WO2005105994A1 - ジスルフィド架橋形成型インビトロタンパク質合成方法 - Google Patents

ジスルフィド架橋形成型インビトロタンパク質合成方法 Download PDF

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WO2005105994A1
WO2005105994A1 PCT/JP2005/008571 JP2005008571W WO2005105994A1 WO 2005105994 A1 WO2005105994 A1 WO 2005105994A1 JP 2005008571 W JP2005008571 W JP 2005008571W WO 2005105994 A1 WO2005105994 A1 WO 2005105994A1
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protein
redox
purity
reagent
protein synthesis
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PCT/JP2005/008571
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Inventor
Hidefumi Kuwata
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Post Genome Institute Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
    • C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
    • C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains

Definitions

  • the present invention relates to a method for synthesizing a protein using an in vitro transcription / translation system, and more particularly to an efficient method for synthesizing a protein having an intermolecular / intramolecular disulfide bond using an in vitro transcription / translation system. .
  • cell-free protein synthesis that does not use such organisms or cells.
  • the cell-free protein synthesis system is also called an in vitro transcription / translation system, in which the type III gene is transcribed by using an extract prepared from Escherichia coli, reticulocyte red blood cells, or wheat germ cells, or a crude fraction thereof. Translated and protein is synthesized.
  • Cell-free protein synthesis systems have a high potential for synthesizing proteins that disrupt the function of living organisms and cells.Suitable for 96- and 384-well formats to synthesize a wide variety of proteins, Reaction conditions
  • the feature is that various restrictions can be lifted by using organisms and cells, such as being able to try many times each time.
  • Non-Patent Document 1 Biochem. J. 254: 805-810 (1988), hereinafter referred to as Conventional Technique 1
  • a method of dialyzing a cell extract A method of adding oxidized daltathione and reduced daltathione, a method of performing gel filtration, or a method of adjusting the oxidation-reduction potential
  • Non-patent document 2 FEBS Lett. 514: 290-4 (2002)
  • Non-patent document 3 Nature Biotech.
  • Patent Document 1 JP-A-2003-116590
  • Patent Document 2 WO 03/072796 Al (hereinafter referred to as Conventional Technique 2).
  • Conventional Technique 2 a method of forming a disulfide bond by using a deletion mutant of an enzyme that maintains a reduced state has been conventionally known (Proc. Natl. Acad. Sci.
  • the target protein can be expressed by Escherichia coli deficient in thioredoxin reductase and daltathione reductase, but strains deficient in such enzymes generally grow extremely slowly or require special culture conditions. It was necessary and was a major obstacle to industrial use.
  • This method is a system for recombination of genes and expression of proteins in Escherichia coli.
  • many organisms have many unidentified but redox enzymes and substrates other than thioredoxin reductase and glutathione reductase (Non-Patent Document 4: Nature
  • Patent Document 2 W0 03/072796 A1
  • Patent Document 3 US 6, 548, 276 B2
  • Non-Patent Document 1 Biochem. J. 254: 805-810 (1988)
  • Non-Patent Document 2 FEBS Lett. 514: 290-294 (2002)
  • Non-Patent Document 3 Nature Biotech. 15: 79-84 (1997)
  • Non-patent document 4 Nature Review Molecular Cell Biology 3: 836-847 (2002))
  • Non-patent document 5 Biochemistry 26: 3129-3134 (1987)
  • Non-Patent Document 6 Biochem J. 159: 377-384 (1976) 'Disclosure of the Invention
  • Prior art 1 requires the labor of preparing the microsomal fraction by homogenization and centrifugation from the pancreas, etc.
  • the microsomal fraction is a cell called the endoplasmic reticulum where disulfide bond formation naturally occurs in cells. It is a fraction in which organelles are destroyed, which is less efficient than disulfide bonds formed in the endoplasmic reticulum, and that the pattern of disulfide bonds formed is different and protein may not show activity There is a problem.
  • a cell extract can be prepared by a simple method such as addition of oxidized daltathione and reduced daltathione or dialysis. It was difficult to efficiently adjust the reproducibility and cross-link disulfide bonds efficiently. This is because cell extracts, which are commonly used cell-free protein synthesis systems, contain thioredoxin reductase [EC 1.6.5.5] and glutathione reductase [EC 1.6.4.2] There are various enzymes and substrates that maintain a reduced state (Nature Review Molecular
  • GSSG oxidized daltathione
  • GSH reduced daltathione
  • the oxidation-reduction potential is a potential measured by using an electrode such as platinum in an equilibrium state in which reversible electron transfer is established, due to the chemical potential difference between the oxidized form and the reduced form. It is only a collective observation of the redox equilibrium state of various inorganic and organic compounds (eg, oxygen, metal, cysteine, heme) involved in redox in the solution, and the equilibrium state of thiol and disulfide Because it is not an indicator of the state, it did not represent the redox state of the protein. Therefore, even if the oxidation-reduction potential is simply adjusted to a specific value as in the prior art 2, it was extremely difficult to adjust the formation of disulfide bonds to proteins.
  • a common problem with conventional methods 1 and 2 is that when cell extracts are subjected to treatments different from the original intracellular environment, such as addition of microsomes, dialysis, and addition of oxidized glutathione and reduced daltathione, protein synthesis Therefore, there is a possibility that the protein synthesis efficiency itself may be reduced due to a difference from the original intracellular environment in which the cell-forming is performed, and this has made it extremely difficult to use a cell-free protein synthesis system at an industrial level.
  • the present inventors have determined that some or all of the protein components constituting the reaction system are labeled while having a relationship of adhering to each other.
  • JP-A-2003-102495 hereinafter referred to as a reconstituted protein synthesis system
  • This method is completely different from conventional cell-free systems and in vitro protein synthesis systems (hereinafter referred to as cell-free protein synthesis systems), in which each component involved in protein synthesis is purified without using a cell extract.
  • cell-free protein synthesis systems in which each component involved in protein synthesis is purified without using a cell extract.
  • protein synthesis is possible by reconstitution, and it is possible to synthesize and rapidly purify proteins having no disulfide bond in the molecule (Nature Biotechnology 19: 732-734 (2001)).
  • concentration should be reconstituted for various components in order to efficiently synthesize proteins having intramolecular / intermolecular disulfide bonds with their original structure and activity, and efficiently? There were no reports.
  • An object of the present invention is to form a disulfide bond.
  • An object of the present invention is to provide a simple and highly efficient method for producing a protein having PT / JP2005 / 008571 using a reconstituted protein synthesis system.
  • the conventional method has a problem that RNaseA needs to be once denatured and a long time for refolding is required.
  • Reconstituted protein synthesis systems include ribosomes with a purity of 90% or more, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl-tRNA synthetases, methionyl-tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, and ribonucleoside 3-phosphorus It has been found that it is particularly preferable to use acids, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolate (FD;), salts and water as components, and the present invention has been completed.
  • FD 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolate
  • the redox state is biased toward the reducing side, and the protein synthesized in the cell exists in the reduced state.
  • a cell-free protein synthesis system mimics this intracellular state and usually contains DTT and other reducing reagents.If no reducing reagent is contained, the storage of the extract will be poor. And the translation efficiency has been reported to be low (Eur. J Biochem. 270: 4780-4786 (2003)).
  • the reducing state is not desirable.
  • the reducing agent DTT is removed by dialysis etc. to form a disulfide bond in the protein. Attempts have been made to reduce the amount added. However, as mentioned above, the effect was limited. JP2005 / 008571
  • DTT can be reduced from a number to It may be added, or DTT may not be added at all.
  • the present invention does not use a cell extract, does not contain impurities that affect the redox state, and has a specified liposome, initiation factor, and elongation.
  • Factors, termination factors, aminoacyl tRM synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, liponucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8-tetrahydrofolate (FD), Salts and water are reconstituted as basic reagents for protein synthesis, and in this reconstituted protein synthesis system, the redox equilibrium between disulfides and thiols is artificially adjusted to produce highly efficient proteins having disulfide bonds.
  • the reconstituted basic reagent for protein synthesis is a highly purified ribosome having a purity of 90% or more, an initiation factor, an elongation factor, a termination factor, an aminoacyl-tRNA synthetase, and a methionyl.
  • a basic protein synthesis reagent for example, a pure system (manufactured by Bost Genome) excluding DTT can be used.
  • the artificial adjustment of the oxidation-reduction equilibrium between disulfide and thiol may be performed by adding (i) a reagent that regulates the oxidation-reduction state to the protein synthesis basic reagent; ) It can be performed by adding an enzyme that catalyzes redox. These additions may be made before, during or after the reaction. good.
  • DTT oxidized glutathione
  • oxidized glutathione and the like can be given as examples of the reagent that regulates the redox state.
  • examples of enzymes that catalyze (mouth) oxidation-reduction include protein disulfide isomerases and dis / sulfide interchain diproteins.
  • protein synthesis method of the present invention may be referred to as a protein production method.
  • the present invention provides a test method for measuring the correlation among the three factors: the activity of the protein to be produced, the amount of a redox enzyme reagent that catalyzes redox, and the amount of a redox reagent added.
  • Ribosomes, initiators, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRM synthetases, methionyl tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, whose abundance and purity are specified respectively, 10 -Formyl 5,6,7,8-Tetrahydrofolate (FD), salts, and water are each reconstituted in a predetermined specific amount to provide a basic protein synthesis reagent.
  • the concentration of the oxidoreductase reagent that catalyzes redox and the concentration of the redox reagent can be changed in the protein synthesis basic reagent.
  • a group of reagents that can change the equilibrium state of the redox reduction is added to the reconstituted protein synthesis system to a desired final concentration, thereby forming disulfide bond crosslinks of the produced protein.
  • the conditions necessary for producing a desired disulfide bond crosslinked protein can be accurately known in a reconstituted protein synthesis system.
  • the information thus obtained can be used as conditions for the protein synthesis.
  • the oxidoreductase reagent and the oxidoreductase reagent may be added at any time before the start of the reaction, during the reaction, or after the reaction.
  • Examples of the oxidoreductase reagent include DTT and GSSG.
  • Examples of the redox reagent include protein disulfide isomerases and disulfide interdiamine diproteins. 1 It is possible to prepare multiple concentrations of reagents in advance and add them to each reaction system before starting the reaction (before adding the type III nucleic acid), after starting the reaction, or after finishing the reaction.
  • the details of the method for measuring the activity are the same as in the protein synthesis system described above, except that the enzyme for promoting the disulfide bond or the enzyme catalyzing the isomerization whose activity is to be measured is added simultaneously with or after the translation. .
  • the protein used as a substrate is added as type II DNA or RNA encoding it.
  • the type of protein used as a substrate is not particularly limited, but preferably has a known structure, and more preferably is an enzyme. Examples of such a substrate include lysozyme and alkaline phosphatase.
  • this method can be used for the purpose of measuring the activity of an enzyme that catalyzes the promotion of a disulfide bond and / or the isomerization of a disulfide bond and, conversely, the screening of a substance that inhibits the activity. is there.
  • screening can be performed by using the test substance together with an enzyme that catalyzes the promotion of disulfide bonds and isomerization.
  • the present invention includes a kit comprising the following (1) a) and b), (2) a) and c), or (3) a), b) and c).
  • a protein synthesis reaction basic reagent consisting of components whose abundance and purity are specified, and which causes the synthesis reaction of the protein encoded by the type II nucleic acid by adding the type II nucleic acid;
  • a redox reagent that regulates one or more redox states whose abundance and purity are specified.
  • Ribosomes initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl-tRNA synthetases, methylo
  • FIG. 1 shows fractionation of a crude liposome extract by a sucrose density gradient of 6 to 36%.
  • Figure 2 shows the Aranyl tRNA synthetase (AlaRS), arginine tRNA synthetase (ArgRS), asparagine tRNA synthetase (AsnRS), aspartate tRNA synthetase (AspRS), cysteine tRNA synthetase (CysRS), and His-Tag attached.
  • AlRS Aranyl tRNA synthetase
  • ArgRS arginine tRNA synthetase
  • AsnRS asparagine tRNA synthetase
  • AspRS aspartate tRNA synthetase
  • cysteine tRNA synthetase CysRS
  • His-Tag attached.
  • FIG. 3 shows a photograph of synthesis electrophoresis of human lysozyme (arrows indicate synthesized human lysozyme).
  • FIG. 4 shows the specific activity of the synthesized lysozyme.
  • FIG. 5 shows the amount of synthesized mIL6 protein.
  • FIG. 6 shows the amount of DHFR protein synthesized.
  • FIG. 7 shows the specific activity (effect of PDI concentration) of the synthesized human lysozyme.
  • FIG. 8 shows the specific activity (effect of DTT concentration in the presence of 0.13 PDI) of the synthesized lysozyme.
  • Figure 9 shows the combined alkaline phosphatase activity (impact of 0. I 3 i M PDI ⁇ Pi l mM GSSG concentration in the presence of DTT).
  • FIG. 10 shows the activity of the synthesized alkaline phosphatase (the effect of a change in DTT concentration in the presence of PDI).
  • FIG. 11 shows the activity of the synthesized lysozyme (the effect of adding or not adding DsbC).
  • FIG. 12 shows the activity of the synthesized alkaline phosphatase (comparison between the method of the present invention and the method using a cell extract).
  • FIG. 13 shows an electrophoresis photograph of the eluted fraction of EF-Tu.
  • FIG. 14 shows electrophoresis photographs of purified DsbA (lane 1) and DsbC (lane 2).
  • the in vitro DNA transcription / translation system or RNA translation system in the present invention is a protein synthesis system comprising a basic component for synthesizing a protein by adding a type III encoding a target protein such as mRNA or cDNA. It consists of a basic reagent, a reagent for adjusting the redox state of redistribution between disulfide and thiol, and an enzyme for catalyzing redox. .
  • the method of the present invention comprises: (1) a reaction system comprising the following a) and b); (2) a), b) and c) Using a reaction system consisting of (3) a reaction system consisting of the following a), b) and d), or (4) a reaction system consisting of the following a), b), c) and d): And a method for synthesizing a protein having a disulfide bond therein.
  • a protein synthesis reaction basic reagent consisting of a plurality of components whose abundance and purity are each specified, wherein the addition of a mirror nucleic acid causes a synthesis reaction of a protein encoded by the type II nucleic acid;
  • a redox reagent that regulates one or more redox states whose abundance and purity are specified.
  • Basic protein synthesis reagents consist of ribosomes, initiation factors, elongation JP2005 / 008571 Factors, termination factors, aminoacyl-tRNA synthetases, methyl-tRNA transformylases, tRNAs, amino acids, ribonucleoside triphosphates, 10-formyl 5,6,7,8 It is characterized in that it contains tetrahydrofolate (FD), salts and water, each having a predetermined purity in a predetermined amount. However, not all the components are required, and the components can be selected as appropriate.
  • FD tetrahydrofolate
  • these components constituting the system do not use a cell extract or a crude fraction thereof, but it is desirable to be able to calculate the concentration of a substance that affects the formation of disulfide bonds in proteins.
  • the reconstituted protein synthesis system of the present invention reconstitutes all components constituting the system, it is easy to identify such components and calculate their contents.
  • the protein synthesis reaction basic reagent in the present invention can be used as a reaction system for protein synthesis for performing transcription and translation from DNA or translation of RNA.
  • the protein referred to in the present invention refers to a protein in which two or more amino acids are linked by a peptide bond, and includes peptides, oligopeptides, and polypeptides.
  • RNA according to the present invention includes chemically synthesized RNA and mRNA
  • DNA includes synthetic DNA, DNA butter, genomic DNA, PCR products and cDNA.
  • the phrase "contains components whose abundance and purity are specified respectively" means that each component is individually purified, its purity can be measured, and quantification is possible. It means that it is possible.
  • a plurality of components whose abundance and purity are specified are defined in advance by a method for purifying a substance such as salting out, chromatography, electrophoresis, difference in solubility, recrystallization, and centrifugation. Each is a purified substance, and the purity of each is about 80% or more by analysis methods such as chromatography, electrophoresis, mass spectrometry, and centrifugation.
  • proteins are mainly purified by chromatography, purity is determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and ribosomes are mainly purified by ultracentrifugation. Purity is determined by sedimentation analysis by ultracentrifugation.
  • the ribosome is composed of multiple RNA molecules (three RNA molecules of 23S, 5S, and 16S in prokaryotes, and four RNA molecules of 28S, 5.8S, 5S, and 18S in eukaryotes) and multiple liposomal proteins ( Approximately 50 eukaryotes in prokaryotes 2005/008571 product), it is possible to identify the molecule as an aggregated molecule and measure its purity by force precipitation analysis, which is an aggregated molecule consisting of about 80 proteins and having a molecular weight of several million.
