JPWO2007004361A1 - 遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いた環境中有害化学物質のモニタリング方法 - Google Patents
遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いた環境中有害化学物質のモニタリング方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JPWO2007004361A1 JPWO2007004361A1 JP2007523359A JP2007523359A JPWO2007004361A1 JP WO2007004361 A1 JPWO2007004361 A1 JP WO2007004361A1 JP 2007523359 A JP2007523359 A JP 2007523359A JP 2007523359 A JP2007523359 A JP 2007523359A JP WO2007004361 A1 JPWO2007004361 A1 JP WO2007004361A1
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- human mammal
- transgenic non
- seap
- marker protein
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 54
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims abstract description 16
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 25
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 24
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 20
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 claims description 18
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims description 16
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims description 16
- 150000002013 dioxins Chemical group 0.000 claims description 16
- 239000000779 smoke Substances 0.000 claims description 16
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 8
- 125000005575 polycyclic aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 6
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 claims description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 claims description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 claims description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 2
- KVGZZAHHUNAVKZ-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxin Chemical compound O1C=COC=C1 KVGZZAHHUNAVKZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 33
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 abstract description 21
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 abstract description 4
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 abstract description 4
- 231100000507 endocrine disrupting Toxicity 0.000 abstract description 4
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 abstract 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 23
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 14
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical class 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 5
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 5
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 5
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 102000008142 Cytochrome P-450 CYP1A1 Human genes 0.000 description 3
- 108010074918 Cytochrome P-450 CYP1A1 Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 2
