WO2005103247A1 - オリゴヌクレオチドプローブ - Google Patents

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WO2005103247A1
WO2005103247A1 PCT/JP2005/007666 JP2005007666W WO2005103247A1 WO 2005103247 A1 WO2005103247 A1 WO 2005103247A1 JP 2005007666 W JP2005007666 W JP 2005007666W WO 2005103247 A1 WO2005103247 A1 WO 2005103247A1
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WO
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group
compound
oligonucleotide probe
oligonucleotide
solution
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Application number
PCT/JP2005/007666
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuo Komatsu
Naoshi Kojima
Ken Nonaka
Yumi Fujinawa
Junya Hashida
Isamu Muto
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Hitachi Software Engineering Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
DNA Chip Research Inc
Original Assignee
Hitachi Software Engineering Co Ltd
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
DNA Chip Research Inc
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Publication date
Application filed by Hitachi Software Engineering Co Ltd, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST, DNA Chip Research Inc filed Critical Hitachi Software Engineering Co Ltd
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Ceased legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/22—Amides of acids of phosphorus
    • C07F9/24—Esteramides
    • C07F9/2404—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
    • C07F9/2408—Esteramides the ester moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic of hydroxyalkyl compounds

Definitions

  • the present invention relates to an oligonucleotide probe composed of a linker having an aromatic group and an oligonucleotide, a carrier having the oligonucleotide probe immobilized thereon, and a compound for synthesizing the oligonucleotide probe.
  • a functional group such as an amino group is introduced into an oligonucleotide via a linker (Coulleta 1-, Tetrahedron, vol. 27, 3991-3994 (19986) ) And Connolly, B. A., Nucleic Acids Res., Vol. 1, 5, 3 1 3 1—3 13 9 (1 98 7))).
  • linker the most frequently used linker with an amino group is a linker having 6 carbon atoms.
  • Oligonucleotide probes to which an amino group is bound via this linker are also commercially available as a probe library for a DNA chip (for example, MWG, Sigma dienosis, etc.).
  • a functional group such as an amino group or a mercapto group is introduced during the synthesis of the oligonucleotide.
  • reagents for introducing an amino group into an oligonucleotide include an amidite compound in which the amino group is protected with a trifluoroacetyl group or a monomethoxytrityl group.
  • the reagents as described above have a problem that the efficiency of introducing an amino group into an oligonucleotide is low.
  • the purified amino group-introduced oligonucleotide obtained above is immobilized on a carrier, sufficient reactivity of the amino group with the coating agent on the carrier surface is low, and sufficient oligonucleotide is immobilized on the carrier. Contains a high concentration of oligonucleotides I needed to spot the tide. As a result, a large number of oligonucleotides were required, which increased the price of the chip. Therefore, it has been desired to effectively immobilize the oligonucleotide probe on a carrier.
  • An object of the present invention is to provide an oligonucleotide probe which is firmly immobilized on a carrier, can be easily purified after synthesis, and efficiently retains a complementary target nucleic acid.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, synthesized a novel compound in which a reactive functional group required for immobilization to a carrier was linked to an aromatic group, and converted this into an oligonucleotide.
  • the inventors have found that the above-mentioned problems can be solved by introducing the present invention, and have completed the present invention.
  • the present invention includes the following inventions.
  • Oligonucleotide probe (Wherein A represents an oligonucleotide, D represents a divalent organic group having at least one aromatic group, and B represents a reactive functional group or a protected form thereof) Oligonucleotide probe.
  • R 2 is a general formula 3:
  • R 3 has the general formula 4:
  • R 4 is a direct bond or one (CH 2 ) (OCH 2 CH 2 ) q — O—,
  • R c and R 6 are each independently a direct bond or a group shown below:
  • n and t each independently represent an integer from 0 to 20,
  • n, w, i, and q each independently represent an integer of 1 to 20,
  • R 7 represents a hydrogen atom or a phosphate protecting group
  • L represents a divalent aromatic group, represents a hydrogen atom or a substituent
  • R 12 , 3 and R 14 each independently represent a direct bond or a substituted or unsubstituted divalent hydrocarbon group which may contain a hetero atom, and A ′ represents a hydroxyl group or an oligonucleotide. ).
  • OR 8 (where D 'represents a divalent organic group having at least one aromatic group, and B is Represents a reactive functional group or a protected form thereof, o represents an oxygen atom, P represents a phosphorus atom, R 8 represents a phosphate protecting group, R 9 and. Is an organic group, and may form a ring together with the nitrogen atom to which they are bonded.)
  • D ′ is a linear or branched, substituted or unsubstituted divalent hydrocarbon group optionally containing a heteroatom, and has at least one aromatic group. 15. The compound according to any one of 5).
  • L represents an aromatic group, represents a hydrogen atom or a substituent
  • R 2 , R 2 ′ and R 3 each independently represent a direct bond or a substituted or unsubstituted hetero atom.
  • R 2 is a general formula 3:
  • R 3 has the general formula 4: One HN NH (CH 2 ) t — R 6- (CH 2 ) w- (4)
  • R 4 is a direct bond or one (CH 2 ) i— ( ⁇ CH 2 CH 2 ) q — 0_, and R 5 and R 6 are each independently a direct bond or a group shown below:
  • n and t each independently represent an integer from 0 to 20,
  • n, w, i, and q each independently represent an integer of 1 to 20,
  • R 7 represents a hydrogen atom or a phosphate protecting group, HN
  • L is a divalent aromatic group, represents a hydrogen atom or a substituent
  • R 12, 1 13 ⁇ Pi 1 ⁇ 14 are each independently, comprise a direct bond or a hetero atom
  • R 15 represents a hydroxyl-protecting group
  • the oligonucleotide probe of the present invention has a high reaction efficiency to a carrier, the amount of oligonucleotide required for immobilization can be reduced.
  • the clear oligonucleotide probe has a high binding efficiency to the target nucleic acid, so that it can be detected with high sensitivity even if it has the same chain length as before.
  • the oligonucleotide probe of the present invention can be easily purified after synthesis, and can be purified by automation even when a plurality of types of probes are prepared.
  • FIG. 1 shows the structures of a conventional oligonucleotide probe and the oligonucleotide probe of the present invention.
  • FIG. 2 shows a method for synthesizing the amidite compound (Y2).
  • FIG. 3 shows a method for synthesizing the amidite compound (Y 3).
  • FIG. 4 shows a method for synthesizing the amidite compound (Y5, 6).
  • FIG. 5 shows a method for synthesizing the amidite compound ( ⁇ 7).
  • FIG. 6 shows a method for synthesizing the amidite compound ( ⁇ 8).
  • FIG. 7 shows a method for synthesizing the amidite compound ( ⁇ 9).
  • FIG. 8 shows the structure of the oligonucleotide probe (Xn—Sp).
  • Figure 9 shows the amount of oligonucleotide probe (Xn-Sp) immobilized on the glass substrate (a) and the reactivity with FITC (b: 50 nucleotide oligonucleotide, c: 25 nucleotide oligonucleotide). .
  • FIG. 10 shows the results of the hybridization in Example 6.
  • FIG. 11 shows a specific example of the intermediate compound.
  • FIG. 13 shows a method for synthesizing the amidite compound (Y10, Y11).
  • Figure 14 shows the X10—Sp25 sequence and the scheme of the X10-Sp25 deprotection reaction (a), and the results of reverse phase HP LC analysis of X10—Sp25 (b), And X10-Sp25 were subjected to acid treatment, and the results of reverse phase HP LC analysis (c) are shown.
  • the present invention will be described in detail.
  • the oligonucleotide probe of the present invention has a structure in which a linker having a reactive functional group and an aromatic group is bonded to an oligonucleotide. That is,
  • A represents an oligonucleotide
  • D represents a divalent organic group having at least one aromatic group
  • B represents a reactive functional group or a protected form thereof.
  • the oligonucleotide may be natural or synthetic, and includes a polynucleotide.
  • Oligonucleotides include nucleic acids such as DNA and RNA, double-stranded oligonucleotides, and oligonucleotide derivatives. PCR products are also included.
  • Oligonucleotide derivatives include oligonucleotide derivatives in which phosphodiester bonds in oligonucleotides have been converted to phosphorothioate bonds, and phosphodiester bonds in oligonucleotides have been converted to N3'-P5, phosphoramidite bonds.
  • Oligonucleotide derivative oligonucleotide derivative in which report and phosphodiester bond in oligonucleotide are converted to peptide nucleoacid bond
  • oligonucleotide in which peracyl in oligonucleotide is substituted with C-15 propynyl peracyl Derivatives Oligonucleotide derivatives in which peracyl in oligonucleotides is substituted with C-5 thiazoleperacyl
  • Oligonucleotides Oligonucleotide derivative in which cytosine in otide is replaced by phenoxazine-modified cytosine, oligonucleotide derivative in which report in oligonucleotide is replaced by 2,1-propylribose, ribose in oligon
  • the number of bases of the oligonucleotide is usually 1 to 500, preferably 5 to 200, and more preferably 10 to 100.
  • B represents a reactive functional group or a protected form thereof.
  • Reactive functional groups are present on the carrier to which the oligonucleotide probe is to be immobilized.
  • a group capable of forming a covalent bond with an existing functional group such as an active ester group, an epoxy group, an aldehyde group, a carbodiimide group, an isothiocyanate group or a group capable of forming a covalent bond with an isocyanate group (for example, , An amino group, etc.), or a group capable of reacting with a maleimide group or a disulfide group (eg, a mercapto group, etc.).
  • a mercapto group and a diamino group are preferred.
  • the amino group is preferably a primary amino group.
  • the B may be a protected form of the reactive functional group.
  • the protected form means a form in which a hydrogen atom of the functional group is substituted with a protecting group.
  • the protecting group for the amino group is not particularly limited, but may be an acyl group, a carbamate group, a trialkylsilyl group, a phthalyl group, a carboxyalkylcarbonyl group, a tosyl group, a trifluoroacetyl group, a trityl group, and Disubstituted trityl groups.
  • Examples of the mono-substituted trityl group include, for example, a monoalkoxytrityl group, preferably a monoalkoxytrityl group having an alkoxy group having 1 to 4 carbon atoms, and more preferably a monomethoxytrityl group, Examples include an ethoxytrityl group, a monopropoxytrityl group, a monoisopropoxytrityl group and a monobutoxytrityl group.
  • a trityl group or a mono- or di-substituted trityl group has an advantage in that the synthesized oligonucleotide probe can be easily purified by a reversed-phase column because of its strong hydrophobicity.
  • an amino group when an amino group is protected with a trityl group or a mono- or di-substituted trityl group, it is necessary to react under a strong acidic condition for a long time in order to deprotect the amino group. Such conditions are not preferable in that they may damage the nucleic acid and require time.
  • the nucleic acid when the amino group is protected with a trityl group or a mono- or di-substituted trityl group, the nucleic acid may be damaged because it can be deprotected in a short time under mildly acidic conditions. No, and the deprotection time can be reduced. For example, deprotection can be performed by treating for 5 to 20 minutes in the presence of pH 2 to 6 or 5 to 80% by volume of acetic acid. '
  • the protective group for the mercapto group is not particularly limited, and examples thereof include a t-butyl group, an aralkyl group, a diphenylmethyl group, a triphenylmethyl group, and a dimethyl group.
  • the oligonucleotide is It is linked to a reactive functional group via a linker part represented by in the general formula 1.
  • D represents a divalent organic group having at least one aromatic group.
  • the divalent organic group is not particularly limited as long as it does not inhibit the binding property of the oligonucleotide probe to the carrier and the complementary binding to the target oligonucleotide, but preferably includes a hetero atom. It is a well-substituted or unsubstituted divalent hydrocarbon group.
  • a chain member of 250 preferably a chain member of 3 to 30, more preferably a chain member of 1 to 5, a chain member of 2 to 50, preferably a chain member of 3 to 3 0, more preferably an alkylene group having a chain member of 1 to 5, a chain member having a chain member of 2 to 50, preferably a chain member having a chain member of 3 to 30, more preferably a chain member having a chain member of 1 to 5
  • a divalent alicyclic hydrocarbon group having a chain member of 3 to 30, more preferably 1 to 10 is exemplified.
  • a part of carbon atoms may be substituted with a complex atom.
  • the hetero atom include an oxygen atom, a nitrogen atom, a sulfur atom, a silicon atom, and a phosphorus atom.
  • substituents examples include a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted amino group, a nitro group, a cyano group, and a substituted or unsubstituted carbon number of 1 to 1.
  • a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine
  • a hydroxyl group a substituted or unsubstituted amino group, a nitro group, a cyano group
  • alkyl group substituted or unsubstituted alkenyl group having 1 to 10 carbon atoms
  • substituted or unsubstituted cycloalkyl group having 1 to 10 carbon atoms
  • substituted or unsubstituted alkoxy group having 1 to 10 carbon atoms
  • the linker portion D is preferably a group represented by the following general formula 2.
  • L represents an aromatic group
  • R 2 , R 2 ′ and R 3 each independently represent a direct bond or a substituent which may contain a hetero atom or Represents an unsubstituted divalent hydrocarbon group.
  • the substituent is the same as described above.
  • the Examples of the divalent hydrocarbon group include the same as those described above.
  • R 2 binds to the reactive functional group B
  • R 2 binds to the oxygen of the hydroxyl group or phosphate group at the 5 ′ end or 3 ′ end of the oligonucleotide.
  • R 2 ′ is a direct bond
  • the carbon atom in the general formula 2 is directly bonded to the hydroxyl or phosphate oxygen at the 5 ′ end or 3 ′ end of the oligonucleotide.
  • R 2 is preferably of the general formula 3:
  • R 3 is preferably of the general formula 4:
  • R 2 ' is preferably a direct bond or _R 2', Ru Oh one (CH 2) "one.
  • R 4 is bonded to the reactive functional group B, in R 3 , 1 ′ (CH 2 ) w — is bonded to the aromatic group L, and in R 2 , one (CH 2 ) is an oligo. Binds to nucleotides.
  • R 4 is preferably a direct bond or 1 (CH 2 ); — (OCH 2 CH 2 ) g — ⁇ -1.
  • R 5 , R 6 and R 2 ′′ are each independently a direct bond or a group shown below:
  • n and t each independently represent an integer of 0 to 20, preferably 0 to 10, more preferably 0 to 6, and still more preferably an integer of 0 to 3, n, w, i, q And j each independently represent an integer of 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 6, and even more preferably 1 to 3.
  • 111 + 11 is usually 1 to 40, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5
  • t + w is usually 1 to 40, preferably 1 to 20, more preferably 1 to 5.
  • 5, i + q is usually 2 to 40, preferably 2 to 20, more preferably 2
  • R 7 represents a hydrogen atom or a phosphate protecting group.
  • the phosphate protecting group is not particularly limited, but preferred examples include a methyl group, a 2-cyanoethyl group, a 2-trimethylsilylethyl group, and a 4-oxypentyl group.
  • R 4 is preferably a direct bond.
  • R 5 is preferably
  • R 6 is preferably 1 O—.
  • examples of the aromatic group include a substituted or unsubstituted aromatic hydrocarbon group, a substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group, and a substituted or unsubstituted polycyclic aromatic group.
  • an aromatic group having high hydrophobicity is preferred.
  • the aromatic group does not include a nucleobase.
  • substituent of the aromatic group examples include a halogen atom selected from fluorine, chlorine, bromine and iodine, a hydroxyl group, a substituted or unsubstituted amino group, a nitro group, a cyano group, and a substituted or unsubstituted carbon atom.
  • substituted or unsubstituted aromatic hydrocarbon group examples include a substituted or unsubstituted monocyclic aromatic hydrocarbon group, specifically, phenyl, 2-fluorophenyl, 3-fluorophenyl, 4 -Phenol group, 2-phenyl phenyl group, 3-chloro phenyl group, 2,3-difluorophenyl group, 2,5-diphenylolenophenylene group, 3,5-difluorophenyl group, 2,3—dichloropheninole, 2,5—dichloropheninole, 3,5—dichloropheninole, 2-methinolephenine, 3-methylphenyl, 4-methylphenyl, 2-— Examples thereof include an ethylphenyl group, a 3-ethylphenyl group, and a 4-ethylphenyl group.
  • aromatic heterocyclic group examples include a pyridyl group, a pyridazinyl group, a pyrimidinyl group, a virazinyl group, a furyl group, a phenyl group, a pyrrolyl group, an imidazolyl group, a thiazolyl group, and an oxazolyl group.
  • substituted or unsubstituted aromatic heterocyclic group examples include 2-pyridyl, 3-pyridyl, 4-pyridyl, 3-pyridazinyl, 4-pyridazinyl, 2-pyrimidinyl, 4-pyrimidinyl Group, 5-pyrimidinyl group, pyrazinyl group 2-furyl group, 3_furyl group, 2-thenyl group, 3-thenyl group, 2-pyrrolyl group, 3-pyrrolyl group, imidazolyl group, thiazolyl group, oxazolyl group, 2-Methyl-3-pyridyl group, 6-methyl-1-pyridyl group, 2-chloro-3-pyridyl group, 6-chloro-3-pyridyl group, 2-methoxy-13-pyridyl group, 6-methoxy-3 —Pyridyl group, 2,6-dichloro-3-pyridyl group, 2,6-dimethoxy-3
  • Polycyclic aromatic groups include naphthyl, phenanthryl, fluorenyl, anthryl, pyrenyl, indanyl, tetrahydronaphthyl, quinolyl, isoquinolyl, nnolinyl, quinazolinyl, quinoxalinyl, naphthyridinyl, Examples include a phthalazinyl group, an indolyl group, an isoindolyl group, a benzofurinole group, a benzochenolinole group, an indazolinole group, a benzimidazoly / le group, and a benzothiazolyl group.
  • substituted or unsubstituted polycyclic aromatic group include: 1-naphthyl group, 2-naphthyl group, 4-indanyl group, 5-indanyl group, 5-tetrahydronaphthyl group, 6-tetrahydronaphthyl group, Quinolyl group, isoquinolyl group, cinnolinyl group, quinazolinyl group, quinoxalinyl group, naphthyridinyl group, phthaladyl group, indolyl group, isoindolyl group, benzofuryl group, benzochelyl group, indazolyl group, benzimidazolyl group, benzothiazolyl group, 2, 3-methylenedioxyphenyl group, 3,4-methylenedioxyphenyl group, 2,3-ethylenedioxyphenyl group, 3,4-ethylenedioxyphenyl group, 4 1-naphthyl group, 4-naphthy
  • Preferred substituted or unsubstituted polycyclic aromatic groups include a naphthyl group, an anthryl group, a pyrenyl group, a fluorenyl group, and a phenanthryl group.
  • an aromatic group is present in the main chain portion of D ', the aromatic group becomes a divalent form.
  • the aromatic group is preferably a monocyclic to pentacyclic aromatic hydrocarbon group.
  • a bicyclic to tetracyclic aromatic hydrocarbon group more specifically, a substituted or unsubstituted naphthyl group, anthryl group, phenanthryl group, fluorenyl group and pyrenyl group, particularly 1-naphthyl group 9 is an anthryl group.
  • the oligonucleotide probe of the present invention includes those having an additional oligonucleotide on the side chain of the linker portion D.
  • the further oligonucleotide may be the same or different from the other oligonucleotide.
  • examples of the oligonucleotide probe include those in which D in the general formula 1 is represented by the following general formula 2 ′.
  • L is a divalent aromatic group, represents a hydrogen atom or a substituent
  • Ru are each independently R 1 2, 1 13 ⁇ Pi 1 14, include a direct bond or a hetero atom
  • a ′ represents a hydroxyl group or an oligonucleotide.
  • R ii binds to the reactive functional group B
  • R 14 binds to the oxygen of the hydroxyl group or phosphate group at the 5 ′ end or 3 ′ end of the oligonucleotide.
  • R E 4 is a direct bond
  • general formula 2 'carbon atoms in the, 5 Origonukureo tides' end or 3' end directly binds to the oxygen of a hydroxyl group or phosphate group.
  • a ′ is an oligonucleotide
  • R i 3 binds to the hydroxyl or phosphate oxygen at the 5 ′ end or 3 ′ end of the oligonucleotide and R 13 is a direct bond
  • the general formula The carbon atom at 2 ' is directly bonded to the hydroxyl or phosphate oxygen at the 5' or 3 'end of the oligonucleotide.
  • Rue preferably has the general formula 3 ′:
  • R 12 is preferably of the general formula 4 ′
  • R 13 is preferably a direct bond or 1 (CH 2 ) ⁇ ⁇ _
  • R 14 is preferably a direct bond or 1 (CH 2 ) f —.
  • one (CH 2 ) a — is bonded to the reactive functional group B, and — (CH 2 ) e — is bonded to the aromatic group L in R 12 .
  • R 5 and R 6 are each independently a direct bond or a group shown below:
  • e and f each independently represent an integer of 20, preferably 1 to 10, More preferably represents an integer of 1 to 5, more preferably represents an integer of 1 to 3, each of a to d independently represents an integer of 0 to 20, preferably 0 to 10, more preferably ⁇ to 5 And more preferably an integer of 0 to 3.
  • a + b is usually 1-40, preferably 1-20, more preferably 1-5
  • c + d is usually 1-40, preferably 1-20, more preferably 1 to 5.
  • R 7 represents a hydrogen atom or a phosphate protecting group. Examples of the phosphate protecting group include, but are not particularly limited to, a methyl group, a 2-cyanoethyl group, a 2-trimethylsilylethyl group, and a 4-oxypentyl group.
  • Pi 1 1 4 is preferably a direct bond.
  • R 5 ′ is preferably one NH—CO— and R 6 ′ is preferably one CO—NH—.
  • the divalent aromatic group L is not particularly limited, but is preferably a highly hydrophobic divalent aromatic group, preferably a substituted or unsubstituted phenanthrylene group, fluorenylene group, naphthylene group, anthrylene group or pyrenylene group, Particularly, a naphthylene group and an anthrylene group are exemplified.
  • the invention also relates to intermediate compounds for synthesizing oligonucleotide probes.
  • the intermediate of the present invention has a structure in which the oligonucleotide portion is a phosphoramidite in the oligonucleotide probe. Is a compound having Therefore, in one embodiment, the intermediate compound of the present invention is represented by the following general formula 5.
