CN103270172B - 血清中二噁英类的新生物检测方法及其在代谢综合征和相关病症中的诊断用途 - Google Patents

血清中二噁英类的新生物检测方法及其在代谢综合征和相关病症中的诊断用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种血清中二噁英类的新生物检测方法及其在代谢综合征和相关病症中的诊断用途。更具体地,根据本发明,通过利用整体血清和用包含基因构建体的重组载体转化的细胞检测荧光素酶活性,证实了血清中二噁英含量和人体变量之间的显著相关性,在所述基因构建体中,二噁英响应元件、启动子和报道基因可操作地连接。并且,本发明所述方法具有相对于需要预处理步骤来从血清纯化二噁英的现有方法的改进,因为将血清作为整体使用,通过本发明所述方法,可以便捷且准确地分析多个样品,即使每个样品的量非常小也是如此。因此,本发明的检测系统涉及在包含其表达由二噁英化合物改变的重组报告基因的基因转化细胞系中进行总血清处理,所述检测系统可以有效地用于血清中二噁英类的生物检测。通过准确检测血清中的POP如二噁英类,该方法也可用于研究特定POP和患者的疾病因素之间的相关性,并且所述方法还可以有效地用于预测疾病的发生及判断治疗效果。

Description

血清中二噁英类的新生物检测方法及其在代谢综合征和相关病症中的诊断用途
技术领域
本发明涉及一种血清中二噁英类活性的新生物检测方法及其在代谢综合征和相关病症中的诊断用途。
背景技术
持久性有机污染物(POP)在自然界不存在,即使存在,也极微量。它们大部分是出于人的需求而人工生成的有机化学品或是工业化的副产物。二噁英及二噁英类物质是该类化合物的代表。一旦POP进入人体,则难以被分解或排泄,导致在人体内的蓄积。近年来,公众越来越关注环境中这些化学品包括工业副产物、杀虫剂、或可能导致人和许多其它野生物种内分泌紊乱的药物的情况。因此,大量报道认为,血液中各种POP如二噁英类、多氯联苯类、和有机磷杀虫剂的血液水平与胰岛素抵抗、糖尿病、肥胖、血脂异常、或高血压(LeeDH等人,DiabetesCare,2006,29(7):1638-44;LeeDH等人,DiabetesCare,2007,Mar;30(3):622-8;LeeDH等人,Diabetologia,2007Sep;50(9):1841-51)以及其它很多疾病的发生密切相关。
作为最有代表性的POP之一,二噁英化合物被称为环境激素或内分泌扰乱剂,已成为世界范围内的重大问题。在诸多环境激素和诸多人工合成化合物中,尤其以2,3,7,8-四氯二苯并-对二噁英(TCDD)的毒性最大,其化学性质非常稳定,几乎会在自然界中永远存在。该化合物一旦进入人体,由于其具有脂溶性,将积聚在脂肪组织中。人体中积聚的TCDD有一些会通过尿液和胆汁排出,但该化合物一般难以被分解或排泄。在用TCDD处理的小鼠中,肝脏内辅酶(CoQ)减少,ATP的合成被抑制(Toxicol.Appl.Pharmacol.217:363,2006)。TCDD诱导AhR依赖的ROS产生,从而导致线粒体膜电位(ΔΨm)的降低并抑制线粒体功能,因而预期发生包括糖尿病在内的代谢综合征。
一旦二噁英被引入细胞,即与胞浆中的芳基烃受体(AhR)特异性地连接。随后该二噁英-受体复合物被引入细胞核,并且该复合物与细胞核中的ARNT(AhR核转位蛋白)结合。结果该复合物被转换成DNA可结合复合物。转换后的DNA可结合复合物牢固地缀合至特定基因,此时该特定基因被称为二噁英响应元件(DRE)。当二噁英复合物与DRE连接后,相邻的应答基因P4501A1被激活,从而诱导细胞色素P4501A1酶的合成。接着,通过合成的这个酶,二噁英的毒性被展现出来。