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000448 Aryl Hydrocarbon Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026792 Aryl hydrocarbon receptor Human genes 0.000 description 1
- FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N Benz[a]pyrene Chemical compound C1=C2C3=CC=CC=C3C=C(C=C3)C2=C2C3=CC=CC2=C1 FMMWHPNWAFZXNH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000002004 Cytochrome P-450 Enzyme System Human genes 0.000 description 1
- 108010015742 Cytochrome P-450 Enzyme System Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N L-Homoarginine Natural products OC(=O)C(N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N L-homoarginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCCNC(N)=N QUOGESRFPZDMMT-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- QWXOJIDBSHLIFI-UHFFFAOYSA-N [3-(1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 QWXOJIDBSHLIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000035622 drinking Effects 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 102000027411 intracellular receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091008582 intracellular receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 210000003254 palate Anatomy 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/0393—Animal model comprising a reporter system for screening tests
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/30—Vector systems having a special element relevant for transcription being an enhancer not forming part of the promoter region
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
低コストで環境中に含まれる環境汚染物質である内分泌撹乱物質や一部の発がん物質等を容易に検出でき、かつ継続的にモニタリングを可能とする遺伝子導入非ヒト哺乳動物を提供する。有害化学物質を含む環境に置かれるとアルカリホスファターゼを体液中に分泌するように、ダイオキシン類高感受性遺伝子（MMTV-DRE）の下流に分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を結合させた遺伝子（MMTV-DRE-SEAP）を非ヒト哺乳動物、例えばマウスに導入する。
Description
本発明は、環境中有害化学物質である、ダイオキシン類、多環芳香族炭化水素などの内分泌撹乱物質や一部の発がん物質等に反応して、分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）を産生・分泌する遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いて環境中の有害化学物質を検出・定量、又はモニタリングする環境中有害化学物質のモニタリング法に関する。
ダイオキシン類、多環芳香族炭化水素などは、ヒトの健康に様々な影響を及ぼす。それら環境中有害化学物質の作用は、芳香族炭化水素受容体（以下、AhR）と呼ばれる細胞内受容体への結合とその活性化により引き起こされることが知られている。
また、タバコ煙の中にはダイオキシン類の他、コプラナーPCBやベンツピレン等の多環芳香族炭化水素など、芳香族炭化水素が多数かつ複合的に含有されており、AhRの活性化がタバコ煙による健康障害においても重要な役割を果たしていることが示唆されている。
芳香族炭化水素等の環境中有害化学物質は、極微量で種々の有害作用を惹起する。従って、鋭敏かつ迅速にこれら有害化学物質を検出する方法の確立は、健康障害を予防する上で緊急の課題と言える。
現在、ダイオキシン類の検出と定量には公定法である高分解能ガスクロマトグラフ質量分析法が用いられているが、この手法は高精度であるものの、前処理や測定に多大な手間とコストを要する。こうした現状を受けて近年、培養細胞を用いた幾つかの簡易測定法（リポーターバイオアッセイ法等の生物検定法）の報告がなされてきた。
2000年米国環境保護庁はこうした手法を環境サンプルのスクリーニング法として採用し、2002年にはEUで食品・飼料のダイオキシン類含量検定のためのスクリーニング法として同様の手法が認定された。こうした現状や上記の公定法による問題点を考慮し、2004年我が国の環境省はダイオキシン類の汚染監視調査において簡易測定法の適用を認め、さらに生物検定法を用いたダイオキシン類の簡易測定法についての検討を進めている。
こうした現状を鑑み、発明者はAhRの活性化を指標として、環境中芳香族炭化水素検出のための簡便で高感度なバイオアッセイDRESSA法を開発した（非特許文献１）。この手法は、ダイオキシン応答配列（DRE）と呼ばれるAhRの結合塩基配列をセンサーとし、その下流にSEAP遺伝子を結合させてリポーターとして用いた新しいアッセイ法である。
