WO2005113767A1 - ダイオキシン類等応答性プラスミド、ダイオキシン類等測定用遺伝子導入細胞、並びにそれを用いたダイオキシン類等検出方法及びバイオセンサー - Google Patents

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Masanori Kitamura
Shuichiro Maeda
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    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
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    • C12N15/1086—Preparation or screening of expression libraries, e.g. reporter assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for controlling endocrine disrupting substances such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbons and some carcinogens via an aromatic hydrocarbon receptor (hereinafter, AhR) which is an intracellular receptor.
  • AhR aromatic hydrocarbon receptor
  • the present invention relates to a simple, quick and highly sensitive detection method or quantification method for harmful chemical substances based on action, a detection substance, and a biosensor for detecting dioxins.
  • Dioxins cause various harmful effects in a very small amount. Therefore, establishment of a method to detect dioxins in a sensitive and rapid manner is considered an urgent issue in order to accurately evaluate exposure to dioxins and prevent health problems. Another major challenge is the overall and quantitative evaluation of the biological toxicity of polycyclic aromatic hydrocarbons, which are as harmful substances in the environment as dioxins, and tobacco smoke containing these in complex.
  • Representative methods for detecting dioxins and the like in the environment include the use of endogenous biomarkers, for example, cytochrome P-4501A1, which is a drug metabolizing enzyme, bioassay using cultured cells, and enzyme immunoassay. And methods using chromatography.
  • bioassays using genetic engineering technology have attracted attention in recent years because of their simplicity and high sensitivity.
  • Such a genetically engineered bioassay is composed of several basic units.
  • the two powerful basic units are (1) cells and (2) the genetic structure to be incorporated into cells.
  • the powerful gene structure further includes a dioxin-responsive DNA sequence, which is a DNA sequence that functions as a dioxin sensor, and a marker protein that defines the marker protein. It is made up of the gene.
  • dioxins and the like When such transfected cells are exposed to a sample containing dioxins and the like, dioxins and the like first bind to intracellular AhR, and furthermore, coactivator (hereinafter, Arnt), which is a transcription promotion coupling factor. Forms a complex with the DNA, and the complex activates the dioxin-responsive DNA sequence as a transcription factor. As a result, the expression of the marker protein gene downstream of the gene sequence is promoted.
  • Arnt coactivator
  • marker protein genes enzyme genes such as chloramphene-col 'acylribosyl'transferase, j8-galactosidase, luciferase, and the like, and a green fluorescent protein gene have been used.
  • Non-patent literature 1 P.A.Bennisch, K. Hosoe, S. 3 ⁇ 4akai, Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin— like compounds: a review of bioassay / biomarker technology, Environ. Int. 27 (2001) 413—439.
  • Non-Patent Document 2 Japanese Patent Application No. 2004-135662, "Transformant for measuring dioxins and method for detecting, quantitatively analyzing and screening dioxins using the same" DISCLOSURE OF THE INVENTION Problems the invention is trying to solve
  • the present invention provides (1) simplified bioassay process, (2) improved detection sensitivity, and (3) improved bioassay for dioxins detection using conventional luciferase or green fluorescent protein.
  • the objectives are to significantly reduce bioassay time, and (4) to reduce costs such as culturing costs and personnel costs.
  • the present invention provides a method for preparing a dioxin and Z or a polycyclic aromatic hydrocarbon, which is activated in response to a dioxin or a Z or polycyclic aromatic hydrocarbon.
  • the secretory marker protein gene is preferably a secretory alkaline phosphatase gene.
  • the dioxins and Z or the polycyclic aromatic hydrocarbon-responsive plasmid described above are introduced into cultured cells that highly express an aromatic hydrocarbon receptor, and the aromatic hydrocarbon receptor is It is a gene-introduced cell for measuring dioxins and z or polycyclic aromatic hydrocarbons, which binds to dioxins and Z or polycyclic aromatic hydrocarbons to produce secretory proteins.
  • culturing the cells with high expression of the aromatic hydrocarbon receptor it is preferably a Hep a -lcl C 7.
  • the present invention provides a neurosensor using the above-described transgenic cell for measuring dioxins and Z or polycyclic aromatic hydrocarbons as a sensor for detecting dioxins and Z or polycyclic aromatic hydrocarbons. is there.
  • the present invention provides a dioxin and a dioxin and a Z or polycyclic aromatic hydrocarbon-sensitive gene sequence activated in response to Z or a polycyclic aromatic hydrocarbon, and a downstream of the gene sequence.
  • Dioxins and Z or Z or polycyclic aromatic hydrocarbons prepared by introducing a dioxin or Z or polycyclic aromatic hydrocarbon responsive plasmid incorporating a secretory marker protein gene into cells that highly express aromatic hydrocarbon receptors.
  • the secretory marker protein is a secretory alkaline phosphatase.
  • the cell is Hepa-lclc7.
  • the present invention provides a dioxin and a dioxin and a Z or polycyclic aromatic hydrocarbon-sensitive gene sequence activated in response to Z or a polycyclic aromatic hydrocarbon, and a downstream of the gene sequence.
  • the biotoxicity of tobacco smoke is evaluated by exposing the transgenic cells for measuring hydrocarbons to tobacco smoke and quantifying the activity of a secretory marker protein secreted by the transgenic cells. Is a quantitative evaluation method.
  • the secretory marker protein is a secretory alkaline phosphatase.
  • dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbons can be easily measured by simple chemiluminescence measurement or the like.
  • the dioxin measurement process up to the measurement of cell seeding power can be completed in several hours, and according to the present invention, low-cost and highly sensitive measurement of dioxins and Z or polycyclic aromatic hydrocarbons can be performed. Can be.
  • the present invention is an excellent invention capable of detecting dioxins and / or polycyclic aromatic hydrocarbons contained in the atmosphere, rivers, soils, foods, and living equipment.
  • FIG. 1 shows plasmids reactive with dioxins and Z or polycyclic aromatic hydrocarbons.
  • FIG. 2 shows a structural diagram of pDRE-SEAPIO.
  • pDRE-SEAPlO contains a dioxin-responsive DNA sequence (DRE) in a part of the mouse breast cancer virus promoter (MM TV).