通过测量人血清中存在的众多POP中TCDD当量(TCDDEq)浓度,有可能鉴别出患有POP诱导的疾病的患者,并分析清除所述污染物和治疗效果的相关性。作为一种用于测量二噁英的方法,仪器方法被广泛使用。到目前为止,气相色谱/质谱(GC/MS)和基于细胞的测定是用于分析TCDDEq的代表性方法。GC/MS使得分析和检测包括TCDD在内的各种污染物的浓度。但是,高通量测定的费用高昂。另外,分析还需要大量的血清样品(25-200ml)。同时,以CALUX(化学活化荧光素酶表达)为代表的基于细胞的测定,是一种检测二噁英化合物的生物学定量方法,其利用通过基因操作构建的在存在二噁英时分泌荧光素酶的细胞系。当这些具有DRE和荧光素酶基因的细胞经二噁英暴露后,二噁英和细胞内的AhR和ARNT结合,然后再与细胞核内的DRE结合。接着,由此诱导出荧光素酶的表达,并以此与所暴露的二噁英的量成比例地合成荧光素酶。因此,荧光素酶活性的变化可以有效地用作二噁英的检测指标。二噁英类化合物和TCDD当量(TEQ)也可以用所述方法测定。但是,采取最新的技术,用所述方法进行分析耗时长,并且为了采用己烷从人血清样品进行提取或纯化,需要大量血清(至少必需1ml血清,一般需要10-20ml样品)。当使用瞬时转染细胞系时,测定间的差异非常大,因此存在可信度问题。随着样品数量增大,操作速度和可信度下降。另外,必须有二噁英提取的步骤。例如,样品用有机溶剂处理以提取脂肪,然后使之经过活化的酸性硅胶柱以纯化脂肪。随后二噁英被提取出来。因为上述二噁英的提取和纯化过程,在TCDD标准物的测定值和血清TEQ的定量值之间有很大的差异(Michael,H.等人,2000,Toxicol.Sciences,54:183-193)。
现有的方法,不仅分析设备昂贵,而且样品纯化的预处理步骤复杂,其使用大量的有机溶剂和其它如放射标记物的有毒试剂,且分析耗时较长。因此,需要开发和改进出一种新的生物方法,通过简单的预处理步骤在短时间段内完成确保高检测灵敏度的检测和定量,以节约时间、精力、和成本。
于是,发明人试图开发出一种新的高通量的POP检测方法,该方法是对现有POP检测方法的改进,并且方便、准确。结果,建立了一种新的生物检测方法,不同于现有检测方法必须有将二噁英从血清纯化的预处理步骤,该方法使用总血清实现对多个样品的便捷、准确的分析,而且特征在于,即便使用少量血清也能实现准确分析。近年来,突变基因及利用该突变基因的发明已经在世界范围内被认可为专利申请的主题。因此,本发明人通过证实DRE基因可以有效地应用于二噁英化合物的检测而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血清中二噁英类的新生物检测方法,及其用在代谢综合征和相关病症中的诊断用途。
为实现上述目的,本发明提供一种血清中二噁英类的新生物检测方法,所述方法包括如下步骤:
1)通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞制备转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英应答元件(DRE)中的至少一个、启动子、和报告基因可操作地连接;
2)在用测试受试者的血清处理步骤1)中制备的转化细胞系后,培养所述转化细胞系;
3)检测由在步骤2)中培养的转化细胞系中的报告基因表达的蛋白的表达;以及
4)当在步骤3)中检测到报告基因的表达后,确定所述血清具有二噁英化合物。
本发明还提供一种用于预测糖尿病或代谢综合征的可能性的方法,所述方法包括如下步骤:
1)通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞制备转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英应答元件(DRE)中的至少一个、启动子、和报告基因可操作地连接;
2)在用测试受试者的血清处理步骤1)中制备的转化细胞系后,培养所述转化细胞系;
3)检测由在步骤2)中培养的转化细胞系中的报告基因表达的蛋白的表达;以及
4)当在步骤3)中检测到报告基因的表达后,确定糖尿病或代谢综合征的可能性。
本发明还提供一种用于监测糖尿病或代谢综合征的预后的方法,所述方法包括如下步骤:
