に限定されるものではない。
[0027] 以下の実施例及び比較例では、病態モデル動物作製のための動物として、 C57B LZ6J系の雄マウス（日本クレア社)を用いた。また、高脂肪食 (以下「HFD」という。 ) としては、 D12492 (脂肪含有量: 60kcal%) (リサーチダイエット社)を用いた。対照 餌としては、マウスの通常の飼育に用いられる CE— 2 (日本クレア社)を用いた。テト ラサイクリン系抗生物質としては塩酸テトラサイクリン (シグマ社)を用いた。塩酸テトラ サイクリンの投与は、 0. 5%生理食塩水を用いて調製した塩酸テトラサイクリンの 0、 1 0、 30及び lOOmg/lOmL溶液の注射によって行った。ここで、「塩酸テトラサイタリ ンの OmgZlOmL溶液」とは、 0. 5%生理食塩水を意味する。
[0028] (実施例 1及び比較例 1)
マウス（6週齢） 29匹を、 HFDを摂取させる群（以下、「HFD群」という。） 15匹と対 照餌を摂取させる群 (以下、「対照群」という。） 14匹とに分けた。 HFD群（15匹)及 び対照群（14匹）に関する以下の実験を、それぞれ実施例 1及び比較例 1とする。
[0029] HFD又は対照餌の給餌、及び塩酸テトラサイクリンの腹腔内投与：
まず、 HFD群及び対照群のマウスにそれぞれ HFD及び対照餌を 8週間自由摂取 させた。その後、体重及び体脂肪率が群間で均等になるように、 HFD群を 3群（5匹 X 3)に、対照群を 3群（5匹 X 2、 4匹 X 1)に分け、 HFD群及び対照群の 、ずれにも 塩酸テトラサイクリン 0、 10及び 30mgZkgZ日を 10日間腹腔内投与した (以下、塩 酸テトラサイクリン 0、 10及び 30mgZkgZ日を投与した群をそれぞれ「TCO群」、「T CIO群」及び「TC30群」という）。 HFD又は対照餌は、塩酸テトラサイクリン投与期間 中もマウスに自由摂取させた。
[0030] 体重の測定：
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の 4日前、投与開始後 1、 3、 5、 7、 1 0及び 11日目に測定した。図 1は、 HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラ サイクリンを 10日間腹腔内投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフ である。図 1より、体重では、 HFD群のマウスが塩酸テトラサイクリン投与開始時に通 常のマウス (対照群のうちの TC0群のマウス)より有意に高 、値を示し、この値が投与 期間中もほぼ維持されたことが分かる。なお、図 1において、「日数」は、塩酸テトラサ イクリン投与開始後の経過日数を表す。
[0031] 採血及び解剖：
塩酸テトラサイクリン投与終了日翌日（投与開始後 11日目）に、マウスにイソフルラ ンを吸入させて麻酔し、尾部をピンセットでつまんで痛覚が消失したことを確認した後 、開腹して腹部大静脈よりへノ^ン入りシリンジで採血した。採取した血液を 4°C、 75 OOrpmで 10分間遠心し、血漿を分離した。得られた血漿は凍結保存した。採血後、 速や力に胸郭を切開して十分に放血した後、肝臓を摘出した。肝臓の一葉は凍結保 存した。また、肝臓の一部 (約 50mg)を切り取り、液体窒素中で凍結保存した。更に 、肝臓の中間葉を 10%中性緩衝ホルマリン液で固定した。
[0032] 血漿 ALT濃度、血漿 AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測 定：
凍結保存していた血漿を用いて、血漿 ALT濃度、血漿 AST濃度及び血漿ダルコ ース濃度を日立自動分析装置 7070 (日立ハイテクノロジーズ社)で、血漿インスリン濃 度をインスリン測定キット (生化学工業社)で測定した。図 2は、 HFD又は対照餌を 8 週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与したマウスの血漿 ALT濃 度を示す棒グラフである。図 3は、 HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサ イクリンを 10日間腹腔内投与したマウスの血漿 AST濃度を示す棒グラフである。図 2 及び 3より、血漿 ALT濃度及び血漿 AST濃度では、 HFD群のうち、 TC30群のマウ スが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。図 4は、 HFD又は対照餌 を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与したマウスの血漿イン スリン濃度を示す棒グラフである。図 5は、 HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸 テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒ダラ フである。図 4及び 5より、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度では、 HFD群 のマウスが通常のマウスと同程度の値か、それより高 ヽ値を示したことが分かる。
[0033] 肝臓 TG量の測定：
凍結保存していた肝臓の一葉をホモジネートとし、このホモジネートの一部から Fol chの試薬で脂質画分を抽出した後、これを窒素ガスで乾固し、デタミナ一 L TGIK 協和メデッタス社)で TG量を測定した。図 6は、 HFD又は対照餌を 8週間摂取させて 塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与したマウスの肝臓 TG量を示す棒グラフで ある。図 6より、肝臓 TG量では、 HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を 示し、中でも TC30群のマウスが著しく高 、値を示したことが分かる。
