KR101272315B1 - 새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성 - Google Patents

새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성에 관한 것으로서, 구체적으로 다이옥신 반응 요소(dioxin responsive element), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 세포와 혈청 전체를 사용함으로써, 루시퍼라제 활성을 측정하여 혈청 내 다이옥신 함량과 신체 변수들 간의 유의적인 상관성을 확인하였고, 혈청으로부터 다이옥신을 정제하기 위한 전처리 과정이 요구되는 기존의 방법으로부터 개선되어, 혈청 전체를 사용함에 따라 다수의 시료를 극소량으로도 쉽고 정확하게 분석할 수 있으므로, 다이옥신류 화합물에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포주에 전체 혈청(total serum)을 처리하는 본 발명의 검출 시스템은 혈청 내 다이옥신의 생물학적 검출에 유용하게 이용할 수 있고, 이러한 방법을 사용하여 혈청 내 존재하는 다이옥신과 같은 POPs의 여부를 정확히 검출함으로써, 특정 POPs와 환자의 질병인자 간의 상관성을 연구하고, 이를 질병의 발병 예측 및 치료 여부를 판정하는데 유용하게 사용할 수 있다.

Description

새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성{New biological detection method of dioxins in serum, and its diagnostic use in metabolic syndrome and related conditions}
본 발명은 새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성에 관한 것이다.
잔류성 유기 오염물질(persistent organic pollutants, POPs)은 자연계에 존재하지 않거나 극히 미량만이 존재하며, 대부분 인간이 필요를 위해 만들어낸 인위적 유기 화학 물질로서 다이옥신이 그 대표적인 예이다. POPs가 체내에 유입되면 쉽게 분해 및 배설되지 않고 조직 내에 축적된다. 최근에 이러한 산업 부산물, 살충제 또는 약품 등을 포함하는 환경성 화합물이 인간 및 많은 야생종에 잠재적인 내분비 교란 영향을 주는 것에 대한 대중의 관심이 증가하였다. 이에, 현재, 다이옥신류, 염화비페닐류, 유기인제 등 각종 POPs의 혈중 농도가 인슐린저항증, 당뇨병, 비만, 이상지질혈증 또는 고혈압의 발생과 관련성이 있음이 보고되고 있다(Lee DH et al., Diabetes Care, 2006, 29(7):1638-44; Lee DH et al., Diabetes Care, 2007, Mar;30(3):622-8; Lee DH et al., Diabetologia, 2007 Sep;50(9):1841-51).
한편, POPs의 대표 물질 중 하나인 다이옥신계 화합물은 환경호르몬(environmental hormone) 또는 내분비 교란물질(endocrine disrupter)이라 불리며 세계적으로 문제시되고 있다. 특히, 2,3,7,8-테르라클로로다이벤조-피-다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)은 환경호르몬 중에서 가장 독성이 강한 동시에 인간이 합성한 물질 중에서 가장 독성이 강한 화합물로서, 화학적으로 매우 안정적이고 자연환경에서 거의 반영구적으로 존재하며 체내에 유입되면 지방조직에 축적되어 일부는 소변 및 답즙으로 배설되나 쉽게 배설 또는 분해되지 않는 것으로 알려져 있다. TCDD를 처리한 마우스에서 간 내 유비퀴논(ubiquinone, CoQ)이 감소하였으며, ATP의 생성이 억제되었고(Toxicol. Appl. Pharmacol. 217: 363, 2006), TCDD는 AhR-의존적 ROS(AhR-dependent ROS)의 생성을 유도하여 미토콘드리아 막전압(ΔΨm)의 감소를 일으킴으로써 미토콘드리아의 기능을 억제하여 당뇨병을 포함한 대사증후군을 유발할 수 있음이 보고되었다.
한편, 다이옥신이 세포 내로 유입되면 다이옥신은 세포질 내에 존재하는 다이옥신수용체(Arylhydrocarbon receptor, AhR)에 특이적으로 결합한다. 이 다이옥신-수용체 복합체는 핵 내로 유입되고 핵 내에서 ARNT(AhR nuclear translocator)와 결합하여 DNA 결합형으로 바뀐다. 변환된 DNA 결합형 복합체는 특이유전자에 강하게 결합하는데 이 특이결합유전자가 바로 다이옥신 반응 요소(Dioxin Responsive Element, DRE)이며 DRE에 다이옥신 복합체가 결합하면 근접한 반응유전자인 P4501A1이 활성화되어 cytochrome P4501A1 효소군의 합성이 유도되고 이들 합성된 효소에 의하여 다이옥신의 독성이 발현된다.