1)通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞制备转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英应答元件(DRE)中的至少一个、启动子、和报告基因可操作地连接;
2)在用糖尿病或代谢综合征经治疗的测试受试者的血清处理步骤1)中制备的转化细胞系后,培养所述转化细胞系;
3)检测由在步骤2)中培养的转化细胞系中的报告基因表达的蛋白的表达;以及
4)与用糖尿病或代谢综合征未经治疗的测试受试者的血清处理的对照相比,当在步骤3)中检测的报告基因的表达水平降低时,判断测试受试者的糖尿病或代谢综合征得到缓解、改善或治疗。
另外,本发明还提供一种具有初始形式的外源蛋白的制备方法。
有益效果
如前所述,本发明检测环境激素的方法是对测试前必须有从血清纯化二噁英类的步骤的现有检测方法的改进,本发明所述方法因使用整体血清而具有省时省力的优点,即使分析多个样品时也使分析更准确和便捷。本方法以生物学方法检测血清中环境激素,其优越性在于因无需使用己烷进行预处理,可以对少量样品进行有效分析。此外,通过准确检测血清中是否存在诸如二噁英类的POP,本方法可以用于研究特定的POP和患者疾病因素之间的关系。本方法还可以用于有效预测疾病的发生以及判断治疗效果。
附图说明
结合附图将更好地理解本发明的优选实施方案的应用:
图1为一组图,说明了pCYP1A1-luc载体的克隆。
图2为照片,显示了稳定表达pCYP1A1-luc的Hepa1C1c7细胞系集落。
图3为绘制图,说明了稳定表达pCYP1A1-luc的Hepa1C1c7细胞系的吲哚-3-甲醇响应测试的结果。
图4为绘制图,说明了稳定表达pCYP1A1-luc的Hepa1C1c7细胞系的2,3,7,8-四氯二苯并-对二噁英(TCDD)响应测试的结果。
图5为绘制图,说明了二噁英倍数诱导值的分布。
图6为绘制图,说明了通过线性回归分析而分析的人血清中二噁英倍数诱导值相对体重的关系。
图7为绘制图,说明了通过线性回归分析而分析的人血清中二噁英倍数诱导值相对bmi的关系。
图8为绘制图,说明了通过线性回归分析而分析的人血清中二噁英倍数诱导值相对wc的关系。
图9为绘制图,说明了通过线性回归分析而分析的人血清中二噁英倍数诱导值相对sbp的关系。
图10为绘制图,说明了通过线性回归分析而分析的人血清中二噁英倍数诱导值相对tg的关系。
图11为绘制图,说明了通过线性回归分析而分析的人血清中二噁英倍数诱导值相对fbs的关系。
具体实施方式
以下,将详述本发明。
本发明提供一种通过利用包含其表达由环境激素改变的重组报告基因的转化细胞系的血清中环境激素的生物检测方法。
特别地,所述检测方法包括但不总是限于下述步骤:
1)通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞制备转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英应答元件(DRE)中的至少一个、启动子、和报告基因可操作地方式连接;
2)在用测试受试者的血清处理在步骤1)中制备的转化细胞系后,培养所述转化细胞系;
3)检测由在步骤2)中培养的转化细胞系中的报告基因表达的蛋白的表达;以及
4)当在步骤3)中检测到报告基因的表达后,确定糖尿病或代谢综合征的可能性。
所述二噁英化合物优选为多氯二苯并-二噁英(PCDD)、多氯二苯并-呋喃(PCDF)、多氯联苯(PCB),多环芳族烃(PAH)、类黄酮、或杀虫剂(但不总限于此);除二噁英化合物外,还可以包括其它任何可通过与所述DRE结合而影响转录活性的环境激素。
在上述方法中,包括步骤1)中的所述二噁英应答元件中的至少一个,最优选包括3-4个DRE,但不总限于此。
在上述方法中,步骤1)中的所述启动子优选自MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)启动子、SV40启动子、和CMV(巨细胞病毒)启动子,更优选清除了糖皮质激素应答元件区域的MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)衍生启动子,但不总限于此。
