KR100355301B1 - 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터유전자를 가지는 형질전환 세포주를 이용한 다이옥신류의생물학적 분석방법 - Google Patents

다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터유전자를 가지는 형질전환 세포주를 이용한 다이옥신류의생물학적 분석방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자, 그의 형질전환 세포주 및 이를 이용한 다이옥신류의 생물학적 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 다이옥신 반응성 요소(DRE)와 루시퍼라제가 결합된 재조합 리포터 유전자를 제작하고 이를 인체 간암 세포주에 형질전환시킨 다음, 상기 세포주에 시료를 처리하여 재조합 리포터 유전자의 발현을 측정함으로써, 다양한 환경시료 중에 존재하는 다이옥신류를 간단하고 경제적으로 분석할 수 있다.

Description

다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 형질전환 세포주를 이용한 다이옥신류의 생물학적 분석방법{Biological method for analysis of dioxin using transformed cell line having recombinant reporter gene}
본 발명은 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자, 그의 형질전환 세포주 및 이를 이용한 다이옥신류의 생물학적 분석방법에 관한 것으로서, 구체적으로는 다이옥신 반응성 요소(dioxin responsive element; 이하 'DRE'로 약함)와 루시퍼라제가 결합된 재조합 리포터 유전자를 제작하고 이를 인체 간암 세포주에 형질전환시킨 다음, 상기 세포주에 시료를 처리하여 재조합 리포터 유전자의 발현을 측정함으로써, 다양한 환경시료 중에 존재하는 다이옥신류를 간단하고 경제적으로 분석할 수 있다.
다이옥신류는 폴리클로리네이티드 디벤조파라다이옥신류(polychlorinated dibenzo-p-dioxins; 이하 'PCDDs'로 약함)와 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류 (polychlorinated dibenzo-furans; 이하 'PCDFs'로 약함)를 총칭하는 말로 75개의 다이옥신 이성질체와 135개의 퓨란 이성질체를 포함한다. 이외에도 다이옥신과 유사한 독성을 나타내는 환경오염 물질로 폴리클로리네이티드 바이페닐류 (polychlorinated biphenyl; PCBs)와 폴리사이클릭 아로메틱 하이드로카본 (polycyclic aromatic hydrocarbon; PAH) 등이 있다.
PCDDs와 PCDFs는 의도적으로 생산되는 화합물이 아니라 제초제, 살충제, 방부제 등을 제조하는 과정에서 불순물로 생성되거나, 제지 산업에서 펄프를 소독하는 과정, 금속을 정련하는 과정에서 부산물로 생성된다. 또한 소각장에서 여러 유기물을 함유하는 쓰레기와 PVC, 플라스틱류 등의 염소화합물을 같이 소각할 때 생성된다(Hutzinger, O. et al.Chemospere, 14, 581, 1995).
이들은 화학적으로 매우 안정된 구조를 지니므로 화학적 방법이나 생물학적 방법 즉, 미생물에 의한 분해가 거의 일어나지 않는 반면, 비산재, 토양, 하천 퇴적물 등에 흡착되어 환경 중에 오랜 기간동안 남아있게 된다. 환경중에 존재하는 다이옥신류는 생물체에 유입되고 생물체내에서 거의 대사되지 않고, 지질친화성이 높기 때문에 지방조직에 녹아 생체내에 축척된다. 이들은 먹이 사슬을 통해 생물농축 과정을 거치게 되고 최종 소비자인 인간에게서 가장 높은 농도로 농축된다(Cook, P. M., Banbury Reports 35, cold Spring Harber, NY, 1991, 143). 어류, 육류, 우유 등 지질을 많이 포함하고 있는 음식물에서 다이옥신류가 검출되고 인간은 주로 음식물 섭취에 의해 다이옥신류에 노출된다(Safe, S. et al.,PCDDs and PCDFs, Springer-Verlag, Heidelberg, 1990, 1).
베트남 전쟁에 참전했던 군인에게서 피부병과 기형아 출산이 나타났는데 이것이 베트남 전역에 뿌려졌던 고엽제 내의 불순물로 섞여있던 다이옥신에 의한 것이라는 사실이 밝혀지면서 인간에 대한 다이옥신의 독성이 알려지기 시작했다. 다이옥신류는 암, 간 독성, 면역기능 약화 등을 유발하는 것이 동물실험을 통해 알려져 있으며, 내분비계 교란 물질로 작용하여 기형 형성, 생식기능 저하 등을 유도하는 것으로 의심되고 있다.