  • tRNAs are composed of 74 to 94 nucleotides and have multiple base sequences.However, the molecules must be separated and identified by electrophoresis, etc., and the purity must be determined by measuring the absorbance at 260 nni and 280 nm. Is possible. In addition, low-molecular substances such as amino acids and salts can be identified and their purity measured by conventional methods such as chromatography, melting point measurement, elemental analysis, and mass spectrometry.
  • Factors for transcription / translation as basic reagents for protein synthesis As enzymes, not only those derived from prokaryotic cells such as Escherichia coli but also those derived from eukaryotic cells, (1) In the case of translation from RNA Ribosomes, initiation factors, elongation factors, termination factors, aminoacyl tRNA synthetases, tRNAs, adenosine triphosphate (ATP), guanosine triphosphate (GTP), amino acids, 10-formyl 5, 6,7,8-tetrahydrofolate (FD), salts and water; if it is a reaction system derived from prokaryotic cells such as Escherichia coli, it further contains methionyl tRNA transformylases; (2) DNA In the case of transcription / translation of E. coli, in addition to (1), peridine triphosphate (UTP), cytidine triphosphate (CTP) and RNA polymerases such as T7 RNA polymerase are included
  • reaction system of the present invention The various factors and enzymes that constitute the reaction system of the present invention are inherently present in all organisms such as Escherichia coli, mold, yeast, and cultured cells. Therefore, each of them must be highly purified and used as a component. However, it is more preferable to use a recombinantly produced protein since a large amount of each protein can be obtained and the possibility of unknown unnecessary or inhibitory components being introduced into the reaction system is reduced.
  • a gene encoding an initiation factor, elongation factor, termination factor, aminoacyl-tRNA synthetase, methionyl-tRNA transformylase, or RNA polymerase is ligated to an appropriate vector, and Escherichia coli, Bacillus subtilis, It can be transformed into mold, yeast, or the like, induced to express, purified, and used as a component of the reaction system of the present invention.
  • the protein may be expressed in an intact state, but may be expressed as a fusion protein.
  • a histidine tag hereinafter referred to as a histidine tag
  • the outline of a purification method of a protein component with a His-Tag using a His-Tag and a nickel column is as follows.
  • various variations are known and can be appropriately selected and used.
  • the salts contain cations and anions which are essential for transcription and translation, and potassium glutamate, ammonium chloride, magnesium acetate, calcium chloride and the like are usually used. It goes without saying that other than the above, it can be appropriately selected and used. Water does not contain ions, microorganisms, and enzymes, such as water produced by Millipore's Milli-Q water production equipment and commercially available pure water. 5 008571
  • the ribosome is a site for peptide synthesis, which binds to mRNA and coordinates aminoacyl tRNA at the A site and formylmethionyl tRNA or beptidyl tRNA at the P site to form peptide bonds.
  • the reaction is performed (Science289: 920-930 (2000)).
  • any substance having such a function can be used regardless of its origin.
  • ribosomes derived from E. coli are used, but those derived from eukaryotic cells can also be used.
  • Preferred examples of the liposome used in the present invention are those derived from Escherichia coli, and include, for example, those obtained from Escherichia coli A19 strain and MRE600 strain.
  • the initiation factors used in the in vitro protein synthesis system of the present invention are factors that are essential for, or significantly promote, the formation of a translation initiation complex, and include those derived from Escherichia coli. , IF1, IF2 and IF3 are known (Biochemistry 29: 5881-5889 (1990)).
  • the initiation factor IF3 promotes the dissociation of the 70S ribosome into the 30S and 50S subunits, a necessary step in the initiation of translation, and formsylmethionyl during the formation of the translation initiation complex. Inhibits the entry of tRNA other than tRNA into the P site.
  • the initiation factor IF2 binds to formylmethionyl tRNA, drives formylmethionyl tRM to the P site of the 30S ribosome subunit, and forms a translation initiation complex.
  • Initiation factor IF1 promotes the function of initiation factors IF2 and IF3.
  • Preferred examples of the initiation factor used in the present invention are those derived from Escherichia coli, such as those obtained from Escherichia coli K12 strain, but those derived from eukaryotic cells can also be used.
  • GTP type binds to aminoacyl-tRNA and transports it to the A site of ribosome. When EF-Tu leaves the ribosome, GTP is hydrolyzed and converted to GDP.
  • EMB0J. 17: 7490-7497 (1998) 0 elongation factor EF-Ts binds to EF-Tu (GDP type) and promotes conversion to GTP type
  • elongation factor used in the present invention is: It is derived from Escherichia coli, for example, those obtained from Escherichia coli K12 strain, but those derived from eukaryotic cells can also be used.
  • Termination factors are essential for terminating protein synthesis, dissociating the translated peptide chain, and regenerating the ribosome to initiate translation of the next mRNA.
  • the reaction stops immediately before the stop codon, and a stable ternary complex of ribosome, peptide, and mRNA is easily formed (polysome display method).
  • Ribosome display method in vitro virus method).
  • the introduction of the unnatural amino acid into the peptide chain is performed by omitting RF1 and / or RF2 from the reaction system. That is, the introduction of unnatural amino acids into the UAG codon when RF1 is omitted and the introduction of unnatural amino acids into the UGA codon when RF2 is omitted are performed with high efficiency.
  • Terminating factors RF1 and RF2 when a stop codon (UAA, UAG, UGA) arrives at the A site of the ribosome, enter the A site and dissociate the peptide chain from peptidyl tRNA (at the P site). Facilitate. RF1 recognizes UAA and UAG among stop codons, and RF2 recognizes UAA and UGA.
  • the termination factor RF3 promotes the dissociation of RF1 and RF2 from liposomes after the dissociation reaction of the peptide chain by RF1 and RF2.
  • Ribosome regeneration factor (RRF) promotes the elimination of tRNA remaining at the P site after protein synthesis is stopped and the regeneration of ribosomes for subsequent protein synthesis.
  • RRF is also treated as one of the termination factors.
  • the functions of the termination factors RF1, RF2, RF3 and RRF are described in EMB0J. 16: 4126-4133 (1997) and EMB0J. 16: 4134-4141 (1997).
  • Preferred examples of the terminator used in the present invention are those derived from Escherichia coli. For example, those obtained from Escherichia coli strain K12 can be mentioned, but those derived from eukaryotic cells can also be used.
  • Aminoacyl tRNA synthetase is an enzyme that synthesizes aminoacyl tRNA by covalently binding tamino acid and tRNA in the presence of ATP (RNA 3: 954-960 (1997), protein nucleic acid enzyme 39: 1215-1225 (1994) )).
  • Preferred examples of the aminoacyl-tRNA synthetase used in the present invention are those derived from Escherichia coli, for example, those obtained from Escherichia coli K12 strain, and those derived from eukaryotic cells can also be used.
  • artificial aminoacyl-tRNA synthetases that recognize unnatural amino acids Patent
  • Methionyl tRNA transformylase is an enzyme that synthesizes N-formylmethyl (fMet) tRNA in which a formyl group is added to the amino group of methionyl tRNA in protein synthesis in prokaryotes. That is, methionyl tRNA transformylase transfers the formyl group of N10-formylte trahydrofolate to the N-terminus of methionyl tRNA corresponding to the initiation codon to fMet-tRNA (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 875). -880 (1999)).
  • the added formyl group is recognized by the initiation factor IF2 and acts as an initiation signal for protein synthesis.
  • initiation factor IF2 acts as an initiation signal for protein synthesis.
  • RNA polymerase is an enzyme that transcribes a DNA sequence into RNA, and is known to exist in various organisms.
  • T7 RNA polymerase from T7 phage which is an enzyme that binds to a specific DNA sequence called the T7 promoter and transcribes the downstream DNA sequence into RNA.
  • the present inventors added a his-tag to the N-terminus of T7 RNA polymerase, expressed it as a fusion protein in a large amount in Escherichia coli BL21 strain, and purified it by affinity chromatography using a nickel column.
  • various RNA polymerases can be used in addition to the T7 RNA polymerase.
  • T3RNA polymerase SP6 RNA polymerase is commercially available, and these can be used.
  • Amino acids include natural or unnatural amino acids, and tRNA charged with natural or unnatural amino acids. By using tRNA charged with unnatural amino acids, it becomes possible to introduce unnatural amino acids into proteins.
  • tRNAs tRNA purified from cells such as Escherichia coli and yeast can be used. An artificial tRNA in which anticodons and other bases are arbitrarily changed can also be used (J. Am. Chem. Soc. 121: 34-40 (1996), Nature Biotech. 20: 177-182).
  • a potassium phosphate buffer (pH 7.3) is usually used as the buffer.
  • Examples of substances that influence the formation of disulfide bonds include oxidoreductase, an enzyme that catalyzes the oxidation and reduction of disulfide bonds, and redox reagent, which is a reagent that regulates the redox state of disulfide bonds.
  • enzymes and / or reagents that affect disulfide bond formation (i) enzymes that catalyze redox: daltathione reductases, thioredoxin reductases, protein disulfide isomerases, Disulfide interchain diproteins, proteins such as thioredoxin-like proteins, and reagents that regulate Z or (mouth) redox state: reduced molecules such as reduced daltathione, oxidized daltathione, DTT, 2-mercaptoethanol and thioredoxin Compounds can be exemplified.
  • the redox reagent in the present invention refers to a reagent capable of reducing disulfide to a thiol or conversely oxidizing a thiol to form a disulfide.
  • substances that affect disulfide bond formation include (ii) redox enzymes (enzymes that catalyze redox) and Z or (red) redox reagents (reagents that regulate the redox state). It is desirable to use enzymes and their substrates that promote and regulate the cross-linking of disulfide bonds.
  • the (a) enzyme that catalyzes redox and / or (mouth) the reagent that regulates the redox state need not always be added during the translation reaction, but may be added after the translation is completed. In the case of adding after the completion of translation, it is preferable to leave the mixture at 37 ° C. for about several tens of minutes to about 1 hour after the addition.
  • the concentration is preferably from 0 to 1 mM, more preferably from 0.001 to 0.5 mM. More preferably, the concentration is preferably in the range of 0.006 to 0.5 mM.
  • the concentration is preferably 0 to 8 mM, and more preferably 0. More preferably, the concentration is 1 to 4 mM.
  • the disulfide interchain diproteins are preferably DsbA and / or DsbC.
  • Protein disulfide isomerase (EC 5.3.4.4.1) is an enzyme that catalyzes the formation of a disulfide bond of approximately 55 kDa and the isomerization / reduction reaction in the endoplasmic reticulum membrane of eukaryotes. It is said to have chaperone-like activity. As described above, this protein can be purified from a living organism and used as a component, or a recombinantly produced protein may be used.
  • proteins are known as protein disulfide isomerases, and can be used as the protein disulfide isomerase of the present invention.
  • DsbA is an enzyme with a 21 kDa thioredoxin-like fold structure that is thought to catalyze the formation of disulfide bonds.
  • DsbB is a 20 kDa protein with four transmembrane sites and two periplasmic domains, and is said to maintain DsbA in an oxidized form.
  • DsbC is a periplasmic protein that forms a homodimer, has a thioredoxin-like fold, and is said to be mainly responsible for the isomerization of disulfide bonds, but also has a role as a chaperone It is believed that.
  • DsbD is a protein with a molecular weight of 59 kDa, consisting of two periplasmic domains and eight transmembrane domains, and is thought to have the function of maintaining the cysteine in the active center of DsbC in a reduced form.
  • the following proteins are known as disulfide interchain diproteins and can be used as the disulfide interchain diproteins of the present invention. Noh.
  • Salmonella typhimurium D protein disulfide-isomerase dsbA homolog PIR Database Accession Nampa, S32895
  • these disulfide interdiazine diproteins can be purified from an organism and used as a component, or may be a recombinantly produced product.
  • the concentration is preferably 0 to 10; It is preferably 0.001 to 5 ⁇ . More preferably, it is preferably 0.001 / ⁇ -2.
  • the amount is preferably 0 ⁇ to 10 ⁇ m. Preferably it is between 0.01 and 10 ⁇ . It is preferred more preferably a 0.1 ⁇ ⁇ 10 ⁇ ⁇ .
  • glutathione reductases and thioredoxin reductases are not contained as much as possible, and the content of thioredoxin reductase and / or glutathione reductase in the components constituting the protein synthesis system is 100 ng / ml or less. Is preferred.
  • the above-mentioned components composed of proteins such as initiation factors, elongation factors, termination factors, methyl tRNA transformylases, and DsbA and DsbC include, for example, His tag and His column using a nickel column as described above. After purifying the tagged protein components by the purification method, confirm the target protein by SDS-PAGE. The migration pattern of 2005/008571 can be calculated by reading with a densitometer.
  • the purity of the purified ribosome can be determined by analysis with a sucrose density gradient.
  • Reagents that are commercially available as ordinary reagents such as tRNAs, amino acids, ribonucleotide triphosphates and FD, other buffers, DTT, and oxidized daltathione, can be used with the purity of commercially available reagents.
  • the purity of all commercially available reagents was 80% or more. .
  • reaction system of the above-mentioned [Method for synthesizing protein having intermolecular or intramolecular disulfide bond] can be used.
  • the oxidoreductase of the present invention the concentration of the oxidoreductase and the concentration of the redox reagent. test method for measuring the correlation between the three parties of activity following a) to d) consisting of the reaction system, specifically, (1) &), 1 3) ⁇ Pi 0), (2) a) , B) d) or (3) a reaction system consisting of a), b), c) and d).
  • a protein synthesis reaction basic reagent consisting of a plurality of components whose abundance and purity are each specified, wherein the addition of type I nucleic acid causes a synthesis reaction of the protein encoded by type I nucleic acid;
  • a redox reagent that regulates one or more redox states whose abundance and purity are specified.
  • the activity of the protein synthesized in the above reaction system is measured, and the correlation with the added c) redox enzyme and d) redox reagent is determined.
  • the activity of the protein measured here is not limited to the enzymatic activity, and includes, for example, the binding activity between the receptor and the protein, the proliferation activity of the cells, and the specific activities thereof.
  • C) and d) may be each a single substance, or may be a mixture of a plurality of substances.
  • oxidoreductases include protein disulfide isomerases, disulfide interchain diproteins, and homologous enzymes thereof.
  • redox reagent As the redox reagent,
  • DTT, GSSG, GSH, thioredoxin and the like can be exemplified.
  • the protein synthesis reaction is started.c) and d) may be added at the beginning of the protein synthesis reaction, or may be added during the synthesis reaction. May be added.
  • the addition is performed after the completion of the synthesis reaction, it is preferable that the mixture is further allowed to stand at 37 ° C. for about several ten minutes to one hour after the addition. In each case synthesized in this way, the activity of the synthesized protein in the reaction solution is measured.
  • the protein synthesized here is not particularly limited as long as it can form a bridge of at least one disulfide bond within a molecule and / or between molecules, and a plurality of proteins are synthesized in the same reaction solution. It is also possible to form a hetero-oligomer and measure the activity.
  • the concentration of c) oxidoreductase and / or d) redox reagent necessary to obtain a predetermined value of activity ′ is determined, and the desired concentration is determined.
  • the target protein can be efficiently produced with the added reaction system.
  • the pellet was suspended in buffer A to obtain a crude ribosome extract.
  • This crude ribosome extract was subjected to 6-36% (w / v) sucrose density gradient centrifugation, and the fractions shown in Fig. 1 were collected.
  • This Liposomes Ichimu fractions were centrifuged at 100, 000 g, its Peretsuto ribosome buffer (pH 7 6 of 20 mM HEPES-K0H, 6 mM MgOAc, 30 mM NH 4 C1, 7 mM j3 -. Mercaptoethanol ( mercaptoethanol)) to prepare purified ribosomes.
  • Analysis of the-part of the purified ribosome with a 6-36% (w / v) sucrose density gradient yielded a single peak with a purity greater than 90%.
  • the gene sequence encoding the RNA tRNA synthetase is amplified by PCR, and DNA with a Sphl at the 5 'end and a sequence recognized by Hindlll at the 3' end. A fragment was obtained. The obtained DNA fragment was inserted into a plasmid pQE30 (manufactured by QIAGEN) cut in advance with Sphl and Hindlll to obtain a vector for highly expressing Araer tRNA synthetase having His-Tag fused to the N-terminus. E. coli BL21 / pREP4 was transformed with the obtained vector. Other vectors expressing high ARS were constructed in the same manner.
  • Table 1 shows the locations of the vectors, restriction enzymes, and His-Tags used.
  • the plasmid pQE series in Table 1 was used for transformation of E. coli BL21 / pREP4, and the pET series was used for transformation of E. coli BL21 / DE3.