この遺伝子構造をマウスの肝癌細胞に導入し、AhRが芳香族炭化水素により活性化されるとSEAPを発現・分泌するHeDS細胞lを樹立した。このセンサー細胞にダイオキシンを含む試料を添加すると、濃度依存的に培養液中にSEAPが分泌される。従って培養液中のSEAP活性を測定することにより、試料中のダイオキシン類、多環芳香族炭化水素を検出・定量することが可能である。
このDRESSA法により、多数の環境サンプルを、極小のスケールで、安価、短時間、かつ高感度にアッセイすることが可能である。また、このシステムはタバコ煙中の芳香族炭化水素にも鋭敏に反応することが確認されている（非特許文献３）。
しかし培養細胞を用いたアッセイ系には、幾つかの限界がある。即ち、１）環境サンプルを培養系に添加するためには、環境有害化学物質を抽出・濃縮するという人工的な操作・過程が介在し、未処理のサンプルの直接的な評価が困難であること、２）動物個体における有害化学物質の影響を現実と同じ曝露様式で直接的に検討することができないこと、３）空気・食品・水など複数の経路を介した複合的な有害化学物質への曝露を統合的に評価できないこと、４）慢性長期的な曝露効果が検討できないこと、などである。
こうした問題を克服するためには、芳香族炭化水素に曝露されるとマーカー遺伝子が発現する遺伝子組換え動物を樹立し、評価に用いる必要がある。これまで、DREの下流にβ-ガラクトシダーゼ遺伝子を組み込んだ遺伝子導入マウスを用いた検討が一例報告されている（非特許文献２）。
このシステムの決定的な問題点としては、１）内因性のβ-ガラクトシダーゼの影響を除外できず、定量性に乏しい、２）マーカータンパクが分泌されないため、測定時にマウスを殺さねばならない、３）従って同一の動物個体を再利用できず（即ち同一個体を用いた継続的な評価が出来ず）、環境のモニタリングに用いた場合膨大なコストがかかる、４）アッセイのためには臓器を摘出し、組織を破砕・溶解し、マーカータンパクを抽出する操作が必要で、煩雑かつ時間がかかる、等が挙げられる。これらの問題点は、実際にこうしたマウスを環境のモニタリングに利用することを極めて困難にしている。また、分泌型リポータータンパクを発現・分泌するトランスジェニックリポーターアニマルは、これまでのところない。
特願2004-153293 Willey JJ, StrippBR, BaggsRB, and GasiewiczTA. Aryl hydrocarbon receptor activation in genital tubercle, palate, and other embryonic tissues in 2,3,7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-responsive lacZ mice. Toxicol Appl Pharmacol151:33-44, 1998. PCT/JP2005/8875
特願2004-153293 Willey JJ, StrippBR, BaggsRB, and GasiewiczTA. Aryl hydrocarbon receptor activation in genital tubercle, palate, and other embryonic tissues in 2,3,7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-responsive lacZ mice. Toxicol Appl Pharmacol151:33-44, 1998. PCT/JP2005/8875
そこで本発明は、現実の環境の中で直接的に有害化学物質である、例えば内分泌撹乱物質や一部の発がん物質等を容易に検出でき、かつ複合的な環境中有害化学物質の影響を総合的かつ継続的に評価することを可能とする遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いた環境有害化学物質のモニタリング方法等を提供するものである。
本発明は、有害化学物質を含む環境に置かれるとマーカータンパクを産生し、体液中に分泌する遺伝子導入非ヒト哺乳動物である。前記環境中有害化学物質としては、ダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素である。また、前記マーカータンパクは、分泌型アルカリホスファターゼであることは好ましい。分泌型アルカリホスファターゼをマーカータンパクとすることで、微量の体液（例えば、血液）の採取のみで評価が可能になり、臓器を摘出し組織を破砕・溶解してタンパクを抽出する必要がない。
導入遺伝子は、ダイオキシン類高感受性遺伝子（MMTV-DRE）の下流に分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を結合させた遺伝子（MMTV-DRE-SEAP）であることは好ましい。また、前記非ヒト哺乳動物は、マウス又はラットであることは好ましい。
本発明は、有害化学物質を含む環境に置かれるとマーカータンパクを産生する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を評価環境中で活動させ、前記遺伝子導入非ヒト哺乳動物の体液中に含まれるマーカータンパクの活性を指標とし、前記評価環境中に含まれる環境中有害化学物質を検出・定量することを特徴とする。
前記環境中有害化学物質としては、ダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素であり、前記マーカータンパクが分泌型アルカリホスファターゼであることは好ましい。
本発明は、有害化学物質を含む環境に置かれるとマーカータンパクを産生する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を、タバコ煙を主とする汚染空気中で活動させ、前記遺伝子導入非ヒト哺乳動物の体液中に含まれるマーカータンパクの活性を指標とし、タバコ煙の生物学的毒性を評価する方法である。前記マーカータンパクは分泌型アルカリホスファターゼであることは好適である。
本発明は、上述した環境中有害化学物質測定方法を時系列的に行い、評価環境中に含まれる環境中有害化学物質をモニタリングする環境中有害化学物質のモニタリング方法である。
本発明は、上述した遺伝子導入非ヒト哺乳動物を用いて、芳香族炭化水素受容体機能を促進する促進物質、又は抑制する抑制物質のスクリーニング方法である。
また、本発明は、上述した芳香族炭化水素受容体機能を促進する促進物質、又は抑制する抑制物質のスクリーニングにより得られた物質を有効成分として含有する、芳香族炭化水素受容体の機能の促進物質、又は抑制物質である。