  • B represents a reactive functional group or a protected form thereof
  • D ′ represents a divalent organic group having at least one aromatic group
  • O represents an oxygen atom
  • P represents a phosphorus atom
  • R 8 represents a phosphate protecting group
  • R 9 and 11 Is an organic group, and may form a ring together with the nitrogen atom to which they are bonded.
  • a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, an isoptyl group, a pentyl group, and an isopentyl group are exemplified.
  • R 9 and R 10 may be taken together with the nitrogen atom to which they are attached to form a ring group.
  • the ring is R 9 and i. May further contain a hetero atom in addition to the nitrogen atom to which is bonded.
  • Such a ring is preferably a ring having a ring member of 5 to 8, preferably 6, and includes, for example, a morpholine ring, a piperidine ring, a piperazine ring, a thiomorpholine ring and the like, and preferably a morpholine ring. .
  • the phosphate protecting group may be any one used in the phosphoramidite method, and is preferably a methyl group, a 2-cyanoethyl group, a 2-trimethylsilylethyl group, a 4-oxypentyl group, or the like. It may be included as a group.
  • the oligonucleotide probe of the present invention can be prepared using an intermediate compound in which D ′ in Formula 5 is equal to the above D.
  • an oligonucleotide probe of the general formula 1 in which D is represented by the general formula 2 can be prepared using an intermediate compound in which D ′ in the general formula 5 is equal to D.
  • the oligonucleotide probe of the general formula 1 in which D is represented by the general formula 2 ′ uses an intermediate compound in which the D ′ in the general formula 5 is represented by the following general formula 6.
  • L is a divalent aromatic group
  • 1 ⁇ represents a hydrogen atom or a substituent
  • 5 hydroxyl represents a protecting group
  • a protecting group used for protecting the ribose at the 5-position in DNA synthesis can be used, for example, an acetyl group, 5′—O—4, 4 ′ , 4,,, — tris (4-benzoyloxy) trityl group and dimethoxytrityl group, and a dimethoxytrityl group is preferred.
  • 1 is bonded to 8
  • R 14 is bonded to an oxygen atom. Specific examples of preferred intermediate compounds are shown in FIG.
  • the oligonucleotide probe of the present invention can be synthesized by linking the above-mentioned intermediate compound with an oligonucleotide. Introduction of the intermediate compound into the oligonucleotide can be carried out on the automatic DNA synthesizer at the same time as the oligonucleotide synthesis.
  • the oligonucleotide probe of the present invention and the above-mentioned intermediate compound can be synthesized and used in any of D-form and L-form, or may be a mixture thereof.
  • the present invention also relates to a carrier having the oligonucleotide probe immobilized thereon.
  • the carrier is not particularly limited as long as it has a functional group capable of covalently bonding with the reactive functional group of the oligonucleotide probe of the present invention on its surface.
  • the base material of the carrier include glass such as quartz glass, borosilicate glass and soda lime glass, silicon, fiber, wood, paper, ceramics, and plastics (eg, polyester resin, polyethylene resin, polypropylene resin,
  • ABS resin (Acrylonitrile Butadiene Styrene resin), Nylon, Atalinole resin, Fluororesin / Polycarbonate resin, Polyurethane resin, Methylpentene resin, Phenol resin, Melamine resin, Epoxy resin, Vinyl chloride resin).
  • glass, silicon, ceramics, and plastic it is preferable to use glass, silicon, ceramics, and plastic.
  • the oligonucleotide probe of the present invention is immobilized by using a substrate in which a functional group is introduced on the surface of the substrate as a carrier. When the reactive functional group of the oligonucleotide probe is protected, it is preferable to remove the protecting group before immobilization.
  • Examples of the functional group capable of covalently bonding to the reactive functional group of the oligonucleotide probe include, for example, an active ester group, an epoxy group, an amino group, a dye group, a disulfide group, an aldehyde group, a maleimide group, and a carpoimide group.
  • a carrier into which an active ester group, an epoxy group, an aldehyde group, a carbodiimide group, an isothiocyanate group, or an isocyanate group is introduced.
  • a carrier into which a maleimide group or a disulfide group is introduced is preferably used.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, and examples thereof include a base, a thread, a sphere, a bead, a polygon, a powder, and a porous form.
  • the base is preferable.
  • the oligonucleotide probe of the present invention can be bound to a label such as biotin and a fluorescent dye.
  • a label such as biotin and a fluorescent dye.
  • the fluorescent dye include CyDye such as Cy3 and Cy5, FITC, RITC, rhodamine, Texas Red, TET, TAMRA, FAM, HEX, ROX, GFP, and the like.
  • the oligonucleotide probes of the present invention can also be conjugated to medicaments.
  • the oligonucleotide probe of the present invention has higher binding efficiency to a target nucleic acid than a conventional probe.
  • the oligonucleotide probe of the present invention is easy to synthesize and purify.
  • An intermediate compound (hereinafter, referred to as an amidite compound) for synthesizing the oligonucleotide probe of the present invention was synthesized, introduced into an oligonucleotide, and the ability of the obtained oligonucleotide probe was evaluated.
  • ⁇ 2 is an amidite compound having only an aromatic group without an amino group.
  • DN Introduction of Y2 into an oligonucleotide by an automatic synthesizer, followed by commercial N-monomethoxytrityl-6-amino. An amino group was introduced using a xyl phosphoramidite compound or a trifluoroacetyl-6-aminohexyl phosphoramidite compound (Glen Research), and an amino group and an aromatic group were added to the end of the oligonucleotide.
  • the amidite compound of Y3, ⁇ 5, ⁇ 6, ⁇ 7, ⁇ 8, ⁇ 9, ⁇ 10, and Y11 has an amino group in the molecule. Therefore, after introducing the synthetic amidite compound into the oligonucleotide, it is not necessary to introduce an amino group using a separately available amino group-bonded phosphoramidite compound, and the synthesis of the oligonucleotide probe is one step shorter than before. have.
  • ⁇ 3 and ⁇ 5 differ in the structure of the linking site between the amino and aromatic groups, and ⁇ 6 introduces a longer linear linker between the amino and aromatic groups than ⁇ 5 And the distance of the oligonucleotide probe from the surface of the carrier can be maintained.
  • ⁇ 7 is an amidite compound in which the aromatic group of ⁇ 6 is an anthryl group instead of a naphthyl group.
  • Y8 is an amidite compound in which the introduction site of the linear linker of Y5 is different, and an amino group and an aromatic group are close to each other.
  • Oligonucleotide probes having these at the 5 'end were synthesized by a DN ⁇ automatic synthesizer (X3-Sp, X5-Sp, X6-Sp, X7-Sp, X8-Sp, respectively). , X 9 -S p; FIG. 8).
  • oligonucleotide probe having no aromatic group As the oligonucleotide probe having no aromatic group, the above-mentioned commercially available amino group-bonded phosphoramidite compound was used, and an amino group was introduced at the end of the oligonucleotide (X1-Sp; FIG. 8). An oligonucleotide probe having no aromatic group between the two (X4_Sp; FIG. 8) was used as a comparative example.
  • the synthesized oligonucleotide was purified to a high degree of purity using a reversed-phase column, dissolved in a spot solution for the preparation of an oligo chip at a certain concentration, spotted on a glass substrate, and immobilized.
  • oligo probes (X 2—Sp, X 3—Sp, X 5—Sp, X 6—Sp, X 8 -S p) was found to be highly immobilized (Fig. 9a).
  • the reaction was performed with fluorescein isothiocyanate and Cy 3 succinimidyl ester.
  • the oligonucleotide probe having an aromatic group of the present invention exhibits higher reactivity with any of the fluorescent dyes than the conventional oligonucleotide probe, and improves the reactivity with a chemical substance even in a solution. (Fig. 9 b, c;).
  • the Y9 amidite compound is a derivative that can be introduced into the end of the oligonucleotide or into the chain (FIG. 7). Oligonucleotides in which the Y9 amidite compound was introduced at the terminal (X9-Sp25) and in the chain (X9-Sp35) were synthesized. As with other amidites, their reactivity with fluorescent dyes (Fig. 9c) and immobilization efficiency on glass substrates (Fig. 12) were examined.
  • the extract was washed once with 100 ml of a saturated saline solution, and the organic layer was dried over sodium sulfate. After concentrating the solution under reduced pressure, the obtained oily substance was dissolved in 80 ml of dimethylformamide under an argon atmosphere, and 1.6 g (3 equivalents) of sodium azide and 1.75 g of ammonium chloride (3 g) were added. (4 equivalents) was added and the mixture was heated and stirred at 80 ° C for 2 hours.
  • N-trifluoroacetyl-6-aminocaproic acid (disulfide compound f) 360 mg (1.3 equivalents) and 1,1'-carboerdiimidazole 23.5 mg (1.2 was dissolved in 1 ml of dimethylformamide and stirred at room temperature for 2 hours.
  • the obtained oily substance was dissolved in 75 ml of methylene chloride, cooled to 0 ° C, and 2.1 ml of trifluoroacetic acid (90% aqueous solution) was added. The mixture was stirred at C for 1 hour. To the reaction solution was added 80 ml of a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate, and the mixture was returned to room temperature. The organic layer was washed once with 8 Om 1 of a saturated aqueous solution of sodium hydrogencarbonate and once with 8 Om 1 of a saturated saline solution, and dried over sodium sulfate.
  • reaction solution was concentrated under reduced pressure, acetic acid was removed by azeotropy with toluene, and the residue was purified by silica gel column chromatography (eluting solvent: ethanol-chloroform) to give 1.4 lg (yield) of the title compound (compound n). 83%) as a pale yellow solid.
  • the extract was washed once with 1 and once with 100 ml of a saturated saline solution, and the organic layer was dried over sodium sulfate. After the solution was concentrated under reduced pressure, the obtained oily substance was dissolved by adding 70 ml of an 80% aqueous acetic acid solution, followed by stirring at room temperature for 20 hours. The reaction solution was concentrated under reduced pressure, acetic acid was removed by azeotrope with toluene, and azeotrope with pyridine. The residue was dissolved in 60 ml of pyridine under an argon atmosphere, and 4.07 g (1.2 equivalents) of dimethoxytritin chloride was added, followed by stirring at room temperature for 2 hours.
  • Oligonucleotide synthesis was performed on an Applied Biostems type 394 DNA / RNA synthesizer.
  • the analysis was performed using a Waters 996 photodiode array detector using a Gison son apparatus for HP LC.
  • Waters ⁇ Bondasphere C 183 00 A (internal diameter 3.9 mm x length 150 mm) as a column for reversed-phase analysis
  • GL Science Inertsi as a column for reversed-phase separation 1 ODS-3C18 (8.0 mm ID x 300 mm length)
  • Tosoh T SK—GE LDE AE—2 SW (4.6 mm ID ⁇ 250 mm length) for anion exchange analysis used.
  • TEAA triethylammonium acetate buffer
  • anion exchange concentration gradient of ammonium formate in 20% acetonitrile in water '.
  • oligonucleotide probes were prepared from doxynucleoside 3'-phosphoramidite (purchased from Nippon Techno Service Co., Ltd.) and used as an automatic DNA synthesizer (Model 394A; PerkinElmer Japan, Inc. 'Applied Dubai) (Manufactured by Systems Division) at 0.2 or 1 ⁇ mo 1 scale.
  • Cy5-AS-Sp 5'-Cy5-ATCGTCATCATCGTCGTC CATGTGGTCATGGCAAACATTGGAATTGCTTGGAA GAGTTTC—3 '(SEQ ID NO: 2)
  • N-monomethoxytrityl-6-aminohexyl phosphoramidite (Glen Research) was used for the amino group introduced at the 5 'end of the X1-Sp and X4-Sp oligonucleotides.
  • the introduction of the amino group of Y 2, ⁇ 3, ⁇ 5 , ⁇ 6, ⁇ 7, and ⁇ 8 were performed using phosphoramidite compounds.
  • FIG. 8 shows the structures of the synthesized oligonucleotide probes X 1 — Sp to X 8 — Sp.
  • the oligonucleotide probe was treated and purified as follows.
  • the oligonucleotide probe was cut out from CPG (Controlled Glass) with concentrated aqueous ammonia, and then 50. Heated at C for 12 hours. After distilling off the solvent and dissolving in deionized water, C18 (manufactured by Waters) open force column chromatography was performed (column size 0.8 x 18 cm: 5-50% acetate etol. 1M triethylammonium acetate (hereinafter referred to as “TEAA”) eluted with a linear concentration gradient using an aqueous solvent.
  • CPG Controlled Glass
  • C18 manufactured by Waters
  • TEAA triethylammonium acetate
  • the conditions for reversed phase HP LC were as follows:
  • 1-3-3- is an oligonucleotide complementary to X 1 —Sp.
  • X 1 —Sp oligonucleotide complementary to X 1 —Sp.
  • Oligonucleotide probe (XI-AS-Sp) (1 nmo1) and Cy5-succinimidyl ester (Pharmacia) (500 nmol) were added to 10% (v / v) dimethylformamide, 0% The solution was dissolved in a 25 M carbonate buffer solution (total volume: 100 L), and the reaction was carried out at 35 ° C under light shielding. Sixteen hours after the start of the reaction, desalting was performed with NAP10 (Pharmacia). Thereafter, fractionation was performed with reversed-phase HPLC. Column: ⁇ —bonder sphere (C-18) column ⁇ 3.9 x 150 mm ( ⁇ made by Otters)
  • Slide glass (20 pieces) was immersed in a 10% aqueous sodium hydroxide solution (200 mL) for 15 minutes, and then water (twice with 200 mL) and a 1% aqueous hydrochloric acid solution (200 mL) were used. L) followed by water (twice with 200 mL). It was immersed in methanol (200 mL), subjected to ultrasonic cleaning for 5 minutes, dried by centrifugation, and further dried at 180 degrees for 3 hours.
  • the dried slide glass was immersed in 3-aminotrimethoxysilane (13 mL), water (8 mL), and methanol (380 mL), and stirred at room temperature for at least 5 hours. Thereafter, the slide glass was taken out, washed three times with methanol (200 mL), centrifuged, and dried at 180 degrees for 3 hours.
  • 1,4-phenylenediisothiocyanate (1400 mg) was dissolved in a 10% pyridine.dimethylformamide solution (220 mL), and the slide glass which had been subjected to the above aminosilane diluting was dissolved in the solution. The mixture was stirred at room temperature for 16 hours.
  • an isothiosinate slide glass is spread on a glass container, and a 20 or 30% tris (3-aminopropyl) amine (methanol solution (130 ⁇ L)) is added dropwise thereto, and the mixture is sealed and sealed at 37 ° C. For 5 hours. Thereafter, the slide glass was washed twice with methanol (200 mL) and once with acetone (200 mL). After drying at room temperature under reduced pressure for 1 hour, 1,4-phenylene diisothiocyanate (1400 mg) was dissolved in 10% pyridine 'dimethylformamide solution (220 mL) in advance. The slide glass was put therein and stirred at room temperature for 16 hours.
  • a 50-base oligonucleotide probe (Xn-Sp) (50-300 pmo1) is dissolved in sterile water (51), and a spot solution (5 ⁇ l; 1M carbonate buffer ( ⁇ 9.0)) is dissolved. And spotted on a coated slide glass coated with 1,4-phenylenediisocarbonate by a spotter (SPBI ⁇ 2000, manufactured by Hitachi Software Engineering Co., Ltd.). After spotting, filter paper was spread on a tight box, and a 300 mM aqueous solution of sodium hydrogen phosphate was wetted. A slide glass that had been spotted was added to prevent the solution from sticking.
  • the glass was immersed in a 1M aqueous solution of ethanolamine (20 OmL), and stirred at room temperature for 1 hour to perform blocking. After washing three times with sterile water, dry in the draft It was dried and refrigerated.
  • the oligonucleotide probe of the present invention can be detected with higher sensitivity than X 1 —Sp or X 4 —Sp.
  • the glass was allowed to stand at room temperature. After 16 hours, remove the slide glass from the tight box, and remove the slide glass with 0.1% Triton X (200 mL) for 5 minutes at room temperature, and with a 2% aqueous hydrochloric acid solution (200 mL) for 2 minutes at room temperature. The plate was washed with 1 M lithium chloride (200 mL) for 10 minutes at room temperature and with sterile water (200 mL) for 1 minute at room temperature. Subsequently, the glass was immersed in a 1 M aqueous ethanolamine solution (200 mL), and stirred at room temperature for 1 hour to perform blocking. After washing three times with sterile water, the mixture was dried in a draft and stored refrigerated.
  • X 10 -Sp 25 has an amino group protected by a monomethoxytrityl group (MMT r).
  • MMT r monomethoxytrityl group
  • a 10% aqueous solution of acetic acid (I mL) was added to the oligonucleotide, and the mixture was treated at room temperature for 5 minutes.
  • the reaction solution was concentrated under reduced pressure, and water was added, and the mixture was azeotroped under reduced pressure. After three azeotropes, the residue was dissolved in 1 mL of sterile water and analyzed by reversed-phase HPLC (Fig. 14b, c). From the above, it can be seen that X 10 — Sp 25 was deprotected under mildly acidic conditions, resulting in the same structure as X 8 — Sp 25 (Fig. 14a).
