WO2006022114A1

WO2006022114A1 - 脳腫瘍の検出方法及びそれに用いる脳腫瘍の検出物質、並びに医薬組成物

Info

Publication number: WO2006022114A1
Application number: PCT/JP2005/013955
Authority: WO
Inventors: Ryuya Yamanaka; Naoto Tsuchiya; Kazuhiro Ikenaka
Original assignee: Niigata University; National Institutes Of Natural Sciences
Priority date: 2004-08-27
Filing date: 2005-07-29
Publication date: 2006-03-02
Also published as: JP5158577B2; JPWO2006022114A1; JP2011126907A; JP4852703B2

Abstract

　確実に、且つ早期に脳腫瘍を検出可能な脳腫瘍の検出方法及びそれに用いる脳腫瘍の検出物質を提供する。さらに、脳腫瘍を治療するための医薬組成物を提供する。　脳腫瘍に特異的に発現する糖蛋白質のＮ結合型糖鎖Ａ２Ｇ２Ｆの検出に基づいて、脳腫瘍を検出することにより、脳腫瘍の早期発見及び治療に有益である。さらに、Ｎ結合型糖鎖Ａ２Ｇ２Ｆに対して結合特異性を有するレクチンを使用して、確実に、且つ早期に脳腫瘍を検出することができる。また、脳腫瘍の検出物質は、糖蛋白質のＮ結合型糖鎖Ａ２Ｇ２Ｆに特異的に結合するレクチンを有するため、糖鎖Ａ２Ｇ２Ｆに基づいて脳腫瘍を早期且つ簡易に検出することができる。さらに、糖蛋白質のＮ結合型糖鎖Ａ２Ｇ２Ｆに対して結合特異性を有するレクチンを有効成分として含む医薬組成物は、脳腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘発するので、脳腫瘍細胞により引き起こされる疾患の予防および治療に有効である。

Description

明細書

脳腫瘍の検出方法及びそれに用いる脳腫瘍の検出物質、並びに医薬組成物

技術分野

[0001] 本発明は、脳腫瘍の検出方法及びそれに用いる脳腫瘍の検出物質、並びに医薬組成物に関する。

背景技術

[0002] 近年、多くの蛋白質に糖鎖が結合していることが知られるようになり、蛋白質に結合した糖鎖が細胞同士の認識や細胞接着，又はウィルスや微生物の宿主への感染等に重要な役割を果たして、る他、蛋白質輸送のためのシグナルや蛋白質立体構造形成の際の補助的因子としても作用していることなどが明らかになりつつある。

[0003] また、複合糖質 (糖蛋白質、糖脂質、プロテオダリカン)の糖鎖は、蛋白質、核酸に次ぐ第三の生命鎖として、その役割が注目されている。特に、糖蛋白質糖鎖がその糖蛋白質の機能発現に不可欠であることが報告されている。例えば、末梢神経系ミエリンにある POという糖蛋白質は細胞間接着因子として機能しており、この POの糖鎖結合部位に改変を加えるとその細胞間接着活性が失われることが知られて、る。このことは糖鎖に接着活性があつたためではなぐ蛋白質の構造を細胞膜上に支えるようにして存在していた糖鎖がなくなったことにより、 POが接着に必要なコンフオメーションを維持できなくなつたと考えられている。このように糖蛋白質糖鎖を有する分子は、神経系の発生にぉ、ても、また他の様々な領域にぉ、ても細胞と細胞間の認識は極めて重要な役割を果たしていることから、糖蛋白質糖鎖の重要性が認識されている。しかしながら、糖蛋白質糖鎖の精製には膨大な時間を要し、また細胞表面や組織中で発現している糖蛋白質糖鎖の系統的解析方法がないなどの理由から、糖蛋白質糖鎖の機能解明はあまり進んでいな力つた。

[0004] そこで、本発明者らの 1人である池中らは HPLCシステムを用いた自動化、簡易化による糖蛋白質糖鎖の系統的解析方法を開発した。そして、この方法により糖鎖の一種であ fnantennary tngalactosylated structure with one outer arm fucosyl ation (A3G3F0)が肺癌患者血清中で増加して!/、ることを見出した (非特許文献 1 および 2)。また、特許文献 1には、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A3G3F0に基づいて癌

、特に肺癌を検出する癌検出方法及びそれに用いる癌検出物質が開示されている。さらに、非特許文献 3には、神経細胞接着分子 (N— CAM)上に存在するポリシアル酸の発現が転移性の肺癌で高発現し、ポリシアル酸を制御する ST8Sia II (STX)遺伝子の発現と腫瘍の悪性度との間に相関性があることが報告されている。

