CN116655807A - 一种特异性靶向蛋白拮抗多肽、其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种特异性靶向蛋白拮抗多肽、其制备方法和应用。本发明设计筛选具有与WT1蛋白具有高亲和力和高选择性的靶向拮抗多肽，用于拮抗WT1蛋白的生物学功能，抑制慢性髓系白血病K562细胞的生存活力。所述多肽含有WT1靶向拮抗多肽序列与穿膜肽序列，能够被慢性髓系白血病K562细胞有效内化，并与细胞核中WT1蛋白特异性结合，促使细胞死亡，在慢性髓系白血病小鼠模型中具有较好的抗肿瘤潜力。本发明多肽为WT1蛋白靶向药物的设计和开发提供候选药物分子，为慢性髓系白血病治疗提供可行的方法和技术。

Description

一种特异性靶向蛋白拮抗多肽、其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种特异性靶向蛋白拮抗多肽、其制备方法和应用。
背景技术
血液系统肿瘤是源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，危害人类生命安全和生活质量。现行白血病治疗方案多为联合化疗，治疗效果受困于细胞耐药和化疗药物缺乏靶向性带来的毒副作用等问题。因此，迫切需要针对血液系统肿瘤高表达靶点，开发特异性靶向药物。
在白血病发生发展过程中，转录因子通过调控造血细胞的增殖和分化发挥重要作用。其中，WT1基因(Wilms Tumor gene1)定位于11p13，所编码的转录调控蛋白可与各种生长因子等基因启动子结合并调节这些基因转录，在各类白血病如急性髓系白血病(acutemyelocytic leukemia，AML)、急性淋巴细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)、慢性髓系白血病(chronice myelogenous leukemia，CML)急变期中高度表达，与年龄、性别、FAB分型及染色体核型等无关，且在正常外周血白细胞中表达水平甚低。WT1也在一系列实体恶性肿瘤(包括肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌)中高表达，且在这些肿瘤中发挥促癌作用。
多肽分子相比于小分子有着更高的活性和选择性，相比于生物大分子有着更低的免疫原性和生产成本，是一类理想的药物候选分子。多肽药物分子一般由几个～几十个氨基酸组成，组分易于调整，利于快速筛选，合成工艺简单，与靶点的亲和力可调，跨越细胞膜和核膜的效率高。但目前现有技术中未筛选出与WT1蛋白具有高特异性和高亲和力的靶向拮抗多肽，并用于白血病的治疗，尤其是慢性髓系白血病。
慢性骨髓性白血病(CML)是一种典型的骨髓增生性新血症，病程进展为温和的慢性期、加速期到高度侵袭性的急变期。虽然慢性期的CML患者可以通过酪氨酸激酶抑制剂(TKIs)获得较好的治疗效果，但一些患者对TKIs没有反应，并发展到加速期，最后到急变期。急变期的CML患者高度难治，对一般化疗的反应率<30％，耐药性发展时间大大缩短。慢性期CML中WT1表达水平相对较低，但随着疾病发展到急变期WT1表达急剧增加，表明WT1的过度表达参与了CML的进展。因此，努力开发新颖有效的抑制剂来治疗WT1相关的晚期CML患者具有重要临床意义。
CML急变期K562细胞是野生型WT1基因高表达的细胞株之一，是研究WT1靶向拮抗多肽药物开发的理想模型。因此本发明以人源K562细胞及其慢性髓系白血病小鼠模型为研究对象，设计筛选出了具有细胞毒性和肿瘤治疗潜力的WT1特异性靶向拮抗多肽，为血液系统肿瘤靶向药物的研发提供可行性的方法和技术。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种特异性靶向蛋白拮抗多肽、其制备方法和应用。所述多肽含有WT1靶向拮抗多肽序列与穿膜肽序列，能够高效跨越细胞膜和核膜，与K562细胞核中WT1蛋白特异性结合，拮抗WT1蛋白的生物学功能，杀伤细胞，并在慢性髓系白血病小鼠模型中具有较好的抗肿瘤潜力。
在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：
术语“WT1”是指：肾母细胞瘤基因编码的转录因子，具有激活和抑制双重功能，可与各种生长因子等基因启动子结合并调节这些基因转录。
术语“FAB分型”是指：法、美、英分型系统，是一系列关于急性白血病的分型诊断标准，最早于1976年提出。
术语“WIP2W”是指：一条WT1特异性靶向拮抗多肽，其序列如SEQ ID NO:11所示。
术语“FITC-WIP2W”是指：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的一条WT1特异性靶向拮抗多肽，其序列如SEQ ID NO:22所示。
术语“穿膜肽的序列”是指：氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示的多肽序列，为YGRKKRRQRRR，具有穿膜和核定位能力。
术语“μM”是指：微摩尔每升(μmol/L),每升体系所含某物质的微摩尔量。
术语“CML”是指：人慢性髓系白血病。
术语“K562”是指：人慢性髓系白血病细胞，是由Lozzio从一名53岁的慢性髓细胞性白血病急变期的女性患者胸水中分离建立的。
术语“MDA-MB-231”是指：人乳腺癌细胞。
术语“HepG2”是指：人肝癌细胞。
术语“786-O”是指：人肾透明细胞腺癌细胞。
术语“RPMI 1640培养基”是指：洛斯维·帕克纪念研究所研发的一类细胞培养基，含有还原剂谷胱甘肽和高浓度的维生素，可用于悬浮和单层培养人类白血病细胞。
术语“DMEM培养基”是指：一类细胞培养基，高糖，含L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，不含酚红。
术语“Hoechst 33342”是指：一种DNA染料，Hoechst AG公司合成的第33342种化合物，主要用于活细胞细胞核标记。
术语“DAPI”是指：4',6-二脒基-2-苯基吲哚，一种能够与DNA强力结合的荧光染料，可以用于活细胞和固定细胞的细胞核染色。