  • the present invention makes it possible to reduce the cost of DNA chips, and is expected to contribute to the widespread use of DNA chips as a means of gene diagnosis technology. Sequence listing free text

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Abstract

　担体上に強固に固定化され、かつ相補的な標的核酸を効率よく保持するオリゴヌクレオチドプローブを提供する。　本発明は、一般式１：Ｂ−Ｄ−Ａ（式中、Ａはオリゴヌクレオチドを表し、Ｄは少なくとも１つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、Ｂは反応性官能基又はその保護された形態を表す）で表されるオリゴヌクレオチドプローブに関する。

Description

オリ ゴヌクレオチドプローブ
技術分野
本発明は、 芳香族基を有するリンカ一とオリゴヌクレオチドからなるオリゴ ヌクレオチドプローブ、 該オリゴヌクレオチドプローブが固定化された担体及 ぴ該オリゴヌク レオチドプローブを合成するための化合物に関する。
明
背景技術
DNAチップ又はビーズ等を用いた遺伝子食ョ解析においては、 合成オリゴヌク レオチド又は P.CR産物などをプローブとして担体上に固定化する必要がある。 当該担体上に固定化されたプローブと、 蛍光などで標識された標的核酸とが相 捕的に結合することによって、 標的核酸が担体上に保持され、 標識に由来する 蛍光強度を測定することによって、 標的核酸量を検出することができる。 DN Aチップは、 平板状の担体上に数千〜数十万種類のプローブが、 あらかじめ決 まった場所に固定化されているため、 他種類の遺伝子の発現量を一度に定量す ることができ、 遺伝子間の複雑なネットワークの解明に極めて有用である。 そ' のため、 遺伝子診断のための有力な手法の一つとして期待されている。
合成オリゴヌクレオチドプロープを担体上に固定化するには、 担体上でオリ ゴヌクレオチドを直接合成する方法 （Nu c l e i c A c i d s R e s . , v o l . 2 0， 1 6 7 5 - 1 6 7 8 ( 1 9 9 2) 及び T r e n d s B i o t e c h n o 1. , v o l . 1 2, 1 9— 2 6 ( 1 9 94) ) 、 及ぴ合成したォ リ ゴヌクレオチドを精製後、 担体上に固定化する方法とがある。 後者の方法に おいては、 オリゴヌクレオチドプロープの合成中に、 アミノ基などの官能基を 導入し、 スポット後にこれらの官能基が担体上にコーティングされた官能基と 共有結合を形成させることによって、 不可逆的にプローブを固定化する方法が 知られている。 また、 プラス電荷を有するポリ Lリジンなどをコーティングし た担体上にオリゴヌク レオチドプロープを静電的に結合させる方法なども報告 されている。 静電的な結合は、 オリゴヌクレオチドのマイナス電荷に依存する ため、 オリゴヌクレオチドプローブの鎖長が短くなるほど、 固定化効率が低下 してしまう。 そのため、 共有結合を介して担体上にオリゴヌクレオチドを固定 化する方法が広く用いられている。
ァミノ基などの官能基は、 リンカーを介してオリゴヌクレオチドに導入する ことが知られている （C o u l l e t a 1 - , T e t r a h e d r o n, v o l . 2 7， 3 9 9 1— 3 9 94 ( 1 9 8 6) 及び C o n n o l l y, B . A. , Nu c l e i c A c i d s R e s . , v o l . 1 5, 3 1 3 1— 3 1 3 9 (1 9 8 7) ) 。 アミノ基が結合したリンカ一として、 現在、 最も頻繁 に用いられるものは、 炭素数 6のリンカ一である。 このリンカ一を介してアミ ノ基が結合したオリゴヌクレオチドプローブは、 DNAチップのプローブライ ブラリーとしても市販されている （例えば、 MWG社、 シグマジエノシス社な ど） 。
オリゴヌク レオチドプローブをチップなどの担体上に固定化する場合、 アミ ノ基又はメルカプト基などの官能基をオリゴヌク レオチド合成時に導入する。 現在用いられているオリゴヌクレオチドへのアミノ基導入のための試薬には、 アミノ基をトリフルォロアセチル基又はモノメ トキシトリチル基で保護したァ ミダイ ト化合物がある。 しかし、 上記のような試薬は、 オリゴヌクレオチドへ のァミノ基の導入効率が低いという問題を有する。 また、 N— トリフルォロア セチル一 6—ァミノへキシルアミダイ ト化合物を用いる場合、 ァミノ基の導入 されたオリゴ^クレオチド （ァミノ基導入オリゴヌクレオチド） と未導入オリ ゴヌクレオチドを分離精製することが困難であり、 これらが混在することが問 題となっていた。 一方、 N—モノメ トキシトリチルー 6—アミノへキシルァミ ダイ ト化合物を用いる場合、 分離精製は可能なものの、 分離後の酸性条件下に おけるモノメ トキシトリチル基の除去に時間を要し、 高純度にオリゴヌクレオ チドを精製することが困難であった。 遺伝子診断では、 多数のオリゴヌクレオ チドプローブが必要なため、 より容易かつ高純度に精製することが望まれてい た。
さらに、 上記で得られる精製アミノ基導入オリゴヌクレオチドを担体上に固 定化する場合、 ァミノ基と担体表面上のコーティング剤との反応性が低く、 十 分なオリゴヌクレオチドを担体上に固定化するには、 高濃度のオリゴヌクレオ チドをスポッ トする必要があった。 結果として多くのオリゴヌクレオチドを必 要とし、 チップの価格を上げる原因となっていた。 従って、 オリゴヌクレオチ ドプローブを担体上に効果的に固定化することが望まれていた。
また、 D N Aチップ等において高い感度を得るためには、 検出すべき標的核 酸をオリゴヌクレオチドプローブ上に効率よく保持することが重要である。 ォ リゴヌクレオチドと標的核酸との結合の安定性は、 オリゴヌクレオチドの長さ に依存するため、 結合安定性を高めるためには長鎖のオリゴヌクレオチドを合 成する必要があった。 しかし、 D N Aチップのように多数のオリゴヌクレオチ • ドプローブを必要とするような場合には、 長鎖オリゴヌク レオチドプローブを 合成することはコストの観点から適当でないという問題があった。 発明の開示
本発明の課題は、 担体上に強固に固定化され、 合成後の精製が容易であり、 かつ相補的な標的核酸を効率よく保持するオリ ゴヌクレオチドプローブを提供 することである。
本発明者らは、 上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、 担体への固定 化に必要な反応性官能基を芳香族基と連結した新規化合物を合成し、 これをォ リゴヌクレオチドに導入することによって上記課題が解決できることを見いだ し、 本発明を完成するに至った。
すなわち、 本発明は以下の発明を包含する。
( 1 ) —般式 1 ：
B— D _ A ( 1 )
(式中、 Aはオリゴヌク レオチドを表し、 Dは少なくとも' 1つの芳香族基を有 する二価の有機基を表し、 Bは反応性官能基又はその保護された形態を表す） で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。
( 2 ) 芳香族基が置換又は無置換の 1〜 5環性芳香族炭化水素基である （1 ) 記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
( 3 ) 芳香族基が置換又は無置換のフエナントレン環、 フルオレン環、 ナフタ レン環、 アントラセン環又はピレン環を含むものである （2 ) 記載のオリゴヌ クレオチドプローブ。 ( HN NH4) D'が複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価 の炭化水素基であって、 少なくとも 1つの芳香族基を有する （ 1) 〜 （3) の いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(5) Dが主鎖に二価の芳香族基を含む （1) 〜 （4) のいずれかに記載のォ リゴヌクレオチドプローブ。
(6) Dが側鎖に芳香族基を有する （1) 〜 （4) のいずれかに記載のオリゴ ヌクレオチドプローブ。
(7) Dが一般式 2で表される （6) 記載のオリゴヌクレオチドプローブ： ·
R3
一 Rウー C I— R2'- ( 2 )
I
R1
(式中、 Lは芳香族基を表し、 は水素原子又は置換基を表し、 R2、 R2' 及び R 3はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を んでいてもよい置換 若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す） 。 - (8) R2が一般式 3 ：
— R4— (CH2) m-R5- (CH2) n— (3)
で表され、
R 3が一般式 4 ：
一 (CH2) t一 R6— (CH2) w— (4)
で表され、
R4は、 直接結合又は一 （CH2) (OCH2CH2) q— O—であり、
Rc及び R6は、 それぞれ独立して、 直接結合又は以下に示す基：
Figure imgf000006_0001
を表し、
m、 tは、 それぞれ独立して 0〜 20の整数を表し、
n、 w、 i、 qはそれぞれ独立して 1〜 20の整数を表し、
R7は水素原子又はリン酸保護基を表す、
(7) 記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
(9) Lが置換又は無置換のフヱエル基、 フエナントリル基、 フルォレニル基、 ナフチル基、 アントリル基又はピレニル基である （7) 又は （8) 記載のオリ ゴヌクレオチドプローブ。
(1 0) Dが側鎖にさらなるオリゴヌクレオチドを有する、 （1) 〜 （6) の いずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
( 1 1 ) Dが一般式 2 ' で表される （ 5 ) 記載のオリ ゴヌクレオチドプロー ブ ：
A' l3
— R"— L— R12—?一 R14— ( 2' )
(式中、 Lは二価の芳香族基を表し、 は水素原子又は置換基を表し、
R12、 3及ぴ R14はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでい てもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、 A' は水酸基又はォ リゴヌクレオチドを表す） 。
(1 2) (1) 〜 （1 1) のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドプローブが 固定化された担体。
(1 3) 一般式 5 ：
？9
-R10
B-D'-O-R (5)
O-R 8 (式中、 D' は少なく とも 1つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、 Bは 反応性官能基又はその保護された形態を表し、 oは酸素原子を表し、 Pはリ ン 原子を表し、 R8はリン酸保護基を表し、 R9及び 。は有機基であり、 それ らが結合している窒素原子と一緒になつて環を形成していてもよい） で表される化合物。
( 1 4) 芳香族基が置換又は無置換の 1〜 5環性芳香族炭化水素基である （1 3) 記載の化合物。
( 1 5) 芳香族基が置換又は無置換のフエナントレン環、 フルオレン環、 ナフ タレン環、 アントラセン環又はピレン環を含むものである （1 4) 記載の化合 物。
( 1 6) D' が複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の 二価の炭化水素基であって、 少なく とも 1つの芳香族基を有する （ 1 3) 〜 ( 1 5) のいずれかに記載の化合物。
( 1 7) D' が主鎖に二価の芳香族基を含む （1 3) 〜 （1 6) のいずれかに 記載の化合物。
( 1 8) D' が側鎖に芳香族基を有する （1 3) 〜 （ 1 6) のいずれかに記載 の化合物。
( 1 9) D' が一般式 2で表される （1 8) 記載の化合物：
Figure imgf000008_0001
(式中、 Lは芳香族基を表し、 は水素原子又は置換基を表し、 R2、 R2' 及び R3はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換 若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す） 。 -
(2 0) R2が一般式 3 ：
一 R4 - (CH2) m—R5 - (CH2) n— (3)
で表され、
R 3が一般式 4 ： 一 HN NH (CH2) t— R6 - （CH2) w - (4)
で表され、
R4は、 直接結合又は一 （CH2) i— (〇CH2CH2) q— 0_であり、 R5及び R6は、 それぞれ独立して、 直接結合又は以下に示す基：
Figure imgf000009_0001
を表し、
m、 tは、 それぞれ独立して 0〜 20の整数を表し、
n、 w、 i、 qはそれぞれ独立して 1〜 20の整数を表し、
R7は水素原子又はリン酸保護基を表す、 H N
0
(1 9) 記載の化合物。 NH
(2 1) Lが置換又は無置換のフエナントリル基、 フルォレニル基、 ナフチル 基、 アントリル基又はピレニル基である （1 9) 又は （20) 記載の化合物。
(22) D， が一般式 6で表される （1 7) 記載の化合物：
Figure imgf000009_0002
(式中、 Lは二価の芳香族基を表し、 は水素原子又は置換基を表し、 R12、 1 13及ぴ1^14はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでい てもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、 R15は水酸基保護 基を表す） 。
本癸明のオリゴヌクレオチドプローブは、 担体への反応効率が高いために、 固定化に要するオリゴヌクレオチド量を低減することができる。 さらに、 本発 明のオリゴヌク レオチ ドプローブは、 標的核酸との結合効率が高いために、 従 来と同じ鎖長のものでも高い感度で検出することが可能である。 また、 本発明 のオリゴヌクレオチドプローブは、 合成後の精製が容易であり、 複数種のプロ ーブを作製した場合でも、 自動化によつて精製可能である。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である特願 2004— 1 24477号、 特 願 2004— 2398 3 1号、 およぴ特願 2004— 3 364 14号の明細書 及び/又は図面に記載された内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 従来のオリゴヌクレオチドプローブと本発明のオリゴヌクレオチド プローブの構造を示す。
図 2は、 アミダイ ト化合物 （Y2) の合成方法を示す。
図 3は、 アミダイ ト化合物 （Y 3) の合成方法を示す。
図 4は、 アミダイ ト化合物 （Y 5、 6) の合成方法を示す。
図 5は、 アミダイ ト化合物 （Υ 7) の合成方法を示す。
図 6は、 アミダイ ト化合物 （Υ8) の合成方法を示す。
図 7は、 アミダイ ト化合物 （Υ 9) の合成方法を示す。
図 8は、 オリゴヌクレオチドプローブ （Xn— S p) の構造を示す。
図 9は、 オリゴヌクレオチドプローブ （Xn— S p) のガラス基盤への固定 ィ匕量 （ a ) と F I T Cとの反応性 （ b ： 50塩基ォリゴヌクレオチド、 c ： 2 5塩基オリゴヌクレオチド） を示す。
図 1 0は、 実施例 6におけるハイブリダィゼーシヨ ンの結果を示す。
図 1 1は、 中間体化合物の具体例を表す。
図 1 2は、 25塩基オリゴヌクレオチドプローブ （Xn— S p 25 ; n= l、 5、 9) と両側にオリゴヌクレオチドをもつプローブ （X 9— S p 3 5) のガ ラス基盤への固定化量の測定結果を示す。
図 1 3は、 アミダイ ト化合物 （Y 1 0、 Y 1 1 ) の合成方法を示す。
図 14は、 X 1 0— S p 25の配列と X 10 - S p 25の脱保護反応のスキ ーム （a) 、 X 10— S p 25を逆相 HP L C分析した結果 （b) 、 及び X 1 0— S p 25を酸処理した後、 逆相 H P LC分析した結果 （c) を示す。 以下、 本発明を詳細に説明する。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、 反応性官能基及び芳香族基を有す るリンカ一とオリゴヌクレオチドが結合した構造を有する。 すなわち、 以下の
—般式 1で表される。
B _ D— A ( 1 )
式中、 Aはオリゴヌクレオチドを表し、 Dは少なく とも 1つの芳香族基を有 する二価の有機基を表し、 Bは反応性官能基又はその保護された形態を表す。 本発明においてオリゴヌクレオチドは、 天然のものでも合成のものでもよく、 ポリヌクレオチドをも包含する。 また、 オリゴヌクレオチドは、 D N A及び R N A等の核酸、 二本鎖オリゴヌクレオチド、 オリゴヌクレオチド誘導体を包含 する。 P C R産物も包含される。 オリゴヌクレオチド誘導体としては、 オリゴ ヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチォエート結合に変換され たオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合 が N 3 ' — P 5， ホスホロアミダイ ト結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 オリゴヌクレオチド中のリポースとリン酸ジエステル結合がペプチド核 酸結合に変換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌク レオチド中のゥラ シルが C一 5プロピニルゥラシルで置換されたオリ ゴヌクレオチド誘導体、 ォ リゴヌクレオチド中のゥラシルが C— 5チアゾールゥラシルで置換されたオリ ゴヌクレオチド誘導体 、 オリゴヌクレオチド中のシトシンが C一 5プロピニ ルシトシンで置換されたオリゴヌク レオチド誘導体 、 オリ ゴヌクレオチド中 のシトシンがフエノキサジン修飾シトシンで置換されたオリゴヌクレオチド誘 導体、 オリゴヌクレオチド中のリポースが 2， 一〇一プロピルリボースで置換 されたオリゴヌクレオチド誘導体、 オリゴヌクレオチド中のリボースが 2 ' 一 O—メ トキシリボースで置換されたオリゴヌクレオチド誘導体、 及ぴオリゴヌ クレオチド中のリボースが 2， 一メ トキシエトキシリボースで置換されたオリ ゴヌクレオチド誘導体等を挙げることができる。
本発明においてオリゴヌクレオチドの塩基数は、 通常 1〜5 0 0、 より好ま しくは 5〜2 0 0、 より好ましくは 1 0〜 1 0 0である。
一般式 1において Bは、 反応性官能基又はその保護された形態を表す。 反応 性官能基とは、 オリゴヌクレオチドプローブを固定化しようとする担体上に存 在する官能基と共有結合を形成しうる基を意味し、 例えば、 活性エステル基、 エポキシ基、 アルデヒ ド基、 カルポジイミ ド基、 イソチオシァネート基又はィ ソシァネート基と共有結合しうる基 （例えば、 アミノ基など） 、 あるいはマレ イミ ド基又はジスルフイ ド基と反応しうる基 （例えば、 メルカプト基など） 等 が挙げられる。 本発明においては、 メルカプト基及ぴァミノ基が好ましい。 ァ ミノ基としては、 1級ァミノ基が好ましい。
Bは反応性官能基の保護された形態でもよい。 保護された形態とは、 官能基 の水素原子が保護基で置換された形態を意味する。 ァミノ基の保護基としては、 特に制限されないが、 ァシル基、 カルパメート基、 トリアルキルシリル基、 フ タリル基、 カルボキシアルキルカルボニル基、 トシル基、 トリフルォロアセチ ル基、 トリチル基、 及ぴモノ又はジ置換トリチル基が挙げられる。 モノ置換ト リチル基としては、 例えば、 モノアルコキシトリチル基、 好ましくは炭素数 1 〜4、 より好ましくは炭素数 1のアルコキシ基を有するモノアルコキシトリチ ル基、 具体的には、 モノメ トキシトリチル基、 モノエトキシトリチル基、 モノ プロポキシトリチル基、 モノイソプロポキシトリチル基及びモノブトキシトリ チル基が挙げられる。 トリチル基又はモノ若しくはジ置換トリチル基は疎水性 が強いため、 合成したオリゴヌクレオチドプローブを逆相カラムによって容易 に精製できるという点で有利である。 通常、 アミノ基をトリチル基又はモノ若 しくはジ置換トリチル基で保護した場合、 脱保護するためには強い酸性条件下 で長時間反応させる必要がある。 このような条件は、 核酸に損傷を与えること も考えられ、 また時間を要するという点でも好ましくない。 しかし、 本発明の オリゴヌクレオチドプローブにおいて、 ァミノ基をトリチル基又はモノ若しく はジ置換トリチル基で保護した場合は、 緩和な酸性条件下、 短時間で脱保護可 能なため、 核酸を傷つけることもなく、 また、 脱保護時間を短縮することもで きる。 例えば、 p H 2〜6、 あるいは 5〜8 0体積％の酢酸存在下、 5〜2 0 分処理することにより脱保護することができる。 '
メルカプト基の保護基としては、 特に制限されないが、 t一ブチル基、 ァラ ルキル基、 ジフヱニルメチル基、 トリフ ニルメチル基及ぴァシル基等が挙げ られる。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブにおいて、 オリゴヌクレオチドは、 一 般式 1において として表されるリンカ一部分を介して、 反応性官能基と連結 されている。 Dは、 少なく とも 1つの芳香族基を有する二価の有機基を表す。 二価の有機基としては、 オリゴヌク レオチドプローブの担体との結合性及ぴ 標的オリゴヌクレオチドとの相補的結合を阻害するものでなければ特に制限さ れないが、 好ましくは複素原子を含んでいてもよい置換又は無置換の二価の炭 化水素基である。 二価の炭化水素基としては、 鎖員 2 5 0、 好ましくは鎖員 3〜 3 0、 より好ましくは鎖員 1〜 5のアルキル基、 鎖員 2〜 5 0、 好ましく は鎖員 3〜3 0、 より好ましくは鎖員 1〜 5のアルキレン基、 鎖員 2〜5 0、 好ましくは鎖員 3〜3 0、 より好ましくは鎖員 1〜5のァルケ二レン基、 鎖員 2〜 5 0、 好ましくは鎖員 3〜 3 0、 より好ましくは鎖員 1〜 1 0の二価の脂 環式炭化水素基等が挙げられる。 上記炭化水素基においては、 炭素の一部が複 素原子で置換されていてもよい。 複素原子としては、 酸素原子、 窒素原子、 硫 黄原子、 ケィ素原子、 リ ン原子が挙げられる。
置換基としては、 例えば、 フッ素、 塩素、 臭素及ぴヨウ素から選ばれるハロ ゲン原子、 ヒ ドロキシル基、 置換又は無置換のアミノ基、 ニトロ基、 シァノ基、 置換又は無置換の炭素数 1〜 1 0のアルキル基、 置換又は無置換の炭素数 1〜 1 0のアルケニル基、 置換又は無置換の炭素数 1〜 1 0のシクロアルキル基、 置換又は無置換の炭素数 1〜 1 0のアルコキシ基、 置換又は無置換のアルコキ シカルボニル基又はカルボキシル基等を挙げることができる。
本発明の一態様において、 リンカ一部分 Dは、 好ましくは以下の一般式 2で 表される基である。
I
— R2-C— R2'- 2 )
I
Ri 式中、 Lは芳香族基を表し、 は水素原子又は置換基を表し、 R 2、 R 2 ' 及ぴ R 3はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換 若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す。 ここで置換基は、 上記と同様であ る。 また、 二価の炭化水素基としては、 上記と同様のものが挙げられる。 一般 式 2において、 R 2が反応性官能基 Bと結合し、 R2， がオリゴヌクレオチド の 5 ' 末端又は 3 ' 末端の、 水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。 R2' が 直接結合の場合は、 一般式 2における炭素原子が、 オリゴヌクレオチドの 5 ' 末端又は 3 ' 末端の、 水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。
R2は、 好ましくは一般式 3 ：
-R4- (CH2) m-R5- (CH2) n— (3)
で表される。 R3は好ましくは一般式 4 ：
― (CH2) t— R6 - (CH2) w— (4)
で表される。 R2' は好ましくは直接結合又は _R 2' ， 一 (CH2) 」一であ る。
R2において、 R4が反応性官能基 Bと結合し、 R3において、 一'（CH2) w—が芳香族基 Lと結合し、 R2， において一 （CH2) 〗一がオリゴヌクレオ チドと結合する。
R4は、 好ましくは直接結合又は一 （CH2) ；— （OCH2CH2) g—〇一 である。
R5、 R6及び R2' ' は、 それぞれ独立して、 直接結合又は以下に示す基：
Figure imgf000014_0001
から選択される。
m、 tは、 それぞれ独立して 0〜2 0の整数を表し、 好ましくは 0〜1 0、 より好ましくは 0〜6、 さらに好ましくは 0〜 3の整数を表し、 n、 w、 i、 q及び j はそれぞれ独立して 1〜 20の整数を表し、 好ましくは 1〜 1 0、 よ り好ましくは 1〜6、 さらに好ましくは 1〜3の整数を表す。
ここで、 111+ 11は通常1〜4 0、 好ましくは 1〜20、 より好ましくは 1〜 5であり、 t +wは、 通常 1〜4 0、 好ましくは 1〜 20、 より好ましくは 1 〜 5であり、 i + qは通常 2〜 4 0、 好ましくは 2〜 20、 より好ましくは 2 〜5であり、 R 7は水素原子又はリン酸保護基を表す。 リン酸保護基と しては、 特に限定されないが、 メチル基、 2—シァノエチル基、 2—トリメチルシリル ェチル基、 4—ォキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。
