KR101868042B1

KR101868042B1 - 뇌종양 진단을 위한 당단백질을 검출하는 방법, 및 이에 이용되는 조성물 또는 키트

Info

Publication number: KR101868042B1
Application number: KR1020160100887A
Authority: KR
Inventors: 이지은; 김영수; 박예은; 이철주; 한기철; 염정훈
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2016-08-08
Filing date: 2016-08-08
Publication date: 2018-06-18
Also published as: KR20180016892A

Abstract

일 양상에 따른 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 당단백질을 검출하는 방법, 이에 이용되는 조성물 또는 키트를 제공한다. 이에 따르면, 뇌종양을 간편하게 진단할 수 있고, 뇌종양을 높은 정확도 및 특이도로 진단하는데 이용할 수 있다.

Description

뇌종양 진단을 위한 당단백질을 검출하는 방법, 및 이에 이용되는 조성물 또는 키트{Method of detecting glycoprotein for diagnosis brain tumor and composition or kit used thereon}

뇌종양 진단을 위한 당단백질을 검출하는 방법, 및 이에 이용되는 조성물 또는 키트에 관한 것이다.

뇌종양(brain tumor 또는 encephaloma)은 뇌질과 뇌막에 생기는 종양을 말한다. 뇌종양은 가장 심각하고 흔하게 발생하는 뇌 질환이며, 뇌종양은 두개골 안에서 성장하기 때문에 종양이 커짐에 따라 뇌압이 상승하게 되고, 특정부위가 압박됨으로써 뇌가 담당하는 기능에도 장애가 올 수 있다. 뇌종양은 발병 후 2년 생존율이 약 30%에 불과하여 예후가 좋지 않은 심각한 악성 종양이다. 현재 뇌종양의 진단 확정을 위해서는 전산화 단층촬영(CT), 자기 공명 영상(MRI), 양전자 방출 단층촬영(PET) 등의 영상을 통한 확인 방법이 주로 사용되고 있을 뿐 뇌종양을 조기에 발견하거나 예측할 수 있는 검증된 뇌종양 특이적인 바이오마커는 아직 없는 것으로 알려져 있다.

대부분의 세포 표면막(plasma memebrane) 단백질은 전사후 가공(Post-translational modification: PTM) 중 하나인 글리코실화(glycosylation)되고, 단백질의 당화는 세포와 세포의 상호작용이나 세포의 기능에 있어서 중요한 역할을 수행한다. 글리코실화는 당화 또는 당질화라고도 한다. 세포의 상태나 종류에 따라 단백질의 글리코실화 패턴이 달라지고, 암 세포에서 단백질의 글리코실화 변화는 암발생이나 전이와 관련되어 있는 것으로 알려져 있다.

따라서, 비용이 비싸고 번거로운 영상 진단이 아니라, 뇌종양을 간편하고 비용이 저렴하게 진단할 수 있고, 진단의 정확도 및 특이도가 높은 바이오마커를 개발할 필요가 있다.

뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

뇌종양 진단용 조성물을 제공한다.

뇌종양 진단용 키트를 제공한다.

일 양상은 뇌종양을 앓고 있거나 뇌종양에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 유래된 생물학적 시료로부터 단백질을 수득하는 단계; 및 수득된 단백질과 렉틴을 접촉시켜 상기 렉틴과 결합하는 당단백질을 검출하는 단계를 포함하는 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 당단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 뇌종양을 앓고 있거나 뇌종양에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 유래된 생물학적 시료로부터 단백질을 수득하는 단계를 포함한다.

뇌종양(brain tumor 또는 encephaloma)은 뇌질과 뇌막에 생기는 종양을 말한다. 상기 뇌종양은 교종(glioma), 수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 전이암(metastatic tumor), 또는 이들의 조합일 수 있다. 예를 들어, 교종은 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme: GBM)이다. 상기 뇌종양은 원발성 뇌종양 또는 다른 암으로부터 전이된 종양일 수 있다.

상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 인간, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 뇌종양을 앓고 있거나 뇌종양에 걸린 것으로 의심되는 개체일 수 있다. 상기 개체는 다른 전이성 암에 걸린 개체일 수 있다.

상기 생물학적 시료는 상기 개체로부터 수득된 시료를 말한다. 상기 생물학적 시료는 예를 들면 조직, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 조직은 뇌 조직, 뇌세포, 뇌척수액, 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 뇌세포는 뇌종양 세포일 수 있다.