术语“GAPDH”是指：甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)的英文缩写，糖酵解反应中的一个酶，被广泛用作标准化内参蛋白。
术语“IC50”是指：半数致死率浓度值。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种特异性靶向蛋白拮抗多肽，所述特异性靶向蛋白拮抗多肽包含靶向蛋白拮抗多肽和穿膜肽；其中，
所述靶向蛋白为癌症中高表达的WT1；和/或
所述特异性靶向蛋白拮抗多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽；
优选地，所述靶向蛋白拮抗多肽为无任何荧光分子标记的WT1靶向拮抗多肽。
根据本发明第一方面的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其中，
所述特异性靶向蛋白拮抗多肽与癌症细胞的WT1蛋白结合；和/或
所述穿膜肽和所述靶向蛋白拮抗多肽的摩尔比为1～1；
优选地，所述WT1靶向拮抗多肽由5～100个氨基酸组成，更优选为由5～50个氨基酸组成，进一步优选为由10～40个氨基酸组成。
根据本发明第一方面的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其中，
所述穿膜肽的序列为SEQ ID NO:23；和/或
所述WT1靶向拮抗多肽的序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11，更优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；最优选为SEQ ID NO:11。
根据本发明第一方面的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其中，所述WT1靶向拮抗多肽为探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽；
优选地，所述探针选自以下一种或多种：荧光探针、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，更优选为荧光探针或量子点；
优选地，所述纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗粒、纳米管、纳米线、石墨烯、二维纳米材料、荧光微球；和/或
优选地，所述生物素为生物素分子。
根据本发明第一方面的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其中，所述荧光探针选自以下一种或多种：FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluro 647，优选选自以下一种或多种：FITC、Cy5、Cy5.5，最优选为FITC。
根据本发明第一方面的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其中，
所述探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
更优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
最优选为SEQ ID NO:22。
本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)溶解多肽干粉于无机溶剂中，得到混合溶液；
(2)将步骤(1)混合溶液涡旋混匀后，除菌，得到所述特异性靶向蛋白拮抗多肽的溶液。
根据本发明第二方面的方法，其中，
所述步骤(1)中，所述无机溶剂选自以下一种或多种：无菌超纯水、磷酸盐缓冲液、生理盐水，优选为磷酸盐缓冲液，最优选为pH为7～8的磷酸盐缓冲液；和/或
所述步骤(2)中，所述特异性靶向蛋白拮抗多肽的溶液的浓度为0.1～200μM，优选为1～100μM，更优选为1～40μM。
本发明的第三方面提供了一种捕获、分离蛋白的方法，所述方法使用第一方面所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽来进行蛋白的捕获、分离；
优选地，所述方法包括以下步骤：
(A)提取细胞总蛋白，并配制免疫共沉淀试剂；
(B)修饰磁珠：清洗磁珠后与特异性靶向蛋白拮抗多肽混合，孵育、洗脱，得到特异性靶向蛋白拮抗多肽修饰的磁珠；
(C)捕获目标蛋白：加入蛋白样品和结合缓冲液，孵育、洗脱，获得蛋白-磁珠-多肽复合物；
(D)分离获得蛋白：加入蛋白上样缓冲液加热变性，去除磁珠，获得磁珠上结合的蛋白，用于免疫蛋白印迹；
优选地，所述步骤(A)中，所述免疫共沉淀试剂选自以下一种或多种：磷酸盐缓冲液、生理盐水、超纯水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、含吐温-20的磷酸盐缓冲液；更优选为磷酸盐缓冲液和/或含吐温-20的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述步骤(B)中，所述修饰磁珠的时间为0.5～5小时；更优选为1～3小时；和/或
优选地，所述步骤(C)中，所述捕获目标蛋白的时间为0.5～6小时；更优选为1～4小时。
本发明的第四方面提供了第一方面所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽在制备用于治疗血液系统肿瘤和/或实体肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述血液系统肿瘤为白血病，更优选为急性髓系白血病和/或慢性髓系白血病，最优选为慢性髓系白血病；和/或
优选地，所述实体肿瘤选自以下一种或多种：肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌。
