WO2005105998A1 - ヒト抗アミロイドβペプチド抗体およびその抗体フラグメント - Google Patents

ヒト抗アミロイドβペプチド抗体およびその抗体フラグメント Download PDF

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Kazuhisa Sugimura
Toshihiro Nakashima
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Definitions

  • the present invention relates to a human anti-A ⁇ antibody that binds to amyloid j8 peptide (hereinafter, referred to as A
  • the antibodies and antibody fragments are expected to be used as diagnostics and therapeutics for Aldino Ima dementia, which is considered to be due in part to the formation of aggregates of ⁇
  • the ⁇ molecule is a degradation product produced by cleavage of -euron amyloid precursor protein by 13-secretase or the like.
  • ⁇ 1-40 and ⁇ 1-42 hereinafter ⁇ ⁇ 42!. It has been reported that the force generated by A ⁇ 42 is more cohesive and correlates with disease and neurotoxicity. It has also been suggested that microgliadastrogocytes are localized in ⁇
  • Non-Patent Document 1 B. Solomon et al.
  • Non-Patent Document 2 reported the in vitro anti-A ⁇ antibody ( ⁇ terminal antibody) aggregation-inhibiting effect of ⁇
  • a vaccine treatment for Alzheimer's dementia with Aj8 has been attempted, and certain onset prevention such as reduction of cerebral amyloid deposition has been attempted.
  • the arrest activity was revealed (Non-Patent Document 3 and Non-Patent Document 4).
  • the vaccine therapy is effective, it has serious side effects due to the induction of an inflammatory response due to the activation of T cells, and it can still be established as a safe and effective preventive treatment. ,.
  • the effects of the A ⁇ vaccine therapy are that the locally activated microglial cells take up and degrade the antibody-deposited Aj8 antigen complex via the Fc receptor, and bind to soluble Aj8. Thus, the effect of preventing local deposition has been estimated.
  • Non-Patent Document 5 In the case of passive immunization with antibody transfer, ⁇ cells are unlikely to induce an inflammatory response by activating cells, but it is said that they do not cross the cerebrovascular barrier because they are less than 0.1% of anti- ⁇ antibodies present in serum. It is considered that large doses and frequent administration are required.
  • Non-Patent Document 1 Solomon, B. et al. (1996) Pro. Natl. Acad. Sci., 93, 452-455.
  • Non-Patent Document 2 Schenk, D. et al., (1999) Nature, 400, 173
  • Non-Patent Document 3 Nicoll, J.A., et al., (2003) Nature Medicine, 9, 448
  • Non-Patent Document 4 Monsonego, A. et al. (2003) Science, 302, 834-838
  • Non-Patent Document 5 McLaurin et al., (2002) Nature Medicine, 8, 1263-1269
  • the problem of the formation of A ⁇ molecule aggregates is also the problem of the conformation of ⁇ molecules. Therefore, if a molecule that suppresses or controls the structural transformation, that is, a ⁇
  • the present invention uses a human antibody phage display library to isolate a human antibody that specifically binds to ⁇
  • scFv human-chain variable regions
  • the present invention includes the following 1) to 32) as medically or industrially useful method 'substances.
  • the complementarity determining region (CDR) of the ⁇ chain has the following amino acid sequence (a) or (b), and the complementarity determining region (CDR) of the L chain has the following (c) or ( The human anti-A
  • the amino acid sequence of CDRs 1-3 is represented by SEQ ID NOs: 2 to 4, 12 to 14, 22 to 24, 32 to 34, 4 ⁇ chain of the human anti-A ⁇ antibody according to 9) above, which is an amino acid sequence from which a combination of 2 to 44, 52 to 54, 62 to 64, 72 to 74, 82 to 84, or 92 to 94 is also selected. Variable region fragment.
  • a human-derived antibody against A ⁇ obtained by linking the human anti-A ⁇ antibody light chain variable region fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 101 with a human-derived antibody constant region, or a fragment thereof.
  • a fusion antibody or a fragment thereof obtained by fusing the antibody or fragment thereof according to any of the above 1) to 21 or a peptide or another protein.
  • these anti- ⁇ antibodies and antibody fragments have the effect of suppressing the aggregation of A
  • a fusion with a protein or a small molecule capable of interacting with an antibody against P-glycoprotein or a receptor involved in drug transport at the brain-vascular barrier can be used. Also,
  • microglia in the brain can be added. Can also be used to remove accumulated A
  • the antibody according to the present invention is a fully human antibody, a diagnostic method can be performed, and a therapeutic method that inhibits the aggregation process of A
  • the human monoclonal antibody and the antibody fragment molecule of the present invention have a variable region of a human-derived anti-A
  • the antibody and the antibody fragment of the present invention can be used as a prophylactic or therapeutic agent for Alzheimer's disease.
  • FIG. 1 is a view showing the results of an ELISA for evaluating the specificity of an isolated clone scFv for A ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 2 is a view showing the results of an ELISA for evaluating the solubility of scFv of isolated clones and the specificity of fibrilized A ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 3 is a diagram showing the expression of expressed scFv-His6 and VL-Dl-D2-His confirmed by Western plot using an anti-His6 antibody.
  • FIG. 4 is a view showing the results of ELISA for evaluating the specificity of VL-D1-D2-His for A ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of evaluating the activity of purified scFv for suppressing A ⁇ 42 peptide fibrillation by a fluorescent thioflavin test.
  • FIG. 6 is a graph showing the concentration dependence of the ability of purified scFv (FvlE4) to inhibit ⁇ 42 peptide aggregation.
  • FIG. 7 is a graph showing the concentration dependence of the ability of purified scFv (B7) to inhibit A ⁇ 42 peptide aggregation.
  • FIG. 8 shows the binding of scFv-displaying phage to fibrillated ⁇ ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 9 is a graph showing the binding properties of scFv to a fibrillated A ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of evaluating the activity of purified scFv for suppressing A ⁇ 42 peptide fibrillation by a fluorescent thioflavin test.
  • FIG. 11 shows the concentration dependence of the ability of purified scFv to inhibit aggregation of ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 12 is a graph showing the binding property of a purified tat peptide-fused VL chain to the ⁇ 42 peptide.
  • FIG. 13 is a graph showing the concentration dependence of the ability of purified tat peptide fusion VL chain to inhibit A ⁇ 42 peptide aggregation.
  • scFv and the like used for the antibodies and antibody fragments of the present invention were obtained as follows.
  • H chain and L chain cDNAs were amplified by RT-PCR, and both were linked with linker DNA, ScFv DNA was prepared by random combination of H chain variable region (VH chain or VH) and VL chain derived from lymphocytes of a healthy subject.
  • the scFv or VL fragment can be expressed, for example, in Escherichia coli.
  • scFv to be expressed such as a useful promoter commonly used and a signal sequence for antibody secretion, can be operably linked and expressed.
  • promoters include the lacZ promoter, araB promoter and the like.
  • the pelB signal sequence (Lei, SP. et al., J. BacterioL, 1987, 169: 4379-4383) may be used as a signal sequence for secretion of scFv when expressed in the periplasm of Escherichia coli. For secretion into the culture supernatant, it is better to use the signal sequence of the g3 protein of the M13 phage.
  • VL fragment In the case of a VL fragment, it can also be expressed alone or in the form of a fusion protein with another peptide or protein.
  • the scFv expressed as described above can be purified intracellularly and extracellularly, and the host can be purified to homogeneity. Since the scFv expressed in the present invention has an E tag sequence added to its C-terminus, it can be easily and quickly purified using affinity chromatography using an anti-E tag antibody. .
  • Other separation and purification methods used for ordinary proteins Can be combined for purification. For example, antibodies can be separated and purified by combining column chromatography such as ultrafiltration, salting out, gel filtration, ion exchange Z hydrophobic chromatography, and the like.
  • scFv protein and VL chain obtained by the present invention have a binding activity to ⁇
  • Methods for measuring the antigen-binding activity of the anti- ⁇ antibody used in the present invention include ELISA, BIAcore, and the like.
  • ELISA a 96-well plate on which Aj8 is immobilized is added to a sample containing the anti-A
  • a secondary antibody labeled with an enzyme such as peroxidase is added, the plate is incubated and washed, and then the chromogenic substrate TMBZ is added and the absorbance is measured to evaluate the antigen binding activity.
  • the anti-A ⁇ antibody fragment of the present invention bound to normal type ⁇ and suppressed structural conversion to aggregated type.
  • these antibodies and antibody fragments can sufficiently suppress the structural conversion into an aggregated form. Therefore, these low-molecular-weight antibodies can be expected to be sufficiently effective as prophylactic agents for suppressing the structural change of ⁇ and as agents for suppressing the progress of symptoms.
  • the anti-A ⁇ antibody fragment of the present invention contains a sequence having a property of reacting more strongly with the aggregated type than with the normal type ⁇ .
  • 8 antibody fragments of the present invention FvlEl, FvlE4, FvlE7, Fv2A7, Fv2A8, Fv2B6, B7, B6, F10, Dl, and VLA2 and antibodies in which an Fc region is bound to these antibody variable regions Molecules and fusion proteins
  • VH chains and VL chains of ten types of scFvs (FvlEl, FvlE4, FvlE7, Fv2A7, Fv2 A8, Fv2B6, B7, B6, F10, Dl) having the above inhibitory activities, and amino acid sequences of VL chains (VLA2) And the nucleotide sequence encoding it are as follows.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone FvlEl is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 2-4. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 1, the 30th to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 2), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 3), 99th to 107th
  • the third amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 4).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 5.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone FvlEl is shown in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOS: 7 to 9. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 6, the amino acid sequence at positions 23 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 7); the amino acid sequence at positions 51 to 57 is CDR2 (SEQ ID NO: 8); The third amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 9).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 10.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone FvlE4 is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 12 to 14. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 11, the 30th to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 12), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 13), 99th to 99th amino acid sequences.
  • the 112nd amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 14).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 15.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone FvlE4 is shown in SEQ ID NO: 16.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOS: 17 to 19. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 16, the amino acid sequence at positions 23 to 36 is CDR1 (SEQ ID NO: 17), the amino acid sequence at positions 52 to 58 is CDR2 (SEQ ID NO: 18), The 100th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 19).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 20.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone FvlE7 is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOS: 22 to 24. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 21, the 30th to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 22), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 23), 99th to 99th amino acid sequences.
  • the amino acid sequence at position 111 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 24).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone FvlE7 is shown in SEQ ID NO: 26.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOS: 27 to 29. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 26, the amino acid sequence at positions 23 to 33 is CDR1 (SEQ ID NO: 27), the amino acid sequence at positions 49 to 55 is CDR2 (SEQ ID NO: 28), 9 The 9th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 29).
  • SEQ ID NO: 30 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone Fv2A7 is shown in SEQ ID NO: 31.
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 32 to 34. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 31, the 30th to 35th amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 32), the 50th to 66th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 33), and 99th to 99th amino acid sequences.
  • the 112nd amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 34).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone Fv2A7 is shown in SEQ ID NO: 36.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOS: 37 to 39. That is, SEQ ID NO: 36
  • the amino acid sequence at positions 24 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 37)
  • the amino acid sequence at positions 51 to 57 is CDR2 (SEQ ID NO: 38)
  • the amino acid sequence at positions 90 to 98 is Corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 39).
  • SEQ ID NO: 40 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone Fv2A8 is shown in SEQ ID NO: 41.