R 4は、 好ましくは直接結合である。
R 5は好ましくは
——
Figure imgf000015_0001
であり、 R 6は好ましくは一 O—である。
本発明においては、 芳香族基としては、 置換又は無置換の芳香族炭化水素基、 置換又は無置換の芳香族複素環基、 置換又は無置換の多環性芳香族基が挙げら れる。 本発明においては、 疎水性の高い芳香族基が好ましい。 また、 本発明に おいて芳香族基には核酸塩基は含まれない。
芳香族基の置換基としては、 例えば、 フッ素、 塩素、 臭素及ぴヨウ素から選 ばれるハロゲン原子、 ヒ ドロキシル基、 置換又は無置換のアミノ基、 ニトロ基、 シァノ基、 置換又は無置換の炭素数 1〜 1 0のアルキル基、 置換又は無置換の 炭素数 1〜 1 0のアルケニル基、 置換又は無置換の炭素数 1〜 1 0のシクロア ルキル基、 置換又は無置換の炭素数 1〜1 0のアルコキシ基、 置換又は無置換 のアルコキシカルボニル基及ぴカルボキシル基等を挙げることができる。
置換又は無置換の芳香^炭化水素基としては、 置換又は無置換の単環性芳香 族炭化水素基、 具体的には、 フエニル基、 2—フルオロフヱニル基、 3 —フル 才ロフエ二ノレ基、 4 ーフノレ才ロフエ二ノレ基、 2—クロ口フエ二ノレ基、 3—クロ 口フエニル基、 2， 3—ジフルオロフェニル基、 2， 5—ジフノレオロフェニノレ 基、 3， 5—ジフルオロフェニル基、 2， 3 —ジクロロフエ二ノレ基、 2 , 5— ジクロロフエ二ノレ基、 3 , 5 —ジクロロフエ二ノレ基、 2—メチノレフエ二ノレ基、 3—メチルフエ二ル基、 4—メチルフエ二ル基、 2—ェチルフエニル基、 3— ェチルフエニル基、 4—ェチルフエニル基などが挙げられる。
芳香族複素環基としては、 ピリジル基、 ピリダジニル基、 ピリ ミジニル基、 ビラジニル基、 フリル基、 チェニル基、 ピロリル基、 イミダゾリル基、 チアゾ リル基、 ォキサゾリル基等が挙げられる。 ' 置換又は無置換の芳香族複素環基の具体例としては、 2—ピリジル基、 3— ピリジル基、 4一ピリジル基、 3—ピリダジニル基、 4ーピリダジニル基、 2 一ピリ ミジニル基、 4—ピリ ミジニル基、 5—ピリ ミジニル基、 ピラジニル基 2—フリル基、 3 _フリル基、 2—チェニル基、 3—チェニル基、 2—ピロリ ル基、 3—ピロリル基、 イミダゾリル基、 チアゾリル基、 ォキサゾリル基、 2 —メチルー 3—ピリジル基、 6—メチル一 3—ピリジル基、 2—クロロー 3— ピリジル基、 6—クロ口 _ 3—ピリジル基、 2—メ トキシ一 3—ピリジル基、 6—メ トキシー 3—ピリジル基、 2 , 6—ジクロロー 3—ピリジル基、 2， 6 —ジメ トキシー 3—ピリジル基、 などを挙げることができる。 好ましい置換又 は無置換の芳香族複素環基としては、 フリル基、 ピロリル基、 ォキサゾリル基 が挙げられる。
多環性芳香族基としては、 ナフチル基、 フエナントリル基、 フルォレニル基、 アントリル基、 ピレニル基、 インダニル基、 テトラヒ ドロナフチル基、 キノリ ル基、 イソキノリル基、 ンノリニル基、 キナゾリニル基、 キノキサリニル基、 ナフチリジニル基、 フタラジニル基、 インドリル基、 イソインドリル基、 ベン ゾフリノレ基、 ベンゾチェ二ノレ基、 インダゾリノレ基、 ベンゾイ ミダゾリ/レ基、 ベ ンゾチアゾリル基が挙げられる。
置換又は無置換の多環性芳香族基の具体例としては、 1 一ナフチル基、 2— ナフチル基、 4一インダニル基、 5—インダニル基、 5—テトラヒ ドロナフチ ル基、 6—テトラヒ ドロナフチル基、 キノリル基、 イソキノリル基、 シンノリ ニル基、 キナゾリニル基、 キノキサリニル基、 ナフチリジニル基、 フタラジュ ル基、 インドリル基、 イソインドリル基、 ベンゾフリル基、 ベンゾチェ二ル基、 イ ンダゾリル基、 ベンゾイ ミダゾリル基、 ベンゾチアゾリル基、 2， 3—メチ レンジォキシフエニル基、 3， 4—メチレンジォキシフエニル基、 2 , 3—ェ チレンジォキシフエ二ノレ基、 3 , 4—エチレンジォキシフエ二ノレ基、 4ーフノレ オロー 1一ナフチル基、 4一クロ口一 1—ナフチル基、 2—メチノレー 1一ナフ チル基、 4ーメチルー 1 一ナフチル基、 2—メ トキシー 1一ナフチル基、 5— メ トキシ一 1一ナフチル基、 6—メ トキシー 1—ナフチル基、 7—メ トキシ一 1—ナフチル基、 2—エトキシ一 1一ナフチル基、 5—エトキシー 1一ナフチ ル基、 6—エトキシー 1 一ナフチル基、 7—エトキシ一 1一ナフチル基、 1一 メ トキシ一 2 _ナフチル基、 3—メ トキシー 2—ナフチル基、 5—メ トキシー 2—ナフチル基、 6—メ トキシ一 2—ナフチル基、 1 一エトキシ一 2—ナフチ ル基、 3—エトキシ一 2 _ナフチル基、 5—エトキシ— 2—ナフチル基、 6— ェトキシ _ 2—ナフチル基、 2—クロロー 5—キノ リル基などを拳げることが できる。 好ましい置換又は無置換の多環性芳香族基としては、 ナフチル基、 ァ ントリル基、 ピレニル基、 フルォレニル基、 フエナントリル基が挙げられる。 芳香族基が D 'の主鎖部分に存在する場合、 上記芳香族基の二価の形態となる。 例えば、 フエ二レン基、 ピリジレン基、 ピリダジニル基、 ピリ ミジニレン基、 ピラジ二レン基、 フ リ レン基、 チ^二レン基、 ピロリ レン基、 イミダゾリ レン 基、 チアゾリ レン基、 ォキサゾリ レン基、 ナフチレン基、 アントリ レン基、 ピ レニレン基、 ィンダニレン基、 テトラヒ ドロナフチレン基、 キノ リ レン基、 ィ ソキノリ レン基、 シンノリ二レン基、 キナゾリ二レン基、 キノキサリニレン基、 ナフチリジニレン基、 フタラジュレン基、 インドリ レン基、 イソインドリ レン 基、 ベンゾフリ レン基、 ベンゾチェ二レン基、 インダゾリ レン基、 ベンゾイミ ダゾリ レン基、 ベンゾチアゾリ レン基が挙げられ、 好ましくはナフチレン基、 アントリ レン基又はピレニレン基である。 上記二価の芳香族基は置換でも無置 換でもよい。
本発明において、 芳香族基は、 1〜 5環性芳香族炭化水素基が好ましい。 特 に、 好ましくは 2〜4環性芳香族炭化水素基、 より具体的には置換又は無置換 のナフチル基、 アントリル基、 フエナントリル基、 フルォレニル基及ぴピレニ ル基、 特に 1 一ナフチル基及ぴ 9一アントリル基である。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブには、 リンカ一部分 Dの側鎖に、 さら なるオリゴヌクレオチドを有するものも包含される。 さら'なるオリ ゴヌクレオ チドはもう一方のオリゴヌクレオチドと同一でも異なっていてもよい。
本発明の別の態様において、 オリゴヌクレオチドプローブとして、 一般式 1 において Dが以下の一般式 2 ' で表されるものが挙げられる。
Figure imgf000017_0001
式中、 Lは二価の芳香族基を表し、 は水素原子又は置換基を表し、 Ru, R1 2、 1 13及ぴ1 14はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでい てもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、 A' は水酸基又はォ リゴヌクレオチドを表す。
ここで置換基は、 上記と同様である。 また、 複素原子を含んでいてもよい置 換若しくは無置換の二価の炭化水素基としては、 上記ど同様のものが挙げられ る。 一般式 2 ' において、 R i iが反応性官能基 Bと結合し、 R14がオリゴヌ クレオチドの 5 ' 末端又は 3 ' 末端の、 水酸基又はリン酸基の酸素と結合する。 Rェ 4が直接結合の場合は、 一般式 2 ' における炭素原子が、 オリゴヌクレオ チドの 5 ' 末端又は 3 ' 末端の、 水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。 A' がオリゴヌクレオチドの場合も同様に、 R i 3がオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端又は 3 ' 末端の、 水酸基又はリン酸基の酸素と結合し、 R 1 3が直接 結合の場合は、 一般式 2 ' における炭素原子が、 オリゴヌクレオチドの 5 ' 末 端又は 3 ' 末端の、 水酸基又はリン酸基の酸素と直接結合する。
R ュは、 好ましくは、 一般式 3 ' ：
(CH2) R 一 (CH2) b— (3 ' )
で表される。 R12は好ましくは一般式 4 '
一 (CH2) R 一 (CH2) d— (4 ' )
で表される。 R13は好ましくは、 直接結合又は一 （CH2) ε·_であり、 R14 は好ましくは、 直接結合又は一 （CH2) f—である。
において、 一 （CH2) a—が反応性官能基 Bと結合し、 R1 2において - (CH2) e—が芳香族基 Lと結合する。
R5， 及び R6， は、 それぞれ独立して、 直接結合又は以下に示す基：
Figure imgf000018_0001
から選択される。
e及び f は、 それぞれ独立して 20の整数を表し、 好ましくは 1〜 1 0、 より好ましくは 1〜5、 さらに好ましくは 1〜 3の整数を表し、 a〜dはそれ ぞれ独立して 0〜 2 0の整数を表し、 好ましくは 0〜1 0、 より好ましくは◦ 〜5、 さらに好ましくは 0〜 3の整数を表す。
ここで、 a + bは通常 1〜 4 0、 好ましくは 1〜2 0、 より好ましくは 1〜 5であり、 c + dは、 通常 1〜4 0、 好ましくは 1〜2 0、 より好ましくは 1 〜5である。 R 7は水素原子又はリン酸保護基を表す。 リン酸保護基としては、 特に限定されないが、 メチル基、 2—シァノエチル基、 2—トリメチルシリル ェチル基、 4一ォキシペンチル基などを好ましい基として挙げることができる。
1 1 3及ぴ1 1 4は、 好ましくは直接結合である。
R 5 ' は好ましくは一 N H— C O—であり、 R 6 ' は好ましくは一 C O— N H—である。
二価の芳香族基 Lとしては、 特に限定されないが、 疎水性の高い二価の芳香 族基、 好ましくは、 置換又は無置換のフヱナントリレン基、 フルォレニレン基、 ナフチレン基、 アントリ レン基又はピレニレン基、 特にナフチレン基及ぴアン トリレン基が挙げられる。 より具体的には、 置換又は無置換の 2， 6 —ナフチ レン基、 1 , 4—ナフチレン基、 1 , 5—ナフチレン基、 2 , 7—ナフチレン 基、 2 , 6—アントリ レン基、 1， 8—アント リ レン基、 9 , 1 0—アント リ レン基、 1， 5—アント リ レン基、 2 , 7—フエナント リ レン基、 2， 8—フ ェナントリ レン基、 1 , 5—フエナント リ レン基、 1 , 6—フエナントリ レン 基、 1 , 7—フエナントリ レン基、 1 , 8—フエナント リ レン基、 1 , 7— 9 H—フルォレニレン基、 1， 6— 9 H—フルォレニレン基、 2， 7—ピレ-レ ン基、 2， 6—ピレニレン基、 又は 1 , 8—ピレニレン基などが挙げられる。 上記のような芳香族基を採用することにより、 環数の増加に伴ってこれら芳 香族基に結合したオリゴヌクレオチドの水への溶解性が低下するのを抑制する ことができる。 また、 担体上に固定化されたプローブ間の疎水的相互作用によ つてプローブ同士が絡み合うこともなく、 標的遺伝子の検出を容易に実施でき る。
本発明はまた、 オリゴヌクレオチドプロープを合成するための中間体化合物 に関する。 一実施形態において本発明の中間体は、 上記オリゴヌクレオチドプ ローブにおいて、 オリゴヌクレオチド部分がホスホロアミダイ トになった構造 を有する化合物である。 従って、 一実施形態において本発明の中間体化合物は、 以下の一般式 5で表される。
Figure imgf000020_0001
式中、 Bは反応性官能基又はその保護された形態を表し、 D ' は少なく とも 1つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、 Oは酸素原子を表し、 Pはリン 原子を表し、 R 8はリン酸保護基を表し、 R 9及ぴ1 1。は有機基であり、 それ らが結合している窒素原子と一緒になつて環を形成していてもよい。
1 9及び1 1。は、 特に制限されないが、 好ましくは炭化水素基であり、 より 好ましくは炭素数 1〜 5のアルキル基である。 例えば、 メチル基、 ェチル基、 プロピル基、 プチル基、 イソプチル基、 ペンチル基、 イソペンチル基が挙げら れる。
あるいは、 R 9及び R 1 0は、 それらが結合している窒素原子と一緒になつて 環基を形成していてもよい。 該環は R 9及ぴ i。が結合している窒素原子の他 にさらに複素原子を含んでいてもよい。 そのような環は、 好ましくは環員 5〜 8、 好ましくは 6の環であり、 例えば、 モルホリン環、 ピぺリジン環、 ピペラ ジン環、 チオモルホリン環等が挙げられ、 好ましくはモルホリン環である。
ここでリン酸保護基は、 ホスホロアミダイ ト法に使用されるものであればど のようなものでもよいが、 メチル基、 2—シァノエチル基、 2—トリメチルシ リルェチル基、 4—ォキシペンチル基などを好ましい基として挙げることがで 含る。
—実施形態において本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、 一般式 5にお いて D ' が上記 Dと等しい中間体化合物を使用して作成することができる。 例 えば、 Dが一般式 2で表される一般式 1のオリゴヌクレオチドプローブは、 一 般式 5において D ' が Dと等しい中間体化合物を使用して作成することができ る。 また、 Dが一般式 2 ' で表される一般式 1のオリゴヌクレオチドプローブ は、 一般式 5において D ' が以下の一般式 6で表される中間体化合物を使用し て作成することができる
Rl5
0
I
^13
— R"― L— R12— C― R 4— (6 )
式中、 Lは二価の芳香族基を表し、 1^は水素原子又は置換基を表し、 R„ R 1 2、 1 1 3及ぴ1 1 4は上記と同義でぁり、 5は水酸基保護基を表す。 水酸 基保護基としては、 D N A合成においてリボースの 5， 位の保護に使用される 保護基を使用することができ、 例えば、 ァセチル基、 5 ' — O— 4， 4 ' , 4， ， — トリス ( 4—ベンゾィルォキシ) ト リチル基及ぴジメ トキシトリチル 基が挙げられ、 ジメ トキシトリチル基が好ましい。 一般式 6においては、 1 ェが8と結合し、 R 1 4が酸素原子に結合する。 好ましい中間体化合物の具体例 を図 1 1に示す。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、 上記中間体化合物をオリゴヌクレ ォチドと連結させることにより合成することができる。 オリゴヌクレオチドへ の中間体化合物の導入は、 D N A自動合成機上でオリゴヌク レオチド合成と同 時に実施することができる。
D ' が一般式 6で表される一般式 5の中間体化合物をオリゴヌクレオチドに 導入した後、 さらに、 オリゴヌクレオチド合成を行うことにより、 R 1 3及ぴ R 1 4にオリ ゴヌク レオチドが連結したオリ ゴヌク レオチ ドプローブを製造す ることができる。 また、 D ' が一般式 6で表される一般式 5の中間体化合物の オリゴヌクレオチドへの導入と、 オリゴヌクレオチドの合成を繰り返し行うこ とにより、 中間体化合物を複数含むオリゴヌク レオチドプローブ、 すなわち複 数の芳香族基を有するオリゴヌク レオチドプローブを合成することもできる。 本発明のオリゴヌクレオチドプローブ及ぴ上記中間体化合物は、 D体及び L 体のいずれも合成及び使用することができ、 またそれらの混合物でもよい。 本発明はまた、 上記オリゴヌク レオチドプローブが固定化された担体に関す る。 該担体は、 本発明のオリゴヌクレオチドプローブが有する反応性官能基と 共有結合しうる官能基をその表面に有するものであれば特に制限されない。 担体の基材としては、 例えば、 石英ガラス、 ホウ珪酸ガラス及びソーダライ ムガラスなどのガラス、 シリコン、 繊維、 木材、 紙、 セラミックス、 プラスチ ック （例えば、 ポリエステル樹脂、 ポリエチレン樹脂、 ポリプロピレン樹脂、
AB S樹脂（Acrylonitrile Butadiene Styrene 樹脂）、 ナイロン、 アタリノレ樹 脂、 フッ素樹脂/ポリカーボネート樹脂、 ポリ ウレタン樹脂、 メチルペンテン 樹脂、 フ ノール樹脂、 メラミン樹脂、 エポキシ樹脂、'塩化ビニル樹脂） が挙 げられる。 本発明においては、 ガラス、 シリ コン、 セラミックス、 プラスチッ クを使用するのが好ましい。 上記基材の表面に官能基を導入したものを担体と して用い、 本発明のオリゴヌクレオチドプローブを固定化する。 オリ ゴヌタレ ォチドプローブの反応性官能基が保護されているときは、 保護基を除去してか ら固定化することが好ましい。
オリゴヌクレオチドプローブが有する反応性官能基と共有結合しうる官能基 としては、 例えば、 活性エステル基、 エポキシ基、 アミノ基、 クロ口基、 ジス ルフィ ド基、 アルデヒ ド基、 マレイイミ ド基、 カルポジイミ ド基、 イソチオシ ァネート基、 イソシァネート基等が挙げられる。
アミノ基又はその保護された形態を有するオリ ゴヌクレオチドプローブを固 定化する場合は活性エステル基、 エポキシ基、 アルデヒ ド基、 カルポジイミ ド 基、 イソチオシァネート基、 イソシァネート基が導入された担体を用いるのが 好ましく、 メルカプト基又はその保護された形態を有するオリゴヌクレオチド プローブを固定化する場合は、 マレイミ ド基、 ジスルフィ ド基が導入された担 体を用いるのが好ましい。
担体の形状は、 特に制限されず、 基盤状、 糸状、 球状、 ビーズ状、 多角形状、 粉末状、 多孔質状などが挙げられ、 本発明においては基盤状が好ましい。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、 ピオチン及び蛍光色素などの標識 に結合させることができる。 蛍光色素としては、 例えば、 Cy 3及ぴ Cy 5な どの C yDy e、 F I TC、 R I TC、 ローダミン、 テキサスレッ ド、 TET、 TAMRA、 F AM, HEX, ROX、 GF Pなどが挙げられる。 本発明のォ リゴヌクレオチドプローブはまた、 医薬に結合させることもできる。
本発明においては、 オリゴヌクレオチドなどの核酸を担体上に固定化する場 合、 固定化する核酸と、 担体への結合に必要な反応性官能基との間に芳香族基 を導入することで核酸を担体上に効率よく固定化することができる。 また、 本 発明のオリゴヌクレオチドプローブは従来のプローブよりも標的核酸との結合 効率が高い。 また第三に、 本発明のオリゴヌクレオチドプローブは、 その合成 と精製が容易である。 発明を実施するための最良の形態 '
以下、 実施例により、 本発明を更に具体的に説明するが、 本発明の範囲はこ れらによって限定されるものではない。
本発明のオリゴヌクレオチドプローブを合成するための中間体化合物 （以下. アミダイ ト化合物と称する） を合成し、 それをオリゴヌク レオチドに導入し、 得られたオリゴヌク レオチドプローブの能力を評価した。
オリゴヌクレオチドへ芳香族基を導入するためのュニット （アミダイ ト化合 物： Y 2、 Υ 3、 Υ 4、 Υ 5、 Υ 6、 Υ 7、 Υ 8、 Υ 9、 Υ 1 0、 Υ 1 1 ) を、 図 2〜 7及び 1 3に示す方法により合成した。
Υ 2は、 アミノ基をもたず芳香族基のみを有するアミダイ ト化合物であり、 D N Α自動合成機により Y 2をオリゴヌクレオチドに導入後、 続けて市販品の N—モノメ トキシトリチルー 6—アミノへキシルホスホロアミダイ ト化合物又 はトリフルォロアセチルー 6—アミノへキシルホスホロアミダイ ト化合物 （グ レンリサーチ社） を用いてアミノ基を導入し、 オリゴヌクレオチドの末端に、 アミノ基と芳香族基を有する 5 0塩基からなるオリゴヌクレオチドプローブ ( X 2 - S p ；図 8 ) を合成した。
Y 3、 Υ 5、 Υ 6、 Υ 7、 Υ 8、 Υ 9、 Υ 1 0、 Y 1 1のアミダイ ト化合物 は、 分子内にアミノ基を有している。 従って、 合成アミダイ ト化合物をオリゴ ヌク レオチドに導入後に、 別途市販のアミノ基結合ホスホロアミダイ ト化合物 を用いてアミノ基を導入する必要がなく、 オリゴヌクレオチドプローブの合成 が従来よりも一工程短くなるという利点を有している。 Υ 3と Υ 5は、 ァミノ 基と芳香族基の連結部位の構造が異なるものであり、 Υ 6は Υ 5よりもァミノ 基と芳香族基の間に、 より長い直鎖リンカ一を導入したものであり、 オリゴヌ クレオチドプローブの担体表面からの距離を保つことができる。 Υ 7は、 Υ 6 の芳香族基がナフチル基ではなくアントリル基であるアミダイ ト化合物である。 Y 8は Y 5の直鎖リンカーの導入部位が異なるアミダイ ト化合物であり、 アミ ノ基と芳香族基が近接している。 これらを 5 ' 末端に有するオリゴヌクレオチ ドプローブをそれぞれ DN Α自動合成機により合成した （X 3—S p、 X 5 - S p、 X 6— S p、 X 7— S p、 X 8— S p、 X 9 - S p ； 図 8) 。
芳香族基を有しないオリゴヌクレオチドプローブとして、 市販の上記アミノ 基結合ホスホロアミダイ ト化合物を用い、 オリゴヌクレオチドの末端にアミノ 基を導入したもの （X l—S p ； 図 8) 、 オリゴヌクレオチドとァミノ基の間 に芳香族基を有しないオリゴヌクレオチドプローブ （X4 _S p ; 図 8) を用 い、 比較例とした。
合成したオリゴヌクレオチドは、 逆相カラムを用いて高純度に精製後、 オリ ゴチップ作製のためのスポッ ト溶液に一定濃度に溶解し、 ガラス基盤上にスポ ッ トし、 固定化した。
基盤への固定化後、 固定化されたオリゴヌクレオチドプローブの 3 ' 末端を 蛍光標識し、 その蛍光強度を測定することで各オリゴヌクレオチドプローブの 基盤上での固定化量を定量した。 実験の結果から、 従来のプローブである X I — S pよりも芳香族基を有するオリゴプローブ （X 2— S p、 X 3— S p、 X 5— S p、 X 6— S p、 X 8 - S p ) は、 固定化量の多いことが明らかとなつ た （図 9 a ) 。
次に各オリゴヌクレオチドプローブの溶液中での活性エステル基との反応効 率を調べるため、 フルォレセインイソチオシアナ一ト及ぴ C y 3スクシンイミ ジルエステルとの反応を行った。 その結果、 本発明の芳香族基を有するオリゴ ヌクレオチドプローブは、 いずれの蛍光色素とも、 従来のオリゴヌクレオチド プローブと比べて高い反応性を示し、 溶液中において.も化学物質との反応性が 向上することが明らかとなった （図 9 b、 c；) 。
Y 9アミダイ ト化合物は、 オリゴヌクレオチドの末端でも、 又は鎖内にも導 入可能な誘導体である （図 7) 。 Y 9アミダイ ト化合物を、 末端 （X 9— S p 25) と鎖内 （X 9— S p 3 5) それぞれに導入したオリゴヌクレオチドを合 成した。 それらについて、 他のアミダイ トと同様に蛍光色素との反応性 （図 9 c) 及びガラス基盤上への固定化効率 （図 1 2) について調べた。
以下に各アミダイ ト化合物及ぴオリゴヌク レオチドプローブの合成方法及び 試験方法を具体的に示す。
(実施例 1) アミダイ ト化合物の合成
薄層クロマトグラフィーは、 K i e s e l g e l 60 F 254 プレート (Me r c k) 上で行った。 カラムクロマトグラフィ一には W a k o g e 1 C- 200 (和光純薬工業） を用いた。 紫外可視スペク トルは島津 UV- 2 5 00 PC分光光度計を用いて測定した。
1 H— NMRはテトラメチルシランを内部標準とし、 J EOL J NM— E X 2 70を用いて測定した。 31 P— NMRは無機リン酸を内部標準とし、 J EOL J NM— E X 270を用いて測定した。
(1) アミダイ ト化合物 （Y 2) の合成 （図 2)
(R) - 1 -0- (1一ナフチルメチル） グリセロール （化合物。）
アルゴン雰囲気下、 1一 (クロロメチル) ナフタレン (化合物 a ) 2.40 m l (1 6. 0 mm o 1 ) 及び （S) — （ + ) — 2 , 2—ジメチルー 1， 3— ジォキソラン一 4一メタノール （化合物 b ) 1. 8 5m l ( 1 5. 0 mm o 1 ) をトルエンとジォキサンの混合溶液 （2 ： 1) 90m lに溶解し、 粉末状に砕 いた水酸化力リウム 4. 5 gを加えて 1 20°Cで 2. 5時間加熱撹拌した。 反応 液を室温まで冷ました後、 酢酸ェチル 300 m 1を加えて、 水 1 00m lで 4 回、 飽和食塩水 1 00m lで 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥 した。 溶液を減圧下濃縮し、 得られた黄色オイル状物質に 80%酢酸水溶液 1 00 m lを加えて溶解し、 室温で 1 5時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮した 後トルエンとの共沸により酢酸を除き、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラ フィー （溶出溶媒： エタノール一クロ口ホルム） により精製して標記化合物
(化合物 c) 3. 24 g (収率 93%) を白色固体状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMSO- d5) δ ': 8.12-8.09 (m, 1 H) , 7.95-7.86 (m， 2 H) , 7.59-7.44 (ra， 4 H), 4.93 (s, 2 H)， 4.67 (d， 1 H， J = 5.3 Hz), 4. 8 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 3.66 (ddddd, 1 H, J = 3.5, 4.8, 5.2， 5.3， 5.9 Hz), 3.56 (dd, 1 H, J = 4.8, 9.7 Hz), 3.45 (dd, 1 H, J = 3.5, 9.7 Hz), 3.39 (ddd, 1 H， J = 5.2， 5.5, 10.9 Hz), 3.34 (ddd, 1 H, J = 5.5, 5.9, 10.9 Hz).