상기 단백질은 막 단백질일 수 있다. 막 단백질은 세포나 세포소기관의 막에 결합된 단백질을 말한다. 상기 막 단백질은 세포 표면막(plasma membrane), 소포체(endoplasmic reticulum: ER), 골지체, 또는 리소좀의 막에 위치할 수 있다, 상기 막 단백질은 표재성(peripheral) 막 단백질, 내재성(integral) 막 단백질, 막관통(trnasmembrane) 단백질, 막 당단백질, 또는 지질 고정(lipid anchored) 막 단백질일 수 있다.

상기 단백질을 수득하는 방법은 생물학적 시료를 균질화, 용해, 원심분리, 여과, 초음파 처리, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다. 상기 원심분리는 초원심분리일 수 있다.

상기 방법은 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 가수분해하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 단백질에 프로테아제를 가하여 가수분해할 수 있다. 상기 프로테아제는 예를 들어, 트립신, 키모트립신, 펩신, 또는 엔테로키나제일 수 있다.

상기 방법은 수득된 단백질과 렉틴을 접촉시켜 상기 렉틴과 결합하는 당단백질을 검출하는 단계를 포함한다.

용어 "렉틴(lectin)"은 탄화수소-결합 단백질을 말한다. 상기 렉틴은 당단백질 또는 당지질의 당 사슬과 특이적으로 결합할 수 있다. 상기 렉틴은 만노스(mannose), 포도당, 푸코스(fucose), 갈락토스, 뉴라민산(neuraminic acid), 글루코스아민(glucosamine), 갈락토스아민(galactoseamine), 아세틸글루코스아민, 아세틸락토스아민, 또는 이들의 조합을 포함한 당 사슬에 특이적으로 결합할 수 있다.

상기 렉틴은 알레우리아 아우렌티아 렉틴(Aleuria aurantia lectin: AAL), 콘카나발린 A(Concanavalin A: Con A), 그리포니아 심플리시폴리아 I(Griffonia simplicifolia I: GS I) 렉틴, 막키아 아무렌시스(Maackia amurensis: MAA) 렉틴, 피숨 사티붐 아글루티닌(Pisum sativum agglutinin: PSA), 리시누스 콤뮤니스 아글루티닌(Ricinus communis agglutinin: RCA), 대두 아글루티닌(Soybean agglutinin: SBA), 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra: SNA) 렉틴, 밀 배아 아글루티닌(Wheat Germ agglutinin: WGA), 도리코스 비프로루스 아글루티닌(Dolichos Biflorus Agglutinin: DBA), 유렉스 유로파에우스 렉틴(Ulex Europaeus Lectin I: UEA I), 파세오루스 불가리스 레우코아글루티닌(Phaseolus Vulgaris Leucoagglutinin: PHA-L), 파세오루스 불가리스 이리트로아글루티닌(Phaseolus vulgaris erythroagglutinin: PHA-E), 시세르 아리에티눔 렉틴(Cicer arietinum Lectin: CPA)　, 렌스 쿠리나리스 아글루티닌(Lens Culinaris Agglutinin: LCA), 가란투스 니바리스 렉틴(Galanthus nivalis lectin: GNA), 로투스 테트라고로부스 렉틴(Lotus Tetragonolobus Lectin: LTL), 알레우리아 아우란티아 글루티닌(Aleuria aurantia agglutinin: AAA), 리코페르시콘 에스큐렌툼 렉틴(Lycopersicon Esculentum Lectin: LEL), 그리포니아 심플리시폴리아 II(Griffonia simplicifolia II: GS II), 다투라 스트라모니움(Datura stramonium: DSA), 비시아 빌로사(Vicia Villosa: VVA), 파세오루스 리메니시스(Phaseolus limensis: LBA), 헬릭스 포마티아 아글루티닌(Helix pomatia agglutinin: HPA), 피넛 아글루티닌(Peanut agglutinin: PNA), 자칼린(Jacalin: JAC), 및 아가리쿠스 비스포루스 아글루티닌(Agaricus bisporus agglutinin: ABA)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 렉틴은 GS I 렉틴이다.