在此启动子可以是一个清除了增强子的迷你启动子。报告基因的转录活性可受增强子或靠近迷你启动子上游的顺式作用元件决定。因此,清除增强子意味着清除其它可能影响转录活性的元件。
在上述方法中,步骤1)中的所述报告基因优选自荧光素酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶、和β-半乳糖苷酶;考虑到活性分析的便利性和灵敏性,更优选荧光素酶;但不总限于此。
本文所述转化细胞系指的是其中稳定表达所述报告基因的细胞系。也就是说,一旦转化的报告载体被引入宿主细胞的染色体,报告载体即稳定地成为宿主细胞基因库的一部分。转化的报告载体中的所引入基因的稳定表达可以至少持续30代。
步骤1)中的所述宿主细胞优选为真核、哺乳动物细胞,更优选哺乳动物肿瘤细胞,最优选小鼠肝癌细胞系,如Hepa1c1c7细胞系;但不总限于此。
当二噁英被引入细胞时,它与芳基烃受体(AhR)特异性结合,而被引入到细胞核内。引入细胞核内的二噁英-受体复合物之后与ARNT(AhR核转位蛋白)缀合,继而被转换成DNA可结合形式。因此,任何能够内源性地表达ARNT和AhR的细胞系都可以用作宿主细胞系。
本文所述的转化可以通过电穿孔、胞质融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、用碳化硅纤维搅拌、或脂质体介导的方法进行;但不总限于此。
现有二噁英化合物的检测方法需要一个预处理步骤,以通过用有机溶剂提纯从样品提取的脂肪来提取二噁英类。然而,在本发明的方法中,步骤2)中的血清是总血清,表示血清可以整体使用。
出于安全考虑,本文之后要应用于转化细胞系的所述血清优选经加热灭活,但并不总是限于此。
在一个本发明的优选实施方案中,构建了包含4个由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英响应元件(DRE)结合位点(5'-TNGCGTG-3')的小鼠CYP1A1启动子和包含小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复序列(LTP)(参见图1)的重组报告基因载体。然后,用所述重组报告基因载体转染Hepa1c1c7,一种小鼠肝癌细胞系,从而构建可以稳定表达所述重组报告基因的细胞系(参见图2)。用构建的细胞系,进行2,3,7,8-四氯二苯并-对二噁英(TCDD)响应测试。其结果是,与未用TCDD处理的对照比较,当用浓度10-1000pM的TCDD进行处理后,荧光素酶活性显著增加(参见图4)。因此,证实了稳定表达重组报告基因的细胞系对TCDD有反应,并且有效地激活荧光素酶。
本发明的发明人通过使用构建的细胞系检测了人血清样品中的二噁英类,然后分析了二噁英含量和人体变量之间的相关性。为准备血清样品,采集了97个人的血清,然后为了细胞培养的安全,在65℃下对血清进行加热灭活30分钟。本文所述加热灭活指的是通过加热消除血清的生物活性。血清不仅含有细胞生长因子和血清蛋白,还含有作为负责体液免疫的因子的补体。许多补体通过识别被培养的细胞而显示出细胞毒性,使得当向培养基中添加整体血清时,细胞生长被抑制,或更糟的是,细胞系可能被杀死。所以,为细胞培养的安全,血清需要加热灭活。
用10μl上述制备的血清样品处理稳定表达重组报告基因的细胞系,然后通过荧光素酶测定分析荧光素酶活性和人体变量之间的相关性。其结果是,采集自97个人的血清样品的倍数诱导值主要分布在2.00-3.00的范围内,检测到的最大比率约为2.50-2.65倍。平均倍数诱导值约为2.35倍(见图5)。