(S) _— 1— O—ジメ トキシトリチルー 3— O— （1—ナフチルメチル） グリ セロール （化合物 d )
アルゴン雰囲気下、 （R) - 1 - 0- ( 1一ナフチルメチル） グリセロール (化合物 c ) 2. 2 0 g ( 9. 5 0 mm o 1 ) をピリジン 8 0 m lに溶解し、 塩 ィ匕ジメ トキシトリチル 3. 9 0 g ( 1. 2当量） を加え、 室温で 1時間撹拌した。 エタノール 1 O m 1を加えて反応を止めた後、 減圧下溶媒を留去した。 残渣を 酢酸ェチル 3 0 0 m lに溶解し、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 1 0 0 m 1 で 1回、 水 1 0 0 m lで 2回、 飽和食塩水 1 0 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫 酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記 化合物 （化合物 d ) 4. 5 9 g (収率 9 0 %) を淡黄色泡状物質として得た。 !H NMR (270 MHz, DMS0-d6) δ ： 8.03—7.86 (m, 3 H)， 7.55—7.19 (ra, 13 H)， 6.85-6.81 (m, 4 H)， 4.94 (d， 1 H， J = 5.6 Hz), 4.91 (s, 2 H) , 3.82 (dddt, 1 H, J = 4.9, 5.3， 5.6, 5.9 Hz), 3.71 and 3.71 (each s, each 3 H), 3.59 (dd, 1 H, J = 4.9, 9.9 Hz), 3.54 (dd， 1 H, J = 5.9, 9.9 Hz), 2.98 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.94 (dd, 1 H， J = 5.9, 9.2 Hz).
( S ) _ 1 — O—ジメ トキシトリチルー 3—〇一 ( 1 一ナフチルメチル) グリ セロール 2— O— （2—シァノエチル一 N, N—ジイソプロピルホスホロァ ミダイ ト） （化合物 Y 2 )
アルゴン雰囲気下、 （S ) — 1 — O—ジメ トキシトリチルー 3— 0— （ 1 一 ナフチルメチノレ） グリセロール （ィ匕合物 d ) 2 7 0 m g ( 0. 5 0 mm o 1 ) を塩化メチレン 1 0 m 1に溶解し、 N, N—ジイソプロピルェチルァミン 0. 2 6 m l ( 3当量） 、 2—シァノエチル一N， N—ジイソプロピルクロ口ホス ホロアミダイ ト 0. 2 2 m 1 ( 2当量） を加え、 室温で 3 0分撹拌した。 反応 液にク口口ホルム 6 0 m lを加えて、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 2 5 m l で 1回、 水 2 5 m 1で 1回、 飽和食塩水 2 5 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸 ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムク 口マトグラフィー （中性シリカゲル、 溶出溶媒：酢酸ェチル一へキサン） によ り精製して標記化合物 （化合物 Y 2 ) 2 7 1 m g (収率 7 4 %) を白色泡状物 質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMS0— d6) δ ： 149.06， Γ48.64. (2) アミダイ ト化合物 （Y 3) の合成 （図 3)
( S ) ー 1一アジドー 3— ( 1—ナフチルメ トキシ） プロパン一 2—オール (化合物 e)
アルゴン雰囲気下、 （R) — 1一〇一 （1一ナフチルメチル） グリセロール (化合物 c) 1. 9 0 g (8. 1 8 mm o 1 ) をピリジン 8 0 m 1に溶解し、 塩 ィ匕トシル 2. 3 2 g ( 1. 5当量） を加えて室温で 4時間撹拌した。 反応液にェ タノール 1 Om lを加えて過剰の試薬を分解した。 減圧下溶媒を留去した後、 残渣を酢酸ェチル 3 0 0 m 1に溶解し、 水 1 0 Om lで 2回、 飽和炭酸水素ナ トリウム水溶液 1 00m lで 1回、 水 1 0 0m lで 1回、 飽和食塩水 1 0 0m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮 後、 得られたオイル状物質をアルゴン雰囲気下、 ジメチルホルムアミ ド 8 0m 1に溶解し、 アジ化ナトリウム 1. 6 0 g (3当量） 及び塩化アンモニゥム 1. 7 5 g (4当量） を加えて 8 0°Cで 2時間加熱撹拌した。 反応液を室温まで冷 ました後、 酢酸ェチル 300m lを加えて、 水 1 0 0 m 1で 5回、 飽和食塩水 1 0 0m lで 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減 圧下濃縮し、 残渣をシリ力ゲル力ラムクロマトグラフィー (溶出溶媒：酢酸ェ チルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 e) 1. 3 0 g (収率 6 2%) を無色オイル状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMS0-d6) δ ： 8.11-8.06 (ra, 1 H), 7.96-7.87 (m， 2 H) , 7.59-7.44 (m, 4 H) , 5.29 (d， 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H)， 3.83
(dddt, 1 H, J = 3.6, 5.3, 6.3， 6.4 Hz), 3.51 (dd， 1 H, J = 5.3, 9.9
Hz), 3.46 (dd， 1 H, J = 6.3, 9.9 Hz), 3.29 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.6 Hz),
3.21 (ddd, J = 6.4, 12.6 Hz).
( S ) 一 1一アミノー 3— （ 1—ナフチルメ トキシ） プロパン一 2—オール (化合物 f )
( S ) — 1一アジドー 3— （ 1—ナフチルメ トキシ） プロパン一 2—オール (化合物 e) 1. 3 0 g (5. 0 5 mm o 1 ) をエタノール 6 0 m 1に溶解し、 パラジウム一炭素 （1 0%) 3 3 0mgを加えて、 常圧の水素雰囲気化、 室温 で 1 5時間撹拌した。 パラジウム触媒をセライ トろ過により除去した後、 溶液 を減圧下濃縮し、 標記化合物 （化合物 f ) '1. 1 7 g (収率 1 0 0 %) を得た。 当化合物は更なる精製をすることなく、 後の反応に用いた。
(S) 一 3— （1—ナフチルメ トキシ） 一 1— N— [6— （トリフルォロアセ トアミ ド） へキサノィル] ァミノプロパン一 2—オール （化合物 g)
アルゴン雰囲気下、 N—トリフルォロアセチルー 6—アミノカプロン酸 （ィ匕 合物 f ) 3 6 0 m g ( 1. 3当量） と 1， 1 ' 一カルボエルジイミダゾール 2 3 5 m g ( 1. 2当量） をジメチルホルムアミ ド、 1 ひ m 1 に溶解し、 室温で 2時間撹拌した。 この反応液に （S) — 1ーァミノ一 3— ( 1—ナフチルメ ト キシ） プロパン一 2—オール （化合物 f ) 2 8 0 m g ( 1. 2 1 mm o 1 ) の ジメチルホルムアミ ド溶液 （5m l ) を加え、 室温でさらに 1 6時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 7 0 m 1を加えて、 水 2 5m lで 4回、 飽和食塩水 2 5 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮 し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： エタノールーク ロロホルム） により精製して標記化合物 （化合物 g ) 4 1 7 m g (収率 7 9 %) を白色固体状物質として得た。
XH NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ： 9.39 (br t, 1 H， J = 4.6 Hz), 8.12-8.08 (m， 1 H)， 7.96-7.86 (m， 2 H), 7.73 (br t， 1 H, J = 5.6 Hz), 7.59-7.44 (ra, 4 H)， 4.94 (br s, 1 H) , 4.93 (s， 2 H)， 3.69 (m, 1 H) , 3.45—3.42 (m， 2 H)， 3.21 (dt, 1 H, J = 5.6, 13.3 Hz), 3.17 (dt, 2 H， J = 4.6, 7.0 Hz), 3.00 (ddd, 1 H, J = 5.6, 6.6， 13.3 Hz), 2.06 (t， 2 H, J = 7. Hz), 1.52-1.41 (m, 4 H) , 1.22 (m, 2 H) .
(S) — 3— （1—ナフチルメ トキシ） 一 1—N— [6— （トリフルォロァセ トアミ ド） へキサノィル] ァミノプロパン一 2—オール 2— （2—シァノエ チルー N, N—ジイソプロピルホスホロアミダイ ト） (化合物 Y 3 )
アルゴン雰囲気下、 （s) — 3— (1—ナフチルメ トキシ） 一 1— N— [6 一 （トリフルォロアセトアミ ド） へキサノィル] ァミノプロパン一 2—オール (化合物 g) 8 8 1 m g (2. 0 0 mm o 1 ) を塩化メチレン 2 0m lに溶解 し、 2—シァノエチルテトライソプロピルホスホロジアミダイ ト 1. 2 7m 1 (2. 0当量） 、 1 H—テトラゾールのァセトニトリル溶液 4. 9 m 1 (0. 4 5 1. 1当量） を加え、 室温で 1時間撹拌した。 反応液にクロ口ホルム 1 0 0 m lを加えて、 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液 40 m 1で 1回、 飽和食塩 7666 水 4 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減 圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （中性シリカゲル、 溶出溶媒：酢酸ェチルーへキサン一 1 %トリェチルァミン） により精製して標 記化合物 （化合物 Y 3) 8 3 1 m g (収率 6 5 %) を無色オイル状物質として 得た。
31P NMR (109 MHz, DMS0-d6) δ ： 148.79.
(3) ァミダイ ト化合物 (Υ 5) の合成 (図 4)
(R) — 2— Ο— （ t e r t—ブチルジメチルシリル） 一 1—〇一 （ 1一ナフ チルメチル） グリセロール （化合物 h)
アルゴン雰囲気下、 (R) 一 1一 0— ( 1一ナフチルメチル) グリセロール (化合物。） 1. 1 6 g (5. 0 0 mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド 3 5 m 1 に溶解し、 t e r t -プチルジメチルクロロシラン 2. 2 6 g (3当量） 、 イミ ダゾール 2. 04 g (6当量） を加えて室温で 2 1時間撹拌した。 反応液にェ タノール 5 m 1 を加えて過剰の試薬を分解した後、 酢酸ェチル 20 0 m 1 を加 えて、 水 7 0m 1で 4回、 飽和食塩水 7 Om 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナ トリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮後、 得られたオイル状物質を塩化 メチレン 7 5 m 1 に溶解して 0°Cに冷却し、 トリフルォロ酢酸 2. 1 m 1 (9 0%水溶液） を加えて、 0°Cで 1時間撹拌した。 反応液に飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液 8 0 m 1 を加えて室温に戻した後、 更にク口口ホルム 1 5 Om 1 を 加えて分液した。 有機層を飽和炭酸水素ナトリ ウム水溶液 8 Om 1で 1回、 飽 和食塩水 8 Om 1で 1回洗浄し、 硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧 下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチ ルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 h)' 1. 7 0 g (収率 9 8%) を無色オイル状物質として得た。
!H NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 8.10—8.07 (m, 1 H)， 7.95—7.85 (m， 2 H)， 7.54-7.43' (m, 4 H), 4.95 (d, 1 H, J = 12.3 Hz), 4.90 (d， 1 H, J = 12.3 Hz), 4.60 (t， 1 H， J = 5.6 Hz), 3.79 (dddd, 1 H, J = 4.0, 5.6， 6.0， 6.3 Hz), 3.58 (dd， 1 H， J = 4.0, 9.9 Hz), 3.44 (dd, 1 H， J = 6.3, 9.9 Hz), 3.36 (ddd, 1 H， J = 5.6, 6.0, 11.1 Hz), 3.31 (dt, 1 H， J = 5.6, 11.1 Hz), 0.83 (s， 9 H) , 0.02 and 0.00 (each s， each 3 H). 2005/007666
( S ) 一 2—〇一 （ t e r t—ブチルジメチルシリル） 一 3—◦一 （ 1一ナフ チルメチル） 一 1一〇一 [N— [ 6 - (トリフルォロアセ トアミ ド） へキシ ル] カルパモイル] グリセロール （化合物 i )
アルゴン雰囲気下、 （R) — 2—〇一 （ t e r t—ブチルジメチルシリル） - 1 -0- (1—ナフチルメチル） グリセローノレ （化合物 h) 6 9 5 m g (2. 0 0 mm o 1 ) 及ぴ DMA P 5 0 m g ( 0. 2当量） をジメチルホルムァミ ド 3 5 m lに溶角军し、 1， 1 ' —カノレポニノレジイミダゾーノレ 1 9 5 m g (0. 6 当量） を加えて室温で撹拌した。 2時間後、 1， 1 ' 一カルボ-ルジイミダゾ ール 1 9 5m g (0. 6当量） を追加してさらに 2時間撹拌した。 この反応液 に Γ， 6—へキサンジァミン 1. 1 6 g (5当量） を加えて室温で 1 5時間撹 拌した。 反応液に酢酸ェチル 1 50 m 1 を加えて、 水 6 0m lで 4回、 飽和食 塩水 6 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリ ゥムにより乾燥した。 溶液を 減圧下濃縮後、 得られた残渣をメタノール3 5 m 1に溶解し、 トリフルォロ酢 酸ェチル 1. 1 9m l ( 5当量） 及びトリェチルァミン 1. 3 9 m 1 (5当量） を加えて、 室温で 1 4時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲ ルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： 酢酸ェチル一へキサン） により精製 して標記化合物 （化合物 i ) 1. 0 7 g (収率 9 2%) を淡黄色オイル状物質 として得た。
XH NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 9.37 (br s， 1 H) , 8.09-8.05 (m, 1 H), 7.95-7.86 (m, 2 H) , 7.55-7.43 (m, 4 H)， 7.06 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 4.96. (d， 1 H, J = 12.2 Hz), 4.91 (d， 1 H, J = 12.2 Hz), 4.03—3.87 (ra, 3 H), 3.56-3.46 (m, 2 H), 3.15 (t， 2 H, J = 6.9 Hz), 2.93 (q, 2 H, J = 6.5 Hz), 1.47-1.34 (m, 4 H), 1.23 (m, 4 H)， 0.81 (s， 9 H), 0.15 and 一 0.01 (each s, each 3 H) .
(S) - 3 -O- (1—ナフチルメチル） 一 1一 O— [N— [6— （トリフル ォロアセトアミ ド） へキシル] 力ルバモイル] グリセロール （化合物 i )
アルゴン雰囲気下、 （S) — 2—〇ー （ t e r t—ブチルジメチルシリル） - 3 -0- (1一ナフチルメチル） 一 1— O— [N— [ 6 - (トリフルォロア セトアミ ド） へキシル] 力ルバモイル] グリセロール （化合物 i ) 1. 0 0 g ( 1. 7 1 mm o 1 ) をテトラヒ ドロフラン 3 5 m 1 に溶解して氷冷し、 フッ 化テトラブチルアンモニゥム溶液 2. 5 7 m 1 ( 1. 0M テトラヒ ドロフラン 溶液、 1. 5当量） を加えた。 反応液を室温に戻した後、 1時間撹拌した。 酢 酸 0. 1 5m l ( 1. 5当量） を加えて中和した後、 反応液を減圧下濃縮し、 残 渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： エタノール一クロ'ロホ ルム） により精製して標記化合物 （化合物〗） 7 34mg (収率 9 1 %) を無 色オイル状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMSO- d6) δ ： 9.38 (br s, 1 H) , 8.10-8.06 (ra, 1 H)， 7.96-7.84 (m, 2 H)， 7.58-7. 4 (ra, 4 H) , 7.10 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.00 (br s, 1 H), 4.93 (s, 2 H) , 3.96 (dd， 1 H, J = 4.6， 10.6 Hz), 3.85 (dd， 1 H, J = 5.9, 10.6 Hz), 3,83 (ra, 1 H) , 3.50 (m， 2 H), 3.15 (dt, 2 H, J = 5.6, 7.0 Hz), 2.94 (q, 2 H, J = 6.4 Hz), 1.48—1.35 (m, 4 H), 1.24 (m, 4 H) .
(S) - 3 -O- ( 1 _ナフチルメチル） 一 1一 O— [N— [6— (トリ フル ォロアセ トアミ ド） へキシル] カルパモイル] グリセロール 2—〇一 （2— シァノエチルー N, N-ジイソプロピルホスホロアミダイ ト） （化合物 Y 5) アルゴン雰囲気下、 （S) — 3 _0— ( 1—ナフチルメチル） 一 1一 O— [N— [ 6 - (ト リ フルォロアセ トアミ ド） へキシル] 力ルバモイル] グリセ ロール （化合物 j ) 1 34 m g (0. 28 mm o 1 ) を塩化メチレン 6. 0 m 1 に溶解し、 2—シァノエチルテトライソプロピルホスホロジァミダイ ト 0. 1 2 m l ( 1. 3当量） 、 1 H—テトラゾールのァセトニトリル溶液 0. 76 m 1 (0. 4 5M、 1. 2当量） を加え、 室温で 1時間撹拌した。 反応液にクロロホ ルム 3 Om l を加えて、 飽和炭酸水素ナトリ ウム水溶液 1 0 m 1で 1回、 飽和 食塩水 1 Om 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液 を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： 酢 酸ェチル—へキサン一 1 %トリェチルァミン） により精製して標記化合物 （ィ匕 合物 Y 5) 1 5 3 m g (収率 8 2%) を無色オイル状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMS0—d6) δ： 149.53.
(4) アミダイ ト化合物 （Υ 6) の合成 （図 4)
(S ) - 2 - O - ( t e r t—プチルジメチルシリル） 一 3— O— （1—ナフ チルメチル） 一— 1一〇一— [N— [1 3—トリ フルォロアセ トアミ ドー 4, 7, . 1 0— トリオキサトリデカニル]—力ルバモイル Ί グリセロール (化合物 k) アルゴン雰囲気下、 （R) 一 2—〇一 （ t e r t—ブチルジメチルシリル） 一 1一 O— （ 1—ナフチルメチル） グリセロール （化合物 h) 7 9 0 m g ( 2 2 8 mm o 1 ) 及び DMA P 5 6 m g (0. 2当量） をジメチルホルムァミ ド 3 5 m l に溶解し、 1 , 1 ' 一力ノレボニノレジイミダゾール 2 22 m g (0. 6 当量） を加えて室温で撹拌した。 1. 5時間後、 1 , 1 ' —カルボニルジイミ ダゾール 22 2m g (0. 6当量） を追加してさらに 2. 5時間撹拌した。 この 反応液に 4, 7, 1 0— トリオキサ一 1 , 1 3— トリデカンジァミン 2. 5 0 m 1 (5当量） を加えて室温で 20時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 2 0 0 m 1 を加えて、 水 7 0 m 1で 4回、 飽和食塩水 7 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層 を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮後、 得られた残渣をメタ ノール 4 0m l に溶解し、 トリフルォロ酢酸ェチル 1. 3 6 m 1 ( 5当量） 及 びトリエチルァミン 1. 5 9 m 1 (5当量） を加えて、 室温で 24時間撹拌し た。 反応液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶 出溶媒 ： 酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 k) 1. 44 g (収率 9 2%) を無色オイル状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 9.36 (br s, 1 H)， 8.09-8.05 (m， 1 H)， 7.96-7.84 (m， 2 H) , 7.55—7.43 (m, 4 H)， 7.05 (t, 1 H， J = 5.6 Hz), 4.96 and 4.90 (each d, each 1 H, J = 12.2 Hz), 4.06-3.86 (m, 3 H)， 3.50-3.34 (m, 14 H) , 3.22 (t， 2 H, J = 7.1 Hz) , 3.00 (q， 2 H, J = 6.6 Hz), 1.69 (m, 2 H)， 1.59 (m， 2 H)， 0.81 (s， 9 H), 0.12 and —0.01 (each s, each 3 H) .
(S) - 3 -O- ( 1—ナフチルメチル） 一 1一〇一 [N— [ 1 3— トリ フル ォロアセ トアミ ド— 4， 7 , 1 0—トリオキサトリデカニル] 力ルバモイル] グリセ口ール （化合物 1 )
アルゴン雰囲気下、 （S) - 2 -0- ( t e r t—プチルジメチルシリル） — 3—〇一 （ 1—ナフチルメチル） 一 1— O— [N— [ 1 3—トリフルォロア セトアミ ドー 4， 7, 1 0 _トリオキサトリデカニル] 力ルバモイル] グリセ ロール （化合物 k) 1. 3 2 g ( 1. 9 2 mm o 1 ) をテトラヒ ドロフラン 3 5 m l に溶解して氷冷し、 フッ化テ トラブチルアンモニゥム溶液 2. 9 0 m 1 ( 1. 0M テトラヒ ドロフラン溶液、 1. 5当量） を加えた。 反応液を室温に 戻した後、 2時間撹拌した。 酢酸 0. 1 7m l (1. 5当量） を加えて中和した 後、 反応液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶 出溶媒：エタノールークロロホルム） により精製して標記化合物 （化合物 1 ) 1. 0 7 g (収率 9 7%) を無色オイル状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ 9.36 (br s， 1 H) , 8.10—8.06 (m, 1 H) , 7.96—7.87 (ra, 2 H)， 7.58-7.44 (m, 4 H)， 7.09 (t, 1 H, J = 5.5 Hz), 4.99 (d, 1 H, J = 4.9 Hz), 4.94 (s, 2 H)， 4.00-3.77 (m， 3 H) , 3.51- 3,35 (ra, 14 H) , 3.23 (q， 2 H, J = 6.6 Hz) , 3.01 (q, 2 H, J = 6.4 Hz), 1.70 (m, 2 H), 1.61 (ra, 2 H) .