상기 렉틴은 검출가능한 물질과 결합된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 물질은 금속 침, 렉틴, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP), 스트렙타비딘, 비오틴, 아비딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine), 자성 입자, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 당단백질은 LRP1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1), Plexin-B2, CD56, 피브로넥틴(fibronectin), 및 CD(cluster of differentiation)280로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. LRP1은 알파-2-마크로글로불린 수용체(alpha-2-macroglobulin receptor: A2MR), 아포리포단백질 E 수용체(apolipoprotein E receptor: APOER) 또는 CD 91로도 알려져 있다. 상기 LRP1은 Uniprot Accession No. Q07954의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. Plexin-B2는 MM1 또는 PLXNB2로도 알려져 있다. 상기 Plexin-B2는 Uniprot Accession No. O15031의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. CD56은 신경세포 접착 분자(Neural cell adhesion molecule: NCAM) 또는 MSK39로도 알려져 있다. 상기 CD56은 NCAM 1일 수 있다. 상기 CD56은 Uniprot Accession No. P13591 예를 들어, P13591-1의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 상기 피브로넥틴(fibronectin)은 피브로넥틴 타입 I, 타입 II, 또는 타입 III일 수 있다. 상기 피브로넥틴은 Uniprot Accession No. P02751 예를 들어, P02751-6의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 상기 CD280은 C-타입 만노스 수용체 2(C-type mannose receptor 2) 또는 마크로파지 만노스 수용체 2(Macrophage mannose receptor 2; MRC 2)로도 불린다. 상기 CD280은 Uniprot Accession No. Q9UBG0의 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 그의 단편일 수 있다.

상기 방법은 상기 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 상기 항체 또는 항원 결합 단편과 인큐베이션하는 단계를 더 포함할 수 있다. 용어 "항체(antibody)"는 용어 "면역글로불린(immunoglobulin)"과 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 항체는 폴리클론 항체 또는 모노클론 항체일 수 있다. 상기 항체는 전장 항체일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 말한다. 상기 항원 결합 단편은 단일-도메인 항체(single-domain antibody), Fab, Fab' 또는 scFv일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 항체 또는 항원 결합 단편이 고체 지지체에 부착된 경우, 항체 또는 항원 결합 단편이 부착된 고체 지지체와 상기 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 인큐베이션하여 상기 당단백질을 분리할 수 있다. 분리된 당단백질은 검출가능한 물질과 결합된 렉틴과 인큐베이션하여 당단백질을 검출할 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 상기 금속은 금(Au)일 수 있다. 상기 금속 칩은 표면 개질된 것일 수 있다.

상기 방법은 상기 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 렉틴과 인큐베이션하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 렉틴은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 고체 지지체는 렉틴-기반 칩이다. 상기 고체 지지체는 예를 들어, 금속 칩, 플레이트, 또는 웰(well)의 표면이다. 렉틴이 고체 지지체에 부착된 경우, 렉틴이 부착된 고체 지지체와 상기 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 인큐베이션하여 렉틴에 결합된 당단백질을 분리할 수 있다. 분리된 당단백질은 검출가능한 물질과 인큐베이션하여 당단백질을 검출할 수 있다. 상기 검출가능한 물질은 상기 당단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 물질, 예를 들어, 항체 또는 항원 결합 단편을 포함한다.

상기 검출하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소-결합 면역흡착법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ELISA), 마이크로어레이, 면역침강, 면역형광, 크로마토그래피, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행될 수 있다.

상기 방법에서, 검출된 당단백질의 양이 정상 대조군의 시료로부터 유래된 당단백질의 양에 비해 증가될 수 있다. 렉틴과 결합된 당단백질을 검출하기 때문에, 검출된 당단백질의 양은 당단백질의 글리코실화 수준을 나타낸다. 예를 들어, 검출된 당단백질의 양이 음성 대조군의 당단백질의 양 보다 많은 경우, 검출된 당단백질의 글리코실화 수준이 음성 대조군의 글리코실화 수준보다 높음을 나타낸다. 검출된 당단백질의 양이 음성 대조군의 당단백질의 양 보다 많은 경우, 상기 개체는 뇌종양, 예를 들어 다형성 교모세포종에 걸리거나 걸릴 확률이 높은 것으로 진단될 수 있다. 뇌종양, 예를 들어 다형성 교모세포종으로 진단된 개체에 항암제, 예를 들어 뇌종양 치료제를 투여할 수 있다.

다른 양상은 렉틴, 및 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 뇌종양 진단용 조성물로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 LRP1, Plexin-B2, CD56, 피브로넥틴, 및 CD280로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합하는 것인 조성물을 제공한다.

상기 렉틴은 AAL, Con A, GS I 렉틴, MAA 렉틴, PSA, RCA, SBA, SNA 렉틴, WGA, DBA, UEA I, PHA-L, PHA-E, CPA　, LCA, GNA, LTL, AAA, LEL, GS II, DSA, VVA, LBA, HPA, PNA, JAC, 및 ABA로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 렉틴은 고체 지지체에 부착된 칩일 수 있다. 상기 고체 지지체는 예를 들어 상기 렉틴은 검출가능한 물질이 결합된 것일 수 있다.

상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것일 수 있다. 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 검출가능한 물질이 결합된 것일 수 있다.

