KR20070015216A - 디술피드 가교 형성형 시험관내 단백질 합성 방법 - Google Patents

디술피드 가교 형성형 시험관내 단백질 합성 방법 Download PDF

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가부시키가이샤 포스트 게놈 겐큐쇼
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Abstract

본 발명의 과제는 디술피드 결합을 갖는 단백질을 재구성 단백질 합성계에서 간편하면서 또한 고효율로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다. 티오레독신 리덕타제[EC1.6.4.5] 및 글루타레독신 리덕타제[EC1.6.4.2]를 포함하는 환원 상태를 유지하는 각종 효소나 기질이 존재하기 때문에 산화 환원 상태의 제조가 어려운 세포 추출액 또는 그의 조분획을 이용하는 대신에, 이들 산화 환원 상태에 영향을 주는 효소 및 기질을 제거하고, 정제된 구성 성분을 포함하는 재구성 단백질 합성계에서 디술피드 및 티올 사이의 산화 환원의 평형 상태를 인위적으로 조정한 재구성 단백질 합성계를 이용함으로써, 활성이 있는 단백질을 효율적으로 합성할 수 있음을 발견하였다.
디술피드, 재구성 단백질, 티오레독신, 글루타레독신

Description

디술피드 가교 형성형 시험관내 단백질 합성 방법 {METHOD OF DISULFIDE CROSSLINK FORMING TYPE IN VITRO PROTEIN SYNTHESIS}
본 발명은 단백질의 시험관내 전사ㆍ번역계에 의한 합성 방법에 관한 것이고, 더욱 상세하게는 분자간/분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질의 시험관내 전사ㆍ번역계에 의한 효율적인 합성 방법에 관한 것이다.
의약품이나 시약으로서 이용 가능한 단백질을 유전자 재조합 기술을 이용하여 생산하는 시도가 널리 행해지고 있다. 유전자 재조합 기술에서는 취급 간편함이나 효율면에서 현재 대장균, 고초균, 곰팡이 또는 효모 등의 미생물, 누에 등의 곤충, 소 등의 포유 동물, 또는 배양 가능한 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포가 즐겨 이용되고 있다. 유전자 재조합 기술을 이용하여 단백질을 생산시키는 방법은 범용되고 있지만, 목적하는 단백질의 발현량이 적어 발현되더라도 활성을 갖지 않거나 또는 응집체를 형성하는 등의 문제가 있으며, 배양 조건, 생육 조건 및 유도 조건의 검토나 다양한 발현계를 실시하는 등의 시행 착오가 필요하다. 그와 같은 다양한 조건을 검토하여도 생산하는 것이 어려운 단백질도 수많이 보고되어 있다.
한편, 이러한 생물이나 세포를 사용하지 않는 무세포 단백질 합성이라 불리는 단백질 합성 방법이 알려져 있다. 무세포 단백질 합성계는 시험관내 전사ㆍ번 역계라고도 불리며 대장균, 토끼 망상형 적혈구, 또는 밀배아 세포 등으로부터 제조한 추출액 또는 이들의 조분획을 이용함으로써, 주형 유전자가 전사ㆍ번역되어 단백질이 합성된다. 무세포 단백질 합성계에서는 생물이나 세포의 기능을 어지럽히는 단백질도 합성할 수 있는 가능성이 높고, 96 웰(well)이나 384 웰의 포맷으로 적응시켜 다품종인 단백질을 합성하거나, 다양한 합성 반응 조건을 한번에 많이 실시하는 것이 가능한 등, 생물이나 세포를 이용하는 것에 의한 다양한 제한을 해제할 수 있다고 하는 특징이 있다.
이들 무세포 단백질 합성계를 이용하더라도, 합성된 단백질이 응집체를 형성하여 본래의 구조를 취하지 못한다고 하는 문제가 종래부터 알려져 있었다. 그 원인 중 하나로서, 분자간 및/또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질이 정확하게 디술피드 결합을 가교할 수 없다는 것이 생각되었다. 단백질에는 분자간 및/또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 것과 갖지 않는 것이 있지만, 세포 표면이나 세포 밖으로 수송ㆍ분비되는 단백질의 대부분은 디술피드 결합을 가지고, 이러한 단백질은 특히 응용면에서의 유용성이 높다고 한다. 예를 들면, 현재 시판되고 있는 단백질 제제 중, 인슐린, 사이토카인이나 혈구 증식 인자 등 대부분의 제제는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질을 성분으로 하고 있다.
이러한 분자내/분자간에 디술피드 결합을 갖는 단백질에 대해서도 효율적으로 생산하기 위해서, 종래부터 무세포 단백질 합성계의 개량이 행해져 왔다. 예를 들면 세포 추출액에 미크로솜 분획을 첨가하는 방법(비특허 문헌 1: Biochem. J. 254: 805-810(1988), 이하 종래 기술 1이라 기재함), 세포 추출액을 투석하는 방 법, 산화형 글루타티온 및 환원형 글루타티온을 첨가하는 방법, 겔 여과하는 방법 또는 산화 환원 전위를 조정하는 방법(비특허 문헌 2: FEBS Lett. 514: 290-4(2002), 비특허 문헌 3: Nature Biotech. 15:79-84(1997), 특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제2003-116590호, 특허 문헌 2: WO03/072796 A1, 이하 종래 기술 2라 기재함)이 행해져 왔다.
또한, 환원 상태를 유지하는 효소의 결실 변이주를 이용함으로써, 디술피드 결합을 형성시키는 방법이 종래부터 알려져 있다(Proc. Natl. Acad. Sci. 96: 13703-13708(1999), 이하 종래 기술 3). 이 방법에서는 티오레독신 리덕타제 및 글루타티온 리덕타제가 결손된 대장균에 의해 목적하는 단백질은 발현할 수 있지만, 이러한 효소의 결손주는 일반적으로 생육이 극단적으로 느리거나 특수한 배양 조건이 필요하고, 산업상 이용하는 데에 있어서 큰 장해가 되었다. 이 방법은 대장균에 유전자를 재조합하여 단백질을 발현시키는 계이지만, 상술한 바와 같이 생물을 직접 이용하는 것에 의한 각종 제한도 있었다. 또한, 많은 생물에게는 티오레독신 리덕타제 및 글루타티온 리덕타제 이외에도 미동정이지만 많은 산화 환원을 담당하는 효소나 기질이 존재하기 때문에(비특허 문헌 4: Nature Review Molecular Cell Biology 3: 836-847(2002)), 이러한 결손 변이주에서 외래 유전자를 발현시키거나, 또는 만일 그 세포 추출액을 이용하여 무세포 단백질 합성계에서 단백질을 합성하였다고 해도 안정적으로 디술피드 결합을 형성시키는 것은 곤란하다고 생각되었다. 이러한 효소나 기질을 불활성화하기 위해서 세포 추출액을 요오드아세트아미드로 처리하는 방법이 종래부터 알려져 있다(US 6,548,276 B2 이하 종래 기술 4). 이 방법에서는 글루타티온 리덕타제나 티오레독신 리덕타제 뿐만 아니라 세포내의 산화 환원을 조절하는 많은 효소나 기질을 불활성화하는 것이 가능하다. 그러나, 요오드아세트아미드는 티올기를 비특이적으로 수식하기 때문에, 예를 들면 전사 번역에 관한 인자나 효소군 및 리보솜 단백질 등도 수식하여 결과적으로 시험관내 단백질 합성 반응의 효율이나 정밀도가 떨어진다고 하는 문제가 생각되었다.
한편, 생물이나 세포를 이용하여 재조합 생산시킨 단백질, 화학 합성에 의해 합성한 펩티드 또는 무세포 단백질 합성계에서 합성한 단백질을 일단 변성제로 완전히 변성시킨 후, 재생한다고 하는 방법이 널리 행해지고 있다(비특허 문헌 5: Biochemistry 26: 3129-3134(1987). 종래 기술 5). 종래 기술 5에서는 단백질은 화학 합성되거나, 또는 생물을 이용한 경우에도 일단 불활성인 불용화물로서 회수되기 때문에, 독성이 있는 단백질의 생산도 가능하다. 단백질을 재생할 때에는 세포를 사용하지 않기 때문에, 시약이나 염류를 자유롭게 조합함으로써 디술피드 결합을 갖는 단백질에 올바른 디술피드 결합을 도입하는 것도 가능하다. 그러나 이 방법에서는 단백질의 합성과 단백질의 구조를 재생하는 개개의 단계가 필요하고, 단백질의 구조를 재생하는 단계는 장시간(수일 내지 1주간)이 소요된다는 문제점이 있었다.
디술피드 결합의 촉진 및/또는 디술피드 결합의 이성화를 촉매하는 효소의 활성 측정법으로서는, 기질이 되는 리보뉴클레아제 A(RNaseA)를 일단 환원하여 변성시키고, 계속해서 활성을 측정하는 효소와 함께 RNaseA를 리폴딩하여 재생하여 얻어지는 RNase 활성을 지표로 하는 것이 종래부터 알려져 있다(비특허 문헌 6: Biochem J. 1976 159: 377-384).
특허 문헌 1 일본 특허 공개 제2003-116590
특허 문헌 2 WO 03/072796 A1
특허 문헌 3 US 6,548,276 B2
비특허 문헌 1 Biochem. J. 254: 805-810(1988)
비특허 문헌 2 FEBS Lett. 514: 290-294(2002)
비특허 문헌 3 Nature Biotech. 15: 79-84(1997)
비특허 문헌 4 Nature Review Molecular Cell Biology 3: 836-847(2002)))
비특허 문헌 5 Biochemistry 26: 3129-3134(1987)
비특허 문헌 6 Biochem J. 159: 377-384(1976)
<발명의 개시>
[단백질 합성]
종래부터의 무세포 단백질 합성계는 분자간 및/또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질을 제조하는 경우에는, 다음에 기재하는 것과 같은 문제가 있었다. 종래 기술 1에서는 췌장 등으로부터 균질화 및 원심 분리로 미크로솜 분획을 제조하는 수고가 필요하고, 미크로솜 분획은 디술피드 결합의 형성이 세포내에서 본래 생기는 소포체라고 불리는 세포 소기관이 파괴된 분획이며, 소포체에서 형성되는 디술피드 결합과 비교하면 효율이 나쁘고, 형성된 디술피드 결합의 패턴이 상이하여 단백질에 활성을 볼 수 없는 경우가 있다는 문제를 생각할 수 있다. 종래 기술 2에서는 미크로솜 분획을 제조할 필요는 없고, 산화형 글루타티온 및 환원형 글루타티온의 첨가 또는 투석이라는 간단한 방법으로 세포 추출액을 제조할 수 있지만, 반응액의 산화 환원 상태를 양호한 재현성으로 조정하고, 효율적으로 디술피드 결합을 가교하는 것은 곤란하였다. 그의 원인으로서, 통상 사용되는 무세포 단백질 합성계인 세포 추출액에는 티오레독신 리덕타제[EC 1.6.4.5] 및 글루타티온 리덕타제[EC 1.6.4.2]를 포함하는 환원 상태를 유지하는 각종 효소나 기질이 존재하는데(Nature Review Molecular Cell Biology 3: 836-847(2002)), 이들의 기능에 의해 투석이나 글루타티온의 첨가에 의해서도 산화 환원 상태를 조정하는 것이 어렵다고 생각된다. 무세포 단백질 합성계에서 산화제, 예를 들면 산화형 글루타티온(GSSG)을 첨가하는 경우, GSSG와 환원형 글루타티온(GSH)의 산화 환원 완충액이 종래에 사용되어 왔다. 그의 비율은 대략 GSSG:GSH=1:5 내지 10 정도인 경우가 많다. 이것은 RNaseA나 리소자임을 일단 환원적으로 변성시켜 리폴딩하고, 구조와 활성의 상관을 조사한 수많은 연구(Biochemistry. 1991 30: 613-619, Biochemistry 1970 9: 5015-5023))로부터 얻어진 산화제의 농도와 비율을 모방하고 있으며, 반드시 무세포 단백질 합성계에 적합한 것이라고 할 수는 없다. 또한, 산화 환원 전위란, 가역적인 전자의 수수가 성립되고 있는 평형 상태에서 산화체와 환원체의 화학 포텐셜차에 의해 발생하는 전위를 백금 등의 전극을 이용하여 측정한 것이지만, 그 용액 중의 산화 환원에 관한 각종 무기ㆍ유기 화합물(예를 들면 산소, 금속, 시스테인, 헴)의 산화 환원의 평형 상태를, 전위로서 통합하여 관찰한 것에 지나지 않고, 티올과 디술피드의 평형 상태를 나타내는 지표가 아니기 때문에, 단백질의 산화 환원 상태를 나타내지는 않았다. 그 때문에, 종래 기술 2와 같이 단순히 산화 환원 전위를 특정 값으로 조절하였다고 해도, 단백질에의 디술피드 결합의 형성을 조절하는 것은 매우 곤란하였다.