  • table 1 shows the locations of the vectors, restriction enzymes, and His-Tags used.
  • the plasmid pQE series in Table 1 was used for transformation of E. coli BL21 / pREP4, and the pET series was used for transformation of E. coli BL21 / DE3.
  • Example 2 In the same manner as in Example 2, a high expression plasmid of the following protein factor and enzyme was constructed. MTF, T7 RM polymerase, IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts and
  • RFlo Plasmids were constructed in the same manner for protein factor 'enzymes not listed in Table 1.
  • the vector use the pQE series or P ET series E. coli BL21 / pREP4 or E. coli BL21 / DE3, respectively.
  • the transformant E. coli BL21 / pREP4 cells obtained in 2 were cultured in 6 liters of LB medium until the absorbance at 660 nm reached 0.7. To this culture, add isopropyl-11-thiol j3-D-galactoside (IPTG) to a final concentration of 0.1 mM, and further at 37 ° C.
  • IPTG isopropyl-11-thiol j3-D-galactoside
  • the cells were cultured for 4 hours.
  • the culture is centrifuged and the cells obtained are suspended in a suspension buffer (pH 7.6).
  • TritonX_100 0.2 mM phenylmethanesulfur fluoride (PMSF), 6 mM jS
  • the suspension was sonicated to break cells.
  • the sonicated suspension was centrifuged (100,000 g, 1 hour at 4 ° C) to remove cell debris.
  • the obtained supernatant fraction was applied to a 10 ml Hi-Trap chelating column (manufactured by Pharmacia) precharged with Ni 2+ , and 100 ml of HT buffer (pH 7.6, 50 mM) containing 10 mM imidazole was applied. Washed with mM HEPES-K0H, 1M NH 4 C1, 10 mM MgCl 2 ).
  • the concentration of imidazole in the HT buffer was linearly ramped from 10 to 400 mM.
  • His-tagged arrul tRNA synthetase was eluted from the column. The fractions containing the purified protein are combined and combined in Stock buffer (50 mM HEPES-K0H, pH 7.6,
  • ArgRS asparagine tRNA synthetase
  • AspRS asparagine tRNA synthetase
  • CysRS cysteine tRNA synthetase
  • GlnRS glutamine tRNA synthetase
  • GluRS glutamate tRNA synthetase
  • composition per protein synthesis reaction basic reagent 50 is as follows. 2 ⁇ ATP, 2 m GTP. 1 mM CTP, 1 mM UTP, 10 mM creatine phosphate, 2.8 A 260 unit tRNA mix, 0.5 gFD, 0.1 mM each amino acid, 9 mM acetic acid Magnesium, 5 mM potassium phosphate, pH 7.3, 95 mM potassium glutamate, 5 mM ammonium chloride, 0.5 mM calcium chloride, 1 mM spermidine, 8 mM putrescine , 12 pmol ribosome, 1 ⁇ g IF1, 2 IF2, 0.75 ⁇ g IF3, 1 ⁇ g EF-G, 2 ⁇ g EF-Tu N 1 g EF- Ts, 0.5 ⁇ g RF1, 0.5 zg RF3, 0.5 ⁇ g RRF, 30-300 units each ARS and MTF, 0.2 / g creatine kinase (
  • the ribosome was removed by passing through an ultrafiltration membrane that passes a substance of 100 kDa or less.
  • ribosomes and those described in Table 1 were prepared in Examples 1 and 4, and the purity was measured.
  • the other components used were commercially available purification reagents.
  • ribosomes, DsbA and DsbC were prepared in Examples 1, 4 and 13 and the purity was measured.
  • the other components used were commercially available purification reagents.
  • Lysozyme is a protein originally having four disulfide bonds in the molecule.
  • the array for the video primer is as follows: AAGGAGATATACCAATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG.
  • the sequence of the reverse primer is as follows: GGATTAGTTATTCATTACACTCCACAACCTTGAACAT C
  • type I DNA of about 0.51 kbp containing the T7 promoter region was amplified by PCR.
  • the sequence of type I DNA is shown in Sequence Listing, SEQ ID NO: 4.
  • Example 5 To the basic reagent for protein synthesis reaction described in Example 5 (the method according to the present invention) and a reaction solution (1 ⁇ mol) prepared by adding 1 mM DTT to the reaction reagent (conventional method), 1 pmol of the prepared type I DNA was added. Then, a protein synthesis reaction was performed.
  • the synthesized protein was separated by SDS-PAGE and stained with SYPR0 Orange (Amersham Fanore Macia). A band of human lysozyme with a molecular weight of 17000
  • the concentration of synthesized trisozyme was determined.
  • the activity of human lysozyme was determined using lyophilized microbial powder of Micrococcus luteus ATCC 4698 (manufactured by SIGMA).
  • the amount that reduces the absorbance at 450 nm by 0.001 per minute was measured as 1 unit (Imoto
  • Fig. 3 shows an electrophoresis photograph of the synthesized protein
  • Fig. 4 shows the specific activity.
  • the protein synthesized by electrophoresis can be confirmed, but no activity is recognized, but in the method according to the present invention, a specific activity of about 300 units / mg is recognized.
  • other proteins having disulfide bonds were examined, almost the same results were obtained.
  • mIL6 was prepared in the same manner as in Example 6.
  • E. coli dihydrofolate reductase (DHFR) type II DNA was prepared in the same manner as in Example 6 using E. coli genomic DNA.
  • a reaction solution obtained by adding ImM DTT to the basic reagent for protein synthesis reaction of Example 5 (conventional method), the basic reagent for protein synthesis reaction of Example 5, and the basic reagent of Example 5 to the final concentration of 2, 4, 8 mM Five kinds of reaction solutions each containing GSSG were prepared, and 1 pmol of type I DNA was added to each of them to synthesize each protein.
  • DHFR When DHFR was synthesized, the solution passed through the ultrafiltration membrane after synthesis, and when mIL6 was synthesized, the synthesis reaction solution was subjected to SDS-PAGE, and the protein was fluorescently stained with SYPRO Red. The staining pattern was analyzed with a fluoroimager, and the amount of protein in the solution was calculated from the staining concentrations of mIL6 and DHFR.
  • Fig. 5 shows the determined amount of mIL6 protein
  • Fig. 6 shows the amount of DHFR protein.
  • the production amount by the conventional method was the largest, and the protein synthesis amount was decreased by the method of the present invention.
  • a reaction solution was prepared by adding 2 mM of GSSG to the basic protein synthesis reaction reagent of Example 5. Four reaction solutions were prepared. To this reaction solution, PDI derived from Escherichia coli (manufactured by Takara Bio Inc.) was further added so that the final concentrations became 0 M, 0.0325 ⁇ , 0.13 ⁇ , and 0.52 ⁇ . Add 50 ⁇ l of each of these reaction solutions to human lysozyme
  • Alkali phosphatase is a protein that has two disulfide bonds in the molecule, and has been a well-known model protein for a long time to study the relationship between disulfide bond formation and its enzymatic activity.
  • Al-force phosphatase was synthesized.
  • type III DNA of Escherichia coli alkaline phosphatase was prepared in the same manner as in Example 6.
  • Five reaction solutions were prepared by adding 1 mM DTT and 0.13 ⁇ M PDI to the protein reaction basic reagent of Example 5, and 0.1, 2, 3, 4 mM GSSG was added thereto.
  • the concentration of the synthesized protein was determined by the same method as in Example 5.
  • the synthesized alkaline phosphatase is p-nitrophenyl T JP2005 / 008571 Using di-sodium phosphate as a substrate, the activity was measured by measuring the absorbance at 405 nm. (Biochim Biophys Acta. 258: 178-87 (1972)
  • Q Fig. 9 shows the relative activity of anorecaliphosphatase. As is evident from Fig.
  • alkaline phosphatase shows no activity with the conventional method, that is, no activity with the basic protein reaction reagent supplemented with 1 mM DTT and 0.13 ⁇ M PDI, whereas the method according to the present invention.
  • the activity was observed in the reaction solution to which GSSG was added at 1 mM or 2 mM Even if DTT was present in the system at 1 mM, alkaline phosphatase was active and the synthesized protein was correctly folded.
  • reaction solutions were prepared by adding 1000 ⁇ , 500 ⁇ , 250 ⁇ 0, 125 ⁇ , and 0 Ai ⁇ of DTT to the reaction solution of Example 5.
  • Escherichia coli DsbC was amplified by PCR, and a high level of dsbC was expressed in the same manner as in Example 2, except that a DNA fragment having a BamHI at the 5 'end and a sequence recognizing Hindlll at the 3' end was obtained.
  • a vector to be constructed was constructed, and E. coli BL21 / pREP4 was transformed with the obtained vector.
  • Purified DsbC was obtained in the same manner as in Example 4. Protein purity was greater than 90%.
  • Three reaction solutions 501 were prepared by adding 1 mM DTT and 2 mM GSSG to the basic protein synthesis reagent of Example 5.
  • Example 1 2 T / JP2005 / 008571 Comparison of basic protein synthesis reagent of the present invention with conventional cell extract
  • GSSG was added to a final concentration of 0, 1, 2, and 3 mM using an in vitro protein synthesis system (Rapid Translation System 100; manufactured by Kuchish) using an E. coli cell extract.
  • the alkaline phosphatase of Escherichia coli was synthesized according to the instructions described in the above.
  • Escherichia coli allelic phosphatase was synthesized by the method of the present invention.
  • the specific activity of the synthesized alkaline phosphatase is shown in FIG. As is evident from Fig. 12, in the system using the in-cell extract of Escherichia coli, the activity of allelic phosphatase was not observed at all even when GSSG was added at various concentrations, whereas the system of the present invention The method showed high activity.
  • Cells expressing EF-Tu with His-tagged protein are sonicated in ice, suspended in loading buffer (300 mM NaCl, 50 mM NaH2P04, H8.0) and lysed. The material was centrifuged (30,000 g, 4 ° C for 30 minutes). To the supernatant obtained above, 50% M2 + -NTA slurry (manufactured by Qiagen) equilibrated in ice-cooled loading buffer was added. The mixture was stirred at 4 ° C for 1 hour. The resin was loaded on the column, and the column was washed with a loading buffer 20 times the column volume at 4 ° C.
  • loading buffer 300 mM NaCl, 50 mM NaH2P04, H8.0
  • the column was washed with loading buffer (containing 10 mM imidazole, pH 8.0) 20 times the column volume at 4 ° C.
  • loading buffer containing 10 mM imidazole, pH 8.0
  • concentration gradient of imidazole was set to 10 to 250 mM
  • the target protein was eluted from the column, and fractions of 1 ml were collected.
  • the target protein was confirmed by SDS-PAGE.
  • the purity was calculated by reading the electrophoresis pattern of each lane with a densitometer.
  • Figure 13 shows an electrophoresis photograph of the eluted fraction of EF-Tu.
  • the electrophoresis pattern of the lane was read with a densitometer, and EF-Tu fractions having a purity of 90% or more were collected.
  • FIG. 14 shows electrophoretic photographs of the purified DsbA (lane 1) and DsbC (lane 2). All enzymes were more than 90% pure. 2005/008571 Industrial applicability
  • DTT which had conventionally been considered to be better removed from the reaction solution, may be added up to a few M or more up to ImM, or DTT may not be added at all.
  • the substrate is synthesized as a single-stranded polypeptide having no disulfide bond by a protein synthesis reaction, so that no step of reducing and denaturing is required, and the activity is simultaneously or simultaneously with or after the synthesis.
  • the enzyme or enzyme to be measured is added, and the activity or structure of the folded protein is used as an index. Therefore, there is the feature that the required steps and time are greatly reduced as compared with the conventional method.

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Abstract

　本発明の課題は、ジスルフィド結合を持つタンパク質を、再構成タンパク質合成系で簡便且つ高効率に製造する方法を提供することにある。　チオレドキシンレダクターゼ[EC1.6.4.5]及びグルタレドキシンレダクターゼ[EC1.6.4.2]を含む還元状態を維持する種々の酵素や基質が存在するために酸化還元状態の調製が難しい細胞抽出液又はその粗画分を用いることに代え、これら酸化還元状態に影響の与える酵素及び基質を除去し、精製した構成成分からなる再構成タンパク質合成系において、ジスルフィド及びチオールの間の酸化還元の平衡状態を人為的に調整した再構成タンパク質合成系を用いることにより、活性のあるタンパク質を効率的に合成できることを見出したものである。

Description

ジスルフィ ド架橋形成型インビトロタンパク質合成方法
技術分野
本発明はタンパク質の in vitro 転写 '翻訳系による合成方法に関し、 更に詳 しくは分子間/分子内にジスルフィ ド結合を持つタンパク質の in vitro 転写 ·翻 訳系による効率的な合成方法に関するものである。
明 背景技術
書
医薬品や試薬として利用可能なタンパク質を遺伝子組換え技術を用いて生産す る試みが広く行われている。 遺伝子組換え技術では、 取扱いの簡便さや効率の面 から、 現在のところ大腸菌、 枯草菌、 カビ、 又は酵母等の微生物、 蚕等の昆虫、 ゥシ等の哺乳動物、 或は培養可能な植物細胞、 昆虫細胞、 動物細胞が好んで用い られている。 遺伝子組換え技術を用いてタンパク質を生産させる方法は汎用され ているが、 目的のタンパク質の発現量が少ない、 発現できても活性を持たない、 或は凝集体を形成する等の問題があり、 培養条件、 生育条件、 及び誘導条件の検 討や、 種々の発現系を試す等の試行錯誤が必要である。 そのような種々の条件検 討を行っても、 生産することが難しいタンパク質も数多く報告されている。 一方、 このような生物や細胞を使わない、 無細胞タンパク質合成よばれるタン パク質合成方法が知られている。 無細胞タンパク質合成系は in vitro転写 ·翻訳 系とも呼ばれ、 大腸菌、 ゥサギ網状赤血球、 又はコムギ胚芽細胞等から調製した 抽出液又はこれらの粗画分を利用することによって、 铸型遺伝子が転写 ·翻訳さ れタンパク質が合成される。 無細胞タンパク質合成系においては、 生物や細胞の 機能を乱すようなタンパク質も合成できる可能性が高いこと、 96穴や 384穴のフ ォーマットに適応させ多品種なタンパク質を合成したり、 多様な合成反応条件を
—度にたくさん試すことが可能である等、 生物や細胞を用いることによる種々の 制限を解除できるという特徴がある。
これら無細胞タンパク質合成系を用いても、 合成されたタンパク質が、 凝集体 を形成する、 本来あるべき構造をとらないという問題が従来より知られていた。 その原因の一つとして、分子間及び/又は分子内にジスルフィ ド結合を持つタンパ ク質が正しくジスルフィ ド結合を架橋できないということが考えられた。 タンパ ク質には分子間及び/又は分子内にジスルフィ ド結合を持つものと持たないもの とがあるが、 細胞の表面や細胞の外へ輸送 ·分泌されるタンパク質の多くはジス ルフィ ド結合を持っており、 このようなタンパク質は特に応用面での有用性が高 いと言われている。 例えば、 現在市販されているタンパク質製剤のうち、 インス リン、 サイトカインゃ血球増殖因子等、 大半の製剤は分子内にジスルフィ ド結合 を有するタンパク質を成分としている。
このような分子内/分子間にジスルフィ ド結合を持つタンパク質についても効 率よく生産するため、 従来より無細胞タンパク質合成系の改良が行われてきた。 例えば、細胞抽出液にミク口ソーム画分を添加する方法（非特許文献 1 ： Biochem. J. 254 : 805-810 (1988)、以下従来技術 1と記載する）、細胞抽出液を透析する方法、 酸化型ダルタチオン及び還元型ダルタチオンを添加する方法、ゲルろ過する方法、 又は酸化還元電位を調整する方法（非特許文献 2： FEBS Lett. 514 : 290-4 (2002)、 非特許文献 3： Nature Biotech. 15： 79- 84 (1997)、特許文献 1：特開 2003- 116590、 特許文献 2 ： W0 03/072796 Al、 以下従来技術 2と記載する）が行われてきた。 また、 還元状態を維持する酵素の欠失変異株を用いることによって、 ジスルフ イ ド結合を形成させる方法が従来より知られている（Proc. Natl. Acad. Sci.