다른 양상은 렉틴, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 검출가능한 물질을 포함하는 뇌종양 진단용 키트로서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 LRP1, Plexin-B2, CD56, 피브로넥틴, 및 CD280로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합하는 것인 키트를 제공한다.

상기 키트는 뇌종양 진단에 필요한 시료를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 고체 지지체, 항체 또는 항원 결합 단편의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 완충용액, 발색 효소, 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다.

일 양상에 따른 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 당단백질을 검출하는 방법, 이에 이용되는 조성물 또는 키트에 따르면, 뇌종양을 간편하게 진단할 수 있고, 뇌종양을 높은 정확도 및 특이도로 진단하는데 이용할 수 있다.

도 1은 렉틴 골드 칩 제작 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 렉틴-기반 골드 칩의 스탓에 결합된 T98G 및 Hs683 세포의 이미지를 정량하고, 이를 GS I 렉틴 스팟에 대한 세포의 결합도로 나타낸 그래프이다.
도 3은 1 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 또는 30 mM의 갈락토스의 존재에서 GS I 렉틴-기반 골드 칩의 스팟에 결합된 T98G 세포의 결합도를 나타내는 그래프이다.
도 4는 뇌 종양 세포에서 막 단백질을 초원심분리에 의해 분리하고, 분리된 단백질을 면역블로팅으로 확인한 이미지이다.
도 5는 T98G 및 Hs683 세포의 막 단백질들을 각각 GS I 렉틴 컬럼을 이용하여, 결합되어진 단백질들을 D-갈락토스로 용출시켜서 전기영동하여 수득한 겔의 이미지이다.
도 6은 차등발현된 당단백질의 GS I 렉틴으로 증폭시킨 T98G 및 Hs683 세포의 당단백질의 세포내 위치를 나타내는 벤 다이어그램이다.
도 7은 차등발현된 5종의 당단백질의 렉틴-기반 ELISA 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 세포의 전체 단백질에 대한 LRP1, Plexin-B2, 피브로넥틴, CD56, 및 CD280의 면역블로팅을 수행하여 수득한 이미지이다.

이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 뇌종양 환자의 단백질 중 차등 발현된 단백질의 확인

1. 뇌종양 세포주의 준비

한국 세포주 은행(Korean Cell Line Bank)으로부터 다형성교모세포종(glioblastoma multiform: GBM) 세포주 T98G와 저등급 신경교종(low grade glioma) 세포주 Hs683을 준비하였다. T98G와 Hs683 세포주를 5% CO₂ 인큐베이터에서 각각 DMEM(Gibco)와 RPMI(Gibco)에 10% 열 불활성화된 우태아혈청(Gibco)과 1%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신(Gibco)을 추가한 배지에서 계대배양하였다. GBM은 세계보건기구(WHO)에서 지정한 등급 4에 해당하는 가장 악성인 뇌종양의 일종으로 진단 후 평균 생존기간이 15 개월 밖에 되지 않는 악성 종양이다.

2. 렉틴-기반 골드 칩의 제작

알레우리아 아우렌티아 렉틴(Aleuria aurantia lectin: AAL), 콘카나발린 A(Concanavalin A: Con A), 그리포니아 심플리시폴리아 I(Griffonia simplicifolia I: GS I) 렉틴, 막키아 아무렌시스(Maackia amurensis: MAA) 렉틴, 피숨 사티붐 아글루티닌(Pisum sativum agglutinin: PSA), 리시누스 콤뮤니스 아글루티닌(Ricinus communis agglutinin: RCA), 대두 아글루티닌(Soybean agglutinin: SBA), 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra: SNA) 렉틴, 및 밀 배아 아글루티닌(Wheat Germ agglutinin: WGA)의 9종의 렉틴을 포함하는 Vector Laboratories(Burlingame, CA)을 이용하여 자기조립 단분자막(Self-assembled Mono layer)을 형성하였다. 9종 렉틴의 당 모이어티를 하기 표 1에 나타내었다.

렉틴	당 모이어티
AAL	푸코스 연결된(α-1,6) N-아세틸글루코스아민 푸코스 연결된(α-1,3) N-아세틸락토스아민
ConA	분지된, 말단 α-연결된 만노스, 및 α-D-글루코스
GS I	α-N-아세틸갈락토스아민, 말단 α-갈락토스
MAA	갈락토실(베타-1,4) N-아세틸글루코스아민
PSA	N-아세틸히토비오스-연결된 α-푸코스, α-연결된 만노스
RCA	말단 갈락토스 β1-4 N-아세틸-D-갈락토스아민
SBA	말단 α-, β-연결된 N-아세틸-D-갈락토스아민
SNA	α-N-아세틸글루코스아민(2-6) 갈락토스, α-N-아세틸글루코스아민(2-6) N-아세틸갈락토스아민
WGA	N-아세틸글루코스아민, N-아세틸뉴라민산