사람 혈청 내에 존재하는 POPs 중 TCDD와 같은 계통의 화합물(TCDD Equivalent, TCDDEq)의 농도를 측정함으로써, POPs에 의해 유발되는 질병을 가진 환자를 분류하고 이들 물질의 제거와 치료 효과와의 상관성 등의 분석을 실시할 수 있다. 다이옥신을 측정하는 방법으로서는 기기분석법이 흔히 이용되고 있다. 현재까지 보고된 TCDDEq 분석 방법에는 가스크로마토그래피/질량분석기법(Gas Chromatography/Mass Spectrometry, GC/MS) 및 세포 기반 분석(cell-based assay)이 있다. 상기 GC/MS 방법은 TCDD와 같은 오염물질의 각 종류별 농도 및 존재 여부 측정이 가능하나, 고효율 분석(High-throughput assay)을 위해서는 고비용의 부담이 따르며, 분석을 위해 다량의 혈청 시료(25 ~ 200 ㎖)가 요구된다. 한편, 세포-기반 분석법(Cell-based assay)으로서, CALUX(Chemically Activated Luciferase Expression) 분석법이 기존에 알려져 있는데, 이는 생물학적 정량법으로서 유전자 조작을 통해 구축된 세포를 이용하여 다이옥신 존재시 루시퍼라제(luciferase)가 분비되는 시스템을 통하여 다이옥신류 화합물을 검출할 수 있다. DRE 및 루시퍼라제 유전자를 가지는 세포가 다이옥신에 노출되면 세포 내의 AhR, ARNT와 결합한 다이옥신은 핵 내의 DRE에 결합하고 이에 의해 루시퍼라제 발현 유전자가 유도되며 노출된 다이옥신 양에 비례하여 세포 내에서 루시퍼라제가 합성된다. 따라서 이 루시퍼라제의 활성도 변화를 다이옥신의 검색지표로 활용하게 된다. 이러한 방법은 다이옥신 유사 화합물의 측정이 가능하고 TCDD 등가( TCDD Equivalency, TEQ)를 측정할 수 있다. 그러나, 현재의 기술은 분석시간이 길고, 사람 혈청 시료로부터 헥산 등을 사용하여 추출 또는 정제하는 과정이 필요하여 다량의 혈청이 필요한 실정이다(최소 1 ㎖, 일반적으로 10~20 ㎖). 또한, 일시발현(transient transfection)되는 세포주를 사용하면 각 분석 간 편차(inter-assay variation)가 커서 신뢰도에 문제가 발생하고 시료의 개수가 많아질수록 처리 속도 및 신뢰도는 더욱 감소하게 된다. 아울러, 시료로부터 다이옥신을 추출하는 과정이 필요하다. 즉, 시료에 유기용매를 처리하여 지방을 추출하고 활성화된 산성 실리카겔 칼럼에 통과시키는 지방 정제과정을 거쳐 다이옥신을 추출하는 것이다. 따라서, 이러한 다이옥신의 추출 및 정제 과정 때문에 TCDD 표준물질의 분석값과 혈청 중의 TEQ를 정량한 값에 차이가 있게 된다(Michael, H. et al, 2000, Toxicol. Sciences, 54 : 183~193).
이와 같이, 기존의 방법은 고가의 분석장비가 요구되고 고도의 시료 정제를 위한 복잡한 전처리과정, 이로 인한 다량의 유기용매, 방사선표지물질 등 유독 시약이 소요되고 분석시간도 길기 때문에 시간, 노동력, 검사비 등의 절감을 위하여 높은 검출 감도가 보장되면서 간단한 전처리, 단시간 내의 검사 및 정량이 가능한 생물학적 검사법의 개발 및 응용이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 기존의 POPs 측정 방법의 문제점이 개선된, 쉽고 정확한 고효율의(high throughput)의 POPs 검출 방법을 개발하고자 연구한 결과, 혈청 시료 사용시 혈청으로부터 다이옥신을 정제하기 위한 전처리 과정이 요구되는 기존의 측정 방법과 달리, 전체 혈청을 사용함으로써 다수의 시료를 쉽고 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 소량의 혈청 시료를 사용하더라도 정확한 분석이 가능한 차별화된 생물학적 검출 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 새로운 혈청 내 다이옥신류의 생물학적 검출 방법, 및 이의 대사증후군 및 관련 증상에 대한 진단적 유용성을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조된 형질전환 세포에 피검자의 혈청을 처리한 후 배양하는 단계;
3) 단계 2)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 리포터 유전자의 발현이 검출된 경우, 혈청에 다이옥신류 화합물이 포함된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 혈청 내 다이옥신류 화합물의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조된 형질전환 세포에 당뇨병 또는 대사증후군이 의심되는 피검자의 혈청을 처리한 후 배양하는 단계;
3) 단계 2)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 리포터 유전자 발현이 검출된 경우, 당뇨병 또는 대사증후군의 발병가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 대사증후군의 발병가능성 예측 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조된 형질전환 세포에 당뇨병 또는 대사증후군에 대한 치료를 받은 피검자의 혈청을 처리한 후 배양하는 단계;
3) 단계 2)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 검출된 리포터 유전자의 발현 수준이 치료 전의 혈청을 처리한 대조군과 비교하여 감소한 경우, 당뇨병 또는 대사증후군이 완화, 개선 또는 치료된 것으로 판정하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 대사증후군의 예후 모니터링 방법을 제공한다.
본 발명의 환경호르몬 검출 방법은, 측정 전에 혈청으로부터 다이옥신을 정제하는 과정이 필요한 기존의 측정 방법으로부터 개선된 것으로서, 혈청 전체를 사용함에 따라 노동력 및 시간을 절감하여 다수의 시료를 쉽고 정확하게 높은 효율로 분석할 수 있고, 헥산(hexane)으로 추출하는 전처리 과정이 없어 소량의 혈청 시료를 사용하더라도 분석이 가능하므로, 혈청 내 환경호르몬의 생물학적 검출에 유용하게 이용할 수 있고, 아울러, 혈청 내 존재하는 다이옥신과 같은 POPs의 존재 여부를 정확히 판단함으로써, 특정 POPs와 환자의 질병인자 간의 상관성을 연구하고, 이를 질병의 발병 예측 및 치료 여부를 판정하는데 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 pCYP1A1-luc 벡터의 클로닝을 나타낸 그림이다.
도 2는 pCYP1A1-luc을 안정적으로 발현하는 Hepa1C1c7 세포주의 콜로니를 나타낸 그림이다.
도 3은 pCYP1A1-luc을 안정적으로 발현하는 Hepa1C1c7 세포주에 있어서, 인돌-3-카비놀에 대한 반응 검사 결과를 나타낸 그림이다.
도 4는 pCYP1A1-luc을 안정적으로 발현하는 Hepa1C1c7 세포주에 있어서, 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조-다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)에 대한 반응 검사 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 다이옥신 배수 유도 값의 분포를 나타낸 그림이다.
도 6은 직선회귀법에 의해 사람의 체중에 따른 그 혈청 내 다이옥신의 배수 유도를 분석한 그림이다.
도 7은 직선회귀법에 의해 사람의 bmi에 따른 그 혈청 내 다이옥신의 배수 유도를 분석한 그림이다.
도 8은 직선회귀법에 의해 사람의 wc에 따른 그 혈청 내 다이옥신의 배수 유도를 분석한 그림이다.