根据本发明的一个具体的实施方案，本发明提供了一种特异性靶向WT1蛋白拮抗多肽的制备及其在治疗慢性髓系白血病中的应用。以人源K562细胞及其慢性髓系白血病小鼠模型为研究对象，设计筛选出了具有细胞毒性和肿瘤治疗潜力的WT1特异性靶向拮抗多肽，为血液系统肿瘤靶向药物的研发提供可行性的方法和技术。
本发明的第一方面提供了一种特异性靶向拮抗多肽，所述特异性靶向拮抗多肽由靶蛋白拮抗多肽序列与穿膜肽序列组成，其中，所述靶蛋白为癌症中高表达的WT1；和/或
优选地，所述多肽包含WT1靶向拮抗多肽序列与穿膜肽序列，并与癌症细胞的WT1蛋白结合；和/或
优选地，所述多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽。
根据本发明第一方面的特异性靶向拮抗多肽，其中，
所述WT1靶向拮抗多肽由5～100个氨基酸组成，进一步优选为5～50个氨基酸，更优选为10～40个氨基酸；
所述多肽选自以下靶向拮抗多肽系列中一种或多种：WIP1、WIP2、WIP3、WIP4、WIP5、WIP21、WIP22、WIP23、WIP2V、WIP2F、WIP2W，优选为WIP2W、WIP2、WIP2F；和；和/或
具体地，所述靶向拮抗多肽系列的氨基酸序列选自以下一种或多种：
WIP1：DQRPSWGGRRPDRRYGRKKRRQRRR；
WIP2：DQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
WIP3：DQRPSWGGRRPDRRGPKKKRKV；
WIP4：RRQSNDSTGYRRRNDYGRKKRRQRRR；
WIP5：RRDPYQCRFDRRRDDFSDSRRYGRKKRRQRRR；
WIP21：DQKKSWGKKKPDKKYGRKKRRQRRR；
WIP22：DQHHSWGHHHPDHHYGRKKRRQRRR；
WIP23：DQKKGGGKKKPDKKYGRKKRRQRRR；
WIP2V：VVGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
WIP2F：FFGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
WIP2W：WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
具体地，生物素或荧光探针标记的靶向拮抗多肽系列的氨基酸序列选自以下一种或多种：
Biotin/Probe-WIP1：Biotin/Probe-DQRPSWGGRRPDRRYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP2：Biotin/Probe-DQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP3：Biotin/Probe-DQRPSWGGRRPDRRGPKKKRKV；
Biotin/Probe-WIP4：Biotin/Probe-RRQSNDSTGYRRRNDYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP5：Biotin/Probe-RRDPYQCRFDRRRDDFSDSRRYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP21：Biotin/Probe-DQKKSWGKKKPDKKYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP22：Biotin/Probe-DQHHSWGHHHPDHHYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP23：Biotin/Probe-DQKKGGGKKKPDKKYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP2V：Biotin/Probe-VVGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP2F：Biotin/Probe-FFGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
Biotin/Probe-WIP2W：Biotin/Probe-WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
最优选为生物素或荧光探针标记的靶向拮抗多肽Biotin/Probe-WIP2W：Biotin/Probe-WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
优选地，所用多肽的浓度范围为0.1～200μM，优选为1～100μM，更优选为1～40μM。
根据本发明第一方面的WT1特异性靶向拮抗多肽，其中，当所述多肽为靶向拮抗多肽WIP2W时：
所述多肽为探针或纳米材料标记的多肽：其中，所述探针选自以下一种或多种：荧光分子、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；和/或所述纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗粒、纳米管、纳米线、石墨烯、二维纳米材料、荧光微球；
所述靶向拮抗多肽WIP2W的氨基酸序列为WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；和/或
生物素或荧光探针标记的靶向拮抗多肽WIP2W的氨基酸序列为Biotin/Probe-WIP2W：Biotin/Probe-WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR；
优选地，所述荧光探针选自以下一种或多种：FITC、Cy5、Cy5.5，进一步优选为FITC。
所述靶向拮抗多肽WIP2W和FITC标记的靶向拮抗多肽WIP2W均可按现有常规技术人工合成，也可外购商品化产品，例如由安徽省国平药业有限公司合成的靶向拮抗多肽WIP2W或FITC标记的靶向拮抗多肽WIP2W，纯度为98％。
