WO2005093483A1

WO2005093483A1 - 標本合焦位置高精度計測法

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Publication number: WO2005093483A1
Application number: PCT/JP2005/006231
Authority: WO
Inventors: Makio Tokunaga
Original assignee: Research Organization Of Information And Systems
Priority date: 2004-03-25
Filing date: 2005-03-24
Publication date: 2005-10-06
Also published as: JP2007225627A

Abstract

試料境界面からの全反射光を及び大きな照明角度からの反射光を用いることにより、透明試料等で低反射率の試料においても、強い反射光を得ることができる。試料境界面が高さ方向にΔz変化すると、反射光は、試料境界面内で横方向にΔxずれた位置から出てくると見なされる。このΔxを、試料位置計測用センサーで計測する。ΔzとΔxの間には、ΔX=2tanθ×Δzの関係があるので、入射角θを大きくすることにより、同じΔzの変化量に対しても、より大きなΔxの変化量を得ることができる。即ち、全反射による強い反射光強度とあわせ、より高精度でΔzを求めることができる。光源よりの入射光を対物レンズの辺縁部分の全反射領域を含む高開口数の領域に通すと、透明試料等も高精度で合焦位置および試料位置を計測でき、光照射等に弱い生物標本や低反射率の試料に対して合焦位置および合焦位置および試料高さ位置を高精度で計測できる標本位置高精度計測法を提供する。

Description

標本合焦位置高精度計《法技術分野，

本発明は光学顕微鏡あるい光を用いた計測装置の標本合焦位置高精度計測法に関し、特に、顕微鏡観察や対物レンズを用いた位置計測において、生物試料のように光照射等に弱い標本に対しても損傷を与えることなく、合焦位置および試料位置を高精度で計測することができ、透明試料等で低反射率の試料においても高精度で計測することができる標本合焦位置高精度計測法に関する。背景技術

従来、オートフォーカスや形状観察において、図 4のように、サンプルとして反射する試料あるいは散乱する試科に対物レンズを介して光を照射し、反射する可視光は結像レンズを介して C CDカスラで観察する。試料の深さ（高さ）方向位置を知る方法としては、対物レンズの片側からレーザー光を入射し、試料表面からの反射光をォ —トフオーカスの光センサーで検出する方法が用いられている。光センサー上に、反射光による試料表面の像を結像させ、光センサー上における反射光の位置変化や非対称な像のボケ方を利用して、試料の高さ位置の変ィヒを求める方法である。例えば、特開 2 0 0 2— 6 2 4 8 1号公報には、試料への照明光を光軸に関して片側のみにすると、反射光も片側のみとなる; め、試料の高さが変化すると、センサー上での反射光の位置もしくは像のボケ方が变化することを利用するものが開示されている。

このような従来の方法は、金属や半導体のように反射率の高い試料では、高精度で位置を計測することが可能であるが、生物試料ゃガラス表面のように低反射率の試料においてはマイクロメ一トル程度の精度しか得ることができなかった。

また、通常、標本の合焦位置を微細に調節した際、装置の機構的なドラフトや温度による変動により、試料の基準位置を操作者が目的とする位置に高精度で位置決めすることは至難の技であるというよりも不可能であつた。発明の開示

そこで、本発明は、顕微鏡観察や対物レンズを用いた位置計測において、生物試料のように光照射等に弱い標本に対しても損傷を与えることなく、透明試料等で低反射率の試料においても、焦点位置及び試料位置を高精度で計測することができ、試料の基準位置を操作者が目的とする位置に高精度で位置決めすることができる標本合焦位置高精度計測法を提供することを目的とするものである。

上記目的を達成するために、この出願の第 1の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサ一上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および、試料高さ位置を計測可能にした標本合焦位置高精度計測法である。

