WO2005118803A9

WO2005118803A9 - 核酸抽出用容器、固体マトリックスの洗浄方法および洗浄機構、ならびに核酸精製方法

Info

Publication number: WO2005118803A9
Application number: PCT/JP2005/010078
Authority: WO
Inventors: Tatsuo Kamata; Shinichi Ohta; Kouji Egawa
Original assignee: Arkray Inc; Tatsuo Kamata; Shinichi Ohta; Kouji Egawa
Priority date: 2004-06-02
Filing date: 2005-06-01
Publication date: 2007-03-15
Also published as: EP1767623A1; WO2005118803A1; EP1767623A4; JPWO2005118803A1; US20080014610A1

Abstract

　本発明は、試料から目的核酸を抽出し、かつ抽出した核酸を付着させるための核酸抽出要素(20)と、核酸抽出要素(20)とは別体として形成され、かつ核酸抽出要素(20)を収容しておくための収容槽(27)を有する容器本体と、を備えた核酸抽出用容器(２)に関する。核酸抽出要素(20)は、たとえば目的核酸を担持させるための固体マトリックス(23)と、この固体マトリックス(23)を保持するための保持部材(20)と、を有するものとして構成される。好ましくは、固体マトリックス(23)は、保持部材(20)の垂直軸に対して傾斜した状態で保持させられる。

Description

核酸抽出用容器、固体マトリックスの洗浄方法および洗浄機構、ならびに核酸精製方法

技術分野

[0001] 本発明は、試料から目的核酸を精製するための技術に関する。

背景技術

[0002] 核酸の分析は、医療分野にお!ヽて、感染症や遺伝子疾患を遺伝子レベルで診断するために重要な役割を果たしているが、現在においては、医療分野に限らず、農業あるいは食品分野などの様々な分野において応用されている。一般に、核酸の分析は、試料からの核酸の精製、精製された核酸の増幅、および増幅された核酸の検出といったプロセスを経て行われている。各プロセスは、人的コスト、再現性、分析効率を考慮した場合、機械により自動で行えるようにするのが好ましぐ理想的には、全てのプロセスを機械により自動で行えるようにするのが好ましい（たとえば特許文献 1 , 2参照)。

[0003] 核酸の精製の自動機械化を目指したものとして、核酸結合性担体を使用する方法がある。その一例として、核酸結合性シリカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法力 Sある（たとえば特許文献 3参照)。この方法は、核酸結合性シリカ粒子および試料中の核酸を遊離する能力をもつカオトロピックイオンを試料と混合して試料中の核酸を核酸結合性シリカ粒子に結合させてから固相と液相を分離した後に、核酸結合性シリカ粒子に結合した核酸を溶離するというものである。し力しながら、固相と液相を分離するためには、遠心分離またはフィルタなどを使用した濾過などの操作を行う必要力 Sあり、機械化を実現した際の操作および装置構成が複雑となる。

[0004] 核酸結合性担体を使用する別の方法としては、磁性を持たせた担体を使用する方法がある（たとえば特許文献 4, 5参照)。この方法は、磁性を持たせたシリカ粒子に核酸を吸着させ後に磁石によってシリカ粒子を分離し、分離されたシリカ粒子力核酸を溶離させた後に溶離液を回収するものがある。この方法は、遠心分離操作などを行うことなく固相と液相を分離できるために機械による自動化にぉ、て利点はある [0005] し力しながら、核酸の回収率が比較的に低い上、その回収率が検体の種類に影響されやすいといった問題がある。し力も、磁性シリカ粒子は、核酸の増幅方法として P CR (Polymerase Chain Reaction)法を採用したときに、増幅反応の阻害剤となるといつた問題が指摘されている。また、核酸を検出する代表的な方法としては、核酸に標識を施し、その標識を光学的手法により測定するものがあるが、この方法を採用した場合には、磁性シリカによって測定誤差が生じ、精製時における磁性シリカ粒子の含有量のバラツキによって再現性が悪化する。

[0006] また、核酸の精製方法としては、たとえば核酸を抽出するのに必要な試薬類を固体マトリックスに含浸させたものを利用する方法がある（たとえば特許文献 6— 8参照)。この方法では、固体マトリックスに対して試料を点着することで目的核酸が抽出される。その後、核酸を増幅させるときに阻害剤になりうる余剰成分が洗浄除去される。より具体的には。余剰成分の洗浄は、ポンチを用いて固体マトリックスの一部を円盤状に打ち抜いた後、打ち抜かれた円盤状の固体マトリックスをマイクロチューブに収容させ、マイクロチューブ内において、円盤状の固体マトリックスから余剰成分が溶離させること〖こより行われる。

[0007] この方法を適用する場合、固体マトリックスの一部を打ち抜く工程が必要となるばかり力固体マトリックスを打ち抜くためには、固体マトリックスを乾燥させる必要が生じる。そのため、円盤状の固体マトリックスを洗浄する前において相当の時間を必要とする。また、円盤状の固体マトリックスの洗浄は、固体マトリックスから余剰成分を洗浄液中に拡散させる方法であるために、洗浄に相当の時間が必要となる。とくに、十分な洗浄効果を得るためには、マイクロチューブに保持させた洗浄液を繰り返し取り替える必要があるため、この点においても洗浄に要する時間が長くなる。そればかりか、洗浄に要する時間をできるだけ短くするためには、円盤状の固体マトリックスを小さくせざるを得ない。この場合、試料から回収できる目的核酸の量が少なくなる。その結果、核酸の検出感度が低くなり、また目的量の核酸を得るためには増幅時間を長く設定する必要が生じる。

[0008] また、円盤状の固体マトリックスを利用する方法では、核酸の増幅が核酸の洗浄を行うためのマイクロチューブにおいて行われるとともに、核酸の分析がマイクロチューブにおいて光学的手法を用いて行われる。そのため、円盤状の固体マトリックスが不当に大きな場合には、円盤状の固体マトリックスが測光路を塞いで核酸の分析を阻害しかねない。このような不具合を生じさせないようにするためには、円盤状の固体マトリックスは、一定以下の大きさ、たとえば 2mm以下の大きさに打ち抜かざるを得ず、試料から回収できる目的核酸の量が少なるといったように、上述した不具合が生じる。また、ユーザとしては、 2mm以下の大きさに固体マトリックスを打ち抜く作業の負担は大きぐ作業効率のよい手法とはいえない。

[0009] ところで、 PCR法を利用した核酸の増幅は、機械による自動化が進んでおり、既に PCR装置も市販されている。 PCR装置としては、核酸の増幅とともに、増幅された核酸の検出を行えるようにしたものが一般的である。

[0010] し力しながら、市販の PCR装置を使用する場合には、それ専用の増幅キットを用いる必要がある。一般的な増幅キットは、蓋付きの容器に予めプライマーおよびポリメラーゼなどの試薬を仕込んだものである。そのため、ユーザは、容器の蓋を開けてから容器内に核酸溶液を分注した上で、容器内の反応液を攪拌して蓋を閉めた後、それを PCR装置にセットするといつた操作を強いられる。すなわち、一般的な増幅キットは、ユーザによる手操作に依存する部分が大き、ためにユーザの負担が大き、上に、ユーザによる手操作が大きく介在するために、分析効率が悪ぐユーザの技量の差に基づく再現性の悪化も懸念される。また、増幅キットにおいて採用されている容器は、通常、榭脂成型によって蓋が一体成型された汎用品であり、 PCR装置において蓋を自動的に開閉させることは困難である。そのため、一般的な専用キットを用いる方法では、ユーザの手操作に委ねていた操作を、 PCR装置において自動的に行うのは困難である。

[0011] 核酸の増幅方法としては、 PCR法の他に、たとえば ICAN(Isothermal and Chimeri c Primer— initiated Amplification of Nucleic acid)法めるいは LAMP(Loop— Mediated I sothermal Amplification)法がある。これらの方法は、 PCR法に比べ、核酸の精製度を十分に高めなければ、目的核酸を十分に増幅させることができない方法である。したがって、核酸の精製および増幅を機械により自動化する場合においては、 PCR法以外に他の増幅方法を採用できるようにするためには、核酸の精製度を高める手法を確立する必要がある。

[0012] 特許文献 1 :特開 2001— 149097号公報

特許文献 2：特開 2003 - 304899号公報

特許文献 3：特許第 2680462号公報

特許文献 4：特開昭 60— 1564号公報

特許文献 5 :特開平 9 19292号公報

特許文献 6：米国特許第 5496562号明細書

特許文献 7 :米国特許第 5939259号明細書

特許文献 8 :米国特許第 6168922号明細書

発明の開示

[0013] 本発明は、核酸の精製、核酸の増幅および核酸の測定といった核酸分析における一連の工程を、機械により自動で行えるようにし、ユーザの負担を軽減するとともに分析効率および再現性を改善することを目的として！ヽる。

[0014] 本発明はさらに、核酸の精製および増幅を機械により自動化できるようにする場合に、種々の増幅方法を採用できる核酸の精製技術を提供することを目的としている。

[0015] 本発明の第 1の側面においては、試料から目的核酸を抽出し、かつ抽出した核酸を担持させるための核酸抽出要素と、上記核酸抽出要素とは別体として形成され、かつ上記核酸抽出要素を収容しておくための収容槽を有する容器本体と、を備えている、核酸抽出用容器が提供される。

[0016] 好ましくは、核酸抽出要素は、目的核酸を担持させるための固体マトリックスと、この固体マトリックスを保持するための保持部材と、を有するものとして構成される。

[0017] 固体マトリックスは、たとえば保持部材の垂直軸に対して傾斜した状態で保持部材に保持され、好ましくは、垂直軸に対して水平または略水平な状態で保持される。この場合、固体マトリックスは、円盤状に形成するのが好ましい。

[0018] 上記垂直軸に対して固体マトリックスが傾斜した状態は、たとえば固体マトリックスに対して保持部材に突き刺すことにより達成することができる。この場合、保持部材は、たとえば端部に向力ほど縮径するテーパ部と、テーパ部力も延出するとともに、固体マトリックスに貫通させるためのピン状部と、固体マトリックスがピン状部から離脱するのを抑制するための係止片と、を有するものとして構成される。

[0019] また、固体マトリックスは、保持部材の垂直軸に対して平行または略平行な状態で保持部材に保持させてもよい。この場合、固体マトリックスは、シート状に形成するのが好ましい。

[0020] 上記垂直軸に対して固体マトリックスが平行または略平行な状態は、たとえば保持部材に対して固体マトリックスを吊持させることにより達成することができる。この場合、保持部材は、たとえば固体マトリックスの端部を挟持して固体マトリックスを吊持するための挟持部を有するものとして構成される。

[0021] 容器本体は、固体マトリックスに付着した余剰な成分を除去するのに必要な洗浄液を保持するための 1以上の洗浄槽を有するものとして構成するのが好ましい。この場合、容器本体には、固体マトリックスまたはその周囲に付着した余剰な洗浄液を除去するための余剰洗浄液除去手段を設けるのが好ましい。

[0022] 余剰洗浄液除去手段は、たとえば吸水性部材を含んでいる。吸水性部材としては、たとえば発泡榭脂、あるいは布などの多孔質体を使用することができる。

[0023] 本発明の核酸抽出用容器は、たとえば核酸分析装置にセットして使用するカートリッジとして構成される。

[0024] 核酸分析装置が、収容槽から目的核酸を担持させた核酸抽出要素を取り出して、当該核酸抽出要素を他の部位に移送するための移送部材を備えている場合においては、核酸抽出要素は、たとえば移送部材に係合させるための係合部を有するものとして構成される。この場合、係合部は、たとえば移送部材の先端部を嵌合させるために筒状に形成され、好ましくは、移送部材の先端部を嵌合させたときに、移送部材に弾性力を作用させることを可能とするための 1以上の欠落部を有するものとして構成される。 1以上の欠落部は、たとえばスリット、切欠および貫通孔のうちの少なくとも 1つを含むものとされる。