特許文献 1：特開 2001— 289860号公報

非特許文献 1 :】. Biochem. 129 : 537- 542, 2001

非特許文献 2 :Anal. Biochem. 267 : 336 - 343, 1999

非特許文献 3 : Cancer Res. , 61： 1666 - 1670, 2001

発明の開示

発明が解決しょうとする課題

[0005] し力しながら、上記の特許文献および非特許文献には特に肺癌に特異的な糖蛋白質糖鎖しか開示されておらず、他臓器の癌における糖蛋白質糖鎖については一切開示されていな力つた。特に脳における腫瘍は肺等の他臓器の癌と異なって、脳という特殊な臓器に存在するため、その発生'占拠部位によっては生きるのに重要な中枢が存在する脳の働きを障害し、様々な症状を引起こしていた。このような背景から、脳での病態による糖鎖の異常を解析し、特に脳腫瘍を確実に、且つ早期に検出する方法が望まれていた。

[0006] また、脳腫瘍の診断には、 CTスキャンや核磁気共鳴装置などの画像診断により行われているが、脳腫瘍に特異的な腫瘍マーカー等の役割を果たす検出物質の発見が期待されていた。

[0007] 一方、脳腫瘍の治療は腫瘍全体を完全に摘除することが基本であるが、悪性の脳腫瘍においては境界が明確でないため、完全には摘出できないことが多ぐ放射線治療、化学療法や免疫療法を併用している。腫瘍細胞の病態細胞の増殖を阻害して、腫瘍細胞に起因する疾病を治療するものとして、例えば、マイトマイシン c、ブレォマイシンなどの抗生物質が知られている力 S、これらはいずれも所定の細胞に作用して、それを壊死すなわちネクローシスを起こさせて病態細胞を排除するものである。し力しながら、このネクローシスによる細胞死は、正常細胞または生体に対する副作用が強、ために充分な効果が上げられておらず、正常細胞にも新たな疾患を惹起するという重大な欠陥がある。他方、生理的な条件下で細胞自らが積極的に惹起するようにプログラムされた細胞死すなわちアポトーシスは、周囲の細胞に影響を与えずに、細胞表面の湾曲、核クロマチンの凝縮、染色体 DNAの断片化等の独特の形態異常を起して細胞が死ぬ現象であり、これを誘導しうることが可能であれば、悪性腫瘍等の疾患に対する治療に際して非常に有利である。

[0008] そこで、本発明は、確実に、且つ早期に脳腫瘍を検出可能な脳腫瘍の検出方法及びそれに用いる脳腫瘍の検出物質を提供することを目的とする。本発明は、また、脳腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘導し、脳腫瘍の有効な予防および治療のための医薬組成物を提供することを目的とする。課題を解決するための手段

[0009] 上記課題に鑑みて鋭意検討した結果、正常な脳組織の N結合型糖鎖の発現バターンは固体差なく保存されて、ることが報告されて、る (非特許文献 1)ことから、正常組織と神経膠腫細胞との N結合型糖鎖の発現パターンを比較したところ、糖蛋白質の N結合型糖鎖のうち特定なものが神経膠腫細胞で増加していることに着目し、その特定の N結合型糖鎖を同定した。そして、同定された N結合型糖鎖 A2G2Fが正常組織には発現されず、神経膠腫細胞のみに発現されることを見出した。さらに、レンズマメ (LCA)レクチンが、神経膠腫細胞に対してアポトーシスを誘導することを見出し、本発明に想到した。

[0010] 本発明の請求の範囲第 1項記載の脳腫瘍の検出方法は、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fの検出に基づいて脳腫瘍を検出することを特徴とする。

[0011] 本発明の請求の範囲第 2項記載の脳腫瘍の検出方法は、請求の範囲第 1項にお Vヽて、前記 N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを使用することを特徴とする。

[0012] 本発明の請求の範囲第 3項記載の脳腫瘍の検出方法は、請求の範囲第 2項において、前記レクチン力レンズマメレクチンであることを特徴とする。

[0013] 本発明の請求の範囲第 4項記載の脳腫瘍の検出方法は、請求の範囲第 1項において、前記脳腫瘍が、神経膠腫であることを特徴とする。

[0014] 本発明の請求の範囲第 5項記載の脳腫瘍の検出物質は、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを含有することを特徴とする。

[0015] 本発明の請求の範囲第 6項記載の脳腫瘍の検出物質は、請求の範囲第 5項において、前記レクチン力レンズマメレクチンであることを特徴とする。

[0016] 本発明の請求の範囲第 7項記載の医薬組成物は、脳腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘発する医薬組成物であって、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを有効成分として含むことを特徴とする。

[0017] 本発明の請求の範囲第 8項記載の医薬組成物は、請求の範囲第 7項において、前記レクチン力レンズマメレクチンであることを特徴とする。

[0018] 本発明の請求の範囲第 9項記載の医薬組成物は、請求の範囲第 7項において、前記脳腫瘍細胞が、神経膠腫細胞であることを特徴とする。

発明の効果

[0019] 本発明の請求の範囲第 1項記載の脳腫瘍の検出方法によれば、脳腫瘍に特異的に発現する糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに基づいて、確実に、且つ早期に脳腫瘍を検出することができる。さらに、脳腫瘍の早期発見及び治療に有益である。