本発明によれば、現実の環境で直接的に環境中有害化学物質である、例えば内分泌撹乱物質や一部の発がん物質等を容易に検出できる。また、複合的な環境中有害化学物質の影響を統合的に評価することができる。
1 HeDS細胞
10 ダイオキシン類応答性プラスミド（pDRE-SEAP）
11 ダイオキシン類高感受性遺伝子配列（MMTV-DRE）
12 分泌型マーカータンパク遺伝子（SEAP）
13 ポリアデニレーションシグナル（polyA）
10 ダイオキシン類応答性プラスミド（pDRE-SEAP）
11 ダイオキシン類高感受性遺伝子配列（MMTV-DRE）
12 分泌型マーカータンパク遺伝子（SEAP）
13 ポリアデニレーションシグナル（polyA）
発明を実施するための最良の形態について以下に述べる。
図１はダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素反応性プラスミドpDRE-SEAP10の構造図を示したものである。pDRE-SEAP10は、マウス乳ガンウイルスのプロモータ（以下、MMTV）の一部にダイオキシン類応答DNA配列（以下、DRE）を組み込んだダイオキシン類高感受性DNA配列（以下、MMTV-DRE11）およびその下流に位置する分泌型アルカリホスファターゼ（以下、SEAP）遺伝子12と、サルウイルス40（以下、SV40）由来のポリアデニレーションシグナル（以下、polyA13）とにより構成されている。
MMTV-DRE11は、ダイオキシン類に応答して活性化されることが知られているDREを4個、MMTVのプロモーターの一部に組み込んだものである。DRE単独のものに比べ強力なダイオキシン類への応答性がある。マーカータンパクとしてはSEAPを用いた。SEAPを含め、これまで分泌型マーカータンパクを用いたダイオキシン類のバイオアッセイ系は確立されていなかった。SEAPはルシフェラーゼと並び高感度に検出しうるマーカータンパクであるが、ルシフェラーゼと異なり細胞外に分泌されるため、細胞を破壊してタンパクを抽出する操作が不要である。
pDRE-SEAP10は遺伝子工学的常法により作製する。即ち、制限酵素により切り出し精製したMMTV-DRE11の断片を、プロモーターを持たないSEAPプラスミドのSEAP遺伝子12の上流に、T4DNAリガーゼを用いて組み込めばよい。
T4DNAリガーゼは、隣接するDNA鎖の5'末端と3'末端とを連結する酵素である。作製したpDRE-SEAP10は大腸菌に導入して大量に増やし、遺伝子工学的常法によりpDRE-SEAP10を精製する。
このpDRE-SEAPを制限酵素MluIおよびSalIにより切断し、3.8 kbのDNA断片MMTV-DRE-SEAP-polyAをアガロースゲルを用いた電気泳動により精製する。これを妊娠マウス（C57BL/6）から採取した受精卵雄性前核に注入し、偽妊娠マウスの卵管に移植する。移植した遺伝子導入受精卵から産仔を得ることで本発明の遺伝子導入マウスを作成することができる。
以下実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
遺伝子工学的常法によりpDRE-SEAP10を作成した。このpDRE-SEAPを制限酵素MluIおよびSalIにより切断し、3.8 kbのDNA断片MMTV-DRE-SEAP-polyAをアガロースゲルを用いた電気泳動により精製した。図２は精製したDNA断片MMTV-DRE-SEAP-polyAの電気泳動像である。DNA断片MMTV-DRE-SEAP-polyAを妊娠マウス（C57BL/6）から採取した受精卵雄性前核に注入し、それを偽妊娠マウスの卵管に移植して産仔を得、26匹の産仔の離乳に成功した。その産仔の尾の一部を採取し、DNAを抽出し、PCR法を行うことにより、5匹の産仔（No.2,5,15,24,25）においてSEAP遺伝子のゲノムへの組み込みを確認した（図３）。これらのマウスのうちNo.25を野生型マウスと交配させ、得られた雄の産仔のうちPCR法によりSEAP遺伝子のゲノムへの組み込みが確認されたものを以下に述べる実験に使用した。
樹立した遺伝子導入マウス（以下、DRESSAマウス）および野生型マウス（C57BL/6）の血液を尾静脈から採取した後、胃ゾンデを用いて2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD；ダイオキシン）を5 ng/g体重で強制経口投与した。その後24時間毎に採血を行い、血清中のSEAP活性を化学発光のシステムにより測定した。
具体的には、5μlの血清に15μlの緩衝液を加え、30分65℃でインキュベートし、内因性のアルカリホスファターゼ活性を失活させた。さらに内因性のアルカリホスファターゼの阻害剤であるL-ホモアルギニンを含む緩衝液を20μl加え5分放置した後、15μlの基質CSPDを加えた。30分暗所にて静置した後、ルミノメーターでSEAP活性を定量した。
図４に示す通り、DRESSAマウスにTCDDを投与した場合、血中SEAP活性は24時間後にはTCDD投与前の約12倍に達した。一方、野生型マウスにTCDDを投与した場合、血中SEAP活性の上昇は全く認められなかった。
図5はその後の血中SEAP活性の経時的な変化をグラフ化した図である。TCDDの経口単回投与により、その後も血中SEAP活性は上昇を続け、28日をピークとしてその後徐々に低下する推移をとった（●で示す推移）。一方、TCDD非投与のDRESSAマウスには、血中SEAP活性の上昇は全く認められなかった（○で示す推移）。
以上のように、DRESSAマウスを用いることにより、血清中のSEAP活性を指標にした環境有害化学物質のモニタリングが可能である。なお、無刺激時のDRESSAマウスの血中SEAP 活性は、野生型マウスのそれの約2.6倍の値を示した。
図6は、TCDDの投与量を変化させた場合の血中SEAP活性の推移を示す。TCDDを0.5, 1, 5 ng/g体重で強制経口投与し、その後21日目までの血中SEAP活性を測定した結果を示すグラフである。図6(a)のグラフに示すように、血中SEAP活性はTCDDの投与量に依存して上昇した。図6(b)のグラフに示すように、0.5 ng/g体重の低用量でも、7日目をピークとする一過性のSEAP活性の上昇を認めた（約4倍）。すなわちDRESSAマウスにおける血中SEAP活性は、有害化学物質の曝露量に相関して増加することがわかる。なお、0.1ng/g体重での投与量では、有意なSEAPの上昇は認められなかった。