[0025] これに対して保持部材は、たとえば移送部材と係合部との嵌合状態を解除するために利用される突出部を有するものとされ、好ましくは、突出部は、外方側に向けて突出したフランジとして構成される。この場合、収容槽は、たとえば当該収容槽に核酸抽出要素を収容したときに、突出部を係止するための段部を有するものとして構成される。

[0026] 本発明の第 2の側面においては、目的核酸を担持させた固体マトリックスから、洗浄液を用いて目的核酸以外の余剰な成分を除去する方法であって、洗浄液に対して固体マトリックスを相対的に上下方向に移動させることによって、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬される状態と、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬されない状態と、を繰り返す、固体マトリックスの洗浄方法が提供される。

[0027] 洗浄液に固体マトリックスが浸漬される状態と浸漬されない状態との繰り返しは、上下方向に対して固体マトリックスを傾斜させた状態で行われ、好ましくは、上下方向に対して固体マトリックスを直交または略直交させた姿勢で行われる。

[0028] 本発明の第 3の側面においては、目的核酸を担持させるための固体マトリックスと、この固体マトリックスを保持するための保持部材と、を有する核酸抽出要素を用いて目的核酸を精製する方法であって、上記固体マトリックスに対して試料を含浸させて試料中の目的核酸を上記固体マトリックスに担持させる核酸担持ステップと、上記固体マトリックスに付着した目的核酸以外の余剰な成分を、洗浄液を用いて除去する洗浄ステップと、を含み、かつ、上記洗浄ステップは、洗浄液に対して上記核酸抽出要素を相対的に上下方向に移動させることによって、上記核酸抽出要素が上記洗浄液に浸漬される状態と、上記核酸抽出要素が上記洗浄液に浸漬されない状態と、を繰り返すことにより行われる、目的核酸の精製方法が提供される。

[0029] 本発明の核酸精製方法においては、核酸抽出要素として、たとえば保持部材の垂直軸に対して傾斜した状態で保持部材に固体マトリックスを保持させたものが用いられる。この場合、洗浄ステップは、たとえば上下方向に対して固体マトリックスを傾斜させた状態で、抽出要素を上下方向に移動させることにより行われる。好ましくは、洗浄ステップは、上下方向に対して、固体マトリックスを直交または略直交させた姿勢で核酸抽出要素を上下方向に移動させることにより行われる。

[0030] 洗浄ステップは、洗浄液に対する固体マトリックスの繰り返しの浸漬が終了した後に、固体マトリックスに付着した余剰な洗浄液を吸水性部材により除去する作業を含んでいる。 [0031] 本発明の第 4の側面においては、目的核酸を担持させた固体マトリックスから、洗浄液を用いて目的核酸以外の余剰な成分を除去するための機構であって、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬される状態と、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬されない状態と、が繰り返されるように、洗浄液に対して固体マトリックスを相対的に上下方向に移動させるように構成されてヽる、固体マトリックスの洗浄機構が提供される。

[0032] 本発明の洗浄機構は、たとえば固体マトリックスを、上下方向に対して傾斜させた状態で上下方向に移動させるように構成され、好ましくは、固体マトリックスを、上下方向に対して直交または略直交させた姿勢で上下方向に移動させるように構成される。

[0033] ここで、本発明において「試料」とは、動物由来の生物試料 (たとえば全血、血清、血漿、尿、唾液、あるいは体液)および動物以外の生物試料を含む概念であり、「核酸」とは、 DNAあるいは RNAを意味し、 2本鎖 DNA、 1本鎖 DNA、プラスミド DNA 、ゲノム DNA、 cDNA、外来性寄生生物（ウィルス、細菌、真菌など）由来 RNA、内在性 RNAを含む概念である。

図面の簡単な説明

[0034] [図 1]核酸分析装置の一例を説明するための全体斜視図である。

[図 2]図 1に示した核酸分析装置の内部構成を示す平面図である。

[図 3]図 2の III III線に沿う断面図である。

[図 4]図 1の IV— IV線に沿う断面図である。

[図 5]核酸精製用カートリッジの一例を示す全体斜視図である。

[図 6]図 5の VI— VI線に沿う断面図である。

[図 7]図 7Aは核酸精製用カートリッジにおける核酸抽出要素の全体斜視図であり、図 7Bは核酸抽出要素の断面図である。

[図 8]核酸増幅用カートリッジの全体斜視図である。

[図 9]図 8の IX— IX線に沿う断面図である。

[図 10]固体マトリックスの洗浄動作を説明するための要部断面図である。

[図 11]核酸増幅用カートリッジからの蓋の取り外し動作を示す要部断面図である。圆 12]蓋を利用した拡散核酸抽出要素の取り出し動作を説明するための要部断面図である。

圆 13]図 13Aは核酸増幅用カートリッジの反応槽に核酸抽出要素を収容する動作を説明するための要部断面図であり、図 13Bは反応槽から蓋を取り外す動作を説明するための要部断面図である。

[図 14]図 13Bの XIV— XIV線に沿う断面図である。

圆 15]温調機構および測定機構を説明するための、図 2の XV— XV線に沿う断面に相当する断面図である。

圆 16]核酸分析装置の一例を説明するための内部構成を示す平面図である。

[図 17]図 16の XVII— XVII線に沿う断面図である。

[図 18]図 16の XVIII— XVIII線に沿う断面図である。

圆 19]核酸精製用カートリッジの一例を示す全体斜視図である。

圆 20]図 20Aは核酸精製用カートリッジにおける核酸抽出要素を示す斜視図、図 20

Bはその平面図、図 20Cは図 20Aの XXc— XXc線に沿う断面図である。

[図 21]核酸精製用カートリッジの容器における図 19の XXI— XXI線に沿った断面に相当する断面図である。

圆 22]容器における収容槽カも核酸抽出要素を取り出す操作を示す要部断面図である。

[図 23]核酸増幅用カートリッジの全体斜視図である。

[図 24]図 24Aは図 23の XXIVa—XXIVa線に沿う断面図であり、図 24Bは図 24Aにお!、て蓋を分離した状態を示す断面図である。

[図 25]ノズルに対するチップの取り付け動作を説明するための要部正面図である。圆 26]ノズルに対する核酸抽出要素の取り付け動作を説明するための要部正面図である。

[図 27]ノズル力ものチップの取り外し動作を説明するための要部正面図である。

[図 28]ノズル力の核酸抽出要素の取り外し動作を説明するための要部正面図である。

圆 29]核酸増幅用カートリッジの蓋に対する回転部材の挿入動作を示す要部断面図である。

[図 30]核酸増幅用カートリッジの蓋を取り外す動作を説明するための要部断面図である。

[図 31]核酸増幅用カートリッジの反応槽に核酸抽出要素を収容する操作を示す要部断面図である。

[図 32]核酸増幅用カートリッジの蓋を再装着する動作を説明するための要部断面図である。

[図 33]測定機構を説明するための、図 16の XXXIII— XXXIII線に沿う断面に相当する断面図である。

[図 34]実施例 1 (PCR法）における蛍光強度の測定結果を示すグラフであり、横軸を温度、縦軸を蛍光強度の微分値として示したものである。

[図 35]実施例 2 (ICAN法）における蛍光強度の測定結果を示すグラフであり、横軸をサイクル数、縦軸を蛍光強度として示したものである。

[図 36]実施例 3 (LAMP法）における蛍光強度の測定結果を示すグラフであり、横軸をサイクル数、縦軸を蛍光強度として示したものである。

発明を実施するための最良の形態

[0035] 以下においては、本発明について第 1および第 2の実施の形態として、図面を参照しつつ説明する。

[0036] まず、本発明の第 1の実施の形態について、図 1ないし図 15を参照して説明する。

[0037] 図 1ないし図 4に示した核酸分析装置 1は、試料中の核酸の精製、抽出された核酸の増幅、および増幅された核酸の分析を自動で行えるように構成されたものであり、図 1および図 2に示したように、筐体 10の内部に、複数の核酸精製用カートリッジ 2および核酸増幅用カートリッジ 3を同一数だけ装着して使用されるものである。

[0038] 図 5および図 6に示したように、核酸精製用カートリッジ 2は、核酸分析装置 1における核酸の自動精製を可能ならしめるためのものであり、核酸抽出要素 20およびカートリッジ本体 21を有している。

[0039] 核酸抽出要素 20は、試料中から核酸を抽出するのに利用されるものであり、後述するカートリッジ本体 21の収容槽 27に収容されている。この核酸抽出要素 20は、図 7Aおよび図 7Bに良く表れているように、保持部材 22および固体マトリックス 23を有している。

[0040] 保持部材 22は、筒状部 24、フランジ部 25、および保持部 26を有するものであり、たとえば全体が榭脂成型によって形成されている。

[0041] 筒状部 24は、核酸抽出要素 20を移動させるときに利用される部分であり（図 4および図 12参照）、凹部 24Aおよび係止ヘッド 24Bを有している。凹部 24Aは、後述する核酸精製用機構 5の挿入ピン 50または核酸増幅用カートリッジ 3の蓋 31におけるピン 36Bを嵌合させるためのものである（図 4および図 12参照）。係止ヘッド 24Bは、後述する核酸増幅用カートリッジ 3の蓋 31における係止爪 36Aを嵌合させるためのものであり、半径方向に突出している。

[0042] フランジ部 25は、後述する核酸精製用カートリッジ 2の収容槽 27に核酸抽出要素 2 0を収容するときに、収容槽 27の段部 27A係合させるためのものであり、半径方向の外方側に向けて突出した環状に形成されて！ヽる（図 12参照)。

[0043] 保持部 26は、固体マトリックス 23を保持するための部分であり、テーパ部 26A、ピン状部 26Bおよび係止片 26Cを有している。テーパ部 26Aは、保持部 26に付着した洗浄液を下方に移動させやすくする役割を果たすものである。ピン状部 26Bは、固体マトリックス 23に貫通させるための部分である。係止片 26Cはピン状部 26Bを固体マトリックス 23に貫通させたときにピン状部 26B (保持部 26)から固体マトリックス 23が離脱するのを防止するためのものである。

[0044] 保持部材 22には、保持部 26の若干上方に Oリング 22Aが固定されている。この O リング 22Aは、図 13Bに良く表れているように、核酸抽出要素 20を核酸増幅用カートリッジ 3の反応槽 34に収容したときに、反応槽 34の内面に密着させるためのものである。すなわち、反応槽 34に核酸抽出要素 20を収容させた場合には、 Oリング 22Aが反応槽 34の内面と密着する位置よりも下方に密閉空間が形成される。そして、 Oリング 22Aが保持部 26よりも上方に配置されていることから、固体マトリックス 23は密閉空間において収容される。

[0045] 固体マトリックス 23は、試料中の核酸を担持させるためのものであり、たとえば濾紙に対して核酸抽出用の試薬類を担持させたものとして構成されている。この固体マトリックス 23は、円盤状に形成されている。すなわち、固体マトリックス 23は、ピン状部 2 6Bに突き刺された状態で、保持部材 22の垂直軸に対して直交するように水平または略水平に支持されている。

[0046] ここで、核酸抽出用の試薬類としては、たとえば弱塩基、キレート試薬、陰イオン界面活性剤あるいは陰イオン洗剤および尿酸あるいは尿酸塩の組み合わせ、もしくは核酸吸着用担体および吸着促進剤の組み合わせを挙げることができる。核酸吸着用担体としては、公知の種々のものを使用することができ、典型的にはシリカビーズが使用される。吸着促進剤としては、細胞膜を破壊し、あるいは試料中のタンパク質を変性させ、核酸吸着用担体への核酸の結合に寄与する物質であればよぐたとえばカオトロピック物質 (たとえばグァ-ジンチォシアン酸塩、グァ-ジン酸塩）を使用することができる。なお、固体マトリックス 23は、試料中の核酸を効率良く吸着させることができる構成であればよぐその構成は上述した例には限定されない。

