CN114259496B - G699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了G699‑0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。属于生物医药技术领域。所述的G699‑0288的结构式如式(Ⅰ)所示，所述的G699‑0288的有效浓度为100～200nM。本发明首次发现小分子化合物G699‑0288能够抑制食管癌的侵袭转移，具体通过靶向MEST抑制食管癌的侵袭转移。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，特别涉及G699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。
背景技术
食道癌是世界上最致命的癌症之一，其发病率和死亡率均位居中国前十，其中90％的死亡率是由肿瘤转移引起。肿瘤转移步骤复杂，难以研究，特别是关于食管鳞状细胞癌(ESCC)中转移的相关基因，几乎没有信息和功能验证。因此，对调节癌症转移的关键驱动因素和信号通路进行全面调查，将为癌症治疗提供新的线索。
手术、放疗、化疗和分子靶向药物是治疗食管癌的几大主要手段。其中手术和放疗为局部治疗，化疗和分子靶向药物治疗为全身治疗。然而临床常用的抗癌药物往往具有一定的毒副作用，且化疗过程中出现的耐受性导致了病人术后复发和较差的预后，治疗难度增加。小分子药物能够特异性地阻断肿瘤生长、增殖过程中所必需的信号传导通路，从而达到治疗的目的。小分子抑制剂具有如下优点：(1)口服生物利用度高；(2)生理屏障的渗透性好，可穿过细胞膜，作用于胞内靶点；(3)成本较低。因此发展小分子化合物作为癌症治疗的药物，在药效，价格上有很大的优势。
G699-0288是一种小分子化合物，目前尚未见有G699-0288在抑制癌细胞，尤其是抑制癌细胞侵袭转移中的应用。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供G699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。
本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现：
G699-0288在制备治疗和/或预防食管癌药物中的应用。
所述的G699-0288的结构式如式(Ⅰ)所示：
所述的G699-0288的有效浓度优选为100～200nM。
所述的治疗和/或预防食管癌药物为能够抑制食管癌细胞侵袭和/或转移的药物。
所述的食管癌优选包括但不限于食管鳞癌。
G699-0288通过靶向MEST基因抑制食管癌的侵袭转移。
一种用于治疗和/或预防食管癌的药物，包括G699-0288。
所述的用于治疗和/或预防食管癌的药物还包含药学上可接受的辅料。
所述的药学上可接受的辅料优选为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂和润滑剂中的至少一种。
所述的用于治疗和/或预防食管癌的药物的给药方式包括但不限于口服给药。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明首次发现小分子化合物G699-0288能够抑制食管癌的侵袭转移，具体通过靶向MEST抑制食管癌的侵袭转移。
附图说明
图1为G699-0288的结构式图。
图2为MEST基因对人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC和人食管鳞癌细胞KYSE410的侵袭能力结果图。
图3为MEST基因对人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC肺转移能力结果图。
图4为G699-0288与MEST基因表面等离子体共振分析结果图。
图5为不同浓度的G699-0288对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响结果图。
图6为G699-0288对食管鳞癌细胞肺转移能力的荧光检测结果图。
图7为G699-0288对小鼠肝肺肾功能的免疫组化结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
G699-0288由上海陶素生化科技有限公司合成，结构式如图1所示；人食管鳞癌细胞KYSE150、人食管鳞癌细胞KYSE410购于德国微生物及细胞培养物有限公司；LB培养基购自于生工生物工程(上海)股份有限公司、0.25％的胰酶购自于美国Gibco。实验雌性小鼠(NOD-SCID)购于江苏集萃药康生物科技有限公司。
人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC已记载在Wen Wen Xu et al.DirectTargeting of CREB1 with Imperatorin Inhibits TGFβ2-ERK Signaling to SuppressEsophageal Cancer Metastasis,Advanced Science,2020.DOI：10.1002/advs.202000925中。