  • DRE dioxin-responsive DNA sequence
  • MMTV-DRE11 Dioxin-sensitive DNA sequence
  • SEAP secreted alkaline phosphatase gene 12 located downstream of it, and a polyadenylation signal derived from salvirus 40 (SV40) (Hereinafter referred to as poly A13).
  • DRE dioxin-responsive DNA sequence
  • SEAP secreted alkaline phosphatase
  • MMTV-DRE in which DRE was incorporated into a part of MMTV was used as a sensor DNA sequence for sensing dioxins. . This established a highly sensitive Atsushi system.
  • MMTV-DRE11 is known to be activated in response to dioxins, and is obtained by incorporating four DREs into a part of the MMTV promoter. It has a stronger response to dioxins than DRE alone.
  • FIG. 2 shows the results of a comparative study of the sensor capabilities of MMTV-DRE and DRE.
  • SEAP reporter plasmids having only MMTV-DRE and DRE as sensor sequences were prepared, and these were each transfected into H-marked a- lclc7 cells. The details of gene transfer will be described later. These cells were then stimulated with TCDD and compared for increased SEAP activity. In cells transfected with a SEAP reporter plasmid containing only DRE as a sensor sequence, stimulation of TCDD increased SEAP activity 4.5-fold.
  • Hepalclc7-DRE-SEAP cells hereinafter referred to as HeDS cells
  • the SEAP activity increased 43.2-fold by TCDD stimulation.
  • TCDD did not increase SEAP activity. This means that the sequence power of MMTV strongly amplifies the response of DRE to dioxin.
  • the high reactivity of MMTV-DRE allows for quick and low cost of Atssey.
  • Example 1 SEAP was used as a marker protein.
  • SEAP secreted extracellularly, unlike marker luciferase, which is a marker protein that can detect dioxins with high sensitivity, along with luciferase. Therefore, there is no need for an operation to extract cells by destroying cells.
  • FIG. 3 is a graph showing the measurement sensitivity of TCDD in 5000 HeDS cells.
  • Conventional dioxin atlas using luciferase requires 60,000 to 100,000 cells to detect ⁇ TCDD, whereas 5,000 HeDS cells as shown in Figure 3 Can detect 0.5pM TCDD.
  • SEAP as a marker protein
  • dioxins can be assayed using only a very small sample of the culture supernatant as small as 5 ⁇ l.
  • the transcription level of SEAP gene 12 and the secretion level of SEAP protein correlate very well, and the activity can be easily detected and quantified by a chemiluminescence detection system such as a luminometer.
  • PolyA13 is an essential gene sequence in the process of producing messenger RNA and translating it into protein.
  • pDRE-SEAPIO is prepared by a conventional genetic engineering method. That is, a fragment of MMTV-DRE11 cut out and purified with a restriction enzyme is incorporated into a SEAP plasmid upstream of the SEAP gene 12 using a T4 DNA ligase without a promoter.
  • T4 DNA ligase is an enzyme that links the 5 'end and 3' end of adjacent DNA strands.
  • the produced pDRE-SEAPIO is introduced into Escherichia coli to increase in large quantities, and pDRE-SEAPIO is purified by a conventional genetic engineering method.
  • the prepared pDRE-SEAP was transformed into a mouse liver cancer cell line by the procedure shown in FIG.
  • Hepa-lclc7 cells Gene transfer into H-marked a- lclc7 cells to establish stable recombinant cells.
  • the inventors selected Hepa-lclc7 cells because (1) in order to establish a bioassay system for dioxins, it was not possible to use cells that produce aromatic hydrocarbon receptors (hereinafter AhR). And (2) selecting a cell that expresses AhR at a high level is an essential component in order to establish a highly sensitive Atsushi system.
  • AhR aromatic hydrocarbon receptors
  • Hepa-lclc7 is selected.
  • the procedure for introducing the prepared pDRE-SEAP into Hepa-lclc7 cells and establishing stable recombinant cells is as shown in FIG.
  • Hepa-lclc7 cells detached from the culture dish with trypsin are thoroughly washed with phosphate buffered saline (PBS), the cuvette for electroporation (hereinafter, “elect mouth poration”) is used.
  • PBS phosphate buffered saline
  • lect mouth poration Made in Bio-Radonnay earth, part number 165-2088) (Sl).
  • 20 ⁇ g pDRE-SEAP and 2 ⁇ g Add and mix the plasmid pcDNA3.1 containing the neomycin resistance gene, mix, and leave on ice for 10 minutes (S2).
  • the culture solution used was ⁇ -MEM (manufactured by Gibconed Earth, part number 12561-056). After that, non-recombinant cells are killed by culturing for 1-2 weeks in the presence of 500 ⁇ g / ml neomycin (S4), and only recombinant cells in which pDRE-SEAP is stably integrated into chromosomal DNA survive. ⁇ Proliferate to form clumps.
  • the cell clumps are individually separated by trypsin treatment, transferred to a 96-well culture plate with two wells, and the culture is continued for one week (S5). After the cells become saturated, the culture medium in each well is replaced with a-MEM100 / zl containing 1% FBS, and cultured for 24 hours in the presence or absence of DD ⁇ TCDD, and the culture supernatant A predetermined SEAP assay is performed using 51, and HeDS cells that respond most sensitively to low concentration of dioxin are established and used for a dioxin detection bioassay (S6).
  • this bioassay method is referred to as DRE-based Sensing of dioxin via Secreted Alkalined phosphatase (hereinafter, referred to as DRESSA method).
  • FIG. 5 shows the response mechanism of the established HeDS cells to dioxins.
  • each component of pDRE-SEAPIO each component of pDRE-SEAPIO
  • MMTV-DRE11 and its downstream SEAP gene 12 and polyadenylation signal 13 are stably integrated.
  • dioxins 20 When the cells are exposed to dioxins 20, dioxins 20 first cross the cell membrane and bind to AhR14, which is present in the cytoplasm.