[0047] 上述の核酸抽出要素 20では、後述する核酸増幅用カートリッジ 3の反応槽 34に核酸抽出要素 20を収容させたときに、固体マトリックス 23を反応槽 34の底力も離間させた状態とすることができる。これにより、後述した測光機構 8の測光経路上に固体マトリックス 23が位置しないようにすることができるため、測光精度を向上させることができる。固体マトリックス 23が測光経路上に位置しないため、固体マトリックス 23として寸法の大きなものを使用することが可能となる。これにより、固体マトリックス 23に対してより多くの核酸を担持させることが可能となり、より効率良く核酸の増幅を行い、また分析精度を向上させることが可能となる。

[0048] 図 5および図 6に示したように、カートリッジ本体 21は、収容槽 27、 3つの洗浄槽 28

1

〜28、試料保持槽 29および余剰液除去槽 21Aを有するものであり、たとえば榭脂

3

成型により一体成型されている。

[0049] 収容槽 27は、核酸抽出要素 20を収容するためのものであり、核酸抽出要素 20のフランジ部 25を係止するための段部 27Aを有している。この収容槽 27は、核酸精製用カートリッジ 2の使用前において、上部開口 27B力も核酸抽出要素 20が離脱しないように、上部開口 27Bをアルミニウム薄膜などのシール材により塞いでおくのが好ましい。シール材は、核酸精製用カートリッジ 2を使用するときにユーザが剥がすようにしてもょ、し、核酸分析装置 1にお、て自動的に剥がすようにしてもょ、。

[0050] 各洗浄槽 28〜28は、固体マトリックス 23に核酸を担持させた後、固体マトリックス

1 3

23から夾雑物を除去するための洗浄液を保持するためのものである。洗浄液は、核酸精製用カートリッジ 2として洗浄槽 28〜28に予め仕込んでおくのが好ましいが、

1 3

核酸分析装置 1に仕込んでおいた洗浄液を分析時に洗浄槽 28〜28に分注するよ

1 3

うにしてもよい。洗浄液としては、たとえば固体マトリックス 23からの核酸の溶離作用が少なぐ夾雑物の結合を妨げるもの（たとえばグァ-ジン塩酸塩あるいはエタノール )を使用することができる。 3つの洗浄槽 28〜28には、同一の洗浄液を保持させて

1 3

もよいが、異なる洗浄液を保持させてもよい。

[0051] なお、各洗浄槽 28〜28に予め洗浄液を仕込んでおく場合には、各洗浄槽 28〜

1 3 1

28の上部開口 28A〜28Aをアルミニウム薄膜などのシール材により塞いでおく必

3 1 3

要がある。この場合、各洗浄槽 28〜28の上部開口 28A〜28Aを個別に塞いでも

1 3 1 3

よいし、 3つの洗浄槽 28〜28の上部開口 28A〜28Aを一括して、あるいは 3つの

1 3 1 3

洗浄槽 28〜28の上部開口 28A〜28Aおよび収容槽 27の上部開口 27Bを一括

1 3 1 3

して塞いでもよい。

[0052] 試料保持槽 29は、分析対象 (核酸を抽出する対象)となる試料を保持しておくためのものである。試料保持槽 29に対する試料の保持は、核酸精製用カートリッジ 2を核酸分析装置 1にセットする前に行ってもよいし、核酸精製用カートリッジ 2を核酸分析装置 1にセットした後に行ってもよい。後者の場合、核酸分析装置 1において自動的に試料保持槽 29に試料が分注されるように構成するのが好ましい。試料としては、たとえば全血、血清、血漿、尿、唾液、あるいは体液を使用することができる。

[0053] 余剰液除去槽 21Aは、核酸抽出要素 20における固体マトリックス 23を洗浄した後において、核酸抽出要素 20、固体マトリックス 23および保持部材 22の保持部 26に付着した余剰な洗浄液を除去するためのものである。この余剰液除去槽 21Aには、底壁 21Aaおよび前後壁 21Ab、 21Acに密着して吸水性部材 21Ad, 21Aeが固定されている。吸水性部材 21Ad, 21Aeは、たとえば発泡榭脂あるいは布などの多孔質材料により構成されており、核酸抽出要素 20を接触させることによって核酸抽出要素 20から余剰な洗浄液を吸収除去できるように構成されて、る。 [0054] 図 8および図 9に示したように、核酸増幅用カートリッジ 3は、核酸分析装置 1における核酸の自動増幅および測定を可能ならしめるためのものであり、カートリッジ本体 3 0および蓋 31を有している。

[0055] カートリッジ本体 30は、 4つの試薬類保持槽 32〜32、混合槽 33、および反応槽 3

1 4

4を有するものであり、たとえば榭脂成型により一体成型されている。

[0056] 各試薬類保持槽 32〜32は、核酸の増幅および測定に必要な試薬類を水溶液あ

1 4

るいは懸濁液の状態で保持するためのものである。ここで、各試薬類保持槽 32〜3

1

2に保持される試薬類の種類は、採用する増幅方法および測定方法に応じて選択さ

4

れる。増幅方法としては、たとえば PCR(Polymerase Chain Reaction)法、 ICAN(Isoth ermal andし himeric Primer— initiated Amplification of Nucleic acid)法、 LAMP(Loop- Mediated Isothermal Amplification)法めいは N AS BA(Nucleic acid Sequence Base a Amplification)法を採用することができる。 PCR法を採用する場合には、試薬類として、少なくとも 2種類のプライマー、 dNTP、および DNAポリメラーゼが使用される。 I CAN法を採用する場合には、試薬類として、キメラプライマー、 DNAポリメラーゼ、および RNaseHが使用される。 LAMP法を採用する場合には、試薬類として、 1種類以上の LAMP用プライマー、 dNTP、鎖置換型 DNA合成酵素、および逆転写酵素が使用される。 NASBA法を採用する場合には、試薬類として、少なくとも 2種類のプライマー、 dNTP、 rNTP、逆転写酵素、 DNAポリメラーゼ、 RNaseH、および RNA ポリメラーゼが使用される。一方、測定方法としては、蛍光測定、発色測定、放射性活性測定、あるいは電気泳動を採用することができる。ただし、核酸分析装置 1においては蛍光測定が採用されているものとする。この場合、プライマーとしては、蛍光プライマーを使用するのが好ましい。

[0057] 混合槽 33は、試薬類保持槽 32〜32に保持された 2以上の試薬類を反応槽 34に

1 4

供給する前に混合する際に利用されるものである。

[0058] なお、試薬類保持槽 32〜32には、試薬類を予め仕込んでおくのが好ましいが、

1 4

核酸分析装置 1に仕込んでおいたものを分析時に試薬類保持槽 32〜32に分注す

1 4 るようにしてもよい。この場合、試薬類保持槽 32〜32の上部開口 32A〜32Aは、

1 4 1 4 アルミニウム薄膜などのシール材により塞、でおく必要があるが、各試薬類保持槽 3 2〜32の上部開口 32A〜32Aを個別に塞いでもよいし、 4つの試薬類保持槽 32

1 4 1 4 1

〜32の上部開口 32A〜32Aを一括して、あるいは 4つの試薬類保持槽 32〜32

4 1 4 1 4 および混合槽 33の上部開口 32A〜32Α , 33Aを一括して塞いでもよい。

1 4

[0059] 反応槽 34は、混合試薬および核酸抽出要素 20を収容するためのものであるとともに、核酸抽出要素 20に担持させた核酸と混合槽 33において調整された混合試薬とを反応させる場を提供するものである（図 13および図 14参照)。この反応槽 34は、筒状部 35および反応検出部 37を有している。

[0060] 筒状部 35は、蓋 31が装着される部分であり、その内周面にネジ溝 35Aが設けられている。

[0061] 反応検出部 37は、核酸の増幅反応を起こさせる場を提供するとともに、蛍光測定を行うための検出容器としての役割を果たすものである。すなわち、反応検出部 37は、後述する測光機構 8の発光部 80から出射された光が照射される部分である（図 15参照)。

[0062] 蓋 31は、反応検出部 37の内部を密閉状態とするか否かを選択するためのものであり、反応槽 34 (筒状部 35)に対して着脱自在とされている。より具体的には、蓋 31は、回転力を作用させることにより、筒状部 35に装着される状態と筒状部 35 (反応槽 3 4)から完全に分離した状態とを選択できるように構成されている。蓋 31は、円筒状の本体部 38、フランジ部 39および保持部 36を有している。

[0063] 本体部 38は、反応槽 34における筒状部 35のネジ溝 35Aに螺合させるためのネジ山 38Aと、後述する蓋着脱機構 6における回転部材 60 (図 11B参照）を挿入するための凹部 38Bと、を有している。凹部 38Bの内周面には、複数のリブ 38Cが設けられている。複数のリブ 38Cは、周方向に一定間隔隔てて上下方向に延びるように設けられている。各リブ 38Cの上端部は、上方に向力ほど幅寸法が小さくなるテーパ状に形成されている。

[0064] フランジ部 39は、反応槽 34から取り外した蓋 31を移動させるときに、後述する蓋着脱機構 6における外套部材 61の爪 64を係止させるためのものである（図 11B参照)。このフランジ部 39は、本体部 38の上端から半径方向の外方側に向けて突出する円環状に設けられている。 [0065] 図 7Bに示したように、保持部 36は、核酸精製用カートリッジ 2における核酸抽出要素 20を保持するためのものであり、一対の係止爪 36Aおよびピン 36Bを有している。

[0066] 一対の係止爪 36Aは、核酸抽出要素 20における係止ヘッド 24Bに係止させるためのものであり、本体部 38の底面 38Dから下方に突出して設けられている。各係止爪 3 6Aは、先端部にフック部 36Aaが設けられており、このフック部 36Aaが揺動可能とされている。すなわち、一対の係止爪 36Aのフック部 36Aa相互は、互いに近接離間可能とされている。

[0067] ピン 36Bは、核酸抽出要素 20における筒状部 24の凹部 24Aに挿入するためのものであり、本体部 38の底面 38Dから下方に突出して設けられている。このピン 36B は、核酸抽出要素 20を蓋 31に保持させるときにガイドとして機能するとともに、蓋 31 に核酸抽出要素 20を保持させた後において蓋 31に対する核酸抽出要素 20のガタツキを抑制するためのものである。

[0068] 図 1に示したように、核酸分析装置 1の筐体 10には、蓋 11、表示部 12および操作部 13が設けられている。蓋 11は、筐体 10の内部が露出する状態と露出しない状態とを選択するためのものであり、筐体 10の内部にカートリッジ 2, 3を出し入れする際には蓋 11が開放される一方で、核酸の分析時および装置の非使用時には蓋 11は閉じた状態とされる。表示部 12は、分析結果などを表示するためのものであり、たとえば LCDにより構成されている。操作部 13は、各種の設定を行うために、あるいは分析開始のためなどに操作される部分である。

[0069] 図 2および図 3に示したように、筐体 10の内部には、後述するピペット装置 4、核酸精製用動作機構 5、蓋着脱機構 6、温調機構 7、および測光機構 8が設けられている

[0070] ピペット装置 4は、主として核酸増幅用カートリッジ 3における混合液の調整行うためのものであり、ノズル 40を有している。このピペット装置 4は、必要に応じて、核酸精製用カートリッジ 2に対して試料もしくは洗浄液を供給するために利用される。

[0071] ノズル 40は、液体を吸引 ·吐出可能なように、図外のポンプに接続されており、ノズル 40の内部に吸引力を作用させる状態と吐出力を作用させる状態とが選択されるように構成されている。このノズル 40は、ロボットアームなどの駆動機構（図示略）により上下方向および水平に移動可能とされており、その動作が CPUなどによって構成された制御部 10によって制御される。ノズル 40は、核酸増幅用カートリッジ 3における試薬類保持槽 32〜32、混合槽 33、反応槽 34、および核酸精製用カートリッジ 2の

1 4

収容槽 27に移動することができる。ノズル 40は、混合試料の調整および反応槽 34 ( 反応検出部 37)への混合試料の分注を行う場合には、図 3に示したように先端部 42 にチップ 43が装着される。チップ 43は、図 2に示したようにノズル 40 (ピペット装置 4) の待機位置の隣接した部位において、ラック 44において保持されている。このラック 4 4に隣接した部位には、使用済みのチップ 43を廃棄するための廃棄ボックス 45が配置されている。