[0020] 本発明の請求の範囲第 2項記載の脳腫瘍の検出方法によれば、前記 N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを使用して、確実に、且つ早期に脳腫瘍を検出することができる。さらに、脳腫瘍の早期発見及び治療に有益である。

[0021] 本発明の請求の範囲第 3項記載の脳腫瘍の検出方法によれば前記 N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレンズマメレクチンを使用して神経膠腫を検出することができる。さらに、神経膠腫の早期発見及び治療に有益である。

[0022] 本発明の請求の範囲第 4項記載の脳腫瘍の検出方法によれば、前記 N結合型糖鎖 A2G2Fに基づいて神経膠腫を、確実に、且つ早期に検出することができる。

[0023] 本発明の請求の範囲第 5項記載の脳腫瘍の検出物質によれば、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを含有するため、糖鎖 A2G 2Fに基づいて脳腫瘍を検出できる。また、本発明の検出物質を用いることにより脳腫瘍をより早期且つ簡易に検出することができる。 [0024] 本発明の請求の範囲第 6項記載の脳腫瘍の検出物質によれば、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレンズマメレクチンを含有するため、糖鎖 A2G2Fに基づいて脳腫瘍を検出できる。また、本発明の検出物質を用いることにより脳腫瘍をより早期且つ簡易に検出することができる。

[0025] 本発明の請求の範囲第 7項記載の医薬組成物によれば、アポトーシス誘導に基づく細胞増殖阻害活性を有するため、周囲の正常細胞に影響を与えずに、脳腫瘍細胞の増殖のみを選択的に阻害しうるので、脳腫瘍細胞により引き起こされる疾患の予防および治療に有効である。

[0026] 本発明の請求の範囲第 8項記載の医薬組成物によれば、脳腫瘍細胞に対して選択的にアポトーシスを誘発することができる。

[0027] 本発明の請求の範囲第 9項記載の医薬組成物によれば、アポトーシスの誘導により、神経膠腫細胞を選択的に排除することができる。

図面の簡単な説明

[0028] [図 1]標準糖鎖のマンノースユニット対グルコースユニットの 2次元マップである。

[図 2]糖鎖の構造式を示す図である。 GluNAcは N ァセチルダルコサミン、 Manはマンノース、 Galはガラクトース、 Fucはフコースの略字である。また、構造式中の各記号の意味は次の通りである； An: M3糖鎖構造に結合する GlcNAcのアンテナの数、 Gn：非還元末端に付けられたガラクトース残基の数、 F：還元末端の GluNAc残基に結合したフコースを有するもの、 FO : GlcNAcの外側にフコースが α 1—3結合したもの、 Β： Μ3糖鎖構造の真ん中のマンノースに結合する GlcNAcを有するもの。

[図 3]本発明の実施例 1における逆相 HPLC溶出パターン図である。 Aは正常組織、 Bは神経膠芽腫を示す。なお、図中のピークに記載の番号は、図 1及び 2に記載されている糖鎖番号に対応する。

[図 4]本発明の実施例 2における免疫組織ィ匕学染色の結果を示す顕微鏡写真である。 Aは神経膠腫細胞株、 Bは神経膠芽腫組織を示す。

[図 5]本発明の実施例 3における LCAレクチンを添カ卩した時の U251, T98G, ON 12細胞の平均の生存率の結果を示すグラフである。

[図 6]本発明の実施例 3におけるアポトーシス細胞のクロマチンの凝集を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す顕微鏡写真である。 Aは LCAレクチン添加なし、 Bは LCA レクチン添加ありを示す。

[図 7]本発明の実施例 3におけるフローサイトメトリー法による hypodiploid DNAの検出結果を示すグラフである。 Aは LCAレクチン添加なし、 Bは LCAレクチン添加ありを示す。

[図 8]本発明の実施例 3における MEBSTAINアポトーシスキットを用いたフローサイトメトリー法によるアポトーシス細胞の検出結果を示すグラフである。 Aは LCAレクチン添加なし、 Bは LCAレクチン添加ありを示す。

[図 9]本発明の実施例 3におけるフローサイトメトリー法による活性ィ匕カスパーゼ一 3の検出結果を示すグラフである。 Aは T98G細胞、 Bは U251細胞、 Cは ON12細胞を示す。

発明を実施するための最良の形態

[0029] 以下、本発明について詳細に説明する。

[0030] 本発明でいう A2G2Fとは、糖蛋白糖鎖（Gal jS 1, 4— GlcNA_{C j}8 1, 2-Man a l , 3—） (Gal jS 1, 4 GlcNAc jS 1, 2-Man a l, 6—） Man jS 1, 4 GlcNAc jS 1 , 4- (Fuc a l, 6—） GlcNAcであり、 A2G2Fという各記号の意味は次の通りである。 An : M3糖鎖構造に結合する GlcNAcのアンテナの数、 Gn:非還元末端に付けられたガラタトース残基の数、 F：還元末端の GluNAc残基に結合したフコースを有するもの。