  • the amino acid sequences of CDR1 to 3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 42 to 44. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 41, the amino acid sequence at positions 30 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 42), the amino acid sequence at positions 50 to 68 is CDR2 (SEQ ID NO: 43), The amino acid sequence at position 112 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 44).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 45.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone Fv2A8 is shown in SEQ ID NO: 46.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 47 to 49. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 46, the 20th to 32nd amino acid sequences are CDR1 (SEQ ID NO: 47), the 48th to 54th amino acid sequences are CDR2 (SEQ ID NO: 48), The amino acid sequence at position 97 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 49).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 50.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone Fv2B6 is shown in SEQ ID NO: 51.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 52 to 54. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 51, the amino acid sequence at positions 30 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 52), the amino acid sequence at positions 49 to 66 is CDR2 (SEQ ID NO: 53), The amino acid sequence at position 110 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 54).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 55.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone Fv2B6 is shown in SEQ ID NO: 56.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOS: 57 to 59. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 56, the amino acid sequence at positions 23 to 36 is CDR1 (SEQ ID NO: 57), the amino acid sequence at positions 52 to 58 is CDR2 (SEQ ID NO: 58), and 9
  • the ninth amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 59).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 60.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone B7 is shown in SEQ ID NO: 61.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOS: 62 to 64. That is, in the amino acid sequence of the VH chain represented by SEQ ID NO: 61, the amino acid sequence at positions 31 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 62), the amino acid sequence at positions 50 to 66 is CDR2 (SEQ ID NO: 63), and the amino acids at positions 99 to 112
  • the second amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 64).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 65.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone B7 is shown in SEQ ID NO: 66.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 67 to 69. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 66, the amino acid sequence at positions 23 to 33 is CDR1 (SEQ ID NO: 67), the amino acid sequence at positions 49 to 55 is CDR2 (SEQ ID NO: 68), and the amino acids at positions 88 to 88
  • the 98th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 69).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 70.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone B6 is shown in SEQ ID NO: 71.
  • the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 72-74. That is, in the amino acid sequence of the VH chain represented by SEQ ID NO: 71, the amino acid sequence at positions 31 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 72), the amino acid sequence at positions 50 to 66 is CDR2 (SEQ ID NO: 73), and the amino acids at positions 99 to 112
  • the amino acid sequence at position 2 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 74).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 75.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone B6 is shown in SEQ ID NO: 76.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 77 to 79. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 76, the amino acid sequence at positions 23 to 33 is CDR1 (SEQ ID NO: 77), the amino acid sequence at positions 49 to 55 is CDR2 (SEQ ID NO: 78), and the amino acid sequence at positions 88 to 88 The 98th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 79).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 80. (0090) Clone F10
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone F10 is shown in SEQ ID NO: 81.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOS: 82 to 84. That is, in the amino acid sequence of the VH chain represented by SEQ ID NO: 81, the amino acid sequence at positions 31 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 82), the amino acid sequence at positions 50 to 66 is CDR2 (SEQ ID NO: 83), and the amino acids at positions 99 to 114 The amino acid sequence at position 2 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 84).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 85.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone F10 is shown in SEQ ID NO: 86.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 87 to 89. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 86, the amino acid sequence at positions 23 to 33 is CDR1 (SEQ ID NO: 87), the amino acid sequence at positions 49 to 55 is CDR2 (SEQ ID NO: 88), and the amino acid sequence at positions 88 to 88 The 98th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 89).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 90.
  • the amino acid sequence of the VH chain of clone D1 is shown in SEQ ID NO: 91.
  • the amino acid sequences of CDRs 1-3 of the VH chain are shown in SEQ ID NOs: 92-94. That is, in the amino acid sequence of the VH chain shown in SEQ ID NO: 91, the amino acid sequence at positions 31 to 35 is CDR1 (SEQ ID NO: 92), the amino acid sequence at positions 50 to 66 is CDR2 (SEQ ID NO: 93), and the amino acids at positions 99 to 106 are The third amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 94).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VH chain is shown in SEQ ID NO: 95.
  • the amino acid sequence of the VL chain of clone D1 is shown in SEQ ID NO: 96.
  • the amino acid sequences of CDR1 to CDR3 of the VL chain are shown in SEQ ID NOs: 97 to 99. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 96, the amino acid sequence at positions 23 to 33 is CDR1 (SEQ ID NO: 97), the amino acid sequence at positions 49 to 55 is CDR2 (SEQ ID NO: 98), and the amino acids at positions 88 to 88
  • the 98th amino acid sequence corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 99).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 100.
  • the amino acid sequence of clone VLA2 consisting of only the VL chain is shown in SEQ ID NO: 101.
  • the V The amino acid sequences of CDRs 1-3 of the L chain are shown in SEQ ID NOs: 102-104. That is, in the amino acid sequence of the VL chain shown in SEQ ID NO: 101, the amino acid sequence at positions 24 to 40 is CDR1 (SEQ ID NO: 102), the amino acid sequence at positions 56 to 62 is CDR2 (SEQ ID NO: 103), The amino acid sequence at positions 103 to 103 corresponds to CDR3 (SEQ ID NO: 104).
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the VL chain is shown in SEQ ID NO: 105.
  • the antibodies and antibody fragments thereof of the present invention are not limited to the above-mentioned VH chain and VL chain, and their CDRs, but are not limited to the sequences shown in the above SEQ ID NOs. It may be a polypeptide.
  • one or more amino acids consist of an amino acid sequence in which substitution, deletion, insertion, and Z or addition are performed, and Also included are polypeptides that serve as complementarity determining regions for chains or L chains, and variable regions for H chains or L chains.
  • substitution or deletion is performed by a known method for producing a mutant protein such as site-directed mutagenesis.
  • a loss, insertion, and Z or as many as possible, eg, 1 to 6 amino acids are substituted, deleted, inserted, and Z or added.
  • Such “mutation” mainly means a mutation artificially introduced by a known method for producing a mutant protein, and the same mutant polypeptide existing in nature (eg, human) is isolated and purified. May be used.
  • the above “mutation” means that when the antibody of the present invention or its antibody fragment is used as a therapeutic agent (when administered to humans), it retains a human-derived structure or has an immune response in humans.
  • the range is not particularly limited when the reaction is performed within a range that does not cause the case and is used as a detection instrument or a diagnostic kit (when not administered to humans).
  • VH chain and Z or VL chain disclosed in the present invention are mainly obtained in the form of scFv using the phage antibody method.
  • the application is limited to scFv.
  • the disclosed VH and Z or VL chains are intact molecular form linked to human immunoglobulin constant regions, or Fab, Fab 'or F (ab'), in combination with a portion of human immunoglobulin constant regions.
  • scFv is used to convert the H or L chain of human immunoglobulin into a constant region.
  • antibody fragments such as single-chain antibodies (scAbs) conjugated to some domains in the region and scFvFc conjugated scFvs to the entire constant region of the heavy and light chains of human immunoglobulin, are also within the scope. included.
  • scAbs single-chain antibodies conjugated to some domains in the region
  • scFvFc conjugated scFvs to the entire constant region of the heavy and light chains of human immunoglobulin
  • the antibody or fragment thereof of the present invention can also be a fusion antibody or fragment thereof obtained by fusing the antibody or fragment with a peptide or other protein.
  • a modified antibody or a fragment thereof obtained by binding a polymer modifier such as polyethylene glycol to these antibodies and antibody fragments or the above-mentioned fusion antibody or a fragment thereof can be used.
  • any single-chain peptide having 10 to 25 amino acids can be used as the peptide linker.
  • the above-mentioned antibody or fragment thereof, the above-mentioned fusion antibody or fragment thereof, or the above-mentioned modified antibody or fragment thereof may be an A
  • the antibody or pima antibody fragment of the present invention Puma, Torishima U number 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 , 80, 85, 90, 95, 100, or 105, based on the gene sequence information encoding the VH and VL chains of each clone obtained according to the present invention, based on an appropriate host (for example, bacteria, yeast, etc.). ) To express the antibody of the present invention or a fragment thereof.
  • the gene of the present invention can also be used as a gene therapy drug for Aluno and Ima dementia associated with ⁇ .
  • the construction of the phage library was based on the method reported by JD Marks et al. (J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991), using lymphocytes from peripheral blood from 20 healthy subjects as starting materials. ,It was constructed. The constructed VH ( ⁇ ) - V ⁇ , VH ( ⁇ ) - V e, VH () - V ⁇ , VH () Each sub-library one is of V 1.1X10 8, 2.1X10 8, 8.4X10 7, 5.3X10 It was assessed to have a diversity of seven clones.
  • an antibody phage library (single-chain antibody-displayed phage solution) derived from a healthy person was used as a mixture of VH ( ⁇ ) - ⁇ and VH (y) -V, ⁇ (/ ⁇ ) - ⁇ and VH (/ z) A mixture of —V mixture was added to each of the two cases, and 100 ⁇ L (5 ⁇ 10 n tu / mL) was added thereto, followed by reaction at room temperature for 1 hour.
  • ELISA for screening the isolated clones was performed as follows. ⁇ The ⁇ 42 peptide was immobilized on an ELISA plate and used for screening. 1.25 ⁇ g / mL Aj842 peptide and 2.5 ⁇ g / mL human serum albumin (HSA) were placed in a 40 ⁇ L / well ELISA plate (Nunc), allowed to stand at 4 ° C for 16 hours, and immobilized. . In the immobilization plate, 400 ⁇ L / well of a PBS solution containing 0.5% BSA, 0.5% gelatin and 5% skim milk was placed in an ELIS II plate, and allowed to stand at 4 ° C. for 2 hours to perform blocking.
  • HSA human serum albumin
  • a sample solution containing scFv-displaying phage was added at 40 ⁇ L / well and reacted, and then the sample solution was discarded and washed five times with a washing solution. It was reacted with a biotin-labeled anti-M13 monoclonal antibody (Pharmacia biotech) and reacted with alkaline phosphatase (AP) -labeled anti-mouse IgG antibody. After washing 5 times with the washing solution, add 50 ⁇ L / well of a chromogenic substrate solution (PBS solution containing lg / mL p-nitrophenyl phosphate (Wako) and 10% diethanolamine (Wako)), and shield from light.
  • PBS solution containing lg / mL p-nitrophenyl phosphate (Wako) and 10% diethanolamine (Wako)
  • the DNA base sequences of VH and VL of the scFv gene of the isolated clone were determined using Dye terminator cycle sequencing Fb Ready Reaction kit (.Applied Biosystems). As a result of ELISA and sequence analysis, the isolated clones were classified into six types of scFv and one type of VL.
  • Plasmid DNA was recovered from the scFv clone reacting with the A
  • the mixture was centrifuged at 8,900 X g for 30 minutes, and the supernatant was collected and filtered with a 0.45 m filter, which was used as a scFv purification starting material having a periplasmic fraction.
  • the starting material for purification thus prepared was purified by affinity chromatography using an anti-E tag antibody according to a conventional method. After dialysis with PBS, endotoxin was removed using an endotoxin removal column Detoxi-gel (PIERCE) according to the attached protocol! After concentration with Centricon (Amicon) with a molecular weight cut-off of 10,000, it was filtered through a 0.45 ⁇ m filter and purified.
  • PIERCE endotoxin removal column Detoxi-gel
  • the purified antibody was added to a 96-well plate (NUNC. MAXISORP) immobilized with ⁇ 42 peptide adjusted to 1.25 ⁇ g / mL with PBS and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with 0.05% Tween-PBS (hereinafter sometimes abbreviated as PBST), the plate was reacted with an anti-E tag antibody at 37 ° C for 1 hour.
  • NUNC. MAXISORP 96-well plate
  • PBST Tween-PBS
  • scFv The binding of scFv to fibrillated Aj842 peptide was measured by ELISA.