96 : 13703 - 13708 (1999)、以下従来技術 3 )。 この方法ではチォレドキシンレダクタ ーゼ及びダルタチオンレダクターゼが欠損した大腸菌により目的のタンパク質は 発現できるが、 このような酵素の欠損株は一般的に生育が極端に遅いか、 特殊な 培養条件が必要であり、 産業上利用する上で大きな障害となっていた。 この方法 は、 大腸菌に遺伝子を組換え、 タンパク質を発現させる系であるが、 前述したよ うに生物を直接用いることによる種々の制限もあった。 また、 多くの生物にはチ ォレドキシンレダクタ ゼ及ぴグルタチオンレダクターゼ以外にも未同定である が多くの酸化還元を司る酵素や基質が存在するため（非特許文献 4 ： Nature
Review Molecular Cell Biology 3： 836-847 (2002) このような欠損変異株で外 来遺伝子を発現させたり、 或は仮にその細胞抽出液を用いて無細胞のタンパク質 合成系でタンパク質を合成したとしても、 安定してジスルフィ ド結合を形成させ ることは困難であると考えられた。このような酵素や基質を不活性化するために、 細胞抽出液をョードアセタミ ドで処理する方法が従来から知られている （us
6, 548, 276 B2 以下従来技術 4 )。 この方法では、 グルタチオンレダクタ一ゼゃチ ォレドキシンレダクターゼだけでなく、 細胞内の酸化還元を調節している多くの 酵素や基質を不活性化することが可能である。 しかしながら、 ョードアセタミ ド はチオール基を非特異的に修飾するため、 例えば転写翻訳に関わる因子や酵素群 及びリボソ一マルタンパク質等も修飾し、結果として in vitroタンパク質合成反 応の効率や精度が落ちるという問題が考えられた。
一方、 生物や細胞を用いて組換え生産させたタンパク質、 化学合成により合成 したペプチド、 又は無細胞タンパク質合成系で合成したタンパク質を、 いったん 変性剤で完全に変性させた後、再生するという方法が広く行われている（非特許文 献 5 ： Biochemistry 26 : 3129-3134 (1987) .従来技術 5 )。 従来技術 5ではタンパク 質は化学合成されるか、 或は生物を用いた場合でも一旦不活性な不溶化物として 回収されることから、 毒性のあるようなタンパク質の生産も可能である。 タンパ ク質を再生する際には細胞を使わないので、 試薬や塩類を自由に組み合わせるこ とで、 ジスルフィ ド結合を持つタンパク質に正しいジスルフィ ド結合を導入する ことも可能である。 しかしながらこの方法では、 タンパク質の合成とタンパク質 の構造を再生する別々のステップが必要であるということ、 タンパク質の構造を 再生するステップは長時間 （数日〜 1週間） を要するという問題点があった。 ジスルフィ ド結合の促進及び/又はジスルフィ ド結合の異性化を触媒する酵素 の活性測定法としては、 基質となるリポヌクレアーゼ A (RNaseA) をー且還元し 変性させ、続いて活性を測定する酵素と共に RNaseAをリフォールディングし再生 して得られる RNase活性を指標とすることが従来より知られている （非特許文献 6 ： Biochem J. 1976 159 : 377-384)。
特許文献 1 特開 2003- 116590
特許文献 2 W0 03/072796 A1
特許文献 3 US 6, 548, 276 B2
非特許文献 1 Biochem. J. 254 : 805-810 (1988) 非特許文献 2 FEBS Lett. 514： 290-294 (2002)
非特許文献 3 Nature Biotech. 15 : 79-84 (1997)
非特許文献 4 Nature Review Molecular Cell Biology 3 : 836-847 (2002) ) ) 非特許文献 5 Biochemistry 26 : 3129-3134 (1987)
非特許文献 6 Biochem J. 159 : 377-384 (1976 ) ' 発明の開示
[タンパク質合成]
従来からの無細胞タンパク質合成系は、分子間及び/又は分子内にジスルフイ ド 結合を持つタンパク質を製造する場合には、 次に記載する通りの問題があった。 従来技術 1ではすい臓等からホモジナイズ及ぴ遠心分離でミク口ソーム画分を調 製する手間が必要であること、 ミクロソーム画分はジスルフィ ド結合の形成が細 胞内で本来起きる小胞体と呼ばれる細胞小器官が破壊された画分であり、 小胞体 で形成されるジスルフィ ド結合とくらべると効率が悪いこと、 形成されたジスル フィ ド結合のパターンが異なりタンパク質に活性がみられない場合があるという 問題が考えられる。 従来技術 2では、 ミクロソーム画分を調製する必要はなく、 酸化型ダルタチオン及ぴ還元型ダルタチオンの添加もしくは透析といった簡単な 方法で細胞抽出液を調製することができるが、 反応液の酸化還元状態を再現性よ く調整し、 効率よくジスルフィ ド結合を架橋することは困難であった。 その原因 として、 通常用いられる無細胞タンパク質合成系である細胞抽出液には、 チォレ ドキシンレダクターゼ [EC 1. 6. 4. 5]及ぴグルタチオンレダクターゼ [EC 1. 6. 4. 2] を含む還元状態を維持する種々の酵素や基質が存在し（Nature Review Molecular
Cell Biology 3 : 836-847 (2002) )、 それらの働きにより透析ゃグルタチオンの添 加によっても、 酸化還元状態を調整することが難しいことが考えられる。 無細胞 タンパク質合成系において酸化剤、 例えば酸化型ダルタチオン （GSSG) を添加す る場合、 GSSG と還元型ダルタチオン （GSH) の酸化還元緩衝液が従来用いられて きた。 その比率はおおむね、 GSSG： GSH=1 : 5-10 程度である場合が多い。 これは、
RNaseAゃリゾチームを一且還元的に変性させ、 リフォールデイングし、 構造と活 性の相関を調べた数々の研究 (Biochemistry. 1991 30 : 613-619、 Biochemi stry 05 008571
1970 9 : 5015 - 5023) ) から得られた酸化剤の濃度と比率を模倣しており、 必ずしも 無細胞タンパク質合成系に適したものとはいえない。 また、 酸化還元電位とは、 可逆的な電子の授受が成り立つている平衡状態において、 酸化体と還元体の化学 ポテンシャル差により発生する電位を白金等の電極を用 、て測定したものである が、その溶液中の酸化還元に関わる様々な無機，有機化合物（例えば酸素、金属、 システィン、 ヘム） の酸化還元の平衡状態を、 電位としてまとめて観察したもの に過ぎず、 チオールとジスルフィ ドの平衡状態を表す指標ではないため、 タンパ ク質の酸化還元状態を表してはいなかった。 そのため、 従来技術 2のように単に 酸化還元電位を特定の値に調節したとしても、 タンパク質へのジスルフィ ド結合 の形成を調節することは極めて困難であった。
従来法 1、 2に共通する問題点として、 ミクロソームの添加、 透析、 酸化型グ ルタチオン及び還元型ダルタチオンの添加といった本来の細胞内の環境とは異な つた処理を細胞抽出液に施すと、 タンパク質合成が行われる本来の細胞内の環境 とは異なるために、タンパク質の合成効率そのものが低下するという恐れがあり、 産業レベルで無細胞タンパク質合成系の利用を著しく困難なものとしていた。 本発明者らは、 細胞を用いない in vitroでの DNA転写 ·翻訳系又は RNA翻訳系 において、 反応系を構成するタンパク質成分の一部又は全部が、 相互に付着しあ う関係の一方でラベルされている方法（特開 2003- 102495号、以下、再構成タンパ ク質合成系という）、を既に開示している。この方法は、従来の無細胞系や in vitro タンパク質合成系（以下、無細胞タンパク質合成系という） とは全く異なる方法、 すなわち細胞抽出液を使わずにタンパク質合成に関わる様々な成分をそれぞれ精 製し、 再構成することでタンパク質合成を可能とし、 分子内にジスルフイ ド結合 を持たないタンパク質の合成や迅速な精製が可能であるという特徴がある (Nature Biotechnology 19 : 732- 734 (2001) )。 しかしながら、 分子内/分子間にジ スルフィ ド結合を持つタンパク質を本来あるべき構造や活性を持ち、 且つ効率よ く合成するには様々な成分をどのような濃度で再構成すればよいかについては報 告がなされていなかった。
このため、 より簡便で、分子内及び/又は分子間にジスルフィ ド結合を持つタン パク質の高効率製造法が希求されていた。 本発明の課題は、 ジスルフィ ド結合を P T/JP2005/008571 持つタンパク質を、 再構成タンパク質合成系で簡便且つ高効率に製造する方法を 提供することにある。
[酵素活性測定]
前記従来方法は、 RNaseA を一旦変性させる必要があること、 リフォールディン グのための時間が長時間必要であるという問題点があった。
[タンパク質合成方法]
本発明者等は、前記課題に鑑みて鋭意検討した結果、分子内/分子間にジスルフ ィ ド結合を持つタンパク質を本来あるべき構造や活性を持ち、 且つ効率よく合成 するには、 チォレドキシンレダクターゼ [EC 1. 6. 4. 5]及ぴグルタチオンレダクタ ーゼ [EC 1. 6. 4. 2]を含む還元状態を維持する種々の酵素や基質が存在するために 酸化還元状態の調整が難しい細胞抽出液又はその粗画分を用いることに代え、 こ れら酸化還元状態に影響を与える酵素及び基質を除去し、 ジスルフィ ド及びチォ ールの間の酸化還元の平衡状態を人為的に調整した再構成タンパク質合成系を用 いることにより達成できることを見出したものである。
再構成タンパク質合成系としては、 90%以上の純度のリボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンテターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、アミノ酸類、リボヌクレオシド 3リン酸類、 10-フオルミル 5，6，7，8 -テトラヒ ドロ葉酸（FD；)、 塩類及び水を成分とすることを 特徴とすることが特に好適であることを見出し本発明を完成させた。
通常細胞内のタンパク質合成部位では、 酸化還元状態が還元側に偏っており、 細胞内で合成されたタンパク質は還元状態で存在する。 無細胞タンパク質合成系 ではこのような細胞内の状態を模倣しているため DTTや他の還元試薬が通常は含 まれており、 還元試薬が含まれていない場合には抽出液の保存が悪くなったり、 翻訳効 率が低下す る こ と が 報告 さ れ て い る （Eur. J Biochem. 270 : 4780-4786 (2003) )。
一方、 チオール基をジスルフイ ド結合させるには、 還元状態は望ましくないの で、 in vitro 転写 ·翻訳系では、 タンパク質にジスルフィ ド結合を形成させるた めに、 還元剤である DTTを透析等で除去するか、 添加量を低く抑える試みがなさ れてきた。 しかしながら、 上述のように、 その効果は限定的なものであった。 JP2005/008571 他方、 本発明による方法では、 再構成タンパク質合成系にジスルフィ ド及ぴチ オール間での平衡に影響を与える成分の存在量が特定されているので、 DTT を数 から更に I mM迄添加しても良く、 また DTTを全く添加しないことも可能であ る。
更に驚くべきことには、 従来の DTTを除去した無細胞タンパク質合成系を用い る方法ではタンパク質にジスルフィ ド結合を形成させることができたとしても、 該条件下ではタンパク質自体の合成量は低下し目的とする活性を持ったタンパク 質の合成効率は低下すると一般的に考えられていたが、 本発明の様に、 再構成タ ンパク質合成系を用いるとタンパク質の合成量は変わらないか、 むしろ増加する 場合があり、 より効率的にタンパク質を合成することが可能であった。
すなわち本発明は、 従来法とは異なり、 細胞抽出液を使わずに、 酸化還元状態 に影響を与える不純物を含まない、 存在量及ぴ純度がそれぞれ特定されているリ ポソーム、 開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRMシンテター ゼ類、 メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リポ ヌクレオシド 3 リン酸類、 10-フオルミル 5, 6， 7， 8-テトラヒ ドロ葉酸（FD)、 塩類 及び水をタンパク質合成基本試薬として再構成し、 この再構成タンパク質合成系 においてジスルフィド及ぴチオールの間の酸化還元の平衡状態を人為的に調整す ることでジスルフィド結合を有するタンパク質の高効率な合成方法を提供する。 なお、 好適には、 上記の再構成したタンパク質合成基本試薬は、 高度に精製さ れた 90%以上の純度のリボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 アミ ノアシル tRNAシンテターゼ類、メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA 類、 アミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 10-フオルミル 5， 6, 7, 8-テトラ ヒドロ葉酸（FD)、 塩類及ぴ水を、 それぞれ予め決められた量だけ含有するように 再構成されている。 タンパク質合成基本試薬としては、 たとえば、 DTT を除いた ピュアシステム（ボストゲノム社製）を利用することができる。 前記タンパク質の 合成方法において、 ジスルフィ ド及ぴチオール間の酸化還元平衡状態の人為的調 整は、 前記タンパク質合成基本試薬に （ィ） 酸化還元状態を調節する試薬を添加 する、 及び Z又は （口） 酸化還元を触媒する酵素を添加することにより行うこと ができる。 これらの添加は、 反応開始前、 反応中、 反応後のいずれに添加しても 良い。
更に具体的には、 （ィ） 酸化還元状態を調節する試薬としては、 DTT、 酸化型グ ルタチオン等を挙げることができる。又、（口）酸化還元を触媒する酵素としては、 プロティンジスルフィ ドイソメラーゼ類、 ジス/レフィ ドインターチェインジタン パク質類を挙げることができる。
なお、 本発明のタンパク質合成方法をタンパク質製造方法と呼ぶこともある。
[タンパク質活性測定法、 及びそれを利用したタンパク合成方法]
さらに本発明は、 製造されるタンパク質の活性度、 酸化還元を触媒する酸化還 元酵素試薬の添加量、 および酸化還元試薬の添加量の 3者の相関を測定する試験 方法を提供する。 存在量及び純度がそれぞれ特定されているリボソーム、 開始因 子類、 延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRMシンテターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 ァミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン 酸類、 10-フオルミル 5，6, 7，8 -テトラヒ ドロ葉酸（FD)、 塩類及び水は、 それぞれ 予め決められた特定の量を再構成して、 タンパク質合成基本試薬とする。 該タン パク質合成基本試薬に、 酸化還元を触媒する酸化還元酵素試薬濃度、 および酸化 還元試薬濃度を変化させることができることが好ましい。 このようにして酸化還 元の平衡状態を変化させることのできる試薬群を再構成タンパク質合成系に所望 の最終濃度となるように添加することにより、 製造されるタンパク質のジスルフ ィ ド結合架橋を形成させたり、 逆に形成をさせないようにしたりすることを可能 とした。
すなわち本発明により所望のジスルフィ ド結合架橋形態のタンパク質を製造す るのに必要な条件を、 再構成タンパク質合成系において正確に知ることができる ようになった。 このようにして得られた情報は、 前記タンパク質合成の条件とし て用いることが可能である。
酸化還元酵素試薬および酸化還元試薬の添加は、 反応開始前、 反応中または反 応後のいずれの時点において行なっても良い。
酸化還元酵素試薬としては、 DTT、 GSSG等を挙げることができる。 酸化還元試 薬としては、 プロテインジスルフイ ドイソメラーゼ類、 ジスルフイ ドインターチ ヱインジタンパク質類を挙げることができる。 1 複数濃度の試薬をあらかじめ作製しておいて、 それぞれの反応系に対して、 反 応開始前（鎵型核酸添加前）、反応開始後、又は反応終了後に添加することが可能 である。
[酵素活性測定法]
活性の測定法の詳細は、 前述したタンパク質合成系、 活性を測定したいジスル フィ ド結合の促進や異性化を触媒する酵素を翻訳と同時または翻訳後に添加する 以外は、 全て同じ方法で行えば良い。 基質として用いるタンパク質はそれをコー ドする鎳型 DNAまたは RNAとして添加される。 基質として用いるタンパク質の種 類は特段の制限はないが、 構造が既知であることが好ましく、 酵素であることが より好ましい。 このような基質の例として、 リゾチームやアルカリフォスファタ 一ゼ等を例示することができる。 また、 この方法ではジスルフイ ド結合の促進及 び/又はジスルフィ ド結合の異性化を触媒する酵素の活性を測定できる力 逆にそ の活性を阻害する物質をスクリ一二ングする目的でも使用可能である。この場合、 ジスルフィ ド結合の促進や異性化を触媒する酵素と共に被検物質を用いることで、 スクリ一ユングを行うことができる。
[キット]
さらに本発明は、 以下の （1 ) a) 及ぴ b )、 ( 2 ) a) 及ぴ c)、 又は （3 ) a)、 b)及び c ) からなるキットが包含される。
a ) 存在量およぴ純度がそれぞれ特定されている成分からなり、铸型核酸を添加 することにより铸型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質 合成反応基本試薬、
b ) 存在量およぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する 酸化還元酵素、
c ) 存在量およぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節 する酸化還元試薬。
具体的には、 a ) 存在量おょぴ純度がそれぞれ特定されているリボソーム、開 始因子類、延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンテターゼ類、 メチォ
-ル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 10-フオルミル 5, 6, 7, 8 -テトラヒ ドロ葉酸（FD)、塩類及び水からなり、 5 008571 鎵型核酸を添加することにより铸型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生 じるタンパク質合成反応基本試薬、 b ) 存在量おょぴ純度が特定されている一つ または複数の酸化還元を触媒する酸化還元酵素、及び c ) 存在量および純度が特 定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節する酸化還元試薬、 からなる キットを提供する。