これにより、試料と支持基板（カバ一ガラス）との屈折率の違いから、臨界角以上の大きな角度で照明光を入射すると、試料境界面で全反射が起こる。また、臨界角以下でも臨界角近くなると反射光強度が急に強くなる。この全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、強い強度の反射光を得ることができ、位置計測用光センサ一に達する光の強度が強くなるため、高精度で、試料位置および合焦位置を計.測することができる。この出願の第 2の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源として、非干渉性（インコヒ一レント）光源 feしくは非干渉性ィヒおよび低干渉性化したコヒーレント光源を用い、この光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、より安定で高精度に合焦位置および試料位置を計測可能にした標本合焦位置高精度計測法である。

これにより、光源にレーザー光を照明光として用レ ^ると、干渉が生じ、位置計測にノイズゃドリフトをもたらし、計測精度が悪くなることが起こる。この場合に、非干渉性（インコヒレント）光源もしくは非干渉性ィヒおよび低干渉性ィヒしたコヒーレント光源を用いて、上記請求項 1に記載の試料合焦位置高精度計測法を行うと、より安定した高精度に位置計測を行うことができる。この出願の第 3の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察おょぴ位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサ一上に結像し、位置計測用光センサーからの出力を試料高さ位置の関数として求めておいて、試料位置を光センサーから計測し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置およぴ試料位置を計測可能にした標本合焦位置高精度計測法である。

これにより位置計測用光センサーからの出力を、試料位置の変化 Δ ζの関数として求めておくことにより、試料位置 Δ ζを光センサー出力から求めることができる。光センサー位置を試料境界面と共役な位置に置けば、試料境界面を基準点として試料位置を求めることができる。この出願の第 4の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測し、位置計測用結像レンズもしくは位置計測用光センサ一位置を光軸方向に動かして位置計測用光センサ一位置を試料境界面と共役な位置からずらすことにより、あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサー位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、試料上の異なる位置を合焦位置として求めることを可能にした標本合焦位置高精度計測法である。

これにより、結像レンズもしくは位置計測用光センサ一位置を光軸方向に動かして位置計測用光センサ一を試料境界面と共役な位置からずらすことにより、あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサ一位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、試料境界面と異なる位置を基準点として試料位置および合焦位置として求めることができる。この出願の第 5の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度での合焦位置および試料位置を計測可能にし、焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ、試料位置制御、対物レンズを経由して照明を行う薄層,斜光照明法や全反射照明法などの照明光制御に適用可能とした標本合焦位置高精度計測法である。これにより、焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合せ（オートフォ一カス）、試料位置制御を行うことができる。また、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明法では、試料位置を正確に知り制御することが、照明光制御に必須であり、これを実頊することができる。この出願の第 6の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサ一上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測可能にし、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、前記中間レンズ群のレンズ構成を換えることにより、異なる倍率の対物レンズにも簡単に対応可能にした標本合焦位置高精度計測法である。

これにより、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ辯を有し、中間レンズ群の有無により位置計測用光センサーと試料側との共役な位置團係が変わらないようにできる構成となっており、前記中間レンズ群のレンズ構成を換えることにより、異なる倍率の対物レンズを交換して用いる場合に、位置計測用光源ならびに位置計測用結像レンズと光センサー側に変更を加えることなく、異なる倍率の対物レンズにも簡単に対応可能にすることができる。異なる倍率即ち異なる焦点距離の対物レンズを用いると、対物レンズ側の光路が変化するが、中間レンズ構成の変更により対物レンズ側の光路の違いを吸収することができ、従って光源側ならびに結像レンズとセンサ一側の光路を同じままにすることができる。この出願の第 7の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、 .全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測可能にし、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることを可能にした標本合焦位置高精度計測法である。