종래법 1, 2에 공통되는 문제점으로서, 미크로솜의 첨가, 투석, 산화형 글루타티온 및 환원형 글루타티온의 첨가라는 본래의 세포내 환경과는 상이한 처리를 세포 추출액에 실시하면, 단백질 합성이 행해지는 본래의 세포내 환경과는 상이하기 때문에, 단백질의 합성 효율 그 자체가 저하된다고 하는 우려가 있고, 산업 수준에서 무세포 단백질 합성계의 이용을 현저히 곤란하게 하였다.
본 발명자들은 세포를 이용하지 않는 시험관내에서의 DNA 전사ㆍ번역계 또는 RNA 번역계에서, 반응계를 구성하는 단백질 성분의 일부 또는 전부가, 서로 부착되는 관계 중 한쪽에서 라벨되는 방법(일본 특허 공개 제2003-102495호, 이하, 재구성 단백질 합성계라 함)을 이미 개시하였다. 이 방법은 종래의 무세포계나 시험관내 단백질 합성계(이하, 무세포 단백질 합성계라 함)와는 전혀 다른 방법, 즉 세포 추출액을 사용하지 않고 단백질 합성에 관한 각종 성분을 각각 정제하여 재구성함으로써 단백질 합성을 가능하게 하고, 분자내에 디술피드 결합을 갖지 않는 단백질의 합성이나 신속한 정제가 가능하다는 특징이 있다(Nature Biotechnology 19: 732-734 (2001)). 그러나, 분자내/분자간에 디술피드 결합을 갖는 단백질을 본래의 구조나 활성을 가지고, 또한 효율적으로 합성하기 위해서는 각종 성분을 어떠한 농도로 재구성하는 것이 좋을지에 대해서는 보고되지 않았다.
이 때문에, 보다 간편하며 분자내 및/또는 분자간에 디술피드 결합을 갖는 단백질의 고효율 제조법이 요망되었다. 본 발명의 과제는 디술피드 결합을 갖는 단백질을 재구성 단백질 합성계에서 간편하면서 또한 고효율로 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.
[효소 활성 측정]
상기 종래 방법은 RNaseA를 일단 변성시킬 필요가 있고, 리폴딩을 위한 시간이 장시간 필요하다고 하는 문제점이 있었다.
[단백질 합성 방법]
본 발명자들은 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, 분자내/분자간에 디술피드 결합을 갖는 단백질을 본래 구조나 활성을 가지며 또한 효율적으로 합성하기 위해서는, 티오레독신 리덕타제[EC 1.6.4.5] 및 글루타티온 리덕타제[EC 1.6.4.2]를 포함하는 환원 상태를 유지하는 각종 효소나 기질이 존재하기 때문에 산화 환원 상태의 조정이 어려운 세포 추출액 또는 그의 조분획을 이용하는 대신에, 이들 산화 환원 상태에 영향을 주는 효소 및 기질을 제거하여 디술피드 및 티올 사이의 산화 환원의 평형 상태를 인위적으로 조정한 재구성 단백질 합성계를 이용함으로써 달성할 수 있음을 발견한 것이다.
재구성 단백질 합성계로서는, 90 ％ 이상의 순도의 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류(transformylases), tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 성분으로 하는 것을 특징으로 하는 것이 특히 바람직한 것을 발견하고, 본 발명을 완성시켰다.
통상 세포내의 단백질 합성 부위에서는 산화 환원 상태가 환원측으로 기울어져 있고, 세포내에서 합성된 단백질은 환원 상태로 존재한다. 무세포 단백질 합성계에서는 이러한 세포내의 상태를 모방하고 있기 때문에 DTT나 다른 환원 시약이 통상은 포함되어 있고, 환원 시약이 포함되어 있지 않은 경우에는 추출액의 보존이 나빠지거나 번역 효율이 저하되는 것이 보고되었다(Eur. J. Biochem. 270: 4780-4786(2003)).
한편, 티올기를 디술피드 결합시키기 위해서는 환원 상태는 바람직하지 않기 때문에, 시험관내 전사ㆍ번역계에서는 단백질에 디술피드 결합을 형성시키기 위해서, 환원제인 DTT를 투석 등으로 제거하거나 첨가량을 낮게 억제하는 시도가 행해져 왔다. 그러나, 상술한 바와 같이 그의 효과는 한정적인 것이었다.
한편, 본 발명에 의한 방법에서는 재구성 단백질 합성계에 디술피드 및 티올 사이에서의 평형에 영향을 주는 성분의 존재량이 특정되어 있기 때문에, DTT를 수 μM부터 또한 1 mM까지 첨가할 수도 있고, 또한 DTT를 전혀 첨가하지 않는 것도 가능하다.
더욱 놀랍게도 종래의 DTT를 제거한 무세포 단백질 합성계를 이용하는 방법에서는 단백질에 디술피드 결합을 형성시킬 수 있었다고 해도, 상기 조건하에서는 단백질 자체의 합성량은 저하되어 목적으로 하는 활성을 갖는 단백질의 합성 효율은 저하된다고 일반적으로 생각되었지만, 본 발명과 같이 재구성 단백질 합성계를 이용하면 단백질의 합성량은 변하지 않거나 오히려 증가하는 경우가 있고, 보다 효율적으로 단백질을 합성하는 것이 가능하였다.
즉, 본 발명은 종래법과는 달리, 세포 추출액을 사용하지 않고서 산화 환원 상태에 영향을 주는 불순물을 포함하지 않는, 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 단백질 합성 기본 시약으로서 재구성하여, 이 재구성 단백질 합성계에서 디술피드 및 티올 사이의 산화 환원의 평형 상태를 인위적으로 조정함으로써 디술피드 결합을 갖는 단백질의 고효율인 합성 방법을 제공한다.
또한, 적합하게는 상기 재구성한 단백질 합성 기본 시약은 고도로 정제된 90 ％ 이상의 순도의 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 각각 미리 정해진 양만 함유하도록 재구성되어 있다. 단백질 합성 기본 시약으로서는 예를 들면 DTT를 제외한 순수한 시스템(포스트게놈사 제조)을 이용할 수 있다. 상기 단백질의 합성 방법에 있어서 디술피드 및 티올 사이의 산화 환원 평형 상태의 인위적 조정은, 상기 단백질 합성 기본 시약에 (가) 산화 환원 상태를 조절하는 시약을 첨가하거나, 및/또는 (나) 산화 환원을 촉매하는 효소를 첨가함으로써 행할 수 있다. 이들 첨가는 반응 개시 전, 반응 중, 반응 후 중 어느 때에 첨가하여도 좋다.
더욱 구체적으로는 (가) 산화 환원 상태를 조절하는 시약으로서는 DTT, 산화형 글루타티온 등을 들 수 있다. 또한, (나) 산화 환원을 촉매하는 효소로서는 프로테인 디술피드 이소머라제류(isomerases), 디술피드 인터체인지(interchange) 단백질류를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 합성 방법을 단백질 제조 방법이라 부르는 경우도 있다.
[단백질 활성 측정법 및 그것을 이용한 단백질 합성 방법]
또한, 본 발명은 제조되는 단백질의 활성도, 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소 시약의 첨가량 및 산화 환원 시약의 첨가량의 3자에 대한 상관을 측정하는 시험 방법을 제공한다. 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물은 각각 미리 정해진 특정량을 재구성하여 단백질 합성 기본 시약으로 한다. 상기 단백질 합성 기본 시약에, 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소 시약 농도 및 산화 환원 시약 농도를 변화시킬 수 있는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 산화 환원의 평형 상태를 변화시킬 수 있는 시약군을 재구성 단백질 합성계에 원하는 최종 농도가 되도록 첨가함으로써, 제조되는 단백질의 디술피드 가교결합을 형성시키거나, 반대로 형성시키지 않도록 하거나 하는 것을 가능하게 하였다.
즉, 본 발명에 의해 원하는 디술피드 가교결합 형태의 단백질을 제조하는 데 필요한 조건을 재구성 단백질 합성계에서 정확하게 알 수 있게 되었다. 이와 같이 하여 얻어진 정보는 상기 단백질 합성의 조건으로서 이용하는 것이 가능하다.
산화 환원 효소 시약 및 산화 환원 시약의 첨가는 반응 개시 전, 반응 중 또는 반응 후 중 어느 시점에서 행하여도 좋다.
산화 환원 효소 시약으로서는 DTT, GSSG 등을 들 수 있다. 산화 환원 시약으로서는 프로테인 디술피드 이소머라제류, 디술피드 인터체인지 단백질류를 들 수 있다.
복수개 농도의 시약을 미리 제조해두고, 각각의 반응계에 대하여 반응 개시 전(주형 핵산 첨가 전), 반응 개시 후, 또는 반응 종료 후에 첨가하는 것이 가능하다.
[효소 활성 측정법]
상세한 활성 측정법은, 상술한 단백질 합성계, 활성을 측정하고자 하는 디술피드 결합의 촉진이나 이성화를 촉매하는 효소를 번역과 동시 또는 번역 후에 첨가하는 것 이외에는 전부 동일한 방법으로 행할 수 있다. 기질로서 사용되는 단백질은 그것을 코딩하는 주형 DNA 또는 RNA로서 첨가된다. 기질로서 이용하는 단백질의 종류는 특별히 제한은 없지만, 구조가 이미 알려진 것이 바람직하고, 효소인 것이 보다 바람직하다. 이러한 기질의 예로서, 리소자임이나 알칼리 포스파타제 등을 예시할 수 있다. 또한, 이 방법에서는 디술피드 결합의 촉진 및/또는 디술피드 결합의 이성화를 촉매하는 효소의 활성을 측정할 수 있지만, 반대로 그의 활성을 저해하는 물질을 스크리닝할 목적으로도 사용 가능하다. 이 경우, 디술피드 결합의 촉진이나 이성화를 촉매하는 효소와 함께 피검 물질을 이용함으로써 스크리닝을 행할 수 있다.