골드 칩(Gold-coated glass chip, Cr: 10Å±4Å, Au 300Å ± 3Å )은 3차 증류수와 에탄올로 씻고, 10 mM 디(11-운데카날) 디술피드 ((CHO-(CH₂)₁₀-S-)2)/에탄올 용액에 밤새 인큐베이션하여 칩의 표면을 알데히드 작용기로 기능기화시켰다. 그 후, 골드 칩을 다시 3차 증류수와 에탄올로 씻어주고, 질소 가스를 사용하여 건조시켰다. 상기에서 준비된 렉틴에 50 mM NaBH₃CN를 가하고, 준비된 골드 칩에 0.7 ㎕ 씩 스폿팅(spotting)하고 밤새 실온에서 인큐베이션하여 렉틴-기반 골드 칩을 준비하였다. 렉틴에 50 mM NaBH₃CN을 가함으로써 이민(immine) 생성물을 보다 안정한 형태의 이차 아민(secondary amine)으로 환원시켰다. 준비된 렉틴-기반 골드 칩을 HEPES 완충액(10 mM HEPES, 1 mM CaCl₂, 0.1%(w/v) NaN₃, pH 8.5)으로 씻어주었다. 씻은 렉틴-기반 골드 칩을 1%(w/v) BSA/둘베코 포스페이트 완충 염수(Dulbecco's phosphate buffered saline: DPBS)(칼슘 및 마그네슘 불포함)에 30분간 담그고, DPBS(칼슘 및 마그네슘 불포함)으로 씻어 블로킹하였다. 블로킹된 렉틴-기반 골드 칩은 사용할 때까지 얼음에 보관하였다. 렉틴 골드 칩 제작 과정의 모식도를 도 1에 나타내었다.

3. 손상되지 않은 세포 표면막 당단백질의 스크리닝

3.1. 렉틴-기반 골드 칩 분석법

2.에서 준비된 9종의 렉틴-기반 골드 칩을 사용하여 세포 표면막 당단백질의 패턴을 확인하였다.

구체적으로, 1.에서 준비된 T98G 및 Hs683 세포주에 각각 0.2% 트립신-EDTA 용액(Gibco)을 가하고, 4℃에서 200 x g에서 10분간 원심분리하여 세포들을 수집하였다. 수집된 세포 펠렛에 DPBS(칼슘 및 마그네슘 불포함)을 가하여 세포를 재현탁하고, 다시 4℃에서 200 x g에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거하였다. 이 과정을 세 번 반복하였다. 남아있는 세포 펠렛에 DPBS(칼슘 및 마그네슘 포함)를 가하여, 3.3 x 10⁵ 세포/㎖의 세포 현탁액을 준비하였다.

3 ㎖의 준비된 세포 현탁액을 2.에서 준비된 렉틴-기반 골드 칩에 각각 가하고, 30분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 그 후, 골드 칩에 6회 x 6 ㎖의 DPBS(칼슘 및 마그네슘 포함)을 가하여 씻어주었다. 그 후 세포가 결합된 렉틴- 기반 골드 칩을 위상차 현미경(phase contrast microscope)으로 확인하고, Image J 프로그램을 이용하여 계수하고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 악성 뇌종양 세포주 T98G는 저등급 신경교종 세포주 Hs683에 비해 GS I 렉틴에 현저하게 결합함을 확인하였다.

3.2. 렉틴의 특이도 확인

각각의 렉틴은 특정 당 모미어티와 특이적으로 결합한다. GS I 렉틴은 α-N-아세틸갈락토스아민 및 α-갈락토스에 특이적으로 결합하므로, 갈락토스의 농도를 증가시키면서 T98G 세포와 GS I 렉틴이 특이적으로 결합하는지 확인하였다.

1x 10⁶ 개의 T98G 세포와, 1 mM, 3 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 또는 30 mM의 갈락토스(Sigma)를 혼합하고, 3.1에 기재된 방법으로 GS I 렉틴-기반 골드 칩에 결합시켰다. 골드 칩에 결합된 세포의 수를 카운팅하고, 칩의 스팟에 대한 세포의 결합도를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 갈락토스의 농도가 높아질수록 GS I 렉틴에 결합된 T98G 세포의 수가 감소하여, T98G 세포가 GS I 렉틴에 특이적으로 결합함을 확인하였다.