  • 96-well plate NUNC. MAXISORP
  • soluble ⁇ 42 peptide 5 ⁇ g / mL mouse IgG and 0.5% gelatin immobilized in PBS adjusted to 1.25 ⁇ g / mL
  • 100 ⁇ L of scFv purified from the E. coli periplasm fraction was purified and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
  • Escherichia coli JM83 was transformed. This transformant was cultured in the same manner as in Example 5, and the VL-Dl-D2-His protein was recovered from the E. coli periplasmic fraction. As analyzed by Western blot, as designed
  • Example 8 40 ⁇ l / well of the VL chain recovered in Example 8 was added to an ELISA plate, and allowed to stand at room temperature for 6 hours. After washing once with PBS containing 0.1% Tween 20, the plate was blocked with 0.25% BSA. To the plate after the treatment, 100 ng / well Aj842 peptide, MCP-1 IL-5, human prion or cyprion (PrPcl02-241 InPro BioTech) was added, and the mixture was reacted at 37 ° C for 1 hour.
  • Example 5 Using the purified scFv prepared in Example 5, the ability to inhibit the aggregation of the A ⁇ 42 peptide was evaluated. Aggregation inhibition ability was evaluated by the progress of amyloid fiber formation by a fluorescent thioflavin test. Sample 220 ⁇ was diluted to 4 ⁇ with 0.1 M potassium phosphate buffer ⁇ 6.5 containing 10 ⁇ thioflavin, and stirred at room temperature for 2 minutes. At this time, l% wt / wt seed aggregates ( In order to suppress the formation of macromolecules in advance, those subjected to ultrasonic treatment) were added at the same time.
  • the fluorescence of the thioflavin dye at an excitation light of 450 nm was measured at 482 nm (Hitachi, F-3000) to evaluate the formation of aggregation. As a result, aggregation inhibition activity was confirmed in all four clones evaluated (Fig. 5).
  • Example 5 Using the purified scFv prepared in Example 5, the concentration dependency of the aggregation inhibiting ability of the A ⁇ 42 peptide was evaluated. Aggregation inhibition ability was evaluated in the same manner as in Example 10 by a fluorescent thioflavin test for amyloid fiber formation. Control scFv and purified scFv (FvlE4 and ⁇ 7, ⁇ -40 ⁇ g / ml) were added to 20 ⁇ l of ⁇ 42, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours. After adjusting the concentration of ⁇ 42 to 2/2, thioflavin ⁇ ⁇ was added to 10/10 and stirred at room temperature for 2 minutes.
  • Control scFv and purified scFv FvlE4 and ⁇ 7, ⁇ -40 ⁇ g / ml
  • the fluorescence of the thioflavin dye at an excitation light of 450 nm was measured at 482 nm (Hitachi, F-3000) to evaluate the formation of aggregation. As a result, it was confirmed that the two clones evaluated had an aggregation inhibitory activity in a scFv concentration-dependent manner (FIGS. 6 and 7).
  • Example 12 Binding of scFv-displaying phage to fibrillated A ⁇ 42 peptide
  • the binding of the scFv-displaying phage to the fibrillated A ⁇ 42 peptide was measured by ELISA. Put fibrinated A ⁇ 42 peptide, soluble ⁇ 42 peptide, and 1000-fold diluted 1000 ⁇ serum adjusted to 50 ng / mL with PBS at 40 ⁇ L / well into an ELISA plate (Nunc) at 4 ° C. It was left still for 6 hours and fixed. In the immobilized plate, a PBS solution containing 0.25% BSA was added to the ELISA plate at 400 ⁇ L / well, and the plate was allowed to stand at 4 ° C. for blocking.
  • 842 peptide was measured by ELISA.
  • a sample solution containing 3 g / mL of scFv purified in the same manner as in Example 5 was placed in a plate prepared in the same manner as in Example 12 at 40 L / well, and reacted.The sample solution was discarded and washed five times with the washing solution. .
  • the cells were reacted with anti-Etag mAb (1: 1000) and reacted with alkaline phosphatase-bound goat mouse IgG (1: 1000). The measurement was performed in the same manner as in Example 12 after the chromogenic substrate solution. As a result, it was confirmed that the evaluated B6 and F10 were specific to the fibrillated A
  • Example 13 Using the purified scFv prepared in Example 13, the aggregation inhibition ability of the ⁇ 42 peptide was evaluated. Agglutination inhibitory ability was evaluated by a fluorescent thioflavin test for the progress of amyloid fiber formation. ScFv was added to a final concentration of 40 g / ml to 20 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ of the sample, and the mixture was allowed to stand. Samples were collected at each time, the concentration of A
  • Example 13 Using the purified scFv prepared in Example 13, the concentration dependency of the aggregation inhibiting ability of the Aj842 peptide was evaluated. Aggregation inhibition ability was evaluated in the same manner as in Example 14 by progression of amyloid fiber formation by a fluorescent thioflavin test.
  • a control scFv and a purified scFv (final concentration: 4040 ⁇ g / ml) were added to 20 ⁇ l of ⁇ 42, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 24 hours. After adjusting the concentration of A ⁇ 42 to S 2 ⁇ , thioflavin ⁇ was added to 10 ⁇ and stirred at room temperature for 2 minutes.
  • the fluorescence of the thioflavin dye at an excitation light of 450 nm was measured at 482 nm (Hitachi, F-3000) to evaluate the formation of aggregation. As a result, it was confirmed that the three clones evaluated had an aggregation inhibitory activity in a scFv concentration-dependent manner (FIG. 11).
  • Example 16 Preparation of tat peptide fusion human-derived anti-A ⁇ 42 peptide VL chain expression preparation
  • HIV tat peptide sequence (Met Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly) (SEQ ID NO: 106) was added to the 5 ′ end of the A ⁇ 42 peptide-specific VL chain gene constructed in Example 8 by PCR. Then, the resultant was added to a pET-29b vector (Novagen) using restriction sites Ndel and Notl. After transformation into E. coli BL21 (DE3) star, induced by IPTG The tat-VL chain was expressed as an inclusion body. After recovering the cells, the cells were sonicated, centrifuged, and the supernatant was removed. The insoluble fraction was dissolved with 6M guanidine hydrochloride.
  • the solubilized fraction was applied to a Ni-NTA column in the presence of 6M guanidine hydrochloride, washed, and the protein bound to the column was eluted with imidazole to obtain a tat-VL chain purified fraction.
  • the tat-VL chain purified fraction was refolded by the step dialysis method as follows. The solution was adjusted with a 50 mM Tris-HCK pH 8.0), 10 mM ⁇ -ME, ImM EDTA, 200 mM NaCl, 6M GdnHCl solution to a 7.5 uM tat-VL chain solution, and dialyzed against the above solution except for j8-ME for 2 hours.
  • Dialysis was performed for 12 hours against GSSG / 200 mM L-Arginine and against PBS for 12 hours to prepare a final refolded tat-VL chain.
  • the tat peptide-fused VL chain recovered in Example 16 was added to the ELISA plate at 40 ⁇ l / well, and allowed to stand at 4 ° C for 12 hours. After washing once with PBS containing 0.1% tween, the plate was blocked with 0.5% gelatin. The plate after the treatment was treated with 100 ng / well of Aj842 peptide, MCP-1, mouse IgG or goat IgG, and reacted at 37 ° C. for 1 hour. After washing 5 times with PBST, secondary antibodies (anti-A
  • the reaction was carried out as it was without). After washing 5 times with PBST, it was further reacted with an alkaline phosphatase-labeled anti-mouse antibody at 37 ° C for 1 hour. After washing 5 times with PBST, a chromogenic substrate solution was added to develop color, and the absorbance at 405 was measured to evaluate the binding property. The results are shown in FIG. The purified tat peptide fusion VL evaluated specifically bound to the A ⁇ 42 peptide.
  • Example 16 Using the purified tat peptide fusion VL chain prepared in Example 16, the ability to inhibit the aggregation of ⁇

Abstract

　アミロイドβペプチド（以下、Ａβという）に結合し、Ａβ分子の凝集を阻害するヒト抗Ａβ抗体および該抗体フラグメントを提供する。本発明の抗体および抗体フラグメントは、ヒト抗Ａβ抗体の可変領域を有し、Ａβと強く反応して、その凝集の阻害作用を示す。本発明の抗体および抗体フラグメントは、Ａβの検出試薬、アルツハイマー痴呆症の予防・治療薬、または診断薬として使用することができる。

Description

明 細 書
ヒト抗アミロイド 0ペプチド抗体およびその抗体フラグメント
技術分野
[0001] 本発明は、アミロイド j8ペプチド（以下、 A |8という）に結合し、 A |8分子の凝集を阻 害するヒト抗 A β抗体および該抗体フラグメントに関する。当該抗体および抗体フラグ メントは、 Α |8分子の凝集体の生成とその細胞毒性が一因と考えられるアルッノヽイマ 一痴呆症の診断および治療薬として期待される。
背景技術
[0002] アルッノ、イマ一痴呆症の発症機構の全貌は未だ不明である力 A β分子の凝集体 による-ユーロン細胞への毒性が重要な役割を果たして 、ると考えられて 、る。 Α β 分子凝集体の生成の問題は、 A |8分子のコンホメーシヨンの問題でもある。
[0003] Α β分子は-ユーロンアミロイド前駆体タンパクから 13セクレターゼなどによる切断 で生じる分解物で、 Α β 1-40と Α β 1-42 (以下、 Α β 42と!、う）の 2種が生成する力 A β 42の方がより凝集性を有し、疾患および神経毒性と相関していることが報告されて いる。また脳内の Α |8プラークにはミクログリアゃァストロサイトが局在化し、このこと力 S 神経毒性とも相関して 、ることが示唆されて 、る。