KYSE150-LUC-LM5细胞构建方法：0.25％的胰酶将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC消化成单细胞，将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC重悬于100μL PBS缓冲液中，尾静脉注射到小鼠体内；饲养5至6周后，腹腔注射D-Luciferin(购自GOLDBIO公司)，进行活体荧光拍照；对发生肺转移的小鼠解剖，取出有KYSE150-LUC细胞转移的肺部；对肺部切碎至肉糜状，培养基重悬；静置一周后，PSB缓冲液清洗两次，加入Blasticidin(5μg/mL，购于上海碧云天生物技术有限公司)，筛选一周至无细胞死亡，此细胞为KYSE150-LUC-LM1。之后0.25％的胰酶将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC-LM1消化成单细胞，将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC-LM1重悬于100μLPBS缓冲液中，尾静脉注射到小鼠体内；饲养5至6周后，腹腔注射D-Luciferin(购自GOLDBIO公司)，进行活体荧光拍照；对发生肺转移的小鼠解剖，取出有KYSE150-LUC-LM1细胞转移的肺部；对肺部进行切碎至肉糜状，培养基重悬；静置一周后，PSB缓冲液清洗两次，加入Blasticidin(5μg/mL，购于上海碧云天生物技术有限公司)，筛选一周至无细胞死亡，此细胞为KYSE150-LUC-LM2。如此循环五次，即得KYSE150-LUC-LM5细胞。
KYSE410-I6细胞已记载在Hui-Fang Hu,et al.Identification of miR-515-3pand its targets,vimentin and MMP3,as a key regulatory mechanism in esophagealcancer metastasis:functional and clinical significance,Signal Transductionand Targeted Therapy,2020,01:206-218.中。
MEST基因稳定过表达的人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC(即KYSE150-LUC-MEST细胞)和MEST基因稳定过表达的人食管鳞癌细胞KYSE410(即KYSE410-MEST细胞)构建方法：
MEST基因构建在pTSB-CMV-MCS-SBP-3Flag-copGFP-F2A-PuroR表达载体上，得到MEST真核表达质粒(委托上海权阳生物科技有限公司构建)。构建好的质粒转化入293T细胞中，将生长状态良好的293T细胞经消化后铺于6孔板。待细胞长至50％-60％时进行MEST真核表达质粒转染。之后24小时，48小时后对细胞进行换液，收集上清。上清进行离心，并用0.45μM的滤膜进行过滤。上清分别加入KYSE150-LUC细胞和人食管癌KYSE410细胞中，感染48小时后细胞从六孔板转移至小瓶内，贴壁后加入工作浓度为1μg/mL的嘌呤霉素(购于Sigma-Aldrich公司)进行筛选，1-2周后，细胞不再发生死亡时停止加药，即得MEST基因稳定过表达的人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC(即KYSE150-LUC-MEST细胞)和MEST基因稳定过表达的人食管鳞癌细胞KYSE410(即KYSE410-MEST细胞)，经Western blot鉴定该细胞能够过表达MEST。
实施例1：MEST基因能够提高人食管鳞癌细胞的转移侵袭能力。
1.对食管鳞癌细胞进行MEST稳定过表达，然后通过Invasion实验以及小鼠体内实验检测细胞侵袭能力。
(1)Invasion实验
1)小室处理：干净的侵袭小室加入100μL 5％基质胶，置于37℃培养箱30分钟。
2)铺细胞：分别将MEST基因(GenBank:D78611.1)稳定过表达的人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC(即KYSE150-LUC-MEST细胞)和MEST基因稳定过表达的人食管鳞癌细胞KYSE410(即KYSE410-MEST细胞)用0.25％的胰蛋白酶消化成悬浮的单细胞，计数后分别按照每个小室50万KYSE150-LUC-MEST细胞和20万KYSE410-MEST细胞加入小室上层，下层加入500μL完全培养基，在37℃、5％CO2条件下培养24h。同时以人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC、人食管鳞癌细胞KYSE410作为对照进行上述实验。
3)结晶紫染色：拿出小室，PBS缓冲液(pH7.4，购于Sigma-Aldrich公司；下同)洗两次，加500μL甲醇于下室，固定10min，吸去甲醇，加入0.2％结晶紫染色10min，吸掉结晶紫后清水洗去残余结晶紫，晾干后拍照。
(2)体内实验
选取12只6周龄、雌性小鼠(NOD-SCID)，对照组6只和实验组6只，构建肿瘤转移模型。
(1)0.25％的胰酶分别将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC和KYSE150-LUC-MEST细胞消化成单细胞。分别将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC和KYSE150-LUC-MEST食管鳞癌细胞重悬于100μL PBS缓冲液中。
(2)在动物进行尾静脉实验前对小鼠进行麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定小鼠处于麻醉状态；
(3)用25G针头的微注射器重悬细胞对小鼠进行尾静脉注射，一共12只。
饲养5至6周后，腹腔注射D-Luciferin(购自GOLDBIO公司)，进行活体荧光拍照，观察癌细胞肺转移情况。
结果如图2和3所示，从图2的体外实验结果可知，MEST基因能够提高人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC和人食管鳞癌细胞KYSE410细胞的抗侵袭能力。从图3的体内实验结果可知，MEST基因可以促进小鼠中人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC肺转移。