根据本发明第一方面的WT1靶向拮抗多肽，其中，所述多肽为溶液形式。
本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的WT1靶向拮抗多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
WT1靶向拮抗多肽干粉溶于无机溶剂中，涡旋混匀后获得WT1靶向拮抗多肽溶液，冻存分装备用；
优选地，所述无机溶剂为无菌超纯水、磷酸盐缓冲液、生理盐水中的任意一种或两种；更优选为磷酸盐缓冲液。
优选地，将上述WT1靶向拮抗多肽溶液配制成1mM；
根据本发明第二方面的方法，其中，还进一步包括将涡旋混匀后所得WT1靶向拮抗多肽溶液除菌的步骤，进一步优选地，所述除菌为将涡旋混匀后所得WT1靶向拮抗多肽溶液用0.22μm滤膜过滤。
本发明的第三方面提供了将第一方面所述的WT1靶向拮抗多肽应用于免疫共沉淀的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取细胞总蛋白；
(2)配制免疫共沉淀所需试剂；
(3)修饰磁珠：链霉亲和素连接的磁珠(SA-磁珠)经清洗后，与生物素标记的WT1靶向拮抗多肽加至结合缓冲液中，室温孵育1-3小时。洗脱未结合的多肽后，得到WT1靶向拮抗多肽修饰的磁珠，设未加多肽修饰的磁珠为空白对照组；
(4)捕获目标蛋白：加入蛋白样品和结合缓冲液，室温孵育1-4小时，洗脱未结合的蛋白后，获得蛋白-磁珠-多肽复合物；
(5)分离获得蛋白：加入蛋白上样缓冲液加热变性，去除磁珠，获得磁珠上结合的蛋白，用于免疫蛋白印迹。
优选地，所述免疫共沉淀所需试剂为磷酸盐缓冲液、生理盐水、超纯水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、含吐温-20的磷酸盐缓冲液中的任意一种或两种；更优选为磷酸盐缓冲液和含吐温-20的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述磁珠修饰所需时间为0.5～5小时；更优选为1～3小时。
优选地，所述捕获目标蛋白所需时间为0.5～6小时；更优选为1～4小时。
本发明的第三方面提供了将第一方面所述的WT1靶向拮抗多肽应用于细胞毒性测定的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)取对数生长期的K562细胞，接种于96孔板中；
(2)加入用RPMI 1640或DMEM完全培养基稀释的不同浓度的WT1靶向拮抗多肽溶液，37℃孵育细胞一定时间；
(3)加入CCK-8试剂继续孵育，采用多功能酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。细胞的存活率＝(OD450 nm(实验组))-OD450 nm(空白孔))/(OD450 nm(对照组)-OD450 nm(空白孔))×100％。
均设置四到六个复孔；
优选地，所述WT1靶向拮抗多肽孵育细胞时间为1～72小时；更优选为2～24小时。
本发明的第三方面提供了将第一方面所述的WT1靶向拮抗多肽应用于慢性髓系白血病小鼠模型的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)收集K562细胞，获得含一定细胞密度的悬混液；
(2)每只小鼠接种107个K562细胞；
(3)当肿瘤体积生长到50～100mm3，将小鼠随机分成两组，分别每日皮下给予磷酸盐缓冲液和WT1靶向拮抗多肽治疗，连续给药治疗14天；
优选地，所述悬混液为磷酸盐缓冲液、生理盐水、基质胶、培养基中的任意一种或两种；更优选为基质胶和磷酸盐缓冲液。
优选地，调整上述K562细胞密度至105～108个细胞/100μL；
优选地，所述小鼠为白变种实验室老鼠(BALB/c)、T淋巴细胞缺陷型裸鼠(BALB/c-nu)、纯合自发突变裸鼠(BALB/c Nude)、重症联合免疫缺陷小鼠(SCID)与B、T免疫细胞缺失小鼠(NOD-SCID)等小鼠；更优选为T淋巴细胞缺陷型裸鼠(BALB/c-nu)、重症联合免疫缺陷小鼠(SCID)与B、T免疫细胞缺失小鼠(NOD-SCID)小鼠。
优选地，所述小鼠周龄为3-12周；更优选为4-7周。
优选地，所述肿瘤接种方式为皮下注射、尾静脉注射、腹腔注射等；更优选为皮下注射。
优选地，所述给药途径为皮下、皮内、腹腔、灌胃、尾静脉等；更优选为皮下和腹腔给药。
优选地，所用WT1靶向拮抗多肽剂量为1～400mg/kg，更优选为5～100mg/kg。
本发明的第一方面所述的癌症，所述癌症种类为白血病、肝癌、乳腺癌和肾癌等，优选地，所述癌症种类为白血病。更优选地，所述癌症为慢性髓系白血病。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的WT1靶向拮抗多肽或按照第二方面所述的方法制备的WT1靶向拮抗多肽溶液为血液系统肿瘤和实体瘤治疗提供思路；优选地，应用于治疗白血病。
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种WT1特异性靶向拮抗多肽在慢性髓系白血病中的应用。本发明设计筛选具有与WT1蛋白具有高亲和力和高选择性的靶向拮抗多肽，用于拮抗WT1蛋白的生物学功能，抑制慢性髓系白血病K562细胞的生存活力。所述多肽含有WT1靶向拮抗多肽序列与穿膜肽序列，能够被慢性髓系白血病K562细胞有效内化，并与细胞核中WT1蛋白特异性结合，促使细胞死亡，在慢性髓系白血病小鼠模型中具有较好的抗肿瘤潜力。本发明多肽为WT1蛋白靶向药物的设计和开发提供候选药物分子，为慢性髓系白血病治疗提供可行的方法和技术。
本发明的氨基酸序列如SEQ ID NO.1～23所示：
SEQ ID NO:1：DQRPSWGGRRPDRRYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:2：DQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:3：DQRPSWGGRRPDRRGPKKKRKV。
