WO2005097182A1 - 経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、これを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン及びｄｄｓ - Google Patents

経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、これを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン及びｄｄｓ Download PDF

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Dai Mizuno
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    • A61K2039/541—Mucosal route

Definitions

  • An antigen drug vehicle that enables transmucosal and transdermal administration, a method for inducing mucosal immunity using the same, a mucosal vaccine and DDS
  • the present invention relates to an antigen drug vehicle that enables transmucosal administration and transdermal administration, and more particularly, to an antigen-specific secretion characterized by using the vehicle for a desired antigen or drug.
  • the present invention relates to a method for inducing mucosal immunity to produce type I immunoglobulin A preferentially and effectively, particularly selectively, to a mucosal vaccine, to prevention and treatment of allergy, and to a drug delivery system.
  • the natural route of infection such as bacteria and viruses is mucous membranes such as the nasal cavity, trachea, and intestinal tract, and is different from the above route. It is desired to achieve infection protection by an inoculation route in accordance with the actual state of natural infection, and particularly to infection protection on the mucous membrane by administering the vaccine via the mucosa.
  • immunoglobulin G (hereinafter abbreviated as “IgG” or “IgG antibody”) is mainly produced in the blood to induce humoral immunity.
  • immunoglobulin A (hereinafter abbreviated as “IgA” or “I g A antibody”) responsible for mucosal immunity is not generated almost produced, the establishment of mucosal immunity is not expected. Need for IgA antibody Sex and efficacy are as follows: IgA antibodies protect against infection of the respiratory tract, such as the nasal cavity and trachea, by droplets and air, and protection of the mucous membrane, which is the gateway to oral intestinal infection. It is responsible for mucosal immunity and plays a very important role in clinical immunity.
  • IgG antibodies have high specificity for antigens, have a narrow spectrum of protection against infection, and are almost ineffective in protecting against infection with antigenic mutant pathogens, whereas IgA antibodies have cross-immunity, that is, Cross-neutralizing activity broadens the spectrum of infection protection and protects against infection against mutant antigens.
  • the IgG antibody titer in the blood is determined by one or more additional inoculations, so-called booster inoculations, based on the subsequent IgG antibody retention status. Need to be increased. For this reason, the cost and labor are repeatedly required, and the effect is recognized in the elderly, adults and school children who have been blessed with the opportunity for booster vaccination, but it is ineffective for younger children who tend to miss the opportunity, especially for infants under 2 years old Cases are scattered.
  • the optimal temperature for growth is 25, and in 39, a method of inoculating a cold-adapted influenza virus strain that rarely grows into the nasal cavity has been put into practical use.However, the mechanism of attenuating the cold-adapted parent strain is not clear, and there is a risk of toxicity return. Sex cannot be denied.
  • the active ingredient of the vaccine is a live virus, it has a high level of invasion into cells and is excellent in initializing immunity.However, mild influenza symptoms are sporadic, so infections with influenza are likely to be severe. Disadvantages such as being unusable for high-risk humans and elderly people are seen.
  • Immune adjuvant is a general term for substances that have regulatory activities such as strengthening or suppressing the immune response, and substances related to the administration form for the purpose of sustained release and storage of antigens in the inoculated body, and the enhancement of the immune response. Substances for the purpose of control and control. Among them, vaccines and toxoids using, for example, aluminum phosphate, myopan, etc. have already been put into practical use as adjuvants for the former, administration form. However, the practical use of adjuvants to enhance and enhance the immune response has not yet been known.
  • live bacteria-derived BCG, BCG-CWS, endotoxin, glucan, etc. synthesized MDP, levamisole, poly I-poly C, vessutin, etc., and cytokines interferon, TNF, CSF
  • MDP levamisole
  • poly I-poly C poly I-poly C
  • vessutin etc.
  • cytokines interferon, TNF, CSF
  • Patent Document 2 pertussis toxin B oligomer
  • cholera toxin (patent document 3), heat-labile enterotoxin B subunit LTB of Escherichia coli (patent document 4), starch particles (patent document 5), cholera toxin B chain protein CTB (patent document 5)
  • Patent Document 6 B subunit of verotoxin 1 (Patent Document 7), oligonucleotide (Patent Document 8), Inuichi Leukin 12 (Non-Patent Document 1), etc. It has not been put to practical use.
  • Patent Document 2 JP-A-3-135923
  • Patent Document 3 Japanese Patent Publication No. 10-500102
  • Patent Document 4 Japanese Translation of PCT International Publication No. 2001-523729
  • Patent Document 5 Japanese Patent Application Publication No. 2002-50452
  • Patent Document 6 JP-A-2003-116385
  • Patent Document 7 JP-A-2003-50452
  • Patent Document 8 PCT publication WO 00/20039 pamphlet
  • Non-patent document 1 Infection and Immunity ⁇ Vol. 71, pp. 4780-4788, 2003
  • Non-patent document 2 Journal of neonatal Nursing, Vol. 10, pp. 2--11, 2004
  • Non-patent document 3 Biology of the Neonate Volume 74 (suppl 1), pp. 9-14, 1998
  • Non-Patent Document 4 American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, Vol. 24, pp. 452-458, 2001
  • the present application has the following objects. That is, the conventional inactivated vaccines and toxoids, confers the ability to induce the production, local immunity or mucosal immunity of I g A antibody. Development of safe and effective technology for that. Conversion of conventional humoral immune vaccine to safe and effective mucosal immune vaccine. Also, prevent and treat allergies, and establish a transmucosal and transdermal drug delivery system (hereinafter abbreviated as “DDS”) that administers and transports drugs via mucous membranes and skin.
  • DDS transmucosal and transdermal drug delivery system
  • the present invention provides an antigen-drug vehicle that enables transmucosal administration and transdermal administration, and an antigen-specific secretory immunoglobulin characterized by using the vehicle for a desired antigen or drug. It is intended to provide a method for exposing mucosal immunity, a mucosal vaccine, a prophylactic and therapeutic agent for allergy, and a transmucosal / transdermal DDS, in which A is preferentially and effectively produced, particularly selectively.
  • Application and use of the antigen drug vehicle provided by the present invention will realize and spread mucosal vaccines for all kinds of infectious diseases, preventive and therapeutic agents for allergy, and transmucosal and transdermal DDS.
  • Mucosal vaccines are an immunization tool that is suited to the actual situation of natural infections, and therefore offer significantly better infection protection than conventional vaccines.
  • the nasal mucosa ig A induced by the drug substance vehicle induces inactivation of allergens there and enables desensitization.
  • the application of the DDS to a wide variety of drugs enhances and promotes the preventive and therapeutic effects of transmucosal and transdermal drug administration. As a result, this invention will greatly improve the health, health and hygiene of all humankind, and will be the long-awaited gospel for medical, health and health workers in the world.
  • FIG. 1 shows influenza virus infection in the nasal cavity (a), lunar cyst (b), and nasal cavity (c) and subalveolar alveoli (d) after administration of various nasal influenza vaccines. Suppression ! effect. * Indicates the level of significance (p ⁇ 0.01) between the administration group and the vaccine alone (no AD vehicle or adjuvant) by t-test (Example 1)
  • Figure 2 shows nasal administration (a), subcutaneous injection (b) Anti-influenza antibody-producing IgA and IgG levels in nasal washes from influenza vaccine White bars indicate IgA levels, black bars indicate IgG levels (Example 2)
  • FIG. 1 shows influenza virus infection in the nasal cavity (a), lunar cyst (b), and nasal cavity (c) and subalveolar alveoli (d) after administration of various nasal influenza vaccines. Suppression ! effect. * Indicates the level of significance (p ⁇ 0.01) between the administration group and the vaccine alone (no AD vehicle or adjuvant) by t-test (Example 1)
  • FIG. 3 shows the effect of the adjuvant on the production of anti-influenza-specific antibodies IgA and IgG in lung washings by nasal (a) and subcutaneous injection (b) influenza vaccine administration.
  • FIG. 4 shows the effects of PSF-2 and CTB on the production of anti-influenza-specific antibodies in blood by nasal (a) and subcutaneous injection (b) influenza vaccine administration.
  • FIG. 5 shows the effect of PSF-2 and CTB on the secretion level of TGF- ⁇ in the nasal cavity (a) and alveolar (b) mucosa by administration of a nasal influenza vaccine.
  • FIG. 6 shows the effect of the adjuvant on the production of anti-influenza-specific antibodies IgA and IgG in lung washings by nasal (a) and subcutaneous injection (b) influenza vaccine administration.
  • FIG. 6 shows the effects of PSF-2 and CTB on the production of anti-influenza-specific antibodies in the nasal cavity (a), alveoli (b) and in serum (c) by the nasal influenza vaccine.
  • Figure 7 shows the effect of SPF-2 and CTB on various cytokins secreted from nasal, lung and spleen lymphocytes by nasal influenza vaccine administration.
  • Example 8 shows the effect of PSF-3 on the production of anti-influenza-specific antibodies in the nasal cavity (a), alveoli (b) and blood (c) by the nasal influenza vaccine.
  • Example 9 BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • Antigen drug vehicle The vehicle (Antigen and Drug Vehicle, hereinafter abbreviated as “AD vehicle” or “ADV”) is a lipid designed to enable transmucosal and transdermal administration of antigens and drugs. It is a complex of a protein and a protein.
  • the AD vehicle consists of the following (a) to (c).
  • Pulmonary surfactant protein B or a fragment thereof (not only natural fragments obtained by proteolytic enzymes, but also artificial fragments obtained by genetic engineering or peptide synthesis; Including substituted and / or deleted mutant fragments, etc.).
  • pulmonary surfactant protein C or a fragment thereof (not only a natural fragment obtained by proteolytic enzymes, but also an artificial fragment obtained by genetic engineering or peptide synthesis, and substitution or substitution of one or more amino acids constituting such a fragment) And / or missing mutant fragments).
  • Lipids such as phospholipids and fatty acids. Its shape is a membrane (spike-like or rolling-like lipid membrane) that has a spike-like or spike-like polypeptide chain on its surface, and the ends of the hydrophobic regions of a plurality of polypeptide chains are inserted into the lipid membrane and spiked. It is different from conventional lipid vesicles (ribosomes).
  • the vehicle is a vehicle that enables transmucosal and transdermal administration of antigens and drugs.
  • the components of the AD vehicle, the proteins, polypeptides or peptides and lipids used in the preparation and production of the vehicle, ie, lung surfactant proteins B and C, fragments thereof, and at least one of these fragment peptides The details of amino acid-substituted and / or deleted mutant fragments, and lipids such as phospholipids and fatty acids will be described later.
  • Pulmonary surfactant Pulmonary surfactant has been put into practical use for the treatment of respiratory distress syndrome (RDS) since the mid-1990s, and a variety of pharmaceutical products derived from humans, humans, busines, etc.
  • Non-Patent Document 2 Synthetic peptide preparations containing an active domain related to RDS treatment are also commercially available, and the design development and synthesis of SP-B and SP-C analogs are also in progress.
  • the composition and composition of the pulmonary surfactant is as follows: about 90% lipids (phosphatichosercholine 67.3%, phosphatidylglycerol 19.3%, phosphatidylserine 3.2%, other free fatty acids, etc.) and about 10% protein (surfactant) (Hereinafter, abbreviated as “SP-A”, “SP-B”, “SP-C”, and “SP-D”).
  • the molecular weights are 28-36 kDa for SP-A ifi, 15 kDa for B, 3.5 kDa for C, and 43 kDa for D.
  • SP-A and D are hydrophilic (water-soluble) and lectin-like (membrane associated).
  • SP-B and C are hydrophobic (lipid-soluble) and lipid-binding, have the ability to fit into phospholipid membranes, and have a surfactant effect.
  • Pulmonary surfactant protein genes derived from humans, pests, bushus, etc. are known, for example, the human SP-B gene in GenBank / NCBI (htt // ww.ncbi.nlm.nih.gov.
  • SEQ ID NO: 2 Human SP-B full-length amino acid sequence decoded from SEQ ID NO: 1;
  • SEQ ID NO: 3 CDR base sequence of human SP-C gene DNA;
  • SEQ ID NO: 4 Human SP-C full-length amino acid sequence decoded from SEQ ID NO: 3;
  • SEQ ID NO: 5 CDR base sequence of SP-C1 occupying on human SP-C gene DNA; and
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 5 Human SP-C1 full-length amino acid sequence decoded from.
  • the preparation and production of the antigen drug vehicle according to the present invention is based on mammals such as humans, sea lions, bush, zilla, iruka, etc., and fish such as tuna, sharks, rays and possibly.
  • mammals such as humans, sea lions, bush, zilla, iruka, etc.
  • fish such as tuna, sharks, rays and peer.
  • the conventional combination of SP-B and SP-C and the combination of SP-B and SP-C1 can be used.
  • a human-derived protein consisting of the full-length amino acid sequence described in SEQ ID NOs: 2, 4 and 6, a combination of SP-B and SP-C, and a combination of SP-B and SP-C1 , Can be used respectively.
  • Mutated fragments and the like can also be used.
  • Mutants or synthetic analogs in which at least one amino acid has been substituted and / or deleted can be used.
  • amino acid numbers are indicated by Met occupying the N-terminus of each sequence as the first amino acid, and in the order of the C-terminal direction (from left to right of the described sequence) in the order ⁇ : .
  • SEQ ID NO: 7 amino acid sequence of positions 214 to 225 of SEQ ID NO: 2 (SP-B fragment);
  • SEQ ID NO: 8 amino acid sequence of positions 257 to 266 of SEQ ID NO: 2 (fragment of SP-B);
  • SEQ ID NO: 9 Amino acid sequence of Nos. 29 to 58 of SEQ ID NOS: 4 and 6 (SP-C fragment)
  • SEQ ID NO: 10 Amino acid sequence of Nos.
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 102 to 110 amino acid sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 12: SEQ ID NO: 119 to 127 amino acid sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 13: SEQ ID NO: SEQ ID NO: SEQ ID NO: 14 amino acid sequence at positions 136 to 142 (SP-B fragment); SEQ ID NO: 14 amino acid sequence at positions 171 to 185 of SEQ ID NO: 2 (SP-B fragment); SEQ ID NO: 15 amino acid sequence at positions 201 to 279 of SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 16 amino acid sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 2 amino acids 253 to 278 (SP-B fragment); SEQ ID NO: 17 SEQ ID NO: 300 to 307 amino acids Sequence (SP-B fragment); SEQ ID NO: 18 Amino acid sequence at positions 317 to 330 of SEQ ID NO: 2 (SP-B fragment); SEQ ID NO: 19 Am
  • SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 14: Amino acid sequence of Nos. 24-58 of SEQ ID NO: 4 and 6 (SP-C fragment)
  • SEQ ID NO: 21 Amino acid sequence of Nos. 24-58 of SEQ ID NO: 4 and 6 (SP-C fragment)
  • an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 7, 8, 10-20 And at least L species selected from the group consisting of SP-B and fragments thereof, and SP-C (and SP-C1) and fragments thereof comprising the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 4, 6, 9 and 21. At least one selected from them can be used in combination.
  • a phospholipid contained in the lung surfactant for example, phosphatidylcholine (lecithin), dipalmitoylphosphatidylcholine, phosphatidylserine and the like.
  • dipalmitoyl glycerol phosphocholine diasylglycerol phosphoglycerol, phosphatidyl reglycerol (cardio lipin), dilauroyl phosphatidyl glycerol, dimyristoyl phosphatidyl glycerol, dipalmitoyl phosphatidyl glycerol, distear yl phosphatidyl glycerol, And phosphatidylethanolamine, phosphatidic acid, sphingomyelin, and the like.
  • fatty acid lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, palmitooleic acid, oleic acid and the like can be used.
  • lipids derived from aquatic gait such as whales, tuna, and dolphins with active lung inflation can be used.
  • a commercially available pulmonary surfactant containing hydrophobic or lipophilic SP-B and SP-C and a phospholipid has been approved by relevant authorities for its safety and efficacy as a therapeutic agent for RDS
  • trade name Surfacten, Infasurf, Curosrf, Humansurf, Exosurf> Alveofact, etc. can be used as AD weekly.
  • commercially available preparations containing SP-A and SP-D, which are hydrophilic or water-soluble, after SP-B and SP-C may be, for example, 1-butanol to dissolve these water-soluble proteins. Extract SP-A and SP-D, remove them to below the detection limit, and use them.
  • the nasal mucosa can be inflamed without causing inflammation.
  • the activated antigen presenting cells, with virus antigen is efficiently incorporated into the cell, without causing induction of IgG production in the mucosal and blood, effective and antiviral I g a production mucosa Preferentially, especially, selectively guided It was.
  • influenza virus split antigen which has been conventionally used as a safe inactivated vaccine antigen, includes a complex of a combination of SP-B and SP-C with a phospholipid, or a lipid-soluble region of such a complex.
  • a complex of a synthetic peptide of both SP-B and SP-C fragments containing the active region (AD vehicle) with a lipid membrane (AD vehicle) while maintaining the high safety of the split antigen, We have found that split antigen alone achieves selective induction of secretory IgA production with sufficiently enhanced and compensated activation of antigen-presenting cells, which is inferior to live vaccines.
  • lung surfactant adsorbs tryptic zegurala, an airway HA processing protease that reduces the influenza virus membrane protein hemadaltinin (HA) to a limited extent and expresses the membrane fusion activity and infectivity of the virus. Inactivation revealed, blocking virus propagation did.
  • pulmonary surfactant selectively activates mucosal antigen-presenting cells to activate immune function against viral antigens, and induces secretory IgA, but also induces secretory IgA.
  • SP-B and SP-C are important together with lipid components as active ingredients for enhancing mucosal immunity in lung surfactants, and to identify the effective areas of these protein components and the effectiveness of enhancing mucosal immunity Verified.
  • the above-mentioned pulmonary surfactant is a physiologically active substance in the living body, and (a) has a property of adsorbing a specific biological substance (Kido H., et al. FEBS Lett. Pulmonary surfactant is a potetitial endogenous inhibitor). of proteolytic activation of Sendai virus and influenza Avirus, 322 (29), 115-119, 1992), (b) secreted from alveolar H-type cells and Clara cells and selectively taken up by macrophages. Metabolism (Akira Fuwabe, J. Jpn. Med. Soc. Biol. Interface; Surfactant metabolism disorders in alveolar proteinosis, 33, 10-13, 2002), and (c) related cells For example, they focused on antigen-presenting cells (dendritic cells) and metabolized them.
  • the active ingredient region of B or the mucosal immune-inducing domain was identified as a peptide consisting of the following amino acid sequence:
  • SP-B 214-225 Leu lie Lys Arg lie Gin Ala Met lie Pro L s Gly (SEQ ID NO: 7);
  • SP-B 257-266 Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu (SEQ ID NO: 8).
  • SP-C 29-58 Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu He Val Val Val Val Val Leu lie Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu (distribution number 9).
  • a component of the pulmonary surfactant induces an increase in the expression of MHC Class II, CD40, and B7-2 in antigen-presenting dendritic cells, causing T-lymphocytes.
  • TGF- ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ induces local force in the mucosa to promote class switching to IgA-producing B-lymphocytes. .
  • the first purpose is to establish a mucosal immunization method.
  • AD Vehicle By providing and utilizing the AD Vehicle, we will achieve 31-selective induction of the production of antigen-specific IgA, which is an effective substance for mucosal immunity, as well as safely and effectively (with no side effects) mucosal immunity induction and methods.
  • the second objective is to improve the quality of AD vehicles in terms of safety, efficacy and homogeneity by using synthetic peptides.
  • Synthetic peptide of SP-B mucosal immunity inducing activity domain comprising the amino acid sequences of SP-B 214-225 and SP-B 257-266 described above
  • SP-C mucosal immunity inducing domain A synthetic peptide (consisting of the amino acid sequence of SP-C 29-58), a synthetic analog thereof, a long-chain synthetic peptide containing such an amino acid sequence as a part thereof, and a lung surfactant lipid.