[키트]
또한, 본 발명은 이하의 (1) a) 및 b), (2) a) 및 c) 또는 (3) a), b) 및 c)를 포함하는 키트가 포함된다.
a) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
구체적으로는 a) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약, b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소, 및 c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약을 포함하는 키트를 제공한다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2004-136520호의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.
도 1은 리보솜 조추출액의 6 내지 36 ％의 슈크로스 밀도 구배에 의한 분획을 나타낸다.
도 2는 His-Tag가 붙은 알라닐 tRNA 신테타제(AlaRS), 아르기닌 tRNA 신테타제(ArgRS), 아스파라긴 tRNA 신테타제(AsnRS), 아스파라긴산 tRNA 신테타제(AspRS), 시스테인 tRNA 신테타제(CysRS), 글루타민 tRNA 신테타제(GlnRS) 및 글루탐산 tRNA 신테타제(GluRS)의 12 ％ SDS-PAGEㆍ쿠마시 브릴리언트 블루 염색 후의 사진을 나타낸다.
도 3은 인간 리소자임의 합성 전기 영동 사진(화살표는 합성된 인간 리소자임을 나타냄)을 나타낸다.
도 4는 합성된 인간 리소자임의 비활성을 나타낸다.
도 5는 합성된 mIL6의 단백질량을 나타낸다.
도 6은 합성된 DHFR의 단백질량을 나타낸다.
도 7은 합성된 인간 리소자임의 비활성(PDI 농도에 의한 영향)을 나타낸다.
도 8은 합성된 인간 리소자임의 비활성(0.13 μM PDI의 존재하에서의 DTT 농도에 의한 영향)을 나타낸다.
도 9는 합성된 알칼리 포스파타제의 활성(0.13 μM PDI 및 1 mM DTT 존재하에서의 GSSG 농도에 의한 영향)을 나타낸다.
도 10은 합성된 알칼리 포스파타제의 활성(PDI 존재하에서의 DTT 농도 변화 에 의한 영향)을 나타낸다.
도 11은 합성된 리소자임의 활성(DsbC 첨가 또는 무첨가에 의한 영향)을 나타낸다.
도 12는 합성된 알칼리 포스파타제의 활성(본 발명에 의한 방법과 세포 추출액을 이용한 방법과의 비교)를 나타낸다.
도 13은 EF-Tu의 용출 분획의 전기 영동 사진을 나타낸다.
도 14는 정제한 DsbA(레인 1) 및 DsbC(레인 2)의 전기 영동 사진을 나타낸다.
<발명을 실시하기 위한 최선의 형태>
이하, 본 발명의 바람직한 실시 양태에 대하여 상세히 설명한다. 단, 본 발명은 이하의 바람직한 실시 양태로 한정되지 않고, 본 발명의 범위내에서 자유롭게 변경할 수 있다.
본 발명에 있어서의 시험관내에서의 DNA 전사ㆍ번역계 또는 RNA 번역계는 mRNA 또는 cDNA 등의 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 주형을 첨가함으로써 단백질을 합성시키기 위한 기본적 성분을 포함하는 단백질 합성 기본 시약, 및 디술피드 및 티올 사이의 산화 환원 평형 상태의 인위적 조정을 행하기 위한 (가) 산화 환원 상태를 조절하는 시약 및/또는 (나) 산화 환원을 촉매하는 효소를 포함한다.
[분자간 또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질 합성 방법]
본 발명의 방법은 (1) 하기 a) 및 b)를 포함하는 반응계, (2) 하기 a), b) 및 c)를 포함하는 반응계, (3) 하기 a), b) 및 d)를 포함하는 반응계, 또는 (4) 하 기 a), b), c) 및 d)를 포함하는 반응계를 이용한 분자간 또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질 합성 방법을 포함한다.
a) 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 1개 또는 복수개의 주형 핵산,
b) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
d) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
[1-1 단백질 합성 기본 시약]
백질 합성 기본 시약은 그의 성분으로서 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 각각 미리 정해진 순도의 성분을 정해진 양만 포함하는 것을 특징으로 하지만, 모든 성분이 필요한 것은 아니고, 성분은 적절하게 선택할 수 있다.
계를 구성하는 이들 성분은 세포 추출액 또는 그의 조분획을 이용하지 않는 것은 물론이지만, 단백질의 디술피드 결합 형성에 영향을 주는 물질 농도를 계산 가능한 것이 바람직하다.
본 발명의 재구성 단백질 합성계는 계를 구성하는 모든 성분을 재구성하기 때문에, 이러한 성분을 특정하여 그의 함유량을 계산하는 것은 용이하다.
본 발명에 있어서의 단백질 합성 반응 기본 시약은 DNA에서의 전사ㆍ번역, 또는 RNA의 번역을 행하게 하는 단백질 합성을 위한 반응계로서 사용할 수 있다. 본 발명에서 말하는 단백질이란, 2개 이상의 아미노산이 펩티드 결합에 의해서 결합한 것을 말하고, 펩티드, 올리고펩티드, 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명에서 말하는 RNA는 화학 합성된 RNA 및 mRNA를 포함하고, DNA는 합성된 DNA, DNA 벡터, 게놈 DNA, PCR 산물 및 cDNA를 포함한다.
본 발명에 있어서의 단백질 합성 반응 기본 시약에서 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 성분을 포함한다는 것은, 각각의 성분에 대하여 개개로 정제되어 그 순도가 측정 가능하고, 또한 정량 가능한 것을 의미한다. 본 발명에서는 존재량 및 순도가 각각 특정된 복수개의 성분이란, 미리 염석, 크로마토그래피, 전기 영동, 용해도의 차, 재결정, 원심 등의 물질 정제법에 의해 각각이 정제된 물질이며, 크로마토그래피, 전기 영동, 질량 분석, 원심 등의 분석 방법에 의해 각각의 순도가 대략 80 ％ 이상, 적합하게는 90 ％ 이상인 물질을 말한다. 예를 들어, 단백질이면, 주로 크로마토그래피에 의해 정제되며 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해 순도가 결정되고, 리보솜이면, 주로 초원심법에 의해 정제되며 초원심 분리에 의한 침강 분석에 의해 순도가 결정된다. 리보솜은 복수개의 RNA 분자(원핵 생물에서는 23S, 5S, 및 16S의 3개, 진핵 생물에서는 28S, 5.8S, 5S, 18S의 4개의 RNA 분자)와 복수개의 리보솜 단백질(원핵 생물에서는 약 50개, 진핵 생물에서는 약 80개의 단백질)을 포함하는 분자량 수백만의 집합체 분자이지만, 침강 분석에 의해서 집합체 분자로서 분자를 동정하여 순도를 측정하는 것이 가능하다. tRNA류는 대부분이 74 내지 94 뉴클레오티드를 포함하고, 복수개의 염기 서열을 갖는 분자이지만, 전기 영동 등에 의해 분자를 분리ㆍ동정하고, 260 nm 및 280 nm의 흡광도 측정에 의해 순도를 측정하는 것이 가능하다. 그 밖에 아미노산이나 염 등의 저분자 물질은 모두 크로마토그래피, 융점 측정, 원소 분석, 질량 분석 등의 통상법에 의해 물질을 동정하여 순도를 측정하는 것이 가능하다.
단백질 합성 기본 시약으로서의 전사/번역을 위한 인자ㆍ효소로서는 대장균 등의 원핵 세포 유래의 것으로 한정되지 않고, 진핵 세포 유래의 것도 사용할 수 있으며, (1) RNA로부터의 번역인 경우에는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, tRNA류, 아데노신 3 인산(ATP), 구아노신 3 인산(GTP), 아미노산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물이고, 대장균 등의 원핵 세포 유래의 반응계인 경우에는 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류를 더 포함하며; (2) DNA로부터의 전사/번역인 경우에는 (1)에 부가적으로 우리딘 3 인산(UTP), 시티딘 3 인산(CTP) 및 RNA 폴리머라제류, 예를 들면 T7RNA 폴리머라제를 포함한다.
본 발명의 반응계를 구성하는 각종 인자ㆍ효소는 대장균, 곰팡이, 효모, 및 배양 세포 등 모든 생물이 본래 구비하고 있는 것이기 때문에, 이것을 각각 고도로 정제하여 성분으로서 이용할 수도 있지만, 각 단백질이 다량으로 얻어지고, 미지의 불필요 또는 저해 성분이 반응계내에 들어갈 가능성이 낮아지기 때문에 재조합 생 산된 것을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
구체적으로는 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신테타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류 또는 RNA 폴리머라제류를 코딩하는 유전자를 적절한 벡터에 연결하고, 대장균, 고초균, 곰팡이, 또는 효모 등에 형질 전환하여 발현 유도를 행하며, 상기 단백질을 정제하여 본 발명의 반응계를 구성하는 성분으로 할 수 있다. 재조합체에 의해 각종 인자ㆍ효소를 생산하는 경우, 인택트(intact)한 상태에서 그 단백질을 발현시킬 수도 있지만, 융합 단백질로서 발현할 수도 있다. 그와 같은 융합 단백질로서 히스티딘 태그(이하 His-Tag), 스트렙토 태그, GST 태그 및 FLAG 태그 등을 예시할 수 있다.(Appl Microbiol Biotechnol. 60(5): 523-533(2003))
일례로서 His-Tag와 니켈 칼럼을 이용한, His-Tag를 붙인 단백질 성분의 정제 방법의 개략을 나타내면 다음과 같다. 이 이외에도 각종 다양한 것들이 알려져 있고, 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
1. 유전자 공학적 수법에 의해 목적 단백질의 N 말단에 His-Tag(6개의 His를 포함함)를 결합시킨 융합 단백질을 얻는다.
2. 태그를 붙인 단백질이 발현되는 세포를 얼음 중에서 초음파 처리하고, 로딩 버퍼(300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)에 현탁시킨다.
3. 세포의 용해물을 원심 분리한다(30,000 g, 4 ℃에서 30 분간).
4. 상기에서 얻어진 상청에, 얼음으로 식힌 로딩 버퍼 중에서 평형화한 50 ％의 Ni2+-NTA 슬러리(퀴아겐사 제조)를 첨가한다. 4 ℃에서 1 시간 교반한다.
5. 수지를 칼럼에 로딩하고, 칼럼 용량의 20배의 로딩 버퍼로 4 ℃에서 칼럼을 세정한다.
6. 칼럼 용량의 20배의 로딩 버퍼(10 mM 이미다졸, pH 8.0을 포함함)로 4 ℃에서 칼럼을 세정한다.
7. 칼럼 용량의 20배의 로딩 버퍼를 이용하여 이미다졸의 농도 구배를 10부터 250 mM이 되도록 설정하고, 칼럼으로부터 목적 단백질의 용출을 행하여 1 ml씩 분획을 모은다. SDS-PAGE에서 목적 단백질을 확인한다.