SEQ ID NO:4：RRQSNDSTGYRRRNDYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:5：RRDPYQCRFDRRRDDFSDSRRYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:6：DQKKSWGKKKPDKKYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:7：DQHHSWGHHHPDHHYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:8：DQKKGGGKKKPDKKYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:9：VVGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:10：FFGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:11：WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR。
SEQ ID NO:12：Biotin/Probe-DQRPSWGGRRPDRRYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.12以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:13：Biotin/Probe-DQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.13以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:14：Biotin/Probe-DQRPSWGGRRPDRRGPKKKRKV(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.14以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:15：Biotin/Probe-RRQSNDSTGYRRRNDYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.15以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:16：Biotin/Probe-RRDPYQCRFDRRRDDFSDSRRYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.16以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:17：Biotin/Probe-DQKKSWGKKKPDKKYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.17以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:18：Biotin/Probe-DQHHSWGHHHPDHHYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.18以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:19：Biotin/Probe-DQKKGGGKKKPDKKYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.19以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:20：Biotin/Probe-VVGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.20以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:21：Biotin/Probe-FFGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.21以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:22：Biotin/Probe-WWGGDQRRSWGRRRPDRRYGRKKRRQRRR(由于本申请所附序列表，其标准格式无法体现Biotin/Probe-，因此，SEQ ID NO.22以说明书此处记载的序列信息为准)。
SEQ ID NO:23：YGRKKRRQRRR。
本发明的特异性靶向蛋白拮抗多肽可以具有但不限于以下有益效果：
1、本发明所述人慢性髓系白血病K562细胞高表达野生型WT1蛋白(图1)，WT1靶向拮抗多肽与其具有较好的亲和力(图3)，且多肽可以有效跨越细胞膜屏障以及核膜屏障并定位于细胞核(图4)，发挥WT1蛋白靶向拮抗功能，为WT1蛋白靶向药物的设计和开发提供候选药物分子。
2、本发明所述靶向拮抗多肽WIP2W可以显著抑制K562细胞活力(图5)，在慢性髓系白血病小鼠模型中具有抗肿瘤潜力，为慢性髓系白血病治疗提供可行的方法和技术(图6)。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了试验例1中WT1在人慢性髓系白血病细胞(K562)中的表达与定位；图1A示出了免疫印迹法检测K562细胞中WT1的表达水平，抗体稀释比为1/1000；图1B示出了共聚焦显微镜观察WT1在K562细胞中的表达与定位，左列为肾母细胞瘤蛋白1(WT1)抗体探针所示的靶蛋白，中间列为用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色后的细胞核，右列为共定位图像。抗体稀释比为1/200，标尺为20μm。
图2示出了实施例1中WT1靶向拮抗多肽(以WIP2W为例)的纯化结果图；采用高效液相色谱确认多肽纯度为98％。