[0072] 図 2〜図 4および図 10に示したように、核酸精製用動作機構 5は、核酸精製用カートリッジ 2の核酸抽出要素 20を利用して試料中の核酸を抽出する際に、核酸抽出要素 20の動作を制御するためのものである。この核酸精製用動作機構 5は、複数の挿入ピン 50、筒状体 51および支持フレーム 52を有している。

[0073] 複数の挿入ピン 50は、核酸抽出要素 20の筒状部 24に嵌合させるためのものであり、支持フレーム 52に対して一体動可能に支持されている。

[0074] 筒状体 51は、挿入ピン 50に装着された核酸抽出要素 20を取り外すためのものであり、挿入ピン 50とは独立して上下方向に移動可能なように挿入ピン 50を外套している。すなわち、筒状体 51は、挿入ピン 50から核酸抽出要素 20を取り外す動作を行うとき以外は、核酸抽出要素 20よりも上方 (待機位置）に位置する一方で、挿入ピン 5 0から核酸抽出要素 20を取り外す動作を行うときには、挿入ピン 50に対して相対的に下方に移動させられる。

[0075] 支持フレーム 52は、複数の挿入ピン 50を、複数の核酸精製用カートリッジ 2の並び方向に一定間隔隔てて支持するとともに、それらの挿入ピン 50を移動せるための媒体として機能するものである。この支持フレーム 52は、図外の駆動機構によって上下方向および前後方向に移動可能とされており、その動作は、たとえば図 2に示した制御部 10によって制御される。そのため、複数の挿入ピン 50ひいてはそれらに装着された核酸抽出要素 20は、支持フレーム 52とともに上下および前後方向に移動することができる。これにより、複数の核酸抽出要素 20は、固体マトリックス 23に対する試料の含浸および固体マトリックス 23の洗浄および余剰液の除去を一括して同時に行うことができる（図 10参照)。

[0076] 図 11および図 13に示したように、蓋着脱機構 6は、核酸増幅用カートリッジ 3の反応槽 34から蓋 31を取り外し、あるいは反応槽 34に蓋 31を装着するためのものであり、回転部材 60および外套部材 61を有している。回転部材 60および外套部材 61は、図外の駆動機構によって上下および水平方向に移動可能とされており、制御部 10 ( 図 2参照）によってその動作が制御されるように構成されて！、る

[0077] 回転部材 60は、核酸増幅用カートリッジ 3の蓋 31に回転力を作用させるとともに、蓋 31を保持して蓋 31を移動させるためのものであり、略円柱状の先端部 62を有している。回転部材 60の先端部 62には、複数のリブ 63が形成されている。複数のリブ 63 は、先端部 62の周方向において、一定間隔隔てて上下方向に延びるように設けられており、各リブ 63の下端部は、下方に向力うほど幅寸法が小さくなるテーパ状に形成されている。これらのリブ 63は、図 14に示すように蓋 31の複数のリブ 38Cに係合させるためのものであり、蓋 31の凹部 38Bに先端部 62を挿入したときに、凹部 38Bにおける互いに隣接するリブ 38Cの間に位置するようになされて!、る。

[0078] この構成では、回転部材 60の先端部 62を回転させたときに、先端部 61のリブ 63と凹部 38Bのリブ 38Cとが相互に干渉しあうので、先端部 62が蓋 31の凹部 38Bにおいて空回転することを抑制でき、回転部材 60の回転力を、蓋 31に対して適切に付与することができる。また、凹部 38Bにおける複数のリブ 38Cの上端部が上方向に向うほど幅が細くなるテーパ状とされている一方で、回転部材 60の先端部 61における複数のリブ 63は下端部が下方向に向うほど幅が細くなるテーパ状とされている。そのため、蓋 31の凹部 38Bに対しては、容易かつ確実に回転部材 60の先端部 61を挿入することができる。

[0079] 外套部材 61は、回転部材 60を外套するものであり、円筒状に形成されている。この外套部材 61は、フランジ部 39に係止させるための爪 64を有している。この爪 64は、先端部 64にフック部 65が設けられたものであり、フック部 65が揺動可能とされている。爪 64は、回転部材 60の先端部 62を蓋 31の凹部 38Bに挿入したときに、蓋 31のフランジ部 39に係止させられる。これにより、回転部材 60に蓋 31がー体ィ匕され、回転部材 60および外套部材 61を移動させることによって蓋 31を移動させることができる。また、爪 62は、回転部材 60によって蓋 31を反応槽 34に再装着するときに、自動的に蓋 31のフランジ部 39との係止状態が解除されるように構成されている。

[0080] 図 15に示したように、温調機構 7は、ヒートブロック 70の温度制御をすることによつて核酸増幅用カートリッジ 3の反応検出部 37に保持された液体の温度を制御するためのものである。ヒートブロック 70の温度は、図外の温度センサによってモニタリングされており、温度センサでのモニタリング結果に応じて、ヒートブロック 70の温度がフイードバック制御されるように構成されている。ヒートブロック 70には、核酸増幅用カートリッジ 3の反応検出部 37の外観形状に対応した凹部 71が形成されている。これにより、ヒートブロック 7において反応槽 34を選択的かつ効率的に温調することができる。ヒートブロック 70にはさらに、凹部 71に繋がる直線状の貫通孔 72, 73が設けられている。貫通孔 72は後述する測光機構 8の発光部 80において出射された光を反応槽 34の反応検出部 37に導くためのものであり、貫通孔 73は反応検出部 37を透過した光を受光部 81に導くためのものである。

[0081] 測光機構 8は、発光部 80および受光部 81を有している。発光部 80は、貫通孔 72 を介して、反応検出部 37に励起光を照射するためのものである。受光部 81は、貫通孔 73を介して、反応検出部 37に励起光を照射したときの蛍光を受光するためのものである。測光機構 8では、発光部 80から連続的に励起光を照射する一方で、受光部 81にお、て連続的に蛍光の量をモニタリングすることにより、リアルタイムで核酸の増幅の程度を把握することができる。

[0082] 次に、核酸分析装置 1における動作を説明する。

[0083] 核酸分析装置 1において核酸の分析を行う場合には、まず図 1ないし図 4に示したように、核酸分析装置 1に核酸精製用カートリッジ 2および核酸増幅用カートリッジ 3をセットする。セットするカートリッジ 2, 3の個数は、核酸精製用カートリッジ 2の個数と核酸増幅用カートリッジ 3の個数が同一であれば何個でもよい。なお、以下の説明においては、核酸精製用カートリッジ 2として洗浄槽 28〜28には予め洗浄液が保持され

1 3

たものを使用し、試料保持槽 29には核酸精製用カートリッジ 2を核酸分析装置 1にセットする前に試料を保持させておいたものとする。 [0084] 次いで、核酸分析装置 1にセットしたカートリッジ 2, 3の個数、およびカートリッジ 2, 3の種類 (精製方法、増幅方法、測定方法)に応じた設定を、核酸分析装置 1に設けられた表示部 12を確認しつつ操作部 13を操作することにより行う。上記設定が終了した場合には、核酸分析装置 1において自動的に核酸の精製、増幅および測定が行われる。

[0085] 図 4に示したように、核酸の精製は、核酸精製用カートリッジ 2において、核酸精製用動作機構 5によって核酸抽出要素 20を移動させることにより行われる。

[0086] より具体的には、まず、核酸精製用動作機構 5の挿入ピン 50を核酸精製用カートリッジ 2における容器 21の収容槽 27の直上に位置させた状態とした上で、支持フレーム 52を駆動して挿入ピン 50を下動させた後に上動させる。挿入ピン 50を下動させることにより、核酸抽出要素 20の筒状部 24に挿入ピン 50が嵌合されて核酸精製用動作機構 5に複数の核酸抽出要素 20が一体化され、挿入ピン 50を上動させることにより核酸抽出要素 20が核酸精製用動作機構 5によって持ち上げられる。

[0087] 次いで、図 10に示したように、支持フレーム 52とともに挿入ピン 50を移動させ、核酸精製用カートリッジ 2における試料保持槽 29に保持させた試料 29Lに、核酸抽出要素 20の固体マトリックス 23を浸漬する。これにより、固体マトリックス 23に試料 29L の核酸が担持する。

[0088] 次いで、 3つの洗浄槽 28〜28に保持させた洗浄液 28L〜28Lに、固体マトリツ

1 3 1 3

タス 23を順次浸漬する。より具体的には、固体マトリックス 23の洗浄は、核酸精製用動作機構 5によって、各洗浄槽 28において固体マトリックス 23を繰り返し上下動させることにより行われる。このとき、核酸精製用動作機構 5においては、固体マトリックス 23が洗浄液 28L〜28Lに完全に浸漬する状態と、固体マトリックス 23が洗浄液 28

1 3

L〜28Lの液面よりも上方に位置する状態とが繰り返えされるように制御される。

1 3

[0089] このような洗浄方法では、固体マトリックス 23が液面よりも上方に位置する状態から洗浄液 28L〜28Lに浸漬されるように下方に移動させられるときに、固体マトリック

1 3

ス 23が液面に叩き付けられる。このとき、固体マトリックス 23が水平または略水平に支持されているために、固体マトリックス 23には大きな負荷が作用する。その一方で、固体マトリックス 23が洗浄液 28L〜28Lの内部を移動させられるときには、固体マトリックス 23が水平または略水平に支持されているために固体マトリックス 23の大きな移動抵抗が作用し、これが洗浄液に対流を生じさせる負荷として作用する。これらの作用により、固体マトリックス 23からは、夾雑物を効率良く除去することができる。これにより、後において行われる核酸の増幅工程において夾雑物が核酸の増幅を阻害することを効果的に抑制し、核酸の分析を精度良く行えるようになる。このような効果は、固体マトリックス 23を水平状態で移動させる場合に限らず、垂直軸に対して固体マトリックス 23を傾斜させた状態で移動させた場合に得ることができる。

[0090] 最後に、核酸抽出要素 20の先端部分を余剰液除去槽 21Aに保持させた吸水性部材 21Ad, 21Aeに接触させる。吸水部材 21Adは、余剰液除去槽 21Aの底壁 21 Aaおよび前後壁 21Ab, 21 Acに接触して配置されているため、それらの全ての吸水部材 21Adに核酸抽出要素 20の先端部を接触させた場合には、核酸抽出要素 2 0の先端部、主として固体マトリックス 23および保持部材 22の保持部 26から余剰な洗浄液が効率良く除去される。その結果、後において核酸抽出要素 20を用いて核酸の増幅を行う際に、洗浄液に含まれる不純物が核酸増幅を阻害することを抑制することがでさる。

[0091] なお、洗浄の終了した固体マトリクス 23は、核酸精製用動作機構 5に保持された状態で送風乾燥させてもよい。固体マトリックス 23の洗浄が終了（場合によって送風乾燥が終了）した場合には、挿入ピン 50から核酸抽出要素 20を取り外し、核酸抽出要素 20を核酸精製用カートリッジ 2の収容槽 27に再収容させる。挿入ピン 50からの核酸抽出要素 20の取り外しは、上述したように、核酸精製用動作機構 5の筒状体 51を下動させ、係止ヘッド 24Bに筒状部 51を干渉させることにより行われる。

[0092] このように、核酸精製用カートリッジ 2においては、核酸を固体 (核酸抽出要素 20) に担持させることによって、固体マトリックス 23を核酸分析装置 1にお、て容易に移動させることができる。この点において、核酸精製用カートリッジ 2は、核酸分析を自動で行うことに寄与して、ると、える。

[0093] 核酸の増幅は、核酸増幅用カートリッジ 3において混合試薬を調整し、それを核酸増幅用カートリッジ 3の反応槽 34に分注した後、核酸を担持させた固体マトリックス 2 3を、保持部材 22とともに反応槽 34に収容させることにより行われる。なお、反応槽 3 4において混合試薬と固体マトリックス 23が共存させられた場合には、採用する増幅方法の種類に応じて、ヒートブロック 70 (図 15参照）の温度を制御して反応槽 34の温調が行われる。