これにより、対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、中間レンズ群の有無により位置計測用光センサーと試料側との共役な位置関係が変わらないようにできる構成となっており、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、位置計測用光源ならびに位置計測用結像レンズと光センサ一側に変更を加えることなく、試料境界面と異なる位置を基準点として試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることを可能にすることができる。試料観察の高さ位置を変更すると対物レンズ側の光路が変化し、これが合焦位置計測可能な範囲を制限するが、中間レンズの移動により対物レンズ側の光路の違いを吸収し、光源側ならびに詰像レンズとセンサー側の光路を同じままにすることができるため、試料観察の高さ置に関し、広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。この出願の第 8の発明は、対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測にぉレ ^て、光源より対物レンズ辺縁部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサ一上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を計測可能にし、焦点合わせの指定位置に連動して、位置計涯 ij用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かし、位置計測用光センサ一からの出力が目的の焦点位置に対応した値になるように、対物レンズと試料間位置を合わせて焦点合わせを行うことにより、高さに関し広い範囲で合焦位置計測を可能にする標本合焦位置高精度計測法である。

これにより、焦点合わせの指定高さ位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かし、位置計測用光センサ一からの出力が目的の焦^ ¾高さ位置に対応した値になるように、対物レンズと試料間距離を合わせて焦点合わせを行うことにより、高さ位置に関し広い範囲で合焦位置計測を可能にすることが可齄である。第 7の発明の方法では、中間レンズの移動を、合焦位置基準点の変更のたに行い、焦点合わせには連動させないが、この第 8の発明の方法では、中間レンズ ¾しくは結像レンズの位置を、焦点合わせの指定高さ位置に連動させるのが特徴である。このようにすると、位置計測用光の光路変動を常に最小化することができるた、光路の大きな変動による光路障碍を避けることができ、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能となる。図面の簡単な説明

図 1は本発明の標本合焦位置高精度計測の基本原理の説明図である。図 2は本発明の標本合焦位置高精度計測方法を実現する基本的な構成図であり、第 1〜第 3の実施例に対応する。図 3は焦点駆動機構の制御フロー図である。図 4は従来の試料の深さ（高さ）方向位置を計測する概要図である。図 5は試料境界面からの反射光強度の対物レンズへの光入射位置依存性のデータである。図 6は標本合焦位置高精度計測法の精度のデータである。図 7は第 4の実施例の標本合焦位置高精度計測方法を実現する構成図である。図 8は第 5の実施例の標本合焦位置高精度計測方法を実現する構成図である。図 9は第 6の実施例の標本合焦位置高精度計測方法を実現する構成図である。図 1 0は第 6の実施例の変形（焦点距離が長い）の標本合焦位置高精度計測方法を実頊する構成図である。図 1 1は第 7の実施例の標本合焦位置高精度計測方法を実頊する構成図である。図 1 2は第 8の実施例の焦点合わせ機構の制御フロー図である

発明を実施するための最良の形態

本発明は、対物レンズの高開口数の領域のみに光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で照射し、試料境界面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を、位置計測用光センサー上に結像し、試料境界面での全反射光を含む大きな照明角度からの反射光を利用して合焦位置および試料位置を高精度に安定に計測するものである。次に、本発明の実施形態を図面に基づいて説明する。図 1は、本発明の標本合焦位置高精度計測の基本原理の説明図である。

図 1において、光源よりの入射光と反射光との関係に注目する。試料境界面が高さ方向に△ z変化すると、反射光は試料境界面内で横方向に Δχずれた位置から出てくるとみなされる。このを試料位置計測用光センサーで計測する。この時 Δ ζと△ Xの間には次式（ 1 ) が成立する。

Ax = 2 X tan^ X Az (1 ) の関係があるので、入射角を大きくすることにより、同じ Δζの変化量に対しても、より大きな Δχの変化量を得ることができる。即ち、より高精度で Δζを求めることができる。従って、光源よりの入射光を対物レンズの辺縁部分の高開口数の領域に通す方が良い。そして、この理由から、透明試料等で低反射率の試料においても 10 0 nm以上の高精度で、合焦位置および試料位置を計測することができる。

また、全反射を用いると、弱い照明光を用いても十分な強度の反射光が得られ、試料側に透過する光がおおきく減少するため、生物試料のように光反射等に弱い標本に対しても損傷を与えることなく、合焦位置および試料位置を計測することができる。それ故、光源からの入射光を対物レンズの辺縁部分の高開口数の領域に通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射する必要がある。