3.4. 세포 표면막 단백체의 분리

1.에서 준비된 T98G와 Hs683 세포를 각각 15 cm 배양 접시(Nunc)에 접종하고, 세포가 배양 접시의 90% 정도까지 자라도록 배양하였다. 그 후, 배양된 세포에 0.2%(w/v) 트립신-EDTA 용액(Gibco)을 가하여 세포를 배양 접시에서 수집하였다. 수집된 세포를 약 4℃에서 200 x g로 10분간 원심분리하여 세포를 수득하였다. 세포 펠렛(약 10⁸세포)에 DPBS(칼슘 및 마그네슘 불포함)을 가하고, 약 4℃에서 200 x g로 10 분간 원심분리하여 세포 펠렛을 수득하였다. 이 과정을 세 번 반복했다. 수득된 세포는 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다.

수득된 세포에 저장성(hypotonic) 완충액 (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 mM MgCl₂, 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(Roche))을 가하여 세포를 재현탁시키고, 얼음에서 10분간 인큐베이션하였다. 그후, 유리 균질기 및 막자(Dounce)를 사용하여 세포를 용해시켰다. 세포 용해물에 수크로스 완충액 (280 mM 수크로스, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 450 mM NaCl, 및 10 mM MgCl₂)을 가하고, 혼합물을 실온에서 2000 x g로 30분간 초고속원심분리하였다. 수득된 용액의 펠렛 부분에는 핵 단백질들과 잔해들이 존재하고, 상층액에는 사이토졸과 세포 표면막 단백질들이 존재한다. 세포 표면막 단백질과 세포질 부분을 분리하기 위해, 상층액을 약 4℃에서 120000 x g로 2 시간 동안 초고속 원심분리하였다. 수득된 pellet에는 세포 표면막 단백질이 존재한다. 수득된 펠렛에 용해 완충액(50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1%(v/v) Triton-X 100, 0.5%(w/v) 데옥시콜레이트, 0.2%(w/v) SDS, 1 mM EDTA, 프로테아제 및 포스파타제 저해제 칵테일(Roche))을 가하고 재현탁시켰다. 재현탁된 혼합물 중 세포 표면막 단백질은 BCA(bicinchoninic acid) 분석 키트(Thermo Scientific)를 사용하여 정량하였다. 준비된 세포 표면막 단백질을 면역블로팅으로 확인하였다(도 4).

3.5. 질량 분석을 통한 차등 발현 단백질의 확인

4 ㎖의 아가로스가 결합된 GS I 렉틴(Vector Laboratories (Burlingame, CA))을 Econo-Pac 크로마토그래피 컬럼(BIO-RAD Laboratories)에 채우고, 컬럼을 5 ㎖의 결합 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 1 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, pH 7.4)으로 15분씩 3회 씻어주었다.

3.4에서 준비된 세포 표면막 단백질(약 3200 ㎍)을 결합 완충액으로 4배 희석하여, 준비된 컬럼에 가하고 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 용출액은 다시 컬럼에 적재하고 상온에서 30분간 다시 인큐베이션하였다. 그 후, 용출액은 버리고, 5 ㎖의 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl,pH 7.4)으로 상온에서 30분씩 3회 씻어주었다. 5 ㎖의 용출 완충액(500 mM 또는 600 mM의 HEPES 완충액 중 D-갈락토스, pH 8.5)를 컬럼에 가하였다. 컬럼을 상온에서 각각 1 시간 동안 인큐베이션한 후, 컬럼에서 용출된 당단백질 시료를 수득하여 렉틴에 결합된 세포 표면막 당단백질을 수득하였다. 이 과정을 3회 반복하였다.

수득된 당단백질 시료를 3K 필터(Amicon ultra-0.5 centrifugal filter devices)를 사용하여 동일한 부피로 농축하고, 25 mM 암모늄 비카르보네이트로 완충액을 교환하였다.