[0094] 混合試薬の調整は、ピペット装置 4におけるノズル 40の先端部 42にチップ 43を装着した上で、核酸増幅用カートリッジ 3における試薬類保持槽 32〜32に保持された

1 4

試薬類を順次、混合槽 33に所定量ずつ分注した後、ピペット装置 4によるピベッティング操作によって分注液を混合することにより行われる（図 3参照)。

[0095] 反応槽 34に対する混合液の分注は、蓋着脱機構 6によって反応槽 34から蓋 31を取り外しておいた上で、ピペット装置 4によって行われる。図 11Aおよび図 11Bに示したように、蓋着脱機構 6における蓋 31の取り外しは、蓋着脱機構 6の回転部材 60 の先端部 62を蓋 31の凹部 38Bに挿入した後に、回転部材 60を回転させつつ上動させることにより行われる。回転部材 60を凹部 38Bに挿入した場合には、外套部材 6 1における爪 64のフック部 65が蓋 31のフランジ部 39に係止される。そのため、反応槽 34から取り外された蓋 31は、回転部材 60および外套部材 61とともに移動させることができる。このように、核酸分析装置 1および核酸増幅用カートリッジ 3においては、核酸の増幅ひ、ては核酸分析の全自動化を達成するために、核酸増幅用カートリツジ 3から蓋 31を容易かつ確実に取り外せるように工夫がなされて、る。

[0096] 一方、反応槽 34への固体マトリックス 23の収容は、蓋着脱機構 6および核酸増幅用カートリッジ 3の蓋 31を利用して行われる。より具体的には、固体マトリックス 23の収容は、図 12および図 13に示したように、蓋 31への核酸抽出要素 20の保持、および反応槽 34への蓋 31の再装着といった一連の操作によって行われる。

[0097] 図 7Bおよび図 12に示したように、蓋 31への核酸抽出要素 20の保持は、蓋着脱機構 6によって蓋 31を核酸精製用カートリッジ 2における収容槽 27の上方に位置させた後に蓋 31を下動させることにより行われる。蓋 31を下動させる過程においては、蓋 31のピン 36Bは、核酸抽出要素 20における筒状部 24の凹部 24Aに挿入される。これにより、蓋 31と核酸抽出要素 20の筒状部 24との位置関係が規制され、蓋 31における一対の係止爪 36Aは、筒状部 24の係止ヘッド 24Bに対応する位置に適切に導かれる。これにより、一対の係止爪 36Aは、上方力係止ヘッド 24Bに押し付けられる。その結果、一対の係止爪 36Aは、それらのフック部 36Aaが互いに離間するように変位させられる。さらに一対の係止爪 36Aを下方に移動させた場合には、蓋 31のピン 36Bが筒状部 24の凹部 24Aにさらに深く挿入されるとともに、フック部 36Aaが係止ヘッド 24Bの下方に位置するときにフック部 36Aaが互いに近づく。その結果、一対の係止爪 36Aは、係止ヘッド 24Bに係止させられ、蓋 31に対して核酸抽出要素 20が保持される。この状態は、蓋 31のピン 36Bが筒状部 24の凹部 24Aに挿入されて、ることにより強固に維持され、蓋 31に対する核酸抽出要素 20のガタツキを抑 ff¾することができる。

[0098] 図 13に示したように、蓋 31の再装着は、蓋 31を保持した回転部材 60を、反応槽 3 4に蓋 31を位置合わせした状態にお、て回転させること〖こより行われる。すなわち、位置合わせ状態において蓋 31に対して回転力を付与することにより、蓋 31は、反応槽 34の筒状部 35に螺合される。蓋 31が筒状部 35に螺合された場合には、外套部材 61の爪 64が蓋 31のフランジ部 39に係止した状態が解除される。これにより、回転部材 60および外套部材 61は、蓋 31とは独立して移動することができる。一方、蓋 31 には核酸抽出要素 20が保持されているために、反応槽 34には核酸抽出要素 20が収容される。上述のように、核酸抽出要素 20には、保持部 26の若干上方位置に Oリング 22Aが配置されているため、核酸抽出要素 20の固体マトリックス 23は、密閉空間において、反応槽 34の底から一定距離離間した位置に固定される。反応検出部 3 7には、先に混合試薬が収容されているので、反応検出部 37においては、固体マトリックス 23の全体が浸漬される。これにより、固体マトリックス 23から核酸が溶出する一方で、溶出した核酸が試薬類と反応して増幅する。

[0099] このように、核酸分析装置 1では、蓋 31の着脱に必要な蓋着脱機構 6を利用して、収容槽 27の核酸抽出要素 20を反応槽 34に移送して収容させることができる。すなわち、核酸分析装置 1では、核酸抽出要素 20を移送させるために個別の機構を設ける必要はない。そのため、核酸の精製および核酸の増幅を 1つの装置において行うに当たって、装置が複雑ィ匕することを回避して装置の大型化を抑制し、また制御すべき動作機構の数の増加を抑制することができるようになるため、この点においても有利である。 [0100] 図 15に示したように、核酸の測定は、反応槽 34の上方を遮光部材 9によって覆つた状態とした後にお、て、測光機構 8によって行われる。

[0101] 測光機構 8においては、反応槽 34における反応検出部 37に対して発光部 80によつて励起光を照射する一方で、そのときの反応検出部 37において生じる蛍光を、受光部 81において受光する。上述したように、固体マトリックス 23が測光機構 8における測光を阻害しない位置にセットされるため、核酸分析装置 1においては核酸の測定を精度良く行うことが可能となる。

[0102] 以上に説明したように、核酸分析装置 1においては、上述した構成の核酸精製用力ートリッジ 2および核酸増幅用カートリッジ 3のセットを装着するだけで自動的に核酸の分析を行うことができる。核酸精製用カートリッジ 2および核酸増幅用カートリッジ 3 においても、自動的に核酸の分析を行えるように様々な工夫がなされている。このため、核酸分析装置 1、核酸精製用カートリッジ 2および核酸増幅用カートリッジ 3を用いた場合には、核酸の抽出操作および核酸の増幅操作において、カートリッジ 2, 3 を核酸分析装置 1にセットする以外に、ユーザの手操作に依存する部分がなくなる。そのため、核酸分析におけるユーザの負担が著しく軽減されるとともに、ユーザの技量差によって核酸の回収率がばらつくなどして測定再現性が悪ィ匕することもない。

[0103] 本発明は、上述した実施の形態において説明した例には限定されない。たとえば核酸抽出要素の固体マトリックスは、必ずしも保持部材の垂直軸に対して水平または略水平な状態となるように保持させる必要はなぐ固体マトリックスは必ずしも円盤状の形態に形成する必要もなぐまた保持部材に固体マトリックスを保持させる構成も固体マトリックスを突き刺す構成には限定されない。さらには、核酸増幅用カートリッジにおける蓋は、必ずしもカートリッジ本体に対して完全に分離可能なように構成する必要はなぐカートリッジ本体に付属したまま反応槽の上部開口を開閉するものであつてもよい。

[0104] 次に、本発明の第 2の実施の形態について、図 16ないし図 33を参照して説明する。ただし、以下において参照する図面には、先に説明した本発明の第 1の実施の形態と同様な要素につ、て同一の符号を付してあり、それらにつ、ての重複説明は省略するものとする。 [0105] 図 16ないし図 18に示した核酸分析装置 1' は、先に説明した核酸分析装置 1 (図 1など参照）と同様に、複数の核酸精製用カートリッジ 2' および核酸増幅用カートリッジを同一数だけ装着して使用するものであり、図 17に示したようにピペット装置 4' および核酸精製用動作機構を備えている。

[0106] 図 19に示したように、核酸精製用カートリッジ ^ は、核酸分析装置における核酸の自動精製を可能ならしめるためのものであり、核酸抽出要素 2( およびカートリッジ本体 21/ を有している。

[0107] 核酸抽出要素 2( は、試料中の核酸を担持させるためのものであり、図 20A〜図 20Cに良く表れているように、保持部材 22' および固体マトリックス 23' を有している。保持部材 22' は、筒状部 24' 、フランジ部 25' 、および挟持部 2 を有するものであり、たとえば全体が榭脂成型によって形成されている。

[0108] 筒状部 24' は、核酸抽出要素 20' を移動させるときに利用されるものであり（図 1 8および図 22参照）、凹部 24A' 、欠落部 24B' , 24C' 、および複数のリブ 24D ' を有している。凹部 24A' は、後述するピペット装置^ におけるノズル 4( の先端部 42^ (図 26Aおよび図 26B参照）あるいは核酸精製用機構の挿入ピン 50 ' (図 18参照）を嵌合させるためのものであり、円柱状に形成されている。欠落部 24 B' , 24 は、筒状部 24^ に弾性を付与するためのものであり、一対の V字状切欠 24B' および矩形貫通孔 24 を含んでいる。すなわち、欠落部 24B' , 24C' は、凹部 24A' にノズル 4( の先端部 4^ あるいは挿入ピン 50' を嵌合させたときに（図 18および図 22参照）、それらに弾性力を作用させて嵌合の確実ィ匕を図る役割を有している。複数のリブ 24びは、凹部 24A' にノズル 4( の先端部 42^ あるいは挿入ピン 50' を嵌合させたときに、それらに摩擦力を作用させて嵌合の確実ィ匕を図るためのものであり、筒状部 24' の内面において上下方向に延びるように形成されている。

[0109] フランジ部 25' は、半径方向の外方側に向けて突出した環状に形成されている。

このフランジ部 25' は、核酸抽出要素 20' を目的部位 (核酸精製用カートリッジ ^ の収容槽 27および核酸増幅用カートリッジ 3' の反応槽 34' )に保持させておくときに、目的部位に設けられた段部 27A, 36' に係止するためのものである（図 21および図 33参照）。

[0110] 挟持部 2 は、固体マトリックス 23' の端部を挟持して、保持部材 22^ に固体マトリックス 23' を一体ィ匕させるためのものであり、一対の爪 26a' により構成されている。一対の爪 26a' は、核酸の回収効率を高めるために、固体マトリックス 23' との接触面積が極力小さくなるように形成するのが好ましい。これは、固体マトリックス 23 ' には、後述するように核酸が付着させられた後にその核酸が溶離 ·回収されるのであるが、一対の爪 26a' が固体マトリックス 23' と接触する部分に存在する核酸の溶離は容易ではな、からである。

[0111] 固体マトリックス 23^ は、試料中の核酸を担持させるためのものであり、たとえば濾紙に対して核酸抽出用の試薬類を担持させたものとして構成されている。この固体マトリックス 23' は、短冊状に形成されており、挟持部 2 に端部が挟持されることによって保持部材 2^ に吊持されている。

[0112] 図 19および図 21に示したように、カートリッジ本体 21' は、先に説明した核酸精製用カートリッジ 2のカートリッジ本体 21 (図 5および図 6参照）と同様に、収容槽 27、 3 つの洗浄槽 28〜28、および試料保持槽 29を有するものである力余剰液除去槽 2

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1A (図 5および図 6参照）は省略されている。もちろん、カートリッジ本体 21/ においても、余剰液除去槽を設けてもよい。

[0113] 図 23、図 24Aおよび図 24Bに示したように、核酸増幅用カートリッジは、核酸分析装置における核酸の自動増幅および測定を可能ならしめるためのものであり、カートリッジ本体 30' および蓋 31/ を有している。