图3示出了试验例2中WT1靶向拮抗多肽与K562细胞中WT1蛋白的结合；图3A示出了利用免疫共沉淀方法检测生物素标记的WT1靶向拮抗多肽系列与细胞内WT1蛋白的结合能力；图3B示出了利用分步提取胞浆和细胞核蛋白试剂盒、免疫共沉淀方法检测生物素标记的靶向拮抗多肽WIP2W与细胞核与胞浆中WT1蛋白的结合能力。
图4示出了试验例3中靶向拮抗多肽在K562细胞中的摄取与定位；图4A示出了流式细胞术检测K562细胞对靶向拮抗多肽WIP2W的摄取情况；图4B示出了共聚焦显微镜观察FITC标记的靶向拮抗多肽WIP2W在K562细胞中的定位，左列为用赫斯特荧光染料33342(Hoechst 33342)染色后的细胞核，中间列为异硫氰酸荧光素(FITC)标记的靶向拮抗多肽，右列为共定位图像。标尺为20μm。
图5示出了试验例4中靶向拮抗多肽的细胞毒性。利用CCK-8的方法检测多肽对细胞活力的影响；图5A示出了不同浓度的靶向拮抗多肽系列(以WIP1、WIP2、WIP3、WIP4、WIP5为例)对人慢性髓系白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)的细胞毒性；图5B示出了10μM浓度的靶向拮抗多肽系列(以WIP2V、WIP2F、WIP2W为例)对K562的3、24、48小时细胞毒性；图5C示出了不同浓度的靶向拮抗多肽WIP2W对K562的24小时细胞毒性。
图6示出了试验例5中裸鼠体内评价靶向拮抗多肽WIP2W抑制肿瘤生长的作用，慢性髓系白血病小鼠模型经过磷酸盐缓冲液或靶向拮抗多肽WIP2W处理14天后皮下肿瘤的增殖曲线。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
除非特别指明，以下实施例中所用的人慢性髓系白血病K562细胞来源于中国医学科学院基础医学研究所-北京协和医学院基础学院。
除非特别指明，下述实施例中所使用的WT1靶向拮抗多肽均为发明人自行设计，委托安徽省国平药业有限公司代为合成，纯度为98％，所使用的WT1靶向拮抗多肽在实验前用溶剂配制成合适浓度的母液。
除非特别指明，以下实施例中使用的试剂和仪器相关信息如下：
所用磷酸盐缓冲液、RPMI 1640培养基以及胎牛血清购自美国Thermo FisherScientific公司。
细胞培养类平皿及孔板购自美国Corning公司。
8腔室盖玻片共聚焦皿(腔室尺寸9.3*8.7，底面为玻璃片，厚度0.170±0.005mm)购自Cellvi公司。
细胞培养用的完全培养基中所含的10％胎牛血清和1％青链霉素均是指体积分数百分比。
兔源的单克WT1抗体及其荧光标记抗体购自abcam公司。HRP标记的山羊抗兔IgG二抗、GAPDH内参抗体、细胞核染料Hoechst 33342、DAPI购自Cell Signaling Technology。CCK-8检测试剂盒购自日本的Dojindo公司。分步提取细胞浆和细胞核蛋白试剂盒(NE-PERNuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents kit，含CER I液、CER II液、NER液)购自美国Thermo Fisher Scientific公司。实验中所涉及的试剂均为分析纯试剂。
连续光谱多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司，型号为SpectraMaxi3。
流式细胞仪购自美国BD公司，型号为C6。
单光子激光共聚焦成像系统购自德国Zeiss光学集团公司，型号Zeiss710。
实施例1特异性靶向蛋白拮抗多肽的制备实验
特异性靶向蛋白拮抗多肽溶液制备方法具体包括以下步骤：
(1)制备特异性靶向蛋白拮抗多肽储液：用pH为7.4的磷酸盐缓冲液溶解1mg多肽干粉，涡旋1分钟混匀后获得浓度为1mM的储液，用0.22μm滤膜过滤，冻存分装备用；
(2)用培养基稀释WT1靶向拮抗多肽储液至工作浓度(1、2.5、5、10、20、40μM)，得到所述多肽溶液。
WT1靶向拮抗多肽干粉采用化学固相合成方法获得，其纯度由高效液相色谱确认。图2示出了实施例2中WT1靶向拮抗多肽(以SEQ ID NO:11，即WIP2W为例)的纯化结果图；如图2所示，经高效液相色谱确认多肽WIP2W的纯度为98％。
实施例2-22特异性靶向蛋白拮抗多肽的制备实验
实施例2-22的特异性靶向蛋白拮抗多肽的制备方法与实施例1相同，区别在于序列不同，具体序列如表1所示：
表1实施例2-22特异性靶向蛋白拮抗多肽的制备实验
试验例1：WT1在K562细胞中的表达与定位实验
利用免疫印迹法分析与免疫荧光检测人慢性髓系白血病细胞(K562)中WT1的表达水平与定位。免疫印迹法：取对数生长期的K562细胞，清洗后加入含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液，冰上裂解细胞，低温高速离心，吸取上清即为细胞总蛋白，加入蛋白上样缓冲液加热变性。将样品加至10％Bis-Tris凝胶中进行蛋白电泳，转至PVDF膜进行转膜，将膜置于5％脱脂奶粉溶液中并于4℃封闭过夜，将膜转至一抗(WT1抗体，1/1000稀释)于4℃孵育过夜，清洗，用二抗(1/2000稀释)室温孵育2小时后清洗，最后通过ECL化学发光检测WT1蛋白的表达。GAPDH作为内参蛋白。免疫荧光：取对数生长期的K562细胞，固定透化和封闭后，用荧光染料直标抗体(1/200稀释)于4℃孵育过夜，清洗，加入细胞核染料DAPI染色，清洗，用培养基分散细胞并加至共聚焦皿，静置后用单光子激光共聚焦显微镜(Carl Zeiss)进行成像。
图1示出了试验例1中WT1在人慢性髓系白血病细胞(K562)中的表达与定位；图1A示出了免疫印迹法检测K562细胞中WT1的表达水平，抗体稀释比为1/1000；图1B示出了共聚焦显微镜观察WT1在K562细胞中的表达与定位，抗体稀释比为1/200，标尺为20μm。
由图1A可知，WT1在K562细胞中高表达。由图1B可知，WT1在K562细胞中主要定位于细胞核。因此WT1靶向拮抗多肽的序列设计包含WT1靶向拮抗多肽序列和穿膜肽序列(YGRKKRRQRRR)，后者用来增强多肽细胞内化、细胞核定位能力。