  • AhR14 forms a complex with Arntl5, a coactivator, and enters the nucleus
  • transcription of the downstream SEAP gene 12 is promoted, messenger RNA 16 is produced, translated into protein 18 by ribosome 17, and rapidly secreted outside the cell as SEAP protein 19. Therefore, by measuring the activity of the SEAP protein in the culture supernatant, it is possible to quantify the level of dioxins exposed to the cells.
  • FIG. 6 is a flowchart showing the procedure for detecting dioxins in a sample.
  • First 96 holes Seed HeDS cells into each well of the culture plate at a density of 2 x 10 4 Zwell. Dispense 100-ml ⁇ -MEM containing 1% FBS into each well (Sl). After culturing for 24 hours to allow the cells to settle to the bottom of each well, the culture medium is replaced, and the liquid sample containing TCDD is added with 1 ⁇ l of calorie (S2). After culturing for 24 hours, the supernatant is sampled in steps of 51 (S3), and the SEAP protein activity is measured by the procedure described below (S4).
  • the SEAP protein activity in the culture supernatant is quantified as follows. Add 5 1 buffer to 5 ⁇ l of culture supernatant and incubate for 30 minutes at 65 ° C to inactivate endogenous alkaline phosphatase activity. In addition, a buffer containing L-homoarginine, an inhibitor of endogenous alkaline phosphatase, was allowed to stand at 20 ⁇ l for 5 min, and then calored with 15 ⁇ l of substrate CSPD and allowed to stand in the dark for 30 min. After placing, the luminosity of the light is measured with a luminometer.
  • FIG. 7 shows the results of stimulating HeDS cells with 6DD of TCDD, followed by a time course of SEAP protein activity in the culture solution up to 10 hours.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the predominant increase in SEAP protein activity was observed 4 hours after TCDD addition, and gradually increased over time.
  • FIG. 8 shows the subsequent transition of SEAP protein activity for up to 72 hours.
  • SEAP protein activity lasted up to 48 hours after stimulation, after which equilibrium was reached.
  • FIG. 9 shows the results of examining the sensitivity of HeDS cells. HeDS cells were exposed to TCDD at a low concentration of 0-1 ⁇ , and the increase in SEAP protein activity in the culture was examined. A predominant increase in SEAP protein activity was already observed at 0.25 pM (2501 M).
  • the DRESSA method can detect TCDD at a concentration of ⁇ or less, which is the conventional detection limit of bioassay.
  • the inventors have confirmed that the SEAP protein activity in the culture solution increases in a concentration-dependent manner up to 100 pM.
  • Fig. 10 shows the result of examination on the number of cells required for the DRESSA method. That is, the number of cells shown in the graph was seeded on a 96-well culture plate, and the cells were exposed to InM TCDD. Then, SEAP protein activity in the culture solution was measured. As shown in FIG. 10, it became clear that if there were 50 cells per sample (one well), the TCDD of InM could be sufficiently detected. This corresponds to the 60,000 to 100,000 Z holes required for conventional In comparison, this is equivalent to one thousandth to one thousandth.
  • the above-described detection procedure can be simplified as shown in FIG. That is, first, 50 ⁇ l of the culture solution containing sample 11 is dispensed into each well of a 96-well culture plate, and HeDS cells suspended in the 501 culture solution are immediately added (total 100 1) (SI) .
  • the culture supernatant is sampled (S2), and the SEAP protein activity is measured (S3).
  • S2 the culture supernatant
  • S3 the SEAP protein activity
  • FIG. 12 shows the time course of SEAP protein activity in a culture solution after stimulating HeDS cells with TCDD (6 pM and InM) by the rapid DRESSA method.
  • TCDD 6 pM and InM
  • FIG. 13 shows a comparison of the sensitivity between the DRESSA method and the rapid DRESSA method.
  • the same number of cells were exposed to 6 pM TCDD under colonization conditions in the DRESSA method or under floating conditions in the rapid DRESSA method, and the subsequent increase in SEAP protein activity in the culture was compared over time.
  • FIG. 13 up to 24 hours after the stimulation, there was no difference in the detection sensitivity of dioxins between the two.
  • FIG. 14 shows that HeDS cells were converted to polycyclic aromatic hydrocarbons of 1 ⁇ of 3-methylcholanthrene (3-MC), benzo [a] pyrene (B [a] P), and ⁇ -naphthoflavone (j8NF).
  • 5 shows SEAP protein activity in the culture supernatant after each stimulation. In each case, marked induction of SEAP protein activity was observed as compared to the control stimulus, DMSO.
  • HeDS cells also secrete SEAP proteins in response to 3-MC, B [a] P, j8 NF), which are harmful chemicals other than dioxins acting via AhR.
  • Tobacco smoke contains complex harmful chemical substances such as dioxins and polycyclic aromatic hydrocarbons. AhR bound to harmful chemicals in tobacco smoke is bound to DRE. In combination, it exerts its biological toxicity. Thus, the AhR activity of cigarette smoke can be expressed as a value converted to the amount of TCDD that causes equivalent AhR activation. The converted value was defined as a DRE-activating potential value (DAP value), and the AhR activating ability of tobacco smoke was quantitatively evaluated as an indicator of the biological toxicity of tobacco smoke. This evaluation method is extremely useful for quantitatively determining the degree of health effects of smoking.
  • DAP value DRE-activating potential value
  • a reference chemical substance add 1 to ⁇ TCDD in the same manner. After culturing for 16 hours, collect 5 ⁇ l of the culture supernatant and measure SEAP activity.
  • a calibration curve showing the correlation between TCDD concentration and SEAP activity was created, and the harmful substance concentration in each cigarette smoke extract was calculated based on the calibration curve and converted to TCDD.
  • Table 1 shows the total amount of AhR activity in the generated smoke, which is calculated and shown as the DAP value. As shown in Table 1, very high levels of AhR activity were observed in cigarette smoke. There is almost a positive correlation between tar content and DAP value.When comparing lmg and 20mg tar contents, the former DAP value is not 1/20 that of the latter, Only about 1/3. The DAP value is higher for 14 mg brands than for 20 mg tar grades. These facts imply that the tar content, which is generally used as an indicator of health impact, is not sufficient as an indicator of biological toxicity, making it more practical and new. The significance of the DAP value as an indicator is high.