[0114] カートリッジ本体 30' は、 5つの試薬類保持槽 32' 、混合槽 33' 、および反応槽

34' を有するものであり、これらの槽 32' , 33' , 34' は、たとえば榭脂成型により一体成型されている。

[0115] 各試薬類保持槽 32' は、核酸の増幅および測定に必要な試薬類を水溶液あるいは懸濁液の状態で保持するためのものである。各試薬類保持槽 32^ は、横断面が略矩形となっている力正確には、 4つの側面 32A' の中央部が内方に向けて突出した形態となっている。すなわち、試薬類保持槽 32^ の四隅部は、 90度以下の鋭角となっている。これにより、試薬類保持槽 32' の側面 32A' に試薬類が付着したままの状態となることを抑制でき、試薬類保持槽 32' の底部に試薬類を保持させておくことができる。その結果、試薬類保持槽 32' に保持された試薬類を有効に利用できるようになり、たとえ高価な試薬を使用する場合であっても、試薬類保持槽 3^ に保持させておくべき試薬の量を少なくして製造コストを低減することが可能となる。このような効果は、試薬類保持槽 3^ の側面 32A' に溝やリブを設けることによつても得ることができる。

[0116] ここで、各試薬類保持槽 32' に保持される試薬類の種類は、採用する増幅方法および測定方法に応じて選択される。増幅方法としては、たとえば PCR法、 ICAN法、 LAMP法あるいは NASBA法を採用することができる。

[0117] 混合槽 33' は、反応槽 34' に供給する前に、試薬類保持槽 32' に保持された 2 以上の試薬類を混合して混合試薬を調整する際に利用されるものである。この混合槽 33' もまた、先に説明した試薬類保持槽 32' と同様に、四隅部の角度が 90度以下の鋭角とされている。もちろん、混合槽 33' の側面 33A' に溝やリブを設けてもよい。

[0118] 反応槽 34^ は、混合試薬および核酸抽出要素 20' を収容するためのものであるとともに、核酸抽出要素 2( に担持させた核酸と混合槽 3 において調整された混合試薬とを反応させる場を提供するものである（図 33参照)。この反応槽 34' は、筒状部 35と反応検出部 37を有しており、これらの間に段部 3 が設けられている。この段部 36^ は、核酸抽出要素 20' のフランジ部 25^ を係止させるための部分であり（図 33参照）、反応検出部 37の径を筒状部 35の径よりも小さく設定することにより設けられている。

[0119] 蓋 31' は、反応検出部 37の内部を密閉とする力否かを選択するためのものであり、反応槽 34' (筒状部 35)に対して着脱自在とされている。より具体的には、蓋 31' は、回転力を作用させることにより、筒状部 35に装着される状態と筒状部 35 (反応槽 34)力完全に分離した状態とを選択できるように構成されている。蓋 31' は、先に説明した核酸増幅用カートリッジ 3の蓋 31 (図 9参照）と同様に、円筒状の本体部 38 およびフランジ部 39を有している。ただし、核酸分析装置！/ では、ピペット装置^ のノズル 4( を利用して核酸抽出要素 20' を移動させるように構成されているため、蓋 31/ においては、先に説明した核酸増幅用カートリッジ 3の蓋 31に設けられていた保持部 36 (図 7Bおよび図 9参照）は省略されている。

[0120] 図 16および図 17に示したピペット装置^ は、核酸増幅用カートリッジでの混合液調整、混合液の反応槽 34' への移動を行うためのものである。このピペット装置 4, ίま、図 25な!ヽし図 28【こ示したよう【こ、ノズノレ 40, および取り外し咅材 41, を有している。

[0121] ノズル 40' は、液体を吸引'吐出可能であるとともに、上下方向および水平に移動可能とされており、核酸増幅用カートリッジにおける試薬類保持槽 3^ 、混合槽 33' 、反応槽 34' 、および核酸精製用カートリッジ ^ の収容槽 27に移動することができるようになされている（図 16および図 17参照）。ノズル 40' は、混合試料の調整および反応槽 34' (反応検出部 37)への混合試料の分注を行う場合には、図 25 Αおよび図 25Βに示したように先端部 42' にチップ 43力 S装着される。ノズル 40' の先端部 42^ におけるチップ 43を装着する部分には、 Oリング 42 が嵌め込まれており、先端部 4^ にチップ 43を装着したときに、先端部 4^ とチップ 43との接触部分の密着性が高められるようになされて、る。

[0122] ピペット装置^ はさらに、図 22に示したように、核酸精製用カートリッジ ^ の収容槽 27から核酸抽出要素 20' を取り出し、この核酸抽出要素 20' を、図 31に示したように、核酸増幅用カートリッジの反応槽 34^ に移動させる役割を有している。このような動作を行う場合には、図 26Aおよび図 26B〖こ示したよう〖こ、ノズル 40' の先端部 42' に核酸抽出要素 20' が装着される。

[0123] 図 27および図 28に示したように、取り外し部材 41/ は、ノズル 40' の先端部 42' に装着されたチップ 43あるいは核酸抽出要素 20' を取り外すためのものである。この取り外し部材 41/ は、ノズル 4( とは独立して上下方向に移動可能なように、ノズル 40' を外套している。すなわち、取り外し部材 41/ は、ノズル 40' の先端部 42' カゝらチップ 43あるいは核酸抽出要素 20' を取り外す動作を行うとき以外は、チップ 4 3の端面 43aあるいは核酸抽出要素 20' のフランジ部 2 よりも上方 (待機位置）に位置する一方で、それらを取り外す動作を行うときには、ノズル 40' に対して相対的に下方に移動させられる。取り外し部材 41' を待機位置から下方に一定距離以上移動させた場合には、取り外し部材 41/ の端面 41A' がチップ 43の端面 43aあるいは核酸抽出要素 2( のフランジ部 25' に干渉してチップ 43あるいは核酸抽出要素 20' に下方に向けた力が作用させられる。これにより、ノズル 40' の先端部 42^ 力もチップ 43あるいは核酸抽出要素 20' が取り外される。

[0124] 図 16ないし図 18に示したように、核酸精製用動作機構は、核酸抽出要素 2( を利用して試料中の核酸を抽出する際に、核酸抽出要素 20' の動作を制御するためのものである。この核酸精製用動作機構は、先に説明した核酸分析装置 1の核酸精製用動作機構 5 (図 2〜図 4参照)と同様に、複数の挿入ピン 50' 、筒状体 5 1および支持フレーム 52を有している。ただし、各挿入ピン 5( は、核酸抽出要素 2 0' の筒状部 24^ に適切に嵌合できるように、ノズル 4( の先端部 42^ と類似した形状とされている。

[0125] 次に、核酸分析装置における動作を説明する。

[0126] 核酸分析装置では、図 16ないし図 18に示したように、核酸分析装置に核酸精製用カートリッジ ^ および核酸増幅用カートリッジをセットした上で、カートリッジ 2' , 3' の個数および種類 (精製方法、増幅方法、測定方法）に応じた設定を行うことにより自動的に核酸の精製、増幅および測定が行われる。

[0127] 核酸の精製は、図 18に示したように、核酸精製用カートリッジ ^ において、核酸精製用動作機構によって核酸抽出要素 20' を移動させること〖こより行われる。より具体的には、まず、核酸精製用動作機構 5' の複数の挿入ピン 50' を、対応する核酸抽出要素 20' の筒状部 24' に嵌合させ、複数の核酸抽出要素 20' を一体化的に移動可能な状態とする。この状態において、核酸精製用動作機構 5' によって複数の核酸抽出要素 20' の固体マトリックス 23' を試料に浸漬させて各固体マトリックス 2 に試料中の核酸を付着させる。

[0128] 最後に、 3つの洗浄槽 28〜28 (図 19参照）の洗浄液に、固体マトリックス 23' を

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順次浸漬する。より具体的には、固体マトリックス 2 の洗浄は、核酸精製用動作機構 5' によって、各洗浄槽 28〜28 (図 19参照）において固体マトリックス 23' を繰

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り返し上下動させることにより行われる。このとき、核酸精製用動作機構は、固体マトリックス 23' が洗浄液に完全に浸漬する状態と、固体マトリックス 23' が洗浄液の液面よりも上方に位置する状態とが繰り返えされるように制御される。このような洗浄方法では、固体マトリックス 2 からは、夾雑物を効率良く除去することができるため、後において行われる核酸の増幅工程において夾雑物が核酸の増幅を阻害することを効果的に抑制し、核酸の分析を精度良く行えるようになる。

[0129] なお、洗浄の終了した固体マトリクス 23' は、核酸精製用動作機構に保持された状態で送風乾燥させてもよい。固体マトリックス 2 の洗浄が終了（場合によって送風乾燥が終了）した場合には、挿入ピン 50' から核酸抽出要素 2( を取り外し、核酸抽出要素 20' を核酸精製用カートリッジ 2' の収容槽 27に再収容させる（図 19 および図 21参照）。

[0130] 核酸精製用カートリッジ ^ においては、目的核酸を固体 (核酸抽出要素 20' )に担持させることによって、目的核酸を核酸分析装置において容易に移動させることができる。この点において、核酸精製用カートリッジ ^ は、核酸分析を自動で行うことに寄与しているといえる。

[0131] 核酸の増幅は、核酸増幅用カートリッジにおいて混合試薬を調製し、それを核酸増幅用カートリッジの反応槽 34^ に分注した後、核酸を担持させた固体マトリックス 23^ を、保持部材 22^ とともに反応槽 34^ に移送させることにより行われる。なお、図 33に示したように、反応槽 34' において混合試薬と固体マトリックス 23' が共存させられた場合には、採用する増幅方法の種類に応じて、ヒートブロック 70の温度を制御して反応槽 34' の温調が行われる。

[0132] 混合試薬の調製および反応槽 34' に対する混合試薬の分注は、先に説明した核酸分析装置 1 (図 1など参照）と同様にピペット装置 4' の動作を制御することにより行われる。なお、反応槽 34^ に混合試薬を分注する場合には、図 31に示したように、蓋着脱機構 6によって反応槽 34' から蓋 3 を取り外しておく必要がある力そのような蓋 31' の取り外しは、図 29および図 30に示したように、蓋着脱機構 6の回転部材 60を蓋 31' の凹部 38B' に挿入した後に、回転部材 60を回転させつつ上動させることにより行われる。回転部材 60を凹部 38B' に挿入した場合には、回転部材 60の爪 62が蓋 31/ のフランジ部 39' 〖こ係止されるので反応槽 34' 力取り外された蓋 31/ は、回転部材 60とともに移動させることができる。このように、核酸分析装置！/ および核酸増幅用カートリッジにおいては、核酸の増幅ひいては核酸分祈の全自動化を達成するために、核酸増幅用カートリッジ 3' から蓋 31' を容易かつ確実に取り外せるように工夫がなされて!/ヽる。

[0133] 一方、固体マトリックス 23^ の反応槽 34^ への移送は、核酸精製用カートリッジ 2 ' の収容槽 27からの核酸抽出要素 20' の取り出し（図 22参照）、核酸増幅用カートリッジの反応層 34' への核酸抽出要素 2( の移動、およびノズル 4( 力もの核酸抽出要素の取り外し（図 28および図 31参照）といった一連の操作によって行われる。

[0134] 核酸抽出要素 2( の取り出しは、図 22に示したように、核酸精製用カートリッジ 2 ' における収容槽 27の直上〖こノズル 40' を位置させた後にノズル 4〇z を下動させてノズル 4( の先端部 4^ を核酸抽出要素 2( の筒状部 24' に嵌合させた後に、ノズル 40' を上動させることにより行われる。ここで、筒状部 24^ には、 V字状切欠 24B' および矩形貫通孔 24 といった欠落部 24B' , 24 が形成されている（図 20A〜図 20C参照)。そのため、筒状部 24' にノズル 4( の先端部 42^ を嵌合させた場合には、先端部 4^ に対して適切な弾性力を付与することができる。これにより、核酸抽出要素 20' は、筒状部 24' において、ノズル 40' の先端部 42' に対して適切に保持される。

[0135] 核酸抽出要素 20' の移動は、ノズル 40' の先端部 42' に核酸抽出要素 20' を保持させた状態において、ノズル 40' を移動させることにより行われる。