[0004] A βの蓄積は、見方を変えれば、個体の加齢プロセスとも考えられ、クリアランスの ノ ランスが崩れて、その敷居値を越えた蓄積が発病に繋がるとの仮説が提唱されて いる。これらの仮説に基づき Α |8の産生そのものを抑制する目的で前駆体タンパクの 切断に関与する j8セクレターゼの低分子阻害剤などの開発が試みられている。しか し、 A |8の生成メカニズムは単純ではなぐ必ずしも十分な成績が得られているわけ ではない。
[0005] 一方、 B. Solomonら（非特許文献 1)の in vitroにおける抗 A β抗体 (Ν末端側の抗 体）による Α |8の凝集抑制効果の報告や、 Schenkらによる凝集前の Α |8 42をマウスに アジュバントと共に投与することにより、脳アミロイド沈着の減少を見いだした報告は 新たな免疫療法への道を開いた (非特許文献 2)。実際、 A j8を用いたアルッハイマ 一痴呆症のワクチン治療法が試みられ、脳アミロイド沈着の減少など一定の発症阻 止活性が明らかにされた (非特許文献 3および非特許文献 4)。しかし、ワクチン療法 では、効果が認められる一方、 T細胞の活性ィ匕による炎症反応の誘導による深刻な 副作用が出現し、未だ安全で有効な予防治療方法として確立できて 、な！、。
[0006] A βワクチン療法の効果は、局所で活性ィ匕したミクログリア細胞が Fc受容体を介し て、抗体沈着した A j8抗原複合体を取り込み、分解する作用と、可溶性の A j8と結合 して、局所での沈着を防ぐ効果が推定されている。
[0007] 一方、 McLaurinらは A β分子の末端 Α β 4-10に対する抗体の受動免疫力 発症 を阻止もしくは遅延を誘導する成果をマウスの実験で明らかにしている (非特許文献 5)。抗体を移入する受動免疫の場合、 Τ細胞の活性化による炎症反応の誘導の可 能性は少ないが、血清中に存在する抗 Α β抗体の 0.1%以下し力脳血管関門を通過 しないとされており、多量、頻回の投与が必要になると考えられている。
[0008] 非特許文献 1： Solomon, B.ら、 (1996) Pro. Natl. Acad. Sci., 93, 452-455
非特許文献 2 : Schenk, D.ら、 (1999) Nature, 400, 173
非特許文献 3 : Nicoll, J. A.ら、 (2003) Nature Medicine, 9, 448
非特許文献 4 : Monsonego, A.ら、 (2003) Science, 302, 834-838
非特許文献 5 : McLaurinら、 (2002) Nature Medicine, 8, 1263-1269
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0009] 副作用の危険性が少なぐ多量、頻回の投与に対応するためには、抗体自体の免 疫原性が低いことが重要となる。また更に、血液脳関門の通過には低分子化抗体が 有利であることが報告されており、 A 分子に特異的でかつ低分子化可能な完全ヒト 抗体が開発できれば、アルッノ、イマ一痴呆症の治療薬として極めて有効であると考 えられる。
[0010] さらに、 A β分子凝集体の生成の問題は、 Α β分子のコンホメーシヨンの問題でも ある。従って、構造変換を抑制する或いは制御するような分子、即ち Α |8特異的なシ ャペロン様分子が共存すれば、十分に Α 分子凝集体生成を制御できる可能性が 考えられる。シャペロン様活性を持つ抗体が報告されており、抗 A |8抗体にこのような 活性を併せ持つことも十分に期待できる。 [0011] さらにアルツハイマー痴呆症の診断では異常 A |8分子の生成や蓄積を早期に検出 するアミロイドイメージング法が注目され、プローブ技術の開発が必須である力 異常 Α 分子を高感度でかつ特異的に検出する脳内の画像ィ匕技術が開発されていない 。脳血管関門を通過でき脳内の異常 Α |8分子の沈着をきわめて早期に発見すること ができれば、すぐれた診断法となる。
課題を解決するための手段
[0012] 本発明では以上の知見にもとづき、ヒト抗体ファージディスプレイライブラリーを用い ることにより、 Α |8 42に特異的に結合するヒト抗体の単離を行い、 Α |8 42に特異的に 結合するヒトー本鎖可変領域 (scFv)を 6種類、また更に通常の scFvと異なり抗体の 軽 (L)鎖可変領域 (VL鎖または VL)のみで A βへの結合特異性を有する VL鎖の単 離に成功した。さらに、これらの scFvおよび VL鎖力 Α |8の凝集を阻害することを見 出し、本発明を完成させるに至った。
[0013] すなわち、本発明は、医学上または産業上有用な方法'物質として下記 1)〜32) の発明を含むものである。
[0014] 1)アミロイド βペプチド (Α β )に結合性を有するヒト抗 Α β抗体。
[0015] 2) Η鎖の相補性決定領域 (CDR)が以下の（a)または (b)のアミノ酸配列を有し、 L 鎖の相補性決定領域 (CDR)が以下の（c)または (d)のアミノ酸配列を有する、上記 1)に記載のヒト抗 A |8抗体：
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52、 62、 72、 82または 92の!ヽずれ 力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53、 63、 73、 83または 93の!ヽ ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 4、 14、 24、 34、 44、 54、 64、 74、 84ま たは 94のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(b) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24 、 32〜34、 42〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94、また はこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およ び Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖の相補性決定領域と なりうるもの；
(c) CDRlとして配列番号 7、 17、 27、 37、 47、 57、 67、 77、 87、 97または 102の ヽずれ力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58、 68、 78、 88、 98ま たは 103の! /、ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 9、 19、 29、 39、 49、 59、 6 9、 79、 89、 99または 104のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(d) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29 、 37〜39、 47〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 97〜99、または 102 〜104、またはこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失 、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖の相補 性決定領域となりうるもの。
[0016] 3) H鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜3 4、 42〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94の組み合わせ 力 選択されるアミノ酸配列であり、 L鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 7 〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89 、 97〜99、または 102〜104の組み合わせ力も選択されるアミノ酸配列である、上記 2)に記載のヒト抗 A |8抗体。
[0017] 4) H鎖の CDR1〜3と L鎖の CDR1〜3との組み合わせのアミノ酸配列力 配列番 号 2〜4と配列番号 7〜9、配列番号 12〜14と配列番号 17〜19、配列番号 22〜24 と配列番号 27〜29、配列番号 32〜34と配列番号 37〜39、配列番号 42〜44と配 列番号 47〜49、配列番号 52〜54と配列番号 57〜59、配列番号 62〜64と配列番 号 67〜69、配列番号 72〜74と配列番号 77〜79、配列番号 82〜84と配列番号 87 〜89、または配列番号 92〜94と配列番号 97〜99とのいずれか一つの組み合わせ である、上記 3)に記載のヒト抗 A β抗体。
[0018] 5) Η鎖可変領域が以下の（e)または (f)のアミノ酸配列を有し、 L鎖可変領域が以 下の（g)または（h)のアミノ酸配列を有する、上記 1)力も 4)の 、ずれかに記載のヒト 抗 Α |8抗体：
(e)酉己歹 IJ番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81また ίま 91の!ヽずれ力一つのアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(f)酉己列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81または 91に示されるアミノ酸酉己列 において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加され たアミノ酸配列であって、 A |8に対する Η鎖可変領域となりうるもの；
(g)酉己歹 IJ番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96また ίま 101の! /、ずれ力一つ のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(h)配列番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96または 101に示されるァミノ 酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付 カロされたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖可変領域となりうるもの。
[0019] 6) H鎖可変領域と L鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列力 配列番号 1と配 列番号 6、配列番号 11と配列番号 16、配列番号 21と配列番号 26、配列番号 31と配 列番号 36、配列番号 41と配列番号 46、配列番号 51と配列番号 56、配列番号 61と 配列番号 66、配列番号 71と配列番号 76、配列番号 81と配列番号 86、または配列 番号 91と配列番号 96との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、上記 1)か ら 5)の!、ずれかに記載のヒト抗 A β抗体。
[0020] 7)当該 A |8が繊維化した A |8である上記 1)力 6)のいずれかに記載のヒト抗 A |8 抗体。
[0021] 8)アミロイド βペプチド (Α β )に結合性を有するヒト抗 Α β抗体の Η鎖可変領域フ ラグメント。
[0022] 9)相補性決定領域 (CDR)が以下の（a)または (b)のアミノ酸配列を有する、上記 8 )に記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメント：
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52、 62、 72、 82または 92の!ヽずれ 力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53、 63、 73、 83または 93の!ヽ ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 4、 14、 24、 34、 44、 54、 64、 74、 84ま たは 94のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(b) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24 、 32〜34、 42〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94、また はこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およ び Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖の相補性決定領域と なりうるもの。
[0023] 10) CDR1〜3のアミノ酸配列が、配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34、 4 2〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94の組み合わせ力も選 択されるアミノ酸配列である、上記 9)に記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグ メント。
[0024] 11)以下の（e)または (f)のアミノ酸配列を有する、上記 8)力も 10)のいずれかに記 載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメント：
(e)酉己歹 IJ番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81また ίま 91の!ヽずれ力一つのアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(f)酉己列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81または 91に示されるアミノ酸酉己列 において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加され たアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖可変領域となりうるもの。
[0025] 12)当該 A |8が繊維化した A |8である上記 8)力 11)のいずれかに記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメント。
[0026] 13)アミロイド βペプチド (Α β )に結合性を有するヒト抗 Α β抗体の L鎖可変領域フ ラグメント。
[0027] 14)相補性決定領域 (CDR)が以下の（c)または (d)のアミノ酸配列を有する、上記 13)に記載のヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメント：
(c) CDRlとして配列番号 7、 17、 27、 37、 47、 57、 67、 77、 87、 97または 102の ヽずれ力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58、 68、 78、 88、 98ま たは 103の! /、ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 9、 19、 29、 39、 49、 59、 6 9、 79、 89、 99または 104のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(d) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29 、 37〜39、 47〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 97〜99、または 102 〜104、またはこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失 、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖の相補 性決定領域となりうるもの。
[0028] 15) CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 4 7〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 97〜99、または 102〜104の組み 合わせ力も選択されるアミノ酸配列である、上記 14)に記載のヒト抗 A |8抗体の L鎖 可変領域フラグメント。
[0029] 16)以下の（g)または (h)のアミノ酸配列を有する、上記 8)力も 10)のいずれかに 記載のヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメント：
(g)酉己歹 IJ番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96また ίま 101の! /、ずれ力一つ のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(h)配列番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96または 101に示されるァミノ 酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付 カロされたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖可変領域となりうるもの。
[0030] 17)当該 A |8が繊維化した A |8である上記 13)から 16)のいずれかに記載のヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメント。
[0031] 18)上記 8)力 12)の 、ずれかに記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメン トと、上記 13)から 17)のいずれかに記載のヒト抗 Α |8抗体の L鎖可変領域フラグメン トとを連結してなる、 A |8に対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。