図7は、TCDD投与前および投与後3日、21日目の肝臓におけるSEAP、 cytochrome P450（CYP1A1）、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)の遺伝子発現をPCR法により検討したものである。CYP1A1はTCDDにより誘導されることが知られている酵素、GAPDHはその発現がTCDDにより影響を受けない酵素である。TCDD投与前にはDRESSAマウスの肝臓にSEAP遺伝子の発現は認められないが、TCDD投与後にはSEAP遺伝子の発現誘導が観察され、しかも21日目は3日目よりも高い発現レベルを示した。この経過は、図5に示した血中SEAP活性の推移と極めて良く相関している。このことは、血中SEAP活性がその時々のDREの活性化の程度を良好に反映している事を意味している。
図8は、TCDDに対するDRESSAマウスの反応性の性差を見たものである。DRESSA No.25を野生型マウスと交配させ、得られた雌雄のマウスに5 ng/g体重のTCDDを強制経口投与し、その後21日目までの血中SEAP活性を測定した。その結果、雌においても血中SEAP活性の有意な上昇が認められたが、雄に比べその反応性・感度は低く、有害化学物質のモニタリングには雄のDRESSAマウスを用いるべきである事が明らかになった。
図9は、タバコ煙中には多種類のAhR活性化物質が含まれている事が知られていることから、DRESSAマウスを一時的にタバコ煙に曝露させ、その後の血中SEAP活性の推移を追ったグラフである。具体的には、500 ml のボトルにマウスを入れ、15分置きに12回、10 mgタールのタバコの主流煙45 mlに曝露させた。その間、ボトルの開口部にはネットを張り、マウスが自由に新鮮な空気を吸入できるようにした（●で示す推移）。対照群として、DRESSAマウスを同様な形でボトルに入れ、15分置きに12回、45 mlの空気に曝露させた（○で示す推移）。タバコ煙への曝露後、 マウスは通常の飼育環境に戻し、連日採血を行なった。図9に示すようにタバコ煙曝露後、血中SEAP活性は12 時間で有意に上昇し、24 時間でピークを示し、その後徐々に値は低下したが、曝露後4日目までSEAP活性の有意な増加が認められた。すなわち、DRESSAマウスにより外気や室内空気の汚染を直接的にモニタリングすることが可能である。
本明細書は、２００５年７月１日出願の特願２００５−１９４１８４に基づく。この内容はすべてここに含めておく。
本発明のダイオキシン類をはじめとする芳香族炭化水素等の有害化学物質に反応し、芳香族炭化水素受容体(AhR)の活性化を介してSEAPを産生・分泌する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を用いれば、煤煙が問題となる焼却場や工場近隣、排気ガスが問題となる幹線道路沿線等における特定の外気、あるいは喫煙室や喫煙車両等におけるタバコ煙が生物に与える影響について、継続的なモニタリングが可能である。
また、食品、飲料水を直接摂取・飲水させることによる有害物質のモニタリングや、環境サンプル、例えば河川水、土壌から抽出した有害化学物質の投与によるモニタリング、あるいはAhRを活性化する化学物質、例えば合成化合物、天然物抽出物質の探索と、その成果の予防医学への応用が可能である。
更に、AhRの活性化による有害作用を抑制する物質、例えば合成化合物、天然物抽出物質の探索と、その成果の治療医学への応用、及びタバコ各銘柄の健康への影響度を定量化するための新しいシステムと指標の開発を可能ならしめるものである。
Claims (15)
- 有害化学物質を含む環境に置かれるとマーカータンパクを産生する遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
- 前記有害化学物質は、ダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素である請求項１に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
- 前記マーカータンパクは、分泌型アルカリホスファターゼである請求項１又は請求項２に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
- 導入遺伝子が、ダイオキシン類高感受性遺伝子（MMTV-DRE）の下流に分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を結合させた遺伝子（MMTV-DRE-SEAP）である請求項１から３のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
- 前記非ヒト哺乳動物は、マウス又はラットであることを特徴とする請求項１に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物。
- 有害化学物質を含む環境に置かれるとマーカータンパクを産生する遺伝子導入非ヒト哺乳動物を評価環境中で活動させ、前記遺伝子導入非ヒト哺乳動物の体液中に含まれるマーカータンパクの活性を指標とし、前記評価環境中に含まれる有害化学物質を定量する環境中有害化学物質の定量方法。
- 前記有害化学物質は、ダイオキシン類及び／又は多環芳香族炭化水素である請求項６に記載の環境中有害化学物質の定量方法。
- 前記マーカータンパクは、分泌型アルカリホスファターゼである請求項６又は請求項７に記載の環境中有害化学物質の定量方法。
- 有害化学物質を含む環境に置かれるとマーカータンパクを産生する遺伝子導入非ヒト哺乳動物をタバコ煙を主とする汚染空気中で活動させ、前記遺伝子導入非ヒト哺乳動物の体液中に含まれるマーカータンパクの活性を指標とし、タバコ煙の生物学的毒性を評価するタバコ煙の生物学的毒性評価方法。
- 前記マーカータンパクは、分泌型アルカリホスファターゼである請求項９に記載のタバコ煙の生物学的毒性評価方法。
- 導入遺伝子が、ダイオキシン類高感受性遺伝子（MMTV-DRE）の下流に分泌型アルカリホスファターゼ（SEAP）遺伝子を結合させた遺伝子（MMTV-DRE-SEAP）である請求項９又は請求項１０に記載のタバコ煙の生物学的毒性評価方法。
- 前記非ヒト哺乳動物は、マウス又はラットであるタバコ煙の生物学的毒性評価方法。
- 請求項６又は請求項７に記載の環境中有害化学物質の定量方法を時系列的に実施し、評価環境中に含まれる有害化学物質をモニタリングする環境中有害化学物質のモニタリング方法。
