JP2013540433A - 血清内ダイオキシン類の新規生物学的検出方法、及びその代謝症候群及び関連症状に対する診断的使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図5
Description
1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(dioxin-responsive element,DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を被検者の血清で処理した後、培養する工程、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現の有無を検出する工程、及び
4)前記工程3)でレポーター遺伝子の発現が検出された場合、血清にダイオキシン類化合物が含まれると判定する工程
を含む、血清内ダイオキシン類化合物の検出方法を提供する。
1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を糖尿病または代謝症候群が疑われる被検者の血清で処理した後、培養する工程、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現の有無を検出する工程、及び
4)前記工程3)でレポーター遺伝子発現が検出された場合、糖尿病または代謝症候群の発病可能性があると判定する工程
を含む、糖尿病または代謝症候群の発病可能性予測方法を提供する。
1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を糖尿病または代謝症候群に対する治療を受けた被検者の血清で処理した後、培養する工程、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現レベルを検出する工程、及び
4)前記工程3)で検出されたレポーター遺伝子の発現レベルが治療を受けていない血清で処理した対照群と比べて減少した場合、糖尿病または代謝症候群が緩和、改善または治療されたと判定する工程
を含む、糖尿病または代謝症候群の予後モニタリング方法を提供する。
1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン−反応要素(dioxin-responsive element,DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を被検者の血清で処理した後、培養する工程、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現の有無を検出する工程、及び
4)前記工程3)でレポーター遺伝子の発現が検出された場合、血清にダイオキシン類化合物が含まれると判定する工程
を含むことが好ましいがそれに限定されない。
1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程と、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を糖尿病または代謝症候群が疑われる被検者の血清で処理した後、培養する工程と、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現の有無を検出する工程、及び
4)前記工程3)でレポーター遺伝子の発現が検出された場合、糖尿病または代謝症候群の発病可能性があると判定する工程
とを含むことが好ましいが、それに限定されない。
1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程と、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を糖尿病または代謝症候群に対する治療を受けた被検者の血清で処理した後、培養する工程と、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現レベルを検出する工程、及び
4)前記工程3)で検出されたレポーター遺伝子の発現レベルが治療を受けていない血清で処理した対照群と比べて減少した場合、糖尿病または代謝症候群が緩和、改善または治療されたと判定する工程
とを含むことが好ましいが、それに限定されない。
<1−1>組換えレポーター遺伝子ベクターの製造
pGudLuc1.1ベクターから、4個のDRE結合部位(AhR結合部位)(5’−TNGCGTG−3’)を有しているマウスCYP1A1プロモーター(482bp)、及びグルココルチコイド応答エレメント部位を除去したマウス乳癌ウイルス(MMTV)の長い末端反復(LTR)を含有する1.8kbのウイルスプロモーター断片をHindIII制限酵素で切断した後、HindIIIで切断したpGL3−basicベクターのHindIII部位にクローニングしてpCYP1A1−lucベクターを製造した(Hanら,BioFactors,2004年,第20巻,p.11-22)。プロモーターの方向はシーケンシングで確認した(図1)。
1×105のマウス肝臓癌細胞株であるHepa1c1c7を6ウェルプレートに分注して、24時間培養して50%の密度になるようにした。前記実施例<1−1>で製造したpCYP1A1−lucベクター2μgとpcDNA3.1ベクター0.5μgを、血清及び抗生剤を含まない100μlのMEM−α培地に添加して10μlのSuperfect(Qiagen)と混合した後、常温で10分間反応させた。その後、10%牛胎児血清(FBS)及び1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を含んだ600μlのMEM−α培地を入れて混合した後、DPBSで洗浄したHepa1c1c7細胞に700μlのSuperfect−DNA反応液を入れて、37℃で3時間培養した。培養後、前記細胞をDPBSで洗浄し、10%FBS及び1%P/Sを含んだ新鮮な2mlのMEM−α培地に交換した。24時間後からG418 300μgを添加して、約3週間G418抵抗性細胞を選別した。コロニーが生成されると、それぞれのコロニーを60mm培養プレートに移した(図2)。
<2−1>インドール3カルビノールを使用した反応検査
前記実施例<1−2>で製造したpCYP1A1−lucを安定的に発現する細胞株を60mm培養ディッシュに1×105の細胞数で分注して、48時間培養した。培養48時間後、0.5%charcoal-stripped FBSを含みフェノールレッドがないDMEM培地に交換して、インドール3カルビノールを0、0.01、0.1、1、10、及び100μMの濃度でそれぞれ4、8または24時間処理した。それぞれの処理時間後、細胞を回収してルシフェラーゼ分析を行なった。