또한, 반응계를 구성하는 각종 인자ㆍ효소로서, 직접 단백질의 합성 반응에는 관여하지 않지만, 크레아틴 키나제류, 미오키나제류 또는 뉴클레오시드 디포스페이트 키나제류라는 에너지 재생에 관한 효소, 및 무기 피로포스파타제류라는 전사ㆍ번역 반응에서 생기는 무기 피롤린산의 분해를 위한 효소류도 동일한 방법으로 상기 단백질을 정제하여 본 발명의 반응계에 첨가하는 것이 보다 바람직하다.
염류로서는, 전사ㆍ번역에 필수인 양이온ㆍ음이온을 포함하는 것이 필수이고, 글루탐산칼륨, 염화암모늄, 아세트산마그네슘, 염화칼슘 등이 통상적으로 사용된다. 또한, 상기 이외에도 적절하게 선택하여 사용할 수 있는 것은 물론이다. 물은 이온이나 미생물류, 효소류를 포함하지 않는 것으로, 예를 들면 밀리포어사 제조의 밀리 Q 물 제조 장치에 의해서 제조되는 물이나 시판용 순수한 물을 들 수 있다.
리보솜은 펩티드의 합성 장소이고, mRNA와 결합하여 아미노아실 tRNA를 A 부위에, 포르밀메티오닐 tRNA 또는 펩티딜 tRNA를 P 부위에 각각 배위하여 펩티드 결합을 형성시키는 반응을 행한다(Science 289: 920-930(2000)). 본 발명에서는 이러한 기능을 갖는 것이라면, 유래를 막론하고 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 대장균 유래의 리보솜이 사용되지만, 진핵 세포 유래의 것도 사용할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 리보솜의 바람직한 예는 대장균 유래의 것으로, 예를 들면 대장균 A19주, MRE600주로부터 얻어지는 것을 들 수 있다.
본 발명의 시험관내 단백질 합성계에서 사용되는 개시 인자류에는, 번역 개시 복합체의 형성에 필수이거나 또는 이것을 현저히 촉진시키는 인자이고, 대장균 유래의 것으로서 IF1, IF2 및 IF3이 알려져 있다(Biochemistry 29: 5881-5889(1990)). 개시 인자 IF3은 번역 개시에 필요한 단계인, 70S 리보솜의 30S 서브 유닛과 50S 서브 유닛으로의 해리를 촉진시키고, 또한 번역 개시 복합체의 형성시에 포르밀메티오닐 tRNA 이외의 tRNA의 P 부위에의 삽입을 저해한다. 개시 인자 IF2는 포르밀메티오닐 tRNA와 결합하고, 30S 리보솜 서브유닛의 P 부위로 포르밀메티오닐 tRNA를 운반하여 번역 개시 복합체를 형성한다. 개시 인자 IF1은 개시 인자 IF2, IF3의 기능을 촉진시킨다. 본 발명에서 사용되는 개시 인자의 바람직한 예는 대장균 유래의 것으로, 예를 들면 대장균 K12주로부터 얻어지는 것을 들 수 있지만, 진핵 세포 유래의 것도 사용할 수 있다.
연장 인자 EF-Tu는 GTP형과 GDP형의 2종이 있고, GTP형은 아미노아실 tRNA와 결합하여 이것을 리보솜의 A 부위로 운반한다. EF-Tu가 리보솜으로부터 떨어질 때 에 GTP가 가수분해되어 GDP형으로 전환된다(EMBOJ. 17:7490-7497(1998)). 연장 인자 EF-Ts는 EF-Tu(GDP형)에 결합하여 GTP형으로의 전환을 촉진시킨다(Archives of Biochemistry and Biophysics 348: 157-162(1997)). 연장 인자 EF-G는 펩티드쇄 신장 과정에서 펩티드 결합 형성 반응 후의 전위(translocation) 반응을 촉진시킨다(Nature Structure Biology 6: 643-647(1999), FEMS Microbiology Reviews 23: 317-333(1999)). 본 발명에서 사용되는 연장 인자의 바람직한 예는 대장균 유래의 것이며, 예를 들면 대장균 K12주로부터 얻어지는 것을 들 수 있지만, 진핵 세포 유래의 것도 사용할 수 있다.
종결 인자는 단백질 합성의 종결, 번역된 펩티드쇄의 해리, 또한 다음 mRNA의 번역 개시에의 리보솜의 재생에 필수이다. 이것을 포함하지 않는 반응계에서 단백질 합성을 행한 경우에는, 종결 코돈(termination codon)의 바로 앞에서 반응이 멈추고, 리보솜ㆍ펩티드ㆍmRNA의 안정한 3자 복합체의 형성이 용이하게 행해진다(폴리솜 디스플레이법, 리보솜 디스플레이법, 인비트로바이러스법). 또한 펩티드쇄에의 비천연 아미노산의 도입은 RF1 및/또는 RF2를 반응계로부터 생략함으로써 행해진다. 즉, RF1을 생략한 경우에는 UAG 코돈, RF2를 생략한 경우에는 UGA 코돈에의 비천연 아미노산의 도입이 높은 효율로 행해진다.
종결 인자 RF1 및 RF2는 리보솜의 A 부위에 종지 코돈(UAA, UAG, UGA)이 왔을 때, A 부위에 들어가 펩티딜 tRNA(P 부위에 있음)로부터 펩티드쇄의 해리를 촉진시킨다. RF1은 종지 코돈 중 UAA, UAG를 인식하고, RF2는 UAA, UGA를 인식한다. 종결 인자 RF3은 RF1, RF2에 의한 펩티드쇄의 해리 반응 후의, RF1, RF2의 리보솜 로부터의 해리를 촉진시킨다. 리보솜 재생 인자(RRF)는 단백질 합성의 정지 후, P 부위에 남아 있는 tRNA의 이탈과, 다음 단백질 합성에의 리보솜의 재생을 촉진시킨다. 본 발명에서는 RRF도 종결 인자류의 하나로서 취급하기로 한다. 또한,종결 인자 RF1, RF2, RF3 및 RRF의 기능에 대해서는 문헌[EMBOJ. 16: 4126-4133(1997), EMBOJ. 16: 4134-4141(1997)]에 해설되어 있다. 본 발명에서 사용되는 종결 인자의 바람직한 예는 대장균 유래의 것이며, 예를 들면 대장균 K12주로부터 얻어지는 것을 들 수 있지만, 진핵 세포 유래의 것도 사용할 수 있다.
아미노아실 tRNA 신테타제는 ATP의 존재하에서 아미노산과 tRNA를 공유 결합시켜 아미노아실 tRNA를 합성하는 효소이다(RNA 3: 954-960(1997), 단백질 핵산 효소 39: 1215-1225(1994)). 본 발명에서 사용되는 아미노아실 tRNA 신테타제의 바람직한 예는 대장균 유래의 것이며, 예를 들면 대장균 K12주로부터 얻어지는 것을 들 수 있지만, 진핵 세포 유래의 것도 사용할 수 있다. 또한, 비천연 아미노산을 인식하는 인공 아미노아실 tRNA 신테타제(일본 특허 제2668701호)를 이용할 수도 있다.
메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제(MTF)는 원핵 생물에 있어서의 단백질 합성에서 메티오닐 tRNA의 아미노기에 포르밀기가 붙은 N-포르밀메티오닐(fMet) tRNA를 합성하는 효소이다. 즉, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제는 N10-포르밀테트라히드로엽산의 포르밀기를 개시 코돈에 대응하는 메티오닐 tRNA의 N 말단에 전이시켜 fMet-tRNA로 만든다(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 875-880(1999)). 부가된 포르밀기는 개시 인자 IF2에 의해 인식되어 단백질 합성의 개시 시그널로서 작용한 다. 진핵 생물의 세포질에 있어서의 합성계에는 MTF가 없지만, 진핵 생물의 미토콘드리아 및 엽록체에 있어서의 합성계에는 존재한다. 본 발명에서 사용되는 MTF의 바람직한 예는 대장균 유래의 것이며, 예를 들면 대장균 K12주로부터 얻어지는 것이다.
RNA 폴리머라제는 DNA 서열을 RNA에 전사하는 효소이고, 각종 생물에 존재하는 것으로 알려져 있다. 그의 일례로서 T7 phage 유래의 T7RNA 폴리머라제를 들 수 있고, 이 폴리머라제는 T7 프로모터라고 불리는 특이적인 DNA 서열에 결합하여 그의 하류 DNA 서열을 RNA에 전사하는 효소이다. 본 발명자들은 T7RNA 폴리머라제의 N 말단에 히스 태그를 부가하여, 융합 단백질로서 대장균 BL21주에서 대량 발현을 행하고, 니켈 칼럼을 이용하는 친화성 크로마토그래피에 의해 정제를 행하였다. 본 발명에 있어서는 T7RNA 폴리머라제 이외에도 각종 RNA 폴리머라제를 사용할 수 있다. 예를 들면, T3RNA 폴리머라제나 SP6RNA 폴리머라제가 시판되고 있고, 이들 등을 이용할 수도 있다.
아미노산류로서는 천연형 또는 비천연형 아미노산, 천연형 또는 비천연형 아미노산으로 차지(charge)된 tRNA를 들 수 있다. 비천연 아미노산으로 차지된 tRNA를 이용함으로써 단백질에 비천연 아미노산을 도입하는 것이 가능해진다.
tRNA류로서는 대장균, 효모 등의 세포로부터 정제한 tRNA를 사용할 수 있다. 또한, 안티코돈이나 그 밖의 염기를 임의로 변경한 인공 tRNA도 사용할 수 있다(J. Am. Chem. Soc. 121: 34-40(1996), Nature Biotech. 20: 177-182 (2002)). 예를 들면, CUA를 안티코돈으로서 갖는 tRNA에 비천연 아미노산을 차지함으로써, 본래 종지 코돈인 UAG 코돈을 비천연 아미노산으로 번역하는 것이 가능하다. 이 방법에서는 단백질에 점 특이적으로 비천연 아미노산을 도입할 수 있다.
그 밖에 완충액으로서는 인산칼륨 완충액(pH 7.3)이 통상적으로 사용된다.
[1-2 디술피드 결합 형성에 영향을 주는 물질]
디술피드 결합 형성에 영향을 주는 물질의 예로서, 디술피드 결합의 산화 환원을 촉매하는 효소인 산화 환원 효소 및/또는 디술피드 결합의 산화 환원 상태를 조절하는 시약인 산화 환원 시약을 들 수 있다. 보다 구체적으로는 디술피드 결합 형성에 영향을 주는 효소 및 또는 시약으로서, (가) 산화 환원을 촉매하는 효소: 글루타티온 리덕타제류, 티오레독신 리덕타제류, 프로테인 디술피드 이소머라제류, 디술피드 인터체인지 단백질류, 티오레독신형 단백질 등의 단백질 및/또는 (나) 산화 환원 상태를 조절하는 시약: 환원형 글루타티온, 산화형 글루타티온, DTT, 2-머캅토에탄올 및 티오레독신 등의 저분자 화합물을 예시할 수 있다. 본 발명에 있어서의 산화 환원 시약이란 디술피드를 환원하여 티올로 만들거나, 반대로 티올을 산화하여 디술피드를 형성시킬 수 있는 시약을 말한다.