도 9는 직선회귀법에 의해 사람의 sbp에 따른 그 혈청 내 다이옥신의 배수 유도를 분석한 그림이다.
도 10은 직선회귀법에 의해 사람의 tg에 따른 그 혈청 내 다이옥신의 배수 유도를 분석한 그림이다.
도 11은 직선회귀법에 의해 사람의 fbs에 따른 그 혈청 내 다이옥신의 배수 유도를 분석한 그림이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 환경호르몬에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포를 이용한 혈청 내 환경호르몬의 생물학적 검출 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 검출 방법은
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조된 형질전환 세포에 피검자의 혈청을 처리한 후 배양하는 단계;
3) 단계 2)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 리포터 유전자의 발현이 검출된 경우, 혈청에 다이옥신류 화합물이 포함된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 다이옥신류 화합물은 폴리클로리네이티드 디벤조다이옥신류(polychlorinated dibenzodioxins; PCDDs), 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류(Polychlorinated dibenzo-furans; PCDFs), 폴리클로리네이티드 바이페닐류(PCBs), 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본류(Polycyclic aromatic hydrocarcons; PAHs), 플라보노이드류(Flavonoids) 또는 페스티사이드에 속하는 모든 화합물인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고, 상기 DRE에 결합하여 전사활성에 영향을 미치는 환경호르몬이라면 모두 가능하며, 다이옥신과 유사한 기능을 갖는 화합물을 모두 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 다이옥신-반응 인자는 1개 이상 포함되고, 3 내지 4개인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 프로모터는 MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터, SV40 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 글루코코르티코이드 반응 인자(glucocorticoid response element) 부위를 제거한 MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus) 유래의 프로모터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 프로모터는 인핸서 부위가 없는 최소 프로모터일 수 있고, 리포터 유전자의 전사 활성 수준은 최소 프로모터의 상부에 인접한 인핸서 또는 시스-반응 요소에 의해 결정될 수 있으므로 전사 활성에 영향을 미치는 다른 요소의 효과는 완전하게 제거될 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 리포터 유전자는 루시퍼라제 (luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chloramphenicol acetyl transferase) 및 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 활성 분석의 편이성 및 민감도 측면에서 루시퍼라제가 사용되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 형질전환 세포는 안정하게 발현하는 형질전환된 세포이고 형질전환된 리포터벡터가 숙주의 염색체로 삽입되어 숙주 세포의 유전적 레파토리의 안정한 일부가 된다는 것을 의미하며, 이에 의해 형질전환된 리포터벡터 내의 유전자의 안정한 발현이 최소 30 세대에 걸쳐 가능하게 될 수 있다.
상기 단계 1)의 숙주세포는 진핵세포이고, 포유동물 세포인 것이 바람직하고, 포유동물 종양세포주인 것이 더욱 바람직하며, 마우스 간암세포주, 예컨대 Hepa1c1c7인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
다이옥신이 세포 내로 유입되면 다이옥신은 세포질 내에 존재하는 다이옥신 수용체(Arylhydrocarbon receptor, AhR)에 특이적으로 결합하고, 핵 내로 유입된 다이옥신-수용체 복합체는 핵 내에서 ARNT(AhR nuclear translocator)와 결합하여 DNA 결합형으로 바뀌므로, 상기 ARNT 및 AhR을 내인적으로(endogenous) 발현하는 세포라면 무엇이든 상기 숙주세포로서 사용가능하다.
상기 형질전환은 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법, 염화 칼슘(CaCl2) 침전법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반 또는 리포펙타민 매개된 방법 등을 사용하여 수행할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
기존의 다이옥신류 화합물의 측정 방법은 시료에 유기용매를 처리하여 지방을 추출하고 지방 정제과정을 거쳐 다이옥신을 추출하는 전처리 과정이 필요하나, 상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 혈청은 전체 혈청(total serum)으로서, 혈청 전체를 사용할 수 있다.
상기 혈청은 형질전환 세포에 처리하기 전에 형질전환 세포에 대한 혈청의 안전성을 위하여 열처리 비활성화(heat activation)되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 서열번호 1로 기재되는 4개의 다이옥신 반응 요소(dioxin responsive element, DRE) 결합 부위(5'-TNGCGTG-3')를 포함하는 마우스 CYP1A1 프로모터, 및 마우스 유방암 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV)의 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR)를 포함하는 재조합 리포터유전자 벡터를 제조하고(도 1 참조), 이를 마우스 간암 세포주인 Hepa1c1c7에 형질전환하여, 상기 재조합 리포터유전자를 안정적으로 발현하는 세포주를 제조하였다(도 2 참조). 상기 제조된 세포주를 대상으로, 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조-p-다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)에 대한 반응 검사를 실시하였다. 그 결과, TCDD를 처리하지 않은 대조군에 비해 10 내지 1000 pM 농도의 TCDD를 처리한 경우 현저히 루시퍼라제 활성이 증가하는 것으로 나타났다(도 4 참조). 이에, 상기 재조합 리포터유전자를 안정적으로 발현하는 세포주는 TCDD에 반응하여 루시퍼라제 활성을 효과적으로 나타냄을 확인하였다.
본 발명자들은 상기 제조된 세포주를 이용하여, 사람의 혈청 시료 내 존재하는 다이옥신 존재 여부를 검출하였고, 다이옥신 정도와 신체계측 변수 간의 상관관계를 분석하였다. 혈청 시료를 준비하기 위하여, 97명의 사람으로부터 수득한 혈청 시료를 65℃에서 30분 동안 열처리 불활성화(heat inactivation)하여, 세포배양에 대한 안전성을 부여한다. 상기 열처리 불활성화는 혈청을 가열하여 생물학적 활성을 소실시키는 것을 말하고, 혈청 중에는 세포증식인자나 혈청 단백질 외에 체액성 면역을 담당하는 인자의 하나로 보체를 함유하고 있다. 다양한 보체 중에는 배양세포를 인식해서 세포독성을 나타내는 것이 함유되어 있어서 혈청을 그대로 배지에 넣어서 배양에 사용하면 세포증식이 억제되거나 사멸할 수 있으므로, 이에 안정성을 위하여 열 불활성화를 실시하였다.
