WO2005079859A1 - 標的指向性運搬体 - Google Patents

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WO2005079859A1
WO2005079859A1 PCT/JP2004/012663 JP2004012663W WO2005079859A1 WO 2005079859 A1 WO2005079859 A1 WO 2005079859A1 JP 2004012663 W JP2004012663 W JP 2004012663W WO 2005079859 A1 WO2005079859 A1 WO 2005079859A1
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WO
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amino acid
acid sequence
domain
targeting
protein
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Application number
PCT/JP2004/012663
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kiyotoshi Sekiguchi
Yuya Sato
Original Assignee
Osaka University
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Publication date
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/6425—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the peptide or protein in the drug conjugate being a receptor, e.g. CD4, a cell surface antigen, i.e. not a peptide ligand targeting the antigen, or a cell surface determinant, i.e. a part of the surface of a cell

Definitions

  • DDS drug delivery system
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-178897 discloses a cell adhesion domain sequence of fibronectin (FN), one of extracellular matrix components, and basic fibroblasts.
  • a functional polypeptide hybridized with a growth factor (bFGF) has been disclosed.
  • bFGF growth factor
  • TGF-j3 transforming growth factor i3
  • Collagen targeting TGF-j3 has been reported (Tuan et al., Connective Tissue Research, Vol. 34, No. 1, 1-9 M (19% zo; Han et al., Protein Expression and Purification> Vol.
  • La'minin (LN) a type of protein that makes up the basement membrane, is a heterotrimeric glycoprotein composed of the j, j3, and y chains. Because of its constant presence in the basement membrane, laminin is thought to play an important role in controlling tissue homeostasis and organogenesis. To date, five ⁇ , three, and three ⁇ chains have been identified, and these combinations have been shown to constitute at least 14 different laminin isoforms (Miner , JH, and Patton, BL (1999) Int J Biochem Cell Biol 31, 811-816). As shown in Fig. 2A, laminin is roughly classified into five types depending on the type of a chain.
  • (3 ⁇ 4 1-chain laminin (al-chain laminin: ⁇ 1-chain 1 ⁇ ) is expressed only in tissues at the developmental stage, and is considered to be essential for embryonic stem cell differentiation and matrix association.
  • Laminin having ⁇ 2 chain (Laminin with 2 chains: ⁇ 2 chain) (LN) is mainly expressed in skeletal and cardiac muscle and is required for muscle cell survival (Kuang, W., Xu, H., Vachon, PH, Liu, L., Loechel, F., Wewer , UM, and Engvall, E.
  • Laminin with ⁇ 4 chain ( ⁇ 4 chain laminin: ⁇ 4 chain LN) is mainly localized in blood vessels and is required for capillary maturation (Thyboll, J., Kortesmaa, J., Cao, R , Soininen, R., Wang, L., Iivanainen, A., Sorokin, L., Risling, M., Cao, Y., and Tryggvason, K. (2002) Mol Cell Biol 22, 1194-1202).
  • Laminin (LN), type IV collagen, nidogen, perlecan, etc. are basement membrane constituent proteins that are constitutively expressed in any basement membrane regardless of the type of cells or tissues. Recent studies have revealed that the basement membrane contains many other proteins that are expressed in a tissue-specific and developmental stage-specific manner.
  • Nephronectin is composed of an RGD (Arg-Gly-Asp) sequence (cell adhesion motif) required for integrin binding, as well as five EGF-like repeats and a MAM domain (see Figure 4. ( ⁇ ) consists of the area excluding the FLAG tag in the ⁇ ⁇ -FLAGJ shown here.) Nephronectin is localized in the basement membrane and coexists with the 8j8 1 integrin, which strongly suggests that it is involved in kidney formation via binding to integrin.
  • MAEG (gate- and -containing gene) protein is also known as a protein expressed in the basement membrane in a tissue-specific and developmental stage-specific manner. It is a protein with a very similar molecular structure to nephronectin, such as having a MAM domain like nephronectin, which also shows limited localization. MAEG is specifically present in the developing follicular basement membrane, and its expression matures the follicle (Nagata, et al., Unpublished due to submission)
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structures of the basement membrane and the stromal matrix.
  • FIG. 2A is a table showing the types of laminin isoforms and their tissue specificity
  • FIG. 2B is a schematic diagram showing the structure of laminin.
  • Figure 3 shows the expression diameter of the laminin subunit gene knockout mouse! : It is a figure showing the relationship with a contagious disease.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the domain structure of recombinant nephronectin (NN) and its deletion mutants ( ⁇ - ⁇ MAM-FLAG, NN-RGD-FLAG, and -MAM-FLAG).
  • ⁇ -FLAGJ the region between the EGF-like repeat sequence and the MAM domain is a part of the RGD linker (in “ ⁇ ⁇ - ⁇ -FLAG”, the region between the EGF-like repeat sequence and the FLAG tag)
  • NN-RGD-FLAGJ the region between the signal peptide and the FLAG tag is a part of the RGD linker.
  • the part of the RGD linker has many O bonds “Marauder-FLAGJ is full-length nephronectin with FLAG,” “-MAM-FULGJ is full-length nephronectin with FLAG lacking the MAM domain, and“ ⁇ -RGD-FLAG ”is the RGD linker with FLAG.
  • Partial and “NN-MAM-FLAGJ indicates a MAM domain with FLAG.
  • ⁇ Fig. 5 shows the purified full-length NN-FLAG (shown as NN in Fig. A), ⁇ - ⁇ -FLAG [Fig. A, shown as ⁇ ), NN-RGD-FLAG (shown as RGD in Figure B), and NN-MA An electrophoresis image (15% gel) of M-F to AG (indicated as MAM in Fig. B)