図 5に、試料として水溶液（屈折率 1.33 ) 、力パーガラスとして光学ガラス（屈折率 1. 52) を用いた場合の、試料境界面からの反射光強度の対物レンズへの光入射位置依存性の結果を示す。図 5上図は、位置計測用センサー 9での反射光強度の実測値であり、対物レンズへの入射光の中心軸からの距離 dが 1.5mmより大きいところで、反射光が強くなることがわかる。下図は、上図に対応する反射率の理論計算値であり、実測値とよく一致している。本装置では入射光として直径約 lmm前後の光を用いているために、理論値よりも入射位置 dが少し小さいところで反射光強度の立ち上がりが見られる。

図 5より、臨界角を超えた全反射領域で反射光強度が著しく強いこと、全反射が起こって無くとも臨界角の手前で反射光の強い領域が存在することがわかる。この入射位置 dが大きい即ち境界面での入射角が大きく、反射光強度が大きい領域での、全反射光及び大きな照明角度からの反射光を、本発明の標本合焦位置高精度計測法では用いている。

この計測原理を適用した、本説明の標本合焦位置高精度計測方法を実現する構成を図 2を参照して、その作用を説明する。図 2は光源に近赤外狭指向性 LE Dもしくは低コヒーレンス性赤外発光素子を用い、位置計測センサーに 2分割フォトダイ才ードを用いた例を示す。

図 2において、 1は観察対象の試料、 2は近赤外狭指向性 L E Dである光源、 3 は照明用の集光レンズ、 4はダイクロイツクミラー、 5は対物レンズ、 6はオイル、 7はカバーガラス、 8は結像用レンズ、 9は 2分割フォトダイオードを用いた位置計測用光センサーである。

対物レンズは開口数が試料の屈折率を越える高開口数の 100倍油浸対物レンズからなる。試料 1は、対物レンズ 5の上方に位置される顕微鏡本体のステージ（図なし）に載置されたカバーガラス（ガラス基板） 7上にオイル 6を介在して配置されている。この場合、試料 1はオイル 6およびカバーガラス（ガラス基板） 7を介して対物レンズ 5の焦点位置に位置される。対物レンズは 1 0 0倍に限ることなく用いることができ、開口数の大きいものほど精度の良い結果が得られる。

位置計測用の照明光源としての近赤外狭指向性 LEDからの照明光は、照明用の集光レンズ 3を通り、ダイクロイツクミラー 4で直角に曲げられて、対物レンズ 5の辺縁部分の高開口数の領域を光が通り、全反射領域を含む大きな照明角度で試料 1を照射

0 する。

試料 1の表面から対物レンズ 5を通して戻ってくる反射光をダイクロイツクミラ一 4で直角に曲げられて、結像用のレンズ 8を介して位置計測用光センサー 9の上に結像する。光源とスリット 2、試料 1、位置計測用光センサ一 9をそれぞれ共役な位置になるように、レンズ 3、対物レンズ 5、結像レンズ 8を配置すれば、より良い計測結果が得られる。ここで図 1で説明した（1 ) に基づいて、試料境界面の高さ方向の変化量 Δ ζに対して、試料境界面内で横方向のずれ Δ χのより大きな変化量を得ることができ、より高精度で Δ ζを求めることができる。このように、試料 1の表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料位置を 1†：測することができる。また、光源 1にレーザー光を照明光として用いると、干渉が生じ、位置計測にノィズゃドリフトをもたらし、計測精度が悪くなることが起こる。この場合に、非干渉性 (インコヒーレント）光源もしくは非干渉性化および低干渉性化したコヒ一レント光源を用いて、上記の試料合焦位置高精度計測法を行うと、より安定で高精度に位置計測を行うことができる。