디술피드 결합 형성에 영향을 주는 물질의 예로서의 (가) 산화 환원 효소(산화 환원을 촉매하는 효소) 및/또는 (나) 산화 환원 시약(산화 환원 상태를 조절하는 시약)은, 단백질의 디술피드 결합의 가교를 촉진ㆍ조정하는 효소류 및/또는 그의 기질을 이용하는 것이 바람직하다. 또한, (가) 산화 환원을 촉매하는 효소 및/또는 (나) 산화 환원 상태를 조절하는 시약은 반드시 번역 반응 중에 첨가할 필요는 없고, 번역 종료 후에 첨가할 수도 있다. 번역 종료 후에 첨가하는 경우에는, 첨가 후 수십 분 내지 1 시간 정도 37 ℃에서 더 정치하는 것이 바람직하다.
산화 환원 상태를 조절하는 시약으로서 DTT를 이용하는 경우에는, 농도가 0 내지 1 mM, 적합하게는 0.001 내지 0.5 mM인 것이 바람직하다. 더욱 적합하게는 0.060 내지 0.5 mM인 것이 바람직하다.
산화 환원 상태를 조절하는 시약으로서 산화형 글루타티온을 이용하는 경우에는, 농도가 0 내지 8 mM, 적합하게는, 0.1 내지 4 mM인 것이 바람직하다. 더욱 적합하게는 1 내지 4 mM인 것이 바람직하다.
상기 단백질의 합성 방법에서 디술피드 인터체인지 단백질류는 DsbA 및/또는 DsbC인 것이 바람직하다.
프로테인 디술피드 이소머라제(EC 5.3.4.1.)는 진핵 생물의 소포체 내막에 존재하는 약 55 kDa의 디술피드 결합의 형성이나 이성화ㆍ환원 반응을 촉매하는 효소이고, 샤페론(chaperone)형의 활성도 갖는다고 되어 있다. 이 단백질은 상술한 대로, 생물로부터 정제하여 성분으로서 이용할 수도 있지만, 재조합 생산된 것을 이용할 수도 있다. 소의 간장으로부터 정제한 프로테인 디술피드 이소머라제(PIR 데이타베이스 승인(accession) 번호 ISBOSS), 효모의 프로테인 디술피드 이소머라제 유전자를 대장균에 재조합하여 발현시켜 정제한 단백질 등을 사용할 수 있다.
그 외에 프로테인 디술피드 이소머라제류로서 하기 단백질이 알려져 있고, 본 발명의 프로테인 디술피드 이소머라제류로서 사용 가능하다.
인간의 단백질 디술피드-이소머라제(protein disulfide-isomerase) PIR 데이타베이스 승인 번호 ISHUSS
인간의 단백질 디술피드-이소머라제 관련 단백질(protein disulfide isomerase related protein) GenBank 승인 번호 4758304
효모의 단백질 디술피드-이소머라제 상동체(protein disulfide isomerase homolog) PIR 데이타베이스 A44483
디술피드 인터체인지 단백질류는 디술피드 인터체인지 단백질 A, B, C, D(DsbA, B , C, D)의 4종의 단백질이 대장균 등에서 알려져 있다. DsbA는 21 kDa의 티오레독신형 폴드 구조를 가지며, 디술피드 결합의 형성을 촉매한다고 생각되는 효소이다. DsbB는 4개의 막 관통 부위와 2개의 페리플라즘(periplasm) 도메인을 갖는 20 kDa의 단백질이며, DsbA를 산화형으로 유지한다고 되어 있다. DsbC는 호모 이량체를 형성하는 페리플라즘 단백질이고, 티오레독신형 폴드를 가지며, 주로 디술피드 결합의 이성화를 담당하는 효소라고 되어 있지만, 그 외에 샤페론으로서의 기능을 갖는다고 생각된다. DsbD는 분자량 59 kDa의 단백질로 2개의 페리플라즘 도메인, 8개의 막 관통 영역을 포함하는 단백질이며, DsbC의 활성 중심의 시스테인을 환원형으로 유지하는 기능을 갖는다고 생각된다.
디술피드 인터체인지 단백질류로서 하기의 단백질이 알려져 있고, 본 발명의 디술피드 인터체인지 단백질류로서 사용 가능하다.
대장균(E. coli)의 DsbA SWISS-PROT 단백질 데이터베이스 승인(protein database Accession) P24991
대장균(E. coli)의 DsbC SWISS-PROT 단백질 데이터베이스 승인(protein database Accession) P21892
살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium)의 단백질 디술피드 이소머라제(protein disulfide-isomerase) dsbA 상동체(homolog) PIR 데이타베이스 승인 번호 S32895
네이세리아 메니기티디스(Neisseria meningitidis)의 티올-디술피드 인터체인지 단백질(thiol-disulfide interchange protein) dsbA 상동체(homolog) NMB0278 PIR 데이타베이스 승인 번호 C81217
카에노라브디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)의 단백질 디술피드 이소머라제 이소폼(protein disulphide isomerase isoform) I Gene Bank 승인 번호 AAB94647
다티스카 글로머라타(Datisca glomerata)의 단백질 디술피드 이소머라제 상동체(protein disulfide isomerase homolog) Gene Bank 승인 번호 AAD28260
이들 디술피드인터체인지 단백질류는 상술한 대로 생물로부터 정제하여 성분으로서 이용할 수도 있지만, 재조합 생산된 것을 이용할 수도 있다.
산화 환원 효소로서 프로테인 디술피드 이소머라제(PDI)를 이용하는 경우, 농도가 0 μM 내지 10 μM인 것이 바람직하다. 적합하게는 0.001 내지 5 μM인 것이 바람직하다. 더욱 적합하게는 0.001 μM 내지 2 μM인 것이 바람직하다. 산화 환원 효소로서 디술피드 인터체인지 단백질를 이용한 경우, 0 μM 내지 10 μM인 것이 바람직하다. 적합하게는 0.01 내지 10 μM인 것이 바람직하다. 더욱 적합하게는 0.1 μM 내지 10 μM인 것이 바람직하다.
또한, 글루타티온 리덕타제류, 티오레독신 리덕타제류에 대해서는, 가능한 한 포함하지 않는 것이 바람직하고, 단백질 합성계를 구성하는 성분에 있어서의 티오레독신 리덕타제 및/또는 글루타티온 리덕타제의 함량이 100 ng/㎖ 이하인 것이 바람직하다.
또한, 상기 각 성분의 순도에 대해서는 측정법을 이하에 예시한다.
상기한 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, 및 DsbA 및 DsbC 등 단백질을 포함하는 성분은, 예를 들면 상기한 His tag와 니켈 칼럼을 이용한 His tag를 붙인 단백질 성분의 정제 방법에 의해 정제한 후, SDS-PAGE에서 목적 단백질을 확인하고, 각 레인의 영동 패턴을 덴시토미터로 판독하여 산출할 수 있다.
정제한 리보솜은 수크로스 밀도 구배에 의한 분석으로 순도를 측정할 수 있다.
tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오티드 3 인산류 및 FD, 기타 완충액, DTT, 산화형 글루타티온 등 통상적으로 시약으로서 시판되는 시약은 시판 시약의 순도로 사용 가능하다. 또한, 시판되는 시약은 모두, 순도는 모두 80 ％ 이상이었다.
[시험 방법 및 그것을 이용한 합성 방법]
본 발명의 시험 방법은 상기한 [분자간 또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질 합성 방법]의 반응계를 사용할 수 있다.
본 발명의 산화 환원 효소, 산화 환원 시약 농도 및 1개의 디술피드 결합에 의한 가교 형성이 가능하며, 그의 가교 형성 양식에 의해 활성이 지배되는 1개 또는 복수개의 펩티드쇄를 포함하는 합성된 단백질 활성의 3자에 대한 상관을 측정하 는 시험 방법은 다음 a) 내지 d)를 포함하는 반응계, 구체적으로는 (1) a), b) 및 c), (2) a), b) 및 d), 또는 (3) a), b), c) 및 d)를 포함하는 반응계를 사용할 수 있다.
a) 1개 또는 복수개의 주형 핵산,
b) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
d) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
이상의 반응계에서 합성된 단백질의 활성을 측정하고, 첨가한 c) 산화 환원 효소 및 d) 산화 환원 시약과의 상관을 구한다. 여기서 측정되는 단백질의 활성은 효소 활성으로 한정되지 않고, 예를 들면 수용체와 단백질의 결합 활성, 세포의 증식 활성, 이들의 비활성 등을 포함한다.
보다 구체적으로는, 우선 농도를 다양하게 변화시킨 c) 산화 환원 효소 및 d) 산화 환원 시약을 준비한다. 이 때, c) 및 d)는 각각 단독의 물질일 수도 있지만, 복수개 물질의 혼합물일 수도 있다. 이러한 산화 환원 효소의 예로서, 프로테인 디술피드 이소머라제류, 디술피드 인터체인지 단백질류 또는 그의 동족 효소 등을 예시할 수 있다. 산화 환원 시약으로서는, DTT, GSSG, GSH, 티오레독신 등을 예시할 수 있다. 이어서, 단백질의 합성 반응을 개시하지만, c) 및 d)는 단백질의 합성 반응의 최초에 첨가할 수도 있지만, 합성 반응 도중에 첨가할 수도 있고, 또한 합성 반응이 종료되고 나서 첨가할 수도 있다. 합성 반응이 종료되고 나서 첨가하는 경우에는, 첨가 후 또한 수십 분 내지 1 시간 정도 37 ℃에서 정치하는 것이 바람직하다. 이와 같이 하여 합성한 각각의 경우에 대하여, 반응액 중의 합성된 단백질의 활성을 측정한다. 여기서 합성되는 단백질은 분자내 및/또는 분자간에 1개 이상의 디술피드 결합의 가교 형성이 가능한 단백질이라면 특별히 제한은 없고, 복수개의 단백질을 동일 반응액 중에서 합성하여 헤테로올리고머 등을 형성시켜 활성을 측정하는 것도 가능하다.
이와 같이 하여, 단백질의 활성과 c) 산화 환원 효소 및/또는 d) 산화 환원 시약의 농도와의 상관 관계를 분명히 할 수 있다.
이렇게 하여 얻은 상관 관계를 이용하여, 미리 정해진 값의 활성(원하는 활성치)을 얻기 위해서 필요한 c) 산화 환원 효소 및/또는 d) 산화 환원 시약의 농도를 결정하고, 상기 원하는 활성을 발휘하는 농도가 되도록 b) 단백질 합성 반응 기본 시약에 c) 산화 환원 효소 및/또는 d) 산화 환원 시약을 첨가하고, 또한 a) 목적 단백질을 코딩하는 주형 핵산을 첨가한 반응계에서 효율적으로 목적 단백질을 생산할 수 있다.
이하에, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, (물론 이들은 예시이고, 본 발명은 이것으로 한정되지 않는다.