线性回归分析还证实了在二噁英含量和许多变量因素之间存在显著相关性,所述变量因素如人的体重、体重指数(bmi)、腰围(wc)、收缩压(sbp)、舒张压(dbp)、甘油三酯(TG)、和空腹血糖(fbs)。随着这些因素的值升高,二噁英倍数诱导值也升高(见图6-图11)。饮酒者/吸烟者比不饮酒者/不吸烟者的二噁英倍数诱导值高。利用多变量分析经所有相关变量修正后,证明只有饮酒或不饮酒才与二噁英倍数诱导值显著相关。通过比较由糖耐量受损(IGT)和空腹血糖受损(IFG)组成的糖调节受损(IGR)以及糖尿病(DM)和糖耐量正常(GNT)的血清中荧光素酶的水平,还证明了荧光素酶活性在IGR或DM血清中比在NGT血清中高。同是,在IGR血清和DM血清之间没有显著差异。对二噁英倍数诱导随代谢综合征要素(MetS要素)的数目变化也进行了分析。其结果是,二噁英倍数诱导值随着MetS要素的数目增加而升高,而且与正常人相比,MetS患者的二噁英倍数诱导值明显升高。另外还分析了二噁英倍数诱导值的升高是否与代谢综合征或糖尿病的风险有关。结果是,随着二噁英倍数诱导值升高1倍,代谢综合征和糖尿病的风险分别增加19.7倍和11.9倍。即使该值经bmi修正后,随着二噁英倍数诱导值升高1倍,代谢综合征和糖尿病的风险仍然分别增加了13倍和8.7倍。该值经年龄、性别、和bmi共同修正后,代谢综合征或糖尿病的风险仍然随着二噁英倍数诱导值的升高而增加。
基于上面的结果,当本发明所述方法与现有方法在技术问题和效果方面进行比较时,可以证实:如表1所示,为有效使用CALUX分析系统,现有方法需要一个通过使用有机溶剂如己烷从血清中提取二噁英类的预处理步骤。另一方面,本发明通过分析简单加热灭活的血清,在省时、省力、和节约成本上体现了优越性。在分析所需血清量的问题上,本发明的系统也有优越性。换句话说,即使用现有方法进行分析所需血清的约千分之一,本发明的系统仍可以高效分析血清,灵敏度与以前采用大量血清的方法相似。
表1
因此,已经证明,通过本发明的二噁英类的检测方法检测出的血清中的二噁英含量与多个人体变量显著相关。与现有方法需要一个从样品纯化二噁英类的预处理步骤不同,本发明的方法通过将血清整体使用,可以省时省力、便捷、快速地分析多个样品而具有优越性,而且即使每个样品的量很少也可以准确分析,因而也具有优越性。此外,携带其表达受环境激素和总血清调控的重组报告基因的转化细胞系,在本方法中可以有效地用于血清中环境激素的生物检测。
本发明还提供了一种用于通过利用携带其表达受二噁英化合物调控的重组报告基因的转化细胞系来预测糖尿病或代谢综合征的可能性的方法。
特别地,所述用于预测的方法优选地包括如下步骤,但并不总是限于此:
1)通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞制备转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英应答元件(DRE)中的至少一个、启动子、和报告基因可操作地连接;
2)在用测试受试者的血清处理步骤1)中制备的转化细胞系后,培养所述转化细胞系;
3)检测由在步骤2)中培养的转化细胞系中的报告基因表达的蛋白的表达;以及
4)当在步骤3)中检测到报告基因的表达后,确定糖尿病或代谢综合征的可能性。
本发明还提供了一种用于通过利用携带其表达受二噁英化合物和总血清调控的重组报告基因的转化细胞株来监测糖尿病或代谢综合征的预后的方法。
特别地,所述用于监测的方法优选地包括如下步骤,但并不总是限于此:
1)通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞制备转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的二噁英应答元件(DRE)中的至少一个、启动子、和报告基因可操作地连接;
2)在用糖尿病或代谢综合征经治疗的测试受试者的血清处理步骤1)中制备的转化细胞系后,培养所述转化细胞系;
3)检测由在步骤2)中培养的转化细胞系中的报告基因表达的蛋白的表达;以及
4)与用糖尿病或代谢综合征未经治疗的测试受试者的血清处理的对照相比,当在步骤3)中检测的报告基因的表达水平降低时,判断测试受试者的糖尿病或代谢综合征得到缓解、改善或治疗。
在上述方法中,包括步骤1)中的所述二噁英应答元件中的至少一个,最优选包括3-4个DRE;但不总限于此。