(S) — 3—〇一 （ 1一ナフチルメチル） ー 1一 O— [N— [ 1 3— トリ フル ォロアセ トアミ ド一 4, 7, 1 0— ト リオキサト リデカニル] 力ルバモイル] グリセロール 2—〇一 （2—シァノエチルー N， N—ジイ ソプロピルホスホ 口アミダイ ト） （化合物 Y 6 )
アルゴン雰囲気下、 （S) - 3 - O - ( 1一ナフチルメチル） - 1 - O - [N- [ 1 3—トリフルォロアセトアミ ド一 4, 7 , 1 0—トリオキサトリデ 力ニル] カルパモィル] グリセロール (化合物 1 ) 2 6 0 m g (0. 45 mm o 1 ) を塩化メチレン 1 Om 1に溶解し、 2—シァノエチルテ トライソプロピ ルホスホロジアミダイ ト 0. 1 9 m 1 (1. 3当量） 、 1 H—テトラゾールのァ セトニトリル溶液 1. 2 0 m 1 ( 0. 4 5M、 1. 2当量） を加え、 室温で 1時 間撹拌した。 反応液にクロ口ホルム 3 0 m 1を加えて、 飽和炭酸水素ナトリ ウ ム水溶液 1 0 m 1で 1回、 飽和食塩水 1 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナ トリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロ マトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル一へキサン一 1 %トリェチルァミン） により精製して標記化合物 （化合物 Y 6) 226mg (収率 6 4%) を無色ォ ィル状物質として得た。
3IP NMR (109 MHz, DMSO— d6) δ： 149.54.
(5) アミダイ ト化合物 （Υ 7) の合成 （図 5)
(R) — 1一 Ο— (9—アントリルメチル） グリセロール （化合物 η)
アルゴン雰囲気下、 9一 （クロロメチル） アントラセン （化合物 m) 1. 3 6 g (6. 0 mm o 1 ) 及ぴ （S ) — （ + ) — 2 , 2—ジメチル 1 , 3—ジォ キソラン一 4ーメタノール （化合物 b) 0. 8 2m l (0. 6 6 mm o 1 ) をト ルェンとジォキサンの混合溶液 （2 ： 1) 6 0m lに溶解し、 粉末状に砕いた 水酸化力リウム 2. 0 gを加えて 1 2 0でで1. 5時間加熱撹拌した。 反応液を 室温まで冷ました後、 酢酸ェチル 2 0 0 m 1を加えて、 水 7 Om lで 3回、 飽 和食塩水 7 Om 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶 液を減圧下濃縮し、 得られた黄色オイル状物質に 8 0%酢酸水溶液 6 Om 1を 加えて溶解し、 室温で 1 8時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮した後トルエン との共沸により酢酸を除き、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶 出溶媒：エタノールークロロホルム） により精製して標記化合物 （化合物 n) 1. 4 l g (収率 8 3%) を淡黄色固体状物質として得た。
Ή NMR (270 MHz, DMSO-d6) δ ： 8.62 (s, 1 H) , 8.45-8.42 (m， 2 H) , 8.12- 8.09 (m， 2 H), 7.62-7.50 (m, 4 H) , 5.46 (s, 2 H) , 4.70 (d, 1 H, J = 5.0 Hz), 4.50 (t, 1 H, J = 5.7 Hz), 3.69—3.54 (ra, 3 H) , 3.36 (ddd, 1 H， J = 4.9, 5.7, 11.2 Hz), 3.31 (ddd, 1 H， J = 5.3, 5.7， 11.2 Hz).
(S) — 3—0— ( 9—アントリルメチル） 一 l—O— （ジメ トキシトリチ ル） グリセローノレ （ィ匕合物 o)
アルゴン雰囲気下、 (R) — 1一 O— ( 9一アントリルメチル) グリセロー ル （化合物 n) 1. 2 5 g (4.4 3 mm o 1 ) をピリジン 3 5m l に溶解し、 塩化ジメ トキシトリチル 1. 8 0 g ( 1. 2当量） を加え、 室温で 1. 5時間撹 拌した。 エタノール 5 m 1を加えて反応を止めた後、 減圧下溶媒を留去した。 残渣を酢酸ェチル 200m lに溶解し、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 7 Om 1で 1回、 水 7 0 m 1で 2回、 飽和食塩水 70 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫 酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラム クロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記 化合物 （化合物 o) 2.4 7 g (収率 9 5 %) を淡黄色泡状物質として得た。 Ή NMR (270 MHz, DMS0 - d6) δ 8.63 (s， 1 H)， 8.39-8.36 (m, 2 H), 8.12- 8.08 (m, 2 H), 7.54—7.46 (m, 4 H) , 7.34—7.15 (m, 9 H), 6.78—6.73 (m, 4 H)， 5.45 (s， 2 H), 4.92 (d， 1 H, J = 5.3 Hz), 3.79 (m, 1 H), 3.72—3.66 (m, 2 H), 3.69 and 3.68 (each s, each 3 H), 2.93 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.3 Hz), 2.88 (dd, 1 H, J = 5.6, 9.3 Hz).
(R) - 1 -O- ( 9一アン ト リルメチル) — 2—0— （ト リイソプロビルシ リル） グリセ口ール （化合物 p )
アルゴン雰囲気下、 （S) - 3 -0- (9—アント リルメチル） 一 1— O— (ジメ トキシトリチル） グリセロール （化合物 o ) 7 6 0 m g ( 1. 3 0 mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド 1 0m l に溶解し、 トリ'イソプロビルシリルク ロリ ド 0. 7 1 m l ( 2. 5当量） 、 ィミダゾール4 5 0111 § (5当量） を加え て室温で 2 日間撹拌した。 反応液にエタノール 5 m l を加えて過剰の試薬を分 解した後、 酢酸ェチル 20 0m l を加えて、 水 70 m 1で 4回、 飽和食塩水 7 0m lで 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧下 濃縮後、 得られたオイル状物質をクロ口ホルム 1 0 m 1 に溶解し、 8 0%酢酸 水溶液 2 Oni 1 を加えて、 室温で 1時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮し、 残 渣をシリ力ゲルカラムク口マトグラフィー （溶出溶媒 ： 酢酸ェチル一へキサ ン） により精製して標記化合物 （化合物 p) 5 2 3 m g (収率 9 2%) を淡黄 色泡状物質として得た。
NMR (270 MHz, DMS0-d6) 8 ·· 8.62 (s, 1 H)， 8.44-8.41 (m, 2 H)， 8.12— 8.06 (m, 2 H), 7.59-7.49 (m, 4 H)， 5.49 and 5.44 (each d, each 1 H, J = 11.5 Hz), 4.59 (t, 1 H, J = 5.4 Hz), 3.81-3.71 (m， 2 H) , 3.61 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.7 Hz), 3.37 (dd, 2 H, J = 5.4, 5.6 Hz), 0.91-0.84 (m, 21 H).
(S) 一 3— O— （9—アント リルメチル） 一 1—〇一 [N— 「1 3— トリフ ルォロアセトアミ ドー 4, 7 , 1 0— トリオキサトリデカニル] 力ルバモイ ル Ί - 2 -0- (トリイソプロビルシリル） グリセロール'（化合物 q )
アルゴン雰囲気下、 （R) - 1 -0- ( 9—アント リルメチル). 一 2—〇一 (ト リイ ソプロビルシリル） グリセロール （化合物 p ) 5 2 0 m g ( 1. 1 8 mm o 1 ) 及ぴ DM A P 3 0 m g (0. 2当量） をジメチルホルムアミ ド 2 0 m l に溶解し、 1 , 1 ， 一カルボニルジイ ミダゾール 1 2 0 m g (0. 6当 量） を加えて室温で撹拌した。 2時間後、 1， 1 ' 一カルボニルジイミダゾー ル 1 2 0 mg (0. 6当量） を追加してさらに 2時間撹拌した。 この反応液に 4， 7， 1 0— トリオキサ一 1， 1 3—トリデカンジァミン 1. 3 0 m 1 (5 当量） を加えて室温で 20時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 1 3 Om 1 を加 えて、 水 5 Om lで 4回、 飽和食塩水 5 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナ トリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮後、 得られた残渣をメタノール 2 Om lに溶解し、 トリフルォロ酢酸ェチル 0. 7 1 m 1 (5当量） 及びトリェ チルァミン 0. 8 4m l (5当量） を加えて、 室温で 24時間撹拌した。 反応 液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： 酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 q) 7 7 3 m g
(収率 84%) を淡黄色オイル状物質として得た。
!H NMR (270 MHz, DMS0_d6) δ ： 9.36 (br s, 1 H) , 8.63 (s, 1 H) , 8.43- 8.40 (m， 2 H)， 8.12—8.08 (ra, 2 H), 7.59—7.50 (m, 4 H)， 7.01 (t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5. 8 (s, 2 H) , 3.99-3.88 (m, 3 H) , 3.69 (dd, 1 H, J = 4.9, 9.9 Hz), 3.64 (dd, 1 H, J = 4.6, 9.9 Hz), 3,51—3.35 (m, 12 H)， 3.23 (t, 2 H， J = 6.9 Hz), 3.00 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 1.70 (m, 2 H)， 1.60 (m, 2 H)， 0.90-0.83 (m, 21 H) .
(S) - 3 -O- ( 9一アントリルメチル) _ l—0— [N— [1 3—トリフ ルォロアセ トアミ ド— 4 , 7 , 1 0— トリオキサトリデカニル] 力ルバモイ ノレ] グリセロール （化合物で）
アルゴン雰囲気下、 （S) — 3—〇一 （9—アントリルメチル） 一 1ー〇一 [N— [ 1 3—トリフルォロアセトアミ ドー 4， 7， 1 0—トリオキサトリデ 力ニル] 力ルバモイル] — 2—0— （トリイソプロビルシリル） グリセロール (化合物 q) 50 0 m g (0. 6 4 mm o 1 ) をテトラヒ ドロフラン 1 2 m 1 に溶解して氷冷し、 フッ化テトラブチルアンモニゥム溶液 0. 9 6m 1 ( 1. 0 M テトラヒ ドロフラン溶液、 1. 5当量） を加えた。 反応液を室温に戻した 後、 1時間撹拌した。 酢酸 5 5 ^ 1 ( 1. 5当量） を加えて中和した後、 反応 液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： エタノールークロロホルム） により精製して標記化合物 （化合物 ） 3 8 3 m g (収率 9 5%) を淡黄色オイル状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMS0 - d6) δ ： 9.37 (br s, 1 H), 8.63 (s， 1 H)， 8.44- 8.41 (m， 2 H)， 8.12-8.09 (m, 2 H), 7.61-7.50 (m, 4 H)， 7.09 (t， 1 H, J = 5.6 Hz), 5.47 (s， 2 H)， 5.00 (d， 1 H， J = 4.6 Hz), 3.95 (m， 1 H), 3.89-3.79 (m, 2 H)， 3.64 (m, 2 H) , 3.50—3.36 (m， 12 H) , 3.23 (q, 2 H, J = 6.6 Hz), 3.01 (q, 2 H, J = 6.5 Hz) , 1.70 (ra, 2 H)， 1.61 (m， 2 H) .
(S) 一 3—〇一 （ 9—アント リルメチル） 一 1— O— [N— [ 1 3— ト リ フ ルォロアセトアミ ドー 4 , 7 , 1 0— トリオキサトリデカニル] カルパモイ ル] グリセロール 2— O— （2—シァノエチノレー N, N—ジイソプロピルホ スホロアミダイ ト） （化合物 Y 7)
アルゴン雰囲気下、 (S) - 3 -0- ( 9—アント リルメチル) 一 1一 O— [N— [1 3— トリ フルォロアセ トアミ ド一 4, 7， 1 0—トリオキサト リデ 力二ノレ] カノレバモイノレ] グリセ口一ノレ （ィ匕合物 r ) 3 5 0 m g (0. 5 6 mm o 1 ) を塩化メチレン 1 0 m 1 に溶解し、 2—シァノエチルテトライソプロピ ルホスホロジアミダイ ト 0. 2 1 m 1 (1. 2当量） 、 1 H—テトラゾールのァ セトニトリル溶液 1. 3 8m l (0. 4 5M、 1. 1当量） を加え、 室温で 1. 5 時間撹拌した。 反応液にクロ口ホルム 6 0 m 1 を加えて、 飽和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液 2 5m lで 1回、 水 2 5m lで 1回、 飽和食塩水 2 5 m 1で 1回洗 浄し、 有機層を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣を シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒： 酢酸ェチルーへキサン一 1 %ト リェチルァミン） により精製して標記化合物 （化合物 Y 7) 2 9 3 m g (収率 64%) を淡黄色オイル状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMSO— d6) δ： 149.51, 149.43.
(6) アミダイ ト化合物 （Υ 8) の合成 （図 6)
(S) 一 3— (1—ナフチルメ トキシ） 一 1— トリフルォロアセトアミ ドプロ パン一 2—オール （化合物 s )
アルゴン雰囲気下、 （s) — 1一アミノー 3— (1—ナフチルメ トキシ） プ ロノヽ0ンー 2—ォーノレ （化合物 f ) 9 0 0 m g (3. 8 9 mm o 1 ) をメタノー ル 5 Om l に溶解し、 トリフルォロ酢酸ェチル 0. 9 3 m 1 (2当量） 及びト リエチルァミン 1. 0 9 m 1 (2当量） を加えて、 室温で 3時間撹拌した。 反 応液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶 媒 ： 酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 s ) 8 6 0m g (収率 6 8 %) を白色固体状物質として得た。
'Η NMR (270 MHz, DMSO - d6) δ： 9.34 (br t, 1 H， J = 5.7 Hz), 8.12-8.08 (m, 1 H)， 7.96-7.87 (m, 2 H) , 7.59—7.45 (m， 4 H)， 5.12 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 4.94 (s, 2 H) , 3.83 (dddt, 1 H， J = 4.6, 5.3, 5.6， 7.7 Hz), 3.50 (dd， 1 H, J = 5.3， 9.9 Hz), 3.45 (dd， 1 H， J = 5.6, 9.9 Hz), 3.32 (ddd, 1 H, J = 4.6， 5.7, 13.2 Hz)， 3.17 (ddd, 1 H, J = 6.1, 7.7, 13.2 Hz).
( S ) 一 2— [N— ( 6 ' —ヒ ドロキシへキシノレ） カノ バモイノレ] ォキシ一 3 一 ( 1一ナフチルメ トキシ） 一 1—トリフルォロァセトアミ ドプロパン （化合 物 t )
アルゴン雰囲気下、 （S) — 3— (1—ナフチルメ トキシ） 一 1— トリフル ォロアセトアミ ドプロパン一 2—オール （化合物 s ) 5 1 0 m g ( 1. 5 6 m m o 1 ) 及ぴ DM A P 3 8 m g ( 0. 2当量） をジメチルホルムァミ ド 2 0 m 1 に溶解し、 1 , 1 ' —カノレボニルジイミダゾール 1 9 0 g (0. 7 5当量） を加えて室温で撹拌した。 2時間後、 1 , 1 ' —カルボニルジイミダゾール 1 9 0 m g (0. 7 5当量） を追加してさらに 2時間撹拌した。 この反応液に 6 —アミノー 1一へキサノール 5 5 0 m g (3当量） を加えて室温で 2時間撹拌 した。 反応液に酢酸ェチル 1 5◦ m 1 を加えて、 水 5 Om lで 4回、 飽和食塩 水 5 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減 圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチルー へキサン） により精製して標記化合物 （化合物 ） 48 7 mg (収率 6 7%) を白色固体状物質として得た。
XH NMR (270 MHz, DMS0_d6) δ ： 9.48 (br s， 1 H), 8.09—8.06 (m, 1 H) , 7.96-7.88 (ra, 2 H) , 7.59-7.44 (m， 4 H) , 7.17 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 5.01 (m, 1 H), 4.97 (d， 1 H， J = 11.9 Hz), 4.91 (d, 1 H, J = 11.9 Hz), 4.33 (t, 1 H, J = 5.2 Hz), 3.68-3.57 (m, 2 H) , 3.42—3.34 (m, 4 H), 2.93 (dt, 2 H, J = 5.6， 6.9 Hz), 1. 2-1.33 (m, 4 H)， 1.27-1.20 (m, 4H) . ( S) - 2 - [N— （6， ーヒ ドロキシへキシル） 力ルバモイル] ォキシ一 3 - ( 1—ナフチルメ トキシ） 一 1— トリフルォロアセトアミ ドプロパン 6， -0- (2—シァノエチル一 N， N—ジイソプロピルホスホロアミダイ ト） (化合物 Y 8)
アルゴン雰囲気下、 （S) — 2— [N- '( 6 ' —ヒ ドロキシへキシル） カル バモイル] ォキシ一 3— ( 1—ナフチルメ トキシ） 一 1—トリフルォロアセ ト ァミ ドプロパン （化合物 t) 1 8 8 m g (0. 4 0 mm o 1 ) を塩化メチレン 8 m 1に溶解し、 2—シァノエチルテトライソプロピルホスホロジァミダイ ト 0. 1 5 m l ( 1. 2当量） 、 1 H—テ トラゾールのァセトニトリル溶液 0. 9 8m l (0.4 5M、 1. 1当量） を加え、 室温で 20分撹拌した。 反応液にク 口口ホルム 3 0m lを加えて、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 1 0 m 1で 1回、 水 1 0 m 1で 1回、 飽和食塩水 1 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウ ムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグ ラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチル—へキサン— 1 %トリェチルァミン） により 精製して標記化合物 （化合物 Y 8) 1 7 Omg (収率 6 3 %) を白色固体状物 質として得た。
31P 画 (109 MHz, DMS0-d6) δ ： 147.21.
(7) アミダイ ト化合物 （Υ 9) の合成 （図 7)
(R) 一 1一〇一トシル— 3— Ο—ジメ トキシトリチルダリセロール （化合物 u)
アルゴン雰囲気下、 （S) —（ + ) — 2， 2—ジメチル 1, 3—ジォキソラン一 4—メタノール （化合物 b) 1. 24m l ( 1 0. 0 mm o 1 ) をピリジン 5 0 m 1に溶解し、 塩化トシル 3. 8 1 g (2. 0当量） を加えて室温で 1 7時間撹 拌した。 反応液に水 1 5m 1を加えて過剰の試薬を分解した。 減圧下溶媒を留 去した後、 残渣を酢酸ェチル 3 5 0 m 1に溶解し、 水 1 0 0m lで 1回、 飽和 炭酸水素ナトリゥム水溶液 1 0 0 m 1で 1回、 水 1 0 0 in 1で 1回、 飽和食塩 水 1 0 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を 減圧下濃縮後、 得られたオイル状物質に 8 0 %酢酸水溶液 7 0m lを加えて溶 解し、 室温で 2 0時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮した後トルエンとの共沸 により酢酸を除き、 さらにピリジンと共沸した。 アルゴン雰囲気下、 この残渣 をピリジン 6 0m l に溶解し、 塩化ジメ トキシト リチノレ 4. 0 7 g ( 1. 2当 量） を加え、 室温で 2時間撹拌した。 エタノール 1 Om 1を加えて反応を止め た後、 減圧下溶媒を留去した。 残渣を酢酸ェチル 3 5 0m lに溶解し、 水 1 0 0 m 1で 1回、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 1 0 0m lで 1回、 水 1 0 0m 1で 1回、 飽和食塩水 1 0 Om 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムによ り乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィ 一 （溶出溶媒 ：酢酸ェチル一^ ~キサン） により精製して標記化合物 （化合物 u) 4. 5 1 g (収率 8 2 %) を白色泡状物質として得た。
¾ NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 7.74 (m, 2 H)， 7.45 (ra， 2 H) , 7, 29—7.13 (m, 9 H), 6.88-6.84 ( , 4 H) , 5.28 (d， 1 H, J = 5.6 Hz), 4.04 (dd， 1 H, J = 3.6, 9.6 Hz), 3.96 (dd， 1 H, J = 5.4, 9.6 Hz)', 3.78 (m, 1 H) , 3.74 (s, 6 H), 2.94 (dd， 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.83 (dd, 1 H， J = 6.9, 9.2 Hz), 2.39 (s, 3 H).
(R) 一 3—ジメ トキシトリチルォキシー 1—アジドプロパン一 2 _オール (化合物 V )
アルゴン雰囲気下、 （R) — 1 —O—トシル一 3— O—ジメ トキシトリチル グリセロール （化合物 u) 9 3 0 m g ( 1. 7 0 mm o 1 ) をジメチルホルム アミ ド 2 0 m 1に溶解し、 アジ化ナトリウム 4 4 0 m g (4当量） 及び塩化ァ ンモ -ゥム 4 5 5 m g ( 5当量） を加えて 8 0°Cで 2時間加熱撹拌した。 反応 液を室温まで冷ました後、 酢酸ェチル 1 5 0 m 1を加えて、 水 5 O m lで 4回、 飽和食塩水 5 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶 媒：酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 V ) 6 9 0 m g (収率 9 6 %) を黄色オイル状物質として得た。
!H NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 7.41—7.18 (m, 9 H)， 6.91—6.86 (m, 4 H) , 5.31 (d， 1 H, J = 5.3 Hz), 3.81 (dtdd, 1 H， J = 3.6, 5.3， 6.3， 6.6 Hz), 3.73 (s, 6 H), 3.36 (dd, 1 H, J = 3.6, 12.5 Hz), 3.28 (dd, 1 H， J = 6.3, 12.5 Hz), 3.00 (dd, 1 H, J = 5.3, 9.2 Hz), 2.88 (dd, 1 H, J = 6.6, 9.2 Hz).
(R) — 3—ジメ トキシトリチルォキシー 1 —ァミノプロパン一 2—オール (化合物 w)
(R) — 3—ジメ トキシトリチルォキシー 1一アジドプロパン一 2—オール (化合物 V ) 6 2 0 m g ( 1. 4 8 mm o 1 ) をェタノール 2 0 m l に溶解し、 パラジウム一炭素 （1 0 %) 1 2 0 m gを加えて、 常圧の水素雰囲気化、 室温 で 6時間撹拌した。 パラジウム触媒をセラ'イ トろ過により除去した後、 溶液を 減圧下濃縮し、 標記化合物 （化合物 w) 54 8 m g (収率 94 %) を白色泡状 物質として得た。 当化合物は更なる精製をすることなく、 後の反応に用いた。 ]H NMR (270 MHz, DMS0-d6) δ ： 7.42-7.21 (m, 9 H)， 6.90-6.86 (m, 4 H)， 4.71 (br s， 1 H), 3.73 (s， 6 H)， 3.55 (dddd, 1 H, J = 4.0, 5.3， 6.0, 6.9 Hz), 2.94 (dd, 1 H, J = 5.3, 8.9 Hz), 2.83 (dd, 1 H， J = 6.0, 8.9 Hz), 2.68 (dd, 1 H， J = 4.0, 12.8 Hz), 2.46 (dd, 1 H， J = 6.9, 12.8 Hz).