실시예 1
리보솜 제조
대수 증식기 중기의 E. coli A19주의 세포 300 g을 알루미나 파쇄하였다. 파쇄한 세포를 완충액 A(pH 7.6의 10 mM 헤페스-수산화칼륨(HEPES-KOH), 10 mM 염화마그네슘(MgCl2), 50 mM 염화칼륨(KCl), 1 mM DTT에 현탁시키고, 알루미나와 세포 파쇄물을 원심 분리(30,000 g, 4 ℃에서 1 시간)하여 제거하였다. 얻어진 상청 분획에 종료 농도가 1 ㎍/㎖가 되도록 디옥시리보뉴클레아제(DNase)를 첨가한 후, 원심(100,000 g, 4 ℃에서 4 시간)하였다. 펠릿을 완충액 A에 현탁시켜 리보솜의 조추출액으로 하였다. 이 리보솜 조추출액을 6 내지 36 ％(w/v)의 수크로스 밀도 구배 원심에 적용하여, 도 1에 나타낸 분획을 분별하였다. 이 리보솜 분획을 100,000 g에서 원심 분리하고, 그 펠릿을 리보솜 완충액(pH 7.6의 20 mM HEPES-KOH, 6 mM MgOAc, 30 mM NH4Cl, 7 mM β-머캅토에탄올(mercaptoethanol)에 현탁시켜 정제 리보솜을 제조하였다. 정제한 리보솜의 일부를 6 내지 36 ％(w/v)의 수크로스 밀도 구배로 분석한 결과, 단일 피크를 형성하고, 그의 순도는 90 ％ 이상이었다.
실시예 2
아미노아실 tRNA 신테타제(ARS) 고발현용 플라스미드의 구축과 형질 전환체의 제조
E. coli A19주로부터 추출한 게놈을 주형으로 하여 알라닐 tRNA 신테타제를 코딩하는 유전자 서열을 PCR법에 의해 증폭시키고, 5' 말단에 SphI, 3' 말단에 HindIII이 인식하는 서열을 갖는 DNA 단편을 얻었다. 얻어진 DNA 단편을 미리 SphI 및 HindIII으로 절단한 플라스미드 pQE30(키아겐사 제조)에 삽입하고, N 말단에 His-Tag가 융합된 알라닐 tRNA 신테타제를 고발현시키기 위한 벡터를 얻었다. 얻어진 벡터로 E. coli BL21/pREP4를 형질 전환하였다. 그 밖의 ARS를 고발현하는 벡터도 동일한 수법으로 구축하였다. 표 1에 사용한 벡터, 제한 효소, His-Tag의 위치를 나타낸다. 또한, 표 1에 있어서의 플라스미드의 pQE 시리즈는 E. coli BL21/pREP4의 형질 전환에, pET 시리즈는 E. coli BL21/DE3의 형질 전환에 각각 이용되었다.
Figure 112006088215666-PCT00001
실시예 3
그 밖의 단백질 인자ㆍ효소의 고발현 플라스미드의 구축
실시예 2와 동일한 방법으로 다음에 나타내는 단백질 인자ㆍ효소의 고발현 플라스미드를 구축하였다. MTF, T7RNA 폴리머라제, IF1, IF2, IF3, EF-G, EF-Tu, EF-Ts 및 RF1. 또한, 표 1에 기재하지 않은 단백질 인자ㆍ효소에 대해서도 동일한 방법으로 플라스미드를 구축하였다. 또한, 벡터는 pQE 시리즈 또는 pET 시리즈를 이용하여 E.coli BL21/pREP4 또는 E. coli BL21/DE3의 형질 전환에 각각 이용되었다.
실시예 4
단백질 인자ㆍ효소의 고발현과 정제
His-Tag가 붙은 알라닐 tRNA 신테타제를 고발현시키기 위해서, 실시예 2에서 얻어진 형질 전환체 E. coli BL21/pREP4 세포를 6 리터의 LB 배지에서 660 nm의 흡광도가 0.7이 될 때까지 배양하였다. 이 배양액에 종료 농도가 0.1 mM이 되도록 이소프로필-1-티오-β-D-갈락토시드(IPTG)를 첨가하여 37 ℃에서 4 시간 더 배양하였다. 이 배양액을 원심 분리하여 얻어진 세포를 현탁 완충액(pH 7.6의 50 mM HEPES-KOH, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2, 0.3 mg/㎖ 난백 리소자임, 0.1 ％ TritonX-100, 0.2 mM 페닐메탄술포닐플루오리드(PMSF), 6 mM β-머캅토에탄올)에 현탁시켰다. 이 현탁액을 초음파 처리하여 세포를 파괴하였다. 초음파 처리한 현탁액을 원심 분리(100,000 g, 4 ℃에서 1 시간)하여 세포 파쇄물을 제거하였다. 얻어진 상청 분획을 Ni2 +로 프리차지된 10 ㎖의 Hi-Trap 킬레이팅(chelating) 칼럼(파마시아사 제조)에 적용하고, 10 mM의 이미다졸을 포함하는 100 ㎖의 HT 완충액(pH 7.6의 50 mM HEPES-KOH, 1 M NH4Cl, 10 mM MgCl2)으로 세정하였다. HT 완충액에 포함되는 이미다졸 농도를 10으로부터 400 mM까지 직선적으로 구배를 두어, His-Tag가 붙은 알라닐 tRNA 신테타제를 칼럼으로부터 용출하였다. 정제된 단백질을 포함하는 분획을 합하여 스톡 완충액(pH 7.6의 50 mM HEPES-KOH, 100 mM KCl, 10 mM MgCl2, 30 ％ 글리세롤(glycerol))로 투석하였다. 정제한 His-Tag가 붙은 알라닐 tRNA 신테타제의 농도는 Protein Assay Kit(Bio-Rad사 제조)를 이용하여 소혈청 알부민(BSA)을 기준으로 제조한 검량선으로부터 산출하였다. 정제한 His-Tag가 붙은 알라닐 tRNA 신테타제는 1 ㎖씩 조금씩 나누어 액체 질소로 급냉동시킨 후 -80 ℃에서 보존하였다. 그 밖의 His-Tag가 붙은 알라닐 tRNA 신테타제(AlaRS), 아르기닌 tRNA 신테타제(ArgRS), 아스파라긴 tRNA 신테타제(AsnRS), 아스파라긴산 tRNA 신테타제(AspRS), 시스테인 tRNA 신테타제(CysRS), 글루타민 tRNA 신테타제(GlnRS) 및 글루탐산 tRNA 신테타제(GluRS)도 동일한 수법으로 정제를 행하였다. His-Tag가 붙은 인자의 12 ％ SDS-PAGE에 의한 분리(쿠마린 브릴리언트 블루로 염색)을 도 2에 나타낸다. 덴시토미터로 순도를 산출한 결과, 어느 인자도 순도는 90 ％ 이상이었다. 또한, 도 2에 나타내지 않은 표 1의 그 밖의 인자ㆍ효소도 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 덴시토미터로 순도를 산출하는 동일한 방법으로 조사한 결과, 모두 순도는 90 ％ 이상이었다.
실시예 5
번역 실험(일반적 방법)
단백질 합성 반응 기본 시약 50 ㎕당 조성은 이하와 같다. 2 mM ATP, 2 mM GTP, 1 mM CTP, 1 mM UTP, 10 mM 크레아틴 인산(creatine phosphate), 2.8 A 260 유닛(unit) tRNA 믹스, 0.5 ㎍ FD, 0.1 mM 각 아미노산, 9 mM 아세트산마그네슘, pH 7.3의 5 mM 인산칼륨, 95 mM 글루탐산칼륨, 5 mM 염화암모늄, 0.5 mM 염화칼슘, 1 mM 스페르미딘(spermidine), 8 mM 푸트레신(putrescine), 12 pmol 리보솜, 1 ㎍ IF1, 2 ㎍ IF2, 0.75 ㎍ IF3, 1 ㎍ EF-G, 2 ㎍ EF-Tu, 1 ㎍ EF-Ts, 0.5 ㎍ RF1, 0.5 ㎍ RF3, 0.5 ㎍ RRF, 30 내지 300 유닛 각 ARS 및 MTF, 0.2 ㎍ 크레아틴 키나제(CK; creatine kinase), 0.15 ㎍ 미오키나제 (MK; myokinase), 0.054 ㎍ 뉴클레오시드 이인산 키나제(NDK; nucleoside diphosphate kinase), 1.78 단위 PPiase 및 0.5 ㎍ T7RNA 폴리머라제. 이 단백질 합성 반응 기본 시약에 1 pmol의 주형 DNA를 첨가하여 37 ℃에서 1 시간 반응을 행하였다.
또한, 반응 후, 리보솜을 제거할 필요가 있을 때에는, 100 kDa 이하의 물질을 통과시키는 한외 여과막에 통과시켜 리보솜을 제거하였다.
또한, 상기 조성 중, 리보솜 및 표 1에 기재된 것은 실시예 1 및 실시예 4에서 제조되어 순도가 측정되었다. 그 밖의 성분은 시판되는 정제 시약을 사용하였다.
또한, 본 조성을 이하의 실시예 6 내지 12에서 사용하는 경우에도, 표 1에 기재된 것, 리보솜, DsbA 및 DsbC는 실시예 1, 4 및 13에서 제조되어 순도가 측정되었다. 그 이외의 성분은 시판되는 정제 시약을 이용하였다.
실시예 6
인간 리소자임의 합성
리소자임은 본래 분자내에 4개의 디술피드 결합을 갖는 단백질이고, 4개 중 2개 이상의 디술피드 결합이 가교되지 않으면 활성을 나타내지 않는 것이 보고되어 있고(J. Biol. Chem. 251: 3147-3153(1976)), 예전부터 구조와 활성의 상관을 조사하기 위한 모델 단백질로서 널리 사용되었다. 여기서는, 본 발명에 의한 방법 및 종래법으로 인간 리소자임을 합성하여 단백질의 합성량과 비활성을 조사하였다.
인간 리소자임의 cDNA 클론(human gene collection, Stratagene사)으로부터, 다음 2개의 프라이머를 이용하여 PCR법에 의해 약 0.42 kbp의 성숙형 인간 리소자임에 상당하는 유전자를 증폭시켰다.
포워드 프라이머의 서열은 다음과 같다:
Figure 112006088215666-PCT00002
리버스 프라이머의 서열은 다음과 같다:
Figure 112006088215666-PCT00003
이어서,
Figure 112006088215666-PCT00004
Figure 112006088215666-PCT00005
의 서열을 갖는 포워드 프라이머 및 상기 리버스 프라이머를 이용하여, PCR법에 의해 T7 프로모터 영역을 포함하는 약 0.51 kbp의 주형 DNA를 증폭시켰다. 주형 DNA의 서열을 서열 목록, 서열 4에 나타내었다.
실시예 5에 기재된 단백질 합성 반응 기본 시약(본 발명에 의한 방법) 및 그의 반응 시약에 1 mM DTT를 첨가한 반응액 50 ㎕(종래법)에, 제조된 주형 DNA 1 pmol을 각각 첨가하여 단백질 합성 반응을 행하였다.