[0031] また、本発明の検出方法により検出可能な脳腫瘍とは、脳や脳の周辺組織などの頭蓋骨の内部にある組織に発生する腫瘍のことであり、脳組織自体から発生する「原発性脳腫瘍」と、他の臓器の癌が脳に転移してくる「転移性脳腫瘍」が挙げられる。原発性脳腫瘍として、原発性脳腫瘍の約 3割を占める神経膠腫、また神経膠腫のうちで最も悪性度の高ヽ神経膠芽腫などが挙げられる。

[0032] 本発明の脳腫瘍の検出方法は、摘出された脳組織の N結合型糖鎖を、 HPLCを用いた糖蛋白質糖鎖システムにより解析し、脳腫瘍に特有の糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fの検出に基づいて脳腫瘍を検出する方法である。また、前記 N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを使用して脳腫瘍を検出する方法である。

[0033] 本発明の脳腫瘍の検出方法に用いるレクチンとは、植物 '動物'微生物に存在するタンパク質または糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質である。本発明の脳腫瘍の検出方法に用いるレクチンとしては、例えばレンズマメ (LCA: Lens culinaris Agglutinin)レクチンが好ましい。このレンズマメレクチンは、ポリぺプチド鎖のァスパラギンに結合した糖鎖 (Asn型 (N型)糖鎖) GlcNAc残基の C— 6位に結合した a—Fucに特異的に結合することが知られている。なお、神経膠芽腫細胞及び神経膠芽腫組織において、 0. 1%以上存在する糖鎖構造の中で A2G2Fのみ力 LCAレクチンが特異的に結合するフコシル化された α 1— 6GlcNAc構造を有する。

[0034] 本発明の脳腫瘍の検出方法により、高精度で神経膠腫を検出でき、さらに A2G2F に対して結合特異性を有するレクチン (LCAレクチン)を利用することにより神経膠腫や神経膠芽腫などの脳腫瘍をより早期且つ簡易に検出できる。また、 A2G2Fを特異的に認識する抗体を利用することにより神経膠腫や神経膠芽腫などの脳腫瘍をより早期且つ簡易に検出してもよ!、。

[0035] また、本発明の脳腫瘍の検出物質としては、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに特異的に結合するレクチンを含有するものであれば特に制限されるものではな、。また、 N結合型糖鎖 A2G2Fに特異的に結合するレクチンとしては、 LCAレクチン等を挙げることができる。さらに、本発明の脳腫瘍の検出物質が、 N結合型糖鎖 A2G2F を特異的に認識する抗体カゝらなるものであってもよヽ。 A2G2Fを認識する抗体としては、モノクローナル抗体やポリクローナル抗体等を例示することができる。これら抗体は、慣用のプロトコールを用いて、実験動物に A2G2Fの糖鎖を投与することにより産生することが可能である。

[0036] また、 A2G2Fを特異的に結合するレクチンや A2G2Fを特異的に認識する抗体を化学蛍光試薬や放射性同位体等で標識することができる。化学蛍光試薬として例えばフルォロセイン，ロダミン，ルミノールなど、放射性同位体として例えば 3H, 14C, 35S, 33P, 32P, 1251などが挙げられる。この標識により、 A2G2Fが例えば脳腫瘍マーカーとして、従来の CTスキャン，核磁気共鳴装置などの画像診断による診断方法を併用することにより、高い精度で、早期且つ確実に脳腫瘍を検出または診断することが可能である。

[0037] 本発明の医薬組成物は、脳腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘発する医薬組成物であって、糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを有効成分として含む。本発明の有効成分として用いるレクチンとは、植物 '動物'微生物に存在するタンパク質または糖タンパク質のうち、糖に対する特異的結合活性をもった物質である。また、本発明の有効成分として用いるレクチンとしては、レンズマメ (LCA: Lens culinaris Agglutinin)レクチンが好ましい。

[0038] 本発明の医薬組成物は、その使用目的に応じ、医薬剤や製剤成分と複合してアポトーシスを誘導するための医薬組成物として用いてもよい。併用される医薬剤としては、抗癌剤、抗ウィルス剤、抗自己免疫疾患剤を挙げることができる。このように、本発明の医薬組成物に、抗癌剤などの医薬剤を包合させることにより薬剤を病巣局所に集約させ、脳腫瘍細胞により引き起こされる疾患の予防および治療に有効である。

[0039] また、本発明の医薬組成物は、医薬製剤としてこの分野で慣用されている各種の投与形態で使用される。例えば、粉末、錠剤、丸剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、カプセル剤、注射剤 (液剤、懸濁剤等)等の形で製剤化することができ、所望に応じ溶解補助剤、緩衝剤、等張化剤、安定剤、保存剤、無痛化剤など注射液に慣用されている添加剤や、充填剤、増量剤、結合剤、付湿剤、崩壊剤、表面活性剤、あるいは賦形剤等を併用してもよい。さら〖こ、本発明の医薬組成物は、経口的又は非経口的に投与される。その投与量は、治療すべき脳腫瘍の程度により増減され、特に限定されるものではない。