6— {N- C (R) — 3 ' —ジメ トキシトリチルォキシ一 2， ーヒ ドロキシプ ロピノレ] 力ルバモイル} ナフタレン一 2—カルボン酸ペンタフルオロフェニル エステル （化合物 X)
アルゴン雰囲気下、 2 , 6—ナフタレンジカルボン酸ジペンタフノレオ口フェ 二ノレエステル 8 2 2 m g ( 1. 5 mm o 1 ) 及ぴ N, N—ジイソプロピルェチ ノレアミン 0. 70m l (4. 0 mm o 1 ) をテトラヒ ドロフラン 70m l に溶解 し、 この溶液に （R) — 3—ジメ トキシトリチルォキシー 1ーァミノプロパン — 2—オール （化合物 w) 5 2 0 m g ( 1. 3 2 mm o 1 ) のテトラヒ ドロフ ラン溶液 （1 0m l ) を 1 0分かけて滴下した。 室温でさらに 1時間撹拌した 後、 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出 溶媒：酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 X ) 6 64 mg (収率 6 7%).を白色泡状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ·■ 9.01 (m, 1 H)， 8.65 (br t, 1 H， J = 5.6 Hz), 8.51 (m, 1 H) , 8.32 (d， 1 H, J = 8.6 Hz), 8.26 (d， 1 H, J = 8.6 Hz), 8.19 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 8.02 (dd, 1 H, J = 1.7, 8.6 Hz), 7.45-7.42 (m, 2 H)， 7.31-7.17 (m, 7 H)， 6.87—6.83 (m, 4 H) , 5.12 (d, 1 H， J = 5.6 Hz), 3.94 (m， 1 H)， 3.69 (s, 3 H)， 3.68 (s， 3 H)， 3.56 (m， 1 H)， 3.29 (m， 1 H), 3.05—2.96 (m， 2 H).
6 - {N— C (R) — 3 ' —ジメ トキシトリチルォキシ一 2 ' —ヒ ドロキシプ 口ピル] カルパモイル} — 2— { N - [N - (ト リ フルォロアセチル） 一 3， ' ーァミノプロピル] 力ルバモイル} ナフタレン （化合物 V )
アルゴン雰囲気下、 6— {N— [ (R) - 3 ' —ジメ トキシトリチルォキシ - 2 ' —ヒ ドロキシプロピル Ί 力ルバモイノレ } ナフタレン一 2—力ノレボン酸ぺ ンタフルォロフエ二ノレエステノレ （化合物 X ) 6 4 0 m g ( 0. 8 4 mm o 1 ) をジメチルホルムアミ ド 2 0 m 1 に溶解し、 1 ， 3—プロパンジァミン 0. 7 ◦ m l ( 1 0当量） を加えて室温で 3 0分撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 1 5 0 m 1 を加えて水 5 0 m 1で 5回洗浄し、 有機層を減圧下濃縮した。 得られた 残渣をアルゴン雰囲気下メタノール 1 5 m 1に溶解し、 トリフルォロ酢酸ェチ ノレ 0. 5 0 m l ( 5当量） 及ぴトリエチルァミ ン 0. 5 9 m 1 ( 5当量） を加え て、 室温で 1 4時間撹拌した。 反応液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラ ムクロマトグラフィー (溶出溶媒：酢酸ェチル一^ ^キサン） により精製して標 記化合物 （化合物 y) 4 4 0 m g (収率 7 0 %) を白色泡状物質として得た。
NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 9.46 (br s, 1 H) , 8.72 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8.55 (br t, 1 H, J = 5.6 Hz), 8. 7 (ra， 1 H)， 8.41 (m, 1 H)， 8.09-8.05 (ra, 2 H)， 7.99-7.91 (m, 2 H)， 7.44-7.41 (m, 2 H)， 7.31-7.16 (m, 7 H)， 6.86-6.82 (m, 4 H) , 5.10 (d, 1 H, J = 5.3 Hz), 3.93 (m, 1 H), 3.68 (s， 3 H), 3.67 (s， 3 H) , 3.53 (m, 1 H) , 3.41-3.23 (m, 5 H), 2.99 (m, 2 H)， L 81 (m, 2 H) . '
6一 {N— [ (R) _ 3 ' —ジメ トキシト リチルォキシー 2 ' —ヒ ドロキシプ ロ ピノレ] 力ルバモイル} - 2 - { N - [N - ( ト リ フルォロァセチル) 一 3 ' ' —ァミノプロピル] カルパモイル} ナフタレン 2 ' — O— ( 2—シァ ノエチルー N, N—ジイソプロピルホスホロアミダイ ト） （化合物 Y 9 )
アルゴン雰囲気下、 6 — {N- [ (R) - 3 ' ージメ トキシトリチルォキシ - 2 ' ーヒ ドロキシプロピル] カルパモイル} — 2— {N— [N— (トリ フル ォロアセチル） 一 3 ' ， ーァミノプロピル] 力ルバモイル} ナフタレン （化合 物 y ) 2 9 8 m g ( 0. 4 0 mm o 1 ) を塩化メチレン 1 0 m 1 に溶解し、 2 —シァノエチルテ トライソプロピルホスホロジアミダイ ト 0. 1 5 m 1 ( 1. 2 当量） 、 1 H—テトラゾールのァセトニト リル溶液 0 · 9 8 m 1 ( 0. 4 5 M、 1. 1当量） を加え、 室温で 2時間撹拌した。 反応液にクロ口ホルム 3 0 m 1 を加えて、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 1 5 m 1で 2回、 飽和食塩水 1 5 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮 し、 残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー （溶出溶媒：酢酸ェチルーへ キサン一 1 %トリェチルァミン） により精製して標記化合物 （化合物 Y 9 ) 2 5 5 m g (収率 6 8%) を白色泡状物質として得た。
31P NMR (109 MHz, DMS0 - d6) δ： 149.20, 148, 95.
(8) アミダイ ト化合物 （Υ 1 0及び Υ 1 1 ) の合成 （図 1 3)
(S) - 1 - (モノメ トキシトリチル） アミノー 3— （ 1一ナフチルメ トキ シ） プロパン一 2 _オール （化合物 α)
アルゴン雰囲気下、 （S) — 1一アミノー 3— （ 1一ナフチルメ トキシ） プ 口パン一 2—オール （化合物 f ) 1. 8 2 g (7. 8 5 mm o 1 ) をピリジン 7 5m 1 に溶解し、 塩化モノメ トキシトリチル 3. 1 5 g ( 1. 3当量） を加え室 温で 7時間撹拌した。 エタノール 1 5 m 1 を加えて反応を止めた後、 減圧下溶 媒を留去した。 残渣を酢酸ェチル 2 00 m 1 に溶解し、 水 7 Om lで 1回、 飽 和炭酸水素ナトリ ゥム水溶液 7 0m lで 1回、 水 7 0m lで 1回、 飽和食塩水 7 0m lで 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリ ウムにより乾燥した。 溶液を減圧 下濃縮し、 残渣をシリカゲルカラムクロマト'グラフィー （中性シリカゲル、 溶 出溶媒： 酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化合物 α) 2. 8 0 g (収率 7 1 %) を白色泡状物質として得た。
JH NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 8.03-8.00 (m, 1 H) ' 7.94-7.85 (m, 2 H)， 7.54-7.34 (ra, 8 H), 7.28-7.12 (m, 8 H)， 6.82—6.77 (m, 2 H) , 4.94 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.88 (d, 1 H, J = 12.2 Hz), 4.80 (d, 1 H， J = 5.3 Hz)， 3.82 (m, 1 H), 3.70 (s， 3 H) , 3.51 (m， 2 H) , 2.39 (br dd, 1 H， J = 7.0, 8.6 Hz), 2.17 (ddd, 1 H, J = 4.6, 8.6， 11.5 Hz), 1.97 (ddd, 1 H， J = 6.6, 7.0, 11.5 Hz).
( S ) 一 2— [N- (6 ' —ヒ ドロキシへキシル） カルパモイル] ォキシ一 1 一 （モノメ トキシトリチル） アミノー 3— ( 1—ナフチルメ トキシ） プロパン (化合物 β )
アルゴン雰囲気下、 （ S ) — 1— （モノメ トキシトリチル） ァミノ一 3— ( 1一ナフチルメ トキシ） プロパン一 2—オール （化合物ひ） 2. 6 2 g (5. 2 0 mm o 1 ) および DM A P 1 3 0 m g (0. 2当量） をジメチルホルムァ ミ ド 5 5m lに溶解し、 1， 1 ' —カルボニルジイミダゾール 6 3 0 m g (0. 7 5当量） を加えて室温で撹拌した。 2時間後、 1 , 1 ' 一カルボニルジイミ ダゾール 6 3 0 m g (0. 7 5当量） を追加してさらに 3時間撹拌した。 この 反応液に 6—アミノー 1一へキサノール 1. 8 3 g (3当量） を加えて室温で 1 6時間撹拌した。 反応液に酢酸ェチル 3 0 0m l を加えて、 水 1 0 0m 1で 4回、 飽和食塩水 1 0 0 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウムにより乾 燥した。 溶液を減圧下濃縮後、 シリカゲルカラムクロマトグラフィー （中性シ リカゲル、 溶出溶媒：酢酸ェチルーへキサン） により精製して標記化合物 （化 合物 ]3) 3. 0 7 g (収率 9 1 %) を白色泡状物質として得た。
NMR (270 MHz, DMSO— d6) δ ： 8.00—7.85 (m, 3 H) , 7.53-7.33 (m， 8 H) , 7.28-7.12 (m， 9 H) , 6.81—6.77 (m， 2 H)， 4.95 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.95 (m, 1 H)， 4.88 (d, 1 H, J = 12.0 Hz), 4.30 (t, 1 H， J = 5.1 Hz), 3.72-3.68 (m, 5 H) , 3.36 (m, 2 H) , 2.96 (m, 2 H)， 2.38 (t, 1 H, J= 8.1 Hz), 2.18 (m， 2 H)， 1.41—1.33 (m, 4 H)， 1.26—1.22 (ra, 4 H) .
( S ) — 2— [N- (6， 一ヒ ドロキシへキシル） 力ルバモイル] ォキシ一 1 一 （モノメ トキシトリチル） ァミノ一 3— （1一ナフチルメ トキシ） プロパン 6 ' - O - (2—シァノエチルー N, N—ジイソプロピノレホスホロアミダイ ト） （化合物 Y 1 0)
ァノレゴン雰囲気下、 （S) — 2— [N— (6， ー ヒ ドロキシへキシノレ） 力ノレ バモイル] ォキシ一 1— (モノメ トキシトリチル） アミノー 3— （1一ナフチ ルメ トキシ） プロパン （化合物 i3 ) 3 2 3 m g (0. 5 0 mm o 1 ) を塩化メ チレン 1 0 m 1 に溶解し、 N， N—ジイソプロピルェチルァミン 0. 5 2 m 1 (6当量） 、 2—シァノエチルー N， N—ジイソプロピルクロ口ホスホロアミ ダイ ト 0. 1 3m l (1. 2当量） を加え、 室温で 3 0分撹拌した。 反応'液にク ロロホルム 5 0 m 1を加えて、 飽和炭酸水素ナトリゥム水溶液 20 m 1で 1回、 水 2 0 m 1で 1回、 飽和食塩水 20 m 1で 1回洗浄し、 有機層を硫酸ナトリウ ムにより乾燥した。 溶液を減圧下濃縮し、 残渣をシリカゲル力ラムクロマトグ ラフィー （中性シリカゲル、 溶出溶媒：酢酸ェチルーへキサン一 1 %トリヱチ ルァミン） により精製して標記化合物 （化合物 Y 1 0) 3 1 0 m g (収率 7 3%) を無色飴状物質として得た。
31P 腿 R (109 MHz, DMS0-d6) δ： 147.27.
(S) — 3— （ 1—ナフチルメ トキシ） 一 1—トリチルァミノプロパン一 2— オール （化合物 ） (S) 一 1ーァミノ一 3— (1—ナフチルメ トキシ） プロパン一 2—オール (化合物 f ) を出発原料とし、 塩化モノメ トキシトリチルの代りに塩化トリチ ルを用いて、 （S) — 1— (モノメ トキシトリチル） アミノー 3— (1—ナフ チルメ トキシ） プロパン _ 2—オール （化合物 α) の合成と同様に処理して、 標記化合物 （化合物 γ) を得た。
( S ) — 2 - ΓΝ- (6， 一ヒ ドロキシへキシル） 力ルバモイル] ォキシ一 3 - ( 1一ナフチルメ トキシ） 一 1一 トリチルァミノプロパン (化合物 δ )
(S) 一 3 _ (1—ナフチルメ トキシ） 一 1 _トリチルァミノプロパン一 2 一オール （化合物 ） を出発原料とし、 （S) — 2— [Ν— （6， ーヒ ドロキ シへキシル） 力ルバモイル] ォキシ一 1— (モノメ トキシトリチル） アミノー 3 - (1—ナフチルメ トキシ） プロパン （化合物 ） の合成と同様に処理して、 標記化合物 （化合物 δ) を得た。
( S ) 一 2― [Ν— （6， 一ヒ ドロキシへキシル） 力ルバモイル] ォキシ一 3 - (1一ナフチルメ トキシ） 一 1—トリチルァミノプロパン 6 ' -0- (2 —シァノエチル一 Ν, Ν—ジイソプロピルホスホロアミダイ ト） （化合物 Y 1 1 )
( S ) 一 2— [Ν— (6， 一ヒ ドロキシへキシル） カルパモイル] ォキシ一 3— ( 1—ナフチルメ トキシ） 一 1一 トリチルァミノプロパン （化合物 δ ) を 出発原料とし、 （S) — 2— [Ν- (6， 一ヒ ドロキシへキシル） 力ルバモイ ル] ォキシ一 1一 （モノメ トキシトリチル） ァミノ一 3— （1一ナフチルメ ト キシ） プロパン 6， -0- (2—シァノエチルー Ν， Ν—ジイソプロピノレホ スホロアミダイ ト） （化合物 Υ 1 0) の合成と同様に処理して、 標記化合物 (化合物 Υ 1 1) を得た。
(実施例 2) オリゴヌクレオチドプローブの合成と精製
オリゴヌクレオチドの合成は A p p l i e d B i o s y s t em s 3 94 型 DNA/RNAシンセサイザ一上で行った。
HP L Cには G i 1 s o nの装置を用い、 分析は Wa t e r s 996フォト ダイオードアレイ検出器を用いて行った。 逆相分析用カラムとして Wa t e r s ^ B o n d a s p h e r e C 1 8 3 00 A (内径 3. 9 mmX長さ 1 50 mm) 、 逆相分取用カラムとして GL S c i e n c e I n e r t s i 1 O D S - 3 C 1 8 (内径 8. 0 mmX長さ 3 0 0 mm) 、 陰イオン交換 分析用として東ソー T SK— GE L D E AE— 2 SW (内径 4. 6 mmX長 さ 2 5 0mm) を使用した。 移動相として、 逆相の場合には 0. 1M 酢酸ト リエチルアンモニゥム緩衝液 （TEAA、 p H 7. 0) 中ァセトニトリル、 陰 イオン交換の場合には 20%ァセトニトリル水中ギ酸アンモニゥムの濃度勾配 'を用いた。
オリゴヌクレオチドプロープの合成
下記の各オリゴヌクレオチドプロープを、 デォキシヌクレオシド 3 ' —ホス ホロアミダイ ト （日本テクノサービス社より購入） を原料として、 DNA自動 合成機 （モデル 3 94A ; (株） パーキンエルマ一ジャパン ' アプライ ドバイ ォシステムズ事業部製） で、 0. 2又は 1 μ m o 1スケールで合成した。
X n - S p (n= l〜8) ： 5 ' -Xn-TCTTC CAAGCAATTC C AATGAAAGCCATGACCACATGGACGACGATGATG- 35 (配列番号 1 )
C y 5 -AS-S p ： 5 ' -C y 5 -ATCGTCATCATCGTCGTC CATGTGGTCATGGCAAACATTGGAATTGCTTGGAA GAGTTTC— 3 ' (配列番号 2)
X 1— S p及び X 4— S pのオリゴヌクレオチドの 5 ' 末端に導入するアミ ノ基には N—モノメ トキシトリチルー 6—アミノへキシルホスホロァミダイ ト (グレンリサーチ社） を用いた。 X 2— S p、 X 3— S p、 X 5— S p、 X 6 — S p、 X 7— S p、 X 8— S pのァミノ基の導入は、 Y 2、 Υ 3、 Υ 5、 Υ 6、 Υ 7、 Υ 8のホスホロアミダイ ト化合物を用いて行った。 合成したオリゴ ヌクレオチドプローブ X 1— S p〜X 8— S pの構造を図 8に示す。
合成終了後、 オリゴヌクレオチドプローブは以下のように処理し精製した。 濃アンモニア水で C PG (C o n t r o l l e d P o r e G l a s s ) よ りオリゴヌクレオチドプローブを切り出し、 5 0。Cで 1 2時間加温した。 溶媒 を留去し、 脱イオン水に溶解した後、 C 1 8 (ウォーターズ社製） オープン力 ラムクロマトグラフィ一を行なつた （カラムサイズ 0. 8 x 1 8 c m : 5 - 5 0 % ァセトエトリル、 0. 1M トリェチルアンモニゥムアセテート （以下 「TEAA」 という） 水溶液の溶媒を用いた直線濃度勾配により溶出） 。 約 3 0 %濃度のァセトニトリルで溶出されたフラクションを集め、 2 m 1の 8 0 % 酢酸水溶液を加え、 6 0分間攪拌した。 酢酸を減圧下留去し、 水層を酢酸ェチ ルで洗浄した。 溶媒を留去後、 滅菌水 1 m 1 に溶解した。
X n - S p (n = l〜8) は、 逆相 H P L Cで分取し精製した。 逆相 HP L Cの条件は以下の通りであった ：
X n - S p (n= l〜6) では力ラム ： I n e r t s i l OD S— 3 (C - 1 8) カラム Φ 8. 0 x 3 00 mm (GL S c i e n c e社製） を使用。
X n - S p (n = 7、 8) ではカラム ： μ—ボンダスフィァー （C— 1 8) 力 ラム Φ 3. 9 x 1 50 mm (ウォーターズ社製） を使用。
表 1
オリ: Γ'ヌクレオチ 保持時間 Β溶液濃度 （％)
1°口-フ、、 (分） (0分 →20分）
X1-SP 9.99 10- →70%
X2-SP 8.79 20- →80%
X3-SP 11.31 20- →50%
X6-SP 7.92 30- →50%
X5-SP 6.83 30- →50%
X4-SP 13.9 30- →50%
X7-SP 10.3 20 - →60%
X8-SP 16.0 40- →60% 溶液 1
Α溶液 5 % ァセトニトリル 0. 1 M TEAA ( p H 7. 0)
B溶液 5 0 % ァセトニトリル Z 0. 1 M TEAA ( p H 7. 0)
カラム温度 ： 5 0度
溶液 2
A溶液 5 % ァセトニトリル 0. 1M TEAA (p H 7. 0)
B溶液 2 5 % ァセトニトリル / 0. 1 M TEAA (p H 7. 0)
カラム温度 ： 5 0度
(実施例 3) オリゴヌクレオチドプローブと蛍光色素との反応
C V 5— X I— AS— S pの合成
X I— AS— S p ： 5 ' -X-l -ATCGTCATCATCGTCGTCCA 2005/007666
G T TT C— 3 '
1ー 3— 3 は、 X 1 — S p と相補的なオリゴヌクレオチドであり、 ま ず上記 X 1 - S pと同様のァミノ基を導入したオリゴヌクレオチドフプローブ として合成し、 続いて逆相 H P L Cにより精製した。
カラム ： I n e r t s i 1 OD S— 3 (C— 1 8 ) カラム Φ 8. 0 x 3 0 0 mm (G L S c i e n c e社製)
X I — A S— S pの C y 5—スクシンイミジルエステルとの反応
ォリゴヌクレオチドプローブ （X I — A S— S p ) ( 1 n m o 1 ) と C y 5 —スクシンィ ミジルエステル （フアルマシア社製） （ 5 0 0 n m o l ) を 1 0 % ( v / v ) ジメチルホルムアミ ド、 0. 2 5 M 炭酸緩衝溶液に溶解し (全量 1 0 0 L) 、 遮光し 3 5 °Cで反応を行った。 反応開始 1 6時間後に、 NA P 1 0 (フアルマシア社） で脱塩した。 その後逆相 H P L Cで分取した。 カラム ： μ—ボンダスフィァー （C一 1 8 ) カラム Φ 3. 9 x 1 5 0 mm (ゥ オーターズ社製）
表 2
才リコ *ヌクレオチト' 保持時間 B溶液濃度変化 溶液
フ。 0-7* (分） (0分→20分）
X1 - AS-Sp 10.3 10→80% 1
Gy5-X1-AS-Sp 12.5 0—70% 1 溶液 1
A溶液 5 % ァセトニ卜リノレ/ 0. 1 M T EAA ( p H 7. 0 ) ；
B溶液 5 0 % ァセ ト二 トリル/ 0. 1 M T E AA ( p H 7. 0 )
カラム温度 ： 5 0度
フルォレセインイソチオシアナート '（F I T C) との反応
ォリゴヌクレオチドプローブ （X n— S p : n = l〜8 ) ( l n m o l ) と
F I T C ( 5 0 0 nm o 1 ) を 1 0 % ( v/ v) ジメチルホルムアミ ド、 0.