本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2004- 136520号の明細書 および/または図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、リポソーム粗抽出液の 6〜3 6 %のショ糖密度勾配による分画を示す。 図 2は、 Hi s- Tagが付されたァラニル tRNAシンテターゼ （AlaRS)、 アルギニン tRNAシンテターゼ（ArgRS)、 ァスパラギン tRNAシンテターゼ（AsnRS)、 ァスパラ ギン酸 tRNAシンテターゼ（AspRS)、 システィン tRNAシンテターゼ（CysRS)、 グル タミン tRNAシンテターゼ（GlnRS)及ぴグルタミン酸 tRNAシンテターゼ（GluRS)の 12% SDS-PAGE ·クマシ一プリリアントブルー染色後の写真を示す。
図 3は、 ヒ トリゾチームの合成 電気泳動写真 （矢印は合成されたヒ トリゾチ ームを示す） を示す。
図 4は、 合成されたヒ トリゾチームの比活性を示す。
図 5は、 合成された mIL6のタンパク質の量を示す。
図 6は、 合成された DHFRのタンパク質の量を示す。
図 7は、 合成されたヒトリゾチームの比活性 （PDI濃度による影響） を示す。 図 8は、 合成されたヒ トリゾチームの比活性 （0. 13 PDIの存在下での DTT 濃度による影響） を示す。
図 9は、 合成されたアルカリフォスファターゼの活性 （0. I3 i M PDI及ぴ l mM DTT存在下における GSSG濃度による影響） を示す。
図 1 0は、 合成されたアルカリフォスファターゼの活性 （PDI 存在下での DTT 濃度変化による影響） を示す。
図 1 1は、合成されたリゾチームの活性（DsbC添加または添加なしによる影響） を示す。 8571 図 1 2は、 合成されたアルカリフォスファターゼの活性 （本発明による方法と 細胞抽出液を用いた方法との比較） を示す。
図 13は EF- Tuの溶出画分の電気泳動写真を示す。
図 14は精製した DsbA (レーン 1)及び DsbC (レーン 2)の電気泳動写真を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。 ただし、 本発明は 以下の好ましい実施態様に限定されず、 本発明の範囲内で自由に変更することが できるものである。
本発明における in vitroでの DNA転写 ·翻訳系又は RNA翻訳系は、 mRNA又は cDNA 等の目的とするタンパク質をコードする铸型を添加することでタンパク質 を合成させるための基本的成分からなるタンパク質合成基本試薬、 並びにジスル フィ ド及ぴチオール間の酸化還元平衡状態の人為的調整をするための （ィ） 酸化 還元状態を調節する試薬、 及ぴ Z又は （口） 酸化還元を触媒する酵素からなる。
[分子間又は分子内にジスルフィ ド結合を有するタンパク質合成方法] 本発明の方法は、 （1 ) 下記 a)及ぴ b ) からなる反応系、 （2 ) 下記 a)、 b)及ぴ c)からなる反応系、 （3 )下記 a)、 b)及び d )からなる反応系、又は（4 )下記 a)、 b)、 c)及び d ) からなる反応系を用いた、 分子間又は分子内にジスルフィ ド結合 を有するタンパク質合成方法を包含している。
a) 目的とするタンパク質をコードする 1または複数の铸型核酸、
b) 存在量おょぴ純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、 鏡型核酸 を添加することにより鎵型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タ ンパク質合成反応基本試薬、
c) 存在量おょぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸 化還元酵素、
d) 存在量おょぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節す る酸化還元試薬。
[ 1 - 1 タンパク質合成基本試薬]
タンパク質合成基本試薬は、 その成分として、 リボソーム、 開始因子類、 延長 JP2005/008571 因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンテターゼ類、 メチォ-ル tRNA トラ ンスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リ ン酸類、 10 - フオルミル 5， 6， 7, 8-テトラヒ ドロ葉酸 (FD)、塩類及び水をそれぞれ予め決められ た純度の成分を決められた量だけ含むことを特徴とするが、 全ての成分が必要で なく、 成分は適宜選択することができる。
系を構成するこれらの成分は、 細胞抽出液又はその粗画分を用いないことはも ちろんであるが、 タンパク質のジスルフィ ド結合形成に影響を与える物質濃度を 計算可能であることが望ましい。
本発明の再構成タンパク質合成系は、 系を構成する全ての成分を再構成するた め、 このような成分を特定し、 その含有量を計算することは容易である。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬は、 DNAからの転写 ·翻訳、或は、 RNA の翻訳を行わせるタンパク質合成のための反応系として使用できる。 本発明 に言うタンパク質とは、 2個以上のアミノ酸がぺプチド結合によって結合したも のを言い、 ペプチド、 オリゴペプチド、 ポリペプチドを含む。 本発明に言う RNA は化学合成された RNA及び mRNAを含み、 DNAは、合成された DNA、 DNAベタター、 ゲノム DNA、 PCR産物及び cDNAを含む。
本発明におけるタンパク質合成反応基本試薬において、 存在量および純度がそ れぞれ特定されている成分を含むとは、 それぞれの成分について、 個々に精製さ れ、 その純度が測定可能であり、 かつ定量可能であることを意味している。 本発 明では、 存在量および純度がそれぞれ特定された複数の成分とは、 予め塩析、 ク 口マトグラフィー、 電気泳動、 溶解度の差、 再結晶、 遠心等の物質の精製法によ り、 それぞれが精製された物質であって、 クロマトグラフィー、 電気泳動、 質量 分析、 遠心等の分析方法により、 それぞれの純度がおおむね 80%以上、 好適には
90%以上である物質を言う。 例えば、 タンパク質であれば、 主にクロマトグラフ ィ一により精製され、 S D S—ポリアクリルアミ ドゲル電気泳動 （SDS-PAGE) に より純度が決定され、 リボソームであれば、 主に超遠心法により精製され、 超遠 心分離による沈降分析により純度が決定される。リボソームは複数の RNA分子（原 核生物では、 23S， 5S, 及ぴ 16Sの 3つ、 真核生物では 28S， 5. 8S, 5S, 18Sの 4 つの RNA分子） と複数のリポソ一マルタンパク質（原核生物では約 50個、真核生 2005/008571 物では約 80個のタンパク質） とからなる分子量数百万の集合体分子である力 沈 降分析によって集合体分子として分子を同定し純度を測定することが可能である。 tRNA類はほとんどが 74から 94ヌクレオチドから成り、複数の塩基配列をもつ分 子であるが、 電気泳動などにより分子を分離 ·同定し、 260 nni及び 280 nmの吸 光度測定により純度を測定することが可能である。 その他、 アミノ酸や塩等の低 分子の物質はいずれもクロマトグラフィー、 融点測定、 元素分析、 質量分析等の 常法により、 物質を同定し純度を測定することが可能である。
タンパク質合成基本試薬としての転写/翻訳のための因子 '酵素としては、大腸 菌等の原核細胞由来のものに限らず、 真核細胞由来のものも使用でき、 （1 ) RNA からの翻訳の場合は、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 アミ ノアシル tRNAシンテターゼ類、 tRNA類、 アデノシン 3 リン酸 （ATP) ，グアノシ ン 3リン酸（GTP)，アミノ酸類、 10-フオルミル 5, 6， 7， 8-テトラヒ ドロ葉酸（FD)、 塩類及ぴ水であり、 大腸菌等の原核細胞由来の反応系である場合は更にメチォニ ル t RNA トランスフオルミラーゼ類を含む；（2 ) DNAからの転写/翻訳の場合は、 ( 1 )に加えゥリジン 3リン酸 （UTP) ，シチジン 3リン酸 （CTP) 及び RNAポリメラ ーゼ類、 例えば T7RNAポリメラーゼを含む。
本発明の反応系を構成する各種因子，酵素は、 大腸菌、 カビ、 酵母、 及ぴ培養 細胞等全ての生物が本来備えているものであるから、 これをそれぞれ高度に精製 し、 成分として用いることもできるが、 各タンパク質が多量に得られ、 未知の不 要又は阻害成分が反応系内に持ち込まれる可能性が低くなることから、 組換え生 産されたものを用いることがより好ましい。
具体的には開始因子類、延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンテタ ーゼ類、メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、又は RNAポリメラーゼ類を コードする遺伝子を適切なベクターにつなぎ、 大腸菌、 枯草菌、 カビ、 又は酵母 等に形質転換し、 発現誘導を行い、 該タンパク質を精製し、 本発明の反応系を構 成する成分とすることができる。 組換え体により、 各種因子 '酵素を生産する場 合、 インタタトな状態でそのタンパク質を発現させても良いが、 融合タンパク質 として発現しても良レ、。そのような融合タンパク質として、 ヒスチジンタグ（以下
His- Tag)、ストレプトタグ、 GSTタグ、及ぴ FLAGタグ等を例示することができる。 JP2005/008571
(Appl Microbiol Biotechnol. 60 (5) : 523 - 533 (2003) )
一例として、 His - Tagとニッケルカラムを利用した、 His - Tagを付したタンパク 質成分の精製方法の概略を示せば次の通りである。 これ以外にも様々なバリエ一 シヨンが知られており、 適宜選択して使用できる。
1 . 遺伝子工学的手法により、 目的タンパク質の N末に His- Tag (6個の Hisより なる） を結合させた融合タンパク質を得る。
2 . タグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理し、 ローデ イングバッファー（300 mM NaCl, 50 mM NaH2P04, pH 8. 0) に懸濁させる。
3 . 細胞の溶解物を遠心分離する（30, 000 g、 4°Cで 30分間）。
4 . 上記で得られた上清に、氷で冷やした口一ディングバッファーの中 で平衡化 した 50%の Ni2+- NTA slurry (Qiagen社製）を加える。 4°Cで 1時間撹拌する。
5 . 樹脂をカラムにロードし、 カラム容量の 20倍のローデイングバッファーで、 4 °Cでカラムの洗浄を行う。
6 . カラム容量の 20倍のローデイングノ ッファー（10 mM imidazole, pH 8. 0を 含む）で、 4 °Cでカラムの洗浄を行う。
7 . カラム容量の 20倍のローデイングバッファーを用いて、 imidazoleの濃度勾 配を 10から 250 mMになるように設定し、 カラムから目的タンパク質の溶出を行 わせ、 1 mlずつフラクションを集める。 SDS - PAGEで目的タンパク質を確認する。 また、 反応系を構成する各種因子 ·酵素として、 直接タンパク質の合成反応に は関わらないが、 クレアチンキ "一ゼ類、 ミオキナーゼ類又はヌクレオシドジフ ォスフヱートキナーゼ類といったエネルギー再生に関わる酵素、 及び無機ピロフ ォスファターゼ類といった、 転写 ·翻訳反応で生じる無機ピロリン酸の分解のた めの酵素類も、 同様な方法で該タンパク質を精製し、 本発明の反応系に加えるこ とがより好ましい。
塩類としては、 転写 ·翻訳に必須な陽イオン ·陰イオンを含むことが必須であ り、 グルタミン酸カリウム、 塩化アンモニゥム、 酢酸マグネシウム、 塩化カルシ ゥム等が通常使用される。 なお、 上記以外にも適宜選択して使用できることは言 うまでもない。 水はイオンや微生物類、 酵素類を含まないもので、 例えばミリポ ァ社製のミリ Q水製造装置によって製造される水や市販の純水を挙げることがで 5 008571 きる。
リボソームは、 ペプチド合成の場であり、 mRNA と結合し、 アミノアシル tRNA を A部位に、 フオルミルメチォニル tRNA又はべプチジル tRNAを P部位にそれぞ れ配位してぺプチド結合を形成させる反応を行う（Science289 : 920-930 (2000) )。 本発明においては、 かかる機能を有するものであれば、 由来を問わず使用するこ とが可能である。 例えば、 大腸菌由来のリボソームが使用されるが、 真核細胞由 来のものも使用できる。 本発明において用いられるリポソームの好ましい例は、 大腸菌由来のものであり、 例えば大腸菌 A19株、 MRE600株から得られるものを挙 げることができる。
本発明の in vitroタンパク質合成系で使用される開始因子類には、翻訳開始複 合体の形成に必須であるか、 又は、 これを著しく促進する因子であり、 大腸菌由 来 の も の と し て 、 IF1 、 IF2 及 び IF3 が 知 ら れ て い る (Biochemistry29 : 5881- 5889 (1990) )。 開始因子 IF3は、 翻訳の開始に必要な段階 である、 70S リボソームの 30Sサブユニットと 50Sサブユニットへの解離を促進 し、また、翻訳開始複合体の形成の際に、 フオルミルメチォニル tRNA以外の tRNA の P部位への揷入を阻害する。開始因子 IF2は、 フオルミルメチォニル tRNAと結 合し、 30Sリボソームサブュニットの P部位へフオルミルメチォニル tRMを運ぴ、 翻訳開始複合体を形成する。開始因子 IF1は開始因子 IF2， IF3の機能を促進する。 本発明において用いられる開始因子の好ましい例は、 大腸菌由来のものであり、 例えば大腸菌 K12株から得られるものを挙げることができるが、 真核細胞由来の ものも使用できる。
延長因子 EF - Tuは、 GTP型と GDP型の 2種類があり、 GTP型はアミノアシル tRNA と結合してこれをリボソームの A部位へ運ぶ。 EF- Tuがリボソームから離れる際 に GTPが加水分解され、 GDP型へ転換する。 (EMB0J. 17： 7490-7497 (1998) ) 0 延長 因子 EF- Ts は、 EF- Tu ( GDP 型） に結合し、 GTP 型への転換を促進する
(ArchivesofBiochemistryandBiophysics348 : 157-162 (1997) ) o 延長因子 EF - Gは、 ぺプチド鎖伸長過程において、ぺプチド結合形成反応の後の転位（translocation) 反応を促進する（Nature Structure Biology 6 : 643- 647 (1999)， FEMS Microbiology
Reviews 23： 317-333 (1999) ) 0本発明において用いられる延長因子の好ましい例は、 大腸菌由来のものであり、 例えば大腸菌 K12株から得られるものを挙げることが できるが、 真核細胞由来のものも使用できる。
終結因子は蛋白質合成の終結、 翻訳されたペプチド鎖の解離、 更に次の mRNA の翻訳開始へのリボソームの再生に必須である。 これを含まない反応系でタンパ ク合成を行った場合は、 終始コドンの手前で反応が止まり、 リボソーム ·ぺプチ ド - mRNAの安定な 3者複合体の形成が容易に行われる （ポリソームディスプレイ 法、 リボソームディスプレイ法、 インビトロバイラス法）。 またペプチド鎖への非 天然アミノ酸の導入は、 RF1及び/又は RF2を反応系から省くことにより行われる。 即ち、 RF1を省いた場合は UAGコ ドン、 RF2を省いた場合は UGAコ ドンへの非天然 アミノ酸の導入が高い効率で行われる。
終結因子 RF1及ぴ RF2は、 リボソームの A部位に終止コドン （UAA， UAG, UGA) が 来た時、 A部位に入ってぺプチジル tRNA (P部位にある） からのべプチド鎖の解 離を促進する。 RF1は終止コドンのうち UAA， UAGを認識し、 RF2は UAA, UGAを認識 する。 終結因子 RF3は、 RF1，RF2によるぺプチド鎖の解離反応後の、 RF1， RF2のリ ポソームからの解離を促進する。 リボソーム再生因子 （RRF) は、 蛋白質合成の停 止後、 P部位に残っている tRNAの脱離と、 次の蛋白質合成へのリボソームの再生 を促進する。 本発明においては、. RRF も終結因子類の一つとして取扱うことにす る。 なお、 終結因子 RF1， RF2, RF3 及び RRF の機能については、 EMB0J. 16 : 4126-4133 (1997)、 EMB0J. 16 : 4134- 4141 (1997)に解説されている。 本発 明において用いられる終結因子の好ましい例は、 大腸菌由来のものであり、 例え ば大腸菌 K12株から得られるものを挙げることができるが、 真核細胞由来のもの も使用できる。
アミノアシル t RNAシンテターゼは、 ATPの存在下でァミノ酸と tRNAを共有結 合させ、 アミノアシル tRNAを合成する酵素である（RNA 3 : 954 - 960 (1997)，蛋白質 核酸酵素 39 : 1215 - 1225 (1994) )。 本発明において用いられるアミノアシル t RNA シンテターゼの好ましい例は、 大腸菌由来のものであり、 例えば大腸菌 K12株か ら得られるものを挙げることができるが、 真核細胞由来のものも使用できる。 ま た、 非天然アミノ酸を認識する人工アミノアシル t RNA シンテターゼ （特許
2668701号） を用いることもできる。 JP2005/008571 メチォニル t RNA トランスフオルミラーゼ （MTF) は原核生物におけるタンパク 質合成においてメチォニル tRNAのァミノ基にフオルミル基がついた N -フオルミ ルメチォ-ル（fMet) t RNAを合成する酵素である。 即ち、 メチォニル tRNA トラン スフオルミラーゼは、 N10 - フオルミルテ トラヒ ドロ葉酸のフオルミル基を、開始 コドンに対応するメチォニル tRNA の N 末端に転移させ、 fMet-tRNA にする (Proc. Natl. Acad. Sci. USA96： 875-880 (1999) )。 付加されたフオルミル基は開始因 子 IF2により認識され、 タンパク質合成の開始シグナルとして作用する。 真核生 物の細胞質における合成系には MTFはないが、 真核生物のミ トコンドリア及ぴ葉 緑体における合成系には存在する。 本発明において用いられる MTFの好ましい例 は、 大腸菌由来のものであり、 例えば大腸菌 K12株から得られるものである。