- 請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の遺伝子導入非ヒト哺乳動物を用いた、芳香族炭化水素受容体機能を促進する促進物質、又は抑制する抑制物質のスクリーニング方法。
- 請求項１４に記載のスクリーニング方法により得られた物質を有効成分として含有する、芳香族炭化水素受容体機能の促進物質、又は抑制物質。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2005194184 | 2005-07-01 | ||
| JP2005194184 | 2005-07-01 | ||
| PCT/JP2006/310027 WO2007004361A1 (ja) | 2005-07-01 | 2006-05-19 | 遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いた環境中有害化学物質のモニタリング方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPWO2007004361A1 true JPWO2007004361A1 (ja) | 2009-01-22 |
Family
ID=37604237
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007523359A Pending JPWO2007004361A1 (ja) | 2005-07-01 | 2006-05-19 | 遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いた環境中有害化学物質のモニタリング方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPWO2007004361A1 (ja) |
| WO (1) | WO2007004361A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100595565C (zh) * | 2007-09-27 | 2010-03-24 | 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 | 一种基于ERα激活效应的环境内分泌干扰物的PCR定量检测方法与试剂盒 |
| KR100995382B1 (ko) | 2008-04-21 | 2010-11-19 | 경기도 | 정자를 이용한 환경호르몬 스크리닝 방법 |
| TWI572354B (zh) | 2010-09-09 | 2017-03-01 | 明治股份有限公司 | 抑制發炎之組成物 |
| KR101272315B1 (ko) | 2010-09-10 | 2013-06-07 | 경희대학교 산학협력단 | 새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005113767A1 (ja) * | 2004-05-24 | 2005-12-01 | Yamanashi University | ダイオキシン類等応答性プラスミド、ダイオキシン類等測定用遺伝子導入細胞、並びにそれを用いたダイオキシン類等検出方法及びバイオセンサー |
-
2006
- 2006-05-19 JP JP2007523359A patent/JPWO2007004361A1/ja active Pending
- 2006-05-19 WO PCT/JP2006/310027 patent/WO2007004361A1/ja active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2005113767A1 (ja) * | 2004-05-24 | 2005-12-01 | Yamanashi University | ダイオキシン類等応答性プラスミド、ダイオキシン類等測定用遺伝子導入細胞、並びにそれを用いたダイオキシン類等検出方法及びバイオセンサー |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6010034713, 財団法人母子健康学会 第１７回医学助成研究報告書, 20060601, ｐ． ２１−２３ * |
| JPN6010034715, Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ, 1998, Ｖｏｌ． １５１, ｐｐ． ３３−４４ * |
| JPN6010034718, フォーラム２００３：衛生薬学・環境トキシコロジー 講演要旨集, 20031010, ｐ． ９６ * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2007004361A1 (ja) | 2007-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Belforte et al. | Postnatal NMDA receptor ablation in corticolimbic interneurons confers schizophrenia-like phenotypes | |
| Jaramillo et al. | Altered striatal synaptic function and abnormal behaviour in Shank3 exon4‐9 deletion mouse model of autism | |
| Alfieri et al. | Reversible behavioral phenotypes in a conditional mouse model of TDP-43 proteinopathies | |
| Al-Anzi et al. | Response of Drosophila to wasabi is mediated by painless, the fly homolog of mammalian TRPA1/ANKTM1 | |
| Bauer et al. | Zebrafish embryos and larvae as alternative animal models for toxicity testing | |
| Cui et al. | Targeted expression of μ-opioid receptors in a subset of striatal direct-pathway neurons restores opiate reward | |