  • a complex (AD vehicle) prepared with the component to improve the quality of the AD vehicle.
  • the third purpose is to replace conventional subcutaneous vaccination of vaccine with transmucosal administration.
  • AD vehicle as inactivated vaccine for respiratory tract infection virus, for example, inactivated vaccine for influenza, SARS, measles, rubella, mumbus, etc., and also for inactivated vaccine for intestinal sensation ⁇ virus, for example, inactivated vaccine for rota, polio, etc. And these skins Convert the inoculated vaccine to a mucosal vaccine.
  • the fourth objective is to use AD vehicles in inactivated vaccines against viral infections via mucous membranes other than the respiratory tract and intestinal tract, such as AIDS, inactivated vaccines such as hepatitis I and hepatitis C. It is to provide.
  • the fifth object is to provide a method that can use an AD vehicle for DNA vaccine, live vaccine, prevention and treatment of allergy, and the like.
  • a sixth object is to provide a method of using an AD vehicle in percutaneous inoculation (application, application, etc.) as an immune route capable of inducing IgA other than mucosa.
  • the seventh objective is to open the way for the use and application of AD Vik not only in DDS and pharmaceuticals but also in agriculture and fisheries.
  • the AD vehicle proposed by the present invention differs in performance and action from the adjuvant conventionally used in immunology as follows. That is, conventional adjuvants are usually inoculated subcutaneously or intramuscularly, and cause a local inflammatory reaction, attract antigen-presenting cells ⁇ B- and T-lymphocytes, and use a foreign substance that exerts the ability as an active ingredient. In addition, mineral oils and metal salts that induce sustained release and retention of antigens are used in combination to maintain a prolonged inflammatory response, and are known as conventional mucosal vaccines' adjuvants.
  • these substances are foreign substances such as Escherichia coli heat labile toxin and cholera toxin, which may cause harmful effects and side effects, whereas the AD vehicle according to the present invention has a local inflammatory reaction.
  • the active ingredient in pulmonary surfactant or its active domain is limited, and Use a low molecular base peptide comprising, thereby realizing an effective mucosal vaccine. Therefore, a very safe, and is non-prone manner. 5.
  • the following (1) to (5) are provided, respectively.
  • the AD vehicle comprises the following groups I (pulmonary surfactant protein B and natural and synthetic polypeptides derived from or derived from protein B), group I (pulmonary surfactant protein C and At least one substance selected from the group consisting of natural and synthetic polypeptides derived from or caused by the protein C) and the group m (lipids such as phospholipids and fatty acids).
  • groups I pulmonary surfactant protein B and natural and synthetic polypeptides derived from or derived from protein B
  • group I pulmonary surfactant protein C and At least one substance selected from the group consisting of natural and synthetic polypeptides derived from or caused by the protein C
  • the group m lipids such as phospholipids and fatty acids
  • Pulmonary surfactant protein B and a polypeptide consisting of the following amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 (The amino acid numbers are as follows: N-terminal Met is the first amino acid; Nos. 1-381 (SEQ ID NO: 2), 214-225 (SEQ ID NO: 7), 257-266 (SEQ ID NO: 8), Nos. 1-20 (SEQ ID NO: 10) Nos. 102-110 (SEQ ID NO: 11), Nos. 119-127 (SEQ ID NO: 12), Nos. 136-142 (SEQ ID NO: 13), Nos. 171-185 (SEQ ID NO: 14), No. 201-279 (SEQ ID NO: 15), No. 253-278 (SEQ ID NO: 16), No.
  • the m group is a sheet-like or roll-like lipid membrane, and a plurality of chains of the I group and the ⁇ group are each in a spike shape in a state where a hydrophobic region end is inserted into the lipid membrane. Being planted is one preferred aspect of its configuration and shape.
  • a mucosal vaccine obtained by coexisting, contacting, capturing or adsorbing an antigen to the antigen drug vehicle of (1), and inducing mucosal immunity.
  • An agent for preventing and treating allergy which is obtained by coexisting, contacting, trapping, or adsorbing an allergen in the antigen drug vehicle of (1), and inducing mucosal immunity. Its effect is, for example, inactivation or desensitization of allergens such as cedar pollen and mites inhaled by the nasal cavity or nasopharyngeal mucosa.
  • Transmucosal and / or transdermal DDS obtained by coexisting, contacting, trapping or adsorbing an effective amount of a drug in the antigen drug vehicle of (1).
  • the method is characterized in that a mucosal vaccine obtained by coexisting, contacting, capturing or adsorbing an antigen with the antigen drug vehicle of (1) above is administered to the nose or upper respiratory tract.
  • a method for inducing mucosal immunity In the above inventions (2), (3) and (5), the induction of mucosal immunity is promoted by the production of IgA antibodies locally in the mucosa, and the TGF- ⁇ and Th2 type This is a preferred mode that is characterized by promoting the production of in.
  • Group I pulmonary surfactant protein B and a group of natural and synthetic polypeptides derived from or derived from protein B
  • Group I pulmonary surfactant protein C and natural and synthetic polypeptides derived or derived from protein C
  • lipids in Group I for example, a mixture of 71 mg of phosphatidylcholine, 21 mg of phosphatidylglycerol, and 4 mg of phosphatidylserine can be employed (total amount of lipids is 96 mg).
  • SP-A and D If a commercially available pulmonary surfactant preparation for the treatment of RDS is used, which has been confirmed to contain SP-B and C, the suspension prepared according to the instructions for use is used as is in the antigen drug vehicle solution. Can be used as. (3) Preparation of mucosal vaccine
  • the antigen drug vehicle solution to the vaccine stock solution and mix so that the dry weight ratio A / V of the antigen drug vehicle amount (V) to the antigen amount (A) in the vaccine is about 0.2 to about 5.
  • the weight ratio A / V l is adopted for 1,000 ml of a vaccine stock solution with an antigen content of 1 pg / ml
  • the antigen drug vehicle (100 mg / 5 ml) solution prepared in (2) above will be used.
  • the addition volume is 50 ⁇ .
  • a homogenizer, a mixer, a shaker, a stirrer, or the like can be used.
  • the pulmonary surfactant used as the "antigen drug vehicle (AD vehicle)" was obtained from the bovine lung using the method of Howgood et al. (Howgood S, et al.,: Effects of a surfactant-associated protein and calcium ions on the structure and surface activity). of lung surfactant lipids. Biochemistry 24, 184-190, 1985) or a sample (PSF-1) prepared by biochemistry 24, or, in many cases, extract this sample with 1-butanol to extract the water-soluble protein component SP-A. , SP-D removed or reduced to below detection limit (Haagsman HP, et al., The major lung surfactant protein, SP28-36, is a calcium-dependent, carbohydrate binding protein, J. Biol. Chem.
  • PSF-2 contains at least 40% by weight of phospholipids composed mainly of phosphatidylcholine dipalmitoyl phosphatidylcholine, and 10-20% of phosphatidylglycerol and 2-5% of phosphatidylserine, similar to lung surfactant lipids.
  • a preparation containing 0 to 3.5% of either or both of the synthetic peptides in the effective region of the soluble protein SP-B and SP-C is used.
  • PSF-5 was also studied.
  • a known product corresponding to PSF-1, PSF-2 for example, trade name Surfacten, Infasurf, cue mouth safety
  • mice and 10-week-old Hartley guinea pigs were purchased from Nippon S.L.C., Inc. (Shizuoka, Japan) and used. All animal experiments were conducted in the infected animal zoo (P2 level) at the Experimental Animal Center, Tokushima University School of Medicine, and were conducted according to the guidelines of the Animal Experiment Committee of the University of Tokushima School of Medicine.
  • Influenza virus A Aichi / 68/2 / H3N2 strain-inoculated suspension from embryonated chicken eggs (1 x 108 Plaque forming unit (PFU)) (Provided by Prof. Masanobu Ouchi, Department of Microbiology, Kawasaki Medical University) The following procedure was used to create a split influenza vaccine.
  • ⁇ -Propiolactone (Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Japan 'Osaka) was used for a virus suspension dialyzed overnight against 0.004M PBS (Yukara Bio Inc. Japan ⁇ Tokyo-Shiga) to 0.05% of the volume and a final concentration of 8 ⁇ . And incubated for 18 hours in an ice bath.
  • ⁇ -propiolactone was hydrolyzed by incubating at 37 ° C for 1.5 hours. After that, the final concentration becomes 0.1%. Then, Tween20 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added, and then an equivalent amount of Tween and Jechiru-Tele (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) were added. The aqueous layer was collected by centrifuging this solution at 2000 rpm for 5 minutes. Furthermore, getyl ether was removed from the water layer using the Automatic Environmental SpeedVac System (SAVANT INSTRUMENTS, INC., New York, USA). This was filtered through a Millex 0.45 ⁇ filter (MILLIPORE Mass., USA) and used as an inactivated split influenza vaccine.
  • SAVANT INSTRUMENTS Automatic Environmental SpeedVac System
  • the split-type influenza vaccine produced by the above-mentioned production method was used as an “AD vehicle” for the lung surfactant (PSF-1), 1-butanol-extracted lung surfactant (PSF-2), and SP-B.
  • SP-C effective region synthetic peptide and pulmonary surfactant lipids PSF-3,4,5
  • known pulmonary surfactant products or cholera toxin B subunit (CTB, SIGMA America, (Missouri) was used as a mixture.
  • Pulmonary surfactant or the above equivalent was suspended in PBS at the concentration required for vaccine administration before use, and sonicated at room temperature for 5 minutes to obtain a uniform suspension.
  • the above-prepared preparation was diluted with PBS to a solution equivalent to 0.1 pg / l ⁇ ⁇ dry weight of Phosphate buffered saline (PBS), and this was diluted 1 ⁇ per animal per side.
  • PBS Phosphate buffered saline
  • the split-type influenza vaccine was diluted with PBS to a 0.1 g / 50 ⁇ 50 solution, and administered subcutaneously to the neck of the mouse.
  • the control group contains the vaccine solution The same amount of PBS was administered.
  • mice The vaccinated mice were subjected to laparotomy and thoracotomy under ventalpital anesthesia, the trachea was incised, 3 Fr with an Atom vein catheter node (Atom Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan) was inserted into the lungs, and 1 ml of saline was injected. This liquid was recovered. This was repeated three times, and a solution collected, ff 13 ml, was used as an alveolar lavage solution. After collecting the lung lavage fluid, an atom venous catheter was inserted into the nasal cavity from the incised trachea, 1 ml of physiological saline was injected, and the fluid coming out of the nose was collected. This solution was used as a nasal washing solution. Further, blood was collected from the heart, and serum was prepared by centrifugation at 5,000 rpm for 10 minutes.
  • Atom vein catheter node Atom Medical Co., Ltd., Tokyo, Japan
  • the protein content of nasal washes, lung washes, and serum was measured using the BCA Protein Assay Reagent Kit (PIERCE, Illinois, USA) (Smith PK. Et al.,: Measurement of protein using bicmchonmic acid. Anal. Biochem., 150, 76-85, 1985).
  • the absorbance at 562 nm was measured using SPECTRAmax PLUS 384 (Molecular Devices Corporation, USA, California).
  • the same influenza virus strain, A Aichi / 68/2 / H3N2 strain, used for the preparation of the split influenza vaccine was used for infection.
  • Two weeks after the completion of the second immunization the mice were anesthetized with a ether, and the suspension from the influenza virus-developed chicken eggs was instilled in both nasal cavities with a total of 7 ⁇ 10 4 PFU / 3 ⁇ .
  • Three days after infection, nasal cavity and alveolar lavage fluid were prepared as described above and used for evaluation of virus infectivity. Evaluation of virus infectivity was performed using ⁇ 549 cells (provided by Dr. Masanobu Ouchi, Kawasaki Medical University, Department of Microbiology).
  • ⁇ 549 cells were cultured under the conditions of 5% fetal calf serum / DMEM (Gibco Ameri New York). ⁇ 549 cells ⁇ The cells were subcultured on a culture plate (Gleiner-Stuttgart, Germany) so that they became 100% confluent. After 24 hours, the medium was replaced with a serum-free medium. Nasal-alveolar lavage fluid of influenza infected mice each ⁇ E Le dropwise by 500 ⁇ , and culture was performed at 16 hours 37 12 hours C0 2 incubator scratch. A 1% PBS solution of red blood cells collected from a guinea pig was added thereto, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes.
  • the cells were washed with 1 mM Ca2 ⁇ / Mg2 ⁇ PBS, and the cells in which erythrocytes were agglutinated were counted as virus-infected cells, and the virus infectivity was evaluated (Tashiro M., Homma ⁇ : Pne motropism of Sendai virus in relation to protease-mediated activation in mouse lungs. Infect. Immun. 39, 879-888, 1983).
  • IgG fraction was purified from the lung lavage of the influenza vaccine-administered and virus-infected mice by affinity chromatography using a recombinant E. coli-expressed ProteinG Sepharose 4B column (ZYMED LABORTORIES INC, San Francisco, USA).
  • Anti-mouse IgA goat IgG (SIGMA) was bound to a BrCN-activated Sepharose 4B column (Amersham Bioscience America's New Zealand), and the IgA fraction was purified by affinity chromatography using the ProteinG flow-through fraction. did.
  • the inactivated split influenza vaccine used for immunization was bound to a BrCN-activated Sepharose column, and the antigen was used from the IgA and IgG fractions.
  • Anti-influenza-specific IgA and IgG were respectively purified by affinity chromatography.
  • the coupling of the split-type influenza protein as a ligand to the column was performed using 0.1 M NaHCO 3 /0.5 M NaCl buffer (pH 8.5), and the free ligand was bound to 0.1 M acetic acid / After removal using a 0.5 M NaCl buffer (pH 8.5), neutralization was performed with PBS (pH 7.5).
  • Anti-influenza IgA and IgG contents in the nasal cavity, alveolar lavage fluid and serum were quantified by ELISA assay.
  • the ELISA assay was performed according to the method of Mouse ELISA quantitation kit of BETHYL LABORATORIES (Ameriki, Texas).
  • 96-well Nunc Immunoplate (Nalgen Nunc International, New York) Add 1 pg of vaccine to each well and 100 ⁇ l of serum serum albumin (BSA, SIGMA America 'Missouri) 1 pg / ml PBS solution to each well, and in 4 The reaction was carried out.
  • BSA serum serum albumin
  • the vaccine solution was rinsed three times with a washing solution (50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0) to remove the vaccine solution.
  • a washing solution 50 mM Tris, 0.14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0
  • 200 ⁇ l of 50 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.15 M NaCL 1% BSA was added to each well, and a blocking reaction was performed at room temperature for 1 hour.
  • nasal washing solution and lung washing solution diluted appropriately with sample binding buffer (50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 8.0)
  • sample binding buffer 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 8.0
  • 100 ⁇ of serum was added and reacted at room temperature for 2 hours.
  • dendritic cells were prepared from the nose, lung, and spleen collected from mice in each group (4 mice per group) using the Gonzalez-Juarrero M method (Gonzalez- Juarrero M, Orme IM .: Characterization of murine lung dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis.Infect Immun 2001; 69: 1 127-33) Preparation was performed. The preparation of dendritic cells from the nose and its collagenase treatment
  • the amount of TGF- ⁇ - secreted from the nasal cavity and alveolar lavage fluid was quantified by ELISA assay.
  • the ELISA assay was performed using a TGF- ⁇ II ELISA kit (BIOSOURCE INTERNATIONAL, California) according to the instructions attached to the kit.
  • Cytokines (interleukin 4: IL-4, I-5, IL-6, IL-13) secreted from the nasal cavity, alveolar lavage fluid, and spleen lymphocytes, respectively. Quantification was performed using an ELISA kit.
  • the PSF-2) 0.1] ig or CTB 0.1 was administered together with the PBS solution as a PBS solution to BALB / c mice in both nose at 1 ⁇ .
  • As a subcutaneous injection vaccine the same amount of vaccine as the nasal vaccine alone, or PSF-2 as an AD vehicle, or CTB as an adjuvant was added, and a 50 ⁇ PBS solution was administered subcutaneously to the neck of a BALB / c mouse neck.
  • a second immunization was performed in the same manner as the first immunization.
  • Anti-influenza specific IgA is selectively produced in the nasal cavity and increased in the lavage fluid by nasally administered split-type influenza vaccine, but the amount of this specific IgA is comparable to that of PSF-2 and CTB. Increased to clear.
  • split injection flu vaccine alone Increase specific I g A quantity of nasal in the washing solution by was observed, but the degree was lower than that in nasal administration.
  • the immunopotentiating effect of PSF-2 and CTB was not observed in both IgA and IgG production.
  • using PSF-1 and PSF-3 instead of PSF-2 has achieved the same effect as PSF-2. Similar phenomena were observed for PSF-4 and -5, but the effect has diminished.
  • Intranasal administration (a), subcutaneous injection (b) Effect of PSF-2 and CTB on the production of anti-influenza-specific antibodies (IgA, IgG) in lung lavage fluid by influenza vaccine 0.1 split-influenza vaccine as nasal vaccine was administered alone or together with 0.1 g of PSF-2 as an AD vehicle or CTB 0.1 as an adjuvant, and 1 ⁇ l of the PBS solution was administered to both nostrils of BALB / c mice for a total of 2 ⁇ l.
  • the subcutaneous vaccine the same amount of vaccine as the nasal vaccine, PSF-2 and CTB were administered subcutaneously to the neck of BALB / c mouse as a 50 ⁇ PBS solution.
  • Intranasal administration (a), subcutaneous injection (b> Effect of PSF-2 and CTB on the production of anti-influenza-specific antibodies (IgA, IgG) in blood by influenza vaccine 0.1 split flu vaccine as nasal vaccine was administered alone or with 0.1 pg of PSF-2 as an AD vehicle, or 0.1 ig of CTB as an adjuvant, and 1 ⁇ ⁇ of BALB / c mice was administered to both nostrils in PBS solution for a total of 2 ⁇ as a subcutaneous injection vaccine.
  • IgA, IgG anti-influenza-specific antibodies
  • Nasal administration subcutaneous injection (b) nasal influenza vaccine, lung, alone Supuritsuto influenza vaccine 0. 1 mu [delta] as the influence nasal vaccine PSF-2, CTB to the antigen presenting ability of dendritic cells of the spleen Or, together with 0.1 pg of PSF-2 and CTB 0,1, a total of 2 ⁇ was administered to both BALB / c mice as a 1 ⁇ PBS solution.
  • Split-type influenza vaccine, PSF-2, and CTB in the same amounts as the nasal vaccine were administered subcutaneously to the neck of BALB / c mice as 50 ⁇ PBS solutions as subcutaneous vaccines.
  • mice Two days later, the mice are sacrificed, dendritic cells are prepared from the nose, lung, and spleen, and the cell surface expression levels of MHC class II, CD40, B7-1 (CD80), and B7-2 (CD80) are measured by flow cytometry. did.
  • Nasal influenza vaccine administered nasal cavity a alveoli (b> mucosal TGF-pl)
  • TGF- ⁇ concentration at which the producing cells are localized is important (Stavnezer, J .: Regulation of antibody production and class switching by TGF-beta. J. Immunol. 155 (4), 1647-1651, 1995). Therefore, the TGF- ⁇ concentration in the nasal cavity (a) and the alveoli (b) under the above conditions was examined.
  • TGF- ⁇ concentrations in the nasal cavity and alveolar mucosa were significantly increased in the presence of SPF-2 and CTB in both cases of administration of the split influenza vaccine.
  • the degree of increase was not significantly different between SPF-2 and CTB.
  • FIGS. 5 (a) and (b) In vivo derived SPF-2 was found to increase the concentration of TGF- ⁇ , which promotes the promotion of IgA-secreting B cell differentiation, as much as the exogenous toxin CTB.
  • PSF-1 and PSF-3 instead of PSF-2. Similar phenomena were observed for PSF-4 and -5, but the effect was diminished.
  • nasal and alveolar lavage fluids showed a marked increase in influenza antibody IgA (blue circles) in the blood when PSF-2 and vaccine were administered.
  • IgG red circle
  • Non-Patent Document 4 J. Freek van Iwaarden et al. (Non-Patent Document 4) reported that when macrophages are artificially removed from the lung, SP-B and lipids induce a systemic immune response but do not remove macrophages. Reported that in some cases immunity could not be induced. In addition, in the above literature, the amount of SP-B + lipid required to induce a predecessor immune response is 250-300 ⁇ , which is far from the PSF-2 dose (0.2 “ ⁇ ) of the above example. No mention is made of local mucosal immunity.
  • TGF- ⁇ and site force-in IL-4, IL-5, I-6, IL-13
  • Figs. 7 (a) to 7 (e) significant increase in secretion of TGF- ⁇ IL-5 and IL-6 was observed in mucosal localization (nasal and lung) after vaccination with PSF-2. However, there was no significant increase in IL-4 and IL-13. On the other hand, no significant increase in any cytokine was observed in the spleen.
  • nasal lavage fluid and alveolar lavage fluid significantly increased anti-influenza antibody IgA (blue circles) in blood when PSF-3 and vaccine were administered.
  • IgG red circle
  • serum serum
  • IgG red circle
  • IgG blue circle