试验例2：WT1靶向拮抗多肽与K562细胞中WT1蛋白的结合实验
利用免疫共沉淀(Pull down)实验研究WT1靶向拮抗多肽与WT1蛋白的亲和力。提取K562细胞总蛋白。配制免疫共沉淀所需试剂。修饰磁珠：链霉亲和素连接的磁珠(SA-磁珠)经清洗后，与生物素标记的WT1靶向拮抗多肽加至结合缓冲液中，室温孵育1-3小时。洗脱未结合的多肽后，得到WT1靶向拮抗多肽修饰的磁珠，设未加多肽修饰的磁珠为空白对照组。捕获目标蛋白：加入蛋白样品和结合缓冲液，室温孵育1-4小时，洗脱未结合的蛋白后，获得蛋白-磁珠-多肽复合物。分离获得蛋白：加入蛋白上样缓冲液加热变性，去除磁珠，获得磁珠上结合的蛋白，用于免疫蛋白印迹。图3样品依次是未加多肽修饰磁珠(空白对照)与WIP2、WIP4、WIP5、WIP21、WIP22、WIP23、WIP2F、WIP2W多肽修饰磁珠捕获的蛋白。
图3示出了试验例2中WT1靶向拮抗多肽与K562细胞中WT1蛋白的结合；图3A示出了利用免疫共沉淀方法检测生物素标记的WT1靶向拮抗多肽系列与细胞内WT1蛋白的结合能力；图3B示出了利用分步提取胞浆和细胞核蛋白试剂盒、免疫共沉淀方法检测生物素标记的靶向拮抗多肽WIP2W与细胞核与胞浆中WT1蛋白的结合能力。
如图3A所示，在K562细胞总蛋白中，WT1靶向拮抗多肽与WT1蛋白直接结合。其中WIP22多肽捕获的WT1蛋白明显少于其他靶向拮抗多肽。相比于WIP2多肽，WIP22的亲和力因将序列中的七个精氨酸替换成赖氨酸后明显下调，显示了多肽蛋白相互作用中的组分效应和可调控的多肽靶蛋白亲和力。另外，靶向拮抗多肽WIP2W与WT1蛋白具有高结合力，本发明实验结果多以该肽为例。
鉴于WT1主要表达于K562细胞核，分步提取了胞浆和细胞核蛋白，探究了靶向拮抗多肽WIP2W对细胞核中靶蛋白的亲和力。取对数生长期的K562细胞，加入含蛋白酶抑制剂的CER I液，冰上裂解细胞10分钟后加入CER II液并静置1分钟后低温高速离心，上清即为胞浆蛋白，作为阳性对照。于沉淀中加入NER液，冰上裂解10分钟，此过程反复4次后离心，上清即为细胞核蛋白，作为阳性对照。利用免疫共沉淀实验检测靶向拮抗多肽修饰后的磁珠对不同亚定位的WT1蛋白的捕获情况。
如图3B所示，在K562细胞中，靶向拮抗多肽WIP2W能够有效结合细胞核中WT1蛋白，反映了靶向拮抗多肽特异性结合靶蛋白的能力。
试验例3：WT1靶向拮抗多肽在K562细胞中的摄取与定位实验
利用流式细胞术检测K562细胞对靶向拮抗多肽WIP2W的摄取能力。用RPMI 1640完全培养基稀释FITC-WIP2W多肽溶液，37℃孵育细胞2～6小时，本试验例孵育时间为2小时，清洗后重悬细胞，利用流式细胞术检测平均荧光强度。
图4示出了试验例3中靶向拮抗多肽在K562细胞中的摄取与定位；图4A示出了流式细胞术检测K562细胞对靶向拮抗多肽WIP2W的摄取情况；图4B示出了共聚焦显微镜观察FITC标记的靶向拮抗多肽WIP2W在K562细胞中的定位，标尺为20μm。
如图4A所示，与磷酸盐缓冲液组相比，靶向拮抗多肽WIP2W处理后的细胞平均荧光强度上升，反映了靶向拮抗多肽WIP2W能够有效结合K562细胞。
为进一步确认靶向拮抗多肽WIP2W的入胞和靶向能力，通过共聚焦显微镜观测靶向拮抗多肽在细胞中的分布情况。如图4B所示，靶向拮抗多肽WIP2W可以有效跨越细胞膜屏障以及核膜屏障并定位于细胞核，发挥WT1靶向拮抗功能。
试验例4：WT1靶向拮抗多肽的K562细胞毒性实验
利用CCK-8检测试剂盒检测多肽的细胞毒性。取对数生长期的人慢性髓系白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(Hep G2)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)，接种于96孔板中，加入用RPMI 1640或DMEM完全培养基稀释的不同浓度的靶向拮抗多肽溶液，37℃孵育细胞一定时间，加入CCK-8试剂继续孵育，采用多功能酶标仪测定在OD450 nm波长处的吸光值并计算细胞存活率。细胞的存活率＝(OD450 nm(实验组))-OD450nm(空白孔))/(OD450 nm(对照组)-OD450 nm(空白孔))×100％。均设置四到六个复孔。
图5示出了试验例4中靶向拮抗多肽的细胞毒性。利用CCK-8的方法检测多肽对细胞活力的影响；图5A示出了不同浓度的靶向拮抗多肽系列(以WIP1、WIP2、WIP3、WIP4、WIP5为例)对人慢性髓系白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)、人肾透明细胞腺癌细胞(786-O)的细胞毒性；图5B示出了10μM浓度的靶向拮抗多肽系列(以WIP2V、WIP2F、WIP2W为例)对K562的3、24、48小时细胞毒性；图5C示出了不同浓度的靶向拮抗多肽WIP2W对K562的24小时细胞毒性。
如图5A所示，不同靶向拮抗多肽对K562、Hep G2、MDA-MB-231、786-O细胞活力的影响程度不同。对于靶向拮抗多肽WIP2，白血病细胞模型对其敏感性高于实体瘤细胞模型(肝癌、乳腺癌、肾癌)的。对多肽WIP2进行序列改造后获得多肽WIP2V、WIP2F、WIP2W。如图5B所示，采用10μM浓度的WIP2W处理K562 24小时后的细胞毒性较为显著，多肽能显著抑制细胞生长。如图5C所示，靶向拮抗多肽WIP2W对人慢性髓系白血病细胞的半数致死率浓度值(IC50)为9.6±0.6μM。
试验例5：WT1靶向拮抗多肽的慢性髓系白血病小鼠模型治疗实验
构建人慢性髓系白血病的小鼠模型，进一步验证靶向拮抗多肽WIP2W的抗肿瘤效应。收集K562细胞，用基质胶与磷酸盐缓冲液重悬。在雌性BALB/c-nu小鼠皮下接种107个K562细胞/每只，当肿瘤体积生长到50～100mm3，随机分成两组，分别每日皮下给予磷酸盐缓冲液和靶向拮抗多肽WIP2W治疗。连续给药治疗14天，每两天用游标卡尺测量皮下肿瘤的长度(L)和宽度(D)(瘤体积＝1/2*L*D2)，绘制皮下移植瘤的生长曲线。
图6示出了试验例5中裸鼠体内评价靶向拮抗多肽WIP2W抑制肿瘤生长的作用，慢性髓系白血病小鼠模型经过磷酸盐缓冲液或靶向拮抗多肽WIP2W处理14天后皮下肿瘤的增殖曲线。