  • the present invention which can detect dioxin and similar harmful chemical substances simply, quickly, inexpensively, and with ultra-high sensitivity, is useful for monitoring industrial wastewater, controlling drinking water quality, controlling food quality, and controlling endocrine disrupting substances in industrial products. It has high industrial utility, such as monitoring for contamination.
  • FIG. 1 Structure of dioxin-like responsive plasmid (pDRE-SEAP)
  • FIG. 9 A graph showing the increase in SEAP protein activity in the culture medium when HeDS cells were exposed to TCDD at a low concentration of 0 to 1 ⁇ .
  • FIG. 14 A graph showing the increase in SEAP protein activity in the culture supernatant after stimulating HeDS cells with a dioxin-like chemical.
  • MMTV-DRE Secreted marker protein gene
  • SEAP Polyadenylation signal
  • polyA Aromatic hydrocarbon receptor
  • AhR Co-activator

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Abstract

　ダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化される遺伝子（以下、ＤＲＥ遺伝子という。）と、前記ＤＲＥ遺伝子の下流に分泌型マーカータンパク発現遺伝子とを含むプラスミドと、このプラスミドが導入され、ダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素に曝露されると分泌型マーカータンパクを分泌する遺伝子導入細胞の開発と、この遺伝子導入細胞を使ったバイオセンサーとを開発する。

Description

明 細 書
ダイォキシン類等応答性プラスミド、ダイォキシン類等測定用遺伝子導入 細胞、並びにそれを用いたダイォキシン類等検出方法及びバイオセンサー 技術分野
[0001] 本発明は、ダイォキシン類、多環芳香族炭化水素などの内分泌撹乱物質や一部の 発がん物質等が、細胞内受容体である芳香族炭化水素受容体 (以下、 AhR)を介し て作用することに基づく有害化学物質の簡便、迅速かつ高感度な検出方法または定 量方法、及び検出物質、並びにダイォキシン類検出バイオセンサーに関する。 背景技術
[0002] 現代社会の深刻な問題の一つである環境汚染への対応策を確立するためには、 環境中の有害化学物質への曝露の程度を正確に評価することが必要である。このた めには、簡便で、感度や再現性の高い有害化学物質の分析方法が確立されている ことが不可欠である。
[0003] ダイォキシン類は、極微量で種々の有害作用を惹起する。従って、鋭敏かつ迅速 にダイォキシン類を検出する方法の確立は、ダイォキシン類への曝露を正確に評価 し、健康障害を予防するために、緊急の課題と考えられる。また、ダイォキシン類と同 じょうに環境中の有害物質である多環芳香族炭化水素、及びこれらを複合的に含有 するタバコ煙の生物学的毒性の総体的かつ定量的評価も大きな課題である。
[0004] 環境中のダイォキシン類等を検出するための代表的な手法としては、内因性のバ ィォマーカー、例えば薬物代謝酵素であるチトクローム P-4501A1の利用、 培養細胞 を用いたバイオアツセィ、酵素免疫アツセィ、クロマトグラフィーを用いた方法などがあ る。特に遺伝子工学技術を用いたバイオアツセィは、その簡便性と感度の高さから、 近年注目を集めている。
[0005] こうした遺伝子工学的バイオアツセィは、幾つかの基本ユニットにより構成されてい る。力かる基本ユニットは、（1)細胞、（2)細胞に組み込む遺伝子構造の 2つである。こ こで、力かる遺伝子構造はさらにダイォキシン類のセンサーとして機能する DNA配列 であるダイォキシン類応答 DNA配列と、マーカータンパクを規定するマーカータンパ ク遺伝子とにより成り立つている。
[0006] こうした遺伝子構造を細胞に導入し、細胞の染色体 DNAに安定に組み込むことに より、ダイォキシン類等に反応するセンサー細胞を作製することが可能である。
[0007] こうした遺伝子導入細胞がダイォキシン類等を含む試料に曝露されると、まずダイ ォキシン類等が細胞内の AhRと結合し、さらに転写促進共役因子であるコアクチべ一 ター（以下、 Arnt)と複合体を形成、その複合体が転写因子としてダイォキシン類応 答 DNA配列を活性ィ匕させる。その結果、遺伝子配列下流のマーカータンパク遺伝子 の発現が促進される。
[0008] 力かるマーカータンパク遺伝子が発現することによりマーカータンパクが産生され、 当該タンパクを定量ィ匕することにより、試料中にどのくらいの濃度のダイォキシン類等 が存在するかを評価することができる。
[0009] マーカータンパク遺伝子としては、これまでクロラムフエ-コール'ァシルリボシル 'ト ランスフェラ一ゼ、 j8 -ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、などの酵素遺伝子や緑色 螢光タンパク遺伝子が用いられてきた。
[0010] し力し、これまでのバイオアツセィでは、（1)マーカータンパクが分泌されないため、 その定量のためには細胞を破壊してマーカータンパクを抽出する操作が必要、（2)環 境中の極微量な有害物質を検出する上で感度が不十分であり、高感度なシステムで も 2、 3、 7、 8- tetrachlorodibenzo- p- dioxin (以下、 TCDD)換算で ΙρΜが検出の限界、 (3)バイオアツセィに 2日〜 3日必要、（4)1サンプルあたり 60、 000個から 100、 000個の 細胞数が必要、このため、培養コスト、人件費などの経費が高くつぐなどの問題点を 挙げることができる。特に (2)〜(4)は、多数のサンプルを効率良くスクリーニングしてゆ く上で大きな障害となっていた。
非特干文献 1 : P.A. Bennisch、 K. Hosoe、 S. ¾akai、 Bioanalytical screening methods for dioxins and dioxin— like compounds: a review of bioassay/biomarker technology, Environ. Int. 27 (2001) 413—439.