2.表面等离子体共振分析MEST与化合物G699-0288的结合。
(1)MEST蛋白表达纯化
MEST基因构建在pET-32a原核表达载体，且带His标签，得到MEST原核表达质粒(委托上海权阳生物科技有限公司完成)。构建好的质粒转化入BL21感受态细胞中，涂板后挑取表达MEST的菌体于10mL LB培养基中，37℃，250rpm，过夜，得到菌液；转接1％上述菌液于1LLB培养基中，37℃，250rpm，摇3小时，当OD值为0.6-0.8时，加入IPTG(工作浓度为0.5mM)，诱导表达4小时；离心收集1L表达MEST的菌体，100mL缓冲液进行重悬，冰浴超声(300W，超声10秒，间隔10秒，30次)，离心后分别收集上清，并上样于平衡好的NTA纯化柱；上样完成后，使用缓冲液对柱子进行洗杂；10mM，20mM，50mM，200mM，500mM的咪唑缓冲液对柱子进行洗脱，收集洗脱液；Western Blot对各组洗脱液进行鉴定，最终将含有目的蛋白的组分混合一起进行超滤浓缩。蛋白液-80℃保存备用。
(2)表面等离子体共振(SPR)实验
选择新的CM7芯片，待芯片锁定后，更换0.4％(v/v)P20的PBS缓冲液(pH 7.4，购于Sigma-Aldrich公司)，对芯片表面进行平衡；将MEST稀释于不同pH(pH分别为4，4.5，5，5.5)、3M的醋酸钠缓冲液(购于Sigma Aldrich)中，流经空白的芯片表面，测试静电吸附的效果；选择合适的pH的环境对芯片进行偶联，手动模式对偶联量以及时间进行尝试，以达到一个好的效果；电泳缓冲液对G699-0288进行多浓度的稀释(稀释后G699-0288的浓度分别为3.125nM、6.25nM、12.5nM、25nM、50nM、100nM)，但要确保与电泳缓冲液中DMSO含量一致；手动上样，测试不同浓度的G699-0288相应值；根据响应值选择G699-0288的合适浓度进行亲和力测定；最后利用Biacore软件进行分析，最终得到G699-0288与MEST的解离常数。
图4的表面等离子体共振结果显示，G699-0288可以与MEST蛋白结合。
实施例2：G699-0288功能验证
(1)Invasion实验
用不同浓度的G699-0288处理食管鳞癌细胞，然后进行食管鳞癌细胞侵袭能力的检测，研究不同浓度的G699-0288对食管鳞癌细胞侵袭能力的影响。
(1)小室处理：干净的侵袭小室加入100μL 5％基质胶，置于37℃培养箱30分钟。
(2)铺细胞：将具有高侵袭性的人食管鳞癌细胞KYSE150-LUC-LM5和KYSE410-I6细胞用0.25％的胰蛋白酶消化成悬浮的单细胞，计数后按照每个小室50万KYSE150-LUC-LM5细胞以及20万KYSE 410-I6细胞加入小室上层，并加入不同浓度的G699-0288(终浓度分别为0，100nM，200nM)；下层加入500μL完全培养基，在37℃、5％CO2条件下培养24h。
(3)结晶紫染色：拿出小室，PBS缓冲液洗两次，加500μL甲醇于下室，固定10min，吸去甲醇，加入0.2％结晶紫染色10min，吸掉结晶紫后清水洗去残余结晶紫，晾干后拍照。
由图5的体外试验结果可知，食管鳞癌细胞的侵袭能力随着G699-0288浓度的增加而减弱。
(2)体内实验
选取12只6周龄、雌性小鼠(NOD-SCID)对照组6只和实验组6只，构建肿瘤转移模型。
(1)0.25％的胰酶将人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC-LM5细胞消化成单细胞；将106个人食管鳞癌荧光素酶标记细胞KYSE150-LUC-LM5食管鳞癌细胞重悬于100μLPBS缓冲液中。
(2)在实验之前对小鼠进行麻醉，通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定小鼠处于麻醉状态；
(3)用25G针头的微注射器重悬细胞对小鼠进行尾静脉注射，一共12只。
(4)G699-0288处理：尾静脉注射食管鳞癌细胞KYSE150-LUC-LM5一周后，用灌胃的方式对小鼠进行给药。G699-0288溶解于PBS缓冲液中，对每组小鼠进行给药处理，药的浓度分别为0mg/kg(即对照组)，5mg/kg(即实验组)，各6只，一周一次。5至6周后，腹腔注射D-Luciferin(购自GOLDBIO)，进行活体荧光拍照，观察癌细胞转移情况。
结果如图6和7所示，从图6的体内实验结果可知，G699-0288处理后的小鼠肺部的生物荧光减少。生物荧光由食管鳞癌KYSE150-LUC-LM5细胞中的luciferase与体液中的D-luciferin发生酶促反应，荧光的强度反映了KYSE150-LUC-LM5细胞的密度。因此，G699-0288处理组(即实验组)中，食管癌细胞肺转移的数量显著比对照组少。
将G699-0288处理后(5mg/kg)的小鼠取出肝肺肾进行免疫组化，结果显示(如图7)G699-0288对小鼠肝肺肾功能无影响。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.G699-0288在制备治疗和/或预防食管鳞癌药物中的应用，其特征在于，所述的G699-0288的结构式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的G699-0288的有效浓度为100～200nM。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗和/或预防食管鳞癌药物为抑制食管鳞癌细胞侵袭和/或转移的药物。
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