[0032] 19)上記 8)力 12)のいずれかに記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメン ト、および Ζまたは上記 13)から 17)のいずれかに記載のヒト抗 Α |8抗体の L鎖可変 領域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、 A |8に対するヒト由来 の抗体またはその抗体フラグメント。
[0033] 20)当該抗体フラグメント力 Fab、 Fab'、 F(ab')、 scAb、または scFv-Fcである上記
2
19)に記載の抗体フラグメント。
[0034] 21)配列番号 101のアミノ酸配列を有するヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメン トとヒト由来の抗体定常領域を連結してなる A βに対するヒト由来の抗体またはそのフ ラグメント。
[0035] 22)上記 1)から 21)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或 いは他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。
[0036] 23)上記 1)から 22)のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメ ントに修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。
[0037] 24)上記 1)から 22)のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメ ントをコードする遺伝子。 [0038] 25)上記 24)に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
[0039] 26)上記 24)に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
[0040] 27)上記 24)に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗 A β抗体また はその断片を生産する方法。
[0041] 28)上記 24)に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
[0042] 29)上記 1)力も 21)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記 2 2)に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記 23)に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いた Α |8の検出試薬。
[0043] 30)上記 1)力も 21)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記 2 2)に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記 23)に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の診断薬。
[0044] 31)上記 1)力 21)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記 2 2)に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記 23)に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いた A β凝集阻害剤。
[0045] 32)上記 1)力も 21)のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または上記 2 2)に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または上記 23)に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の予防、治療剤。
[0046] これらの抗 Α β抗体および抗体フラグメントは scFvや VLと 、う小さな分子形態であ るにも関わらず、 in vitroで A |8の凝集を抑制する効果があることが確認された。この 抗体は分子量がきわめて小さいので脳血管関門を通過できるように抗体エンジニアリ ングすることができる。例えば、トランスフェリン受容体を介して脳血管関門を通過で きるようにするトランスフェリンとの融合体や二重特異性抗体などもこの範疇に入る。
[0047] また、 P糖蛋白に対する抗体や脳血管関門の薬剤輸送に関わる受容体と相互作用 し得るタンパク質や低分子との融合体とすることも可能である。また、さらに
McCaffertyら（J. McCaffertyら、 Nature, 348:552- 554, 1990)が報告したように、膜透 過性に優れ、抗原性の少な 、繊維状ファージの上にこれらの抗体フラグメントを提示 させ、脳内に移行させることも可能である。
[0048] さらに、これらの分子に Fc受容体との相互作用領域を付加し、脳内でのミクログリア との相互作用により、蓄積した A |8凝集体の除去に用いることも可能である。
[0049] 本発明による抗体は完全ヒト抗体であるので、診断の画像ィ匕を可能にするとともに、 A |8分子の凝集プロセスを阻害する治療法の開発ができる。従って、アルツハイマー 痴呆症の医療への本発明の貢献は多大である。
発明の効果
[0050] 本発明のヒトモノクローナル抗体および該抗体フラグメント分子は、ヒト由来抗 A |8 抗体の可変領域を有し、 A と強く反応して、その凝集の阻害作用を示す。このこと 力 本発明の抗体および該抗体フラグメントはアルッノヽイマ一痴呆症の予防または 治療薬として使用することができる。
図面の簡単な説明
[0051] [図 1]分離クローンの scFvの A β 42ペプチドへの特異性を評価した ELISAの結果を 示す図。
[0052] [図 2]分離クローンの scFvの可溶性及び繊維化された A β 42ペプチドへの特異性を 評価した ELISAの結果を示す図。
[0053] [図 3]発現 scFv-His6および VL-Dl-D2-Hisの発現を抗 His6抗体を用いてウェスタン プロットで確認した図。
[0054] [図 4]VL-Dl-D2-Hisの A β 42ペプチドへの特異性を評価した ELISAの結果を示す 図。
[0055] [図 5]精製 scFvの A β 42ペプチド繊維化抑制活性を蛍光チオフラビン試験で評価し た結果を示す図。
[0056] [図 6]精製 scFv (FvlE4)の Α β 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
[0057] [図 7]精製 scFv(B7)の A β 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
[0058] [図 8]繊維化した Α β 42ペプチドに対する scFv提示ファージの結合性を示す図。
[0059] [図 9]繊維化した A β 42ペプチドに対する scFvの結合性を示す図。
[0060] [図 10]精製 scFvの A β 42ペプチド繊維化抑制活性を蛍光チオフラビン試験で評価 した結果を示す図。
[0061] [図 11]精製 scFvの Α 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示す図。
[0062] [図 12]Α β 42ペプチドに対する精製 tatペプチド融合 VL鎖の結合性を示す図。 [0063] [図 13]精製 tatペプチド融合 VL鎖の A β 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性を示 す図。
発明を実施するための最良の形態
[0064] 本発明の抗体および抗体フラグメントに使用される scFv等は以下のようにして得ら れた。
[0065] 健常者 20名分の末梢血 Bリンパ球より、 RT— PCR法にて、免疫グロブリン重 (H) 鎖、軽 (L)鎖 cDNAを増幅、更に両者を linker DNAで結合し、健常者リンパ球由来 の H鎖可変領域 (VH鎖または VH)と VL鎖のランダムな組み合わせによる scFv DN Aを作製した。
[0066] この scFv DNAをファージミドベクター pCANTAB5Eに組込み、 109クローンからなる 健常者由来 scFvディスプレイファージライブラリーを作製した。このライブラリーを、固 相に固定ィ匕された A |8と結合させて回収、濃縮し、抗 A |8 scFvディスプレイファージ クローンをスクリーニングした。その結果、スクリーニングされた各クローンは、 A |8と 結合する scFv抗体もしくは VLフラグメントを産生した。
[0067] scFvや VLフラグメントの発現方法としては、例えば、大腸菌で発現させることがで きる。大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配 列等、発現させる scFvを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモ 一ターとしては、 lacZプロモーター、 araBプロモーター等を挙げることができる。 scFv の分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに発現させる場合、 pelBシグナル配列（Lei, SP.ら、 J. BacterioL, 1987, 169： 4379- 4383)を用いるとよい 。培養上清中に分泌させるには M13ファージの g3蛋白のシグナル配列を用いること ちでさる。
[0068] また VLフラグメントの場合は、同様に単独で或いは他のペプチドやタンパク質との 融合蛋白の形で発現させることができる。
[0069] 前記のように発現された scFvは細胞内外、宿主力 分離し均一にまで精製すること ができる。本発明で発現される scFvは、その C末端に E tag配列が付加されているの で、抗 E tag抗体を用いたァフィユティークロマトグラフィーを用いて、容易に短時間で 精製することができる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法 を組み合わせて精製することも可能である。例えば、限外濾過、塩析、ゲル濾過,ィ オン交換 Z疎水クロマト等のカラムクロマトグラフィーを組み合わせれば抗体を分離' 精製することができる。
[0070] 本発明により得られた scFv蛋白や VL鎖は、 Α |8に対する結合活性を有することが 明らかになった。本発明で使用される抗 Α β抗体の抗原結合活性を測定する方法と して、 ELISA、 BIAcore等の方法がある。例えば ELISAを用いる場合、 A j8を固相化 した 96穴プレート〖こ目的の抗 A |8抗体や抗体フラグメントを含む試料、例えば大腸 菌の培養上清や精製抗体を加える。次にパーォキシダーゼ等の酵素で標識した二 次抗体を添加し、プレートをインキュベーション、洗浄した後、発色基質 TMBZを加 えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
[0071] このようにして得られた scFvや VLフラグメントを用いて、 A j8の凝集抑制が可能か 評価した結果、 A の凝集体の形成を十分に抑制することが可能であることが明らか になった。
[0072] これは、本発明の抗 A β抗体フラグメントが、正常型 Α βに結合し、凝集型への構 造変換を抑制したためと考えられる。このような効果は生体内で、これらの抗体およ び抗体フラグメントが、凝集型に構造変換することを十分に抑制可能であることを示し ている。従って、これらの低分子化抗体は Α の構造変換を抑制する予防薬として、 さらには症状の進展を抑制する薬剤としても十分に効果が期待できる。更に、本発明 の抗 A β抗体フラグメントは正常型 Α βよりも、凝集型に強く反応する性質を有する 配列を含んでいることが明らかになった。脳内に沈着したアミロイドは大部分が凝集 型、あるいはそれらが繊維化したものと考えられており、先駆的なワクチン療法の試 みで認められた患者脳内の脳アミロイド沈着の減少は、局所で活性ィ匕したミクロダリ ァ細胞が Fc受容体を介して抗体 沈着した Α β抗原複合体を取り込み、分解する 作用の結果と推定されている。従って、本発明の抗 Α |8抗体フラグメント (FvlEl、 F vlE4、 FvlE7、 Fv2A7、 Fv2A8、 Fv2B6、 B7、 B6、 F10、 Dl、および VLA2)お よびこれらの抗体可変領域に Fc領域を結合させた抗体分子や融合蛋白は、
(1)正常型 A βのみに結合し、凝集型への構造変換を抑制するもの (VLA2)；
(2)凝集型および繊維化した Α のみに結合し、凝集型 A の除去、繊維化した A βの増加抑制、さらには正常型 Α の凝集型への変換抑制に効果を発揮するもの（ B6、 F10、 Dl)；または
(3) (1)及び（2)の両特性を有するもの（FvlEl、 FvlE4、 FvlE7、 Fv2A7、 Fv2A 8、 Fv2B6、 B7)
であり、 、ずれもアルッノ、イマ一型治療薬として有望である。
[0073] 上記阻害活性を有する 10種類の scFv(FvlEl、 FvlE4、 FvlE7、 Fv2A7、 Fv2 A8、 Fv2B6、 B7、 B6、 F10、 Dl)の VH鎖および VL鎖、並びに VL鎖（VLA2)の アミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列は、下記の通りである。
[0074] (1)クローン FvlEl
クローン FvlElの VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 1に示した。当該 VH鎖の CDR 1〜3のアミノ酸配列を配列番号 2〜4に示した。すなわち、配列番号 1に示す VH鎖 のアミノ酸配列において、 30番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 2)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 3)、 99番目〜107番目のアミ ノ酸配列が CDR3 (配列番号 4)に対応している。また、当該 VH鎖をコードする遺伝 子の塩基配列を配列番号 5に示した。
[0075] また、クローン FvlElの VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 6に示した。当該 VL鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 7〜9に示した。すなわち、配列番号 6に示す V L鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 7 )、 51番目〜57番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 8)、 90番目〜100番目のァ ミノ酸配列が CDR3 (配列番号 9)に対応している。また、当該 VL鎖をコードする遺伝 子の塩基配列を配列番号 10に示した。
[0076] (2)クローン FvlE4
クローン FvlE4の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 11に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 12〜14に示した。すなわち、配列番号 11に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 30番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 12)、 50番目〜 66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 13)、 99番目〜 112番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 14)に対応している。また、当該 VH鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 15に示した。 [0077] また、クローン FvlE4の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 16に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 17〜19に示した。すなわち、配列番号 16に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜36番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 17)、 52番目〜58番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 18)、 91番目〜1 00番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 19)に対応している。また、当該 VL鎖を コードする遺伝子の塩基配列を配列番号 20に示した。
[0078] (3)クローン FvlE7
クローン FvlE7の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 21に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 22〜24に示した。すなわち、配列番号 21に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 30番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 22)、 50番目〜 66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 23)、 99番目〜 111番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 24)に対応している。また、当該 VH鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 25に示した。