非特許文献 2：特願 2004-135662「ダイォキシン類測定用形質転換体並びにそれを 用いたダイォキシン類の検出方法、定量分析方法及びスクリーニング方法」 発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0011] そこで本発明は、従来のルシフェラーザや緑色蛍光タンパクを用いたダイォキシン 類検出のバイオアツセィに比較し、（1)バイオアツセィプロセスの簡便化、（2)検出感度 の向上、（3)バイオアツセィ時間の大幅な短縮、（4)培養コスト、人件費等の経費の削 減、を課題とするものである。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明は、ダイォキシン類、及び Z又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化さ れるダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素高感受性遺伝子配列の下流に
、分泌型マーカータンパク遺伝子を組み込んだダイォキシン類及び Z又は多環芳香 族炭化水素応答性プラスミドである。
[0013] 前記分泌型マーカータンパク遺伝子は、分泌型アルカリホスファターゼ遺伝子であ ることは好適である。
[0014] 本発明は、上述したダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素応答性プラス ミドが、芳香族炭化水素受容体を高発現する培養細胞に導入され、前記芳香族炭化 水素受容体がダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素に結合し、分泌型マ 一力一タンパクを産生するダイォキシン類及び z又は多環芳香族炭化水素測定用 遺伝子導入細胞である。
[0015] 前記芳香族炭化水素受容体を高発現する培養細胞は、 Hepa-lclC7であることは 好適である。
[0016] 本発明は、上述したダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素測定用遺伝 子導入細胞をダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素の検出センサーとし て用いたノィォセンサーとするものである。
[0017] 本発明は、ダイォキシン類、及び Z又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化さ れるダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素高感受性遺伝子配列と、前記 遺伝子配列の下流に分泌型マーカータンパク遺伝子を組み込んだダイォキシン類 及び Z又は多環芳香族炭化水素応答性プラスミドを芳香族炭化水素受容体を高発 現する細胞に導入し作製したダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素測定 用遺伝子導入細胞を、ダイォキシン類、及び Z又は多環芳香族炭化水素に曝露し、 前記遺伝子導入細胞が分泌する分泌型マーカータンパクの活性を定量し、ダイォキ シン類、及び Z又は多環芳香族炭化水素を検出するダイォキシン類、及び Z又は多 環芳香族炭化水素の検出方法である。
[0018] 分泌型マーカータンパクは、分泌型アルカリホスファターゼであることは好適である 。また、前記細胞は、 Hepa-lclc7であることは好適である。
[0019] 本発明は、ダイォキシン類、及び Z又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化さ れるダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素高感受性遺伝子配列と、前記 遺伝子配列の下流に、分泌型マーカータンパク遺伝子を組み込んだダイォキシン類 及び Z又は多環芳香族炭化水素応答性プラスミドを芳香族炭化水素受容体を高発 現する細胞に導入し作製したダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素測定 用遺伝子導入細胞をタバコ煙に曝露させ、前記遺伝子導入細胞が分泌する分泌型 マーカータンパクの活性を定量することにより、タバコ煙の生物学的毒性を評価する タバコ煙の生物学的毒性の定量的評価方法である。
[0020] 前記分泌型マーカータンパクは、分泌型アルカリホスファターゼであることは好適で ある。
発明の効果
[0021] 本発明によれば、単純な化学発光計測等により、簡便にダイォキシン類や多環芳 香族炭化水素を測定できる。また、細胞の播種力 計測までのダイォキシン測定プロ セスを、数時間で完了でき、更に本発明によれば、低コストで高感度なダイォキシン 類及び Z又は多環芳香族炭化水素の測定を行うことができる。
[0022] 本発明は、大気、河川、土壌、食品、生活器材に含まれるダイォキシン類及び/又 は多環芳香族炭化水素を検出できる優れた発明である。
発明を実施するための最良の形態
[0023] 発明を実施するための最良の形態について以下に述べる。
実施例 1
[0024] 図 1はダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素反応性プラスミド
pDRE-SEAPIOの構造図を示したものである。 pDRE-SEAPlOは、マウス乳ガンウィル スのプロモータ（以下、 MM TV)の一部にダイォキシン類応答 DNA配列（以下、 DRE) を組み込んだダイォキシン類高感受性 DNA配列（以下、 MMTV-DRE11)およびその 下流に位置する分泌型アルカリホスファターゼ (以下、 SEAP)遺伝子 12と、サルウイ ルス 40 (以下、 SV40)由来のポリアデ-レーシヨンシグナル（以下、 poly A13)とにより 構成されている。
[0025] 従来、ダイォキシン類応答 DNA配列として DREが用いられてきた力 この実施例で は、ダイォキシン類を感知するセンサー DNA配列として、 MMTVの一部に DREを組み 込んだ MMTV-DREを用いた。これにより高感度なアツセィ系を確立した。
[0026] MMTV-DRE11は、ダイォキシン類に応答して活性化されることが知られて 、る DRE を 4個、 MMTVのプロモーターの一部に糸且み込んだものである。 DRE単独のものに比 ベ強力なダイォキシン類への応答性がある。