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Abstract

抗原特異的分泌型IgA抗体の優先的かつ選択的な産生、局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する機能を発揮する抗原薬物ヴィークル(ADヴィークル)、及び該ADヴィークルを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン、アレルギーの予防あるいは治療剤。更に、上記ヴィークルを用いる経粘膜・経皮DDS。

Description

明細書 経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィ一クル、 これを用いる粘膜免疫の 誘導方法、 粘膜ワクチン及ぴ DDS
技術分野 本発明は、 経粘膜投与及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークルに関する ものであり、 更に詳しくは、 該ヴィークルを所望の抗原や薬物に用いることを特 徵とする、 抗原特異的分泌型免疫グロブリン Aを優先的かつ効果的、 特に選択的 に産生させる粘膜免疫の誘導方法、 粘膜ワクチン、 アレルギーの予防 ·治療、 及 びドラッグデリパリ一システムに関するものである。
背景技術 従来の不活化ワクチンやトキソィド等には次の欠点が知られている ： ( 1) 自然感染ルートでの乏しい感染防御
ワクチン接種ルートが皮下、 筋肉内等であるのに対し、 細菌やウィルス等の自 然感染ルートは、 例えば鼻腔、 気管、 腸管等の粘膜であり、 上記接種ルートとは 異なる。 自然感染の実態に即した接種ルートによる感染防御、 特に粘膜経由のヮ クチン投与よる粘膜での感染防御の実現が望まれる。
(2) 低い粘膜免疫性
ワクチン被接種者においては、 主に免疫グロブリ ン G (以下 「IgG」 又は 「IgG抗体」 と略記する） が血中に産生され、 体液性免疫が誘導される。 しかし、 粘膜免疫を担う免疫グロブリン A (以下 「IgA」 又は 「IgA 抗体」 と略記する） は、 ほとんど産生されず、 粘膜免疫の成立は期待できない。 尚、 IgA抗体の必要 性と有効性は次の通りである ： IgA抗体は、 飛沫や空気による鼻腔、 気管等の呼 吸器への感染、 また、 経口による腸管への感染の門戸である粘膜での感染防御、 即ち、 粘膜免疫を担っており、 臨床免疫上、 極めて重要な役割を演じている。 更 に、 IgG抗体が、 抗原に対する特異性が高く、 感染防御スペクトルが狭隘で、 抗 原変異した病原体の感染防御にはほとんど無効であるのに対し、 IgA抗体は、 交 差免疫性、 即ち、 交差中和活性があるので、 それだけ感染防御スペクトルの幅が 広く、 変異抗原に対する感染をも防御する。
(3) 追加接種の必要性と重なる費用
初回免疫の 1 回接種だけでは産生される IgG抗体が低く、 確実な効果が期待 できないため、 その後の IgG抗体保有状況に基づき、 更に 1 回以上の追加接種、 いわゆるブースター接種により血中 IgG 抗体価を高める必要がある。 そのため、 経費や労力を繰り返し要する上に、 ブースター接種の機会に恵まれた高齢者、 成 人及び学童では効果が認められるが、 その機会を逸し易い低年齢、 特に 2 歳以 下の乳幼児では効果なしのケースが散見される。 以上につき換言すれば、 従来の不活化ワクチンやトキソィ ド等は、 被接種者に おいて主に血中 IgG 抗体の産生を誘導し、 体液性免疫を高める作用効果をもた らし、 その有効性は確認されている。 しかし、 IgA抗体産生ないしは粘膜免疫の 誘導能が低いため、 自然感染を防御するに十分な機能と効果には限界がある。 か かる現状から、 従来ワクチンの欠点を解消するため、 現在までに多種多様な側面 から多くの試みがなされている。 例えば、 ワクチン抗原の質的又は量的改良、 不 活化ワクチンに代わる生ワクチンの試作、 新しい接種ルートゃ粘膜ワクチン等の 開発、 体液性免疫の高進とその持続をちたらすアジュバン卜のスクリーニング、 粘膜免疫アジュバントの開発に特定した試行等々。 しかし、 未だ安全かつ有効な 粘膜ワクチンの開発は達成されていない。 以下、 粘膜ワクチンの開発につき、 説明する。 i l) ワクチン抗原の増量 皮下又は筋肉内接種するワクチン抗原を増量し、 粘膜に分泌される IgG 及び IgA抗体量を増加させる試みがされている。 例えば、 従来の不活化インフルェン ザワクチンに該ウィルス膜蛋白のノィラミニダーゼを添加混合して抗体産生量を 増加させたり、 アジュパントとして MF59 を添加混合する方法等が試みられて いる。 しかし、 これには痛みを生じ、 副反応が弓食くなる等の不都合が見られる。
(2) 経鼻投与型ワクチン
最も有効と考えられる IgA 抗体による感染防御のため、 液状のスプリット抗 原を経鼻に直接接種する方法が試みられたが、 IgA産生量の低いことが指摘され ている。 そこで IgA 抗体産生能を上げるため、 スプリッ ト抗原にアジュパント として大腸菌易熱生毒素やコレラ毒素を添加混合し、 粘膜免疫応答、 即ち、 IgA 抗体産生能を上げる試みがなされているが、 アジュバントとしての毒素の安全性 が保証されていない現状から、 治検が中止され、 実用化には至っていない。 (3) 鼻腔内接種が可能な低温馴化株を用いる生ワクチン
増殖の最適温度が 25 であり、 39 ではほとんど増殖しない低温馴化インフ ルェンザウィルス株を鼻腔内に接種する方法が実用化されているが、 低温馴化親 株の弱毒のメカニズムが明らかでなく毒性復帰の危険性が否定できない。 また、 ワクチンの有効成分が生きたウィルスのため、 細胞内への侵入力が高く免疫の初 期化には優れているが、 軽度のインフルエンザ症状が散発するので、 インフルェ ンザに感染すると重症化しやすいハイリスクのヒトゃ高齢者等には使えない等の 欠点が見られる。
(4) その他のワクチン
ワクチニァウィルスをウィルスベクタ一としたベクターワクチンや、 リバース ジエネティクスによる弱毒生ワクチン、 DNAや cDNAそのものを有効成分とし て用いる DNA ワクチン等の開発が実験的に進められてはいるが実用化には至つ ていない。 更に、 以下、 免疫アジュバントの開発につき、 説明する。 (1) 免疫アジュパント
免疫アジュパントは、 免疫応答の強化や抑制等の調節活性を有する物質の総称 であり、 被接種体内での抗原の徐放ゃ貯留等を目的とした投与形態に係る物質と、 免疫応答の高進や抑制等を図るための物質に 2 大別される。 これ等のうち、 前 者、 投与形態のためのアジュバントとしては、 例えばリン酸アルミニウム、 ミヨ ゥパン等を用いるワクチンやトキソイドが既に実用化されている。 しかし、 後者、 免疫応答の強化 ·高進を図るためのアジュバントの実用化は、 未だ知られていな い。 例えば、 細菌由来の BCG 生菌、 BCG-CWS、 エンドトキシン、 グルカン等、 合成された MDP、 レバミソ一ル、 ポリ I一ポリ C、 べス夕チン等、 また、 サイ トカイン類のインターフェロン、 TNF、 CSF 等が公知であるが、 関節炎、 慢性 関節リウマチ、 高 γ グロブリン血症、 貧血等のアジュパント病、 効果が不十分 等々の理由により、 これ等の実用化には安全性と有効性の保証が必要だと思量さ れる。 また、 広く体液性免疫の誘導強化を図るため、 高等動物由来の肺サーファ クタント ·プロテインをアジュパントとして用いる技術 （特許文献 1) が公知で あるが、 その実用化は未だ知られていない。
(2) 粘膜免疫用アジュバントの開発
例えば、 百日咳毒素 Bオリゴマー （特許文献 2) 、 コレラ毒素 （特許文献 3) 、 大腸菌の易熱性ェンテロトキシン B サブュニット LTB (特許文献 4) 、 デンプ ン粒子 （特許文献 5) 、 コレラトキシン B鎖タンパク質 CTB (特許文献 6) 、 ベロ毒素 1 の Bサブユニット （特許文献 7) 、 オリゴヌクレオチド （特許文献 8) 、 イン夕一ロイキン 12 (非特許文献 1) 等々、 多種多様に開発されてはいる が、 未だ実用化には至っていない。 以上の通り、 皮下や筋肉内等へ接種する従来ワクチンから、 ウィルスの自然感 染ルートである粘膜において IgA 抗体の産生を誘尊する粘膜ワクチンへの切り 替えの必要性は、 広くかつ深く認識されている。 特に、 21 世紀における次世代 ワクチンとしては、 IgA抗体の産生、 局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する、 い わゆる粘膜ワクチンの開発と実用化が全世界で待望されてはいるが、 未だ達成さ れていない。 その理由は、 IgA抗体産生、 局所免疫ないしは粘膜免疫を誘導する 機能をワクチンに付与するための安全かつ有効なアジュパントが特定 ·確立され ていないことにあると思量される。 特許文献 1：特表 2002— 521460号公報
特許文献 2：特開平 3— 135923号公報
特許文献 3：特表平 10— 500102号公報
特許文献 4：特表 2001— 523729号公報
特許文献 5：特表 2002— 50452号公報
特許文献 6：特開 2003—116385号公報
特許文献 7：特開 2003— 50452号公報
特許文献 8： PCT公表 WO 00/20039号パンフレッ ト
非特許文献 1： Infection and Immunity^ 第 71巻、 4780-4788頁、 2003年 非特許文献 2： Journal of neonatal Nursing, 第 10巻、 2- 1 1頁、 2004年 非特許文献 3： Biology of the Neonate 第 74 巻 （suppl 1 ) 、 9- 14 頁、 1998年
非特許文献 4 ： American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, 第 24巻、 452-458頁、 2001年
発明の開示 本出願は以下を課題とする。 すなわち、 従来の不活化ワクチンやトキソイド等 に、 IgA抗体の産生、 局所免疫あるいは粘膜免疫を誘導する機能を付与する。 そ のための安全かつ有効な技術の開発。 従来の体液性免疫ワクチンから安全かつ有 効な粘膜免疫ワクチンへの変換。 また、 アレルギーの予防と治療、 更に、 粘膜や 皮膚を経由して薬物を投与かつ輸送する経粘膜 ·経皮ドラッグデリバリーシステ ム （以下 「DDS」 と略記する） の確立。 本発明は、 前記課嬉の解決手段として、 経粘膜投与及び経皮投与を可能にする 抗原薬物ヴィークル、 該ヴィークルを所望の抗原や薬物に用いることを特徴とす る、 抗原特異的分泌 免疫グロブリン A を優先的かつ効果的、 特に選択的に産 生させる粘膜免疫の露導方法、 粘膜ワクチン、 アレルギーの予防と治療剤、 並ぴ に経粘膜 ·経皮 DDS を提供する。 本発明が提供する抗原薬物ヴィークルの適用 ·汎用により、 多種多様な感染症 に対する粘膜ワクチン、 アレルギーの予防と治療剤、 及び経粘膜 ·経皮 DDS の 実現と普及をもたらす。 粘膜ワクチンは、 自然感染の実態に即した免疫手段であ るので、 従来ワクチンに比し、 著しく優れた感染防御効果を発揮する。 また、 抗 原薬物ヴィークルが誘導する鼻腔粘膜 igA は、 そこでのアレルゲンの失活をも たらし、 減感作を可き にする。 更に、 多種多様な薬剤への該 DDS の適用は、 薬 物の経粘膜投与及び経皮投与による予防 ·治療効果を強化かつ促進させる。 その 結果、 この発明は、 人類全体の医療 ·保健 ·衛生を多大に向上させる と共に、 世 界の医療 ·保健 ·衛生分野の従事者には待望の福音になる。 併せて、 従来及び未 来のワクチンやトキソィ ド等を含む生物学的製剤、 更に多種多様な薬物に広く、 注射に比べ簡便な経粘膜投与及び経皮投与が可能な機能と性能を付加する手段を 与える。
図面の簡単な説明 図 1 は、 各種経鼻インフルエンザワクチン投与における鼻腔 (a)、 月市胞 (b)、 皮 下注ィンフルェンザヮクチン投与における鼻腔 (c)、 肺胞 (d)におけるィンフルェ ンザウィルス感染抑 !!効果。 *は t検定によるワクチン単独 （AD ヴィークル又 はアジュパントなし〉 投与群との間の有意水準 (p<0.01)を示す。 （実施例 1) 図 2 は、 経鼻投年（a)、 皮下注射 (b)インフルエンザワクチンによる鼻腔洗浄液 の抗ィンフルェンザ抗体産生 IgA と IgG量。 白いバーは IgA量を、 黒いバーは IgG量をそれぞれ示す。 （実施例 2) 図 3 は、 経鼻 (a)、 皮下注射 (b)インフルエンザワクチン投与による肺洗净液に おける抗インフルエンザ特異抗体 IgA及び IgG産生に対するアジュバン卜の影 響を示す。 （実施例 3) 図 4 は、 経鼻 (a)、 皮下注射 (b)インフルエンザワクチン投与による血中抗イン フルェンザ特異抗体産生に対する PSF-2，CTBの影響を示す。 （実施例 4) 図 5 は、 経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻腔 (a)、 肺胞 (b)粘膜におけ る TGF-β Ι分泌レベルに対する PSF-2，CTBの影響を示す。 （実施例 6) 図 6 は、 経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔 (a)、 肺胞 (b)及び ώΐ液中 (c)の抗インフルエンザ特異抗体産生に対する PSF-2、 CTB の影響を示す。 （実 施例 7) 。 図 7 は、 経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻、 肺および脾臓のリンパ 球から分泌される各種サイト力インに対する SPF-2、 CTB の影響を示す。 （実 施例 8) 。 図 8 は、 経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔 (a)、 肺胞 (b)及び血液中 (c)の抗インフルエンザ特異抗体産生に対する PSF-3 の影響を示す。 （実施例 9) 。 発明を実施するための最良の形態 以下、 本発明の実施形態を詳しく説明する。
1. 用語及び抗原薬物ヴィークル構成成分の説明 ( 1) 抗原薬物ヴィークル 該ヴィークル （Antigen and Drug Vehicle, 以下、 「AD ヴィークル」 又は 「ADV」 と略記する） は、 抗原や薬物等の経粘膜投与及び経皮投与が可能にな るよう設計 （デザイン） された、 脂質とタンパク質との複合体 （コンプレック ス） である。 ADヴィークルは、 次の（a)〜(c)からなる。
(a) 肺サーファクタントプロティ ン B 又はその断片 （タンパク質分解酵素によ り得られる天然断片だけではなく、 遺伝工学やべプチド合成により得られる 人工断片、 かかる断片を構^するアミノ酸の 1 個以上が置換及び/又は欠 失した変異断片等々をも含む） 。
(b) 肺サーファクタントプロティ ン C 又はその断片 （タンパク質分解酵素によ り得られる天然断片だけで なく、 遺伝工学やペプチド合成により得られる 人工断片、 かかる断片を構成するアミノ酸の 1 個以上が置換及び/又は欠 失した変異断片等々をも含む） 。