在上述方法中,步骤1)中的所述启动子优选自MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)启动子、SV40启动子、和CMV(巨细胞病毒)启动子,更优选MMTV(小鼠乳腺肿瘤病毒)衍生启动子;但不总限于此。
在上述方法中,步骤1)中的所述报告基因优选自荧光素酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶、和β-半乳糖苷酶;考虑到活性分析的便利性和灵敏性,更优选荧光素酶;但不总限于此。
步骤1)中的所述宿主细胞优选为真核、哺乳动物细胞,更优选哺乳动物肿瘤细胞,最优选小鼠肝癌细胞系,如Hepa1c1c7细胞系;但不总限于此。任何能够内源性地表达ARNT和AhR的细胞系都可以用作本文的宿主细胞系。
本文所述的转化可以通过电穿孔、胞质融合、磷酸钙(CaPO4)沉淀、氯化钙(CaCl2)沉淀、用碳化硅纤维搅拌、或脂质体介导的方法进行;但不总限于此。
在上述方法中,步骤2)中的血清是可以整体使用的总血清,无需用于从血清纯化二噁英类的预处理步骤。
出于血清安全考虑,在用其处理转化细胞系之前,所述血清优选加热灭活,但并不总是限于此。
本发明的发明人构建了一株转化细胞系,所述转化细胞系成功转染了重组报告基因载体,所述载体包含二噁英响应元件(DRE)结合位点、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)衍生启动子、和下游的荧光素酶基因;并且所述发明人利用所述转化细胞系分析了人血清中二噁英含量和人体变量之间的相关性。结果证明,二噁英含量和人的体重、bmi、wc、sbp、dbp、tg、或fbs之间存在显著相关性,而且进一步地,还证实了二噁英含量与包括糖耐量受损(IGT)和空腹血糖受损(IFG)的糖调节受损(IGR)、糖尿病(DM)、和糖耐量正常(NGT)之间有显著相关性。特别地,IGR或DM患者的血清显示荧光素酶活性高于NGT患者的血清。二噁英倍数诱导值随着代谢综合征要素(MetS要素)数目的增加而升高,而且与正常人相比,MetS患者的二噁英倍数诱导值明显升高。因此,也证实了二噁英倍数诱导值升高增加了糖尿病或代谢综合征的风险。
由此,血清中二噁英含量和糖尿病或代谢综合征的显著相关性得到了确认。相应地还证实了,本发明所述利用包含其表达受环境激素和总血清调控的重组报告基因的转化细胞系的二噁英类的检测方法,可以有效地用于糖尿病或代谢综合征的可能性的预测以及预后的预测。
下面的实施例、实验例和制备例所示的是对本发明进行说明的实际和目前优选的实施方案。
然而,可以理解,本领域中的技术人员在考虑所述公开内容后,可以在本发明的精神和范围之内进行修改和改进。
实施例1:稳定表达重组报告基因的细胞系的构建
<1-1>重组报告基因载体的构建
通过用HindIII将1.8kb的病毒启动子片段从pGudLuc1.1载体上切下,之后克隆入经HindIII消化的pGL3-basic载体的HindIII位点,所述病毒启动子片段包含具有4个DRE结合位点(AhR结合位点)(5'-TNGCGTG-3')的小鼠CYP1A1启动子(482bp)以及去除了糖皮质激素应答元件的小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的长末端重复序列(LTR)。由此,构建了pCYP1A1-luc载体(Han等人,BioFactors,20:11-22,2004)。通过测序证实了启动子的方向(图1)。
<1-2>表达重组报告基因的转化细胞系的构建
hepa1c1c7,小鼠肝癌细胞系,被分布在6孔板(1×105个细胞/孔)内,然后培养24小时,直到融合达到50%。将2μg在实施例<1-1>中构建的pCYP1A1-luc载体和0.5μgpcDNA3.1载体添加到100μl的MEM-α(无血清和抗菌素),然后与10μl的Superfect(Qiagen)混合,在室温下反应10分钟。然后,加入600μl补充10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素/链霉素(P/S)的MEM-α。将700μl的Superfect-DNA反应液加入到用DPBS洗涤过的Hepa1c1c7细胞,然后在37℃下培养3小时。培养完成后,将细胞用DPBS洗涤,用补充10%FBS和1%P/S的新鲜的MEM-α2ml更换培养基。反应开始后24小时,加入300μg的G418。收集G418抵抗细胞3周。一旦形成细胞集落,每个集落被转移到60毫米培养板上(图2)。