상기와 같이 준비한 혈청 시료 10 ㎕를 상기 재조합 리포터유전자를 안정적으로 발현하는 세포주에 처리하고 루시퍼라제 분석을 실시하여, 루시퍼라제 활성과 신체계측 변수 간의 상관성을 분석한 결과, 97개의 사람 혈청 시료에 대한 루시퍼라제의 배수 유도 값은 2.00 내지 3.00 배수 구간에 대부분 분포하였고 약 2.50 내지 2.65 배수에 가장 높은 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 배수 유도 값의 평균값은 약 2.35 배수인 것으로 확인되었다(도 5 참조).
또한, 직선회귀법(linear regression)에 의해 사람의 체중, 체질량지수(body mass index, bmi), 허리둘레(waist circumference, wc), 수축기 혈압(systolic blood pressure, sbp), 확장기혈압(diastolic blood pressure, dbp), 중성지방(triglyceride, TG), 또는 공복시혈당(fasting blood sugar, fbs) 지수와 다이옥신 사이에 유의적인 상관성이 있음을 확인하였고, 상기 변수 값이 증가할수록 다이옥신의 배수 값도 증가하는 경향을 나타냈다(도 6 내지 11 참조). 다이옥신 배수 유도 값은 비음주 및 비흡연자에 비해 음주 및 흡연자에게서 더욱 높게 측정되었고, 다변량 분석(multivariate analysis)을 통하여 상관성이 있는 변수들로 모두 보정한 결과, 음주 여부만이 유의적인 상관성이 유지됨을 확인하였다. 또한, 내당능장애(impaired glucose tolerance, IGT) 및 공복혈당장애(impaired fasting glucose, IFG)로 구성되는 당조절장애(impaired glucose regulation, IGR), 당뇨병(diabetes mellitus, DM), 및 정상내당능(normal glucose tolerance, NGT)에 있어서, NGT의 혈청에 비해 IGR 또는 DM의 혈청에서 루시퍼라제 분석값이 높았으며, IGR 및 DM 사이에는 유의적인 차이가 없었다. 대사증후군 요소(metabolic syndrome component, MetS component) 개수에 따른 다이옥신 배수 유도를 분석한 결과, MetS 요소 수가 늘어날수록 다이옥신 배수 유도 값이 증가하였고, MetS 환자에 있어서는 정상에 비해 다이옥신 배수 유도 값이 현저히 증가한 것으로 나타났다. 아울러, 다이옥신 배수 유도의 증가가 대사증후군 또는 당뇨병에 대한 위험도에 어떠한 상관성을 갖는지를 분석한 결과, 다이옥신의 배수 유도 값이 1 증가할 때마다 대사증후군 및 당뇨병 위험이 각각 19.7배 및 11.9배 증가하는 것으로 분석되었고, 이를 bmi 지수로 보정하더라도 배수 유도 값이 1씩 증가할 때마다 대사증후군 및 당뇨병이 각각 13배 및 8.7배로 증가하였으며, 나이, 성별 및 bmi로 보정하여도 배수 유도 값이 증가하면 대사증후군 또는 당뇨병도 증가하는 것으로 확인되었다.
이와 같은 결과를 통하여, 본 발명과 이전 보고들의 기술적 특징 및 효과를 비교해 보면, 하기 표 1과 같이, 선행 문헌에는 CALUX 분석 시스템을 사용하기 위해, 헥산과 같은 유기용매를 사용하여 혈청으로부터 다이옥신을 추출하는 전처리하는 과정이 수반되었다. 반면에, 본 발명은 혈청을 간단한 열처리 비활성화한 후 바로 분석이 함으로써 시간, 비용 및 노동력의 절감이라는 장점이 있었다. 또한, 분석에 필요한 혈청의 양에 있어서도, 본 발명의 시스템으로는 선행 문헌에 비해 약 1/1000 만큼의 혈청으로 분석가능한 것이 확인되었으며, 더욱 많은 양을 사용한 선행문헌과 유사한 민감도를 갖는 고효율의 분석 시스템임을 입증하였다.