(c) リン脂質や脂肪酸等の脂質。 その形状構造は、 表面に棘状あるいはスパイク 状のポリペプチド鎖を保有 膜状 （シート状又はローリング状の脂質膜） で あり、 複数のポリペプチド鎖の疎水領域末端を、 脂質膜に嵌入させスパイク 状に植鎖したかたちになっており、 従来の脂質小胞 （リボソーム） とは異な る。 この発明に係る抗原薬物ヴィークルに所望の抗原や薬物等を共存、 接触、 捕捉、 吸着又は結合させれば （乗せれ tま） 、 かかる抗原や薬物等の経粘膜投与及び経皮 投与が可能になる。 換言すれば、 該ヴィークルは、 抗原や薬物等の経粘膜投与及 ぴ経皮投与を可能にする、 これ等の乗り物である。 尚、 AD ヴィークルの構成成分、 該ヴィーィダルの調製 ·製造に用いるタンパ ク質、 ポリペプチドあるいはペプチドと脂質、 即ち、 肺サーファクタントプロテ イン B および C、 これ等の断片、 かかる断片ペプチドの少なくとも 1 個のアミ ノ酸が置換及び 又は欠失した変異断片等々、 及びリン脂質、 脂肪酸等の脂質の 詳細については、 後述される。 (2) 肺サーファクタント 肺サーファクタントは、 呼吸窮迫症候群 （ RDS ： Respiratory Distress Syndrome) の治療に 1990年代中頃から実用化され、 既に現在、 ヒト、 ゥシ、 ブ夕等に由来の、 多様な製剤が広く市販され常用化されている （非特許文献 2) 。 また、 RDS 治療に係る活性ドメインを含む合成ペプチド製剤も市販され、 更に、 SP-B や SP-C アナログのデザイン開発や合成も進められている （非特許文献 3) 。 肺サーファクタントの組成と構成は通りである ：約 90 %の脂質 （ホスフ ァチシセルコリン 67.3 %、 ホスファチジルグリセロール 19.3%、 ホスファチジ ルセリン 3.2%、 その他の遊離脂肪酸等） と、 約 10 %の蛋白質 （サ一ファクタ ントプロテイン A、 B、 C 及び D；以下 「SP-A」 、 「SP-B」 、 「SP-C」 及び 「SP-D」 とそれぞれ略記する） からなる複合体である。 分子量は SP-A ifi 28- 36kDa、 Bが 15 kDa、 Cが 3.5 kDa、 及ぴ Dが 43 kDaである。 SP-Aと D は親水性 （水溶性） かつレクチン様 （膜ァソシエイテッド） である。 SP-B と C は、 疎水性 （脂溶性） かつ脂質結合性で、 リン脂質膜への嵌入能及び界面活性作 用を有する。 ヒト、 ゥシ、 ブ夕等に由来の肺サ一ファクタントプロテイン遺伝子 は公知であり、 例えば、 GenBank/NCBI ( htt / /ww .ncbi.nlm.nih.gov. / ) におけるヒト SP-B 遺伝子 DNA の完全長塩基配列のァクセッション番号は J02761 , ヒト SP-C (及ぴ SP-C 1 ) のそれは、 J03890 である。 以下、 この NCBI より得たヒト SP-B及び C のコーディング領域 （CDR) とそれがコード するアミノ酸配列を記載する。 配列番号 1： ヒト SP-B遺伝子 DNAの CDR塩基配列；
配列番号 2：配列番号 1から解読されたヒト SP-B完全長アミノ酸配列 ； 配列番号 3： ヒト SP-C遺伝子 DNAの C D R塩基配列；
配列番号 4：配列番号 3から解読されたヒト SP-C完全長アミノ酸配列； 配列番号 5： ヒト SP-C遺伝子 DNA上に占める SP-C 1の C D R塩基配列；及び 配列番号 6：配列番号 5から解読されたヒト SP-C 1完全長アミノ酸配列。
(3) この発明で用いるタンパク質あるいはぺプチド
この発明に係る抗原薬物ヴィークルの調製 ·製造には、 ヒト、 ゥシ、 ブ夕、 ジラ、 ィルカ等の哺乳類に由来、 更に、 マグロ、 サメ、 エイ、 プリ等の魚類に 来の SP-B と SP-C との組合せ、 及 SP-B と SP-C 1 との組合せをそれぞれ用 いることができる。 例えば、 上記の配列番号 2、 4及ぴ 6にそれぞれ記載の完全 長アミノ酸配列からなるヒト由来タンパク質、 SP-B と SP-C との組合せ、 及び SP-B と SP-C 1 との組合せを、 それぞれ用いることができる。 更に、 例えば Kyte-Doolittleの疎水性値に基づく S P-B及び SP-Cの疎水性 （脂溶性） 領域及 ぴ該領域を含む断片、 かかる断片ペプチドの少なくとも 1 個のアミノ酸が置換 及び Z又は欠失した変異断片等々をも用いることができる。 例えば、 以下に示す 配列番号 7〜20 に記載のアミノ酸配列からなる天然ペプチドあるいは遺伝子ェ 学や化学合成により得られるぺプチド、 これ等のぺプチドを含むこれより長鎖の ペプチド、 及びかかるペプチドの少なくとも 1 個のアミノ酸が置換及ぴノ又は 欠失した変異体や合成アナログ等々を使用できる。 尚、 アミノ酸番号は、 各配列 の N末端を占める Met を第 1 番アミ ノ酸とし、 これより C末端方向 （記載配列 の左から右方向） に順に付された序^:で表示されている。 配列番号 7：配列番号 2の第 214〜225番のアミノ酸配列 （SP-B断片） ； 配列番号 8：配列番号 2の第 257〜2 66番のアミノ酸配列 （SP-B断片） ； 配列番号 9：配列番号 4及ぴ 6の第 29~ 58番のアミノ酸配列 （SP- C断片） 配列番号 10：配列番号 2の第 1〜20 番のアミノ酸配列 （SP-B断片） ； 配列番号 1 1：配列番号 2の第 102〜 1 10番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 12：配列番号 2の第 1 19〜 127番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 13：配列番号 2の第 136〜 142番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 14 配列番号 2の第 171〜 185番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 15 配列番号 2の第 201〜 279番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 16 配列番号 2の第 253〜 278番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 17 配列番号 2の第 300〜 307番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 18 配列番号 2の第 317〜 330番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 19 配列番号 2の第 344〜 35 1番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 20 配列番号 2の第 358— 38 1番のアミノ酸配列 ( SP-B断片） ； 配列番号 21 ：配列番号 4及ぴ 6の第 24- 58番のアミノ酸配列 （SP- C断片） この発明によれば、 配列番号 2、 7、 8、 10- 20 に記載のアミノ酸配列か らなる SP-B とその断片群から選ばれる少なくとも L 種と、 配列番号 4、 6、 9 及ぴ 21 に記載のアミノ酸配列からなると SP-C (及び SP-C 1) とその断片群か ら選ばれる少なくとも 1種とを組合せて用いることができる。 (4) 本発明で用いる脂質
リン脂質としては、 肺サーファクタン卜が含有する リン脂質、 例えばホスファ チジルコリン （レシチン） 、 ジパルミトイルホスファチジルコリン、 ホスファチ ジルセリン等の使用が望ましい。 その他、 ジパルミ トイルグリセ口ホスホコリン、 ジァシルグリセ口ホスホグリセロール、 ホスファチジリレグリセロール （カルジォ リピン） 、 ジラウロイルホスファチジルグリセロール、 ジミリストイルホスファ チジルグリセロール、 ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、 ジステア口 ィルホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイ ノシトール、 ホスファチジ ルエタノールァミン、 ホスファチジン酸、 スフインゴミエリン等を用いることが できる。 また、 脂肪酸としては、 ラウリル酸、 ミリスチン酸、 パルミチン酸、 ス テアリン酸、 パルミトォレイン酸、 ォレイン酸等を用 いることができる。 更に、 肺の膨張が活発なクジラ、 マグロ、 ィルカ等の水棲軌物に由来の脂質を用いるこ とができる。
(5) RDS治療用の市販の肺サーファクタント製剤
この発明によれば、 RDS 治療剤としての安全性と有効性が関係当局により認 可され、 かつ、 疎水性あるいは脂溶性の SP-B及ぴ SP-C並びにリン脂質を含有 する市販の肺サーファクタント、 例えば、 商品名サーファクテン （Surfacten) 、 Infasurf、 Curos rf, Humansurf、 Exosurf> Alveofact 等 ¾ AD ウィーク レ として用いることができる。 尚、 SP-B と SP-C以^ kに、 親水性あるいは水溶性 の SP-A及び SP-Dを含有する市販製剤では、 例え【 1—ブ夕ノールでこれ等の 水溶性夕ンパク質 SP-Aと SP-D とを抽出し、 これ寧を検出限界以下にまで除去 した後、 使用に供する。 また、 AD ヴィークルの調 における使用濃度の調整を 考慮すると、 液状製剤に比べ、 乾燥製剤の使用が望 しい。
2. 本発明の基礎となる新規な知見 この発明は、 前述した背景技術の激しく厳しい渦中にあって、 10 余年にも及 ぶ試行錯誤を重ねた筆頭発明者の卓抜した観察力と解析力、 そして深い学識経験 と斬新な着想によるものであり、 次の驚くべき発見 tこ基づく。 ( 1) 従来のアジュパントが炎症を惹起して抗原提示能を増強するのに対し、 本 来、 肺や消化管粘膜が分泌の界面活性物質である肺サ一ファクタントの 4 種の タンパク質有効成分、 SP-A、 B、 C及ぴ Dから、 と D とを除去した SP-B及 ぴ SP-Cの組合せとリン脂質との複合体、 あるいはこれ等の脂溶性領域 （有効領 域） を含む SP-B と SP-C 両断片の合成ペプチド 組合せと脂質膜との複合体 (前述した ADヴィークル） に、 ウィルス抗原を共存又は接触又は捕捉又は吸着 させると、 炎症を惹起することなく鼻腔粘膜の抗原提示細胞が活性化され、 ウイ ルス抗原が該細胞内に効率よく取り込まれると共に、 粘膜や血液中での IgG 産 生の誘導を起こすことなく、 粘膜の抗ウィルス IgA 産生が効果的かつ優先的に、 就中、 選択的に誘導されることを発見した。
(2) 更に、 従来から安全な不活化ワクチン抗原として使用されているインフル ェンザウィルス ·スプリット抗原に、 SP- B と SP- C の組合せとリン脂質との複 合体、 あるいはこれ等の脂溶性領域 （有効領域） を含む SP-B と SP-C両断片の 合成ペプチドの組合せと脂質膜との複合体 （AD ヴィークル） を添加混合するこ とにより、 スプリット抗原の高い安全性を保持しながら、 しかもスプリット抗原 単独では生ワクチンに比べて劣る抗原提示細胞の活性化が十分に増強され補われ た状態で、 分泌型 IgA産生の選択的誘導が実現されることを発見した。
3. 上記の発見に至る経緯
( 1) 筆頭発明者は、 インフルエンザ発症機序と治據、 予防法を解明するべく鋭 意研究を重ねてきた。 その過程で、 インフルェンザウィルス膜蛋白質のへマダル チニン （HA) を限定分解してウィルスの膜融合活性と感染能を発現させる気道 の HAプロセシングプロテアーゼのトリプ夕一ゼグララを肺サーファクタントが 吸着して不活性化し、 結果としてウィルスの増殖ナイクルを阻止することを解明 した。
(2) 引き続く研究の結果、 肺サーファクタントには上記の作用以外に、 選択的 に粘膜の抗原提示細胞を活性化してウィルス抗原に対する免疫能を活性化して、 分泌型 IgA の誘導を引き起こすが IgG の誘導は起こさないこと を見いだした。 さらに肺サ一ファクタント中の粘膜免疫増強有効成分として、 SP-B、 SP-Cが脂 質成分と共に重要であることを明らかにし、 これら蛋白成分の有効領域の特定と、 粘膜免疫増強の有効性を検証した。 (3) 更に、 上述したように気道粘膜の生体防御物質とウィルス感染防御の観点 から研究を進め、 体内に分泌されている肺サーファクタントが生体内由来の粘膜 免疫アジュパントとして選択的 IgA 産生の誘導に関与している ことを証明した。
(4) 上記の肺サーファクタントが本来生体内の生理的作用物質で、 （a)特定の生 体物質を吸着する性質のあること （Kido H.， et al. FEBS Lett. Pulmonary surfactant is a potetitialendogenous inhibitor of proteolytic activation of Sendai virus and influenza Avirus, 322(29), 1 15- 119, 1992) 、 （b)肺胞 H 型細胞やクララ細胞から分泌された後、 選択的にマクロファー ーに取り込まれ て代謝されること （諷訪部彰、 J. Jpn. Med. Soc. Biol. Interface; 肺胞蛋白症 におけるサ一ファクタント代謝異常、 33， 10- 13， 2002) 、 更に（c)その類縁細 胞、 例えば抗原提示細胞 （樹状細胞） に取り込まれて代謝されらことに注目し研 究を重ねた。
その結果、 肺サーファクタントの蛋白成分の中で、 SP-B、 SP- C及び脂質成分 だけで、 選択的に IgA産生を誘導する粘膜ワクチンの 「ADヴ ークル」 として 機能すること、 更に、 SP-B の有効成分領域あるいは粘膜免疫露導活性ドメイン が次のアミノ酸配列からなるぺプチドであることを明らかにし ：
SP-B 214-225： Leu lie Lys Arg lie Gin Ala Met lie Pro L s Gly (配列番号 7) ；及び
SP-B 257-266： Leu Leu Asp Thr Leu Leu Gly Arg Met Leu (配列番号 8) 。
併せて、 SP-C の有効成分領域あるいは粘膜免疫誘導活性ド インが次のアミ ノ酸配列からなるぺプチドであることを明らかにした：
SP-C 29-58： Cys Pro Val His Leu Lys Arg Leu Leu He Val Val Val Val Val Val Leu lie Val Val Val lie Val Gly Ala Leu Leu Met Gly Leu (配^!番号 9) 。 (5) 更に、 選択的 IgA 誘導の機序として、 肺サ一ファクタントの有 成分は、 抗原提示樹上細胞の MHC Class II、 CD40、 B7-2 の発現増加を誘導して T-リ ンパ球への抗原提示を効果的に実行する以外に、 粘膜局所のサイト力イン TGF- β ΐを誘導して IgA産生 B-リンパ球へのクラススィッチを促進してい ·¾ことを明 らかにした。
4. 以上の発見とその経緯に基づき完成された本発明の目的は次の通りである
( 1) 第 1 の目的は、 粘膜免疫方法の確立である。 「AD ヴィークル」 の提供と その活用により、 粘膜免疫の有効物質である抗原特異的 IgA 産生の 31択的誘導 を実現すると共に、 安全かつ有効な （副作用のない） 粘膜免疫の誘導 とその方法 を確立する。
(2) 第 2 の目的は、 合成べプチドの使用による、 AD ヴィークルの安全性 ·有 効性 ·均質性に係る品質の向上にある。 SP-B の粘膜免疫誘導活性ド メイン （前 述 SP-B 214-225及び SP-B 257- 266の各アミノ酸配列からなる） の合成ぺプ チド、 及び SP-Cの粘膜免疫活性導活性ドメイン （前記 SP-C 29-58 のアミノ酸 配列からなる） の合成ペプチド、 これ等の合成アナログ、 更に、 これ等のアミノ 酸配列を部分として含む長鎖の合成ペプチド等々と、 肺サーファクタ ン卜脂質成 分との間で調製される複合体 （AD ヴィークル) を提供し、 AD ヴィ 一クルの品 質を向上させる。
(3) 第 3 の目的は、 従来ワクチンの皮下接種から経粘膜投与への 換にある。 AD ヴィークルを、 気道感染ウィルスの不活化ワクチン、 例えばインフルエンザ、 SARS、 麻疹、 風疹、 ムンブス等の不活化ワクチン、 更に、 腸管感^ウィルスの 不活化ワクチン、 例えばロタ、 ポリオ等の不活化ワクチンに利用し、 これ等の皮 下接種ワクチンを粘膜ワクチンに変換する。