같은 부피의 당단백질 시료를 MES 완충액 상에서 4-15% 농도구배 겔(Invitrogen)에서 전기영동하고, 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 염료 용액으로 염색하였다(도 5). 단백질 밴드를 각각 18개의 분획으로 나누고, 각 겔 조각을 절단하였다. 절단된 겔 조각에 12.5 mM NH₄HCO₃ 및 25% 아세토니트릴 완충액을 가하여 겔에 염색된 염료를 제거하였다. 겔 조각에 50 mM NH₄HCO₃(sigma)를 가하여 3회 씻어주었다. 그 후, 12.5 mM NH₄HCO₃(sigma) 및 25% 아세토니트릴 완충액에서 5분(2회), 25 mM NH₄HCO₃(sigma) 및 50% 아세토니트릴 완충액에서 5분(2회), 및 100% 아세토니트릴 완충액에서 5분(3회) 인큐베이션하여 겔을 탈수시킨 후 겔을 건조시켰다. 건조된 겔에 10 mM DTT 및 25 mM NH₄HCO₃(sigma)를 가하고 약 56℃에서 약 1시간 동안 인큐베이션하여 단백질의 이황화결합을 절단시켰다. 10 mM DTT, 25 mM NH₄HCO₃(sigma) 용액을 제거하고, 55 mM IAA, 25 mM NH₄HCO₃ 용액을 가하고 약 25℃의 어두운 곳에서 약 1시간 동안 인큐베이션하여 단백질을 알킬화시켰다. 55 mM IAA, 25mM NH₄HCO₃ 용액을 제거한 후 앞의 과정과 동일한 방법으로 젤 조각들을 탈수시킨 후 건조시켰다. 건조된 젤 조각들에 12.5 ng/㎕ 트립신(promega) 및 25mM NH₄HCO₃ 용액을 가하고 얼음에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 트립신 용액을 제거하고 50 mM NH₄HCO₃ 용액을 가하고, 37℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 인큐베이션된 반응물에 포름산이 포함된 아세토니트릴 용액을 가하고, 회전 증발기를 사용하여 펩티드 혼합물을 건조시켰다.

준비된 펩티드 혼합물의 질량 분석을 위해, nanoLC 2D(Eksigent Tehnologies) 시스템을 연결한 Orbitrap XL™(Thermo Scientific) 질량 분석기를 사용하였다. 1 ㎕의 준비된 펩티드 혼합물을 6.5 ㎕의 0.4%(v/v) 아세트산(Sigma)에 용해시키고,

내부 직경이 75 ㎛인 1.5 cm C18 트랩 컬럼에 로딩하고, 내부 직경이 150 ㎛인 15 cm C18 어날 컬럼으로 단백질을 분리하였다. 사용된 액체 크로마토그래피 조건은 다음과 같다:

- 이동상 :

A : 100% HPLC 물, 0.2%(v/v) 포름산(WAKO)

B : 100%(v/v) 아세토니트릴(J.T. Baker), 0.2%(v/v) 포름산(WAKO)

- 유속 : 300 nL/분

- 구배 : B 8% → 40% (50분), 40% → 80% (5분), 80% → 80% (10분), 80% → 5% (5분), 5% → 80% (13분), 80% → 5% (7분), 5% → 5% (10 분).

질량 분석을 통해 얻어진 펩티드 스펙트럼을 Proteome discoverer 프로그램을 이용하여 동정하였다. 펩티드 스펙트럼 매치(Peptide Spectrum Match: PSM)을 이용하여 차등발현을 확인하고, UniprotKB을 이용하여 단백질의 세포내 위치와 글리코실화 여부를 확인하였다. 차등 발현되는 세포 표면막 당단백질 중 5개의 전이성 뇌종양 특이적인 세포 표면막 당단백질 후보군을 선정하였고, 5종의 세포 표면막 당단백질의 글리코실화 위치가 세포 표면막에 존재하는 것을 확인하였다. 동정된 당단백질의 세포내 위치를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타난 바와 같이, 동정된 553개의 당단백질 중 약 65%인 294개의 당단백질이 세포 표면막 당단백질이었다. 동정된 당단백질 중, 차등발현 수준이 높은 LRP1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1), Plexin-B2, CD56, 피브로넥틴, 및 CD280의 5개 당단백질을 선정하였다.

3.6. 렉틴 기반 ELISA를 이용한 차등발현 단백질의 글리코실화 수준의 검증

3.5에서 선정된 당단백질에 대해 글리코실화 수준을 확인하였다.

100 ng의 항-LRP1 항체(Sigma-Aldrich), 항-Plexin-B2 항체(Santa Cruz Biotechnology), 항-CD56 항체(Santa Cruz Biotechnology), 항-피브로넥틴 항체(Santa Cruz Biotechnology), 및 항-CD280 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 각각 96-웰 플레이트의 웰에 코팅하였다. 20 mM 소듐 페이오데이트, DPBS (칼슘 및 마그네슘 불포함) 완충액을 상기 플레이트에 가하고 상온에서 약 30분간 인큐베이션하여 항체 유래 글리칸을 산화시켰다. 그 후, 플레이트를 3% BSA, DPBS (칼슘 및 마그네슘 불포함) 완충액으로 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하여 블로킹하였다. PBS-T (DPBS (칼슘 및 마그네슘 불포함), 0.05% Tween 20)) 용액으로 플레이트를 씻고, 3 ㎍의 T98G와 Hs683의 세포 표면막 단백질을 각각의 웰에 가하고 상온에서 2시간 동안 결합시켰다. 그 후, 3 ㎍ 또는 5 ㎍의 비오틴화된 GS I, DPBS (칼슘 및 마그네슘 불포함) 완충액을 가하고, 상온에서 1시간 30분간 인큐베이션하고, HRP/스트렙타비딘(1:3000)을 가하고, 상온에서 1시간 30분간 인큐베이션하였다. 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 기질을 가하고, 반응 종결 용액을 가하여 반응을 종결시켰다. ELISA 리더기에서 450 nm에서의 흡광도를 측정하고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, LRP1, Plexin-B2, 피브로넥틴, CD56, 및 CD280은 모두 글리코실화 수준은 Hs683에 비해 T98G 세포주에서 높게 나타나는 것을 확인하였고, 이는 질량분석 결과와 일치하였다.