CALUX 분석 시스템(1) CALUX 분석 시스템(2) 고감도 CALUX 분석 시스템
문헌 Garrison PM et al (1996) Fund. Appl. Toxicol. 30:194-203 Han D et al. (2004) BioFactors 20:11-22 본 발명
형질전환 일시적(Transient) 안정적(Stable) 안정적(Stable)
벡터 pGudLuc1.1 pGL2-basic pGL3-basic
혈청의 전처리 헥산 추출 후
DMSO에 용해		 헥산 추출 후
DMSO에 용해		 열처리 비활성화
분석에 사용한 혈청의 양 10 ~ 20 ㎖ 1 ~ 10㎖ 10 ㎕
스크리닝 시스템 24 웰 분석 시스템 96 웰 분석 시스템 96 웰 분석 시스템
세포주 Hepa1c1c7 마우스 간암 세포주 H1L1.6 마우스 간암 세포주 Hepa1c1c7 마우스 간암세포주
사람 혈액에서의 민감도 1 pM ~ 1 nM 1 pM ~ 1 nM 1 pM ~ 1 nM
따라서, 상기 다이옥신류 화합물의 검출 방법으로서 확인된 다이옥신류의 혈청 내 함량과 신체의 여러 변수 간에는 유의적인 상관성이 있음을 확인하였으므로, 시료로부터 다이옥신을 정제하기 위한 전처리 과정이 요구되는 기존의 측정 방법과 달리, 혈청 전체를 사용함에 따라 노동력 및 시간을 절감함으로써 다수의 시료를 쉽고 정확하게 분석할 수 있을 뿐만 아니라, 소량의 혈청 시료를 사용하더라도 정확한 분석이 가능하므로, 환경호르몬에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포주 및 전체 혈청(total serum)은 혈청 내 환경호르몬의 생물학적 검출에 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 다이옥신류 화합물에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포를 이용한, 당뇨병 또는 대사증후군의 발병 가능성 예측 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 예측 방법은
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조된 형질전환 세포에 당뇨병 또는 대사증후군이 의심되는 피검자의 혈청을 처리한 후 배양하는 단계;
3) 단계 2)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 리포터 유전자 발현이 검출된 경우, 당뇨병 또는 대사증후군의 발병가능성이 있는 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
아울러, 본 발명은 다이옥신류 화합물에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포, 및 전체 혈청을 이용한, 당뇨병 또는 대사증후군의 예후 모니터링 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 예후 예측 방법은
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 단계 1)에서 제조된 형질전환 세포에 당뇨병 또는 대사증후군에 대한 치료를 받은 피검자의 혈청을 처리한 후 배양하는 단계;
3) 단계 2)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 수준을 검출하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)에서 검출된 리포터 유전자의 발현 수준이 치료 전의 혈청을 처리한 대조군과 비교하여 감소한 경우, 당뇨병 또는 대사증후군이 완화, 개선 또는 치료된 것으로 판정하는 단계를 포함하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 다이옥신-반응 인자는 1개 이상 포함되고, 3 내지 4개인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 프로모터는 MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터, SV40 프로모터, CMV(cytomegalovirus) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, MMTV(Mouse Mammary Tumor Virus) 유래의 프로모터인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 리포터 유전자는 루시퍼라제 (luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chloramphenicol acetyl transferase) 및 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고, 활성 분석의 편이성 및 민감도 측면에서 루시퍼라제가 사용되는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 단계 1)의 숙주세포는 진핵세포이고, 포유동물 세포인 것이 바람직하고, 포유동물 종양세포주인 것이 더욱 바람직하며, 마우스 간암 세포주, 예컨대 Hepa1c1c7인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않고, ARNT 및 AhR을 내인적으로(endogenous) 발현하는 세포라면 무엇이든 상기 숙주세포로서 사용가능하다.
상기 형질전환은 전기천공법(electroporation), 원형질 융합, 인산 칼슘(CaPO4) 침전법, 염화 칼슘(CaCl2) 침전법, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반 또는 리포펙타민 매개된 방법 등을 사용하여 수행할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 혈청은 전체 혈청(total serum)으로서, 혈청으로부터 다이옥신류 화합물을 정제하는 전처리 과정 없이, 혈청 전체를 사용할 수 있다.
상기 혈청은 형질전환 세포에 처리하기 전에 형질전환 세포에 대한 혈청의 안전성을 위하여 열 비활성화되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명자들은 다이옥신 반응 요소(dioxin responsive element, DRE) 결합 부위, 마우스 유방암 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV) 유래의 프로모터, 그 하부에 루시퍼라제 유전자를 포함하는 재조합 리포터유전자 벡터가 안정적으로 형질전환된 세포주를 제조하여, 사람의 혈청 내 존재하는 다이옥신 존재 여부와 신체계측 변수 간의 상관관계를 분석한 결과, 사람의 체중, bmi, wc, sbp, dbp, tg 또는 fbs 변수와 다이옥신 사이에 유의적인 상관성이 있음을 확인하였고, 내당능장애(impaired glucose tolerance, IGT) 및 공복혈당장애(impaired fasting glucose, IFG)로 구성되는 당조절장애(impaired glucose regulation, IGR), 당뇨병(diabetes mellitus, DM), 및 정상내당능(normal glucose tolerance, NGT)과 다이옥신 함량 간의 유의적인 상관성을 입증하였으며, 특히, NGT의 혈청에 비해 IGR 또는 DM 환자의 혈청에서 루시퍼라제 분석값이 높은 것을 확인하였다. 또한, 대사증후군 요소(metabolic syndrome component, MetS component) 수가 증가할수록 다이옥신 배수 유도 값이 증가하였고, MetS 환자는 정상인에 비해 다이옥신 배수 유도 값이 현저히 높은 것을 확인하였으며, 다이옥신 배수 유도의 증가가 대사증후군 또는 당뇨병에 대한 위험도를 증가시키는 것을 확인하였다.
따라서, 다이옥신류의 혈청 내 함량과 당뇨병 또는 대사성증후군 간에는 유의적인 상관관계가 있음을 확인하였으므로, 환경호르몬에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 포함하는 형질전환 세포주 및 전체 혈청(total serum)을 이용한 상기 다이옥신류 화합물의 검출 방법은 당뇨병 또는 대사증후군의 발병가능성 및 예후의 예측에 유용하게 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세하게 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
재조합 리포터유전자를 안정적으로 발현하는 세포주의 제조
<1-1> 재조합 리포터유전자 벡터의 제조
pGudLuc1.1 벡터로부터, 4개의 DRE 결합 부위(AhR 결합 부위)(5'-TNGCGTG-3')를 가지고 있는 마우스 CYP1A1 프로모터(promotor)(482 bp), 및 글루코코르티코이드 반응 요소(glucocorticoid response element) 부위를 제거한 마우스 유방암 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV)의 긴 말단 반복(long terminal repeat, LTR)을 포함하는 1.8 kb의 바이러스 프로모터 단편을 Hind Ⅲ 제한 효소로 절단한 다음, Hind Ⅲ로 절단된 pGL3-basic 벡터의 Hind Ⅲ 부위에 클로닝하여 pCYP1A1-luc 벡터를 제조하였다(Han et al., BioFactors, 20:11-22, 2004). 프로모터의 방향은 시퀀싱으로 확인하였다(도 1).