(4) 第 4 の目的は、 気道、 腸管以外の粘膜経由ウィルス感染に対する不活 ί匕ヮ クチン、 例えばエイズ、 Β 型肝炎、 C 型肝炎等の不活化ワクチンにおいて、 AD ヴィークルの利用可能な方法を提供することである。
(5) 第 5の目的は、 DNAワクチン、 生ワクチン、 アレルギーの予防や治療等に ついても、 ADヴィークルの利用可能な方法を提供することである。 (6) 第 6 の目的は、 粘膜以外の IgAを誘導可能な免疫ルートとして、 経皮接種 (塗布や貼付等） において、 AD ヴィークルの利用可能な方法を提供することに ある。
(7) 第 7の目的は、 DDSや製薬のみならず、 農業、 漁業等々への ADヴィーク ルの用途と応用の道を開くことにある。 尚、 本発明が提案する ADヴィークルは、 従来免疫学で使用されているアジュ パントとは、 次の通り性能と作用を異にする。 すなわち、 従来アジュバント ま、 通常、 皮下あるいは筋肉内接種され、 局所の炎症反応を引き起こし、 抗原提示細 胞ゃ B -、 T-リンパ球を引き寄せ、 その能力を発揮する異物を有効成分とし" Xい る。 更に、 長時間にわたる炎症反応を維持するため、 抗原の徐放ゃ貯留を惹起す る鉱油や金属塩が併用されている。 また、 従来の粘膜ワクチン ' アジュバン 卜と して知られているものは、 前述した通り、 大腸菌易熱生毒素やコレラ毒素等の異 物であり、 為害作用や副作用の生じる危険性がある。 これに対し、 本発明に係る AD ヴィークルは、 局所の炎症反応を引き起こさない。 更に、 生体成分由来 あ る上に、 肺サーファクタン卜の中の活性成分あるいはその活性ドメインが限定さ れていると共に、 かかるドメインゃ該ドメイン領域を含む低分子べプチドを使い、 効果的な粘膜ワクチンを実現している。 従って、 極めて安全であり、 かつ非 襲 的である。 5. この発明によれば、 次（1)〜(5)が、 それぞれ提供される
( 1) 肺サーファクタン卜プロテイン B又は該プロティン Bに由来の複数の断片 から選ばれる少なくとも 1 つの断片、 肺サーファクタン卜プロテイン C又は該 プロテイン C に由来の複数の断片から選ばれる少なくとも 1 つの断片、 及び少 なくとも 1種の脂質からなる複合体である抗原薬物ヴィークル。 更に詳しくは、 AD ヴィークルは、 次の I群 （肺サ一ファクタントプロテイン B 及ぴ該プロテイン B に由来あるいは起因する天然及び合成ポリペプチド群） 、 Π群 （肺サ一ファクタントプロテイン C及ぴ該プロテイン C に由来あるいは起 因する天然及び合成ポリペプチド群） 及び m群 （リン脂質、 脂肪酸等の脂質群） の各群から少なくとも 1 種ずつ選ばれる、 合計、 少なくとも 3 種の物質からな る複合体である。 [ I群] 肺サーファクタントプロテイン B、 及び配列番号 2 に記載の次のアミ ノ酸配列からなるポリペプチド （アミノ酸番号は、 N末端の Metを第 1番アミ ノ酸とし、 これより C末端方向に順次付されている） ：第 1-381番 （配列番号 2) 、 第 214-225番 （配列番号 7) 、 第 257-266番 （配列番号 8) 、 第 1-20 番 （配列番号 10) 、 第 102- 1 10番 （配列番号 1 1) 、 第 1 19- 127番 （配列番 号 12) 、 第 136- 142番 （配列番号 13) 、 第 171- 185番 （配列番号 14) 、 第 201-279番 （配列番号 15) 、 第 253-278番 （配列番号 16) 、 第 300-307番 (配列番号 17) 、 第 317-330番 （配列番号 18) 、 第 344-351 番 （配列番号 19) 、 第 358-381 番 （配列番号 20) 、 上記のアミノ酸配列の少なくとも 1 つ の配列を活性ドメインとして保有するポリペプチド、 上記の各アミノ酸配列の少 なくとも 1 個のアミノ酸が置換及び 又は欠失したポリペプチド、 これ等の合 成アナログ、 これ等の糖又は糖鎖による修飾体等々。
[ Π群] 肺サ一ファクタントプロテイン C、 及び配列番号 4 に記載の次のアミ ノ酸配列からなるポリペプチド （アミノ酸番号は、 N末端の Metを第 1番アミ ノ酸とし、 これより C末端方向に順次付されている） ：第 1- 197番 （配列番号 4) 、 第 29-58番 （配列番号 9) 、 第 24-58番 （配列番号 21) 、 配列番号 6の 第 1- 191 番のアミノ酸配列からなるポリペプチド、 上記のアミノ酸配列の少な くとも 1 つの配列を活性ドメインとして保有するポリペプチド、 上記の各アミ ノ酸配列の少なくとも 1 個のアミノ酸が置換及び 又は欠失したポリペプチド、 これ等の合成アナログ、 これ等の糖又は糖鎖による修飾体等々。
[m群] ホスファチジルコリン、 ジパルミトイルホスファチジルコリン、 ホスフ ァチジルセリン、 ジパルミ トイルグリセ口ホスホコリン、 ジァシルグリセ口ホス ホグセロール、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファチジルイノシトール、 ホ スファチジルエタノールァミン、 ホスファチジン酸等のリン脂質、 ラウリル酸、 ミリスチン酸、 パルミチン酸、 ステアリン酸、 ォレイン酸等の脂肪酸等々の脂質。 またこの抗原薬物ヴィークルは、 前記 m群がシート状又はロール状の脂質膜で あり、 前記 I群及び π群のそれぞれ複数鎖が、 疎水領域末端を該脂質膜に嵌入し た状態でスパイク状に植鎖されていることを、 その構成及び形状の一つの好まし い態様としている。
(2) 上記（1)の抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、 接触、 捕捉、 又は吸着させる ことにより得られ、 粘膜免疫を誘導することを特徴とする粘膜ワクチン。
(3) 上記（1)の抗原薬物ヴィークルにアレルゲンを共存、 接触、 捕捉、 又は吸着 させることにより得られ、 粘膜免疫を誘導することを特徴とするアレルギーの予 防及び治療剤。 その作用効果は、 例えば、 飛来吸引されたスギ花粉、 ダニ等のァ レルゲンの鼻腔あるいは鼻咽頭粘膜 IgAによる失活あるいは減感作にある。
(4) 上記（1)の抗原薬物ヴィークルに薬効を奏する量の薬物を共存、 接触、 捕捉 又は吸着させることにより得られる経粘膜及び/又は経皮 DDS。
(5) 上記（1)の抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、 接触、 捕捉又は吸着させるこ とによって得られる粘膜ワクチンを鼻または上気道に投与することを特徵とする 粘膜免疫の誘導方法。 なお、 上記の発明 (2)、 （3)および (5)においては、 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所 における IgA抗体の産生促進によって、 さらには粘膜局所における TGF-β Ι お よび Th2 タイプサイト力インの産生促進によって特徵付けられることを好まし い態様としている。
6. 以下、 この発明の実施態様につき説明する。 ( 1) ADヴィークルの組成
前述した I群 （肺サ一ファクタントプロテイン B及び該プロテイン B に由来 あるいは起因する天然及ぴ合成ポリペプチド群） 、 Π群 （肺サ一ファクタントプ ロティン C及び該プロティン C に由来あるいは起因する天然及ぴ合成ポリべプ チド群） 及び ΙΠ群 （リン脂質、 脂肪酸等の脂質群） の 3 群の乾燥重量％は、 次 の通りである ： I群は約 0. 1〜約 6.0重量％、 Π群は約 0. 1〜約 6.0重量％、 及 び ΠΙ群は約 88〜約 99.8 重量％である。 抗原薬物ヴィークルの調製では、 重 量％において I群％ + H群 + ΠΙ群％ = 100 %になるよう調整する。
(2) ADヴィークルの調製 - 以下に調製手順を例示する。 例えば、 I群を 2 mg、 Π群を 2 mg、 及び IE群 を 96 mg それぞれ枰取し （重量％にて I群％ + Π群 + DI群％ = 100 % ) 、 これ 等を 5 mlの等張液、 例えば生理的食塩水ゃリン酸緩衝液 （PBS) 中に均一に懸 濁させる。 得られた懸濁液は、 抗原薬物ヴィ一クル （100 mg/ 5 ml) 液として 使用に供する。 該ヴィークルは、 使用時にその都度、 調製する。 尚、 懸濁には、 超音波、 ホモジナイザー、 ミキサー、 振盪器等を用いることができる。 超音波は 過剰処理による液の変性 （粘性の増加） をもたらし易いので、 ミキサー、 例えば ボックスミキサー （例えば商品名 Vortex mixer) の使用が望ましい。
尚、 ΠΙ群の脂質 96 mgの内訳については、 例えば、 ホスファチジルコリン 71 mg、 ホスファチジルグリセロール 21 mg、 及びホスファチジルセリン 4 mgの 混合等を採用することができる （脂質量の合計は 96 mg) 。 また、 SP-A と D が除去され、 SP-B と Cの含有が確実な市販の RDS治療用の肺サ一ファクタン ト製剤を用いる場合には、 その使用書に従って調製した懸濁液をそのまま、 抗原 薬物ヴィ一クル液として使用に供することができる。 (3) 粘膜ワクチンの調製
ワクチン中の抗原量 （A) に対する抗原薬物ヴィークル量 （V) の乾燥重量比 A/V が約 0.2〜約 5 になるよう、 ワクチン原液に抗原薬物ヴィークル液を添加 混合し調製する。 例えば、 抗原含有量が 1 pg/mlのワクチン原液 1，000 mlに 対し、 重量比 A/V= l を採用すると、 上記 (2)で調製した抗原薬物ヴィークル ( 100 mg/5 ml) 液の添加混合量は 50 μΐである。 尚、 均一に混合するには、 ホモジナイザー、 ミキサー、 振盪器、 攪拌器等を用いることができる。
(4) 経粘膜 ·経皮 DDSの調製
上記 (3)と同様にして、 抗原の代わりに薬物を用いることにより、 調製できる。
実施例 以下、 実施例を示し、 この発明の構成と効果につき、 具体的に説明する。 但し、 この発明は、 これ等の具体例、 説明及ぴ記載にのみ限定されるわけではない。 なお、 この実施例で使用した材料、 試験手続等は以下のとおりである。
( 1) 肺サ一ファクタント
「抗原薬物ヴィークル （AD ヴィークル） 」 して用いた肺サーファクタントは、 牛の肺より Howgoodらの方法 （Howgood S, et al.，： Effects of a surfactant- associated protein and calcium ions on the structure and surface activity of lung surfactant lipids. Biochemistry 24, 184- 190， 1985) で調整した標 品 （PSF- 1) か、 あるいは多くはこの標品を 1—ブ夕ノールで抽出して水溶性蛋 白成分 SP-A、 SP-D を除去、 あるいは検出限界以下にまで減じた標品 (Haagsman HP, et al.， ： The major lung surfactant protein, SP28-36, is a calcium-dependent, carbohydrate binding protein, J. Biol. Chem. 262, 13977- 13880, 1987) (PSF-2) 、 さらに主にホスファチジルコリンゃジパル ミトイルホスファチジルコリンからなるリン脂質を全体として 40重量％以上含 有し、 さらに肺サーファクタント脂質に類似してホスファチジルグリセロールを 10-20%、 ホスファチジルセリンが 2~ 5%含有され、 脂溶性蛋白質の SP-B、 SP-C の有効領域の合成ペプチドのどちらか、 あるいは両方のペプチドを合わせ て、 0〜3.5%含む標品が用いられる。 この標品の中で SP-B、 SP-C の有効領域 の両方のペプチドを合わせ持つ標品 （PSF-3) 、 SP-B の有効領域の合成べプチ ドを有する標品 （PSF- 4 ) 、 SP-C の有効領域の合成ペプチドを有する標品
(PSF-5) についても検討した。 あるいは PSF- 1、 PSF-2 に相当する公知の標 品、 例えば商品名サーファクテン、 インサァ一フ （Infasurf) 、 キュー口サ一フ
(Cnrosurf) 、 ヒュ一マンサーフ （Humansurf) 、 ェキソサーフ （Exosurf) 、 ァルビオファクト （Alveofact) なども用いられる。
(2) 動物
6週齢、 メス BALB/cマウスおよび、 10週齢 Hartleyモルモットを日本エス エルシ一株式会社 （日本 '静岡） から購入して用いた。 全ての動物実験は徳島大 学医学部実験動物センターの感染動物舎 （P2 レベル） で行われ、 徳島大学医学 部動物実験委員会のガイドラインに従って行われた。
(3) スプリット型ィンフルェンザワクチンの作製
ィ ンフルェンザウィルス A Aichi/68/2/H3N2 株を接種した発育鶏卵由来浮 遊液 （1 x 108 Plaque forming unit (PFU)) (川崎医科大学 ·微生物学教室 大 内正信教授より供与された） を用いて以下の操作でスプリット型インフルエンザ ワクチンの作成を行った。 0.004M PBS (夕カラバイオ株式会社 日本 ·東京 - 滋賀） で一晩透析されたウィルス浮遊液に β プロピオラクトン （和光純薬株式 会社 日本 '大阪） を液量の 0.05%、 最終濃度 8 ηΜ になるように添加し、 氷 浴中で 18時間インキュベートした。 その後、 37 で 1.5時間インキュベートす ることで、 β プロピオラクトンの加水分解を行った。 その後、 終濃度 0.1%とな るように Tween20 (和光純薬株式会社） を加え、' さらに Tween と等量のジェ チルェ一テ レ （和光純薬株式会社） を加え、 4でで 2 時間転倒混和した。 この液 を 2000 rpm、 5 分間遠心分離することにより水層を回収した。 さ らに Automatic Environmental SpeedVac System ( SAVANT INSTRUMENTS, INC. アメリカ 'ニューヨーク） を用いて水層よりジェチルエーテルの除去を行 つた。 これを Millex 0.45 μπιフィルター (MILLIPORE アメリカ ·マサチュー セッッ） で濾過し、 不活化スプリット型インフルエンザワクチンとして用いた。
(4) 免疫法
上記の製造法で作製したスプリット型インフルエンザワクチンに 「AD ヴィ一 クル」 として上記の肺サ一ファクタント （PSF- 1 ) 、 1—ブ夕ノール抽出肺サー ファクタン ト （PSF-2) 、 SP-B, SP-C の有効領域の合成ペプチドと肺サ一フ ァクタント脂質 （PSF-3、 4、 5 ) 、 公知の肺サーファクタント商品、 あるいは 免疫アジュバントとしてコレラトキシン B サブュニッ ト ( CTB、 SIGMA ァメ リカ ， ミズーリ） を混合して用いた。 肺サ一ファクタントあるいは上記の相当標 品を、 ワクチン投与に必要な濃度で用時 PBS に懸濁し、 室温、 5 分間の超音波 処理により均一な懸濁液とした。 これに肺サ一ファクタントあるいは上記の相当 標品の乾燥重量で 0. 1 ]ig に対してスプリット型インフルエンザワクチンを 0. 1 μδ加え、 ポルテックスミキサーで混合したのち、 室温で 1 時間静置して使用し た。 CTB も同様に用時に調整し、 スプリット型インフルエンザワクチン 0. 1 μ§ に対 して 0. 1 ]ig に な る よ う に混合 し た （ Watanabe I， et al.， ： Characterization of protective immune responses induced by nasal influenza vaccine containing mutant cholera toxin as a safe Adjuvant (CT 1 12 ) . Vaccine 2002 ; 20 : 3443-55) 。