2 5 M 炭酸緩衝溶液に溶解し （全量 1 0 0 L) 、 遮光し 4 0 Cで反応を開 始した。 反応開始後 3 0分〜 4時間までの任意な時間に 1 5 μ Lはかりとり、
NA P 5 (フアルマシア社） で脱塩した。 その後逆相 H P L Cで分析した。 フ ルォレセィンと結合した各オリゴヌクレオチドプローブの逆相 H P L Cによる 分析条件及び結果を表 3に示した。
表 3
オリ: Γヌクレオチド 保持時間 B溶液濃度 （°/c) 溶液
フ'口-フ、' （分） (0分→20分)
X1-SP 9.1 0→100
X2-SP 10.9 0→100
X3-SP 11.2 0→100
X4-SP 8.7 0→100
X5-SP 12.3 0→100
X6-SP 12.2 0→100
X7-SP 16.6 0→70
X8-SP 15.8 o→70 溶媒 1
A溶液 5 % ァセトニトリル / 0. 1 M T E AA (p H 7. 0) ；
B溶液 5 0% ァセ トニ トリル/ 0. 1 M T E AA (p H 7. 0 ) ； カラム温度： 5 0度
結果を図 9 bに示す。
(実施例 .4) オリゴヌクレオチドプローブのスライ ドガラスへのスポットと結 合反応
スライ ドガラス （ 20枚） を 1 0 %水酸化ナトリゥム水溶液 （ 2 0 0 m L ) に 1 5分間浸した後、 水 （ 2 0 0 m Lで 2回） 、 1 %塩酸水溶液 （ 2 0 0 m L) 、 水 （20 0m Lで 2回） の順で洗浄した。 メタノール （20 0mL) に 浸し 5分間の超音波洗浄を行い、 遠心によって乾燥させ、 さらに 1 8 0度で 3 時間乾燥した。
続いて乾燥させたスライ ドガラスを 3—ァミノ トリメ トキシシラン （1 3m L) 、 水 （8mL) 、 メタノール （3 8 0mL) 中に浸し、 室温で少なく とも 5時間攪拌下させた。 その後スライ ドガラスを取り出し、 メタノール （20 0 mL) で 3回洗浄して遠心後、 1 80度で 3時間乾燥させた。 あらかじめ 1 , 4—フエ二レンジイソチオシァネート （ 1 40 0mg) を 1 0%ピリジン . ジ メチルホルムアミ ド溶液 （2 20 mL) に溶解させ、 これに上記アミノシラン ィ匕を行ったスライ ドガラスを入れ、 室温下 1 6時間攪拌させた。 スライ ドガラ スを取り出し、 ジメチルホルムアミ ド （ 200 mL) で 2回、 ジクロロメタン ( 200 mL) 、 アセトン （200m l ) 、 メタノール （200mL) の順で 洗浄し、 減圧下室温で乾燥させ、 イソチオシァネート化されたスライ ドガラス を得た。
続いてイソチオシァネート化されたスライ ドガラスをガラス容器に敷き、 そ こに 20又は 30%トリス （3—ァミノプロピル） ァミン ' メタノール溶液 (1 30 μ L) を滴下し、 密封して 3 7度で 5時間反応させた。 その後スライ ドガラスをメタノール （200mL) で 2回、 アセトン （200mL) で 1回 洗浄した。 減圧下室温で 1時間乾燥させた後、 あらかじめ 1 , 4一フエ二レン ジイソチオシァネート （1400mg) を 1 0 %ピリジン ' ジメチルホルムァ ミ ド溶液 （220 mL) に溶解させた溶液中にそのスライ ドガラスを入れ、 室 温下 1 6時間攪拌させた。 スライ ドガラスを取り出し、 ジメチルホルムアミ ド ( 200 mL) で 2回、 ジクロロメタン （200mL) 、 アセ トン （200m 1 ) 、 メタノール （200mL) の順で洗浄し、 減圧下室温で乾燥させ、 2層 目のイソチオシァネート化されたスライ ドガラスを得、 これをオリ ゴヌクレオ チドのスポッ トに供した。
50塩基オリゴヌクレオチドプローブ （Xn— S p) (50〜3 00 pmo 1 ) を滅菌水 （5 1 ) に溶解し、 スポッ ト溶液 （5 μ 1 ； 1M 炭酸緩衝液 (ρ Η 9. 0) ) と混合させ、 スポッター （S P B I〇 2000、 日立ソフト ウェアエンジニアリング株式会社製） によって 1， 4—フエ二レンジイソチォ シァネートをコーティングしたコーティング済みスライ ドガラス上にスポッ ト した。 スポッ ト後タイ トボックスにろ紙を敷き、 300mM リン酸水素ニナ トリ ゥム水溶液を湿らせ、 溶液が付かないようにスポッ 卜済みのスライ ドガラ スを入れ、 密閉後室温で放置した。 1 6時間後タイ トボックスからスライ ドガ ラスを取り出し、 スライ ドガラスを 0. 1 % T r i t o n X (200m L) で室温 5分間、 0. 02%塩酸水溶液 （200mL) で室温 2分間、 0. 1 M 塩化力リウム （200mL) で室温 1 0分間、 滅菌水 （20 OmL) で 室温 1分間洗浄した。
続いて 1M エタノールァミン水溶液 （20 OmL) にガラスを浸し、 室温 で 1時間攪拌しブロッキングを行った。 滅菌水で 3回洗浄後、 ドラフ ト内で乾 燥させて冷蔵保存した。
(実施例 5 ) オリゴヌクレオチドプローブのスライ ドガラス上への固定化の確
4 0 ^ Μ T e x a s R e d - d d AT P ( 2 z L) 、 ジメチノレスルホキ シド （ 1 0 ;u L) 、 2 5 mM 塩化コパルト溶液 （ 1 0 L) 、 反応緩衝溶液 ( x 5、 1 M 力コジル酸カリウム、 1 2 5 mM トリスー塩酸、 1 . 2 5 m g /m l B S A、 p H 6. 6 ； 2 0 μ L) 、 ターミナルトランスフエレース ( l Ai L ; 4 0 0 u n i t s ) に滅菌水を加えて全量 8 0 I とした反応溶液 を調製後、 直ちに実施例 4のスライ ドガラスに全量滴下した。 カバーガラスを 反応液上にのせ、 3 7度で放置した。 1 5分後 1 X S S C緩衝液 （0 · 1 5 M N a C l、 0. Ό 3 M クェン酸二水和物） 、 0. 1 % S D S溶液で 6 0 °C、 1 0分間、 ミリ給水洗浄、 エタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機 （スキヤ ンアレイ） で測定した （図 9 a ) 。
(実施例 6 ) 担体上でのハイブリダイゼーション
C y 5 - X l -A S - S p ( 4. 8 p m o 1 ) に 2 0 X S S C ( 0. 6 μ 1 ) 、 1 0 % S D S ( 1. 2 μ 1 ) 、 及ぴ滅菌水を加え全量 2 4 μ 1 のプロ一 ブ溶液を作製した。 そのプローブ D Ν Α溶液を静かに実施例 4で作製した D N Aチップ上にのせた後、 カバーグラスを溶液上にのせ、 4 X S S C溶液で湿ら せたキムタオルを敷いたタイ トボックス内に入れ、 4 0度又は 6 0度で 1 6時 間放置した。
ハイブリダイゼーション後、 チップを 0. 1 X S S C— 0. 1 % S D S溶液 ( 2 0 0 m L) に 5分間、 0. 0 5 x S S C— 0. 1 % S D S溶液 （2 0 0 m L) に 1 0分間、 続いて 0. 0 5 x S S C ( 2 0 0 mL) でそれぞれ室温で洗 浄した。 乾燥させた後、 チップスキャナー （S c a n A r r a y、 A P a c k a r d B i o s c i e n c e C o m p a n yの商品名） で検出した。 結果を図 1 0に示す。
ハイブリダィゼーシヨンの結果から、 X 1 — S pや X 4— S pと比べて、 本 発明のオリゴヌクレオチドプロープ用いた場合は、 より好感度に検出できるこ とが明らかとなった。
(実施例 7 ) 2 5塩基オリゴヌクレオチドの合成 X n - S p ( n = l 〜 S ) と同様の方法で X n— S p 2 5 ( n = l 、 3〜 9 ) 及ぴ X 9— S p 3 5を合成し、 精製した。
それぞれの逆相 H P L Cの条件は以下の通りであった ：
表 4
才リコ'ヌクレオチ卜" 保持時間 B溶液濃度 （Q/o) 溶液 カラム
フ '口-フ" （分） （0分—20分）
XI - Sp25 8.47 20→40% 2
X3-Sp25 10.31 25→55% 1
X4-Sp25 12.19 30→50% 2
X5-Sp25 9.47 30→70%
X6-Sp35 13.41 35→60% 1
X7-Sp25 12.88 20→60% 1
X8-Sp25 17.16 40→60% 2
X9-Sp25 12.8 15→35% 2
X9-Sp35 13.97 15→35% 2 溶液 1
A溶液 5 % ァセトニトリルノ 0. 1 M T E AA ( p H 7. 0 )
B溶液 5 0 % ァセトニトリルノ 0. 1 M T E AA ( p H A 7AAA ABBBB . 0 )
カラム温度： 5 0度
溶液 2
A溶液 5 % ァセトニトリル Z 0. 1 M T EAA ( p H 7. 0 )
B溶液 2 5 % ァセトニトリル Z 0. 1 M T E AA ( p H 7. 0 )
カラム温^： 5 0度
カラム A ： μ—ボンダスフィァー （C— 1 8 ) カラム Φ 3. 9 x 1 5 0 mm ' (ウォーターズ社製）
カラム B : I n e r t s i l OD S— 3 (C— 1 8 ) カラム Φ 8. 0 x 3 0 0 mm (G L S c i e n c e社製）
X n - S p 2 5 (n = l 、 3〜 9 ) ：
5 ' - X n - T C T T C C AA G C AA T T C C AA T GAAAG C - 3 ' (配列番号 3 )
X 9 - S p 3 5 ：
5 ' 一 AG CAAGAAAC— X n— T C TT C CAAG CAAT T C CAA T GAAAG C - 35 (配列番号 4 ) (実施例 8) 2 5塩基オリゴヌク レオチドプローブと蛍光色素との反応 フルォレセインイソチオシアナート （F I TC) との反応
ォリゴヌクレオチドプローブ （Xn— S p 2 5 ： n = l、 3〜9 ； X 9 - S p 3 5 ) ( 1 nm 0 1 ) と F I TC ( 5 0 0 n m o 1 ) を 1 0% (v/v) ジ メチルホルムアミ ド、 0. 2 5M 炭酸緩衝溶液に溶解し （全量 1 0 0 L) 、 遮光し 4 0°Cで反応を開始した。 反応開始後 3 0分〜 4時間までの任意な時間 に 1 5 /i Lはかり とり、 NAP 5 (フアルマシア社） で脱塩した。 その後逆相 HP L Cで分析した。 各オリゴヌクレオチドプローブの逆相 HP L Cによる分 析条件を下記に示した。 また F I T Cの生成率の結果を図 9 cに示した。
H P L C条件
溶媒
A溶液 5 % ァセ トニ ト リル / 0. 1M TE AA (p H 7. 0) ；
B溶液 5 0 % ァセ トニ ト リノレ/ 0. 1 M TEAA (p H 7. 0) ；
カラム温度： 5 0度
カラム ： μ—ボンダスフィァー （C— 1 8) カラム Φ 3. 9 x 1 5 0 mm (ゥ オーターズ社製）
(実施例 9 )
実施例 4と同様に表面をコーティングしたスライ ドガラスに対し、 2 5塩基 オリ ゴヌクレオチドプローブ （Xn— S p 2 5 ; n= l、 5、 9) (5 0又は 1 0 0 p m o 1 ) を滅菌水 （ 5 μ 1 ) に溶解し、 スポッ ト溶液 （ 5 1 ； 1 Μ 炭酸緩衝液 （ ρ Η 9. 0 ) ) と混合させ、 スポッター （S P B 1 02 00 0、 日立ソフトウェアエンジニアリング株式会社製） によって 1， 4—フエ二レン ジィソチオシァネートをコーティングしたコーティング済みスライ ドガラス上 にスポッ トした。 スポッ ト後タイ トボックスにろ紙を敷き、 3 0 0mM リン 酸水素ニナトリ ウム水溶液を湿らせ、 溶液が付かないようにスポット済みのス ライ ドガラスを入れ、 密閉後室温で放置した。 1 6時間後タイ トボックスから スライ ドガラスを取り出し、 スライ ドガラスを 0. 1 % T r i t o n X (2 0 0 mL) で室温 5分間、 0. 0 2 %塩酸水溶液 （20 0mL) で室温 2 分間、 0. 1 M 塩化力リ ウム （2 00mL) で室温 1 0分間、 滅菌水 （ 20 0 mL) で室温 1分間洗浄した。 続いて 1 M エタノールァミン水溶液 （2 0 0 m L) にガラスを浸し、 室温 で 1時間攪拌しブロッキングを行った。 滅菌水で 3回洗浄後、 ドラフ ト内で乾 燥させて冷蔵保存した。
(実施例 1 0 ) オリゴヌクレオチドプローブのスライ ドガラス上への固定化の 確認
4 0 μ Μ T e x a s R e d - d d AT P ( 2 μ L) 、 ジメチルスルホキ シド （ 1 0 μ L) 、 2 5 mM 塩化コバルト溶液 （ 1 0 μ L) 、 反応緩衝溶液 ( χ 5、 1 Μ 力コジル酸カリ ウム、 1 2 5 mM トリス—塩酸、 1 . 2 5 m g /m l B S A、 p H 6. 6 ； 2 0 μ L) 、 ターミナルトランスフエレース ( l i L ; 4 0 0 u n i t s ) に滅菌水を加えて全量 8 0 1 とした反応溶液 を調製後、 直ちに実施例 9のスライ ドガラスに全量滴下した。 カバーガラスを 反応液上にのせ、 3 7 °Cで放置した。 1 5分後 1 X S S C緩衝液 （0. 1 5 M N a C l、 0. 0 3 M クェン酸ニ水和物） 、 0. 1 % S D S溶液で 6 0 °C、 1 0分間、 ミ リ給水洗浄、 エタノール水溶液で洗浄し乾燥させ検出機 （スキヤ ンアレイ） で測定した （図 1 2 ) 。
(実施例 1 1 ) オリゴヌクレオチド （X 1 0— S p 2 5 ) の合成と、 緩和な条 件での脱保護実験
実施例 1で合成したアミダイ ト化合物 （Y 1 0 ) を用い、 X n— S p (n = ：!〜 8 ) と同様の方法で、 X 1 0— S p 2 5を合成し、 精製した。
X n— S p (n = 8、 1 0 )
5 ' - X n - T C T T C C AAG C AA T T C C AA T GAAAG C - 3 ' (配列番号 3 )
それぞれの逆相 H P L Cの条件は以下の通りであった ：
表 5
オリコ"ヌクレオチド' 保持時間 B溶液濃度 （％) 溶液 カラム
フ。 Vi- (分） (0分→20分）
X10-Sp25 22.8 0→100% 1 A
X8-Sp25 11.8 0→100% 1 A 溶液 1
A溶液 5 % ァセトニトリル/ 0. 1 M T EAA ( p H 7. 0 ) B溶液 5 0% ァセ トニ ト リル Z 0. 1 M TEAA ( p H 7. 0) カラム温度 ： 5 0度
カラム A ： I —ボンダスフィァー （C一 1 8) カラム Φ 3. 9 1 5 0 mm (ウォーターズ社製）
X 1 0 - S p 2 5はモノメ トキシトリチル基 （MMT r ) によってアミノ基 が保護されている。 このオリゴヌクレオチドに 1 0 %酢酸水溶液 （ I mL) を 加え、 室温で 5分間処理した。 反応液を減圧下濃縮し、 さらに水を加えて減圧 下共沸した。 共沸を 3度繰り返し行った後、 残渣を滅菌水 1 mLに溶解し、 逆 相 HP L Cによって分析した （図 1 4 b、 c ) 。 以上から、 X 1 0— S p 2 5 が緩和な酸性条件によって脱保護され、 X 8— S p 2 5と同じ構造になったこ とがわかる （図 1 4 a ) 。
本明細書中で引用した全ての刊行物、 特許及ぴ特許出願をそのまま参考とし て本明細書中にとり入れるものとする。 産業上の利用の可能性
本発明により、 DN Aチップの低価格化が可能になり、 広く遺伝子診断技術 の手段としての DN Aチップの普及に寄与することが期待される。 配列表フリーテキス ト
配列番号 1〜4 合成オリゴヌクレオチド

Claims

R 2 請 求 の 範 囲 R c R—— I
1 . 一 31般式 1 ：
B— D— A ( 1 )
(式中、 Aはオリゴヌクレオチドを表し、 Dは少なく とも 1つの芳香族基を有 する二価の有機基を表し、 Bは反応性官能基又はその保護された形態を表す） で表されるオリゴヌクレオチドプローブ。 '
2 . 芳香族基が置換又は無置換の 1〜 5環性芳香族炭化水素基である請求の範 囲第 1項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
3 . 芳香族基が置換又は無置換のフエナントレン環、 フルオレン環、 ナフタレ ン環、 アントラセン環又はピレン環を含むものである請求の範囲第 2項記載の オリ ゴヌクレオチドプローブ。
4 . Dが複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価の 炭化水素基であって、 少なく とも 1つの芳香族基を有する請求の範囲第 1項〜 第 3項のいずれか 1項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
5 . Dが主鎖に二価の芳香族基を含む請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか 1 項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
6 . Dが側鎖に芳香族基を有する請求の範囲第 1項〜第 4項のいずれか 1項記 载のオリゴヌクレオチドプローブ。
7 . Dが一般式 2で表される請求の範囲第 6項記載のオリゴヌクレオチドプロ —ブ：
R2'— 2 )
(式中、 Lは芳香族基を表し、 1 ュは水素原子又は置換基を表し、 R 2、 R 2 ' 及ぴ R 3はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換 若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す） 。
8. R2が一般式 3 ：
一 R4 - (CH2) m-R5- (CH2) n - (3)
R
で表され、 2
R 3が一般式 4 R cR—— I. •
1：
一 1
3
一 (CH2) t-R (CH2) w - （4)
4
で表され、
R4は、 直接結合又は一 （CH2) i — (〇CH2CH2) q—〇一であり、 R5及び R6は、 それぞれ独立して、 直接結合又は以下に示す基：
Figure imgf000057_0001
人 o
を表し、 H N
m、 tは、 それぞれ独立して 0〜 20の整数を表し、
n、 w、 i、 qはそれぞれ独立して 1〜20の整数を表し、
R7は水素原子又はリン酸保護基を表す、
請求の範囲第 7項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
9. Lが置換又は無置換のフエナントリル基、 フルォレニル基、 ナフチル基、 アントリル基又はピレニル基である請求の範囲第 7項又は第 8項記載のオリゴ ヌクレオチドプロープ。
10. Dが側鎖にさらなるオリゴヌクレオチドを有する、 請求の範囲第 1項〜第 6項のいずれか 1項記載のオリゴヌクレオチドプローブ。
11. Dが一般式 2 ' で表される請求の範囲第 5項記載のオリゴヌクレオチドプ ローブ
Α'
Rn一 I (2') (式中、 Lは二価の芳香族墓を表し、 は水素原子又は置換基を表し、 R 1 2、 R 1 3及ぴ R 1 4はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでい てもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、 A ' は水酸基又はォ リ ゴヌクレオチドを表す） 。
12. 請求の範囲第 1項〜第 1 1項のいずれか 1項記載のオリゴヌクレオチドプ ローブが固定化された担体。
13. 一般式 5 ：
Figure imgf000058_0001
(式中、 D ' は少なくとも 1つの芳香族基を有する二価の有機基を表し、 Bは 反応性官能基又はその保護された形態を表し、 Oは酸素原子を表し、 Pはリ ン 原子を表し、 R 8はリン酸保護基を表し、 尺9及ぴ 1。は有機基でぁり、 それ らが結合している窒素原子と一緒になって環を形成していてもよい） で表される化合物。
14. 芳香族基が置換又は無置換の 1〜 5環性芳香族炭化水素基である請求の範 囲第 1 3項記載の化合物。
15. 芳香族基が置換又は無置換のフエナントレン環、 フルオレン環、 ナフタレ ン環、 アントラセン環又はピレン環を含むものである請求の範囲第 1 4項記载 の化合物。
16. D ' が複素原子を含んでいてもよい直鎖又は分岐の置換又は無置換の二価 の炭化水素基であって、 少なくとも 1つの芳香族基を有する請求の範囲第 1 3 項〜第 1 5項のいずれか 1項記載の化合物。
17. D ' が主鎖に二価の芳香族基を含む請求の範囲第 1 3項〜第 1 6項のいず れか 1項記載の化合物。
18. D 5 が側鎖に芳香族基を有する請求の範囲第 1 3項〜第 1 6項のいずれか 1項記載の化合物。
19. D' が一般式 2で表される請求の範囲第 1 8項記載の化合物
Figure imgf000059_0001
(式中、 Lは芳香族基を表し、 ！^ェは水素原子又は置換基を表し、 R2、 R 2 及び R3はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでいてもよい置換 若しくは無置換の二価の炭化水素基を表す） 。
20. R2が一般式 3 ：
一 R4 - (CH2) m-R5- (CH2) n - (3)
で表され、
R3が一般式 4 ：
一 (CH2) t-R6- (CH2) w— (4)
で表され、
R4は、 直接結合又は一 （CH2) ;— (O CH2 CH2) q— O—であり、 R5及ぴ R6は、 それぞれ独立して、 直接結合又は以下に示す基：
H - H H ^ II mAM
— N- — O— — C— N— —— N— C— — O-P-O— 一 N N——
I H H
OR7
Figure imgf000059_0002
を表し、
m、 tは、 それぞれ独立して 0〜2 0の整数を表し、
n、 w、 i、 qはそれぞれ独立して 1〜 20の整数を表し、
R7は水素原子又はリン酸保護基を表す、
請求の範囲第 1 9項記載の化合物。
21. Lが置換又は無置換のフエナントリル基、 フルォレニル基、 ナフチル基、 アントリル基又はピレニル基である請求の範囲第 1 9項又は第 20項記載の化 合物。 '
22. D' が一般式 6で表される請求の範囲第 1 7項記載の化合物：
Figure imgf000060_0001
(式中、 Lは二価の芳香族基を表し、 尺ェは水素原子又は置換基を表し、 R12、 1 1 3及び1 1 4はそれぞれ独立して、 直接結合又は複素原子を含んでい てもよい置換若しくは無置換の二価の炭化水素基を表し、 R15は水酸基保護 基を表す） 。
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