[0079] また、クローン FvlE7の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 26に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 27〜29に示した。すなわち、配列番号 26に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜33番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 27)、 49番目〜55番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 28)、 88番目〜9 9番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 29)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 30に示した。
[0080] (4)クローン Fv2A7
クローン Fv2A7の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 31に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 32〜34に示した。すなわち、配列番号 31に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 30番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 32)、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 33)、 99番目〜 112番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 34)に対応している。また、当該 VH鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 35に示した。
[0081] また、クローン Fv2A7の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 36に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 37〜39に示した。すなわち、配列番号 36に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 24番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 37)、 51番目〜57番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 38)、 90番目〜9 8番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 39)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 40に示した。
[0082] (5)クローン Fv2A8
クローン Fv2A8の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 41に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 42〜44に示した。すなわち、配列番号 41に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 30番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 42)、 50番目〜68番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 43)、 101番目〜112 番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 44)に対応している。また、当該 VH鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 45に示した。
[0083] また、クローン Fv2A8の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 46に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 47〜49に示した。すなわち、配列番号 46に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 20番目〜32番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 47)、 48番目〜54番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 48)、 87番目〜9 7番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 49)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 50に示した。
[0084] (6)クローン Fv2B6
クローン Fv2B6の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 51に示した。当該 VH鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 52〜54に示した。すなわち、配列番号 51に示す VH鎖のアミノ酸配列において、 30番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 52)、 49番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 53)、 98番目〜110番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 54)に対応している。また、当該 VH鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 55に示した。
[0085] また、クローン Fv2B6の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 56に示した。当該 VL鎖 の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 57〜59に示した。すなわち、配列番号 56に 示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜36番目のアミノ酸配列が CDR1 (配 列番号 57)、 52番目〜58番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 58)、 91番目〜 9 9番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 59)に対応している。また、当該 VL鎖をコ ードする遺伝子の塩基配列を配列番号 60に示した。
[0086] (7)クローン B7
クローン B7の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 61に示した。当該 VH鎖の CDR1 〜3のアミノ酸配列を配列番号 62〜64に示した。すなわち、配列番号 61に示す VH 鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 62 )、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 63)、 99番目〜 112番目の アミノ酸配列が CDR3 (配列番号 64)に対応している。また、当該 VH鎖をコードする 遺伝子の塩基配列を配列番号 65に示した。
[0087] また、クローン B7の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 66に示した。当該 VL鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 67〜69に示した。すなわち、配列番号 66に示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜33番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 67)、 49番目〜55番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 68)、 88番目〜98番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 69)に対応している。また、当該 VL鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 70に示した。
[0088] (8)クローン B6
クローン B6の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 71に示した。当該 VH鎖の CDR1 〜3のアミノ酸配列を配列番号 72〜74に示した。すなわち、配列番号 71に示す VH 鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 72 )、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 73)、 99番目〜 112番目の アミノ酸配列が CDR3 (配列番号 74)に対応している。また、当該 VH鎖をコードする 遺伝子の塩基配列を配列番号 75に示した。
[0089] また、クローン B6の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 76に示した。当該 VL鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 77〜79に示した。すなわち、配列番号 76に示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜33番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 77)、 49番目〜55番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 78)、 88番目〜98番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 79)に対応している。また、当該 VL鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 80に示した。 [0090] (9)クローン F10
クローン F10の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 81に示した。当該 VH鎖の CDR1 〜3のアミノ酸配列を配列番号 82〜84に示した。すなわち、配列番号 81に示す VH 鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 82 )、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 83)、 99番目〜114番目の アミノ酸配列が CDR3 (配列番号 84)に対応している。また、当該 VH鎖をコードする 遺伝子の塩基配列を配列番号 85に示した。
[0091] また、クローン F10の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 86に示した。当該 VL鎖の C DR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 87〜89に示した。すなわち、配列番号 86に示 す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜33番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列 番号 87)、 49番目〜55番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 88)、 88番目〜98 番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 89)に対応している。また、当該 VL鎖をコー ドする遺伝子の塩基配列を配列番号 90に示した。
[0092] (10)クローン D1
クローン D1の VH鎖のアミノ酸配列を配列番号 91に示した。当該 VH鎖の CDR1 〜3のアミノ酸配列を配列番号 92〜94に示した。すなわち、配列番号 91に示す VH 鎖のアミノ酸配列において、 31番目〜35番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番号 92 )、 50番目〜66番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 93)、 99番目〜106番目の アミノ酸配列が CDR3 (配列番号 94)に対応している。また、当該 VH鎖をコードする 遺伝子の塩基配列を配列番号 95に示した。
[0093] また、クローン D1の VL鎖のアミノ酸配列を配列番号 96に示した。当該 VL鎖の CD Rl〜3のアミノ酸配列を配列番号 97〜99に示した。すなわち、配列番号 96に示す VL鎖のアミノ酸配列において、 23番目〜33番目のアミノ酸配列が CDR1 (配列番 号 97)、 49番目〜55番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 98)、 88番目〜98番 目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 99)に対応している。また、当該 VL鎖をコード する遺伝子の塩基配列を配列番号 100に示した。
[0094] (11)クローン VLA2
VL鎖のみからなるクローン VLA2のアミノ酸配列を配列番号 101に示した。当該 V L鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列を配列番号 102〜104に示した。すなわち、配列番 号 101に示す VL鎖のアミノ酸配列において、 24番目〜40番目のアミノ酸配列が C DR1 (配列番号 102)、 56番目〜62番目のアミノ酸配列が CDR2 (配列番号 103)、 95番目〜103番目のアミノ酸配列が CDR3 (配列番号 104)に対応している。また、 当該 VL鎖をコードする遺伝子の塩基配列を配列番号 105に示した。
[0095] 本発明により得られたクローン毎にアミノ酸配列および塩基配列にっ 、て上述した 力 配列表に記載された各アミノ酸配列情報 (VH鎖、 VL鎖、各 CDR1〜3)をもとに 、単独または複数の配列を適宜組み合わせて使用することも可能である。
[0096] 本発明の抗体およびその抗体フラグメントは、上記 VH鎖および VL鎖、並びにそれ らの CDRとして、上記配列番号に示される配列に限定されるものではなぐそれらの 一部が改変された変異ポリペプチドであってもよい。
[0097] すなわち、各配列番号に記載されたアミノ酸配列において、 1またはそれ以上のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列からなり、かつアミ ロイド j8ペプチドに対する H鎖または L鎖の相補性決定領域、 H鎖または L鎖の可変 領域となるポリペプチドも含まれる。
[0098] ここで、「1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加され た」とは、部位特異的突然変異誘発法等の公知の変異タンパク質作製法により置換 、欠失、挿入、および Zまたは付加できる程度の数、例えば、 1ないし 6程度の数のァ ミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加されることを意味する。このような「変 異」としては、主として、公知の変異タンパク質作製法により人為的に導入された変異 を意味するが、天然 (例えば、ヒト）に存在する同様の変異ポリペプチドを単離精製し たものであってもよい。
[0099] なお、上記「変異」は、本発明の抗体またはその抗体フラグメントを、治療薬として利 用する場合 (ヒトに投与する場合）には、ヒト由来の構造を保持またはヒトが免疫反応 を起こさない範囲で行い、検出器具や診断キットなどとして使用する場合 (ヒトに投与 しない場合）には、その範囲は特に制限されない。
[0100] 本発明で開示される VH鎖および Zまたは VL鎖は、ファージ抗体法を用いて主と して scFvの形で得られたものである力 原則としてその適用は scFvに限定されること はない。例えば、開示した VH鎖および Zまたは VL鎖をヒト免疫グロブリンの定常領 域と連結した完全分子型、またヒト免疫グロブリンの定常領域の一部と組み合わせた Fab、 Fab'または F(ab')、さらに scFvをヒト免疫グロブリンの H鎖または L鎖の定常領
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域の一部のドメインと結合させた一本鎖抗体（scAb)や、 scFvをヒト免疫グロブリンの H鎖および L鎖の全定常領域と結合させた scFvFcなどの他の抗体フラグメントもそ の適用範囲に含まれる。
[0101] また、本発明の抗体またはそのフラグメントは、当該抗体またはフラグメントにぺプ チド或いは他のタンパク質と融合させた融合抗体またはそのフラグメントとすることも できる。
[0102] また、これらの抗体および抗体フラグメントあるいは上記融合抗体またはそのフラグ メントに、ポリエチレングリコールなどの高分子修飾剤を結合させた修飾抗体またはそ のフラグメントとすることもできる。
[0103] H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させた scFvを調製する場合、ペプチドリン カーとしては、例えばアミノ酸 10〜25残基力もなる任意の一本鎖ペプチドが用いら れる。
[0104] 上記の抗体またはそのフラグメント、上記の融合抗体もしくはそのフラグメント、また は上記の修飾抗体もしくはそのフラグメントは、 A |8の検出試薬、 A |8凝集阻害剤、 A βが関与するアルツハイマー痴呆症の予防、治療剤、または診断薬として利用でき る。
[0105] 本発明の抗体また ίま抗体フラグメント ίま、酉己歹 U番号 5、 10、 15、 20、 25、 30、 35、 4 0、 45、 50、 55、 60、 65、 70、 75、 80、 85、 90、 95、 100、または 105に示した本 発明により得られた各クローンの VH鎖および VL鎖をコードする遺伝子配列情報を もとに、適当な宿主 (例えば、細菌、酵母）に導入して、本発明の抗体またはそのフラ グメントを発現させることができる。