3.7. 면역블로팅을 이용한 차등발현 단백질의 검증

T98G와 Hs683 세포 전체의 단백질을 준비하고, 마우스 항-LRP1 항체(1:1000)(Sigma-Aldrich), 마우스 항-Plexin-B2 항체(1:200)(Santa Cruz Biotechnology), 마우스 항-CD56 항체(1:200)(Santa Cruz Biotechnology), 마우스 항-피브로넥틴 항체(Santa Cruz Biotechnology) 및 마우스 항-CD280 항체(Santa Cruz Biotechnology)를 사용하여 세포의 전체 단백질에 대해 면역블로팅을 수행하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에서 나타난 바와 같이, LRP1, Plexin-B2, 피브로넥틴, 및 CD56의 단백질 수준은 Hs683 세포주에 비해 T98G 세포주에서 더 높은 것을 확인하였다. 그러나, CD280은 Hs683에서 더 많이 발현되었다. 3.6의 결과를 고려하면, LRP1, Plexin-B2, 피브로넥틴, 및 CD56은 뇌종양에서 단백질 발현 및 글리코실화 수준이 특이적으로 증가하였고, CD280은 뇌종양에서 글리코실화 수준이 특이적으로 증가하였다. 따라서, LRP1, Plexin-B2, 피브로넥틴, CD56, 및 CD280의 당화 수준은 뇌종양을 진단하는 바이오마커로서 유용함을 확인하였다.

Claims

하기 단계를 포함하는 뇌종양 진단에 필요한 정보를 제공하기 위해 당단백질을 검출하는 방법으로서,
뇌종양을 앓고 있거나 뇌종양에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 유래된 생물학적 시료로부터 단백질을 수득하는 단계; 및
수득된 단백질과 그리포니아 심플리시폴리아 I(Griffonia simplicifolia I: GS I) 렉틴(lectin)을 접촉시켜 상기 렉틴과 결합하는 당단백질을 검출하는 단계를 포함하고,
상기 당단백질은 LRP1(Low density lipoprotein receptor-related protein 1), CD56, 피브로넥틴, 및 CD280로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 뇌종양은 교종(glioma), 수막종(meningioma), 뇌하수체선종(pituitary adenoma), 전이암(metastatic tumor), 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 2에 있어서, 상기 교종은 다형성 교모세포종(glioblastoma multiforme: GBM)인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 단백질은 막 단백질인 것인 방법.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 GS I 렉틴은 검출가능한 물질과 결합된 것인 방법.
청구항 6에 있어서, 상기 검출가능한 물질은 금속 침, 렉틴, 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase: HRP), 스트렙타비딘, 비오틴, 아비딘, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine), 자성 입자, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 항체 또는 항원 결합 단편과 인큐베이션하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 8에 있어서, 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 고체 지지체에 부착된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 검출하는 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소-결합 면역흡착법(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: ELISA), 마이크로어레이, 면역침강, 면역형광, 크로마토그래피, 질량분석, 또는 이들의 조합인 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 검출된 당단백질의 양이 정상 대조군의 시료로부터 유래된 당단백질의 양에 비해 증가된 것인 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 방법은 생물학적 시료로부터 수득된 단백질을 가수분해하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
청구항 12에 있어서, 트립신으로 가수분해하는 것인 방법.
GS I 렉틴, 및 항체 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 뇌종양 진단용 조성물로서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 LRP1, CD56, 피브로넥틴, 및 CD280로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합하는 것인 조성물.
삭제
GS I 렉틴, 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 및 검출가능한 물질을 포함하는 뇌종양 진단용 키트로서,
상기 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 LRP1, CD56, 피브로넥틴, 및 CD280로 이루어진 군으로부터 선택된 단백질에 특이적으로 결합하는 것인 키트.