<1-2> 재조합 리포터유전자를 발현하는 형질전환 세포주의 제조
1×105의 마우스 간암 세포주인 Hepa1c1c7을 6 웰 플레이트에 분주하고, 24시간 동안 배양하여 50%의 밀도가 되도록 하였다. 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 pCYP1A1-luc 벡터 2 ㎍과 pcDNA3.1 벡터 0.5 ㎍을, 혈청 및 항생제가 포함되지 않은 100 ㎕의 MEM-α 배지에 첨가하여 10 ㎕의 Superfect(Qiagen)와 혼합한 다음, 상온에서 10분간 반응시켰다. 그런 다음, 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 포함된 600 ㎕의 MEM-α 배지를 넣어 혼합한 후, DPBS로 세척한 Hepa1c1c7 세포에 700 ㎕의 Superfect-DNA 반응액을 넣고, 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 세포를 DPBS로 세척하였고, 10% FBS 및 1% P/S가 포함된 신선한 2 ㎖의 MEM-α 배지로 교체하였다. 24시간 후부터 G418 300 ㎍과 첨가하여, 약 3주 동안 G418 저항성 세포를 선별하였다. 콜로니가 생성되면 각각의 콜로니들을 60 ㎜ 배양 플레이트로 옮겨주었다(도 2).
재조합 리포터유전자를 발현하는 형질전환 세포주에 대한 반응 검사
<2-1> 인돌-3- 카비놀(indole-3-carbino)을 사용한 반응 검사
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 pCYP1A1-luc를 안정적으로 발현하는 세포주를 60 ㎜ 배양 디쉬에 1×105의 세포수로 분주하여 48시간 동안 배양하였다. 배양 48시간 후 0.5% charcoal-stippped FBS가 포함되고 페놀 레드가 없는 DMEM 배지로 교체하고, 인돌-3-카비놀(Indole-3-carbinol)을 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 및 100 μM의 농도로 각각 4, 8 또는 24시간 동안 처리하였다. 각각의 처리 시간 후 세포를 회수하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 3과 같이, 0.001 내지 10 μM 농도의 인돌-3-카비놀 처리군은 무처리군 보다 농도의존적으로 루시퍼라제 활성이 증가하였고, 특히 100 μM 농도에서는 약 3배 이상 루시퍼라제 활성이 증가하였다. 이때, 처리시간에 따른 유의적인 차이는 나타나지 않았다(도 3).
<2-2> 2,3,7,8- 테트라클로로다이벤조 -p-다이옥신 (2,3,7,8- tetrachlorodibenzo -p-dioxin, TCDD )을 사용한 반응 검사
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 pCYP1A1-luc를 안정적으로 발현하는 세포주를 60 ㎜ 배양 디쉬에 2×105의 세포수로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 24시간 후 0.5% charcoal-stipped FBS가 포함되고 페놀 레드가 없는 DMEM 배지로 교체하고, 2,3,7,8-테트라클로로다이벤조-p-다이옥신 (2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, TCDD)을 0, 0.1, 1, 10, 100, 및 1000 pM의 농도로 각각 4 또는 8시간 동안 처리하였다. 각각의 처리 시간 후 세포를 회수하여 루시퍼라제 분석을 수행하였다
그 결과, 도 4와 같이, 0.1 또는 1 pM의 TCDD를 처리한 경우에는 TCDD를 처리하지 않은 대조군과 유사한 수준의 루시퍼라제 활성을 확인하였으나, 10 내지 1000 pM의 TCDD에 대해서는 대조군에 비해 현저히 루시퍼라제 활성이 증가한 것으로 나타났고, 처리 시간이 길수록 루시퍼라제 활성이 다소 증가하였으나 현저한 차이는 없었다(도 4).
사람 혈청 내에 존재하는 다이옥신의 검출
<3-1> 사람 혈청 시료의 준비
97명의 사람으로부터 수득한 혈청 시료는 65℃에서 30분 동안 열 불활성화(heat inactivation)하여 전처리하였다. 이러한 과정은 일반적인 세포배양 방법에 있어서, 열 처리에 의한 불활성화에 의해 세포배양에 대한 안전성을 부여한다.
<3-2> 사람 혈청 내 다이옥신의 검출 및 신체 변수에 따른 상관관계 분석
상기 실시예 <1-2>에서 제조한 pCYP1A1-luc를 안정적으로 발현하는 세포주 5×104을 96 웰 플레이트에 분주한 후 24시간 동안 배양하였다. 배지를 페놀 레드가 없는 90 ㎕ DMEM 배지로 교체하고, 최종농도 10%의 사람 혈청 시료 10 ㎕를 첨가한 다음 24시간 동안 처리하였다. 그런 다음, 각 웰에 있는 세포를 luciferase lysis buffer(Promega)로 용해하였다. 각 웰의 세포 용해물(lysate)을 1 ㎕씩 96 웰로 옮겨서 단백질을 BCA법으로 정량하였다. 나머지 세포 용해물은 Promega luciferase assay kit를 사용한 루시퍼라제 분석에 이용하였다. 루시퍼라제 활성은 단백질 농도로 보정하였고, 배수 유도(fold induction) 또는 %대조군(%Control)으로서 그 결과를 표시하였다.
그 결과, 도 5와 같이, 97개의 사람 혈청 시료에 대한 배수 유도 값은 2.00 내지 3.00 배수 구간에 대부분 분포하고 그 외 구간에서는 비교적 낮으며, 약 2.50 내지 2.65 배수에 가장 높은 비율로 존재하는 것으로 나타났다. 배수 유도 값의 평균(Mean)은 약 2.35 배수인 것으로 확인되었다(도 5).