[0136] 核酸抽出要素 2( の取り外しは、図 28および図 31に示したように、核酸抽出要素 20' とともにノズル 4( の先端部 42^ を反応槽 34^ の内部に位置させ、取り外し部材 41/ をノズル 40' に対して相対的に下方に移動させることにより行われる。すなわち、取り外し部材 4 を下方に移動させた場合には、核酸抽出要素 2( のフランジ部 25' に取り外し部材 41/ が干渉し、フランジ部 25^ ひいては核酸抽出要素 20' に対して下方に向けた力が作用してノズル 4( の先端部 42^ 力も核酸抽出要素 20' が取り外される。

[0137] このように、核酸分析装置！/ では、試料の調整に必要なノズル 4( および取り外し部材 4 を利用して核酸抽出要素 20' の移動を行えるようになされている。そのため、核酸の精製および核酸の増幅を 1つの装置において行うに当たって、本来必要な構成 (ピペット装置 4)を利用してヽるために、装置が複雑化することが抑制される。また、制御すべき動作機構の数の増加を抑制することができるようになるため、この点においても装置構成の複雑ィ匕および大型化を抑制する上で有利である。

[0138] 図 31に示したように、ノズル 4( の先端部 42^ 力も取り外された核酸抽出要素 20 ' は、保持部材 22^ のフランジ部 25' において、反応槽 34^ の段部 36^ に係止される。このとき、固体マトリックス 2 は、その下端が反応検出部 37の底部から一定距離離間した状態において反応検出部 37に収容される。反応検出部 37には、先に混合試薬が収容されているので、反応検出部 37においては、固体マトリックス 23 ' の全体が浸漬される。これにより、固体マトリックス 2 から核酸が溶出する一方で、溶出した核酸が試薬類と反応して増幅する。

[0139] 上述したように、固体マトリックス 23' の下端は、反応検出部 37の底部力も離間した状態となっている。より具体的には、固体マトリックス 23' の下端位置は、測光機構 8により反応検出部 37への励起光の照射および蛍光の測定を阻害しない位置とされる（図 33参照)。これにより、核酸を付着させるのに固体担体を使用する場合であつても、その固体担体が核酸の測定において、それを阻害することはない。

[0140] 核酸の測定は、図 32および図 33に示したように、反応槽 34' の蓋 31/ を再装着した状態とする一方で、反応槽 34' の上方を遮光部材 9によって覆った状態とした後において、測光機構 8によって行われる。測光機構 8により核酸の測定は、先に説明した核酸分析装置 1 (図 1など参照）と同様にして行われる。

[0141] 以上に説明したように、核酸分析装置 1' においても、先に説明した核酸分析装置 1 (図 1など参照）と同様に、上述した構成の核酸精製用カートリッジ ^ および核酸増幅用カートリッジをセットするだけで自動的に核酸の分析を行うことができ、核酸の抽出操作および核酸の増幅操作において、カートリッジ 2' , 3' を核酸分析装置 1にセットする以外に、ユーザの手操作に依存する部分がなくなる。そのため、核酸分析におけるユーザの負担が著しく軽減されるとともに、ユーザの技量差によって核酸の回収率がばらつくなどして測定再現性が悪ィ匕することもない。

[0142] [実施例] 以下においては、上述した本発明の第 1の実施の形態に係る核酸精製用カートリツジ、核酸増幅用カートリッジおよび核酸分析装置を利用して、目的核酸としてのヒトゲノム DNAを、適切に精製.増幅させることができるか否力 SNP (Single Nucleotide Pol ymorphism)タイピングによりを検討した。

実施例 1

[0143] (核酸精製用カートリッジの形成）

核酸精製用カートリッジは、カートリッジ本体（図中の符号 21参照）および核酸抽出要素（図中の符号 20参照）を次に説明する方法により形成した後に、カートリッジ本体の収容槽 (図中の符号 27参照）に核酸抽出要素を収容させ、かつ余剰液除去槽（図中の符号 21A参照）に吸水性部材（図中の符号 21Ad, 21 Ae参照）としての発泡榭脂（ (株)イノアツクコーポレイシヨン製、発泡ウレタン SAQ)を固定することにより形成した。吸水性部材 21Adの寸法は 5mmX 8mm X 17mmとし、吸水性部材 21Ae の寸法は 5mm X 1 lmm X 14mmとした。

[0144] カートリッジ本体は、 PETを用いた榭脂成型により図 5および図 6に示す形態に形成した。

[0145] 一方、核酸抽出要素は、保持部材（図中の符号 22参照）に固体マトリックス（図中の符号 23参照）を保持させることにより形成した。固体マトリックスは、 FTA Classic Ca rd (Whatman社、 Cat. No. WB120205)を、パンチを用いて φ 2. 5mmの円盤状に打ち抜くことにより形成した。ここで、 FTA Classic Cardは、セルロースを主成分とする核酸収集用濾紙である。一方。保持部材は、 PETを用いた榭脂成型により図 7Aおよび図 7Bに示す形態に形成した。ただし、榭脂成型直後の保持部材においては、係止片（図中の符号 26C参照）は形成されておらず、係止片は、固体マトリックスの中心に穴を開けて保持部材のピン状部（図中の符号 26B参照）に差し込んだ後に、ピン状部の先端部を熱処理することにより形成した。係止片は、上述のようにピン状部力もの固体マトリックスの抜け落ちを防止するためのものである。

[0146] (核酸増幅用カートリッジの形成）

核酸精製用カートリッジは、カートリッジ本体（図中の符号 30参照）および蓋（図中の符号 31参照）を、 PETを用いた榭脂形成により図 8および図 9に示した形態に形成した後に、カートリッジ本体の反応槽（図中の符号 34参照）に蓋を螺号することにより形成した。

[0147] (核酸の精製）

核酸の精製は、核酸精製用カートリッジ本体の試料保持槽 (図中の符号 29参照）に試料（図中の符号 29L参照）を、 3つの洗浄槽（図中の符号 28〜28参照）に洗浄

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液（図中の符号 28L〜28L参照）をそれぞれ分注した上で、核酸分析装置（図中の

1 3

符号 1参照）に核酸精製用カートリッジをセットし、核酸分析装置において自動的に行った。

[0148] 試料としては、全血 (抗凝固剤：へパリン Na含有)を用い、その分注量は 120 とした。洗浄液 28Lとしては下記表 1に示す洗浄液 1 (800 L)を用い、洗浄液 28Lと

1 2 しては下記表 1に示す洗浄液 1 (600 L)を用い、洗浄液 28Lとしては下記表 1に示

3

す洗浄液 II (600 μ L)を用いた。

[0149] [表 1]

[0150] 一方、核酸分析装置においては、核酸抽出要素（固体マトリックス）が次に説明する動作を行うように核酸精製用動作機構 (図中の符号 5参照)を駆動させた。

[0151] まず、核酸動作機構における挿入ピン (図中の符号 50参照)を保持部材の筒状部

(図中の符号 24参照）に嵌合させた状態とし、固体マトリックスを試料保持槽中の全血に浸漬させた。次いで、 3つの洗浄槽 28〜28を利用して固体マトリックスを洗浄

1 3

した。固体マトリックスの洗浄は、使用する洗浄槽 28〜28を洗浄槽 28→洗浄槽 28

1 3 1

→洗浄槽 28の順で順次変えつつ行った。洗浄槽 28を利用した固体マトリックスの

2 3 1

洗浄は、固体マトリックス 23の全体が洗浄液 28Lの液面よりも上方に位置する状態

1

と 28Lに完全に浸漬する位置との間の 20Hzで 1分間上下動させることにより行った

1

。一方、洗浄槽 28 , 28を利用した固体マトリックスの洗浄においては、上下動させる

2 3

時間を 2分間とした以外は、洗浄槽 28を利用する場合と同様にして行った。

1

[0152] 次いで、後に行う核酸増幅反応を阻害する可能性のある余剰な成分の除去を行つた。余剰な成分の除去は、固体マトリックスおよび保持部材の先端部分 (係止片、ピン状部、テーパ部（図中の符号 26参照）を吸水性部材（図中の符号 21Ad, 21Ae参照）に押し付けることにより行った。

[0153] (核酸の増幅確認）

核酸の増幅は、下記表 2の試薬混合液 A, Bを用いた PCR法により行い、核酸の増幅の程度は、薬剤代謝酵素をコードする塩基配列である CYP2C19 * 2 * 3の SNP

(Single Nucleotide Polymorphism)タイピングにより確認した。

[0154] [表 2]

配列番号 1： gttttctcttagatatgcaataattttccca

配列香号 2： cgagggttgttgatgtccatc

酉己歹 'J番号 3： gaaaaattgaatgaaaacatcaggattgta

酉己列番号 4 : gtacttcagggcttggtcaata

配列番号 5： ttatgggttcccgggaaataatc- (BOD I PY-FL)

配列番号 6 : gcaccccctggatcc- (TAMRA)

[0155] より具体的には、核酸の増幅確認は、試薬混合液 Aまたは試薬混合液 Bを核酸増幅用カートリッジ本体の試薬類保持槽（図中の符号 32 , 32参照）に個別に分注した

1 2

上で、核酸分析装置（図中の符号 1参照）に核酸増幅用カートリッジをセットし、核酸分析装置にお!、て自動的に行った。

[0156] 核酸分析装置においては、核酸抽出要素（固体マトリックス)を次に説明する動作を行うようにピペット装置（図中の符号 4)、蓋着脱機構 (図中の符号 6参照)および温調機構 (図中の符号 7)を駆動させた。

[0157] まず、ピペット装置のノズル（図中の符号 40)にチップ（図中の符号 43)を装着させた上で、試薬類保持槽 33Aから試薬混合液 Aを 30 L、試薬類保持槽 33Bから試薬混合液 Bを 30 L採取して混合槽 (図中の符号 33参照)分注した。次いで、ノズルの吸排活動により試薬混合液 A, Bの攪拌'混合を行って反応液を調製した後、ノズルによって反応液を 50 L採取して、それを反応槽（図中の符号 34参照）に分注した。

[0158] その一方で、蓋着脱機構の回転部材（図中の符号 60参照）により核酸増幅用カートリッジから蓋（図中の 31参照）を取り外した上で、蓋を移動させて蓋の係止爪（図中の符号 36A参照）を核酸抽出要素の係止ヘッド（図中の符号 24B参照）に係合させ、それらを一体化させた。

[0159] 次いで、蓋着脱機構により蓋とともに核酸抽出要素 20を核酸増幅カートリッジの反応槽（図中の符号 34参照）に収容させつつ、回転部材が回転させることで反応槽を蓋により閉鎖した。これにより、固体マトリックスは、反応液に完全に浸漬された状態で反応槽 (図中 34)に密閉保持された。

[0160] 次いで、温調機構のヒートブロック（図中の符号 70参照）を駆動させて、反応槽における反応液の温度を変化させて目的核酸の増幅を行った。温度変化は、 95°Cで 12 0秒→ (95°Cで 4秒 + 54°Cで 60秒）を 50サイクル→95°Cで 60秒→45°Cで 90秒とした。

[0161] SNPタイピングにおいては、 Tm解析を採用した。 Tm解析に当たっては、核酸の増幅させた反応液の温度を 45°Cから 95まで 1°CZ3秒の割合で上昇させて、き、そのときの蛍光強度をリアルタイムで測定した。測定波長は515〜55511111 ( * 2)、 585 〜750nm ( * 3)の 2種類とし、それぞれの測定波長（（ * 2) , ( * 3) )につ!/、て SNP タイピングを行った。それぞれの波長にお、て蛍光強度を測定した結果につ!、ては、横軸を温度、縦軸を蛍光強度の微分値 (変化率)として図 34に示した。 [0162] 図 34から分かるように、測定波長 * 2および * 3のいずれの場合であっても、測定される蛍光強度の微分値 (変化率)の変化曲線には、 2つのピークが現れている。これらのピークは、 SNPタイプ野生型と変異型に対応するものであり、それらを区別できる程度に目的核酸が十分に増幅されていることが確認できる。