如图6所示，与磷酸盐缓冲液组相比，靶向拮抗多肽WIP2W治疗后的慢性髓系白血病小鼠模型皮下肿瘤体积减小，表明靶向拮抗多肽WIP2W具有抗肿瘤活性的潜力。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (10)

1.一种特异性靶向蛋白拮抗多肽，其特征在于，所述特异性靶向蛋白拮抗多肽包含靶向蛋白拮抗多肽和穿膜肽；其中，
所述靶向蛋白为癌症中高表达的WT1；和/或
所述特异性靶向蛋白拮抗多肽选自以下一种或多种：以极性氨基酸为主的多肽、以疏水氨基酸为主的多肽、兼有极性氨基酸和疏水性氨基酸的多肽；
优选地，所述靶向蛋白拮抗多肽为无任何荧光分子标记的WT1靶向拮抗多肽。
2.根据权利要求1所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其特征在于：
所述特异性靶向蛋白拮抗多肽与癌症细胞的WT1蛋白结合；和/或
所述穿膜肽和所述靶向蛋白拮抗多肽的摩尔比为1～1；
优选地，所述WT1靶向拮抗多肽由5～100个氨基酸组成，更优选为由5～50个氨基酸组成，进一步优选为由10～40个氨基酸组成。
3.根据权利要求1或2所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其特征在于：
所述穿膜肽的序列为SEQ ID NO:23；和/或
所述WT1靶向拮抗多肽的序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11，更优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11；最优选为SEQ ID NO:11。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其特征在于，所述WT1靶向拮抗多肽为探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽；
优选地，所述探针选自以下一种或多种：荧光探针、量子点、放射性元素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶，更优选为荧光探针或量子点；
优选地，所述纳米材料选自以下一种或多种：纳米颗粒、纳米管、纳米线、石墨烯、二维纳米材料、荧光微球；和/或
优选地，所述生物素为生物素分子。
5.根据权利要求4所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其特征在于，所述荧光探针选自以下一种或多种：FITC、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、Alexa Fluro647，优选选自以下一种或多种：FITC、Cy5、Cy5.5，最优选为FITC。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽，其特征在于：
所述探针、纳米材料或生物素标记的WT1靶向拮抗多肽序列选自以下一种或多种：SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
更优选选自以下一种或多种：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22；
最优选为SEQ ID NO:22。
7.制备权利要求1至6中任一项所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)溶解多肽干粉于无机溶剂中，得到混合溶液；
(2)将步骤(1)混合溶液涡旋混匀后，除菌，得到所述特异性靶向蛋白拮抗多肽的溶液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述无机溶剂选自以下一种或多种：无菌超纯水、磷酸盐缓冲液、生理盐水，优选为磷酸盐缓冲液，最优选为pH为7～8的磷酸盐缓冲液；和/或
所述步骤(2)中，所述特异性靶向蛋白拮抗多肽的溶液的浓度为0.1～200μM，优选为1～100μM，更优选为1～40μM。
9.一种捕获、分离蛋白的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求1至6中任一项所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽来进行蛋白的捕获、分离；
优选地，所述方法包括以下步骤：
(A)提取细胞总蛋白，并配制免疫共沉淀试剂；
(B)修饰磁珠：清洗磁珠后与特异性靶向蛋白拮抗多肽混合，孵育、洗脱，得到特异性靶向蛋白拮抗多肽修饰的磁珠；
(C)捕获目标蛋白：加入蛋白样品和结合缓冲液，孵育、洗脱，获得蛋白-磁珠-多肽复合物；
(D)分离获得蛋白：加入蛋白上样缓冲液加热变性，去除磁珠，获得磁珠上结合的蛋白，用于免疫蛋白印迹；
优选地，所述步骤(A)中，所述免疫共沉淀试剂选自以下一种或多种：磷酸盐缓冲液、生理盐水、超纯水、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液、含吐温-20的三羟甲基氨基甲烷缓冲液、含吐温-20的磷酸盐缓冲液；更优选为磷酸盐缓冲液和/或含吐温-20的磷酸盐缓冲液；
优选地，所述步骤(B)中，所述修饰磁珠的时间为0.5～5小时；更优选为1～3小时；和/或
优选地，所述步骤(C)中，所述捕获目标蛋白的时间为0.5～6小时；更优选为1～4小时。
10.权利要求1至6中任一项所述的特异性靶向蛋白拮抗多肽在制备用于治疗血液系统肿瘤和/或实体肿瘤的药物中的应用；
优选地，所述血液系统肿瘤为白血病，更优选为急性髓系白血病和/或慢性髓系白血病，最优选为慢性髓系白血病；和/或
优选地，所述实体肿瘤选自以下一种或多种：肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌。
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