합성된 단백질은 SDS-PAGE로 분리하고, SYPRO Orange(아마샴 파마시아사 제조)로 염색하였다. 분자량 17000의 인간 리소자임의 밴드를 기지 농도의 BSA와 비교하여, 합성된 인간 리소자임의 농도를 구하였다. 인간 리소자임의 활성은 Micrococcus luteus ATCC 4698주의 동결 건조균 분말(시그마사 제조)를 이용하여 450 nm의 흡광도를 1 분당 0.001 저하시키는 양을 1 유닛으로 하여 측정하였다(Imoto T., Johnson L. N., North A. T. C., Phillips D. C., Rupley J. A., The Enzymes, 3rd ed., 7, 665-868(1972)). 도 3에 합성된 단백질의 전기 영동 사진을, 도 4에 비활성을 각각 나타내었다. 도 3 및 도 4로부터 분명한 바와 같이, 종래법에서는 전기 영동으로 합성된 단백질은 확인할 수 있지만 활성은 전혀 확인되지 않는데, 본 발명에 의한 방법에서는 약 300 units/mg의 비활성이 확인되고, 본 발명에 의한 방법으로 디술피드 결합을 본래 갖는 단백질이 정확하게 폴딩되는 것을 알았다. 또한, 디술피드 결합을 갖는 그 밖의 단백질에 대해서도 조사한 결과, 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 7
마우스 인터루킨 6(mIL6)의 합성
마우스 cDNA 라이브러리를 이용하여 실시예 6과 동일한 방법으로 mIL6을 제조하였다. 또한, 대장균 게놈 DNA를 이용하여 실시예 6과 동일한 방법으로 대장균 디히드로엽산 환원 효소(DHFR)의 주형 DNA를 제조하였다. 실시예 5의 단백질 합성 반응 기본 시약에 1 mM의 DTT를 첨가한 반응 용액(종래법), 실시예 5의 단백질 합성 반응 기본 시약, 실시예 5의 기본 시약에 최종 농도 2, 4, 8 mM의 GSSG를 각각 첨가한 총 5 종류의 반응 용액을 준비하고, 그의 각각에 1 pmol의 주형 DNA를 첨가하여 각각의 단백질을 합성하였다. DHFR을 합성한 경우에는, 합성 후에 한외 여과막을 통과시킨 용액을, mIL6을 합성한 경우에는 합성 반응액을 각각 SDS-PAGE에 적용하여, SYPRO Red에 의해 단백질을 형광 염색하였다. 염색 패턴을 플루오로이메이저에서 해석하고, mIL6과 DHFR의 염색 농도로부터 용액 중의 단백질량을 계산하였다. 구한 mIL6의 단백질량을 도 5에, DHFR의 단백질량을 도 6에 각각 나타내었다. 도 5 및 도 6으로부터 분명한 바와 같이, 분자내에 디술피드 결합을 갖지 않는 DHFR을 합성한 경우에는, 종래법에 의한 생산량이 가장 많고, 본 발명에 의한 방법에서는 단백질 합성량이 저하되었지만, 반대로 분자내에 디술피드 결합을 갖는 mIL6을 합성한 경우에는, 종래법보다 본 발명에 의한 방법이 생산된 단백질량이 많은 것이 판명되었다. 또한, mIL6의 주형 DNA 대신에 다른 디술피드 결합을 갖는 단백질의 주형 DNA를 이용하여 동일한 실험을 행하였지만, 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 8
프로테인 디술피드 이소머라제(PDI)의 영향
실시예 5의 단백질 합성 반응 기본 시약에 2 mM의 GSSG를 첨가한 반응 용액을 준비하였다. 이 반응 용액을 4개 준비하였다. 이 반응 용액에 또한 소 유래 PDI(다카라바이오사 제조)를 최종 농도 0 μM, 0.0325 μM, 0.13 μM, 0.52 μM이 되도록 각각 첨가하였다. 이들 반응 용액 각각 50 ㎕에 인간 리소자임의 주형 DNA를 1 pmol 첨가하여 단백질을 합성하였다. 실시예 6과 동일한 방법으로 리소자임의 비활성을 구하였다. 도 7에는 반응계에 첨가한 PDI의 농도와 합성된 인간 리소자임의 비활성의 관계를 나타내었다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, PDI를 0.0325 μM 이상 첨가함으로써, 디술피드 결합을 갖는 단백질의 비활성이 보다 높아지는 것을 알았다. 또한, 본 발명의 방법을 사용하여 PDI의 활성을 측정할 수 있음을 알았다. 또한, 소의 PDI 대신에 다른 종류의 PDI 및 디술피드 인터체인지 단백질류를 사용한 경우에도 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 9
디티오스레이톨 (DTT) 농도의 영향
실시예 5의 단백질 합성 반응 기본 시약에 0.13 μM의 PDI를 첨가한 반응 용액을 6개 제조하였다. 이 반응 용액에 또한 최종 농도 1000 μM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 62.5 μM, 0 μM의 DTT를 각각 첨가하였다. 이들 반응 용액 각각 50 ㎕에 인간 리소자임의 주형 DNA를 1 pmol 첨가하여 단백질을 합성하였다. 실시예 6과 동일한 방법으로 리소자임의 활성을 구하였다. 도 8에 결과를 나타내었다. 이 도면으로부터 분명한 바와 같이, DTT의 농도가 125 μM 이하이면, 리소자임이 강한 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
실시예 10
알칼리 포스파타제의 합성
알칼리 포스파타제는 분자내에 2개의 디술피드 결합을 갖는 단백질이며, 디술피드 결합의 형성과 그 효소 활성과의 관계에 대하여 예전부터 잘 조사된 모델 단백질이다. 여기서는 알칼리 포스파타제를 합성하였다.
대장균 게놈 DNA 및 대장균 알칼리 포스파타제에 특이적인 PCR 프라이머를 이용하여, 실시예 6과 동일한 방법으로 대장균 알칼리 포스파타제의 주형 DNA를 제조하였다. 실시예 5의 단백질 반응 기본 시약에 1 mM DTT 및 0.13 μM PDI를 첨가한 반응 용액을 5개 준비하여 0, 1, 2, 3, 4 mM의 GSSG를 각각 첨가하였다.
이 반응 용액 각각 50 ㎕에 알칼리 포스파타제 유전자의 주형 DNA를 1 pmol 첨가하여 단백질을 합성하였다. 합성된 단백질 농도는 실시예 5와 동일한 방법에 의해 구하였다. 합성된 알칼리 포스파타제는 p-니트로페닐인산 이나트륨염(nitrophenyl phosphate disodium salt)을 기질로서 이용하여, 405 nm의 흡광도를 측정함으로써 측정하였다(Biochim Biophys Acta. 258: 178-87(1972)). 도 9에 알칼리 포스파타제의 상대활성을 나타내었다. 도 9로부터 분명한 바와 같이, 알칼리 포스파타제는 종래법, 즉 1 mM DTT 및 0.13 μM PDI를 첨가한 단백질 반응 기본 시약에서는 전혀 활성을 나타내지 않은 것에 대하여, 본 발명에 의한 방법, 즉 GSSG를 1 mM 또는 2 mM 첨가한 반응 용액에서는 활성이 확인되었다. DTT가 계에 1 mM 존재하더라도, 알칼리 포스파타제가 활성을 나타내고, 합성된 단백질이 정확하게 폴딩되는 것이 밝혀졌다. 또한, 실시예 5의 반응액에 1000 μM, 500 μM, 250 μM, 125 μM, 0 μM의 DTT를 첨가한 반응액을 각각 제조하였다. 상기와 동일하게 주형 DNA를 첨가하여 단백질을 합성 후, 알칼리 포스파타제의 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. PDI 비존재하에서 DTT만 농도를 변화시킨 결과, 500 μM 이하에서 알칼리 포스파타제가 활성을 나타내는 것이 밝혀졌다.
실시예 11
DsbC의 영향
대장균의 DsbC를 PCR에 의해 증폭시키고, 5' 말단에 BamHI, 3' 말단에 HindIII이 인식하는 서열을 갖는 DNA 단편을 얻은 점을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 dsbC를 고발현시키는 벡터를 구축하고, 얻어진 벡터로 E. coli BL21/pREP4를 형질 전환하였다. 실시예 4와 동일한 방법으로, 정제된 DsbC를 얻었다. 단백질의 순도는 90 ％ 이상이었다. 실시예 5의 단백질 합성 기본 시약에 1 mM DTT 및 2 mM GSSG를 첨가한 반응 용액 50 ㎕를 3개 제조하였다. 이들 반응 용액에 각각 0, 0, 0.5 μM의 DsbC 및 0, 1, 1 pmol의 실시예 6의 인간 리소자임 유전자의 주형 DNA를 각각 첨가하였다. 실시예 6과 동일한 방법으로 합성된 단백질량과 리소자임의 활성을 측정하였다. 도 11에 비활성을 나타내었다. 도 11로부터 분명한 바와 같이, DsbC를 첨가함으로써 리소자임의 비활성은 대폭 상승하는 것이 밝혀졌다. 또한, DsbC 대신에 다른 디술피드 인터체인지 단백질을 이용한 경우, 및 복수 종류의 디술피드 인터체인지 단백질을 동시에 이용한 경우에도 거의 동일한 결과가 얻어졌다.
실시예 12
본 발명의 단백질 합성 기본 시약과 종래의 세포 추출액과의 비교
대장균의 세포 추출액을 사용하는 시험관내 단백질 합성계(Rapid Translation System 100; 로슈사 제조)를 이용하여, GSSG를 최종 농도 0, 1, 2, 3 mM이 되도록 첨가한 점을 제외하고, 제품의 설명서에 따라서 대장균의 알칼리 포스파타제를 합성하였다. 또한, 실시예 10과 동일하게, 본 발명의 방법으로 대장균의 알칼리 포스파타제를 합성하였다. 합성한 알칼리 포스파타제의 비활성을 도 12에 나타내었다. 도 12로부터 분명한 바와 같이, 대장균의 세포 중 추출액을 사용하는 시스템에서는 알칼리 포스파타제의 활성이 GSSG를 다양한 농도로 첨가하더라도 전혀 확인되지 않는 것에 대하여, 본 발명의 합성 방법에서는 높은 활성이 확인되었다.
실시예 13
EF-Tu, 및 DsbA 및 DsbC의 순도 확인
EF-Tu에 His 태그를 붙인 단백질이 발현되고 있는 세포를 얼음 중에서 초음파 처리하고, 로딩 버퍼(300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, pH 8.0)에 현탁시켜 세포의 용해물을 원심 분리하였다(30,000 g, 4 ℃에서 30 분간). 상기에서 얻어진 상청에, 얼음으로 식힌 로딩 버퍼 중에서 평형화한 50 ％의 Ni2 +-NTA 슬러리(키아겐(Qiagen)사 제조)를 첨가하였다. 4 ℃에서 1 시간 교반하였다. 수지를 칼럼에 로딩하고, 칼럼 용량의 20배의 로딩 버퍼로 4 ℃에서 칼럼을 세정하였다. 칼럼 용량의 20배의 로딩 버퍼(10 mM 이미다졸, pH 8.0을 포함함)로 4 ℃에서 칼럼을 세정하였다. 칼럼 용량의 20배의 로딩 버퍼를 이용하여 이미다졸의 농도 구배를 10 내지 250 mM이 되도록 설정하고, 칼럼으로부터 목적 단백질의 용출을 행하여 1 ㎖씩 분획을 모았다. SDS-PAGE로 목적 단백질을 확인하였다. 각 레인의 영동 패턴을 덴시토미터로 판독하여 순도를 산출하였다. 도 13에 EF-Tu의 용출 분획의 전기 영동 사진을 나타내었다. 레인의 영동 패턴을 덴시토미터로 판독하여 순도 90 ％ 이상의 EF-Tu 분획을 모았다.