実施例 2

[0163] 本実施例においては、実施例 1と同様にして核酸の精製を行った後、増幅法として ICNA法を採用して SNPタイピングを行った。増幅試薬として TaKaRa社製 Cycleav e ICAN human ALDH2 Typing Kit (Cat. No. CY101)を使用し、カートリッジ本体の試薬類保持槽（図中の符号 32， 32参照）に保持させるべき試薬混合液 A, Bの組成

1 2

は表 3に示した通りとした。それらの試薬混合液 A, Bの分注量、混合条件および反応液の分注量は実施例 1の場合と同様とした。

[0164] [表 3]

[0165] (反応条件）

反応は、反応液に固体マトリックスを浸漬させた状態において、 70°Cで 300秒インキュペートした後に 60°Cで一時間行った。この一時間の反応は、蛍光強度の測定を行わない第 1ステップ 30秒および蛍光強度の測定を行う第 2ステップ 30秒を 1サイクルとする 60サイクル力なり、蛍光強度は各サイクルの第 2ステップにおいてリアルタィムで測定した。測定波長は 515〜555nm (mt)、 585〜750nm (wt)の 2種類とし、 SNPタイプ変異型および野生型のそれぞれについて SNPタイピングを行った。それぞれの波長において蛍光強度を測定した結果については、横軸をサイクル数、縦軸を蛍光強度として図 35に示した。

[0166] 図 35から分力るように、一定のサイクル数が経過した後においては SNPタイプ変異型に対応する蛍光強度が増加して!/、る一方で、 SNPタイプ野生型に対応する蛍光強度についてはサイクル数を増カロさせても殆ど蛍光強度が増加していない。したがつて、図 35に示した結果からは、 SNPタイプ野生型と変異型を区別できる程度に目的核酸 (SNPタイプ野生型）が選択的かつ十分に増幅されて、ることが確認できる。実施例 3

[0167] 本実施例においては、実施例 1と同様にして核酸の精製を行った後、増幅法として LAMP法を採用して SNPタイピングを行った。増幅試薬としては栄研ィ匕学社製 Loo pamp P450タイピング試薬キット（CYP2C9*3)を使用し、カートリッジ本体の試薬類保持槽（図中の符号 33A, 33B参照）に保持させるべき試薬混合液 A， Bの組成は表 3 に示した通りとした。それらの試薬混合液 A, Bの分注量、混合条件および反応液の分注量は実施例 1の場合と同様とした。

[0168] [表 4]

[0169] (反応条件）

反応は、反応液に固体マトリックスを浸漬させた状態において、 95°Cで 5分処理した後に 60°Cで一時間反応させた。この一時間の反応は、蛍光強度の測定を行わない第 1ステップ 30秒および蛍光強度の測定を行う第 2ステップ 30秒を 1サイクルとする 60サイクル力もなり、蛍光強度は各サイクルの第 2ステップにおいて、測定波長を 5 15〜555nmとしてリアルタイムで測定した。各サイクルの第 2ステップにおいて蛍光強度を測定した結果については、横軸をサイクル数、縦軸を蛍光強度として図 36に示した。

[0170] 図 36から分かるように、一定のサイクル数が経過した後においては SNPタイプ変異型に対応する蛍光強度（図中の Aアレル）が増加して、る一方で、 SNPタイプ野生型に対応する蛍光強度（図中の Gアレル）につ、てはサイクル数を増カロさせても殆ど蛍光強度が増加していない。したがって、図 36に示した結果からは、 SNPタイプ野生型と変異型を区別できる程度に目的核酸 (SNPタイプ野生型）が選択的かつ十分に増幅されてヽることが確認できる。

[0171] 実施例 1〜3の結果力分力るように、本発明の第 1の実施の形態において説明した核酸抽出要素を用いて核酸の精製を行った場合に、 PCR法に限定されず、増幅方法として ICAN法あるいは LAMP法を採用した場合であっても、適切に目的核酸を増幅させることができる。上述のように、 ICAN法および LAMP法は、目的核酸の精製度が高くな、場合には、十分な増幅反応を起こさせることができな、のである。そのため、本発明の第 1の実施の形態において説明した精製方法は、目的核酸を適切に精製できるものであるといえる。したがって、上述の精製方法は、 PCR法ばかりでなぐそれ以外の増幅方法の前処理として適切に適用することができ、また増幅時間の短縮ィ匕に寄与できるといえる。

[0172] また、実施例 1〜3では、本発明の第 1の実施の形態において説明した核酸精製用カートリッジ、核酸抽出用カートリッジおよび核酸分析装置を用いることにより、核酸の分析を自動で行えることが確認された。この場合において、核酸増幅方法としては、 PCR法に限らず、 PCR法を初めとする公知の種々の増幅方法を採用できることも確 f*i¾ れ。

[0173] なお、実施例 1〜3においては、本発明の第 1の実施の形態において説明した例に基づ、て核酸が適切に増幅されて!、るかにっ、て検討した力本発明の第 2の実施の形態において説明した構成を採用した場合であっても核酸を適切に増幅でき、上述した効果を享受できるものと考えられる。

Claims

請求の範囲

[1] 試料から目的核酸を抽出し、かつ抽出した核酸を担持させるための核酸抽出要素と、

上記核酸抽出要素とは別体として形成され、かつ上記核酸抽出要素を収容しておくための収容槽を有する容器本体と、

を備えている、核酸抽出用容器。

[2] 上記核酸抽出要素は、目的核酸を担持させるための固体マトリックスと、この固体マトリックスを保持するための保持部材と、を有している、請求項 1に記載の核酸抽出用谷器。

[3] 上記固体マトリックスは、上記保持部材の垂直軸に対して傾斜した状態で保持されている、請求項 2に記載の核酸抽出用容器。

[4] 上記固体マトリックスは、上記垂直軸に対して水平または略水平に支持されている

、請求項 3に記載の核酸抽出用容器。

[5] 上記固体マトリックスは、上記保持部材に突き刺された状態で上記保持部材に支持されている、請求項 3に記載の核酸抽出用容器。

[6] 上記保持部材は、端部に向力うほど縮径するテーパ部と、上記テーパ部から延出するとともに、上記固体マトリックスに貫通させるためのピン状部と、上記固体マトリツタスが上記ピン状部力も離脱するのを抑制するための係止片と、を有している、請求項 5に記載の核酸抽出用容器。

[7] 上記固体マトリックスは、円盤状に形成されている、請求項 3に記載の核酸抽出用谷器。

[8] 上記固体マトリックスは、シート状に形成されており、かつ上記保持部材に対して吊持された状態で保持されている、請求項 2に記載の核酸抽出用容器。

[9] 上記保持部材は、上記固体マトリックスの端部を挟持して上記固体マトリックスを吊持するための挟持部を有している、請求項 8に記載の核酸抽出用容器。

[10] 上記容器本体は、上記固体マトリックスに付着した余剰な成分を除去するのに必要な洗浄液を保持するための 1以上の洗浄槽を有してヽる、請求項 2に記載の核酸抽出用容器。

[11] 上記容器本体には、上記固体マトリックスまたはその周囲に付着した余剰な洗浄液を除去するための余剰洗浄液除去手段が設けられている、請求項 10に記載の核酸抽出用容器。

[12] 上記余剰洗浄液除去手段は、吸水性部材を含んで、る、請求項 11に記載の核酸抽出用容器。

[13] 核酸分析装置にセットして使用するカートリッジとして構成されている、請求項 1に記載の核酸抽出用容器。

[14] 上記核酸分析装置が、上記収容槽から目的核酸を担持させた核酸抽出要素を取り出して、当該核酸抽出要素を他の部位に移送するための移送部材を備えている場合において、

上記核酸抽出要素は、上記移送部材に係合させるための係合部を有している、請求項 13に記載の核酸抽出用容器。

[15] 上記係合部は、上記移送部材の先端部を嵌合させるために筒状に形成されている

、請求項 14に記載の核酸抽出用容器。

[16] 上記係合部は、上記移送部材の先端部を嵌合させたときに、上記移送部材に弾性力を作用させることを可能とするための 1以上の欠落部を有している、請求項 15に記載の核酸抽出用容器。

[17] 上記 1以上の欠落部は、スリット、切欠および貫通孔のうちの少なくとも 1つを含んでいる、請求項 16に記載の核酸抽出用容器。

[18] 上記保持部材は、上記移送部材と上記係合部との嵌合状態を解除するために利用される突出部を有している、請求項 14に記載の核酸抽出用容器。

[19] 上記突出部は、外方側に向けて突出したフランジである、請求項 18に記載の核酸抽出用容器。

[20] 上記収容槽は、当該収容槽に上記核酸抽出要素を収容したときに、上記突出部を係止するための段部を有している、請求項 18に記載の核酸抽出用容器。

[21] 目的核酸を担持させた固体マトリックスから、洗浄液を用いて目的核酸以外の余剰な成分を除去する方法であって、

洗浄液に対して上記固体マトリックスを相対的に上下方向に移動させることによつて、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬される状態と、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬されない状態と、を繰り返す、固体マトリックスの洗浄方法。

[22] 上記固体マトリックスが洗浄液に浸漬される状態と浸漬されない状態との繰り返しは

、上下方向に対して上記固体マトリックスを傾斜させた状態で行われる、請求項 21に記載の固体マトリックスの洗浄方法。

[23] 上記固体マトリックスが洗浄液に浸漬される状態と浸漬されない状態との繰り返しは

、上記方向に対して上記固体マトリックスを水平または略水平な状態として行われる、請求項 22に記載の固体マトリックスの洗浄方法。

[24] 上記洗浄液に対する浸漬が終了した後に、上記固体マトリックスに付着した余剰な洗浄液を吸水性部材により除去する、請求項 21に記載の固体マトリックスの洗浄方法。

[25] 目的核酸を担持させるための固体マトリックスと、この固体マトリックスを保持するための保持部材と、を有する核酸抽出要素を用いて目的核酸を精製する方法であって上記固体マトリックスに対して試料を含浸させて試料中の目的核酸を上記固体マトリックスに担持させる核酸担持ステップと、

上記固体マトリックスに付着した目的核酸以外の余剰な成分を、洗浄液を用いて除去する洗浄ステップと、を含み、かつ、

上記洗浄ステップは、洗浄液に対して上記核酸抽出要素を相対的に上下方向に移動させること〖こよって、上記核酸抽出要素が上記洗浄液に浸漬される状態と、上記核酸抽出要素が上記洗浄液に浸漬されない状態と、を繰り返すことにより行われる、核酸精製方法。

[26] 上記核酸抽出要素として、上記保持部材の垂直軸に対して傾斜した状態で上記保持部材に上記固体マトリックスを保持させたものを用い、かつ、

上記洗浄ステップは、上下方向に対して上記固体マトリックスを傾斜させた状態で、上記抽出要素を上下方向に移動させることにより行われる、請求項 25に記載の核酸精製方法。

[27] 上記洗浄ステップは、上下方向に対して上記固体マトリックスを直交または略直交させた姿勢で、上記核酸抽出要素を上下方向に移動させることにより行われる、請求項 26に記載の核酸精製方法。

[28] 上記洗浄ステップは、上記洗浄液に対する上記固体マトリックスの繰り返しの浸漬が終了した後に、上記固体マトリックスに付着した余剰な洗浄液を吸水性部材により除去する作業を含んでいる、請求項 25に記載の核酸精製方法。

[29] 目的核酸を担持させた固体マトリックスから、洗浄液を用いて目的核酸以外の余剰な成分を除去するための機構であって、

上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬される状態と、上記固体マトリックスが上記洗浄液に浸漬されない状態と、が繰り返されるように、洗浄液に対して固体マトリツタスを相対的に上下方向に移動させるように構成されて、る、固体マトリックスの洗浄機構。

[30] 上記固体マトリックスを上下方向に対して傾斜させた状態で、上記固体マトリックスを上下方向に移動させるように構成されて、る、請求項 29に記載の固体マトリックスの洗浄機構。

[31] 上記固体マトリックスを上下方向に対して直交または略直交させた姿勢で、上記固体マトリックスを上下方向に移動させるように構成されて、る、請求項 30に記載の固体マトリックスの洗浄機構。