[0106] また本発明の遺伝子は、 Α βが関与するアルッノ、イマ一痴呆症の遺伝子治療薬と しても利用できる。
[0107] 以下、本発明を実施例に基づき詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定さ れるものではない。 実施例
[0108] 《実施例 1：健常者からのファージライブラリーの構築》
ファージライブラリーの構築は、 J. D. Marksら（J. Mol. Biol, 222: 581-597, 1991) により報告されている方法を参考に、健常者 20名由来末梢血由来リンパ球を出発材 料に、構築した。構築した VH( γ )— V κ、 VH( γ )— Vえ、 VH( ）— V κ、 VH ( ） V の各サブライブラリ一はそれぞれ 1.1X108、 2.1X108、 8.4X107、 5.3X107クロー ンの多様性を有すると評価された。
[0109] 《実施例 2:パンニング》
125 μ g/mlの DSS 100 μ Lで活性化した Cova- link plate (Nunc)に 0.1M炭酸バッファ 一 pH9.6に溶解した 1 μ§Αβ 42ペプチドを加え、 4°Cでー晚静置した。
[0110] 0.1%Tween20を含む PBSで 1回洗浄後、 1回目の選択用には 0.5%のゼラチンで 2 回目の選択用には 0.25%の BSAでプレートをブロック処理した。
[0111] これに健常人由来の抗体ファージライブラリー（一本鎖抗体提示ファージ液)を VH( γ)—νκと VH(y)—V の混合物、 νΗ(/ζ)—νκと VH(/z)—V の混合物の 2種 の場合に分けて、 100 μL(5X 10ntu/mL)ずつ加え、室温で 1時間反応させた。
[0112] 0.1%Tween20- PBSで 10回洗浄した後、 100 μ Lのグリシン緩衝液（ρΗ2.2)を加え、 IL-18と結合する一本鎖抗体提示ファージを溶出させた。溶出したファージは 1M Tris (hydroxymethyl)aminomethane-HCl, pH9.1をカ卩えて pHを調整した後、対数増殖 期の大腸菌 TG1に感染させた。感染後の TG1は 3000 Xg, 10分で遠心分離して、上 清を除き、 200 Lの 2 XYT培地で懸濁し、 SOBAGプレート（2%グルコース、 100 g/mlのアンピシリン含有 SOBプレート）に播き、 30°Cのふ卵器中でー晚培養した。生 じたコロニーは適量の 2 XYT培地を力卩ぇスクレイパー（Costar)を使って懸濁、回収し た。
[0113] この TG1液 50 μ Lを、 30mLの 2Χ YTAG培地に植え、ヘルパーファージを用いて レスキューし、スクリーニング後のファージライブラリーを調製した。健常人由来ファー ジライブラリー VH(y)— V Kと VH(y)— V 由来、 VH ( ） V κと VH ( ） V 由 来、それぞれについて前述の A j842ペプチド固定化プレートを用いてパンニングを 計 2回行った。 2回目のパンユング後に、 SOBAGプレートから任意にクローンを抽出 し、 scFvの発現の確認および A j8 42ペプチド ELISAによる特異性の確認と塩基配 列の解析を行った。
[0114] 《実施例 3：スクリーニング A β 42ペプチド ELISA》
分離したクローンのスクリーニングのための ELISAは以下のように行った。 Α β 42 ペプチドを ELISAプレートに固定化してスクリーニングに用いた。 1.25 μ g/mLの A j8 42ペプチド、 2.5 μ g/mLのヒト血清アルブミン（HSA)を 40 μ L/well ELISAプレート（ Nunc)に入れ、 4°Cで 16時間静置し、固定化した。固定化プレートは、 0.5%BSA、 0.5%ゼラチンおよび 5%スキムミルクを含む PBS溶液 400 μ L/wellを ELIS Αプレート に入れ、 4°Cで 2時間静置し、ブロッキングを行った。
[0115] scFv提示ファージを含む試料液を 40 μ L/well入れて反応させた後、試料液を捨て 洗浄液で 5回洗った。ピオチン標識した抗 Ml 3モノクローナル抗体（Pharmacia biotech)と反応させ、アルカリフォスファターゼ (AP)標識した抗マウス IgG抗体と反応 させた。洗浄液で 5回洗った後、発色基質液（lg/mL p-nitrophenyl phosphate (Wako )、 10%ジエタノールァミン (Wako)を含む PBS溶液）を 50 μ L/well入れ、遮光し、室 温〜 37°Cで、 5〜： L0分発色させた。マノレチプレートオートリーダー NJ- 2001 (Inter Med)で 405nmの吸光度を測定した結果、評価したクローン全て力 A 42ペプチド に特異的であることが確認できた。
[0116] 《実施例 4 :クローンの配列分析》
単離したクローンの scFv遺伝子の VHおよび VLの DNA塩基配列を Dye terminator cycle sequencing Fb Ready Reaction kit (.Applied Biosystems)を用い飞決 定した。 ELISAおよび配列分析の結果、単離したクローンは 6種の scFvと 1種の VL に分類された。
[0117] 《実施例 5 :ヒト由来抗 A |8 42ペプチド scFvの発現と精製》
前記実施例 2、 3で単離した A |8 42ペプチドに反応する scFvクローンからプラスミド DNAを回収して、常法に従って大腸菌 HB1251を形質転換した。 2%グルコースおよ び 100 μ g/mLのアンピシリンを含む 2 Χ ΥΤ培地でこれらの大腸菌を一夜前培養後、 グルコースフリーの 2 X YT培地に一部移植し、終濃度 ImM IPTG、 100 g/mLのァ ンピシリンを加えて更に一夜培養して scFvの発現誘導を行った。培養終了後菌体を 遠心回収し、 ImM EDTAを含む PBSに懸濁して氷中に 30分菌体を放置した。次い で 8,900 X gで 30分間遠心し、上清を回収して 0.45 mフィルター濾過後、ペリプラズ ム画分力 の scFvの精製出発材料とした。
[0118] このようにして調製した精製の出発材料を、抗 E tag抗体を用いたァフィユティークロ マトグラフィ一で常法に従って精製した。 PBSで透析後、エンドトキシン除去カラム Detoxi-gel (PIERCE社）で添付のプロトコルに従!、エンドトキシンを除去した。分子量 カット 10,000の Centricon (Amicon社）で濃縮後、 0.45 μ mフィルター濾過して精製標 ロロとレ /こ。
[0119] 《実施例 6：精製 scFvの A β 42ペプチドとの結合性》
次に精製 scFvの A j8 42ペプチドとの結合性を ELISA法で測定した。 PBSで 1.25 μ g/mLに調整した Α β 42ペプチドを固相化した 96穴プレート (NUNC. MAXISORP) に、精製抗体を 100 /z Lカ卩えて 37°Cで 1時間反応させた。 0.05%Tween-PBS (以下 PBSTと省略することもある）で 5回洗浄後、抗 E tag抗体と 37°C1時間反応させた。さ らに、 PBSTで 5回洗浄後、アルカリフォスファターゼ (AP)標識した抗マウス IgG抗体 と 37°C1時間反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、発色基質液をカ卩えて呈色させ、 405nmの吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図 1に示す。十分な発現を示 し、評価できた 5種の scFvは全て A |8 42ペプチドと特異的に結合した。また、データ には示していないが、その他の scFvとして B7も A j8 42ペプチドと特異的に結合した。
[0120] 《実施例 7 :精製 scFvの特異性解析》
scFvの繊維化した A j8 42ペプチドとの結合性を ELISA法で測定した。 PBSで 1.25 μ g/mLに調製した繊維化した Α β 42ペプチド、可溶性 Α β 42ペプチド、 5 μ g/mLマ ウス IgG及び 0.5%ゼラチンのみを固相化した 96穴プレート（NUNC. MAXISORP)に、 大腸菌ペリブラズム画分力も精製した scFvを 100 μ Lカ卩えて 37°Cで 1時間反応させた 。 0.05%Tween- PBS (以下 PBSTと省略することもある）で 5回洗浄後、ピオチン化抗 E tag抗体と 37°C1時間反応させた。さらに、 PBSTで 5回洗浄後、アルカリフォスファタ ーゼ (AP)標識したストレプトアビジンと 37°C30分反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、 発色基質液を加えて呈色させ、 405應の吸光度を測定して結合性を評価した。結果 を図 2に示す。評価した 6種の scFvは全て可溶性の A |8 42ペプチドと同様に繊維化 した A β 42ペプチドとも強く結合することが明らかになった。
[0121] 《実施例 8 :ヒト由来 ¾A j8 42ペプチド VL鎖の発現と精製》
前記実施例 2および 3で単離した A |8 42ペプチドに反応するクローンの内、 1クロー ン¾111鎖の一部と VL鎖のみから構成されて!、た。このクローンの DNAのうち VK鎖 の部分のみを PCR法でリクローニングして、 5'末端に制限酵素 Sfilの認識サイトを、さ らに 3'末端に制限酵素 Notlの認識サイトを付加した。両制限酵素で切断、ァガロー スゲル電気泳動で精製後、このクローンの VL鎖を pTrc99A-Dl+D2-His (繊維状ファ ージの g3タンパクの D1および D2ドメインの末端に Hisがついたタンパク質と融合タ
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ンパク質の形で発現できるようにした発現ベクター）に組み込み、大腸菌 JM83を形質 転換した。この形質転換体を実施例 5と同様に培養し、大腸菌ペリブラズム画分より VL-Dl-D2-Hisタンパク質を回収した。ウェスタンブロットで解析した結果、設計通り
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の 47Kdaのバンドを示す融合タンパクの発現が確認できた（図 3)
[0122] 《実施例 9 VL鎖の A β 42ペプチドとの結合性》
実施例 8で回収した VL鎖 40 μ 1/ゥエルを ELISAプレートに添カ卩し、室温で 6時間 静置した。 0.1%Tween20を含む PBSで 1回洗浄後、 0.25%の BSAでプレートをブロ ック処理した。処理後のプレートに lOOng/ゥエルの A j8 42ペプチド、 MCP-1 IL-5、ヒ トプリオン或いはゥシプリオン（PrPcl02- 241 InPro BioTech)を加え、 37°Cで 1時間反 応させた。 PBSTで 5回洗浄後、それぞれの抗原に対応した二次抗体 (抗 A |8 42モノ クローナル抗体、抗 MCP-1モノクローナル抗体、抗 IL-5モノクローナル抗体、抗プリ オンモノクローナル抗体）をさらに反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、アルカリフォスフ ァターゼ標識抗マウス抗体と更に 37°C1時間反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、発色 基質液を加えて呈色させ、 405 の吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図 4 に示す。評価した VLは A |8 42ペプチドと特異的に結合した。
[0123] 《実施例 10：精製 scFvの A β 42ペプチド凝集阻害能の評価》
実施例 5で調製した精製 scFvを用いて、 A β 42ペプチドの凝集阻害能の評価を行 つた。凝集阻害能の評価はアミロイド繊維形成の進展を蛍光チオフラビン試験で行つ た。サンプル 220ηΜを 10 μ Μのチオフラビンを含有する 0.1Mリン酸カリウムバッファー ρΗ6.5で 4ηΜに希釈し、室温で 2分間攪拌した。このときに l%wt/wtの種の凝集体（ 予め巨大分子生成を抑制するため、超音波処理したもの）を同時に添加した。チオフ ラビン色素の励起光 450nmでの蛍光 482nmを測定し（日立、 F-3000)、凝集の生成を 評価した。その結果、評価した 4クローン全てで凝集抑制活性が確認できた（図 5)
[0124] 《実施例 11：精製 scFvの A β 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性評価》
実施例 5で調製した精製 scFvを用いて、 A β 42ペプチドの凝集阻害能の濃度依存 性の評価を行った。凝集阻害能の評価は実施例 10と同様にアミロイド繊維形成の進 展を蛍光チオフラビン試験で行った。 20 μ Μの Α β 42にコントロール scFvおよび精製 scFv (FvlE4および Β7、 Ο〜40 μ g/ml)を加えて、 24時間 37°Cで静置した。 Α β 42 の濃度が 2 /ζ Μになるように調整後、 10 /ζ Μになるようにチオフラビン Τをカ卩え、室温 で 2分間攪拌した。チオフラビン色素の励起光 450nmでの蛍光 482nmを測定し（日立 、 F-3000)、凝集の生成を評価した。その結果、評価した 2クローンは scFv濃度依存 的に凝集抑制活性を有することが確認できた（図 6および図 7)。
[0125] 《実施例 12：繊維化した A β 42ペプチドに対する scFv提示ファージの結合性》
繊維化した A β 42ペプチドに対する scFv提示ファージの結合性を ELISA法で測 定した。 PBSで 50ng/mLに調整した繊維化した A β 42ペプチド、可溶性 Α β 42ぺプ チド、 1000倍希釈した Α β血清を 40 μ L/wellずつ ELISAプレート（Nunc)に入れ、 4 °Cで 6時間静置し、固定ィ匕した。固定化プレートは、 0.25%BSAを含む PBS溶液を 400 μ L/wellずつ ELISAプレートに入れ、 4°Cでー晚静置し、ブロッキングを行った。
[0126] scFv提示ファージを含む試料液 40 μ L/wellを入れて反応させた後、試料液を捨て 洗浄液で 5回洗った。ピオチン標識した抗 Ml 3モノクローナル抗体（Pharmacia biotech)と反応させ、アルカリフォスファターゼ (AP)標識した抗マウス IgG抗体と反応 させた。洗浄液で 5回洗った後、発色基質液（lg/mL p-nitrophenyl phosphate (Wako )、 10%ジエタノールァミン (Wako)を含む PBS溶液）を 50 μ L/well入れ、遮光し、マ ノレチプレートオートリーダー NJ-2001 (Inter Med)で 405nmの吸光度を測定した。その 結果、評価したクローン全て力 繊維化した A |8 42ペプチドに特異的であることが確 認できた（図 8)。
[0127] 《実施例 13：繊維化した A β 42ペプチドに対する scFvの結合性》
繊維化した Α |8 42ペプチドに対する scFvの結合性を ELISA法で測定した。実施 例 5と同様に精製した scFvを 3 g/mL含む試料液を 40 L/wellずつ、実施例 12と 同様に調製したプレートに入れて反応させた後、試料液を捨て洗浄液で 5回洗った。 anti-Etag mAb (1 : 1000)と反応させ、アルカリフォスファターゼを結合させた goat mouse IgG (1 : 1000)と反応させた。発色基質液以降は実施例 12と同様に測定した。 その結果、評価した B6と F10は、繊維化した A |8 42ペプチドに特異的であることが確 認できた（図 9)。
[0128] 《実施例 14：精製 scFvの A β 42ペプチド凝集阻害能の評価》
実施例 13で調製した精製 scFvを用いて、 Α β 42ペプチドの凝集阻害能の評価を 行った。凝集阻害能の評価はアミロイド繊維形成の進展を蛍光チオフラビン試験で 行った。サンプル 20 Μに終濃度 40 g/mlになるように scFvを加えて放置した。各 時間ごとにサンプルを回収し、 A |8の濃度を 2 Mに調整後、 10 Mになるようにチ オフラビン Tを加え、室温で 2分間静置した。チオフラビン色素の励起光 450nmでの 蛍光 482應を測定し（日立、 F-3000)、凝集の生成を継時的に評価した。その結果、 評価した 3クローン全てで凝集抑制活性が確認できた（図 10)
[0129] 《実施例 15：精製 scFvの A β 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性評価》
実施例 13で調製した精製 scFvを用いて、 A j8 42ペプチドの凝集阻害能の濃度依 存性の評価を行った。凝集阻害能の評価は実施例 14と同様にアミロイド繊維形成の 進展を蛍光チオフラビン試験で行った。 20 μ Μの Α β 42にコントロール scFvおよび 精製 scFv (終濃度 Ο〜40 μ g/ml)を加えて、 24時間 37°Cで静置した。 A β 42の濃度 力 S 2 Μになるように調整後、 10 Μになるようにチオフラビン Τをカ卩え、室温で 2分間 攪拌した。チオフラビン色素の励起光 450nmでの蛍光 482nmを測定し（日立、 F-3000 )、凝集の生成を評価した。その結果、評価した 3クローンは scFv濃度依存的に凝集 抑制活性を有することが確認できた（図 11)。
[0130] 《実施例 16： tatペプチド融合ヒト由来抗 A β 42ペプチド VL鎖の発現調製》
実施例 8で構築した A β 42ペプチド特異的 VL鎖遺伝子の 5 '末端に HIV tatぺプチ ド配列（Met Gly Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gin Arg Arg Arg Gly) (配列番号 106 )を PCRを用いて付カ卩し、制限酵素サイト Ndel, Notlを用いて pET-29bベクター（ Novagen社）に組み込んだ。大腸菌 BL21 (DE3) starに形質転換後、 IPTG誘導により 、 tat-VL鎖を inclusion bodyとして発現させた。菌体を回収後、超音波破砕し、遠心 分離後、上清を除去し、不溶性画分を 6M塩酸グァニジンを用いて可溶ィ匕した。可溶 化画分を、 6M塩酸グァ-ジン存在下、 Ni-NTAカラムにアプライし、洗浄後、カラムに 結合した蛋白質をイミダゾールを用いて溶出し、 tat-VL鎖精製画分とした。 tat-VL鎖 精製画分は段階透析法によるリフォールデイングを以下の様に行った。 50mM Tris- HCKpH 8.0), 10mM β -ME, ImM EDTA, 200mM NaCl, 6M GdnHCl溶液で 7.5 uM tat-VL鎖溶液になるように調整、 j8 -MEを除いた前記の溶液で 2時間透析した。 更に、 6M GdnHClで 3時間、 3M GdnHClで 6時間、 2M GdnHClで 12時間、 1M GdnHCl/375uM GSSG/200mM L— Arginineで 12時間、 0.5M GdnHCl/375uM