[0034] 肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL 1 j8 mRNA量の測定：
液体窒素中で凍結保存して 、た肝臓の一部から ISOGEN (二ツボンジーン社)で R NAを抽出した後、アプライドバイォシステムズ社のリアルタイム定量 PCR試薬で cD NAを合成し、 18S rRNAを内部標準として、 ABI PRISM 7900HT Sequence Detecti on System (アプライドバイォシステムズ社）で TNF a mRNA量及び IL— 1 j8 mRN A量を測定した。図 7は、 HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与したマウスの肝臓 TNF a mRNA量を示す棒グラフである。図 8 は、 HFD又は対照餌を 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間腹腔内投与 したマウスの肝臓 IL— 1 |8 mRN A量を示す棒グラフである。図 7及び 8より、肝臓 TN F a mRNA量及び肝臓 IL l j8 mRNA量では、 HFD群のうち、 TC10群及び TC 30群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。
[0035] 肝臓の病理組織学的検査：
ホルマリン液で固定した肝臓の中間葉からパラフィン切片を作製し、へマトキシリン' ェォジン染色及びオイルレッド O染色 (脂肪染色）を行って、病理組織学的検査を行 つた。図 9は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン 30mgZkgZ日を 10日 間腹腔内投与したマウスの肝臓中間葉の切片に対するへマトキシリン'ェォジン染色 の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図 10は、図 9の黒枠で示された 部分を拡大した光学顕微鏡写真に対応する図である。図 11は、 HFDを 8週間摂取 させて塩酸テトラサイクリン 30mgZkgZ日を 10日間腹腔内投与したマウスの肝臓中 間葉の切片に対するオイルレッド O染色の結果を示す光学顕微鏡写真に対応する 図である。図 9〜： L 1より、 HFD群のうち、 TC30群のマウスにおいて、脂肪肝の存在 及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。
[0036] 実施例 1及び比較例 1により、マウスに高脂肪食を 8週間摂取させた後、塩酸テトラ サイクリン 30mgZkgZ日を 10日間腹腔内投与することによって、体重、血中インス リン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を示す NASH病態 モデル動物が作製されることが示された。
[0037] (実施例 2)
HFDの給餌、及び塩酸テトラサイクリンの皮下投与：
マウス（7週齢) 20匹に HFDを 8週間自由摂取させた。その後、体重及び体脂肪率 が群間で均等になるように 4群（5匹 X 4)に分け、塩酸テトラサイクリン 0、 30、 60及び 100mg/kg/日を 10日間皮下投与した（以下、塩酸テトラサイクリン 0、 30、 60及 び lOOmgZkgZ日を投与した群をそれぞれ「TC0群」、「TC30群」、「TC60群」及 び「TC100群」という）。 HFDは、塩酸テトラサイクリン投与期間中もマウスに自由摂 取させた。
[0038] 体重の測定：
マウスの体重を、塩酸テトラサイクリン投与開始の 3日前に測定し、更に投与開始日 翌日から 11日目まで毎日測定した。図 12は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサ イクリンを 10日間皮下投与したマウスにおける体重の推移を示す折れ線グラフである 。図 12より、いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与開始時に通常のマウスよ り有意に高い値を示したこと、及び体重は塩酸テトラサイクリンの投与量及び投与日 数に応じて減少した力 いずれの群のマウスも塩酸テトラサイクリン投与終了時に通 常のマウスと同程度力、それより高い値を示したことが分かる（図 1参照)。なお、図 12 にお 、て、「日数」は、塩酸テトラサイクリン投与開始後の経過日数を表す。
[0039] 採血及び解剖：
採血及び解剖を、実施例 1と同様に行った。
[0040] 血漿 ALT濃度、血漿 AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測 定：
血漿 ALT濃度、血漿 AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、 実施例 1と同様に測定した。図 13は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリン を 10日間皮下投与したマウスの血漿 ALT濃度を示す棒グラフである。図 14は、 HF Dを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの血漿 AST 濃度を示す棒グラフである。図 13及び 14より、血漿 ALT濃度及び血漿 AST濃度で は、 TC30群、 TC60群及び TC100群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を 示したことが分かる（図 2及び 3参照)。図 15は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラ サイクリンを 10日間皮下投与したマウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。 図 15より、血漿インスリン濃度では、 TCO群、 TC30群及び TC60群のマウスが通常 のマウスより高い値を示し、 TC100群のマウスが通常のマウスと同程度の値を示した ことが分かる（図 4参照)。図 16は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 1 0日間皮下投与したマウスの血漿グルコース濃度を示す棒グラフである。図 16より、 血漿グルコース濃度では、いずれの群のマウスも通常のマウスより高い値を示したこ とが分力る（図 5参照)。