[0027] 図 2は、 MMTV-DREと DREのセンサー能力を比較検討した結果である。
MMTV-DREと DREのみをセンサー配列として持つ SEAPリポータープラスミドを作成し 、これらを各々 H印 a-lclc7細胞に遺伝子導入した。なお、遺伝子導入の詳細は後述 する。その後、これらの細胞を TCDDで刺激し、 SEAP活性の増加を比較した。 DREの みをセンサー配列として持つ SEAPリポータープラスミドを導入した細胞では、 TCDD の刺激によって SEAP活性は 4.5倍に上昇した。
[0028] これに対して、 MMTV-DREをセンサー配列として持つ SEAPリポータープラスミドを 導入した細胞（Hepalclc7- DRE- SEAP細胞、以下、 HeDS細胞）では、 TCDDの刺激 によって SEAP活性は 43.2倍に上昇した。 MMTVのみをセンサー配列として持つ SEAPリポータープラスミドを導入した細胞では、 TCDDにより SEAP活性の増加は見ら れなかった。このことは MMTVの配列力 DREのダイォキシンに対する応答性を強力 に増幅することを意味している。 MMTV-DREの高反応性は、アツセィの迅速性、低コ ストを可能とする。
[0029] 実施例 1では、マーカータンパクとして SEAPを用いた。 SEAPを含め、これまで分泌 型マーカータンパクを用いたダイォキシン類のバイオアツセィ系は確立されていなか つた。 SEAPはルシフェラーゼと並び高感度にダイォキシン類を検出しうるマーカータ ンパクである力 ルシフェラーゼと異なり細胞外に分泌されるため、細胞を破壊してタ ンパクを抽出する操作が不要である。 [0030] 図 3は 5000個の HeDS細胞で TCDDの検出感度を測定したグラフである。従来のル シフェラーゼを用いたダイォキシンアツセィでは ΙρΜの TCDDを検出するために 60、 000個〜 100、 000個の細胞数が必要なのに対し、図 3に示す通り、 5000個の HeDS細 胞で 0.5pMの TCDDの検出が可能である。
[0031] SEAPをマーカータンパクとして用いることにより、僅カゝ 5 μ 1という極めて微量な培養 上清のサンプルのみで、ダイォキシン類のアツセィが可能である。 SEAP遺伝子 12の 転写レベルと SEAPタンパクの分泌レベルは極めて良く相関し、その活性はルミノメー ターなどの化学発光の検出システムで容易に検出 ·定量ィ匕が可能である。なお、 polyA13はメッセンジャー RNAが作られてからタンパクに翻訳される過程で不可欠な 遺伝子配列である。
[0032] pDRE-SEAPIOは遺伝子工学的常法により作製する。即ち、制限酵素により切り出 し精製した MMTV- DRE11の断片を、プロモーターを持たな!、SEAPプラスミドの SEAP 遺伝子 12の上流に、 T4DNAリガーゼを用いて組み込む。
[0033] T4DNAリガーゼは、隣接する DNA鎖の 5'末端と 3'末端とを連結する酵素である。作 製した pDRE-SEAPIOは大腸菌に導入して大量に増やし、遺伝子工学的常法により pDRE-SEAPIOを精製する。
[0034] 作製した pDRE- SEAPを、図 4のような手順によりマウスの肝臓癌細胞株である
H印 a-lclc7細胞に遺伝子導入し、安定な組換え細胞を榭立する。ここで発明者が Hepa-lclc7細胞を選択したのは、（1)ダイォキシン類のバイオアツセィ系を確立する ためには、芳香族炭化水素受容体 (以下、 AhR)を産生する細胞を用いることが不可 欠であること、（2)高感度のアツセィ系を榭立するには、 AhRを高度に発現している細 胞を選択することが必須構成要件であること、との観点力もである。
[0035] 力かる観点力 発明者は鋭意検討した結果、肝臓癌細胞由来の細胞系、
Hepa-lclc7を選択したものである。作製した pDRE- SEAPを Hepa- lclc7細胞に導入 し、安定な組換え細胞を榭立した手順は図 4に示す通りである。
[0036] トリプシンで培養皿から剥離した 4 X 106個の Hepa-lclc7細胞をリン酸緩衝生理食 塩水である PBSで良く洗浄した後、電気穿孔法 (以下、エレクト口ポレーシヨン)用キュ ベット（バイオラドネ土製、品番 165- 2088)に入れる（Sl)。 20 μ gの pDRE- SEAPと 2 μ gの ネオマイシン耐性遺伝子を含むプラスミド pcDNA3.1を添カ卩して混和、 10分間氷上で 静置する (S2)。
[0037] 次に、ジーンパルサー（バイオラドネ土製)を用いて 150mV、 960 μ Fの条件でエレクト 口ポレーシヨンを施行、その 1/10から 1/20の細胞数を 100 mm培養皿に播種し、 37°C 、 CO濃度 5%、 10%の牛胎児血清（以下、 FBS)存在下で 3日間培養する（S3)。
2
[0038] 培養液は α -MEM (ギブコネ土製、品番 12561-056)を用いた。その後 500 μ g/mlのネ ォマイシン存在下で 1〜2週間培養することにより、非組換え細胞は死滅し (S4)、 pDRE-SEAPが染色体 DNAに安定に組み込まれた組換え細胞のみが生存 ·増殖して 集塊を形成する。
[0039] この細胞集塊を個別にトリプシン処理して剥離し、各々を 2穴づっ 96穴培養プレート に移し 1週間培養を継続する（S5)。細胞が飽和状態になった後、各穴の培養液を 1% の FBSを含有する a - MEMlOO /z lに交換し、 ΙΟρΜの TCDD存在下、または非存在下 で 24時間培養、その培養上清 5 1を用いて所定の SEAPアツセィを行ない、低濃度の ダイォキシンに最も鋭敏に反応する HeDS細胞を榭立、ダイォキシン類検出ノィオア ッセィに用いる（S6)。本明細書ではこのバイオアツセィ法を DRE-based Sensing of dioxin via Secreted Alkalined phosphatase ( 下、 DRESSA法ノと ヽっ。
[0040] 榭立した HeDS細胞のダイォキシン類への応答メカニズムを図 5に示す。 HeDS細胞 では、その染色体 DNAの中に pDRE-SEAPIOの各コンポーネント、即ち
MMTV-DRE11およびその下流の SEAP遺伝子 12とポリアデ-レーシヨンシグナル 13 が安定に組み込まれている。この細胞がダイォキシン類 20に曝露されると、ダイォキ シン類 20はまず細胞膜を通過し、細胞質内に存在する AhR14に結合する。
[0041] さらに AhR14は、コアクチベータ一である Arntl5と複合体を形成し核内に入り、