また、位置計測用光センサーからの出力を.試料位置の変化△ zの関数として求めておくことにより、試料位置△ zを光センサー出力から求めることができる。即ち、光センサ一位置を試料境界面と共役な位置に置けば、試料境界面を基準として試料位置を求めることができる。センサ一として直線状の多分割フォトダイオードゃフォトダィオードァレイなどの直線状光センサーを用いることにより、より広い△ zの範囲を計測することが可能である。

位置計測用光センサ一 2分割フォトダイオードを用いることにより、図 3の制御フ口一に示すように、位置計測用光センサ一 9の 2分割フォトダイオード 1 0 a、 1 0 bの差分出力を差分増幅器 1 1を用いて増幅し、試料位置信号として用いる。これを、薄層斜光照明法および全反射照明法を用いた蛍光顕微鏡 1 2に組み込まれた焦点駆動機構 1 3の制御信号に利用し、自動焦点を合わせ、試料位置制御、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明光制御に適用することができる。

試料 1の境界面を観察する場合には、位置計測用光センサ一 9を試料境界面と共役な位置に置く。境界面より深い位置を観察する場合には位置計測用光センサ一 9をその観察位置と共役な位置に置けば、その位置を基準として位置計測を行うことができる。即ち、結像レンズ 8もしくは光センサー 9の位置を光軸方向に動かし、光センサ一 9の位置を試料境界面と共役な位置からずらす。あるいは、 .前記結像レンズもしくは前記光センサ一位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、基準位置を変更することができる。試料境界面と異なる位置を観察する場合には、位置計測用光の光路が変化するので、位置計測用光源からの光の角度を調整すると良い結果が得られる。これにより、生物試料や透明試料で低反射率の試料においても、合焦位置および試料位置を 1 0 0 nm以上の高精度で計測することができる。

また、図 8に示す例のように、光源側のレンズ 3と結像レンズ 8を共通化し、 1個の結像レンズ 8より構成する場合には、結像レンズ 8の位置を変更することにより、光センサー 9の位置を光学的に試料境界面と共役な位置からずらし、試料境界面と異なる位置を基準点として試料位置および合焦位置を求めることができる。

また、中間レンズ群を用いる場合には、中間レンズ群の有無により位置計測用光センサ一と試料側との共役な位置関係が変わらないようにできる構成とする。無限遠補正光学系顕微鏡の場合の例として、図 9、図 1 0に示すように、試料の観察位置から出た光は対物レンズを通った後平行光となるが、中間レンズ 1 4で結像したのち、中間レンズ 1 5により平行光に戻る構成とする。

対物レンズ、中間レンズ 1 4、中間レンズ 1 5の焦点距離を各 f o b j、 f 1 4、 f 1 5とすると、中間レンズ 1 5下流の平行光の幅、すなわち中間レンズ 1 5よりも結像レンズ 8側での照明光と反射光の間隔は、 f o b j X f 1 5 / f 1 4に比例する。従って、異なる倍率の対物レンズすなわち異なる焦点距離； f o b jの対物レンズを用いる場合にも、 f o b j X f l 5 / f 1 4が同じになるように f 1 4と ί 1 5の組み合わせを選べば、対物レンズ側の光路の違いを中間レンズ群により吸収することができ、従つて光源 2側ならびに結像レンズ 8と光センサー 9側の光路を同じままにすることができる。

また、試料境界面と異なる位置を基準点として試料上の異なる高さ位置を合焦位置とし ~て求める場合に、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことにより、光センサー 9を光学的に試料境界面と共役な位置からずらし、光源 2側ならぴに洁像レンズ 8と光センサ一 9側に変更を加えることなく行うことができる。図 1 1 の例を用いて作用を説明すると、試料高さ位置の変更により、中間レンズ 1 4による像の位置、即ち中間レンズ 1 4と中間レンズ 1 5の間で光が交差する位置がずれる。その像位置の変化量と同じ距離だけ、中間レンズのいずれかを移動し中間レンズ 1 4 と中間レンズ 1 5間の距離を変更すれば、中間レンズ 1 5よりも光源 2と結像レンズ 8の側では、光路が試料高さ位置の変更前と同じとなる。