상기한 바와 같은 발암성, 기형형성, 생식독성 등의 다양한 독성을 가지는 다이옥신류에 의한 피해를 예방하기 위하여 가장 선행되어야 하는 일은 우선, 다이옥신류를 분석하는 것이다.
다이옥신류는 다양한 이성질체를 가지고 있으므로 이들을 분석하기 위해서 종래에는 고해상도 가스 크로마토그래피/질량 분광측정기 (high resolution gas chromatography/mass spectrometry; HRGC/MS)를 이용하였다. 그러나, 이 화학적 기기 분석법은 다음과 같은 단점을 가지고 있다. 1) 우선, 고가의 첨단 장비와 이를 사용할 수 있는 숙련된 전문 인력을 필요로 한다. 2) 복잡한 시료 전처리 과정을 거쳐야 하며 따라서 시간과 비용이 많이 들고 오랜 경험이 요구된다. 3) 또한 이과정에서 많은 양의 유기용매가 사용되므로 또다른 환경 오염을 유발할 수 있다. 4) 방사선 동위원소를 포함한 정량용 표준 물질을 사용하여야 하므로 비용이 많이 들고, 방사선 동위원소의 취급에 주의를 요한다. 5) 각각의 이성질체를 분석하여 여기에 다이옥신에 대한 상대적 독성치(toxic equivalent factor; TEF)를 곱해 TCDD TEQ으로 환산해야 하므로 번거로울 뿐 아니라 이 과정에서 누락되는 다이옥신류가 있을 수 있으며 그 결과 실제 오염정도와 차이가 생길 수 있다. 6) 시료중에 포함되어 있는 다이옥신류에 대한 정량적 의미만을 가지므로 생물체, 특히 인체에 미치는 영향을 예견하기 어렵다.
이에, 본 발명자들은 화학적 기기 분석법의 단점을 극복하여 간단하고 경제적이며 생체내에서의 다이옥신류에 의한 영향을 예측할 수 있는 다이옥신류의 생물학적 분석 방법을 개발하고자 노력한 결과, DRE와 루시퍼라제 유전자가 결합되어 다이옥신류에 의해 발현이 조절되면서 측정이 용이한 재조합 리포터 유전자를 제작하고 이를 인체 간암 세포주에 형질전환시킨 다음 다이옥신류에 의하여 유도된 루시퍼라제의 발현을 효소 활성을 통해 측정함으로써 환경 시료중에 존재하는 다이옥신류를 분석할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 독성이 매우 강한 환경오염 물질인 다이옥신류를 생물학적 방법을이용하여 간단하고 경제적으로 분석하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
도 1은 본 발명의 분석 방법의 흐름도이다.
도 2는 다이옥신의 농도에 따른 루시퍼라제의 발현양의 증가를 나타내는 그래프이다.
도 3은 미국 환경청 표준 물질 및 이의 계산된 다이옥신 등가값(TCDD toxic equivalency; 이하 'TCDD TEQ'로 약함)과 동일한 농도의 2,3,7,8-테트라클로로디벤조-p-다이옥신(2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin; 이하 '2,3,7,8-TCDD'로 약함)을 처리하였을 때 양자에 의한 루시퍼라제 발현량이 상호 일치함을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 재조합 플라스미드 pDRE-Luc.의 제한 효소 지도이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 환경시료 중에 존재하는 다이옥신류를 분석하는 방법에 있어서, (1) 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 세포주에 시료를 처리하는 단계; 및 (2) 상기 리포터 유전자의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 다이옥신류의 생물학적 분석방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (1) 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 세포주에 시료를 처리하는 단계; 및 (2) 상기 리포터 유전자의 발현정도를 측정하여 환경 시료내의 다이옥신류의 양을 검출하는 단계를 포함하는 다이옥신류의 생물학적 분석방법을 제공한다.
이 때 상기 다이옥신류는 폴리클로네이티드 디벤조파라다이옥신류(PCDDs), 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류(PCDFs), 폴리클로리네이티드 바이페닐류(PCBs) 및 폴리사이클릭 아로메틱 하이드로카본류(PAHs)를 포함한다.