RNAポリメラーゼは、 DNA配列を RNAに転写する酵素であり、様々な生物に存在 することが知られている。 その一例として、 T7ファージ由来の、 T7RNAポリメラ ーゼを挙げることができ、このポリメラーゼは T7プロモーターと呼ばれる特異的 な DNA配列に結合してその下流の DNA配列を RNAに転写する酵素である。 本発明 者等は、 T7RNAポリメラーゼの N末端にヒスタグを付加して、 融合タンパク質と して大腸菌 BL21株において大量発現を行い、ニッケルカラムを用いるァフィニテ ィクロマトグラフィーにより精製を行った。 本発明においては、 T7RNA ポリメラ ーゼ以外にも種々の RNAポリメラーゼを用いることができる。 例えば、 T3RNAポ リメラーゼゃ SP6RNAポリメラーゼが市販されており、これ等を利用することもで さる。
アミノ酸類としては天然型又は非天然型アミノ酸、 天然型又は非天然型ァミノ 酸でチャージされた tRNAが挙げられる。 非天然アミノ酸でチャージされた tRNA を用いることで、 タンパク質に非天然アミノ酸を導入することが可能となる。 tRNA類としては、 大腸菌、 酵母等の細胞から精製した tRNAを用いることがで きる。またアンチコドンやその他の塩基を任意に変更した人工 tRNAも用いること ができる （J. Am. Chem. Soc. 121 : 34-40 (1996)， Nature Biotech. 20： 177-182
(2002) )。 例えば、 CUAをアンチコドンとして持つ tRNAに非天然のアミノ酸をチ ヤージすることで、 本来終止コドンである UAGコドンを非天然アミノ酸に翻訳す ることが可能である。 この方法ではタンパク質に点特異的に非天然アミノ酸を導 入することができる。
その他、 緩衝液としては、 リン酸カリウム緩衝液、 （pH7. 3)が通常使用される。
[ 1 - 2 ジスルフィ ド結合形成に影響を与える物質]
ジスルフィド結合形成に影響を与える物質の例として、 ジスルフィ ド結合の酸 化還元を触媒する酵素である酸化還元酵素及ぴノ又はジスルフィ ド結合の酸化還 元状態を調節する試薬である酸化還元試薬が挙げられる。 より具体的には、 ジス ルフィ ド結合形成に影響を与える酵素及び又は試薬として、 （ィ）酸化還元を触媒 する酵素： ダルタチオンレダクターゼ類、 チォレドキシンレダクターゼ類、 プロ ティンジスルフィ ドイソメラーゼ類、 ジスルフィ ドインターチェインジタンパク 質類、 チォレドキシン様タンパク質等のタンパク質及び Z又は （口） 酸化還元状 態を調節する試薬：還元型ダルタチオン、 酸化型ダルタチオン、 DTT、 2-メルカプ トエタノール及びチォレドキシン等の低分子化合物を例示することができる。 本 発明における酸化還元試薬とはジスルフィ ドを還元しチオールにしたり、 逆にチ オールを酸化しジスルフィ ドを形成させることのできる試薬を言う。
ジスルフィド結合形成に影響を与える物質の例としての、（ィ）酸化還元酵素（酸 化還元を触媒する酵素） 及び Z又は (口） 酸化還元試薬 （酸化還元状態を調節す る試薬） は、 タンパク質のジスルフイ ド結合の架橋を促進 ·調整する酵素類及ぴ 又はその基質を用いることが望ましい。 なお、 （ィ） 酸化還元を触媒する酵素及 び/又は （口）酸化還元状態を調節する試薬は、 必ずしも翻訳反応中に加える必要 はなく、 翻訳終了後に加えても良い。 翻訳終了後に添加する場合には、 添加後更 に数十分から 1時間程度 37°Cに静置するのが好ましい。
酸化還元状態を調節する試薬として、 DTTを用いる場合は濃度が 0〜1 mM、 好 適には 0. 001 〜0. 5 mMであることが好ましい。 更に好適には、 0. 060〜0. 5 mM であることが好ましい。
酸化還元状態を調節する試薬として、 酸化型ダルタチオンを用いる場合は濃度 が 0〜8 mM、 好適には、 0. ：!〜 4 mMであることが好ましい。 更に好適には 1 〜 4 mMであることが好ましい。
前記タンパク質の合成方法おいて、 ジスルフィ ドインターチェインジタンパク 質類は DsbA及び/又は DsbCであることが好ましい。 プロテインジスルフィ ドイソメラーゼ（EC 5. 3. 4. 1. )は真核生物の小胞体内膜 に存在する約 55kDaのジスルフィ ド結合の形成や異性化 ·還元反応を触媒する酵 素であり、 シャペロン様の活性も持つと言われている。 このタンパク質は前述の 通り、 生物から精製し、 成分として用いることもできるが、 組換え生産されたも のを用いてもよい。 ゥシの肝臓から精製したプロテインジスルフィ ドイソメラー ゼ（PIR データベース ァクセッション番号 ISB0SS)、酵母のプロテインジスノレフ ィ ドイソメラーゼ遺伝子を大腸菌に組換え発現させ、 精製したタンパク質等を用 いることができる。
その他にプロティンジスルフィ ドィソメラーゼ類として下記のタンパク質知ら れており、 本発明のプロテインジスルフィ ドイソメラーゼ質類として使用可能で ある。
ヒ 卜の protein disulfide - isomerase PIRテータベース ァクセッションナンノ ー ISHUSS
ヒ 卜の protein disulfide isomerase related protein enBank 7クセッンヨン ナンパ一 4758304
酵母の protein disulfide isomerase homolog PIR テータベース A44483 ジスノレフィ ドインターチェインジタンパク質類は、 ジスノレフィ ドインターチェ インジタンパク質 A、 B、 C、 D (DsbA, B， C， D) の 4種のタンパク質が大腸菌等 で知られている。 DsbAは、 21kDaのチォレドキシン様フォールド構造を持つ、 ジ スルフィ ド結合の形成を触媒すると考えられている酵素である。 DsbBは 4個の膜 貫通部位と、 2個のペリプラズムドメインを持つ 20 k Da のタンパク質で、 DsbA を酸化型に維持すると言われている。 DsbCはホモ 2量体を形成するペリプラズム タンパク質であり、 チォレドキシン様のフォールドを持ち、 主にジスルフイ ド結 合の異性化を担う酵素であると言われているが、 他にシャペロンとしての働きも あると考えられている。 DsbDは分子量 59kDaのタンパク質で 2つのペリプラズム ドメイン、 8個の膜貫通領域からなるタンパク質で、 DsbCの活性中心のシスティ ンを還元型に維持する働きを持っていると考えられる。
ジスルフィ ドインターチェインジタンパク質類として下記のタンパク質が知ら れており、 本発明のジスルフィ ドインターチヱインジタンパク質類として使用可 能である。
E. coliの DsbA SWISS - PROTprotein database Accession P24991
E. coli の DsbC SWISS-PROTprotein database Accession P21892
Salmonella typhimurium (D protein disulfide - isomerase dsbA homolog PIRデ ータベース ァクセッションナンパ、一 S32895
Neisseria meningitidisの thiol-disulfide interchange protein dsbA homolog NMB0278 PIRデータベース ァクセッションナンパ一 C81217
Caenorhabditis elegansの rotein disulphide isomerase isoform I Gene Bank ァクセッションナンパ一 AAB94647
Datisca glomerataの protein disulfide isomerase homolog -ene Bank ァクセ ッションナンパ一 AAD28260
これらジスルフィ ドインタージヱインジタンパク質類は前述の通り、 生物から 精製し、 成分として用いることもできるが、 組換え生産されたものを用いてもよ い。
酸化還元酵素としてプロテインジスルフイ ドイソメラーゼ （P D I ) を用いる 場合、 濃度が 0 〜； 10 ； Μであることが好ましい。 好適には 0.001〜5 μΜで あることが好ましい。更に好適には 0.001 /ζΜ〜2 であることが好ましい。 酸 化還元酵素としてジスルフィ ドインターチヱインジタンパクを用いた場合、 0 μΜ 〜10 であることが好ましい。好適には 0.01から 10 μΜであることが好まし い。 更に好適には 0.1 μΜ〜10 ^ Μであることが好ましい。
なお、 グルタチオンレダクターゼ類、 チォレドキシンレダクターゼ類について は、 できるだけ含まないことが望ましく、 タンパク質合成系を構成する成分にお けるチォレドキシンレダクターゼ及び/又はグルタチオンレダクターゼの含量が 100 ng/ml以下であることが好ましい。
また、 上記された各成分の純度については、 測定法を以下に例示する。
上記した開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 メチォ-ル tRNA トランスフォ ルミラーゼ類、 並びに DsbA及ぴ DsbCなどタンパク質からなる成分は、 例えば、 前記した、 His tagとニッケルカラムを利用した、 His tagを付したタンパク質成 分の精製方法により精製した後、 SDS- PAGEで目的タンパク質を確認し、 各レーン 2005/008571 の泳動パターンをデンシトメ一ターで読み取って算出することができる。
精製したリボソームは、 ショ糖密度勾配による分析で純度を測定できる。
tRNA類、 アミノ酸類、 リボヌクレオチド 3 リン酸類及び FD、 その他緩衝液、 DTT,酸化型ダルタチオンなど通常試薬として市販されている試薬は、 市販試薬の 純度で使用可能である。 なお、 市販の試薬はいずれも、 純度はいずれも 8 0 %以 上であった。 .
[試験方法、 及びそれを利用した合成方法]
本発明の試験方法は、 上記した [分子間又は分子内にジスルフィ ド結合を有す るタンパク質合成方法] の反応系を用いることができる。
本発明の酸化還元酵素、 酸化還元試薬濃度及ぴ 1個のジスルフィ ド結合による 架橋形成が可能でその架橋形成様式により活性が支配される 1または複数のぺプ チド鎖からなる合成されたタンパク質の活性の 3者の相関を測定する試験方法は、 次の a)〜d)のから成る反応系、 具体的には、 （1 ) &)，13)及ぴ0 )、 （2 ) a)、 b)お ょぴ d )、 または （3 ) a)、 b )、 c ) 及び d ) からなる反応系によることができ る。
a) 1または複数の錄型核酸、
b) 存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、 铸型核酸 を添加することにより铸型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タ ンパク質合成反応基本試薬、
c) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸 化還元酵素、
d) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節す る酸化還元試薬。
以上の反応系で合成されたタンパク質の活性を測定し、添加した c)酸化還元酵 素及ぴ d)酸化還元試薬との相関を求める。 ここで測定されるタンパク質の活性は 酵素活性に限らず、例えばレセプターとタンパク質の結合活性、細胞の増殖活性、 これらの比活性等を含む。
より具体的には、 まず濃度を様々に変化させた c ) 酸化還元酵素及び d ) 酸化 JP2005/008571 還元試薬を準備する。 その際、 C ) 及び d ) はそれぞれ単独の物質でも良いが、 複数の物質の混合物であっても良い。 このような酸化還元酵素の例として、 プロ ティンジスルフィ ドイソメラーゼ類、 ジスルフィ ドインターチェインジタンパク 質類、或はそのホモログ酵素等を例示することができる。酸化還元試薬としては、
DTT、 GSSG、 GSH、 チォレドキシン等を例示することができる。 続いて、 タンパク 質の合成反応を開始するが、 c ) 及ぴ d ) はタンパク質の合成反応の最初に加え ても良いが、 合成反応の途中で加えても良く、 更に合成反応が終了してから加え ても良い。 合成反応が終了してから加える場合には、 添加後更に数十分から 1時 間程度 37°Cに静置するのが好ましい。 このようにして合成したそれぞれの場合に ついて、 反応液中の合成されたタンパク質の活性を測定する。 ここで合成される タンパク質は分子内及び/又は分子間に少なくとも 1つのジスルフィ ド結合の架 橋形成が可能であるタンパク質であれば特に制限はなく、 複数のタンパク質を同 じ反応液中で合成しヘテロオリゴマ一等を形成させ活性を測定することも可能で ある。
このようにして、 タンパク質の活性と、 c ) 酸化還元酵素及び/又は d ) 酸化 還元試薬の濃度との相関関係を明らかにすることができる。
こうして得た、 相関関係を利用し、 予め決められた値の活性' （所望の活性値） を得るために必要な c ) 酸化還元酵素及び 又は d ) 酸化還元試薬の濃度を決定 し、当該所望の活性を奏する濃度になるように b)タンパク質合成反応基本試薬に c ) 酸化還元酵素及び/又は d ) 酸化還元試薬を添加した、 更に a) 目的タンパ ク質をコ一ドする鎵型核酸を添加した反応系で、 効率的に目的タンパク質を生産 することができる。
以下に、 実施例により本発明を更に詳細に説明するが、 もとよりこれらは例示 であり、 本発明はこれらに限定されるものではない。
実施例 1
リボソーム調製
対数増殖期中期の E. coli A19株の細胞 300 gをアルミナ破砕した。 破砕した 細胞を緩衝液 A (pH7. 6の 10 mM へぺス-水酸化力リゥム（HEPES- K0H)、 10 mM塩化 マグネシウム（MgCl2)、 50 mM塩化カリゥム（KC1)、 1 mM DTTに懸濁し、 アルミナ 08571 と細胞破碎物を遠心分離 （30，000 g、 4 °Cで 1時間） して除いた。 得られた上清 画分に終濃度が 1 g/mlになるようにデォキシリボンクレアーゼ（DNase)を加え た後、 遠心 （100, 000 g， 4 °Cで 4時間） した。 ペレットを緩衝液 Aに懸濁しリボ ソームの粗抽出液とした。 このリボソーム粗抽出液を 6〜3 6 % (w/v) のショ糖 密度勾配遠心にかけ，図 1に示した画分を分取した。 このリポソ一ム画分を 100, 000 g で遠心分離し、 そのペレツトをリボソーム緩衝液（pH7. 6 の 20 mM HEPES-K0H、 6 mM MgOAc、 30 mM NH4C1、 7 mM j3 -メルカプトエタノール (mercaptoethanol) )に懸濁し精製リボソームを調製した。 精製したリボソームの —部を 6〜3 6 % ( w/v) のショ糖密度勾配で分析したところ、 単一のピークを 形成し、 その純度は 90%以上であった。
実施例 2
アミノアシル t RNA シンテターゼ（ARS)高発現用プラスミ ドの構築と形質転換体 の作成
E. coli A19株より抽出したゲノムを鎳型としてァラ -ル t RNAシンテターゼを コードする遺伝子配列を PCR法により増幅し、 5 端に Sphl、 3 ' 端に Hindlll が認識する配列を持った DNA断片を得た。 得られた DNA断片をあらかじめ Sphl 及ぴ Hindlll で切断したプラスミ ド pQE30 (QIAGEN社製） に挿入し、 N末端に His- Tag が融合したァラエル t RNA シンテターゼを高発現させるためのベクター を得た。 得られたベクターで E. coli BL21/pREP4を形質転換した。 その他の ARS を高発現するベクターも同様の手法で構築した。 表 1に使用したベクター、 制限 酵素、 His- Tagの位置を示す。 なお、 表 1におけるプラスミ ドの pQEシリーズは E. coli BL21/pREP 4の、 pET シリーズは Ε· col i BL21/DE3の形質転換にそれぞ れ用いられた。 表 1
Figure imgf000025_0001
k : REは ifi¾醉 を ^ te る
実施例 3
その他のタンパク質因子 '酵素の高発現プラスミ ドの構築
実施例 2と同様な方法で次に示すタンパク質因子 .酵素の高発現プラスミ ドを 構築した。 MTF、 T7 RM ポリメラーゼ、 IF1、 IF2、 IF3、 EF-G, EF-Tu, EF-Ts 及ぴ
RFlo なお、 表 1に記載していないタンパク質因子'酵素についても同様な方法で プラスミ ドを構築した。 なお、 ベクターは pQEシリーズまたは PETシリーズを用 い、 E. coli BL21/pREP 4または E. col i BL21/DE3の形質転換にそれぞれ用いられ た。
実施例 4
タンパク質因子 ·酵素の高発現と精製
His - Tagが付されたァラニル t RNAシンテタ一ゼを高発現させるために、実施例
2で得られた形質転換体 E. coli BL21/pREP4細胞を 6 リ ッ トルの LB培地で 660 nm の吸光度が 0. 7になるまで培養した。 この培養液に終濃度が 0. I mMになるように イソプロピル一 1一チォー j3— D—ガラクトシド（IPTG)を添加し、 更に 3 7 °Cで
4時間培養した。 この培養液を遠心分離し、 得られた細胞を懸濁緩衝液（pH7. 6の
50 mM HEPES- K0H、 1 M NH4C1、 10 mM MgCl2、 0. 3 mg/ml 卵白リゾチーム、 0. 1%
TritonX_100、 0. 2 mM フヱニルメタンスルホ-ルフルオリ ド（PMSF)、 6 mM jS
- mercaptoethanol)に懸濁した。 この懸濁液を超音波処理し、細胞を破壌した。 超 音波処理した懸濁液を遠心分離（100，000g， 4 °Cで 1時間） し、細胞破砕物を除い た。 得られた上清画分を Ni2+でプレチャージされた 10 mlの Hi- Trap chelating カラム （フアルマシア社製） に供し、 10 mMのィミダゾールを含む 100 ml の HT 緩衝液（pH7. 6の 50 mM HEPES- K0H、 1M NH4C1、 10 mM MgCl2)で洗浄した。 HT緩衝 液に含まれるイミダゾール濃度を 10 から 400 mM まで直線的に勾配をつけて、
His- Tagが付されたァラュル t RNAシンテタ一ゼをカラムから溶出した。精製され たタンパク質を含む画分を合わせて、 Stock緩衝液（pH7. 6の 50 mM HEPES- K0H、