또한, 다이옥신과 여러 신체 변수와의 상관관계를 분석한 결과, 각각의 변수들에 대한 r 및 P 값이 하기 표 2와 같이 나타났다. 특히, 도 6 내지 11과 같이, 직선회귀법(linear regression)에 의해 사람의 체중, 체질량지수(body mass index, bmi), 허리둘레(waist circumference, wc), 수축기 혈압(systolic blood pressure, sbp), 확장기혈압(diastolic blood pressure, dbp), 중성지방(triglyceride, TG), 또는 공복시혈당(fasting blood sugar, fbs) 지수와 다이옥신 사이에 유의적인 상관성이 있음을 확인하였고, 상기 변수 값이 증가할수록 다이옥신의 배수 값도 증가하는 경향을 나타냈다(도 6 내지 11).
r P value
나이 0.0747397 0.466872841
체중 0.3287115 0.001011469
체질량지수
( bmi ) 		0.3385887 0.000740128
허리둘레
( wc ) 		0.4194761 2.0988E-05
수축기혈압
( sbp ) 		0.3163346 0.001596079
확장기혈압
( dbp ) 		0.2696278 0.007568065
혈청 크레아틴
(serum creatinine, cr)		 0.1057983 0.302361753
백혈구수치
(wbc)		 0.185271 0.06924526
got -0.058096 0.571911012
gpt 0.0216235 0.833487555
콜레스테롤
(chol)		 0.1860382 0.068080471
중성지방
( tg ) 		0.2508027 0.013218103
고밀도지단백
(hdl)		 -0.1656577 0.104886065
저밀도지단백
(ldl)		 0.1170971 0.253347357
공복시혈당
( fbs ) 		0.2320468 0.022191056
당화혈색소
(hba1c)		 0.1845205 0.070400124
또한, 음주 및 흡연 여부를 기준으로 혈청 시료의 다이옥신 배수 값을 분석한 결과, 하기 표 3 및 4과 같이, 다이옥신 배수 유도 값은 음주 및 흡연자에게서 더욱 높게 측정되는 것으로 확인되었다.
음주여부 N 평균
(Mean)		 표준편차
(Std. Deviation)		 평균의 표준오차
(Std. Error Mean)
배수
(fold)		 무 43 2.1425 0.49264 0.07513
유 50 2.5111 0.54727 0.07740
* P=0.001
흡연여부 N 평균
(Mean)		 표준편차
(Std. Deviation)		 평균의 표준오차
(Std. Error Mean)
배수
(fold)		 무 64 2.2448 0.55652 0.06956
유 29 2.5652 0.49577 0.09206
* P=0.009
또한, 다변량 분석(multivariate analysis)을 실시한 결과, 하기 표 5와 같이, 상관성 있는 변수를 모두 입력하여 보정한 경우, 음주 여부만이 유의적인 상관성이 유지됨을 확인하였다.
모델
비표준화계수
(Unstandardized Coefficients)		 표준화계수
(Standardized Coefficients)
 t
 Sig.
B 표준오차
(Std. Error)		 Beta B 표준오차
(Std. Error)
1
 (Constant) 0.396 0.534 0.742 0.460
bmi 0.031 0.017 0.188 1.878 0.064
sbp 0.006 0.004 0.171 1.666 0.099
흡연여부 0.090 0.125 0.076 0.719 0.474
음주여부 0.290 0.108 0.263 2.682 0.009
tg 0.000 0.001 0.086 0.834 0.407
fbs 0.002 0.003 0.068 0.660 0.511
또한, 정상내당능(normal glucose tolerance, NGT), 내당능장애(impaired glucose tolerance, IGT) 및 공복혈당장애(impaired fasting glucose, IFG)로 구성되는 당조절장애(impaired glucose regulation, IGR), 및 당뇨병(diabetes mellitus, DM)에 따라, 다이옥신에 대한 루시퍼라제를 분석한 결과, 하기 표 6과 같이, NGT의 혈청에 비해 IGR 또는 DM의 혈청에서 루시퍼라제 분석값이 높았으며, IGR 및 DM 사이에는 유의적인 차이가 없었다.
NGT
N=50		 IGR
N=24		 DM
N=23		 IGR vs. NGT DM vs. NGT DM vs. IGT
평균 SD 평균 SD 평균 SD p value p value p value
나이 44.1 10.3 49.0 9.3 49.3 8.5 0.052 0.037 0.894
bmi 23.2 3.5 24.7 3.1 25.6 2.4 0.084 0.004 0.246
wc 80.8 7.8 85.7 9.2 87.3 7.6 0.022 0.002 0.508
sbp 116.5 11.4 130.1 16.4 129.7 16.9 0.000 0.000 0.930
dbp 68.5 8.3 76.0 9.7 77.3 11.6 0.001 0.000 0.677
bun 14.4 3.7 14.1 3.5 14.5 3.5 0.705 0.868 0.635
cr 0.8 0.2 0.8 0.2 0.9 0.1 0.771 0.111 0.140
hb 14.5 1.5 14.3 1.7 14.6 1.6 0.500 0.771 0.426
wbc 6.3 1.6 6.5 1.5 6.1 1.3 0.551 0.669 0.341
plt 22.7 4.8 24.0 5.5 24.0 4.9 0.289 0.290 0.978
got 23.4 6.1 23.6 7.4 25.1 7.2 0.880 0.296 0.495
gpt 23.5 8.2 23.3 13.8 27.7 17.5 0.935 0.159 0.333
ggt 27.5 17.1 40.5 39.8 56.3 43.6 0.052 0.005 0.202
chol 198.1 31.9 193.0 34.7 217.6 38.0 0.531 0.025 0.025
tg 112.2 95.2 144.9 118.5 171.9 80.1 0.206 0.011 0.367
hdl 59.8 14.2 56.0 14.9 53.6 12.7 0.299 0.081 0.558
ldl 115.9 30.3 108.0 35.1 129.6 32.4 0.322 0.083 0.034
fbs 90.0 5.6 104.5 4.3 114.5 37.1 0.000 0.005 0.211
hba1c 6.1 0.2 6.1 0.3 7.1 1.2 0.692 0.001 0.001
배수 ( calux ) 2.05 0.47 2.58 0.42 2.77 0.46 0.000 0.000 0.152
또한, 대사증후군 요소(metabolic syndrome component, MetS component) 개수에 따른 다이옥신 배수 유도를 분석한 결과, 하기 표 7 및 8과 같이, MetS 요소 수가 늘어날수록 다이옥신 배수 유도 값이 증가하는 것을 확인하였고, MetS 환자에 있어서는 정상에 비해 다이옥신 배수 유도 값이 현저히 증가한 것으로 나타났다.