또한 본 발명은 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자로 DRE-루시퍼라제 결합 유전자를 제공한다.
또한 본 발명은 DRE-루시퍼라제 재조합 유전자로 형질전환된 인체 간암 세포주 hep G2(수탁번호:KCTC 0671BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 DRE-루시퍼라제 재조합 유전자로 형질전환된 인체 간암 세포주에 시료를 처리한 다음, 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 루시퍼라제의 효소 활성을 측정함으로써 환경 시료내의 다이옥신류를 분석하는 다이옥신류의 생물학적 분석 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 환경시료 중에 존재하는 다이옥신류를 생물학적으로 분석하기 위하여, 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 세포주를 제작한다.
우선, 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 단백질의 조절 영역에 있는 DRE를 발현정도를 측정하기 용이한 리포터 유전자와 결합시켜 재조합 리포터 유전자를 제작한다.
일반적으로 생물체내로 유입된 다이옥신류는 세포질에 있는 수용체(aryl hydrocarbon recepter)와 높은 친화성을 가지고 결합한 후 핵 안으로 이동하고, 핵내에서 다시 다이옥신류-수용체 복합체가 핵 단백질인 ARNT(aryl hydrocarbon recepter nuclear translocater)와 결합한 다음 DNA의 특정 염기서열 즉, DRE를 인식하여 결합하는 것으로 알려져 있다(Burbach, K. M., et al.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 8185, 1992).
이러한 DNA와 단백질의 결합은 특정 단백질의 전사를 증가시키고 결국 세포내의 단백질의 양을 증가시키게 되며, 다이옥신류의 생물 독성은 이러한 단백질의 양이 증가됨에 의하여 유발된다고 생각되어지므로, 증가한 단백질의 양을 측정하면 환경 시료내의 다이옥신류의 양을 간접적으로 측정할 수 있다.
다이옥신류에 의해 양이 증가한다고 알려진 단백질은 10여가지가 있으며 가장 대표적이고 뚜렷하게 나타나는 것이 시토크롬 p450 1A1이다(Whitlock, J. P., Pharmacol. Rev., 39, 147, 1987). 시토크롬 p450은 주로 간에서 발현되는 산화효소로, 이는 외부물질에 의해 발현이 유도되는 특성을 가지며 다이옥신류에 의해 시토크롬 p450 1A1의 발현양이 현저히 증가한다.
본 발명에서는 상기 시토크롬 p450 1A1의 조절 영역의 DRE를 루시퍼라제 유전자와 결합시켜 DRE-루시퍼라제 결합 재조합 리포터 유전자를 제작하였다(도 4 참조).
다음에, 상기 재조합 리포터 유전자를 적합한 세포주에 형질전환시켜 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 세포주를 제작한다.
이 때 생물농축에 의한 가장 큰 피해자가 사람이고, 다이옥신류는 일차적으로 간에서 독성을 나타내게 되므로 이를 감안하여 상기 세포주로는 인체의 간암 세포를 이용하는 것이 바람직하고, 본 발명에서는 인체 간암 세포주인 Hep G2를 이용하였다.
구체적으로, 상기 DRE-루시퍼라제 결합 재조합 리포터 유전자를 포함하는 pDRE-Luc.와 세포주 선별을 용이하게 하는 항생제 내성 유전자를 포함하는 플라스미드를 엘렉트로포레이션(elctroporation)방법으로 Hep G2에 동시형질전환한 후, pDRE-Luc.가 세포내로 들어간 것을 항생제 내성으로 확인하여 본 발명의 세포주를 선별하고, 이를 Hep G2라고 명명하여, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1999년 10월 15일자로 기탁하였다(수탁번호: KCTC 0671BP).
본 발명은 상기 과정으로 제작한 다이옥신류에 의하여 발현이 조절되는 재조합 리포터 유전자를 가지는 세포주를 이용하여 다이옥신류를 처리하였을 때 리포터 유전자의 단백질 산물의 발현을 측정함으로써, 다양한 환경 시료내에 존재하는 다이옥신류를 분석한다.