GSSG/200mM L-Arginineで 12時間、 PBSで 12時間透析を行い、最終的なリフォール デイングした tat-VL鎖を調製した。
[0131] 《実施例 17： tatペプチド融合 VL鎖の A β 42ペプチド結合能評価》
実施例 16で回収した tatペプチド融合 VL鎖 40 μ 1/ゥエルを ELISAプレートに添カロ し、 4°Cで 12時間静置した。 0.1%tweenを含む PBSで 1回洗浄後、 0.5%ゼラチンでプ レートをブロック処理した。処理後のプレートに lOOng/ゥエルの A j8 42ペプチド、 MCP- 1、マウス IgG或いはャギ IgGをカ卩え、 37°Cで 1時間反応させた。 PBSTで 5回洗 浄後、それぞれの抗原に対応した二次抗体 (抗 A |8 42モノクローナル抗体、抗 MCP-1モノクローナル抗体、抗ャギ IgG抗体）をさらに反応させた（マウス IgG抗体は 洗浄せずそのまま反応させた)。 PBSTで 5回洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識 抗マウス抗体と更に 37°Cで 1時間反応させた。 PBSTで 5回洗浄後、発色基質液を加 えて呈色させ、 405應の吸光度を測定して結合性を評価した。結果を図 12に示す。 評価した精製 tatペプチド融合 VLは A β 42ペプチドと特異的に結合した。
[0132] 《実施例 18： tatペプチド融合 VL鎖の Α β 42ペプチド凝集阻害能の濃度依存性評価 )>
実施例 16で調製した精製 tatペプチド融合 VL鎖を用いて、 Α |8 42ペプチドの凝集 阻害能の評価を行った。凝集阻害能の評価はアミロイド繊維形成の進展を実施例 10 と同様の蛍光チオフラビン試験で行った。その結果、評価した精製 tatペプチド融合 VL鎖が凝集抑制活性を有することが確認できた (図 13)。

Claims

請求の範囲
アミロイド βペプチド (Α β )に結合性を有するヒト抗 Α β抗体。
Η鎖の相補性決定領域 (CDR)が以下の (a)または (b)のアミノ酸配列を有し、 L鎖 の相補性決定領域 (CDR)が以下の（c)または (d)のアミノ酸配列を有する、請求項 1に記載のヒト抗 A |8抗体：
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52、 62、 72、 82または 92の!ヽずれ 力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53、 63、 73、 83または 93の!ヽ ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 4、 14、 24、 34、 44、 54、 64、 74、 84ま たは 94のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(b) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24 、 32〜34、 42〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94、また はこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およ び Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖の相補性決定領域と なりうるもの；
(c) CDRlとして配列番号 7、 17、 27、 37、 47、 57、 67、 77、 87、 97または 102の ヽずれ力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58、 68、 78、 88、 98ま たは 103の! /、ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 9、 19、 29、 39、 49、 59、 6 9、 79、 89、 99または 104のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(d) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29 、 37〜39、 47〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 97〜99、または 102 〜104、またはこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失 、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖の相補 性決定領域となりうるもの。
H鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34 、 42〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94の組み合わせ力 ^ ら選択されるアミノ酸配列であり、 L鎖の CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 7〜9 、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 9 7〜99、または 102〜104の組み合わせ力も選択されるアミノ酸配列である、請求項 2に記載のヒト抗 A |8抗体。
[4] Η鎖の CDR1〜3と L鎖の CDR1〜3との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号 2
〜4と配列番号 7〜9、配列番号 12〜14と配列番号 17〜19、配列番号 22〜24と配 列番号 27〜29、配列番号 32〜34と配列番号 37〜39、配列番号 42〜44と配列番 号 47〜49、配列番号 52〜54と配列番号 57〜59、配列番号 62〜64と配列番号 67 〜69、配列番号 72〜74と配列番号 77〜79、配列番号 82〜84と配列番号 87〜89 、または配列番号 92〜94と配列番号 97〜99との!/、ずれか一つの組み合わせであ る、請求項 3に記載のヒト抗 A β抗体。
[5] Η鎖可変領域が以下の（e)または (f)のアミノ酸配列を有し、 L鎖可変領域が以下 の（g)または (h)のアミノ酸配列を有する、請求項 1から 4のいずれかに記載のヒト抗 A J3抗体：
(e)酉己歹 IJ番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81また ίま 91の!ヽずれ力一つのアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(f)酉己列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81または 91に示されるアミノ酸酉己列 において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加され たアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖可変領域となりうるもの；
(g)酉己歹 IJ番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96また ίま 101の! /、ずれ力一つ のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(h)配列番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96または 101に示されるァミノ 酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付 カロされたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖可変領域となりうるもの。
[6] H鎖可変領域と L鎖可変領域との組み合わせのアミノ酸配列が、配列番号 1と配列 番号 6、配列番号 11と配列番号 16、配列番号 21と配列番号 26、配列番号 31と配列 番号 36、配列番号 41と配列番号 46、配列番号 51と配列番号 56、配列番号 61と配 列番号 66、配列番号 71と配列番号 76、配列番号 81と配列番号 86、または配列番 号 91と配列番号 96との組み合わせにより示されるアミノ酸配列である、請求項 1から 5の!、ずれかに記載のヒト抗 A β抗体。
[7] 当該 Α βが繊維化した Α βである請求項 1から 6の 、ずれかに記載のヒト抗 Α β抗 体。
[8] アミロイド βペプチド (Α β )に結合性を有するヒト抗 Α β抗体の Η鎖可変領域フラグ メント。
[9] 相補性決定領域 (CDR)が以下の（a)または (b)のアミノ酸配列を有する、請求項 8 に記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメント：
(a) CDRlとして酉己歹 IJ番号 2、 12、 22、 32、 42、 52、 62、 72、 82または 92の!ヽずれ 力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 3、 13、 23、 33、 43、 53、 63、 73、 83または 93の!ヽ ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 4、 14、 24、 34、 44、 54、 64、 74、 84ま たは 94のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(b) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24 、 32〜34、 42〜44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94、また はこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、およ び Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖の相補性決定領域と なりうるもの。
[10] CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 2〜4、 12〜14、 22〜24、 32〜34、 42〜
44、 52〜54、 62〜64、 72〜74、 82〜84、または 92〜94の組み合わせ力も選択 されるアミノ酸配列である、請求項 9に記載のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメ ント。
[11] 以下の（e)または (f)のアミノ酸配列を有する、請求項 8から 10のいずれかに記載 のヒト抗 A β抗体の Η鎖可変領域フラグメント：
(e)酉己歹 IJ番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81また ίま 91の!ヽずれ力一つのアミ ノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(f)酉己列番号 1、 11、 21、 31、 41、 51、 61、 71、 81または 91に示されるアミノ酸酉己列 において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付加され たアミノ酸配列であって、 A |8に対する H鎖可変領域となりうるもの。
[12] 当該 A |8が繊維化した A |8である請求項 8から 11のいずれかに記載のヒト抗 A |8抗 体の H鎖可変領域フラグメント。
[13] アミロイド 13ペプチド (A β )に結合性を有するヒト抗 Α β抗体の L鎖可変領域フラグ メント。
[14] 相補性決定領域 (CDR)が以下の（c)または (d)のアミノ酸配列を有する、請求項 1 3に記載のヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメント：
(c) CDRlとして配列番号 7、 17、 27、 37、 47、 57、 67、 77、 87、 97または 102の ヽずれ力一つ、 CDR2として酉己歹 IJ番号 8、 18、 28、 38、 48、 58、 68、 78、 88、 98ま たは 103の! /、ずれ力一つ、および CDR3として酉己歹 IJ番号 9、 19、 29、 39、 49、 59、 6 9、 79、 89、 99または 104のいずれか一つによりそれぞれ示されるアミノ酸配列；
(d) CDRl〜3のアミノ酸配列として、それぞれ、配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29 、 37〜39、 47〜49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 97〜99、または 102 〜104、またはこれらアミノ酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失 、挿入、および Zまたは付加されたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖の相補 性決定領域となりうるもの。
[15] CDR1〜3のアミノ酸配列力 配列番号 7〜9、 17〜19、 27〜29、 37〜39、 47〜 49、 57〜59、 67〜69、 77〜79、 87〜89、 97〜99、または 102〜104の組み合 わせ力も選択されるアミノ酸配列である、請求項 14に記載のヒト抗 A |8抗体の L鎖可 変領域フラグメント。
[16] 以下の (g)または (h)のアミノ酸配列を有する、請求項 8から 10のいずれかに記載 のヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメント：
(g)酉己歹 IJ番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96また ίま 101の! /、ずれ力一つ のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列；
(h)配列番号 6、 16、 26、 36、 46、 56、 66、 77、 86、 96または 101に示されるァミノ 酸配列において 1またはそれ以上のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および Zまたは付 カロされたアミノ酸配列であって、 A |8に対する L鎖可変領域となりうるもの。
[17] 当該 A |8が繊維化した A |8である請求項 13から 16のいずれかに記載のヒト抗 A |8 抗体の L鎖可変領域フラグメント。
[18] 請求項 8から 12のいずれかに記載のヒト抗 A |8抗体の H鎖可変領域フラグメントと、 請求項 13から 17のいずれかに記載のヒト抗 A |8抗体の L鎖可変領域フラグメントとを 連結してなる、 A |8に対するヒト由来の抗体の一本鎖可変領域フラグメント。 [19] 請求項 8から 12のいずれかに記載のヒト抗 A |8抗体の H鎖可変領域フラグメント、 および Zまたは請求項 13から 17のいずれかに記載のヒト抗 A |8抗体の L鎖可変領 域フラグメントに、ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる、 A |8に対するヒト由来の 抗体またはその抗体フラグメント。
[20] 当該抗体フラグメントが、 Fab, Fab'、 F(ab')、 scAb、または scFv-Fcである請求項 1
2
9に記載の抗体フラグメント。
[21] 配列番号 101のアミノ酸配列を有するヒト抗 A β抗体の L鎖可変領域フラグメントと ヒト由来の抗体定常領域を連結してなる A βに対するヒト由来の抗体またはそのフラ グメント。
[22] 請求項 1から 21のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメントとペプチド或いは 他のタンパク質とを融合させた融合抗体またはそのフラグメント。
[23] 請求項 1から 22のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメント に修飾剤が結合されてなる修飾抗体またはそのフラグメント。
[24] 請求項 1から 22のいずれかに記載の抗体もしくは融合抗体またはそのフラグメント をコードする遺伝子。
[25] 請求項 24に記載の遺伝子を含む組換え発現ベクター。
[26] 請求項 24に記載の遺伝子が導入された形質転換体。
[27] 請求項 24に記載の遺伝子を宿主に発現させることによって、ヒト抗 Α β抗体または その断片を生産する方法。
[28] 請求項 24に記載の遺伝子を含む遺伝子治療剤。
[29] 請求項 1から 21のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項 22 に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項 23に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いた Α |8の検出試薬。
[30] 請求項 1から 21のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項 22 に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項 23に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の診断薬。
[31] 請求項 1から 21のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項 22 に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項 23に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いた A β凝集阻害剤。
請求項 1から 21のいずれかに記載の抗体またはそのフラグメント、または請求項 22 に記載の融合抗体またはそのフラグメント、または請求項 23に記載の修飾抗体また はそのフラグメントを用いたアルツハイマー痴呆症の予防、治療剤。
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