試料高さ位置を変更すると対物レンズ側の光路が変化し、これが合焦位置計測可能な範囲を制限するが、中間レンズの移動により対物レンズ側の光路の違いを吸収し、さらに、照明光と反射光の光路を光軸に関して対称に保つことができるため、試料観察の高さ位置に関し、広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。

また、焦点合わせの指定高さ位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かせば、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。図 11の例の場合には中間レンズ 14と中間レンズ 1 5間の距離を、図 8の例の場合には結像レンズ 8の位置を、高さ位置に連動して変更する。図 12の制御フローに示すように、顕微鏡の焦点合わせリングまたは制御ソフトウエアによる観察高さ位置の指定に対し、前記中間レンズまたは前記結像レンズを高さ位置に対応した位置に連動して動かす。位置計測用光センサーからの出力が目的の高さ位置に対応した値になるように、顕微鏡の焦点駆動機構をフィードパックして動かし、合焦させる。このようにすると、常に光路を光軸に関して対称に保ち光路の変動を最小ィ匕することができるため、光路の大きな変動による光路障碍を避けることができ、高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことができる。

また、合焦位置計測は、位置計測用光センサー上における像の拡大倍率に依存する。結像倍率が高ければ、分解能が高いが、計測可能な高さ位置範囲は狭くなる。結像レンズ 8の焦点距離を f imag eとすると、結像倍率は、（ f 14/f ob j ) X ( f imag e/f 15 ) で与えられる。即ち、

結像倍率 = (f image/f ob j ) X (f l4/f l 5) (2 ) である。必要とする分解能と計測範囲に応じて、対物レンズ、中間レンズ、結像レンズの焦点距離を選択して用いる。

また、生きている生物試料に対して光照射損傷の弱い近赤外光を位置計測用光源として用いており、光照射に弱い生きている生物試料に対しても損傷をほとんど与えることなく、試料位置を知ることができる。実施例 1

本発明の第 1の実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 2に示される装置において、光源 2として波長 8 3 0から 8 5 O nmの低コヒ一レンス性高輝度赤外発光素子、対物レンズ 5として開口数 1 · 4 5の油浸 1 0 0倍対物レンズ、ダイクロイツクミラ一4として蛍光観察用ダイクロイツクミラーで 8 3 0 -8 5 O nmの赤外光を反射するもの、結像レンズ 8として焦点距離 3 Ommのレンズ、位置計測用センサ一 9として 2分割 S iフォトダイオードより構成される。

図 6に、本発明の標本合焦位置高精度計測法による計測結果の精度ならびに試料温度に対する安定性の実測結果を示す。試料に冷水を加えたところ、試料温度は急激に 3 4. 5度まで冷え、その後 3 6度台まで回復したが、これに伴い、機械的な試料高さ位置計測では温度ドリフトにより最大 5マイクロメ一トルまで表示が変化した。しかしながら、本装置では、冷却直後の瞬間を除き、どの時間においてもプラスマイナス 3 O nm ( 0. 0 3マイクロメートル）いないの高精度で、試料の高さ位置を計測でき、合焦位置を保持できている。実施例 2

本発明の第 2の実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 2に示される装置において、結像レンズ 8として焦点距離 1 5 mniのレンズを用い、他は第 1の実施例と同じ構成である。結像レンズ 8の焦点距離を 1 5 mmとすると、焦点距離 3 0 mmの場合と比べ、位置計測用センサ一 9上での像の倍率が半分となる。その結果、合焦位置計測の精度は約半分に落ちるが、計測可能な高さ位置の範囲が広くなる。実施例 3

本発明の第 3の実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 2に示される装置において、位置計測用センサー 9としてリニア 8分割フォトダイオードを用い、他は第 1の実施例と同じ構成である。リニア 8分割フォトダイオードは、分割されたフォトダイオードが直線上に並んだものである。試料上の異なる高さ位置を観察する場合に、反射光が変化する方向に分割フォトダイオードを並べることにより、高さ位置に関し、より広い範囲で計測が可能となる。この場合に計測範囲を限定するものは、試料高さ位置が変わる際の光路変動による光路障碍に起因する。実施例 4