[0040] なお、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。上記実施形態は、例示であり、本発明の特許請求の範囲に記載された技術的思想と実質的に同一な構成を有し、同様な作用効果を奏するものは、いかなるものであっても本発明の技術的範囲に包含される。

実施例 1

[0041] (神経膠芽腫組織、及び神経膠腫細胞株における N結合型糖蛋白質糖鎖の発現解析） 3例の正常脳組織、 15例の神経膠芽腫組織、及び 3種の神経膠腫細胞株を用いて糖蛋白質糖鎖分析を行った。コントロールとしての 3例の正常脳組織 (男性:女性 = 2: 1、平均年齢 55. 2)は、てんかん性の手術を受けた患者力もインフォームドコンセントを得て組織を収集した。また、 15例の神経膠芽腫組織は、新潟大学病院で神経膠芽腫を有する患者 (表 1参照)カゝらインフォームドコンセントを得て組織を収集した。

[表 1]

まず、検体の前処理として、脳組織を冷 PBSで灌流し、その重量を測定した後、 9 倍量の一 20。Cのアセトンを加えた。なお、 PBSは、 NaCl 8g、 KCl 0. 2g、 Na HP O 1. 44g、 KH PO 0. 24gを 1リツ卜ノレの脱ィ才ン水に溶力して、 pH7. 4として

4 2 4

調製したものを使用した。脳組織を、 9倍量の冷アセトン中でポリトロン型ホモジナイザ一を用いてホモジナイズし、— 20°Cで 60分間放置した後、 4°C、 8000Gで 20分間遠心した。この上清を除去後、再度同様の操作を行った後、沈殿物を凍結乾燥し、検体を得た。乾燥重量 2mgの検体を GlycoPrep™1000 (Oxford Glycosystems, O xford, UK)を用いて検体をヒドラジン分解して蛋白質力も糖鎖を切り離した。次に、切り離された糖鎖を GlycoTag™(Takara, Tokyo, Japan)を用いてピリジルアミノィ匕による光標識を行った後、ノイラミニダーセ (neuraminidase) (Arthrobacter ureafaciens由来， Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)で糖鎖を処理して、その側鎖にあるシアル酸を切断した。電荷を有するシアル酸が切断された結果、検体の脳組織内に存在する中性の糖鎖を得ることができた。

[0044] 検体中の様々な大きさの糖鎖を、その大きさ別に分けるために、蛍光標識された上記中性の糖鎖群を含む検体を順相 HPLC (Asahipak NH2P- 50 size- fractionation column (4.6 X 50 mm; Shodex, Tokyo, Japan))にかけ、糖鎖の量を蛍光検出器で検出して測定した。順相 HPLCの測定条件を詳しく述べると、流速は 0. 6 ml/ min、カラムの温度は 30°C、溶媒 Aを 20%ァセトニトリル、 0. 3%酢酸を含み、トリエチルァミンで pH7. 0に調整した水として、溶媒 Bは 93%ァセトニトリル、 0. 3%酢酸を含み、トリェチルァミンで _PH7. 0に調整した水として、最初溶媒 A:溶媒 Bの比を 9 7 : 3でスタートさせ、溶媒 Bを、検体を投入して 1分後に 19%、 35分後に 57%まで直線的に増加させた。ここ力も溶出してくる蛍光標識糖鎖を励起波長 310nm、検出波長 380nmで検出し、標準糖鎖（PA- sugar chain M2A,M3B,M4B,M5A,M6B, M7A,M8A,M9A(Takara,Tokyo,Japan))の溶出時間にしたがって M2〜M10の画分を分取した。 M10溶出時間は M9A溶出時間 + 1. 5分として設定した。

[0045] 順相 HPLCで大きさ別に分離された糖類を、今度はその糖鎖分子の構造上の特性によって分類するために逆相 HPLC (Cosmosil 5C18- P reversed- phase column (4.6 X 150 mm; Nacali Tesque))にかけた。なお、 HPLCシステムとして PU- 2089 plus HPLC pump (Nihon Bunkou, Tokyo, Japan) ^ FP- 2055 plus fluorescenc e detector (Nihon Bunkou)、 AS— 2055 plus autosampler (Nihon Bunkou)を用いた。コントロールシステム及びピークの溶出時間、相対含有量の解析には Jasco Bow in(Nihon Bunkou)を使用した。逆相 HPLCの測定条件を詳しく述べると、流速は 1. 5ml/min 、カラムの温度は 30°C、溶媒 Cを 0. 1Mの酢酸アンモ-ゥム緩衝液（pH 4. 0)、溶媒0は溶媒じに0. 5%の 1ブタノールをカ卩えたものとして、最初溶媒 C :溶媒 Dの比を 94 : 6でスタートさせ、溶媒 Dを、検体を投入して 45分後に 80%まで、直線的に増加させた。ここ力も溶出してくる蛍光標識糖鎖を励起波長 320nm、検出波長 400nmで検出し、その溶出パターンを次の手順で比較検討し、検体中の糖鎖の構造と含有量を決定した。