구체적으로 본 발명에서는 루시퍼라제의 발현을 측정함으로써 다이옥신류를 분석하고, 루시퍼라제의 발현은 세포에 다이옥신류를 처리하고 단백질을 수득하여 루시퍼라제 효소 활성을 측정함으로써 결정한다. 루시퍼라제는 기질인 루미놀(luminol)과 효소-기질 반응에 의하여 빛을 생성하고, 이때 생성되는 빛을 광측정기로 측정함으로써 증가된 루시퍼라제의 양을 결정할 수 있으며, 이를 통하여 본 발명의 세포에 처리된 다이옥신류를 분석한다.
본 발명의 세포주에서 처리된 다이옥신류의 농도에 따라 루시퍼라제의 발현량이 증가하는지를 확인하기 위하여, 다이옥신류의 농도를 변화시켜 처리하였다. 본 발명에서는 다이옥신류중에서 가장 독성이 강한 것으로 알려진 2,3,7,8-TCDD를 처리하였고, 그 결과 도 2에서 확인되는 바와 같이 처리된 2,3,7,8-TCDD의 농도가 클수록 루시퍼라제의 발현량이 증가되었고, 이는 본 발명의 세포주를 이용한 분석방법에 의하면 루시퍼라제의 발현정도를 측정함으로써 환경 시료내의 다이옥신류의 양을 정확하게 측정할 수 있음을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 분석방법에 의하면 다이옥신류의 정성적 분석뿐 아니라 정량적 분석도 가능하다.
본 발명에 의한 분석방법이 다이옥신류의 다양한 이성질체에 의한 영향을 실질적으로 반영하는지 확인하기 위하여, 미국 환경청이 정한 다이옥신류중 독성이강한 17가지가 일정 농도로 혼합된 표준 물질과 이 표준 물질과 등가치의 독성을 가지는 것으로 계산된 농도의 2,3,7,8-TCDD을 처리하였다. 그 결과 도 3에서 확인되는 바와 같이, 표준물질과 본 발명에서 처리한 2,3,7,8-TCDD는 거의 동일한 양의 루시퍼라제 발현을 유도하였다. 따라서, 본 발명의 분석 방법에 의하면 다이옥신의 다양한 이성질체에 의한 영향을 모두 분석할 수 있다.
이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 인체 간암 세포의 배양
인체 간암 세포주인 Hep G2 세포를 10% 소태아혈청(fetal calf serum, FCS)을 포함한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 배양액으로 37℃, 5% CO2가 유지되는 세포배양기에서 배양하였다. 배양액은 이틀에 한번씩 교체하고 세포를 분주할 때에는 0.25% 트립신-EDTA를 넣고 배양접시에서 떼어낸 후 2-4개로 나누었다.
실시예 2. 재조합 리포터 유전자(pDRE-Lue.) 제작
시토크롬 p450 1A1 유전자의 상부(upstream)의 DRE를 포함하는 DRE-MMTV 최소 프로모터(minimal promoter)의 양끝은 제한효소HindⅢ로 자르고, 루시퍼라제 유전자는 pBI-L(클론테크)에서PstⅠ,HindⅢ로 잘라내고 송아지 소장 알칼라인 포스파타제(calf intestinal alkaline phosphatase)를 처리하여 뭉툭한 말단(blunt end)을 만들었다.
상기 두 유전자를 라이게이션하여 재조합 리포터 유전자 pDRE-Luc.를 만들고이를BglⅡ를 이용한 다이제스쳔 분석(digestion analysis)으로 확인하였다.
실시예 3. 재조합 리포터 유전자를 가지는 형질전환 세포주의 제작
인간 간암 세포 Hep G2 1×107세포에 pDRE-Luc. 30㎍, pcDNA 3.1(+) 3㎍을 960㎌, 230mV로 엘렉트로포레이션 방법으로 동시형질전환시켰다. 48시간 동안 배양한 후 1㎎/㎖의 G418(네오마이신)을 처리하여 유전자가 형질전환되지 않은 세포는 제거하였다. 유전자가 들어간 세포는 pcDNA 3.1(+)에 있는 네오마이신 내성 유전자에 의해 살아남게 된다. 단일 세포가 만든 세포군을 피펫팅으로 취해 96 웰 플레이트로 옮겨 배양하였다. 세포수가 증가하면 각 세포군을 두개의 새로운 웰에 나누고 DMSO(0.1%), 1nM 2,3,7,8-TCDD을 각각 24시간 동안 처리한 후 단백질을 얻어 루시퍼라제 효소 활성 분석을 통해 pDRE-Luc. 유전자가 세포내로 들어가 기능을 발휘하는 세포군만을 선별하였다.