本発明の第 4の実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 7に示される装置より構成される。図 2に示される装置において、第 1の実施例では光を光源 2側で光路を曲げるのに対し、本実施例では、反射光側の結像レンズ 8と位置計測用センサー 9の側で、光を反射させ光路を曲げている。第 1の実施例のものと同等の効果がある。実施例 5

本発明の第 5の実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 8に示される装置より構成される。図 2に示される装置における、結像レンズ 8と光源側のレンズ 3とを共通化し、 1個の結像レンズ 8より構成する。光源 2側ならびに位置計測用センサー 9側の両方の光路が直角とは異なる角度で配置されるが、試料の高さ位置が変化した際に、光路の変ィヒが光軸に鬨して対称となり、高さ位置に関する計測範囲が広くなる。結像レンズ 8を光軸方向に変化させることにより、位置計測用光センサ一位置を試料境界面と共役な位置からずらすことができ、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることができる。実施例 6 本発明の第 6の実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 9に示される装置より構成される。図 2に示される装置に、中間レンズ 14と中間レンズ 15とを加えた構成となっている。試料の観察位置から出た光は対物レンズを通った後、平行光となるが、中間レンズ 14で結像したのち、中間レンズ 15により平行光に戻る配置となっている。図では 100倍対物レンズを用いる場合で、中間レンズ 14として焦点距離 3 0mm. 中間レンズ 15として焦点距離 3 Ommのレンズを用いている。図 10に示すように、異なる対物レンズ（図 9より低倍の対物レンズ）を用いる場合には、中間レンズの組み合わせを変更するのみで、他の光学系には何らの変更を加えることなく、簡単に対応することができるものであり、 60.倍対物レンズを用いる場合で、中間レンズ 14として焦点距離 30X 100/60 mm= 50 mm, 中間レンズ 15として焦点距離 3 Oirniiのレンズを用いている。対物レンズ、中間レンズ 1 4、中間レンズ 15の焦点距離を各 ί ot) j、 f l4、 f 15として、 f ob j X i 15/f 14が同じであれば、、他の組み合わせでも良い。

このようにすれば、対物レンズの違いによる光路の違いを中間レンズ群で吸収することができ、光源 2側ならびに、結像レンズ 8と位置計測用センサー 9側は、図 9と全く同じ構成のままで計測を行うことができる。実施例 7

本発明の第 Ίの実施例の標本合焦位置高精度計測法は、図 11に示される装置より構成される。図 2に示される装置に、中間レンズ 14と中間レンズ 15とを加えた構成となっている。試料の観察位置から出た光は対物レンズを通った後、平行光となるが、中間レンズ 14で結像したのち、中間レンズ 15により平行光に戻る配置となつ

7 ている。

試料上の異なる高さ位置を観察する場合には、中間レンズ 1 4と 1 5間の距離を変えることにより、位置計測用光センサ一位置を試料境界面と共役な位置からずらすことができ、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることができる。図 1 1では中間レンズ 1 5の位置を変えているが、中間レンズ 1 4の位置を変えても良い。試料観察の高さ位置を変更すると、対物レンズ側の光路が変化し、これが合焦位置計測可能な範囲を制限するが、中間レンズ 1 5の移動により対物レンズ側の光路の違いを吸収し、光源 2側ならびに結像レンズ 8と位置計測用センサ一 9側の光路を同じままにすることができるため、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。実施例 8

本発明の第 8実施例の標本合焦位置高精度計測法は、第 7の実施例の図 1 1に示される装置と、図 1 2に示される焦点合わせ機構とより構成される。

顕微鏡の焦点合わせリングまたは焦点制御ソフトウエアによる観察高さ位置の指定に対し、中間レンズ 1 4もしくは 1 5の位置を観察高さ位置の対応する位置に連動させる。位置計測用光センサ一からの出力が目的の焦点位置に対応した値になるように、顕微鏡の焦点駆動機構をフィードパックして駆動し、合焦させる。