[0046] 逆相 HPLCに検体を投入する前に、予め、グルコースオリゴマー（3〜22個のブドゥ糖が結合した標準糖鎖)を投入し、その溶出時間を測定しておき、検体の溶出時間の内的標準とする。検体のピークが内部標準のどれくらいの位置に匹敵するかを計算し、グルコースユニット（GU)として表現する。逆相 HPLCで認められるピーク毎にそのピークに含有する糖鎖を採取し、もう一度これを順相 HPLCに投入する。 GU と同様な方法で、今度はマンノースユニット（MU)を計算し、逆相 HPLCで認められる各々のピークについて、 GU及び MUの 2つの指標を用いて、横軸に GU、縦軸に MUをとつて 2次元のグラフ上にプロットする。 2次元でその糖鎖の特性を判別するこの方法を、予め構造が分かっている糖鎖（Takara, Seikagaku Corporation (Tokyo, Japan), Oxford GlycoSystemsから購入）について行った後、脳組織由来の糖鎖について行い、その 2次元マップ上で点が重複するか否かで、構造を同定した。図 1は標準糖鎖の 2次元マップであり、横軸はグルコースユニット値を示し、縦軸はマンノースユニット値を示す。また、図 1のグラフ上にプロットされた番号の糖鎖構造式を図 2 に示す。すなわち、番号 1は A0G0F、 2は A2G1F0 (3) FB、 3は A2G1F0 (6) FB、 4ίま A2G2, 5ίま A2G2F、 6ίま A3G3、 7ίま ΒΑ2、 8ίま M2B、 9ίま Μ3Β、 10ίま M4B、 11は M5A、 12は M6B、 13は M7A、 14は M7B、 15は M8A、 16は M9Aを示している。

[0047] 図 3は、ヒト正常脳組織 (A)および神経膠芽腫組織 (B)の N結合型糖鎖の逆相 HP LC分析における全フラクション（M2〜M11)の溶出パターンを示す。ピーク 5は、神経膠芽腫組織 (B)の M6及び M7画分のみに確認され、ヒト正常脳組織 (A)では確認されなかった。このピーク 5は、図 1に示す 2次元マップにより糖鎖 A2G2Fであると同定された。このことより、糖鎖 A2G2Fは正常脳組織に発現されず、神経膠腫細胞にのみ発現される、神経膠腫に特異的な糖鎖であることがわ力つた。

[0048] また、正常脳組織 (Normal Brain)、神経膠芽腫組織 (GBM)、及び神経膠腫細胞株 (Cell Line)の分離、同定された糖蛋白質の N結合型糖鎖の含有率 (％)を表 2示す。

[0049] [表 2]

一 JeLoesoi一

正常脳組織においては、 N結合型糖鎖全体のうち平均 46. 4%が同定された。また、分岐の数を考慮した場合、 2分岐構造を持つ糖鎖が 6. 27%と最も多く認められたものの、 3分岐構造及び 4分岐構造を持つ高分岐型糖鎖は殆ど認められなカゝつた。オリゴマンノース系列では M5Aが最も多く認められ、次いで M6B, M9Aが多く認められた。さらに、 A2G2においては 2. 78%認められた。 [0051] A2G2Fは正常脳組織には認められな力つた力神経膠芽腫細胞株及び神経膠芽腫組織で認められた (Pく 0. 01)。また、標準検体 (A2G2F)との Co- injectionにより単一のピークとなることを確認した。 A2G2Fは神経膠芽腫組織において 2. 9± 1. 9 3%含まれており、神経膠腫細胞株において 5. 60± 1. 14%含まれていた。 2例の神経膠芽腫組織にっ、てイオン交換 HPLCを行ヽ、 A2G2Fのシアル酸ィ匕率を調べたところ、 62. 20%と 56. 19%であった。 A2G2はネ申経膠芽腫糸且織で 12. 66±8. 3 3%認められ、正常脳組織での 2. 78±0. 60%に比べ有意に高かった。 A3G3は神経膠芽腫組織で 1. 00±0. 79%、神経膠腫細胞株で 3. 51 ± 2. 13%認められた。神経膠芽腫組織には肺癌や肝細胞癌で認められている高分岐型糖鎖は認められなかった。

実施例 2

[0052] (レクチン染色）

HPLCの結果神経膠芽腫に含有され、正常脳では検出されな力つた A2G2Fに対して、レクチン染色を行った。細胞において LCAレクチンが特異的に結合する fucos ylated α 1— 6GlcNAc構造は、 0. 1%以上存在する糖鎖構造の中で A2G2Fのみであったことから、コア（core)の α 1,6-focosylation構造に特異的に結合する LCA( レンズマメレクチン； Seikagaku Corporation,Tokyo,Japan)を使用した。