实施例2:表达重组报告基因的转化细胞系的响应测试
<2-1>吲哚-3-甲醇响应测试
将在实施例<1-2>中构建的稳定表达pCYP1A1-luc的细胞系以1×105个细胞的密度分布在60mm培养皿里,然后培养48小时。在培养完成后,将培养基更换为补充0.5%活性炭过滤的FBS、但不补充酚红的DMEM,然后分别用浓度为0、0.01、0.1、1、10、和100μM的吲哚-3-甲醇处理4、8、或24小时。然后收集细胞,进行荧光素酶测定。
结果如图3所示,与未处理的对照组相比,用0.001-10μM吲哚-3-甲醇处理的组的荧光素酶活性呈剂量依赖性地增加。特别是,当吲哚-3-甲醇的处理浓度为100μM时,荧光素酶的活性增加至少3倍。此时,未检测到随时间的显著性差异(图3)。
<2-2>2,3,7,8-四氯二苯并-对二噁英(TCDD)响应测试
将在实施例<1-2>中构建的稳定表达pCYP1A1-luc的细胞系以2×105个细胞的密度分布在60mm培养皿里,然后培养24小时。在培养完成后,将培养基更换为补充0.5%活性炭过滤的FBS、但不补充酚红的DMEM,然后分别用浓度为0、0.1、1、10、100、和1000pM的2,3,7,8-四氯二苯并-对二噁英(TCDD)处理4、或8小时。然后收集细胞,进行荧光素酶测定。
结果如图4所示,浓度0.1或1pM的TCDD处理的组显示出与未经TCDD处理的对照类似的荧光素酶活性,而10-1000pM的TCDD处理的组显示出荧光素酶的活性显著增加。荧光素酶活性随处理时间而增加,但没有那么显著(图4)。
实施例3:人血清中的二噁英类的检测
<3-1>人血清样品的制备
在65℃下对从97个人采集的血清样本进行加热灭活30分钟。所述加热灭活过程保证了细胞培养的安全。
<3-2>人血清中的二噁英类的检测以及二噁英类和人体变量之间的相关性 的分析
将在实施例<1-2>中构建的稳定表达pCYP1A1-luc的细胞系以5×104个细胞/孔的密度分布在96孔板中,然后培养24小时。将培养基更换为不含酚红的DMEM(90μl/孔),然后用10%的人血清样品(10μl/孔)处理24小时。然后,每个孔中的细胞用荧光素酶裂解缓冲液(Promega)裂解。将各孔的裂解物转移到96孔板中(1μl/孔),随后通过BCA法进行蛋白质定量。剩余的细胞裂解物使用Promega的荧光素酶测定试剂盒进行荧光素酶测定。荧光素酶活性经蛋白质浓度修正,结果以倍数诱导值或%对照显示。
结果如图5所示,从97个人采集的血清样品的倍数诱导值主要分布在2.00-3.00倍的范围内,检测到的最高比率约为2.50-2.65倍。平均倍数诱导值约为2.35倍(图5)。
对二噁英类和各种人体变量之间的相关性进行了分析。结果是,每个变量的r和P值如表2中所示。特别是,如图6-图11所示,还通过线性回归分析证明了在二噁英含量和许多变量因素之间存在显著相关性,所述变量因素如人的体重、体重指数(bmi)、腰围(wc)、收缩压(sbp)、舒张压(dbp)、甘油三酯(TG)、和空腹血糖(fbs)。随着这些变量值的增加,二噁英倍数诱导值也升高(图6-图11)。
表2
对二噁英倍数诱导值与饮酒和吸烟的关系也进行了研究。结果如表3和表4所示,饮酒者/吸烟者的二噁英倍数诱导值高于不饮酒者/不吸烟者。
表3
*P=0.001
表4
*P=0.009
通过所有相关变量的修正进行了多因素分析。结果如表5中所示,证明仅饮酒或不饮酒为显著相关因素。
表5
研究了随二噁英变化的荧光素酶活性与糖耐量正常(NGT)、由糖耐量受损(IGT)和空腹血糖受损(IFG)组成的糖调节受损(IGR)和糖尿病(DM)的相关性。结果如表6中所示,荧光素酶活性在IGR或DM的血清中高于NGT的血清。但是,在IGR和DM的血清之间无显著差异。