ワクチンの経鼻投与においては、 上記の調整品を乾燥重量相当量として 0. 1 pg/ l μΐ Phosphate buffered saline ( PBS) 溶液になるように PBSで希釈し、 これを 1匹当たり片側 1 μΐづっを両側に投与して、 合計 2 μΐをエーテルで麻酔 したマウスの両側鼻腔に点鼻投与した。 比較のために行つた従来型皮下注射にお いては、 スプリット型ィンフルェンザワクチンを 0. 1 g/ 50 μΐ溶液になるよう に PBS で希釈し、 これをマウス頸部皮下に投与した。 対照群にはワクチン液と 同量の PBSを投与した。 4週間後に初回免疫と同様の方法によって 2次免疫を 行い、 2次免疫後 2 週間目のマウスの、 鼻腔 ·肺胞洗浄液および血清を調製して、 ウィルス特異的な IgA、 IgGの測定とウィルス感染実験に用いた。 (5) マウス鼻腔 · 胞洗浄液および血清の調製
ワクチン投与マウスをベントパルピタール麻酔下で開腹開胸し、 気管を切開し アトム静脈カテーテル節付 3 Fr (アトムメディカル株式会社 日本 ·東京） を 肺へ挿入後、 生理食塩水 1 mlを注入し、 この液を回収した。 これを 3回繰り返 して採取した液、 ff十 3 mlを肺胞洗浄液として用いた。 肺洗浄液採取後、 切開し た気管から鼻腔方向へアトム静脈カテーテルを挿入し、 1 ml の生理食塩水を注 入し、 鼻から出てきた液を採取した。 この液を鼻洗浄液として用いた。 さらに、 心臓より採血を行い、 5,000 rpm、 10分間の遠心分離により血清を調製した。
(6) タンパク定量
鼻洗浄液、 肺洗挣液、 および血清の夕ンパク含有量を BCA Protein Assay Reagent Kit ( PIERCE アメリカ ·イリノイ） を用いて測定した （Smith PK. et al. , : Measurement of protein using bicmchonmic acid. Anal. Biochem. , 150, 76-85, 1985 ) 。 562 nm の吸光度は SPECTRAmax PLUS 384 (Molecular Devices Corporation アメリカ 'カリフォルニア） を用いて測定 した。
(7) ウィルス感染実験および感染価の評価
スプリット型インフルエンザワクチンの調製に用いたウィルス株と同じィンフ ルェンザウィルス株、 A Aichi/68/2/H3N2株を感染に用いた。 2次免疫終了後 2週間目のマウスをェ一テルで麻酔した後、 インフルエンザウイルス発育鶏卵由 来浮遊液を、 両側鼻腔に合計 7x l04PFU/3 μΐを滴下して感染させた。 感染 3日 後に鼻腔、 肺胞洗挣液を上記の要領で調製し、 ウィルス感染価の評価に用いた。 ウィルス感染価の評価を Α549細胞 （川崎医科大学 ·微生物学教室 大内正信教 接より供与された） を用いて行った。 Α549 細胞は、 5%牛胎児血清/ DMEM ( Gibco ァメリ ' ニューヨーク） の条件下で培養を行った。 Α549 細胞を 6 ゥエル培養プレート （グレイナ一 ドイツ · シュトウットガルト社） に 100%コ ンフルェントになるよラに継代し、 24 時間後に無血清培地に交換した。 各ゥェ ルにインフルエンザ感染マウスの鼻腔 ·肺胞洗浄液を 500 μΐずつ滴下し、 C02 インキュベータ一にて 12時間から 16時間 37 で培養を行った。 これにモルモ ッ卜より採血した赤血球 1% PBS液を加え、 5分間室温下で静置した。 これを 1 mM Ca2÷/Mg2÷ PBS を用いて洗浄し、 赤血球を凝集させた細胞をウィルス感染 細胞としてカウントし、 ウィルス感染価の評価を行った （Tashiro M.， Homma Μ· : Pne motropism of Sendai virus in relation to protease-mediated activation in mouse lungs. Infect. Immun. 39, 879-888, 1983) 。
(8) 抗インフルエンザ特異的 IgAおよび IgGの精製
ELISA assay における定量の基準として用いるために、 特異的抗インフルェ ンザ IgA および IgG の精製を以下のようにして行った。 組換え大腸菌発現 ProteinGセファロース 4Bカラム （ZYMED LABORTORIES INC, アメリカ · サンフランシスコ） を用いたァフィニィティ一クロマトグラフィーにより、 イン フルェンザワクチン投与およびウィルス感染マウスの肺洗浄液から IgG 画分を 精製した。 抗マウス IgAャギ IgG (SIGMA) を BrCN活性化セファロース 4B カラム ( Amersham Bioscience アメリカ ' 二ュ一シヤージー) に結合し、 ProteinG の素通り画分からこれを用いたァフィニィティークロマトグラフィー により IgA画分を精製した。 これらの IgG、 IgA画分からウィルス特異的抗体を 精製するため、 免疫に用いた不活化スプリ ッ ト型インフルエンザワクチンを BrCN 活性化セファロースカラムに結合し、 IgA、 IgG 画分からこれを用いた抗 原ァフィニィティーク Πマトグラフィ一によりそれぞれ抗インフルエンザ特異的 IgAおよび IgGを精製した。 リガンドとしてのスプリット型ィンフルェンザ蛋白 質のカラムへのカップリングは、 0. 1 M NaHCO3/0.5 M NaCl 緩衝液 （pH 8.5) を用いて結合反 を行い、 フリーのリガンドを 0. 1 M 酢酸 /0.5 M NaCl 緩衝液 （pH 8.5) を用いて除去後、 PBS (pH 7.5) により中和を行った。 各ァ フィニティクロマトグラフィーは PBS (pH 7.5) によりァフィ二ティ結合反応 およびフリーの抗体の除去を行った後、 glycine-HCl 緩衝液 （pH 2.8) によつ て特異抗体の溶出を行った。 溶出された画分は直ちに 0.5 M Tris-HCl 緩衝液 (pH 9.0) により中和を行い、 LilliQ水にて透析後凍結乾燥し、 用時 PBSに溶 解して用いた。
(9) 抗インフルエンザ抗体の定量
鼻腔、 肺胞洗浄液および血清中の抗インフルエンザ IgA、 IgG 含有量を、 ELISA assayにより定量した。 ELISA assayは BETHYL LABORATORIES社 (ァメリ力 ·テキサス） の Mouse ELISA quantitation kitの方法に従って行つ た。 96 ゥエル Nunc ィムノプレート （Nalgen Nunc International ァメリ 力 . ニューヨーク） 各ゥエルにワクチン 1 pg、 ゥシ血清アルブミン （BSA, SIGMA アメリカ ' ミズーリ） 1 pg/ml PBS溶液 100 μΐを加え、 4ででー晚固 層化反応を行った。 その後洗浄液 (50 mM Tris, 0. 14 M NaCl, 0.05% Tween 20, pH 8.0) で 3回すすぎワクチン液を除去した。 各ゥエルに 0. 15 M NaCL 1% BSAを含む 50 mM Tris-HCl緩衝液 （pH 8.0) 200 μΐを加え、 室温で 1 時間ブロッキング反応を行った。 各ゥエルを洗浄液で 3 回すすいだのち、 サン プル結合緩衝液 （50 mM Tris, 0. 15 M NaCl, 1% BSA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) にて適量に希釈した鼻洗浄液 ·肺洗浄液あるいは血清を 100 μΐ 加え、 室 温で 2 時間反応させた。 Goat anti-mouse IgA または IgG-horse rADish peroxidase (HRP) (BETHYL LABORATORIES INC.) を二次抗体として用レ 、 TMB Microwell Peroxidase Substrate System ( Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc. アメリカ · メリ一ランド） を用いて発色反応を行った。 各 ゥエルに 100 μ1、 2 M H2S04 (和光純薬株式会社） を添加することによって反 応を停止し、 450 nmの吸光度を SPECTRAmax PLUS 384で測定した。 定量 のためのスタンダードとして、 上記肺洗浄液から精製した抗インフルエンザ IgA および IgG 10 ngについて同様にして得られた吸光度を用いた。
( 10) 樹状細胞の調製およびフローサイ卜メ卜リ一
初回免疫後 2 日目の各群のマウス （1 群 4 匹） より採取した鼻、 肺、 脾臓よ り、 樹状細胞の調製を Gonzalez-Juarrero M の方法 （ Gonzalez- Juarrero M, Orme IM. : Characterization of murine lung dendritic cells infected with Mycobacterium tuberculosis. Infect Immun 2001 ; 69: 1 127-33) によりの 調製を行った。 なお、 鼻より樹状細胞の調製、 およびそのコラゲナ一ゼ処理は
Asanuma H 等の方法 Asanuma H, et al.，： Characterization of mouse nasal lymphocytes isolated by enzymatic extraction with collagenase. J Immunol Methods 1995; 187: 41-5 1 ) に従って行った。 各組織から調製され た樹状細胞を 1 mM EDTA/PBSにて洗浄し、 106細胞当たり FITC conjugated Anti-IA/IE (MHC class II) および PE conjugated Anti CD40あるいは FITC conjugated Anti-CD80 (B7- 1) および PE conjugated Anti CD86 (B7-2)
(BD バイオサイエンス アメリカ 'ニュージャージー） 各 1 pg/ml を加え、 50 μΐ 1 mM EDTA/PBS懸濁液として氷上で 30 分間反応させた。 1 ml の 1 mM EDTA/PBS で 2 回洗浄を行っ てフリーの抗体を除き、 1ml の ImM EDTA/PBS に再懸濁した。 これを用いて BD FACS Callibur (BDバイオサイ エンス） により細胞表面修飾因子の検出を行った。
( 1 1) TGF-β Ιの定量
鼻腔、 肺胞洗浄液中の TGF-β Ι の分泌量を、 ELISA assay により定量した。 ELISA assayは TGF-β Ι ELISA kit ( BIOSOURCE INTERNATIONAL ァメリ 力 ·カリフォルニア） を用いて、 キッ トに添付された使用法に従って行った。
( 12) 各種サイトカインの定量
鼻腔、 肺胞洗浄液中、 および脾臓のリンパ球からそれぞれ分泌されるサイト力 イン （インターロイキン 4： IL-4、 Iし- 5、 IL-6、 IL- 13) の量を、 それぞれの市 販 ELISAキットにより定量した。
( 13) SP-Bおよび SP-Cの合成べプチドとリン脂質とからなる PSF-3の調製 SP-B 253-278 (配列番号 16) と SP- C 24-58 (配列番号 2 1 ) のそれぞれの ペプチドを公知の方法により化学合成した。 これらのペプチドを、 リン脂質膜 (ジパルミ トイルホスファチジルコリ ン（75)、 ホスファチジルグリセロール（25)、 パルミチン酸（10)) に加えて板状のリン脂質膜を作成し、 AD ヴィークル PSF-3 を調製した。 実施例
と皮下 ΐ
ウィルス増殖抑制作用の比較 経鼻ワクチンとしてスプリット型ィンフル工ンザワクチン 0. 1 ]igを単独、 あ るいは 「AD ヴィークル」 として 1ーブ夕ノール抽出 （SP-A、 SP-D 除去） サー ファクタント （以下 PSF-2) 0. 1 ]ig, あるいは CTB 0. 1 とともに、 PBS溶 液として BALB/ cマウス両鼻に 1 μΐずつ投与を行った。 皮下注射ワクチンとし ては、 経鼻ワクチンと同量のワクチン単独、 あるいは AD ヴィークルとして PSF-2、 又はアジュパントとして CTB を加え、 全体で 50 μΐ PBS 溶液として BALB/ cマウス頸部皮下に投与した。 4週間後に初回免疫と同様の方法によって 2 次免疫を行った。 対照群にはそれぞれ同容量の PBS を投与した。 2 次免疫 2 週間経過後に 6.6 x l 04PFUのインフルエンザウイルスを 3 μΐ PBS溶液として経 鼻感染させた。 感染 3 日後にマウスを屠殺し、 鼻腔および肺胞洗浄液を調製し これらを用いてウィルス感染価の評価を行つた （n= 15 ~ 20；平均 ±SE; * , t検 定による有意水準はワクチン投与群に対して τχθ .01 ) 。 図 1 (a)と (b)に示すように、 経鼻インフルエンザワクチン投与の場合、 鼻腔と 肺洗净液中のインフルエンザウイルスの増殖は、 ワクチン単独投与によっても抑 制されるが、 PSF-2、 CTB はその効果を有意に増強してほぼ完全にまでインフ ルェンザの増殖をおさえてワクチンの効果を確実にした。 図には示していないが、 PSF-2 の代わりに PSF- 1、 PSF-3 を使用してもほほ程度の効果が得られている。 PSF-4、 -5についても同様な現象は確認されたが、 効果は減弱している。 尚、 図には示していないが PSF-2、 CTB をそれぞれ単独に初回免疫時と 2次 免疫時に経鼻投与しても、 ウィルス増殖の抑制効果は全く認められず、 PSF-2、 CTBの効果はワクチン作用の増強効果と判定された。 方、 皮下注射インフルエンザワクチンの場合、 図 1 (c)と（d)に示す通り、 鼻 腔、 肺洗浄液中のインフルエンザウイルスのタイ夕一 （PFU) はワクチン単独で も有意に減少して、 ワクチンの効果は確認されたが、 PSF-2、 CTB のワクチン 作用の増強効果は認められなかった。 則ち皮下投与の場合には、 PSF-2、 CTB の免疫増強効果はほとんど認められないか、 あっても極僅かと推定された。 なお、 この実験においては図には示していないが、 PSF-2、 CTB をそれぞれ単独に初 回免疫時と 2 次免疫時に皮下投与しても、 ウィルス増殖の抑制効果は全く認め られなかった。 図には示していないが、 PSF-2 の代わりに PSF- 1、 PSF-3、 PSF-4、 PSF-5を使用してもワクチン作用の増強効果は認められなかった。
実施例 2