[0041] 肝臓 TG量の測定：
肝臓 TG量を、実施例 1と同様に測定した。図 17は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸 テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの肝臓 TG量を示す棒グラフである。図 17より、肝臓 TG量では、いずれの群のマウスも通常のマウスより有意に高い値を示 し、中でも TC30群のマウスが著しく高い値を示したことが分かる（図 6参照)。
[0042] 肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL 1 j8 mRNA量の測定：
肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL—1 |8 mRNA量を、実施例 1と同様に測定した 。図 18は、 HFDを 8週間摂取させて塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウ スの肝臓 TNF a mRNA量を示す棒グラフである。図 19は、 HFDを 8週間摂取させ て塩酸テトラサイクリンを 10日間皮下投与したマウスの肝臓 IL— 1 β mRNA量を示 す棒グラフである。図 18及び 19より、肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL 1 j8 mR NA量では、 TC30群、 TC60群及び TC100群のマウスが通常のマウスより有意に 高!ヽ値を示し、中でも TC30群のマウスが!/、ずれの mRNA量にお!、ても著しく高！ヽ 値を示したことが分かる（図 7及び 8参照)。
[0043] 肝臓の病理組織学的検査：
肝臓の病理組織学的検査を、実施例 1と同様に行った。 TC30群、 TC60群及び T C100群のマウスにおいて、脂肪肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められた。
[0044] 実施例 2により、マウスに高脂肪食を 8週間摂取させた後、塩酸テトラサイクリンを 10 日間皮下投与することによって、体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度 が正常値又はそれより高い値を示す NASH病態モデル動物が作製されることが示さ れた。
[0045] (実施例 3及び比較例 2)
マウス（7週齢） 12匹を HFD群 6匹と対照群 6匹とに分けた。 HFD群（6匹)及び対 照群 (6匹）に関する以下の実験を、それぞれ実施例 3及び比較例 2とする。
[0046] HFD又は対照餌の給餌：
HFD群及び対照群のマウスには、それぞれ HFD及び対照餌を 50週間自由摂取 させた。
[0047] 体重の測定：
マウスの体重を、 HFD又は対照餌の給餌を終了した後、採血前 (麻酔前）に測定し た。図 20は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの体重を示す棒グラフで ある。図 20より、体重では、 HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示し たことが分力る（図 1参照)。 [0048] 採血及び解剖：
採血及び解剖を、 HFD又は対照餌の給餌を終了した直後に、実施例 1と同様に行 つた o
[0049] 血漿 ALT濃度、血漿 AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度の測 定：
血漿 ALT濃度、血漿 AST濃度、血漿インスリン濃度及び血漿グルコース濃度を、 実施例 1と同様に測定した。図 21は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウス の血漿 ALT濃度を示す棒グラフである。図 22は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取さ せたマウスの血漿 AST濃度を示す棒グラフである。図 21及び 22より、血漿 ALT濃 度及び血漿 AST濃度では、 HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示 したことが分かる（図 2及び 3参照)。図 23は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させた マウスの血漿インスリン濃度を示す棒グラフである。図 23より、血漿インスリン濃度で は、 HFD群のマウスが通常のマウスより高い値を示したことが分かる（図 4参照)。図 2 4は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの血漿グルコース濃度を示す棒 グラフである。図 24より、血漿グルコース濃度では、 HFD群のマウスが通常のマウス と同程度の値を示したことが分かる（図 5参照)。
[0050] 肝臓 TG量の測定：
肝臓 TG量を、実施例 1と同様に測定した。図 25は、 HFD又は対照餌を 50週間摂 取させたマウスの肝臓 TG量を示す棒グラフである。図 25より、肝臓 TG量では、 HF D群のマウスが通常のマウスより有意に高 、値を示したことが分かる（図 6参照)。
[0051] 肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL 1 j8 mRNA量の測定：
肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL—1 |8 mRNA量を、実施例 1と同様に測定した 。図 26は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 TNF a mRNA量を 示す棒グラフである。図 27は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 I L- Ι β mRNA量を示す棒グラフである。図 26及び 27より、肝臓 TNF a mRNA量 及び肝臓 IL 1 j8 mRNA量では、 HFD群のマウスが通常のマウスより有意に高い 値を示したことが分かる（図 7及び 8参照)。
[0052] 肝臓の病理組織学的検査： 肝臓の病理組織学的検査を、実施例 1と同様に行った。図 28は、 HFDを 50週間 摂取させたマウスの肝臓中間葉の切片に対するへマトキシリン 'ェォジン染色の結果 を示す光学顕微鏡写真に対応する図である。図 29は、対照餌を 50週間摂取させた マウスの肝臓中間葉の切片に対するへマトキシリン'ェォジン染色の結果を示す光学 顕微鏡写真に対応する図である。図 28及び 29より、 HFD群のマウスにおいて、脂肪 肝の存在及び炎症細胞の浸潤が認められたことが分かる。
[0053] 肝臓 I型コラーゲン（ α 1) mRNA量及び肝臓 α— SMA mRNA量の測定：
肝臓の線維化が生じているかどうかを、肝臓 I型コラーゲン（ α 1) mRNA量及び肝 臓 ex - SMA mRNA量を指標として確認した。
肝臓 I型コラーゲン（ a 1) mRNA量及び肝臓 a— SMA mRNA量の測定は、実施 例 1における肝臓 TNF a mRNA量及び肝臓 IL 1 β mRNA量の測定と同様の方 法で行った。図 30は、 HFD又は対照餌を 50週間摂取させたマウスの肝臓 I型コラー ゲン 1) mRNA量を示す棒グラフである。図 31は、 HFD又は対照餌を 50週間摂 取させたマウスの肝臓 α—SMA mRNA量を示す棒グラフである。図 30及び 31より 、肝臓 I型コラーゲン（ α 1) mRNA量及び肝臓 α— SMA mRNA量では、 HFD群 のマウスが通常のマウスより有意に高い値を示したことが分かる。そして、そのことから 、 HFD群のマウスでは、通常のマウスと異なり、肝臓の線維化が生じていたことが分 かる。
[0054] 実施例 3及び比較例 2により、マウスに高脂肪食を 50週間摂取させることによって、 体重、血中インスリン濃度及び血中グルコース濃度が正常値又はそれより高い値を 示し、かつ肝臓の線維化が生じて ヽる NASH病態モデル動物が作製されることが示 された。
産業上の利用可能性
[0055] 本発明は、非アルコール性脂肪性肝炎治療薬の開発に利用することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を 増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与して作製される非アルコ ール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
[2] 前記高脂肪食は、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに 占める脂肪由来のカロリーが 30%以上の高脂肪食である、請求項 1記載の非アルコ ール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
[3] 前記テトラサイクリン系抗生物質を、
血中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量、肝臓 TNF o; mRNA量及び肝臓 IL
—1 β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与して作 製される、請求項 1又は 2記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
[4] 少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに占める脂肪由来の カロリーが 30%以上の高脂肪食を、
血中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量、肝臓 TNF o; mRNA量及び肝臓 IL
- 1 β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続的に摂取さ せて作製される非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物。
[5] 高脂肪食を摂取させることにより、通常食を摂取させた群に比較して有意に体重を 増加させた動物に、テトラサイクリン系抗生物質を連続投与する、非アルコール性脂 肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
[6] 前記高脂肪食は、少なくともタンパク質、炭水化物及び脂肪を含有し、全カロリーに 占める脂肪由来のカロリーが 30%以上の高脂肪食である、請求項 5記載の非アルコ ール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
[7] 前記テトラサイクリン系抗生物質を、
血中 ALT濃度、血中 AST濃度、肝臓 TG量、肝臓 TNF o; mRNA量及び肝臓 IL
- 1 β mRNA量が、同種の健常動物に比べて有意に高くなるまで連続投与する、 請求項 5又は 6記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動物の作製方法。
[8] 請求項 1〜4の！、ずれか一項に記載の非アルコール性脂肪性肝炎病態モデル動 物に候補薬物を投与するステップを備える、非アルコール性脂肪性肝炎用薬物のス クリーニング方法。
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