| Kasai et al. | High levels of dioxin-like potential in cigarette smoke evidenced by in vitro and in vivo biosensing | |
| Borgesius et al. | Accelerated age-related cognitive decline and neurodegeneration, caused by deficient DNA repair | |
| Dunlop et al. | Impaired spinal cord glutamate transport capacity and reduced sensitivity to riluzole in a transgenic superoxide dismutase mutant rat model of amyotrophic lateral sclerosis | |
| Shi et al. | Organ-specific roles of CYP1A1 during detoxication of dietary benzo [a] pyrene | |
| Yokota et al. | Social isolation-induced territorial aggression in male offspring is enhanced by exposure to diesel exhaust during pregnancy | |
| Kelp et al. | A novel transgenic rat model for spinocerebellar ataxia type 17 recapitulates neuropathological changes and supplies in vivo imaging biomarkers | |
| Shimshek et al. | Enhanced odor discrimination and impaired olfactory memory by spatially controlled switch of AMPA receptors | |
| Decarvalho et al. | Aversive cues fail to activate fos expression in the asymmetric olfactory-habenula pathway of zebrafish | |
| Poon et al. | Editor’s highlight: transgenic zebrafish reporter lines as alternative in vivo organ toxicity models | |
| Wallén-Mackenzie et al. | Restricted cortical and amygdaloid removal of vesicular glutamate transporter 2 in preadolescent mice impacts dopaminergic activity and neuronal circuitry of higher brain function | |
| Wei et al. | Long-term exposure of zebrafish to bisphenol S impairs stress function of hypothalamic-pituitary-interrenal axis and causes anxiety-like behavioral responses to novelty | |
| Brunnberg et al. | The constitutively active Ah receptor (CA-Ahr) mouse as a potential model for dioxin exposure—effects in vital organs | |
| Eells et al. | Chronic Toxoplasma gondii in Nurr1-null heterozygous mice exacerbates elevated open field activity | |
| Tong et al. | Localization and function of metabotropic glutamate receptor 8 in the enteric nervous system | |
| Bedeković et al. | Control and elimination of rabies in Croatia | |
| Tamura et al. | Drosophila PQBP1 regulates learning acquisition at projection neurons in aversive olfactory conditioning | |
| JPWO2007004361A1 (ja) | 遺伝子導入非ヒト哺乳動物、およびこれを用いた環境中有害化学物質のモニタリング方法 | |
| Sanahuja et al. | Multi-organ characterisation of B-esterases in the European sea bass (Dicentrarchus labrax): Effects of the insecticide fipronil at two temperatures | |
| Mar et al. | LY6E is a pan-coronavirus restriction factor in the respiratory tract |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20091225 |
|
| RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20091228 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100628 |
|
| A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100827 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20101012 |