経鼻 (a)、 皮下注射 (b)によるィンフルェンザワクチン投与後の鼻腔洗浄液中にお ける抗インフルエンザ特異抗体 （IgA、 IgG) 産生に対する PSF-2、 CTBの影響 図 1 に記載した方法で、 経鼻ワクチンと してスプリット型インフルエンザヮ クチン 0. 1 を単独、 あるいは ADヴィークルとして PSF-2 0.1 pg、 あるい はアジュバントとして CTB 0. 1 ]igと共に、 PBS溶液として BALB/ cマウス両 鼻に 1 μΐずつ合計 2 μΐ投与を行った。 皮下ワクチンとしては、 経鼻ワクチンと 同量のワクチン、 PSF-2、 CTBを 50 μΐ PB S溶液として BALB/cマウス頸部皮 下に投与した。 4週間後に初回免疫と同様の方法によって 2次免疫を行った。 対 照群にはそれぞれ同容量の PBSを投与した。 2次免疫 2週間経過後に 6.6 104 PFUのインフルエンザウイルスを 3 μΐ PBS溶液として経鼻感染させた。 感染 3 日後にマウスを屠殺し、 鼻腔洗浄液を調製しこれらを用いてウィルス感染価の評 価を行った （n= 15~ 20； 平均土 SE ; *， t検定による有意水準はワクチン投 与群に対して p<0.01) 。 その結果を図 2(a)と（b)に示す。 経鼻投与したスプリッ ト型インフルエンザヮ クチンによって、 抗インフルエンザ特異 IgA が選択的に鼻腔で産生されて洗浄 液中に増加するが、 この特異的 IgA量を PSF-2、 CTB は共に同程度、 著明に増 加させた。 一方皮下注射した場合も、 スプリ ット型インフルエンザワクチン単独 による鼻腔洗浄液中の特異的 IgA 量の増加は認められたが、 鼻腔投与に比べて その程度は低かった。 またワクチンの皮下注射の場合、 PSF-2、 CTB の免疫増 強効果は IgA、 IgG産生において共に認められなかった。 図には示していないが、 PSF-2の代わりに PSF- 1、 PSF-3を使用しても PSF-2と同程度の効果が得られ ている。 PSF-4、 -5 についても同様な現象は確認されたが、 その効果は減弱し ている。
実施例 3
経鼻投与 (a)、 皮下注射 (b)インフルエンザワクチンによる肺洗浄液中の抗インフ ルェンザ特異抗体 （IgA、 IgG) 産生に対する PSF-2、 CTBの影響 経鼻ワクチンとしてスプリット型インフ レエンザワクチン 0. 1 を単独、 あ るいは ADヴィ一クルとして PSF-2 0. 1 g, あるいはアジュバントとして CTB 0. 1 と共に、 PBS溶液として BALB/cマウス両鼻に 1 μΐずつ合計 2 μΐ投与 を行った。 皮下ワクチンとしては、 経鼻ワクチンと同量のワクチン、 PSF-2、 CTBを 50 μΐ PBS溶液として BALB/cマウス頸部皮下に投与した。 4週間後に 初回免疫と同様の方法によって 2 次免疫を行った。 対照群にはそれぞれ同容量 の PBS を投与した。 2次免疫 2週間経過後に 6.6X 104 PFUのィンフルェンザ ウィルスを 3 μΐ PBS溶液として経鼻感染させた。 感染 3 日後にマウスを屠殺し、 肺胞洗浄液を調製しこれらを用いて抗インフルエンザ特異抗体 IgA、 IgG産生に 対する抗原薬物ヴィークルの影響を検討した。 （n= 15〜20； 平均土 SE; *， t検定による有意水準はワクチン投与群に対して p<0.01 ) 。
図 3(a)と（b)に示すようにワクチンの鼻腔投与の場合と同様、 肺洗浄液中に産 生される抗インフルエンザ特異抗体に対する PSF-2、 CTB の産生促進効果は著 明で、 両者の間に大きな差はなかった。 この免疫増強効果は IgA に特異的で、 IgGに対して効果は認められなかった。 皮下注射の場合、 肺洗浄中の IgAの増加 が認められたが、 PSF-2、 CTB の免疫増 5 効果は、 鼻腔洗浄液中の場合と同様 に認められなかった。 なお、 図には示していないが PSF- 2、 CTB をそれぞれ単 独に初回免疫時と 2 次免疫時に経鼻投与、 皮下投与しても、 肺洗浄中のウィル ス特異的 IgA、 IgGの増加は認められず、 PSF-2、 CTBの効果はワクチン作用の 増強効果と判定された。 図には示していないが、 PSF-2 の代わりに PSF- 1、 PSF-3 を使用してもほほ程度の効果が得られている。 PSF- 4、 -5 についても同 様な現象は確認されたが、 その効果は減弱している。
実施例 4
経鼻投与 (a)、 皮下注射 (b>インフルエンザワクチンによる血液中の抗インフルェ ンザ特異抗体 （IgA、 IgG) 産生に対する PSF-2、 CTBの影響 経鼻ワクチンとしてスプリツト型インフルエンザワクチン 0. 1 ]igを単独、 あ るいは ADヴィークルとして PSF-2 0.1 pg、 あるいはアジュパントとして CTB 0.1 igと共に、 PBS溶液として BALB/cマウス両鼻に 1 μΐずつ合計 2 μΐ投与 を行った。 皮下注射ワクチンとしては、 経鼻ワクチンと同量のワクチン、 PSF-2、 CTBを 50 μΐ PBS溶液として BALB/cマウス頸部皮下に投与した。 4週間後に 初回免疫と同様の方法によって 2 次免疫を行った。 対照群にはそれぞれ同容量 の PBS を投与した。 2次免疫 2週間後にマウスを屠殺し、 心臓採血を行い、 こ れより血清を調製しこれらを用いて抗インフルエンザ抗体発現量の定量を行った (n= 15~20, 平均土 SE) 。
. 図 4(a)と（b)に示すように、 血液中抗インフルエンザ抗体 IgA (白いバ一） 、 IgG (黒いパー） の産生量は、 経鼻ワクチン投与の場合、 軽度の IgA、 IgG の増 加が認められるものの、 PSF-2、 CTBによる IgA、 IgGの増加はなく、 免疫増強 効果は認められなかった。 一方、 皮下注射の場合、 スプリット型インフルエンザ ワクチン投与による著しい IgGの増加と、 IgAの B月らかな増加が認められたが、 ここでも PSF-2、 CTB による抗体産生量の増加はなく、 免疫増強効果は認めら れなかった。 特に皮下注射の場合、 IgG が特異的に血液中で増加していた。 PSF-2 の代わりに PSF- 1 を使用してもほほ同様の結果が得られている （図には 示していない） 。
なお、 PSF-2、 CTB をそれぞれ単独に初回免疫時と 2 次免疫時に経鼻投与、 皮下投与しても血液中のウィルス特異的 IgA、 Ig の増加は認められず、 PSF-2、 CTBの効果はワクチン作用の増強効果と判定された （図には示していない） 。
実施例 5
経鼻投与 )、 皮下注射 (b)インフルエンザワクチンによる鼻、 肺、 脾臓の樹状細 胞の抗原提示能に対する PSF-2、 CTBの影響 経鼻ワクチンとしてスプリツト型インフルエンザワクチン 0. 1 μδを単独、 あ るいは PSF-2 0. 1 pg、 CTB 0, 1 と共に、 1 μΐ PBS溶液として BALB/cマ ウス両鼻に合計 2 μΐ投与を行った。 皮下ワクチンとして経鼻ワクチンと同量の スプリット型インフルエンザワクチン、 PSF-2、 CTBを 50 μΐ PBS溶液として BALB/cマウス頸部皮下に投与した。 2 日後にマウスを屠殺し鼻、 肺、 脾臓より 樹状細胞を調製し、 フローサイトメトリーにより MHC class II、 CD40、 B7- 1 ( CD80) 、 B7-2 (CD80) の細胞表面発現レベルを測定した。
その結果、 CTB によってワクチンをチャレンジした鼻の樹状細胞 （抗原提示 細胞） の膜表面の抗原提示関連分子、 CD40、 B7-2 の発現増加が認められ、 ァ ジュパント効果が分子のレベルで確かめられた。 PSF-2 の場合、 鼻の樹状細胞 の CD40、 B7-2 に加えて MHC II分子の発現増加も認められ、 その免疫増強効 果に樹状細胞の少なくとも 3つの分子が関与していることが明らかとなった。 しかし肺と脾臓の樹状細胞の CD40、 B7-2、 MHC II分子では、 明らかな変化 は認めることができなかった。 また、 PSF- 2 の代わりに PSF- 1、 PSF-3 を使用 してもほほ程度の効果が得られた。 PSF-4、 -5 についても同様な現象は確認さ れたが、 その効果は減弱していた。
実施例 6
経鼻インフルエンザワクチン投与による鼻腔 (a 肺胞 (b>粘膜における TGF-pl
分泌レベルに対する SPF-2、 CTBの影響 経鼻ワクチンとしてスプリット型インフルエンザワクチン 0. 1 を単独、 あ るいは SPF-2 0. 1 ]xg, CTB 0. 1 とともに、 1 μΐ PBS溶液として BALB / c マウス両鼻に合計 2 μΐ投与を行った。 皮下ワクチンとして経鼻ワクチンと同量 のワクチン、 PSF-2、 CTBを 50 μΐ PBS溶液として BALB/ cマウス頸部皮下に 投与した。 4週間後に初回免疫と同様の方法によって 2次免疫を行った。 対照群 にはそれぞれ同容量の PBS を投与した。 2次免疫 2週間後にマウスを屠殺し、 鼻腔洗浄液を調製しこれらを用いて TGF- (¾ 1 分泌量の定量を行つ.た （n= 15〜 20 ; 平均土 SE; *， t検定による有意水準はワクチン投与群に対して p<0.0 1 ) 。
B 細胞が IgA 産生細胞に分化 （クラススィッチ） するためには、 産生細胞の 局在している局所の TGF- β Ι濃度が重要であることが知られている （Stavnezer, J. : Regulation of antibody production and class switching by TGF-beta. J. Immunol. 155(4)， 1647- 165 1 , 1995) 。 そこで上記の条件下での鼻腔 (a)、 肺 胞 (b)粘膜局所の TGF- β ΐ濃度を検討した。
スプリット型インフルエンザワクチンを投与した鼻腔、 肺胞粘膜局所の TGF- β ΐ濃度は、 共に SPF-2、 CTB存在下に有意に増加した。 増加の程度は、 SPF-2、 CTB 間で有意な差はなかった。 その結果を図 5 (a)と（b)に示す。 生体内由来の SPF-2は、 外来毒素の CTB と同程度、 IgA分泌 B細胞分化の促進を促す TGF- β ΐ の濃度を増加させていることが判明した。 図には示していないが、 PSF-2 の 代わりに PSF- 1、 PSF-3 を使用してもほほ程度の効果が得られている。 PSF-4、 -5 についても同様な現象は確認されたが、 効果は減弱している。 なお、 PSF-2、 CTB をそれぞれ単独に初回免疫時と 2 次免疫時に経鼻投与、 皮下注射投与して も TGF- β Ι の濃度の増加は認められず、 PSF-2、 CTB の効果はワクチン作用の 増強効果と判定された （図には示していない） 。
実施例 7
経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔 (a)、 肺胞 )及ぴ血液中（c)の抗ィン フルェンザ特異抗体 （IgA、 IgG) 産生に対する PSF-2、 CTBの影響 経鼻ワクチンとしてスプリット型ィンフルェンザワクチン 0.2 igを単独、 あ るいは ADヴィークルとして PSF-2 0.2 μ^、 あるいはアジュバントとして CTB .2 ]Xgと共に、 PBS溶液として BALB/cマウス両鼻に 1 μΐずつ合計 2 μΐ投与 を行った。 4週間後に初回免疫と同様の方法によって 2次免疫を行った。 対照群 にはそれぞれ同容量の PBS を投与した。 各群とも、 2次免疫 2週間後にマウス を屠殺し、 鼻腔洗浄液、 肺胞洗？争液および心臓採血による血清を調製し、 これら を用いて抗インフルエンザ抗体発現量の定量を行った （η= 15〜30， 平均 ±SE、 +， pく 0.01 vs.ワクチン単独投与） 。
図 6(a)と (b)に示すように、 鼻腔洗浄液および肺胞洗浄液では、 PSF-2 とワク チンとを投与した場合に血液中 インフルエンザ抗体 IgA (青丸） が顕著な増加 を示したが、 図 6(c)に示すよう に、 血液中では IgG (赤丸） の増加は認められな かった。
一方、 CTB とワクチンを投与した場合、 IgG と IgGが、 鼻腔洗浄液およ肺胞 洗浄液で増加し （図 6(a)、 （b)) 、 さらに血液中でも顕著に増加した （図 6(c)) 。 以上のとおり、 CTB の場合 こは、 従来からの報告のとおり、 経鼻接種した抗 原に反応して局所免疫を成立 させる以外に、 全身性の免疫反応 （Systemic Immune Response) を生じさ せた。 一方、 PSF-2 を用いた場合には、 局所粘 膜免疫のみを成立させた。
なお、 J. Freek van Iwaarden等 （非特許文献 4) は、 肺からマクロファ一ジ を人工的に除去すると、 SP-B と脂質によって全身性の免疫反応を誘導で者るが、 マクロファージを除去しない場合には免疫を誘導することができないことを報告 している。 また、 前記文献においては、 前身性免疫反応を誘導するために必要な SP-B+脂質量は 250-300 μΐであり、 前記実施例の PSF-2投与量 （0.2 "μΐ) と は大きくかけ離れている。 しか も、 局所粘膜免疫については一切言及していない。
実施例 8
経鼻ィンフルェンザワクチン投与による鼻、 肺おょぴ脾臓のリンパ球から分泌 される各種サイト力インに対する SPF-2、 CTBの影響 経鼻ワクチンとしてスプリ、ゾ ト型ィンフルェンザワクチン 0.2 g を SPP-2 0.2 pg、 または CTB 0.2 とともに、 1 μΐ PBS溶液として BALB/cマウスの 上気道に合計 2 μΐ投与した。 2次免疫 2週間後にマウスを屠殺し、 鼻腔、 肺胞 および脾臓リンパ球からの TGF-β Ι およびサイ ト力イン （IL-4、 IL-5, Iし- 6、 IL- 13 ) の分泌量の定量を行った （n= 15 ~ 20； 平均土 SE; +++， P=0.06 ; ++, Ρ=0·05; +， P=0.01 vs.ワクチン単独投与） 。
図 7(a)〜 (e)に示すように、 PSF-2 とともにワクチン免疫した後の粘膜局所 (鼻、 肺） では TGF-β Ι IL-5および IL-6の有意な分泌増加が認められだが、 IL-4 および IL- 13 では有意な増加は認められなかった。 一方、 脾臓ではいずれ のサイトカインの有意な増加は観察されなかった。
以上の結果から、 PSF-2 は、 IgA を産生する B 細胞の分化、 誘導を促進する Th2タイプのサイトカインを粘膜局所で増加させることが確認された。
実施例 9
経鼻投与インフルエンザワクチンによる鼻腔 (a)、 肺胞 (b)及び血液中（c)の抗ィン フルェンザ特異抗体 （IgA、 IgG) 産生に対する PSF-3の影響 経鼻ワクチンとしてスプリット型ィンフルェンザワクチン 0.2 を単 ί虫、 あ るいは ADヴィ一クルとして PSF- 3 (配列番号 16に記載の S Ρ一 Β断片 253~ 278ペプチドと配列番号 21に記載の S P— C断片 24~ 58ペプチドとの等重量 混合物） 0.2 、 または脂質成分 0.2 μδと共に、 PBS溶液として BALB /cマ ウス両鼻に 1 μΐずつ合計 2 μΐ投与を行った。 4週間後に初回免疫と同様の方法 によって 2次免疫を行った。 対照群にはそれぞれ同容量の PBS を投与した。 各 群とも、 2次免疫 2週間後にマウスを屠殺し、 鼻腔洗浄液、 肺胞洗浄液および心 臓採血による血清を調製し、 これらを用いて抗インフルエンザ抗体発現量の定量 を行った （η= 15~ 30, 平均土 SE、 +， p<0.01 vs.ワクチン単独投与） 。
図 8(a)と (b)に示すように、 鼻腔洗浄液おょぴ肺胞洗浄液では、 PSF-3 とワク チンとを投与した場合に血液中抗インフルエンザ抗体 IgA (青丸） が顕著な増加 を示したが、 IgG (赤丸） の有意な増加は認められなかった。 一方、 血清中（ で は、 IgG (赤丸） および IgG (青丸） とも、 有意な増強は認められなかった。 産業上の利用可能性 この発明に係る 「AD ヴィークル」 は、 抗原 ·薬物 ·栄養剤等々のあらゆる物 質を、 鼻 ·気管 ·腸管等々の粘膜あるいは皮膚から細胞内に輸送する機能を究揮 すると共に、 そこでの IgA産 を優先的かつ選択的に誘導するので、 粘膜ワク チン、 アレルギーの予防と治療、 経粘膜及ぴ経皮 DDS、 薬物や栄養素等の有用 物質の経粘膜投与及び経皮投与を可能にする。 しかも、 その臨床使用及び安全性 は国内及び諸外国で既に認可されている。
従って、 生物学的製剤や DDS 等での医薬品 ·製薬、 機能性食品や健康食品等 での飲食品 ·食糧工業、 農産物の育成 ·栽培 ·病気対策 ·昆虫駆除等での農業 · 農薬、 魚病ワクチン，投薬等での栽培漁業、 防蟻 ·防虫等での建築業や環境保全 等々、 極めて広範囲の産業にお サる用途と活用が期待される。