또한, 도 14에는 정제한 DsbA(레인 1) 및 DsbC(레인 2)의 전기 영동 사진을 나타내었다. 모든 효소의 순도는 90 ％ 이상이었다.
[단백질 합성 방법]
본 발명에 의한 방법에서는, 종래 반응액에서 제거하는 것이 바람직하다고 하였던 DTT를 수 μM부터1 mM까지 첨가할 수도 있고, 또한 DTT를 전혀 첨가하지 않는 것도 가능하다.
또한, 종래의 DTT를 제거한 무세포 단백질 합성계를 이용하는 방법에서는 단백질에 디술피드 결합을 형성시킬 수 있어도, 상기 조건하에서는 단백질 자체의 합성량은 저하되어 목적으로 하는 활성을 갖는 단백질의 합성 효율은 나빠진다고 일반적으로 생각되었지만, 본 발명과 같이, 재구성 단백질 합성계를 이용하면 단백질의 합성량은 변하지 않거나 오히려 증가하는 경우가 있고, 보다 효율적으로 단백질을 합성하는 것이 가능하였다.
[효소 측정법]
본 발명에 의한 활성 측정법에서는, 기질은 단백질 합성 반응에 의해 디술피드 결합을 갖지 않는 1 본쇄의 폴리펩티드로서 합성되기 때문에, 환원하여 변성시키는 단계가 필요없고, 합성과 동시에 또는 합성 후에 활성을 측정하는 효소를 첨가하여 폴딩된 단백질의 활성이나 구조를 지표로 한다. 그 때문에 필요한 단계과 시간이 종래법에 비해 대폭 적다고 하는 특징이 있다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 포함하는 것으로 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Post Genome Institute Co., Ltd. <120> In vitro synthesis of disulfide bond containing protein <130> PH-2448-PCT <150> JP 2004-136520 <151> 2004-04-30 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 1 aaggagatat accaatgaag gtctttgaaa ggtgtg 36 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 2 ggattagtta ttcattacac tccacaacct tgaacat 37 <210> 3 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60 ttaactttaa gaaggagata tacca 85 <210> 4 <211> 495 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gaaattaata cgactcacta tagggagacc acaacggttt ccctctagaa ataattttgt 60 ttaactttaa gaaggagata taccaatgaa ggtctttgaa aggtgtgagt tggccagaac 120 tctgaaaaga ttgggaatgg atggctacag gggaatcagc ctagcaaact ggatgtgttt 180 ggccaaatgg gagagtggtt acaacacacg agctacaaac tacaatgctg gagacagaag 240 cactgattat gggatatttc agatcaatag ccgctactgg tgtaatgatg gcaaaacccc 300 aggagcagtt aatgcctgtc atttatcctg cagtgctttg ctgcaagata acatcgctga 360 tgctgtagct tgtgcaaaga gggttgtccg tgatccacaa ggcattagag catgggtggc 420 atggagaaat cgttgtcaaa acagagatgt ccgtcagtat gttcaaggtt gtggagtgta 480 atgaataact aatcc 495

Claims (37)

  1. 하기 a) 및 b) 및 c) 및/또는 d)를 포함하는 반응계를 이용한, 분자간 또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질 합성 방법.
    a) 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 1개 또는 복수개의 주형 핵산,
    b) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 디술피드 결합의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    d) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 디술피드 결합의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
  2. 제1항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 단백질의 디술피드 결합의 촉진 및/또는 디술피드 결합의 이성화를 촉매하는 효소인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 프로테인 디술피드 이소머라제(PDI)류 또는 디술피드 인터체인지 단백질류로 이루어지는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  6. 제5항에 있어서, 프로테인 디술피드 이소머라제의 농도가 0 μM 내지 10 μM인 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 디술피드 인터체인지 단백질의 농도가 0 μM 내지 10 μM인 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 시약이 디티오스레이톨 또는 산화형 글루타티온인 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  9. 제8항에 있어서, 산화형 글루타티온 농도가 0 내지 8 mM인 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 디티오스레이톨의 농도가 0 내지 1 mM인 단백질 합성 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 반응계에 포함되는 티오레독신 리덕타제 농도가 100 ng/㎖를 넘지 않는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 반응계에 포함되는 글루타티온 리덕타제 농도가 100 ng/㎖를 넘지 않는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  13. 하기 a) 및 b) 및 c) 및/또는 d)를 포함하는 반응계에서, 산화 환원 효소 시약 농도 및 산화 환원 시약 농도를 변화시켜 분자내 또는 분자간에 1개 이상의 디술피드 결합에 의한 가교 형성이 가능하며, 그의 가교 형성 양식에 의해 활성이 지배되는 1개 또는 복수개의 펩티드쇄를 포함하는 단백질을 합성하고, 상기 단백질의 활성을 측정함으로써 상기 단백질의 활성, 산화 환원 효소 시약 농도 및 산화 환원 시약 농도의 3자에 대한 상관을 측정하는 시험 방법.
    a) 목적하는 단백질을 코딩하는 1개 또는 복수개의 주형 핵산,
    b) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    d) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
  14. 제13항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  15. 제13항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 단백질의 디술피드 결합의 촉진 및/또는 디술피드 결합의 이성화를 촉매하는 효소인 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 프로테인 디술피드 이소머라제류 또는 디술피드 인터체인지 단백질류로 이루어지는 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 농도 0 μM 내지 10 μM의 프로테인 디술피드 이소머라제류인 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 효소가 농도 0 μM 내지 10 μM의 디술피드 인터체인지 단백질인 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  20. 제13항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 산화 환원 시약이 디티오스레이톨 또는 산화형 글루타티온인 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  21. 제20항에 있어서, 산화형 글루타티온 농도가 0 내지 8 mM인 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  22. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 반응계에 포함되는 티오레독신 리덕타제 농도가 100 ng/㎖를 넘지 않는 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  23. 제13항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 반응계에 포함되는 글루타티온 리덕타제 농도가 100 ng/㎖를 넘지 않는 것을 특징으로 하는 시험 방법.
  24. 하기 a), b) 및 c)를 포함하는 단백질의 디술피드 결합의 촉진 및/또는 디술피드 결합의 이성화를 촉매하는 효소의 활성 측정법.
    a) 1개 또는 복수개의 주형 핵산
    b) 화합물, 존재량 및 순도가 특정되어 있는 복수개의 화합물군을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약
    c) 화합물, 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 시약을 포함하는 산화 환원 시약.
  25. 제24항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 측정법.
  26. 제24항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산 (FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 활성 측정법.
  27. 하기 a) 및 b)를 포함하는 기본 단백질 합성 반응계에 대하여, c) 산화 환원을 촉매하는 효소의 농도 및/또는 d) 산화 환원 상태를 조절하는 시약의 농도를 변화시켜 첨가하고, 분자내 또는 분자간에 1개 이상의 디술피드 결합에 의한 가교 형성이 가능하며, 그의 가교 형성 양식에 의해 활성이 지배되는 1개 또는 복수개의 단백질을 합성하고, 상기 단백질의 활성을 측정함으로써 상기 단백질의 활성, 산화 환원을 촉매하는 효소의 농도 및 산화 환원 상태를 조절하는 시약 농도의 3자에 대한 상관을 측정함으로써, 목적하는 단백질의 활성이 미리 결정된 활성을 넘는 c) 및 또는 d)의 농도를 결정하는 방법.
    a) 목적으로 하는 1개 또는 복수개의 단백질을 코딩하는 1개 또는 복수개의 주형 핵산,
    b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    d) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
  28. 제27항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 다음 공정을 포함하는 분자간 또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질 합성 방법.
    (1) a) 목적으로 하는 1개 또는 복수개의 단백질을 코딩하는 1개 또는 복수개의 주형 핵산 및
    b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    및
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소, 및/또는
    d) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약
    을 포함하는 단백질 합성 반응계에서, c) 산화 환원을 촉매하는 효소의 농도 및/또는 d) 산화 환원 상태를 조절하는 시약의 농도를 변화시킨 복수개의 합성 조건하에서, 분자내 또는 분자간에 1개 이상의 디술피드 결합에 의한 가교 형성이 가능하 며, 그의 가교 형성 양식에 의해 활성이 지배되는 1개 또는 복수개의 폴리펩티드를 포함하는 단백질을 합성하고, 상기 단백질의 활성을 측정함으로써 상기 단백질의 활성과 산화 환원을 촉매하는 효소의 농도 및 산화 환원 상태를 조절하는 시약 농도의 3자에 대한 상관을 결정하며, 목적하는 단백질의 활성과 미리 결정된 활성보다 커지는 c) 및/또는 d)의 농도를 결정하는 공정, 및
    (2) 상기 결정된 c) 및/또는 d) 농도가 되도록 제조한 상기 a) 및 b) 및 c) 및/또는 d)를 포함하는 단백질 합성 반응계를 목적하는 단백질을 합성하는 공정.
  30. 제29항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  31. 제29항에 있어서, 단백질 합성 반응 기본 시약이 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 아미노산류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 합성 방법.
  32. 이하의 a) 및 b) 및/또는 c)를 포함하는 키트.
    a) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종 결 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 아미노산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
  33. 이하의 a) 및 b) 및/또는 c)를 포함하는 키트.
    a) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 아미노산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
  34. 이하의 a) 및 b) 및/또는 c)를 포함하는 키트.
    a) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, 종결 인자류, RNA 폴리머라제류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 아미노산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조절하는 산화 환원 시약.
  35. 이하의 a) 및 b) 및/또는 c)를 포함하는 키트.
    a) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 리보솜, 개시 인자류, 연장 인자류, RNA 폴리머라제류, 아미노아실 tRNA 신타제류, 메티오닐 tRNA 트랜스포르밀라제류, tRNA류, 리보뉴클레오시드 3 인산류, 아미노산류, 10-포르밀 5,6,7,8-테트라히드로엽산(FD), 염류 및 물을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약,
    b) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원을 촉매하는 산화 환원 효소,
    c) 존재량 및 순도가 특정되어 있는 1개 또는 복수개의 산화 환원 상태를 조 절하는 산화 환원 시약.
  36. 제32항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 컨트롤용으로 컨트롤 단백질을 코딩하는 주형 핵산을 포함하는 키트.
  37. 하기 a) 및 b)를 포함하는 반응계를 이용한, 분자간 또는 분자내에 디술피드 결합을 갖는 단백질 합성 방법.
    a) 목적으로 하는 단백질을 코딩하는 1개 또는 복수개의 주형 핵산,
    b) 존재량 및 순도가 각각 특정되어 있는 복수개의 성분을 포함하고, 주형 핵산을 첨가함으로써 주형 핵산이 코딩되는 단백질의 합성 반응이 일어나는 단백질 합성 반응 기본 시약.
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