실시예 4. 루시퍼라제 효소 활성 측정
DMSO와 2,3,7,8-TCDD을 각각 24시간 동안 처리한 후 배양액을 흡인제거하고 DPBS(Dulbecco's Phospate Buffered Saline)로 2회 세척하였다. 50㎕의 완충액(비이온성 계면활성제 1% 트리톤 X-100, 20mM 트리스 pH8.0, 150mM NaCl, 2mM DTT)을 넣고 세포를 용해시켰다. 이 중 10㎕을 취해 12×75 보로실리케이트(borosilicate) 튜브에 넣고 루시퍼라제의 기질인 루미놀(파마시아) 50㎕와 섞어 생성되는 빛을 광측정기로 측정하였다.
실시예 5. 2,3,7,8-TCDD에 의한 루시퍼라제의 발현 유도 확인
제작된 세포주 1×104세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 나누고, 24시간 후 DMSO(0.1%), 2,3,7,8-TCDD 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 1.0, 5.0, 10nM을 처리하였다. 24시간후 완충액 50㎕를 넣어 세포를 용해시키고 이중 10㎕를 취해 루시퍼라제 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 처리된 2,3,7,8-TCDD의 농도가 클수록 루시퍼라제의 발현양이 증가되었고, 이를 도 2에 나타내었다.
실시예 6. 미국 환경청 표준물질과 2,3,7,8-TCDD의 루시퍼라제 발현량 비교
PCDDs와 PCDFs 중 독성이 강한 17가지가 2,3,7,8-TCDD에 대한 상대적 독성이 정해져 있으며 이들이 일정 농도로 혼합되어 있는 미국 환경청 표준 물질이 있다. 세포주 1×104세포를 96웰 플레이트의 각 웰에 나누고, 24시간 후 표준 시료의 TCDD TEQ값을 계산하여 2,3,7,8-TCDD의 양과 동일한 양을 각각 처리하였다. 24시간 후 루시퍼라제 효소 활성 측정을 통해 이들에 의한 루시퍼라제 발현량을 비교하였다. 그 결과 표준물질과 2,3,7,8-TCDD는 거의 동일한 양의 루시퍼라제 발현을 유도하였고, 이를 도 3에 나타내었다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 분석 방법은 과정이 단순하여 간편하게 분석할 수 있으며, 고가의 장비와 방사선 동위원소를 사용하지 않으므로 비용이 절감되고 짧은 시간내에 대량 분석할 수 있으므로 경제적이다. 특히 한꺼번에 수십 내지 수백개의 시료를 분석할 수 있으므로 많은 수의 환경 시료 분석에 적합하다.
또한 본 발명에 의한 분석방법은 다이옥신류가 생물체내에서 유발하는 독성기전에 기반을 두고 있으므로 다이옥신류의 정성, 정량적 분석뿐 아니라 생물체에 미치는 독성효과를 동시에 확인할 수 있는 이점을 가지고 있다.

Claims (8)

  1. 환경시료 중에 존재하는 인체에 유해한 다이옥신류를 분석하는 방법에 있어서, (1)제 4 도의 제한효소 지도를 갖는 재조합 플라스미드 pDRE-Luc로 형질전환된 인체 간암 세포주에 시료를 처리하는 단계; 및 (2) 루시퍼라아제의 발현을 측정하는 단계를 포함하는 다이옥신류의 생물학적 분석방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 다이옥신류는 폴리클로네이티드 디벤조파라다이옥신류(PCDDs), 폴리클로리네이티드 디벤조퓨란류(PCDFs), 폴리클로리네이티드 바이페닐류(PCBs) 및 폴리사이클릭 아로메틱 하이드로카본류(PAHs)인 것을 특징으로 하는 분석방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 (2) 단계는 루시퍼라제의 효소 활성을 측정하는 것을 특징으로 하는 분석방법.
  7. DRE-루시퍼라제 재조합 유전자를 포함하여 제 4 도의 제한효소 지도를 가지는 재조합 플라스미드 pDRE-Luc.
  8. DRE-루시퍼라제 재조합 유전자로 형질전환된 인간 간암 세포주 hep G2(수탁번호: KCTC 0671BP).
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