MetS 요소수
 평균
 N 표준편차
0.00 2.0191 25 0.47701
1.00 2.1790 23 0.44884
2.00 2.4048 24 0.43824
3.00 2.8263 16 0.47832
4.00 2.7213 6 0.71194
5.00 2.6845 2 0.17577
합계 2.3461 96 0.54742
* P < 0.001, 직선회귀방법
MetS 여부 N 평균 표준편차 평균의 표준오차
배수 .00 72 2.1987 0.47686 0.05620
1.00 24 2.7882 0.51367 0.10485
* P < 0.001, t test
아울러, 다이옥신 배수 유도의 증가가 대사증후군 또는 당뇨병에 대한 위험도에 어떠한 상관성을 갖는지를 분석한 결과, 하기 표 9 내지 11과 같이, 다이옥신 배수 유도 값이 1 증가할 때마다 대사증후군 및 당뇨병 위험이 각각 19.7배 및 11.9배 증가하는 것으로 분석되었다. 이를 bmi 지수로 보정하더라도 배수 유도 값이 1씩 증가할 때마다 대사증후군 및 당뇨병이 각각 13배 및 8.7배로 유의적으로 증가하는 것으로 나타났으며, 나이, 성별 및 bmi로 보정하여도 대사증후군 또는 당뇨병이 증가하는 것으로 확인되었다.
B S.E. Wald df Sig. Exp(B)
대사증후군
 Step 1(a) fold 2.981 0.776 14.742 1 0.000 19.701
Constant -8.565 2.033 17.750 1 0.000 0.000
당뇨병
 Step 1(a)
 fold 2.478 0.686 13.066 1 0.000 11.920
Constant -7.374 1.802 16.742 1 0.000 0.001
B S.E. Wald df Sig. Exp(B)
대사증후군 Step 1(a) fold 2.577 0.808 10.160 1 0.001 13.154
bmi 0.260 0.109 5.701 1 0.017 1.298
Constant -14.037 3.266 18.475 1 0.000 0.000
당뇨병 Step 1(a) fold 2.173 0.702 9.574 1 0.002 8.788
bmi 0.101 0.097 1.077 1 0.299 1.106
Constant -9.137 2.656 11.836 1 0.001 0.000

B
 S.E. Wald df
 Sig.
 Exp(B)
대사증후군 Step 1(a) fold 2.422 0.837 8.375 1 0.004 11.264
bmi 0.294 0.116 6.426 1 0.011 1.342
나이 0.040 0.031 1.727 1 0.189 1.041
성별 0.260 0.642 0.163 1 0.686 1.296
Constant -16.789 4.135 16.488 1 0.000 0.000
당뇨병 Step 1(a) fold 1.961 0.707 7.701 1 0.006 7.105
bmi 0.103 0.102 1.026 1 0.311 1.109
나이 0.036 0.029 1.536 1 0.215 1.037
성별 -.437 0.591 0.547 1 0.459 0.646
Constant -9.753 3.244 9.041 1 0.003 0.000
서열목록 전자파일 첨부

Claims (14)

1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 피검체로부터 분리된 혈청을 열처리 비활성화하여 시료를 얻는 단계;
3) 혈청이 포함되지 않은 배지에 단계 1)에서 얻은 형질전환 세포와 단계 2)에서 얻은 시료를 넣고 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 혈청 내 다이옥신 화합물의 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 다이옥신류 화합물은 폴리클로리네이티드 디벤조다이옥신류(polychlorinated dibenzodioxins; PCDDs), 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류(Polychlorinated dibenzo-furans; PCDFs), 폴리클로리네이티드 바이페닐류(PCBs), 폴리사이클릭 아로마틱 하이드로카본류(Polycyclic aromatic hydrocarcons; PAHs), 플라보노이드류(Flavonoids) 및 페스티사이드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 다이옥신-반응 요소는 3 내지 4개가 포함되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 프로모터는 MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus) 프로모터, SV40 프로모터, 및 CMV(cytomegalovirus) 프로모터로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 리포터 유전자는 루시퍼라제 (luciferase), 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chloramphenicol acetyl transferase) 및 β-갈락토시다아제(β-galactosidase)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 숙주세포는 포유동물 종양 세포주인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 6항에 있어서, 상기 숙주세포는 마우스 간암 세포주인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 2)의 혈청은 전체 혈청(total serum)인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
제 1항에 있어서, 상기 열처리 비활성화는 60 내지 70 ℃에서 20 내지 40분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 피검체로부터 분리된 혈청을 열처리 비활성화하여 시료를 얻는 단계;
3) 혈청이 포함되지 않은 배지에 단계 1)에서 얻은 형질전환 세포와 단계 2)에서 얻은 시료를 넣고 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 대사증후군의 진단방법.
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 피검체로부터 분리된 혈청을 열처리 비활성화하여 시료를 얻는 단계;
3) 혈청이 포함되지 않은 배지에 단계 1)에서 얻은 형질전환 세포와 단계 2)에서 얻은 시료를 넣고 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 대사증후군의 발병 가능성이 있는 것으로 판정하는 방법.
1) 서열번호 1로 기재되는 1개 이상의 다이옥신-반응 요소(dioxin-responsive element, DRE), 프로모터, 및 리포터 유전자가 작동가능하게 연결된 유전자 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환 세포를 제조하는 단계;
2) 피검체로부터 분리된 혈청을 열처리 비활성화하여 시료를 얻는 단계;
3) 혈청이 포함되지 않은 배지에 단계 1)에서 얻은 형질전환 세포와 단계 2)에서 얻은 시료를 넣고 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)에서 배양된 형질전환 세포 내의 리포터 유전자에 의해 발현되는 단백질의 발현 여부를 검출하는 단계로 구성되는 것을 특징으로 하는 당뇨병 또는 대사증후군의 예후 모니터링 방법.
제 10항 또는 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 2)의 혈청은 전체 혈청(total serum)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 10항 또는 제 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 열처리 비활성화는 60 내지 70 ℃에서 20 내지 40분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
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