Claims

請求の範囲
1. 肺サーファクタン 卜プロテイン B又は該プロテイン Bに由来の複数の断片か ら選ばれる少なくとも 1 つの断片、 肺サーファクタントプロテイン C又は該プ 口ティン Cに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも 1 つの断片、 及び少な くとも 1種の脂質からなる複合体である抗原薬物ヴィ一クル。
2. 少なくとも 1 種の脂質が、 ホスファチジルコリン、 ジパルミ トイルホスフ ァチジルコリン、 ホスファチジルセリン、 ジパルミトイルグリセ口ホスホコリン、 ジァシルグリセ口ホスホグリセロール、 ホスファチジルグリセロール、 ホスファ チジルイノシトール、 ホスファチジルエタノールァミン、 ホスファチジン酸、 ラ ゥリル酸、 ミリスチン酸、 パルミチン酸、 ステアリン酸、 及びォレイン酸からな る脂質群から選ばれる請求項 1に記載の抗原薬物ヴィークル。
3. プロテイン B に由来の断片が、 配列番号 2、 7、 8、 10、 1 1、 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 または 20 のアミノ酸配列からなるペプチドである請求 項 1に記載の抗原薬物ヴィークル。
4. プロテイン C に由来の断片が、 配列番号 4、 配列番号 9、 21、 または配列 番号 6 のアミノ酸配列からなるペプチドである請求項 1 に記載の抗原薬物ヴィ 一クル。
5. 脂質がシート状又はロール状の膜であり、 肺サーファクタン卜プロテイン B 又は該プロテイン Bに由来の複数の断片から選ばれる少なくとも 1 つの断片、 及び肺サ一ファクタン トプロテイン C又は該プロテイン Cに由来の複数の断片か ら選ばれる少なくと ¾> 1 つの断片のそれぞれ複数鎖が、 疎水領域末端を該脂質 膜に嵌入した状態で又パイク状に植鎖されている請求項 1 から 4のいずれかに 記載の抗原薬物ヴィークル。
6. 請求項 1から 5 のいずれかに記載の抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、 接 触、 捕捉、 又は吸着させることにより^られ、 粘膜免疫を誘導することを特徴と する粘膜ワクチン。
7. 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所にお る IgA抗体の産生促進によって特徴付け られる請求項 6に記載の粘膜ワクチン。
8. 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所にお る TGF-β Ι および Th2 タイプサイトカ インの産生促進によって特徴付けられる請求項 6 または 7 に記載の粘膜ワクチ ン。
9. 請求項 1から 5のいずれかに記載の抗原薬物ヴィークルにアレルゲンを共 存、 接触、 捕捉、 又は吸着させることにより得られ、 粘膜免疫を誘導することを 特徴とするアレルギーの予防剤又は治察剤。
10. 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所における IgA抗体の産生促進によって特徴付 けられる請求項 9に記載のアレルギーの予防剤又は治療剤。
1 1. 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所における TGF-β Ι および Th2 タイプサイ ト カインの産生促進によって特徴付けられる請求項 9または 10に記載のアレルギ 一の予防剤又は治療剤。
12. 請求項 1 から 5 のいずれかに記載の抗原薬物ヴィークルに薬効を奏する 量の薬物を共存、 接触、 捕捉又は吸着させることにより得られる経粘膜及び Z又 は経皮 DDS。
13. 請求項 1 から 5 のいずれかに記載の抗原薬物ヴィークルに抗原を共存、 接触、 捕捉又は吸着させた粘膜ワクチンを鼻腔または上気道に投与することを特 徵とする粘膜免疫の誘導方法。
14. 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所における IgA抗体の産生促進によって特徴付 けられる請求項 13に記載の粘膜免疫の誘導方法。
15. 粘膜免疫の誘導が、 粘膜局所における TGF- β ΐ および Th2 タイプサイト 力インの産生促進によって特徴付けられる請求項 13 または 14 に記載の粘膜免 疫の誘導方法。
1/9
インフルエンザ整染 3B後
ワクチン PSF-2 CTS
(MPS) {Μ Β) (0.1|ifl)
Figure imgf000039_0001
ウィルス ft Ei 1 X lo'PFWmei protein)
(b) インフルエンザ感染 3曰後
ゥクチン PSF-2 CTB
Figure imgf000039_0002
0 2 4 6 8 10 ウィルス想赚 (x10*PFU/tng protein)
差眷ぇ用弒（規則
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JP2006512040A JP4843792B2 (ja) 2004-04-05 2005-03-22 経粘膜及び経皮投与を可能にする抗原薬物ヴィークル、これを用いる粘膜免疫の誘導方法、粘膜ワクチン及びｄｄｓ
BRPI0508792-9A BRPI0508792A (pt) 2004-04-05 2005-03-22 veìculo para fármaco-antìgeno, vacina de mucosa, agente para prevenção ou tratamento de alergia, sistema de liberação de fármaco (dds), método para induzir imunidade de mucosa
US11/547,650 US8268321B2 (en) 2004-04-05 2005-03-22 Antigen-drug vehicle enabling transmucosal and transdermal administration, and method of inducing mucosal immunity and mucosal vaccine and DDS using the same
EP05721586A EP1738765B1 (en) 2004-04-05 2005-03-22 Antigen-drug vehicle enabling transmucosal and transdermal administration and method of inducing mucosal immunity, mucosal vaccine and dds using the same
CA2579710A CA2579710C (en) 2004-04-05 2005-03-22 Antigen-drug vehicle enabling transmucosal and transdermal administration, and method of inducing mucosal immunity and mucosal vaccine and dds using the same
CN2005800120996A CN1942205B (zh) 2004-04-05 2005-03-22 可经粘膜和经皮给予的抗原药物媒介物、使用该媒介物的粘膜免疫的诱导方法、粘膜疫苗和dds

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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007018152A1 (ja) * 2005-08-05 2007-02-15 The University Of Tokushima IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン
WO2009123119A1 (ja) 2008-04-02 2009-10-08 国立大学法人徳島大学 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン
WO2010087771A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Alphabeta Ab Compound and method for treatment of alzheimer's disease
WO2010089940A1 (ja) * 2009-02-05 2010-08-12 国立大学法人大阪大学 粘膜ワクチン
WO2013031827A1 (ja) 2011-08-29 2013-03-07 国立大学法人徳島大学 Rsv粘膜ワクチン
US8785391B2 (en) 2010-06-24 2014-07-22 Alphabeta Ab Compound and method for treatment of alzheimer's disease and familial dementia
US9522170B2 (en) 2011-04-05 2016-12-20 Alphabeta Ab Methods of screening compounds for the fibril formation of Aβ peptides based on a decreased trimer/monomer ratio of a chaperone protein
WO2020045155A1 (ja) 2018-08-30 2020-03-05 国立大学法人徳島大学 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤
WO2021206103A1 (ja) * 2020-04-06 2021-10-14 応用酵素医学研究所株式会社 皮下投与型ワクチン

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107397956A (zh) * 2017-08-08 2017-11-28 南开大学 一种铜绿假单胞菌外膜蛋白疫苗的制备方法及应用
US20210322511A1 (en) * 2020-04-17 2021-10-21 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for treating a respiratory disease
EP4228691A2 (en) * 2020-10-16 2023-08-23 Biosuperior Technology, Inc. Lung treatment compositions

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH069428A (ja) * 1992-06-24 1994-01-18 Tokyo Tanabe Co Ltd 気道部ウィルス疾患の予防及び治療剤
EP0976403A1 (en) 1998-07-30 2000-02-02 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Adjuvant comprising pulmonary surfactant
US20020155151A1 (en) 1997-02-11 2002-10-24 Franz Enzmann Transdermal, oral and intravenous preparations of 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzoquinone

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5527696A (en) * 1995-03-31 1996-10-16 Children's Hospital Medical Center Use of surfactants for introducing genetic material into lun g cells
EP1440084B1 (en) * 2001-10-24 2010-01-06 University College Cardiff Consultants Ltd. Sperm factor sequences

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH069428A (ja) * 1992-06-24 1994-01-18 Tokyo Tanabe Co Ltd 気道部ウィルス疾患の予防及び治療剤
US20020155151A1 (en) 1997-02-11 2002-10-24 Franz Enzmann Transdermal, oral and intravenous preparations of 2,3-dimethoxy-5-methyl-6-decaprenyl-1,4-benzoquinone
EP0976403A1 (en) 1998-07-30 2000-02-02 Stichting Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid (ID-DLO) Adjuvant comprising pulmonary surfactant

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AUGUSTO L.A. ET AL: "Cellular Antiendotoxin Activities of Lung Surfactant Protein C in Lipid Vesicles", AMERICAN JOURNAL OF RESPIRATORY AND CRITICAL CARE MEDICINE, vol. 168, 2003, pages 335 - 341, XP002989571 *
AUGUSTO L.A. ET AL: "Interaction of Pulmonary Surfactant Protein C with CD14 and Lipopolysaccharide", INFECTION AND IMMUNITY, vol. 71, no. 1, January 2003 (2003-01-01), pages 61 - 67, XP002989572 *
SCHRAM V. ET AL: "Non-cooperative effects of lung surfactant proteins on early adsorption to an air/water interface", BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA, vol. 1616, 2003, pages 165 - 173, XP004464814 *
See also references of EP1738765A4
VAN IWAARDEN J.F. ET AL: "Alveolar Macrophages, Surfactant Lipids, and Surfactant Protein B Regulate the Induction of Immune Responses via the Airways", AM. J. RESPIR. CELL MOL. BIOL., vol. 24, 2001, pages 452 - 458, XP002989570 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007018152A1 (ja) * 2005-08-05 2007-02-15 The University Of Tokushima IgA抗体の選択的産生からIgA及びIgG両抗体産生への切換えを可能にする抗原薬物ビークルとこれを用いる経鼻・粘膜ワクチン
EP1930025A1 (en) * 2005-08-05 2008-06-11 The University of Tokushima ANTIGEN-AND-DRUG VEHICLE WHICH ENABLES THE CHANGEOVER FROM THE SELECTIVE PRODUCTION OF IgA ANTIBODY TO THE PRODUCTION OF BOTH OF IgA AND IgG ANTIBODIES, AND TRANSNASAL/TRANSMUCOSAL VACCINE USING THE VEHICLE
EP1930025A4 (en) * 2005-08-05 2008-12-03 Univ Tokushima ANTIGEN-AND-ARZNEI VEHICLE FOR ENABLING THE CONVERSION FROM THE SELECTIVE PRODUCTION OF AN IGA ANTIBODY TO THE PRODUCTION OF IGA AND IGG ANTIBODIES AND TRANSNASAL / MUCOSAL VACCINE WITH THIS VEHICLE
WO2009123119A1 (ja) 2008-04-02 2009-10-08 国立大学法人徳島大学 合成ペプチドを含有する抗原薬物ビークルとこれを用いる粘膜ワクチン
US9402883B2 (en) 2009-01-30 2016-08-02 Alphareta Ab Compound and method for treatment of Alzheimer's disease
US8785390B2 (en) 2009-01-30 2014-07-22 Alphabeta Ab Methods for treatment of Alzheimer's disease
WO2010087771A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Alphabeta Ab Compound and method for treatment of alzheimer's disease
WO2010089940A1 (ja) * 2009-02-05 2010-08-12 国立大学法人大阪大学 粘膜ワクチン
US8785391B2 (en) 2010-06-24 2014-07-22 Alphabeta Ab Compound and method for treatment of alzheimer's disease and familial dementia
US9522170B2 (en) 2011-04-05 2016-12-20 Alphabeta Ab Methods of screening compounds for the fibril formation of Aβ peptides based on a decreased trimer/monomer ratio of a chaperone protein
WO2013031827A1 (ja) 2011-08-29 2013-03-07 国立大学法人徳島大学 Rsv粘膜ワクチン
US9463236B2 (en) 2011-08-29 2016-10-11 Tokushima University RSV mucosal vaccine
WO2020045155A1 (ja) 2018-08-30 2020-03-05 国立大学法人徳島大学 免疫寛容誘導剤及びアレルギー性疾患の治療又は予防剤
WO2021206103A1 (ja) * 2020-04-06 2021-10-14 応用酵素医学研究所株式会社 皮下投与型ワクチン

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