顕微鏡で試料深さ方向の異なった位置を観察する場合には、試料と対物レンズ間の距離を変える。従って、試料観察の高さ位置と、試料と対物レンズ間距離を対応させて考えるのが、顕微鏡法でこれまで一貫して行われてきた方法である。

これに対し、この実施例の方法では、試料観察の高さ位置の変更に対しては、位置計測用中間レンズまたは結像レンズの位置の変更をもって対応させる。しかる後、位置計測用光センサ一からの出力が目的の焦点位置に対応した値になるように、試料と対物レンズ間の距離を変えて焦点合わせを行う。

このようにすると、位置計測用光の光路の変動を常に最小化することができるため、光路の大きな変動による光路障碍を避けることができ、試料観察の高さ位置に関し、より広い範囲で合焦位置計測を行うことが可能である。産業上の利用可能性

本発明の標本合焦位置高精度計彻 J法は顕微鏡観察や対物レンズを用いた位置計測に適用できる。また、蛍光顕微鏡、フォトトンネル顕微鏡あるいは光を利用した計測装置にも利用でき、焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ（オートフォーカス）、試料位置制御を行うことができる。

る。

Claims

請求の範囲

1 . 対物レンズを用いた顕微鏡観察および位置計測において、光源より対物レンズ辺緑部分の高開口数の領域に光を通し、全反射領域を含む大きな照明角度で試料を照射し、試料表面から対物レンズを通して戻ってくる反射光を位置計測用光センサー上に結像し、試料表面での全反射光及び大きな照明角度からの反射光を利用することにより、透明試料等で低反射率の試料においても、高精度で合焦位置および試料高さ位置を計測可能にしたことを特徴とする標本合焦位置高精度計測法

2. 前記光源として非干渉性（インコヒ一レント）光源もしく.は非干渉性化および低干渉性化したコヒ一レント光源を用い、より安定で高精度に位置計測を行うことを特徴とする請求項 1に記載の標本合焦位置高精度計測法。

3 . 位置計測用光センサ一からの出力を、試料高さ位置の関数として求めておくことにより、試料位置を光センサ一から計測することを特徴とする請求項 1に記載の標本合焦位置高精度計測法。

4. 位置計測用結像レンズもしくは位置計測用光センサ一位置を光軸方向に動かして位置計測用光センサ一位置を試料境界面と共役な位置からずらすことにより、あるいは、前記結像レンズもしくは前記光センサー位置を光軸と垂直な方向に動かすことにより、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることを特徴とする請求項 1に記載の標本合焦位置高精度計測法。

5 . 焦点駆動機構と組み合わせることにより、自動焦点合わせ、試料位置制御、対物レンズを経由して照明を行う薄層斜光照明法や全反射照明法などの照明光制御に適用可能としたことを,特徴とする請求項 1記載の標本合焦位置高精度計測法。

. 対物レンズと位置計測用結像レンズの間に中間レンズ群を有し、前記中間レンズ群のレンズ構成を換えることにより、異なる倍率の対物レンズにも簡単に対応可能であることを特徴とする請求項 1に記載の標本合焦位置高精度計測法。

. 対物レンズと位置計測用結像レンズの間に間レンズ群を有し、前記中間レンズ群のうちの一部のレンズ位置を動かすことこより、試料上の異なる高さ位置を合焦位置として求めることを可能にする請求項 1に記載の標本合焦位置高精度計測法。

- 焦点合わせの指定高さ位置に連動して、位置計測用中間レンズもしくは位置計測用結像レンズを動かし、位置計測用光センサ一からの出力が目的の焦点高さ位置に対応した値になるように、対物レンズと試料間距離を合わせて焦点合わせを行うことにより、高さ位置に関し広い範囲で合焦位置計測を可能にすることを特徴とする請求項 1に記載の標本合焦位置高精度計測法。

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