[0053] 以下の手順により、神経膠芽腫組織 (n= 10)及び 3種類の神経膠腫細胞株、コントロールとして正常脳組織（_n= 3)において、 LCA (レンズマメレクチン）を用いた染色を行い顕微鏡観察した。まず、それぞれの試料の凍結切片を用い、蛍光試薬 FIT Cで標識された LCA— FITC (Seikagaku Corporation,Tokyo,Japan; 500 μ g/ml: diluted 1:50)を加え 20分間反応後、蛍光顕微鏡にて観察した。なお、糖鎖 A2G2F に対し、非免疫マウスィムノグロブリンをネガティブコントロールとして用いた。

[0054] 結果を図 4に示す。図 4— Aは神経膠腫細胞株の免疫組織ィ匕学染色を示し、図 4

Bは神経膠芽腫組織の免疫組織化学染色を示す。神経膠腫細胞株では LCAにより非常に強く染色され (図 4 A)、神経膠芽腫組織においても LCAにより強く染色された（図 4— B)。正常脳組織においては実質には明らかな染色を認めな力つた（図示せず)。この結果より、 A2G2Fと特異的に結合する LCAレクチンが神経膠芽腫組織及び神経膠腫細胞株と特異的に結合するのが明らかとなった。したがって、脳腫瘍のみに発現する A2G2Fに対して結合特異性を有する蛍光試薬で標識されたレクチンを用いて脳腫瘍を検出することが可能である。

実施例 3

[0055] (細胞増殖及びアポトーシス測定）

U251, T98G (Riken Cell Bank,Tsukuba,Japan)、及び神経膠芽腫患者組織から培養された ON— 12神経膠腫細胞株を 10%の FCS, 50mMの 2—メルカプトエタノーノレ， 10mMのへぺス（HepesKpH 7. 4), 2mMのグルタミン， lOOUZmlのぺ -シリン， 100 g/mlのストレプトマイシンを含む MEM培地（Invitrogen, TokyoJ apan)中で培養したものを試料として使用した。

[0056] (1) U251, T98G, ON— 12の各細胞を、 96wellプレートに 5 X 10³ずつ細胞を播種し、 24時間後に各濃度の LCAレクチンを加え、さらに 24時間培養を継続した。その後、テトラカラーワン（TetraColor ONE)試薬 (Seikagaku Corporation, Tokyo, J apan)を 10 /z lカ卩え、 4時間後に 420nmの吸光度を測定後、各細胞の細胞増殖能を検討した。

[0057] (2) U251, T98G, ON— 12の各細胞 1 X 10⁴を培養スライド (BD Falcon.Bedford, MA)で培養し、 25 gZmlの LCAレクチンをカ卩ぇ 24時間培養後、 Hoechst 33342 ( bisbenzimiae hj3342 Fluorochrome ： Calbiochem— Novabiochem. し o.，し A) 10 μ lZml加え、核クロマチンを蛍光顕微鏡にて観察した。

[0058] (3) U251, T98G, ON— 12の各細胞 1 X 10⁶を 25 μ gZmlの LCAレクチンをカロえ 24時間培養後、 50 gZmlのヨウ化プロビジゥム (Sigma, Tokyo, Japan)を用いて核染色を行い、フローサイトメトリー法にて hypodiploid DNAを測定した。

[0059] (4) MEBSTAINアポトーシスキット（Medical & Biological Laboratories CO.,

Nagoya, Japan)を用いて、ビォチン化 dUTPで DNA末端をニックエンドラベルし、さらに FITC標識アビジンで染色することにより、 DNAの断片化を指標に、アポトーシスによる細胞死を細胞個々に検出した。具体的には、各細胞に gZmlの LCAレクチンをカ卩ぇ 24時間培養後、細胞をトリプシン処理により回収し、 PBS/0. 2%BS A (Bovine serum albumin)で数回洗净行い、 4%PFA(paraformaldehyde)にて 30分間固定を行った後、 PBSZO. 2%BSAで洗浄後、 70%エタノール lmlをカ卩えて、 20°Cで 30分間さらに固定を行った。次いで、 PBS/0. 2%BSAにて洗浄後、細胞沈渣に対して TdT (ターミナル ·デォキシヌクレオチジル ·トランスフェラーゼ)反応液を 30 1カ卩ぇ撹拌し、 37°Cで 1時間反応させた。次いで、 PBS/0. 2%BSAにて洗浄後、細胞沈渣を 500 1の PBSZO. 2%BSAに懸濁させフローサイトメトリー法にて測定した。

[0060] (5)細胞内のカスパーゼー 3を FITC結合ラビット抗活性カスパーゼー 3モノクロ一ナル抗体（BD PharMingen, Tokyo, Japan)を用いて検討した。具体的には、 25 gZmlの LCAレクチンを、 U251, T98G, ON— 12の各細胞に加え 24時間以上培養して細胞沈渣を回収した後、 FITC結合ラビット抗活性ィ匕カスパーゼー 3モノクロ一ナル抗体（BD PharMingen, Tokyo, Japan)を 20 1カ卩ぇ撹拌し、 4°Cで 1時間反応させた。次いで、 PBS/0. 2%BSAにて洗净後、細胞沈を 500 1の PBS/0. 2 %BSAに懸濁させフローサイトメトリー法にて測定した。