MMTV-DRE 11に結合してそれを活性化させる。結果として下流の SEAP遺伝子 12の 転写が促され、メッセンジャー RNA16が作られ、リボゾーム 17でタンパク 18に翻訳され て、 SEAPタンパクとして細胞外に速やかに分泌される 19。従って培養上清中の SEAP タンパクの活性を測定することにより、細胞がどれだけのレベルのダイォキシン類に 曝露されて 、るのかを定量することができる。
[0042] 試料中のダイォキシン類の検出手順を、フローチャートとして図 6に示す。まず 96穴 培養プレートの各穴に HeDS細胞を 2 X 104Zwellの密度で播種する。培養液は 1% FBSを含む α - MEMを 100 1づっ各穴に分注する（Sl)。 24時間培養して細胞を各穴 の底に定着させた後、培養液を交換し、 TCDDを含有する液体試料を 1 μ 1づっ添カロ する（S2)。 24時間培養した後上清を 5 1づっサンプリングし (S3)、以下に述べる手 順で SEAPタンパク活性を測定する（S4)。
[0043] 培養上清中の SEAPタンパク活性は、以下のようにして定量する。 5 μ 1の培養上清 に 15 1の緩衝液をカ卩え、 30分 65°Cでインキュベートし、内因性のアルカリホスファタ ーゼ活性を失活させる。さらに内因性のアルカリホスファターゼの阻害剤である L-ホ モアルギニンを含む緩衝液を 20 μ 1カ卩ぇ 5分放置した後、 15 μ 1の基質 CSPDをカロえ、 30分暗所にて静置した後、ルミノメーターでィ匕学発光度を計測する。
[0044] 図 7は、 HeDS細胞を 6ρΜの TCDDで刺激し、その後の培養液中の SEAPタンパク活 性の推移を経時的に 10時間まで追ったものである。コントロールとして、 TCDDの溶 媒であるジメチルスルフオキサイド（以下、 DMSO)を用いた。優位な SEAPタンパク活 性の増大は TCDD添加後 4時間で認められ、時間の経過とともに漸増した。
[0045] 図 8はその後の SEAPタンパク活性の推移を、さらに 72時間まで追ったものである。
SEAPタンパク活性の増加は刺激後 48時間まで続き、その後平衡状態に達したことが ゎカゝる。
[0046] 図 9は、 HeDS細胞の感度を検討した結果である。 HeDS細胞を 0〜1ρΜの低濃度の TCDD〖こ曝露し、培養液中の SEAPタンパク活性の上昇を検討した。優位な SEAPタン パク活性の増加は 0.25pM (2501M)ですでに認められた。
[0047] このように、 DRESSA法は従来のバイオアツセィの検出限界とされている ΙρΜ以下の 濃度の TCDDを検出しうる。なお、発明者らは培養液中の SEAPタンパク活性が 100 pMまで濃度依存的に上昇することを確認して 、る。
[0048] 図 10は、 DRESSA法に必要な細胞数に関し検討を行なったものである。すなわちグ ラフに示された数の細胞を 96穴培養プレートに播種し、その細胞を InMの TCDDに曝 露させた後、培養液中の SEAPタンパク活性を測定した。図 10に示されるように、 1試 料（1穴）あたり 50個の細胞が存在すれば、 InMの TCDDを十分に検出しうることが明 らかになつた。これは従来のアツセィに必要とされる細胞数 60,000〜100,000Z穴に 比べ、 1000分の 1から 2000分の 1の数に相当する。
実施例 2
[0049] 上述した DRESSA法を簡便、経済的かつ短時間に行なうため、前述した検出手順を 、図 11のように簡略ィ匕することが可能である。即ち、まず試料 1 1を含む培養液を 50 μ 1づっ 96穴培養プレートの各穴に分注し、直ちに 50 1の培養液に浮遊させた HeDS細胞を添加する（total 100 1) (SI)。
[0050] 3〜4時間後培養上清をサンプリングし (S2)、 SEAPタンパク活性を測定する（S3)。こ の手法を用いることにより、現行の方法での検出限界とされる ΙρΜの TCDDを、 4〜5 時間以内に検出することが可能である。この便法を、本明細書では、以下、迅速 DRESSA法という。迅速 DRESSA法は検出感度の上でも、 DRESSA法と遜色がない。
[0051] 図 12は、迅速 DRESSA法により HeDS細胞を TCDD (6pMおよび InM)で刺激し、そ の後の培養液中の SEAPタンパク活性の推移を経時的に追ったものである。いずれの 場合にも、優位な SEAPタンパク活性の増大は TCDD添加後 3時間の時点で既に認め られ、時間の経過とともに漸増した。
[0052] 図 13は、 DRESSA法と迅速 DRESSA法との感度を比較検討したものである。同数の 細胞を DRESSA法では定着条件下で、また迅速 DRESSA法では浮遊条件下で 6 pM の TCDDに曝露させ、その後の培養液中の SEAPタンパク活性の上昇を経時的に比 較検討した。その結果、図 13に示す通り、刺激後 24時間まで、ダイォキシン類の検 出感度に関し両者に差は認められな力つた。
[0053] 図 14は HeDS細胞を多環芳香族炭化水素である 1 μ Μの 3- methylcholanthrene ( 3- MC)、 benzo[a]pyrene (B[a]P)、 β -naphthoflavone ( j8 NF)で各々刺激した後の、 培養上清中の SEAPタンパク活性を示している。いずれの場合にも、コントロール刺激 である DMSOに比べ、著明な SEAPタンパク活性の誘導が認められた。このように HeDS細胞は、 AhRを介して作用するダイォキシン類以外の有害化学物質である 3- MC、 B[a]P、 j8 NF)にも反応し SEAPタンパクを分泌する。
実施例 3
[0054] タバコ煙には、ダイォキシン類や多環芳香族炭化水素などの有害化学物質が複合 的に含まれている。こうしたタバコ煙中の有害化学物質と結合した AhRは、 DREに結 合してその生物学的毒性を発揮する。そこで、タバコ煙の AhR活性ィ匕能を、同等の AhR活性化を引き起こす TCDDの量に換算した値として示すことが可能である。かか る換算値を DRE-activating potential value (以下、 DAP値)とし、タバコ煙の生物学的 毒性の指標として、タバコ煙の AhR活性ィ匕能を定量的に評価した。なお、この評価法 は喫煙の健康への影響度を定量ィ匕する上で極めて有用である。