表6
二噁英倍数诱导值随代谢综合征要素(MetS要素)的数目的变化也进行了分析。结果如表7和表8中所示,随着MetS要素数目的增加,二噁英倍数诱导值也升高。与正常人相比,MetS患者中的二噁英倍数诱导值显著提高。
表7
*P<0.001,线性回归分析
表8
*P<0.001,t检验
此外,还研究了二噁英倍数诱导值的升高如何与糖尿病或代谢综合征的风险相关。结果如表9-表11中所示,二噁英倍数诱导值每升高1倍,代谢综合征和糖尿病的风险分别增加19.7倍和11.9倍。结果经bmi修正后,二噁英倍数诱导值每升高1倍,代谢综合征和糖尿病的风险仍然分别显著地增加13倍和8.7倍。结果经年龄、性别、和bmi共同修正后,代谢综合征和糖尿病的风险仍然增加。
表9
表10
表11
工业实用性
如前所述,本发明所述的检测系统,其特征在于,以总血清处理携带其表达受二噁英化合物调控的重组报道基因的转化细胞系,优点在于便捷、准确、高效地检测血清中的二噁英类。因此,基于二噁英和病人的疾病因素之间的相关性,本发明所述的检测系统可以有效地应用于诊断技术以用于预测疾病的发生和判断治疗效果。
本领域技术人员将理解,为实现本发明相同目的,在上述的说明中所公开的概念和具体实施方案可以容易地被用来作为修改或设计其它实施方案的基础。本领域的技术人员也将理解,这些等效的实施方案没有脱离如所附权利要求所记载的本发明的精神和范围。

Claims (6)

1.一种通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞的转化细胞系用于检测通过加热灭活的血清样品中的二噁英化合物的体外用途,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的4个二噁英应答元件(DRE)、启动子、和报告基因可操作地连接,其中所述宿主细胞内源性地表达ARNT和AhR,并且其中所述启动子为小鼠乳腺肿瘤病毒启动子并包含小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列,所述载体为pGL3-basic,并且所述转化细胞系为稳定转化的小鼠肝癌细胞系Hepalclc7,并且其中所述加热灭活在65℃下进行30分钟,且其中所述血清样品分离自受试者,其中该方法用于非诊断目的。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述二噁英化合物选自多氯二苯并二噁英(PCDD)、多氯二苯并-呋喃(PCDF)、多氯联苯(PCB)、多环芳族烃(PAH)、类黄酮、和杀虫剂。
3.一种包含基因构建体的重组载体,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的4个二噁英应答元件(DRE)、启动子、和报告基因可操作地连接,其中所述启动子为小鼠乳腺肿瘤病毒启动子并包含小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列,所述载体为pGL3-basic。
4.一种通过将包含基因构建体的重组载体引入宿主细胞的转化细胞系,在所述基因构建体中,由SEQ.ID.NO:1表示的4个二噁英应答元件(DRE)、启动子、和报告基因可操作地连接,其中所述启动子为小鼠乳腺肿瘤病毒启动子并包含小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列,所述载体为pGL3-basic,并且所述转化细胞系为稳定转化的小鼠肝癌细胞系Hepalclc7。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述报告基因选自荧光素酶、碱性磷酸酶、氯霉素乙酰转移酶、和β-半乳糖苷酶。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述血清为总血清。
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