100 mM KC1、 10 mM MgCl2、 30% グリセロール （ glycerol) )で透析した。 精製し た His- Tag が付されたァラニル t RNA シンテターゼの濃度は Protein Assay
Kit (Bio- Rad社製）を用いてゥシ血清アルブミン （BSA) を基準に作成した検量線 から算出した。 精製した His - Tagが付されたァラニル t RNAシンテターゼは 1 ml ずつ小分けして液体窒素で急冷凍した後一 8 0 °Cで保存した。 その他の His- Tag が付されたァラ-ル tRNAシンテターゼ （AlaRS)、 アルギェン tRNAシンテターゼ
(ArgRS)、 ァスパラギン tRNAシンテターゼ（AsnRS)、 ァスパラギン酸 tRNAシンテ ターゼ（AspRS)、 システィン tRNAシンテターゼ（CysRS；)、 グルタミン tRNAシンテ ターゼ（GlnRS)及ぴグルタミン酸 tRNA シンテターゼ（GluRS)も同様の手法で精製 を行った。 His - Tagが付された因子の 12%SDS- PAGEによる分離（クマシ一プリリ 5 008571 アントブルーで染色）を図 2に示す。 デンシトメ一ターで純度を算出したところ、 いずれの因子も、 純度は 90%以上であった。 なお、 図 2に示していない表 1のそ の他の因子 .酵素も、 SDS- PAGEによる分離し、 デンシトメ一ターで純度を算出す る同様な方法で調べたこところ、 いずれも純度は 90%以上であった。
実施例 5
翻訳実験 （一般的方法）
タンパク質合成反応基本試薬 50 1あたりの組成は以下のとおりである。 2 πιΜ ATP, 2 m GTP. l mM CTP, 1 mM UTP, 10 mM クレアチンリン酸（creatine phosphate)、 2. 8 A 260 unit tRNA mix、 0. 5 gFD、 0. 1 mM各アミノ酸、 9 mM酢酸マグネシゥ ム、 pH 7. 3の 5 mM リン酸カリゥム、 95 mM グルタミン酸カリゥム、 5 mM塩化ァ ンモニゥム、 0. 5 mM塩ィ匕カルシウム、 1 mM スぺノレミジン（spermidine)、 8 mM プ トレツシン（putrescine) , 12 pmol リボソーム、 1 β g IF1、 2 IF2、 0. 75 μ g IF3、 1 μ g EF-G, 2 μ g EF-TuN 1 g EF— Ts、 0. 5 μ g RF1, 0. 5 z g RF3、 0. 5 μ g RRF, 30-300 units各 ARS及び MTF、 0. 2 / g クレアチンキナーゼ（CK； creatine kinase) , 0. 15 gミオキナーゼ （MK; myokinase；)、 0. 054 μ g ヌクレオシドニリ ン酸キナーゼ (NDK; nucleoside diphosphate kinaseリ， 1. 78 units PPiase及ぴ 0. 5 T7 RNA ポリメラーゼ。 このタンパク質合成反応基本試薬に、 1 pmol の鎳型 DNAを加え、 37°Cで 1時間反応を行った。
なお、 反応後、 リボソームを除去する必要がある時は、 100 kDa 以下の物質を 通す限外ろ過膜に通し、 リボソームを除去した。
なお、 上記組成のうち、 リボソーム及び表 1記載のものは、 実施例 1及び実施 例 4で調製され、純度が測定された。その他の成分は市販の精製試薬を使用した。 また、本組成を以下の実施例 6から 12において利用する場合も、表 1に記載の もの、 リボソーム、 DsbA及ぴ DsbCは、 実施例 1, 4及ぴ 13で調製され純度が測定 された。 それ以外の成分は市販の精製試薬を利用した。
実施例 6
ヒ トリゾチームの合成
リゾチームは本来分子内に 4本のジスルフィ ド結合を持つタンパク質であり、
4つのうち 2つ以上のジスルフイ ド結合が架橋しなければ活性を示さないことが P T/JP2005/008571 報告されており (J Biol Chem 251： 3147-3153 (1976) )、 古くから構造と活性の相 関を調べるためのモデルタンパク質として広く使用されている。 ここでは、 本発 明による方法及び従来法でヒ トリゾチームを合成しタンパク質の合成量と比活性 を調べた。
ヒ トリゾテームの cDNAクローン (human gene collection, Stratagene社リ よ り、次の 2つのプライマーを用い PCR法により約 0. 42 kbpの成熟型ヒ トリゾチー ムに相当する遺伝子を増幅した。
フ ォ ヮ 一 ド プ ラ イ マ 一 の 配 列 は 次 の 通 り： AAGGAGATATACCAATGAAGGTCTTTGAAAGGTGTG。
リバースプライマーの配列は次の通り： GGATTAGTTATTCATTACACTCCACAACCTTGAACATC 次 に
AGGAGATATACCA の配列を持つフォヮ一ドプライマ一及び上記リパースプライマー を用い、 PCR法により、 T7プロモーター領域を含む約 0. 51 kbpの铸型 DNAを増幅 した。 铸型 DNAの配列を配列表、 配列番号 4に示した。
実施例 5に記載したタンパク質合成反応基本試薬 （本発明による方法） 及びそ の反応試薬に 1 mM DTTを添加した反応液 50 μ 1 (従来法） に、 作成した鎳型 DNA 1 pmolをそれぞれ添加し、 タンパク質合成反応を行った。
合成されたタンパク質は SDS - PAGEで分離し、 SYPR0 Orange (アマシャムファノレ マシア社製）で染色した。分子量 17000のヒ トリゾチームのバンドを、既知濃度の
BSA と比較し、 合成されたヒ トリゾチームの濃度を求めた。 ヒ トリゾチームの活 性は、 Micrococcus luteus ATCC 4698株の凍結乾燥菌末 （SIGMA社製） を用い、
450nmの吸光度を 1分当たり 0. 001低下させる量を 1 unitとして測定した（Imoto
T.， Johnson L. N.， North A. T. C. , Phillips D. C. , Rupley J. A. , The Enzymes, 3rd ed. , 7, 665-868 (1972) )。 図 3に合成されたタンパク質の電気泳動写真を、 図 4 に比活性をそれぞれ示した。 図 3及び図 4から明らかなように、 従来法では電気 泳動で合成されたタンパク質は確認できるものの活性は全く認められないが、 本 発明による方法では約 300 units/mgの比活性が認められ、本発明による方法でジ スルフィ ド結合を本来有するタンパク質が正しくフォールディングされることが 571 分かった。 なお、 ジスルフィ ド結合を持つほかのタンパク質についても調べたと ころ、 ほぼ同様な結果が得られた。
実施例 7
マウスインターロイキン 6 (mIL6)の合成
マウス cDNAラプラリ一を用い実施例 6と同様の方法で mIL6を作成した。また、 大腸菌ゲノム DNA を用い実施例 6と同様の方法で大腸菌ジヒ ドロ葉酸還元酵素 (DHFR)の鎳型 DNAを作成した。実施例 5のタンパク質合成反応基本試薬に ImM の DTTを添加した反応溶液 （従来法）、 実施例 5のタンパク質合成反応基本試薬、 実 施例 5の基本試薬に最終濃度 2， 4, 8 mM の GSSGをそれぞれ添加した計 5種類の 反応溶液を用意し、 そのそれぞれに l pmolの铸型 DNAを添加し、 それぞれのタン パク質を合成した。 DHFRを合成した場合は、 合成後に限外ろ過膜を通過した溶液 を、 mIL6 を合成した場合は合成反応液をそれぞれ SDS-PAGE に供し、 SYPRO Red によりタンパク質を蛍光染色した。 染色パターンをフルォロイメージヤーで解析 し、 mIL6 と DHFRの染色濃度より、 溶液中のタンパク質の量を計算した。 図 5に 求めた mIL6のタンパク質の量を、図 6に DHFRのタンパク質の量をそれぞれ示し た。 図 5及び図 6から明らかなように、 分子内にジスルフイ ド結合を持たない DHFRを合成した場合は従来法による生産量が最も多く、本発明による方法ではタ ンパク質合成量が低下しているが、 逆に分子内にジスルフィ ド結合を持つ mIL6 を合成した場合には、 従来法よりも、 本発明による方法が生産されたタンパク質 の量が多いことが判明した。 なお、 mIL6の錶型 DNAに代えて、 他のジス フィ ド結合を持つタンパク質の鎵型 DNAを用いて同じ実験を行ったが、 ほぼ同様の結 果が得られた。
実施例 8
プロテインジスルフイ ドイソメラーゼ （PDI) の影響
実施例 5のタンパク質合成反応基本試薬に 2 mM の GSSGを添加した反応溶液を 用意した。 この反応溶液を 4本用意した。 この反応溶液に更にゥシ由来 PDI (タ カラバイオ社製）を最終濃度 0 M , 0. 0325 Μ, 0. 13 μ Μ, 0. 52 μ Μとなるよう にそれぞれ添加した。 これらの反応溶液それぞれ 50 μ ΐにヒ トリゾチームの鎵型
DNAを l pmol添加しタンパク質を合成した。 実施例 6と同様の方法でリゾチーム の比活性を求めた。 図 7には反応系に添加した PDIの濃度と合成されたヒ トリゾ チームの比活性の関係を示した。 この図から明らかなように、 PDIを 0. 0325 μ Μ 以上添加することで、 ジスルフィ ド結合を持つタンパク質の比活性がより高くな ることが分かった。 また、 本発明の方法を使って、 PDI の活性が測定できること が分かった。 なお、 ゥシの PDIに代えて他種の PDI及びジスルフイ ドインターチ エインジタンパク質類を使った場合も、 ほぼ同様な結果が得られた。
実施例 9
ジチオスレィ トール （DTT) 濃度の影響
実施例 5のタンパク質合成反応基本試薬に 0. 13 β Μの PDIを添加した反応溶液 を 6本作成した。 この反応溶液に更に最終濃度 1000 μ Μ , 500 Μ, 250 μ Μ, 125 μ Μ, 62. 5 Μ, 0 Μの DTTをそれぞれ添加した。 これらの反応溶液それぞれ 50 1にヒ トリゾチームの铸型 DNAを l pmol添加しタンパク質を合成した。 2実施 例 6と同様の方法でリゾチームの活性を求めた。 図 8に結果を示した。 この図か ら明らかなように、 DTTの濃度が 125 μ Μ以下であれば、 リゾチームが強い活性 を示すことが明らかとなった。
実施例 1 0
アル力リフォスファターゼの合成
アル力リフォスファターゼは分子内に 2つのジスルフィ ド結合を持つタンパク 質で、 ジスルフィ ド結合の形成とその酵素活性との関係について古くから良く調 ベられているモデルタンパク質である。 ここではアル力リフォスファタ一ゼを合 成した。
大腸菌ゲノム DNA及び大腸菌アル力リフォスファターゼに特異的な PCRプライ マーを用いて、 実施例 6と同様の方法で大腸菌アル力リフォスファタ一ゼの鎵型 DNAを作成した。実施例 5のタンパク質反応基本試薬に 1 mM DTT及び 0. 13 ^ M PDI を添加した反応溶液を 5本用意し、 0, 1， 2， 3, 4 mMの GSSGをそれぞれ添加し た。
この反応溶液それぞれ 50 ^ 1にアル力リフォスファターゼ遺伝子の鎵型 DNAを
1 pmol添加しタンパク質を合成した。 合成されたタンパク質濃度は実施例 5と同 様の方法により求めた。 合成されたアルカリフォスファターゼは p- ni trophenyl T JP2005/008571 phosphate di sodium saltを基質として用い、 405 nmの吸光度を測定することで 活性を測定した （Biochim Biophys Acta. 258： 178-87 (1972) Q 図 9にァノレカリフ ォスファターゼの相対活性を示した。 図 9から明らかなように、 アルカリフォス ファターゼは従来法、 すなわち 1 mM DTT及び 0. 13 μ M PDIを添加したタンパク 質反応基本試薬では全く活性を示さないのに対し、 本発明による方法，すなわち GSSGを 1 mMまたは 2 mM添加した反応溶液では活性が認められた。 DTTが系に 1 mM 存在していても、 アルカリフォスファターゼが活性を示し、 合成されたタンパク 質が正しくフォールデイングしていることが明らかとなった。 また、 実施例 5の 反応液に 1000 μ Μ, 500 μ Μ, 250 μ Μ, 125 μ Μ, 0 Ai Μの DTTを添加した反応液 をそれぞれ作成した。 上記と同様に铸型 DNAを添加し、 タンパク質を合成後、 ァ ルカリフォスファターゼの活性を測定した。 その結果を図 1 0に示した。 PDI 非 存在下で、 DTTのみ濃度を変化させたところ、 500 /_t M以下でアル力リフォスファ ターゼが活性を示すことが明らかとなった。
実施例 1 1
DsbCの影響
大腸菌の DsbCを PCRにより増幅し、 5 ' 端に BamHI、 3 ' 端に Hindll lが認識 する配列を持った DNA断片を得た点を除き、実施例 2と同様の方法にて dsbCを高 発現させるベクターを構築し、 得られたベクターで E. col i BL21/ p REP4を形質 転換した。 実施例 4と同様な方法で、精製した DsbCを得た。 タンパク質の純度は 90%以上であった。 実施例 5のタンパク質合成基本試薬に 1 mM DTT及び 2 mMGSSG を添加した反応溶液 50 1を 3本作成した。 これら反応溶液にそれぞれ 0, 0, 0. 5 μ Μの DsbC及ぴ 0， 1， 1 pmolの実施例 6のヒ トリゾチーム遺伝子の铸型 DNAをそ れぞれ添加した。 実施例 6と同様の方法で合成されたタンパク質の量とリゾチー ムの活性を測定した。図 1 1に比活性を示した。図 1 1から明らかなように、 DsbC を添加することで、 リゾチームの比活性は大幅に上昇するが明らかとなった。 な お、 DsbCに代えて、他のジスルフィ ドインターチヱインジタンパク質を用いた場 合、 及び複数種類のジスルフィ ドインターチェインジタンパク質を同時に用いた 場合もほぼ同様な結果が得られた。
実施例 1 2 T/JP2005/008571 本発明のタンパク質合成基本試薬と従来の細胞抽出液との比較
大腸菌の細胞抽出液を使う in vitro タンパク質合成系（Rapid Translation System 100； 口ッシュ社製）を用いて、 GSSGを最終濃度 0， 1, 2， 3 mMになるよ うに添加した点を除き、 製品の説明書に従い、 大腸菌のアルカリフォスファタ一 ゼを合成した。 また、 実施例 10と同様に、本発明の方法で大腸菌のアル力リフォ スファターゼを合成した。 合成したアルカリフォスファタ一ゼの比活性を図 1 2 に示した。 図 1 2から明らかなように、 大腸菌の細胞中抽出液を使うシステムで は、アル力リフォスファターゼの活性は GSSGをさまざまな濃度で添加しても全く 認められないのに対し、 本発明の合成方法では高い活性が認められた。
実施例 1 3
EF - Tu、 並びに DsbA'及び DsbCの純度の確認
EF-Tuに Hisタグをつけたタンパク質が発現している細胞を氷中で超音波処理 し、 ローデイングバッファー （300 mM NaCl, 50 mM NaH2P04, H 8. 0) に懸濁さ せ、 細胞の溶解物を遠心分離した （30, 000 g、 4°Cで 30分間）。 上記で得られた上 清に、 氷で冷やしたローデイングバッファーの中で平衡化した 50%の M2+- NTA slurry (Qiagen社製）を加えた。 4°Cで 1時間撹拌した。樹脂をカラムにロードし、 カラム容量の 20倍のローディングバッファーで、 4 °Cでカラムの洗浄を行った。 カラム容量の 20倍のローデイングバッファー （10 mM imidazole, pH 8· 0を含む） で、 4 °Cでカラムの洗浄を行った。カラム容量の 20倍のローデイングバッファー を用いて、 imidazoleの濃度勾配を 10から 250 mMになるように設定し、 カラム から目的タンパク質の溶出を行わせ、 l mlずつフラクションを集めった。 SDS- PAGE で目的タンパク質を確認した。 各レーンの泳動パターンをデンシトメ一ターで読 み取って純度を算出した。図 13に EF-Tuの溶出画分の電気泳動写真を示した。 レ 一ンの泳動パターンをデンシトメ一ターで読み取り、 純度 9 0 %以上の EF- Tu画 分を集めた。
また、図 14には、精製した DsbA (レーン 1)及び DsbC (レーン 2)の電気泳動写真 を示した。 いずれの酵素も、 純度は 90%以上であった。 2005/008571 産業上の利用可能性
[タンパク質合成方法]
本発明による方法では、 従来反応液から除去したほうが良いとされていた DTTを 数 Mカゝら更に I mM迄添加しても良く、 また DTTを全く添加しないことも可能で ある。
更に、 従来の DTTを除去した無細胞タンパク質合成系を用いる方法ではタンパ ク質にジスルフィ ド結合を形成させることができても、 該条件下ではタンパク質 自体の合成量は低下し目的とする活性を持ったタンパク質の合成効率は悪くなる と一般的に考えられていたが、 本発明の様に、 再構成タンパク質合成系を用いる とタンパク質の合成量は変わらないか、 むしろ増加する場合があり、 より効率的 にタンパク質を合成することが可能であった。
[酵素測定法]
本発明による活性測定法では、 基質はタンパク質合成反応によりジスルフィ ド 結合を持たない一本鎖のポリべプチドとして合成されるため還元し変性させるス テツプが必要なく、 合成と同時又は合成後に活性を測定する酵素を添加しフォー ルデイングされたタンパク質の活性や構造を指標とする。 そのため必要なステツ プと時間が従来法に比べて大幅に少ないという特徴がある。
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として 本明細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
1 . 下記 a)及び b)並びに c)及び/又は d)からなる反応系を用いた、分子間又 は分子内にジスルフイ ド結合を有するタンパク質合成方法。
a) 目的とするタンパク質をコードする 1または複数の铸型核酸、
b) 存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、 鎳型核酸 を添加することにより鐃型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タ ンパク質合成反応基本試薬、
c) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のジスルフィ ド結合の酸 化還元を触媒する酸化還元酵素、
d) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数のジスルフィ ド結合の酸 化還元状態を調節する酸化還元試薬。 .