[0055] タール含量が各々 1,6,10,14,20 mg/本である 5種類のタバコ銘柄を用いて、 10.5 1/minの吸引速度でタバコ煙を生成、タバコ 1本あたりの煙を 50mlの PBSに溶解する。
[0056] HeDS細胞を 96穴培養プレートに 5000細胞 Z穴で播種し、上記タバコ煙抽出液 (5 種、各 n=4)を 100〜1000倍の希釈で添加する。基準となる化学物質として、 1〜 ΙΟΟρΜの TCDDを同様に添加する。 16時間培養後、培養上清を 5 μ 1づっ採取し、 SEAP活性を測定する。
[0057] TCDD濃度と SEAP活性との相関を示す検量線を作成し、それをもとに各タバコ煙抽 出液中の有害物質の濃度を TCDDに換算する形で算出、各タバコ 1本より生成する 煙に含まれる AhR活性ィ匕能の総量を計算し DAP値として示したものが表- 1である。 表- 1に示されるように、タバコ煙には極めて高レベルの AhR活性ィ匕能が認められた。 なお、タール含量と DAP値の間にはほぼ正の相関が認められる力 タール含量が lmgのものと 20mgのものを比較した場合、前者の DAP値は後者のそれの 1/20ではな く、 1/3程度に過ぎない。また、 DAP値はタール含量が 20mgの銘柄よりも 14mgの銘柄 のほうが逆に高い。これらの事実は、一般に健康への影響度の指標として用いられて レ、るタール含量が、生物学的毒性の指標としては不充分であることを意味しており、 より実用的な、新たな指標としての DAP値の意義は高い。
[0058] [表 1] 銘 柄 タール含量 (mg) DAP値（ng TGDD -相当/本） マイルドセブン（one) 1 30.6 ± 7.5
マイルドセブン（super lights) 6 51.2土 6.4
マイルドセブン（original) 10 81.6 ± 8.0
セブンスター 14 100.8土 20.8
ピース 20 95.2土 5.2 産業上の利用可能性
[0059] ダイォキシンおよび類似有害化学物質を簡便、迅速、安価かつ超高感度に検出し うる本発明は、工業排水のモニタリング、飲用の水質管理、食品の品質管理、またェ 業製品における内分泌撹乱物質の混入の監視など、産業上の利用価値も高い。 図面の簡単な説明
[0060] [図 1]ダイォキシン類等応答性プラスミド (pDRE-SEAP)の構造
[図 2]MMTV-DREと DREのセンサー能力を比較検討した図
[図 3]5000個の HeDS細胞で TCDDの検出感度を測定した図
[図 4]HeDS細胞樹立の手順
[図 5]HeDS細胞のダイォキシン類感知メカニズム
[図 6]DRESSA法によるダイォキシン類検出の手順
[図 7]HeDS細胞を TCDDで刺激した後の培養上清中 SEAPタンパク活性の推移 (短時 間）
[図 8]HeDS細胞を TCDDで刺激した後の培養上清中 SEAPタンパク活性の推移 (長時 間）
[図 9]HeDS細胞を 0〜1ρΜの低濃度の TCDDに曝露し、培養液中の SEAPタンパク活 性の上昇をグラフにより示した図
[図 10]RESSA法に必要な HeDS細胞数をグラフにより示した図
[図 11]迅速 DRESSA法によるダイォキシン類検出の手順
[図 12]迅速 DRESSA法により細胞を TCDDで刺激した後の培養上清中 SEAPタンパク 活性の推移
[図 13]DRESSA法と迅速 DRESSA法との検出感度の比較を示した図
[図 14]HeDS細胞をダイォキシン類似化学物質で刺激した後の培養上清中 SEAPタン ノ ク活性の上昇をグラフで示した図
符号の説明
[0061] 1 HeDS細胞
10 ダイォキシン類応答性プラスミド (pDRE-SEAP)
11 ダイォキシン類高感受性遺伝子配列（MMTV-DRE) 分泌型マーカータンパク遺伝子 (SEAP) ポリアデ-レーシヨンシグナル（polyA) 芳香族炭化水素受容体 (AhR) コアクチベータ一（Arnt)
SEAP遺伝子のメッセンジャー RNA リボゾーム
SEAPタンパク
細胞外への SEAPタンパクの分泌 ダイォキシン類

Claims

請求の範囲
[1] ダイォキシン類、及び Z又は多環芳香族炭化水素に応答性を有するプラスミドであ つて、
ダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素に反応して活性化される遺伝子 (以 下、 DRE遺伝子という。）と、
前記 DRE遺伝子の下流に分泌型マーカータンパク発現遺伝子
とを含むことを特徴とするプラスミド。
[2] 前記分泌型マーカータンパク遺伝子は、アルカリホスファターゼ発現遺伝子であるこ とを特徴とする請求項 1に記載のプラスミド。
[3] 前記 DRE遺伝子が 2つ以上組み込まれていることを特徴とする請求項 1又は 2に記 載のプラスミド。
[4] 前記 DRE遺伝子が所定のプロモーターの一部に組み込まれて 、ることを特徴とする 請求項 1又は 2に記載のプラスミド。
[5] 前記分泌型マーカータンパク遺伝子の下流にポリアデ-レーシヨンシグナルを更に 含むことを特徴とする請求項 1から 4のいずれかに記載のプラスミド。
[6] ダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素を測定するための遺伝子導入細胞 であって、
芳香族炭化水素受容体を高発現させる細胞に請求項 1から 5のいずれかに記載の プラスミドが導入され、
ダイォキシン類及び Z又は多環芳香族炭化水素を含む雰囲気に置かれると分泌型 マーカータンパクを分泌することを特徴とする遺伝子導入細胞。
[7] 前記細胞がマウスの癌細胞株 (Hepa-lclc7)であることを特徴とする請求項 6に記載 の遺伝子導入細胞。
[8] 請求項 6又は 7に記載の遺伝子導入細胞を含み、該遺伝子導入細胞をダイォキシン 類及び/又は多環芳香族水素の検出に用いることを特徴とするノィォセンサー。
[9] 請求項 6又は 7に記載の遺伝子導入細胞を評価対象雰囲気に置 ヽたときに前記遺 伝子導入細胞が分泌する分泌型マーカータンパクの活性を測定することによりダイ ォキシン類及び Z又は多環芳香族水素を検出することを特徴とするダイォキシン類 及び z又は多環芳香族炭化水素の検出方法。
請求項 6又は 7に記載の遺伝子導入細胞をタバコ煙に曝露させたときに前記遺伝子 細胞が分泌する分泌型マーカータンパクの活性を測定することによりタバコ煙の生物 学的毒性を評価することを特徴とするタバコ煙の生物学的毒性の評価方法。
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