前記実施例<1−2>で製造したpCYP1A1−lucを安定的に発現する細胞株を60mm培養ディッシュに2×105の細胞数で分注して、24時間培養した。培養24時間後、0.5% charcoal-stripped FBSを含みフェノールレッドがないDMEM培地に交換して、2,3,7,8−テトラクロロジベンゾ−p−ダイオキシン(TCDD)を0、0.1、1、10、100、及び1000pMの濃度でそれぞれ4または8時間処理した。それぞれの処理時間後、細胞を回収してルシフェラーゼ分析を行なった。
<3−1>ヒト血清試料の準備
97名の成人から得た血清試料は、65℃で30分間熱不活性化して前処理した。このような過程は一般的な細胞培養方法において、熱処理による不活性化によって細胞培養に対する安全性を付与する。
前記実施例<1−2>で製造したpCYP1A1−lucを安定的に発現する細胞株5×104を96ウェルプレートに分注後、24時間培養した。培地をフェノールレッドがない90μl DMEM培地に交換して、最終濃度10%のヒト血清試料10μlを添加した後、24時間処理した。その後、各ウェルにある細胞をルシフェラーゼlysis buffer(Promega)で溶解した。各ウェルの細胞溶解物を1μlずつ96ウェルに移して、タンパク質をBCA法で定量した。残りの細胞溶解物は、Promegaルシフェラーゼ分析キットを用いたルシフェラーゼ分析に用いた。ルシフェラーゼ活性はタンパク質濃度に補正し、倍数誘導(fold induction)または%対照群としてその結果を表示した。
Claims (13)
- 1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(dioxin-responsive element,DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程と、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を被検者の血清で処理した後、培養する工程と、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現の有無を検出する工程、及び
4)前記工程3)でレポーター遺伝子の発現が検出された場合、血清にダイオキシン類化合物が含まれると判定する工程
とを含む、血清内ダイオキシン類化合物の検出方法。 - 前記ダイオキシン類化合物が、ポリ塩化ジベンゾダイオキシン類(polychlorinated dibenzodioxins;PCDDs)、ポリ塩化ジベンゾフラン類(Polychlorinated dibenzo-furans;PCDFs)、ポリ塩化ビフェニル類(PCBs)、多環芳香族炭化水素類(Polycyclic aromatic hydrocarcons;PAHs)、フラボノイド類及び農薬(pesticides)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記工程1)のダイオキシン反応要素が、3ないし4個含まれることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記工程1)のプロモーターが、マウス乳癌ウイルス(Mouse Mammary Tumor Virus, MMTV)プロモーター、SV40プロモーター、及びサイトメガロウイルス(cytomegalovirus, CMV)プロモーターからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記工程1)のレポーター遺伝子が、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ及びβ−ガラクトシダーゼからなる群から選択されることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記工程1)の宿主細胞が、哺乳動物の腫瘍細胞株であることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記宿主細胞が、マウスの肝臓癌細胞株であることを特徴とする、請求項6に記載の検出方法。
- 前記工程2)の血清が、全血清(total serum)であることを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 前記工程2)の血清が、形質転換細胞に処理する前に加熱不活性化(heat activation)することを特徴とする、請求項1に記載の検出方法。
- 1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程と、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を糖尿病または代謝症候群が疑われる被検者の血清で処理した後、培養する工程と、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現の有無を検出する工程、及び
4)前記工程3)でレポーター遺伝子発現が検出された場合、糖尿病または代謝症候群の発病可能性があると判定する工程
とを含む、糖尿病または代謝症候群の発病可能性予測方法。 - 1)1個以上の配列番号1で表されるダイオキシン反応要素(DRE)、プロモーター、及びレポーター遺伝子が作動可能に連結された遺伝子構築物を含有する組換えベクターを宿主細胞に導入して形質転換細胞を製造する工程と、
2)工程1)で製造された形質転換細胞を糖尿病または代謝症候群に対する治療を受けた被検者の血清で処理した後、培養する工程と、
3)工程2)で培養された形質転換細胞内のレポーター遺伝子によって発現されるタンパク質の発現レベルを検出する工程、及び
4)前記工程3)で検出されたレポーター遺伝子の発現レベルが治療を受けていない血清で処理した対照群と比べて減少した場合、糖尿病または代謝症候群が緩和、改善または治療されたと判定する工程
とを含む、糖尿病または代謝症候群の予後モニタリング方法。 - 前記工程2)の血清が、全血清であることを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。
- 前記工程2)の血清が、形質転換細胞を処理する前に加熱不活性化されることを特徴とする、請求項10または11に記載の方法。
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