2 . タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、開始因子類、延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォ-ル tRNA トランスフォノレ ミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リポヌクレオシド 3 リン酸類、 10 -フオルミ ル 5, 6， 7， 8 -テトラヒ ドロ葉酸 （F D')、 塩類、 およぴ水を含むことを特徴とする 請求項 1に記載のタンパク質合成方法。
3 . タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、開始因子類、延長因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォエル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リポヌクレオシド 3リン酸類、 10 -フオルミル 5， 6， 7, 8-テ トラヒ ドロ葉酸 （F D )、塩類、 および水を含むことを特徴とする請求項 1に記載 のタンパク質合成方法。
4 . 酸化還元酵素がタンパク質のジスルフィ ド結合の促進及び/又はジスルフ ィ ド結合の異性化を触媒する酵素であることを特徴とする請求項 1〜 3いずれか 1項に記載のタンパク質合成方法。
5 . 酸化還元酵素がプロテインジスルフイ ドイソメラーゼ （P D I ) 類また はジスルフィ ドインターチヱインジタンパク質類からなることを特徴とする請求 項 1〜 4のいずれか 1項に記載のタンパク質合成方法。
6 . プロテインジスルフイ ドイソメラーゼの濃度が 0 ί Μ〜； 10 Μであるこ とを特徴とする請求項 5記載のタンパク質合成方法。
7 . ジスルフイ ドインターチェインジタンパク質の濃度が 0 μ Μ〜10 μ Μで あることを特徴とする請求項 5または 6記載のタンパク質合成方法。
8 . 酸化還元試薬がジチオスレィトールまたは酸化型ダルタチオンであるこ とを特徴とする請求項 1〜 7のいずれかに記載のタンパク質合成方法。
9 . 酸化型ダルタチオン濃度が 0〜8πιΜであることを特徴とする請求項 8記 載のタンパク質合成方法。
1 0 . ジチオスレィ トールの濃度が 0〜1 mMである請求項 8または 9記載の タンパク質合成方法。
1 1 . 反応系に含まれるチォレドキシンレダクターゼ濃度が 100ng/mlを越え ないことを特徴とする請求項 1〜 1 0のいずれか 1項に記載のタンパク質合成方 法。
1 2 . 反応系に含まれるダルタチオンレダクタ一ゼ濃度が 100ng/mlを越えな いことを特徴とする請求項 1〜1 1のいずれか 1項に記載のタンパク質合成方法。
1 3 . 下記 a)及ぴ b )並びに c )及び 又は d ) からなる反応系において、 酸化還元酵素試薬濃度およぴ酸化還元試薬濃度を変化させて、 分子内または分子 間に少なくとも 1個のジスルフィ ド結合による架橋形成が可能でその架橋形成様 式により活性が支配される 1または複数のぺプチド鎖からなるタンパク質を合成 し、 該タンパク質の活性を測定することにより、 該タンパク質の活性、 酸化還元 酵素試薬濃度および酸化還元試薬濃度の 3者の相関を測定する試験方法。
a) 目的のタンパク質をコードする 1または複数の鎵型核酸、
b) 存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、 铸型核酸 を添加することにより錶型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タ ンパク質合成反応基本試薬、
c) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸 化還元酵素、
d) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節す る酸化還元試薬。
14. タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフ オルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 10-フォ ルミル 5, 6, 7,8-テトラヒ ドロ葉酸 （FD)、 塩類および水を含むことを特徴とす る請求項 1 3に記載の試験方法。
1 5. タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフォノレミラーゼ 類、 tRNA類、アミノ酸類、 リポヌクレオシド 3 リン酸類、 10 -フオルミル 5， 6， 7， 8- テトラヒ ドロ葉酸（FD)、塩類およぴ水を含むことを特徴とする請求項 1 3に記 載の試験方法。 ·
1 6. 酸化還元酵素がタンパク質のジスルフィ ド結合の促進及び/又はジスル フィ ド結合の異性化を触媒する酵素であることを特徴とする請求項 1 3〜1 5に 記載の試験方法。
1 7. 酸化還元酵素がプロテインジスルフィ ドイソメラーゼ類またはジスル フィ ドインターチヱインジタンパク質類からなることを特徴とする請求項 1 3〜 1 6のいずれかに記載の試験方法。
1 8. 酸化還元酵素が濃度 0 ζΜ〜10 μΜのプロテインジスルフイ ドイソメラ ーゼ類であることを特徴とする請求項 1 3〜1 7のいずれかに記載の試験方法。
1 9. 酸化還元酵素が濃度 O^M〜： 10 tMのジスルフイ ドインターチェインジ タンパク質であることを特徴とする請求項 1 3〜1 8記載の試験方法。
20. 酸化還元試薬がジチオスレィ トールまたは酸化型ダルタチオンである ことを特徴とする請求項 1 3から 1 9のいずれかに記載の試験方法。
2 1. 酸化型ダルタチオン濃度が 0〜8πιΜであることを特徴とする請求項 2 0に記載の試験方法。
22. 反応系に含まれるチォレドキシンレダクターゼ濃度が lOOng/mlを越え ないことを特徴とする請求項 1 3〜2 1のいずれか 1項に記載の試験方法。
23. 反応系に含まれるダルタチオンレダクターゼ濃度が 100ng/mlを越えな いことを特徴とする請求項 1 3〜2 1のいずれか 1項に記載の試験方法。
24. 下記 a)、 b)及び c)からなるタンパク質のジスルフィ ド結合の促進及ぴ /又はジスルフィ ド結合の異性化を触媒する酵素の活性測定法。
a) 1または複数の錶型核酸
b) 化合物、 存在量および純度が特定されている複数の化合物群からなり、 錶型 核酸を添加することにより鎳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タンパク質合成反応基本試薬
c) 化合物、 存在量おょぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態 を調節する試薬を含む、 酸化還元試薬。
2 5 . タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフ オルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 10-フォ ルミル 5， 6， 7， 8 -テトラヒ ドロ葉酸 （F D )、 塩類およぴ水を含むことを特徴とす る請求項 2 4に記載の活性測定法。
2 6 . タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフォノレミラーゼ 類、 tRNA類、アミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 10-フオルミル 5, 6， 7， 8 - テトラヒ ドロ葉酸（F D)、塩類およぴ水を含むことを特徴とする請求項 2 4に記 載の活性測定法。
2 7 . 下記 a) 及び b ) からなる基本タンパク合成反応系に対して、 c ) 酸 化還元を触媒する酵素の濃度および 又は d ) 酸化還元状態を調節する試薬の濃 度を変化するように添加し、 分子内または分子間に少なくとも 1個のジスルフィ ド結合による架橋形成が可能でその架橋形成様式により活性が支配される 1また は複数のタンパク質を合成し、 該タンパク質の活性を測定することにより、 該タ ンパク質の活性、 酸化還元を触媒する酵素の濃度及び酸化還元状態を調節する試 薬の濃度の 3者の相関を測定することにより、 目的のタンパク質の活性が予め決 められた活性を越える c)及び又は d ) の濃度を決定する方法。
a) 目的とする 1又は複数のタンパク質をコードする 1または複数の鎢型核酸、 b) 存在量および純度が特定されている複数の成分からなり、 铸型核酸を添加す ることにより铸型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タンパク質 合成反応基本試薬、 c) 存在量およぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸 化還元酵素、
d) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節す る酸化還元試薬。
2 8 . タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフ オルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リポヌクレオシド 3 リン酸類、 10 -フォ ルミル 5，6，7，8-テトラヒドロ葉酸 （F D )、 塩類および水を含むことを特徴とす る請求項 2 7に記載の方法。
2 9 . 次の工程を含む分子間又は分子内にジスルフィ ド結合を有するタンパ ク質合成方法。
( 1 ) a) 目的とする 1又は複数のタンパク質をコードする 1または複数の鎵型 核酸及び b) 存在量および純度が特定されている複数の成分からなり、铸型核酸 を添加することにより鎳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タ ンパク質合成反応基本試薬、
並びに
c) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する酸 化還元酵素、 及ぴノ又は
d) 存在量おょぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節す る酸化還元試薬
からなるタンパク合成反応系において、 C ) 酸化還元を触媒する酵素の濃度およ び 又は d ) 酸化還元状態を調節する試薬の濃度を変化させた複数の合成条件下 で、 分子内または分子間に少なくとも 1個のジスルフィ ド結合による架橋形成が 可能でその架橋形成様式により活性が支配される 1または複数のポリべプチドか らなるタンパク質を合成し、 該タンパク質の活性を測定することにより、 該タン パク質の活性と、 酸化還元を触媒する酵素の濃度及び酸化還元状態を調節する試 薬の濃度の 3者の相関を決定し、 目的のタンパク質の活性と予め決められた活性 より大きくなる c)及び又は d ) の濃度を決定する工程、 並びに
( 2 ) 前記決定された c ) 及び Z又は d ) 濃度となるように調製した上記 a)及ぴ b) 並びに c) 及ぴノ又は d) からなるタンパク質合成反応系を目的のタンパク 質を合成する工程。
30. タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフ オルミラーゼ類、 tRNA類、 アミノ酸類、 リポヌクレオシド 3 リン酸類、 10 -フォ ルミル 5，6，7，8 -テトラヒドロ葉酸 （FD)、 塩類および水を含むことを特徵とす る請求項 29記載のタンパク質合成方法。
3 1. タンパク質合成反応基本試薬が、 リボソーム、 開始因子類、 延長因子 類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォエル tRNA トランスフォ ミラーゼ 類、 tRNA類、ァミノ酸類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 10 -フオルミル 5， 6, 7, 8 - テトラヒ ドロ葉酸（FD)、塩類および水を含むことを特徴とする請求項 2 9記載 のタンパク質合成方法。
32. 以下の a) 並びに b) 及び/又は c) からなるキット。
a) 存在量および純度が特定されているリボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフオル ミラーゼ類、 tRNA類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 アミノ酸類、 10-フオルミ ル 5,6， 7， 8-テトラヒ ドロ葉酸 （FD)、 塩類、 および水からなり、 錶型核酸を添 加することにより錶型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク 質合成反応基本試薬、
b) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する 酸化還元酵素、
c) 存在量おょぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節 する酸化還元試薬。
33. 以下の a) 並びに b) 及ぴ 又は c) からなるキット。
a) 存在量および純度が特定されているリボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 ァミノ酸類、 10-フオルミル 5， 6, 7, 8-テ トラヒドロ葉酸 （FD)、 塩類、 および水からなり、 铸型核酸を添加することによ り鎳型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じるタンパク質合成反応基本 試薬、
b ) 存在量およぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する 酸化還元酵素、
C ) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節 する酸化還元試薬。
3 4 . 以下の a) 並びに b ) 及び/又は c ) からなるキット。
a ) 存在量および純度が特定されているリボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 終結因子類、 RNAポリメラーゼ類、 ァミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォニル tRNA トランスフオルミラーゼ類、 tRNA類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 ァミノ 酸類、 10-フオルミル 5, 6, 7， 8 -テトラヒ ドロ葉酸 （F D )、 塩類、 および水からな り、 鎳型核酸を添加することにより鎵型核酸がコードするタンパク質の合成反応 が生じるタンパク質合成反応基本試薬、
b ) 存在量およぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する 酸化還元酵素、
c ) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節 する酸化還元試薬。
3 5 . 以下の a) 並びに b ) 及ぴノ又は c ) からなるキット。
a ) 存在量および純度が特定されているリボソーム、 開始因子類、 延長因子類、 RNAポリメラーゼ類、 アミノアシル tRNAシンターゼ類、 メチォ-ル tRNA トラン スフオルミラーゼ類、 tRNA類、 リボヌクレオシド 3 リン酸類、 アミノ酸類、 10- フオルミル 5， 6, 7, 8-テトラヒ ドロ葉酸 （F D)、 塩類、 および水からなり、 铸型 核酸を添加することにより铸型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる タンパク質合成反応基本試薬、
b ) 存在量およぴ純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元を触媒する 酸化還元酵素、
c ) 存在量および純度が特定されている一つまたは複数の酸化還元状態を調節 する酸化還元試薬。 ，
3 6 . コントロール用にコントロールタンパク質をコードする鎳型核酸を含 む請求項 3 2〜3 5いずれか 1項に記載のキット。
3 7 . 下記 a)及ぴ b)からなる反応系を用いた、分子間又は分子内にジスルフ ィ ド結合を有するタンパク質合成方法。
a) 目的とするタンパク質をコードする 1または複数の铸型核酸、
b) 存在量および純度がそれぞれ特定されている複数の成分からなり、 铸型核酸 を添加することにより鎵型核酸がコードするタンパク質の合成反応が生じる、 タ ンパク質合成反応基本試薬。
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