[0061] 上述した（1)〜（5)の細胞増殖又はアポトーシス測定の結果を図 5〜9に示す。図 5 は、 U251, T98G, ON— 12細胞にそれぞれ LCAレクチンを添カ卩した時の U251, T98G, ON— 12細胞の平均の生存率の結果を示すグラフである。図 5からわ力るように、 U251, T98G, ON— 12細胞は LCAレクチン添カ卩により濃度依存性に細胞増殖能の抑制が認められた。

[0062] 図 6は、 T98G細胞に LCAレクチンを添カ卩してな!/、もの（A)と、 LCAレクチンを添加したもの (B)を培養後、 Hoechst 33342の蛍光色素を使用してアポトーシス細胞のクロマチンの凝集を蛍光顕微鏡下で観察した結果を示す顕微鏡写真である。図 6— Bの LCAレクチンを添加した細胞では、クロマチンの凝集部分に色素が集まり（矢印で示した箇所)、強い青色蛍光染色が認められた。この結果は、クロマチン凝集がァポトーシスに伴うもっとも特徴的な形態変化の一つであることから、 LCAレクチンによつてアポトーシスが誘導されることを示した。

[0063] 図 7は、フローサイトメトリー法による hypodiploid DNAの検出結果を示すグラフである。図 7— Aは、 T98G細胞に LCAレクチンを添カ卩してないコントロール核の典型的な DNAヒストグラムであり、図 7— Bは、 T98G細胞に LCAレクチンを添カ卩して培養した細胞の DNAヒストグラムである。図 7に示したように核染色により hypodiploid DNA の検討を行ったところ T98G細胞では、無処置では 0. 29%であったが、 LCAレクチンを加えると 31. 99%であり、 LCAレクチン添カ卩による hypodiploid DNAの増加が認められた。

[0064] 図 8は、 MEBSTAINアポトーシスキットを用いたフローサイトメトリー法によるアポト一シス細胞の検出結果を示すグラフである。 MEBSTAINアポトーシスキットを用いた染色によりヌクレオソームにおける DNAの断片化の観察では、 T98G細胞の LCA レクチンを添カ卩してないもの (図 8— A)では 2. 08%であったが、 LCAレクチンを添カロしたもの (図 8— B)では 16. 45%であり、 LCAレクチンを添カ卩することにより DNAの断片化の増加が認められた。この結果より、神経膠腫細胞は LCAレクチンでアポトーシスが誘導されることがわかった。

[0065] 図 9は、フローサイトメトリー法による活性ィ匕カスパーゼ一 3の検出結果を示すグラフである。図 9— A, B, Cは、それぞれ T98G, U251, ON12の各細胞におけるカスパーゼー 3陽性細胞の検出結果を示す。また、図中の実線は、 LCAレクチンを添カロしたものを示し、破線は LCAレクチンを添カ卩していないものを示す。 T98G, U251, ON12の各細胞は、それぞれ LCAレクチンを添カ卩した場合、 36. 78%, 23. 03%, 20. 86%であり、 LCAレクチンを添カ卩していないものと比較し、活性化カスパーゼ— 3の増加が認められた。これらの結果力わ力るように、神経膠腫細胞に LCAレクチンはアポト-シスを誘導し、それはカスパーゼ経路依存性であることが明ら力となった

Claims

請求の範囲

[1] 糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fの検出に基づいて脳腫瘍を検出することを特徴とする脳腫瘍の検出方法。

[2] 前記 N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを使用することを特徴とする請求の範囲第 1項記載の脳腫瘍の検出方法。

[3] 前記レクチンが、レンズマメレクチンであることを特徴とする請求の範囲第 2項記載の脳腫瘍の検出方法。

[4] 前記脳腫瘍が、神経膠腫であることを特徴とする請求の範囲第 1項記載の脳腫瘍の検出方法。

[5] 糖蛋白質の N結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを含有することを特徴とする脳腫瘍の検出物質。

[6] 前記レクチンが、レンズマメレクチンであることを特徴とする請求の範囲第 5項記載の脳腫瘍の検出物質。

[7] 脳腫瘍細胞に対してアポトーシスを誘発する医薬組成物であって、糖蛋白質の N 結合型糖鎖 A2G2Fに対して結合特異性を有するレクチンを有効成分として含むことを特徴とする医薬組成物。

[8] 前記レクチンが、レンズマメレクチンであることを特徴とする請求の範囲第 7項記載の医薬組成物。

[9] 前記脳腫瘍細胞が、神経膠腫細胞であることを特徴とする請求の範囲第 7項記載の医薬組成物。