  • the right side shows the CBB (Coomass ie Brill iant) after electrophoresis.
  • Blue R-250 shows the results of staining
  • the left side shows the results of immunoblotting using an anti-FLAG M2 monoclonal antibody after electrophoresis.
  • Fig. 6 is an electron micrograph image diagram (A, B) and a diagram (C) showing the molecular structure of NN deduced from nephronectin (band) stained negatively in Experimental Example 1 (A, B).
  • Triangles (V) indicate NN monomers
  • arrows indicate NN multimers
  • scale par indicates lOOnm
  • left and right in Figure B triangles (V) in Figure A Is a high magnification image of One is lOOnm).
  • FIG. 7 shows that, in Experimental Example 2, full length NN-FLAG (NN: FIG. A), ⁇ - ⁇ MAM-FLAG ( ⁇ : FIG. ⁇ ), NN-RGD-FLAG (RGD: FIG. C), and NN-MAM-
  • FIG. 4 is a view showing the results of examining the adhesiveness of KA8 cells (leukemia cells stably expressing integrin ⁇ 8 chain) to FLAG (MAM: FIG. D) and cell expansion.
  • FIG. 8 shows that various basement membrane proteins [laminin (LN-1, LN-2 / 4, LN-5, LN-8, LN-10 / 11), fibronectin (FN), vitronectin (VN
  • FIG. 7 shows the results of an investigation on the binding of nephronectin (band-FLAG) to collagen types I, II, IV and V].
  • FIG. 3 is a view showing the results of a study performed by co-immunoprecipitation atsie using the above method.
  • Figure 10 shows the binding of NN to laminin (LN-8), laminin (LN-10 / 11), and fibronectin (FN) using 10 mM EDTA, 0.5 M NaCl, or 1 ⁇ g /
  • FIG. 4 shows the results of evaluation by solid-phase binding assay in the presence of heparin and in the absence of these (control).
  • Figure 11 shows the laminin of nef, lonectin (full length) (NN-FLAG) and its deletion mutants ( ⁇ - ⁇ -FLAG, NN-RGD-FLAG, and ⁇ -MAM-FLAG) in Experimental Example 4.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating the binding activity to (LN-10 / 11) by solid-phase binding assay.
  • Fig. 12 shows the results of a study on the binding of Nef-mouth nectin (full length) (NN-FLAG) and its mutant mutant (NN-MAM-FLAG) to the basement membrane of adult mouse kidney in Experimental Example 5. It is.
  • Figure A is the result of the FLAG
  • Figure B is the result of the ⁇ -MAM-FLAG
  • Figure C is the control (no-probe).
  • Figure 13A shows the binding of GST fusion protein (GST-MAEG-MAM) to various laminins (LN-1, LN-2 / 4, LN-5, LN-8, LN-10 / 11).
  • Fig. B shows the results of examining the binding of the GST fusion protein (GST-Mai-MAM) to various laminins (same as above) (Experimental Example 6).
  • FIG. 5 is a view showing the results of examining the binding activity to a protein-deficient mutant (LN-10AG).
  • FIG. 15 is a diagram showing the results of examining the localization of NN and LN- ⁇ 5 chain in the kidney tissue of a mouse by immunohistochemical staining in Experimental Example 8 (the original is a color diagram).
  • FIG ⁇ is the result immunized stained with anti-POEM / nephronectin antibody (anti-NN antibody),
  • Figure B shows the result of immunostaining with anti-LN-a 5 chain antiserum (anti-LN- a 5 antibody).
  • Arrows indicate renal glomeruli. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a carrier comprising a polypeptide having a specific binding activity to a basement membrane protein specifically present in various tissues or a gene encoding the same, comprising:
  • An object of the present invention is to provide a targeting carrier that can selectively transport a desired drug (for example, a bioactive peptide or a gene encoding the same) to a tissue. More specifically, the present invention selectively binds to various types of laminin present in various tissues, and selectively binds the target substance or tissue expressing laminin based on its properties.
  • An object of the present invention is to provide a transporter having a tissue-directivity (target-directed transporter) capable of transporting or combining the same.
  • a desired drug for example, a bioactive peptide or a gene encoding the same
  • the drug is conjugated with the carrier (for example, a bioactive peptide complex or a bioactive peptide gene complex).
  • the present invention also aims to provide such a system.
  • LN- 10/11 (a5j31 / 2 7 D and LN - in 8 (a4j31y 1) Binds selectively but does not bind to LN-2 / 4 (a2j3 I / 27I), which has the same chain and ⁇ chain as LN-10 / 11 and LN-8, so that nephronectin ( ⁇ ) (See Experimental Example 3 and Figure 8 below.) Furthermore, the present inventors have found that nephronectin and these laminin isoforms bind to each other.
  • LN-8 (having four chains) is specifically localized in capillaries and new blood vessels among blood vessels.
  • LN-10 and LN-11 are specifically localized in thick blood vessels (large vessels), kidney, lung and knee tissue among blood vessels.
  • LN-5 (having three chains), in which the MAEG protein and its ⁇ and ⁇ domains exhibit selective binding, is specifically localized in skin (epidermis), hair follicles and lung tissues.
  • nephronectin or its ⁇ domain and MAEG protein or its ⁇ domain exhibit tissue-specific target targeting based on its specific laminin binding (see below).
  • tissue-specific target targeting based on its specific laminin binding
  • a useful drug for example, a physiologically active peptide or its gene
  • the present invention includes the following embodiments;
  • MAM domain (meprin, 5A protein, receptor protein-tyrosine phosphatase ⁇ -domain) or a polypeptide having a portion thereof, or a gene encoding a MAM domain or a polypeptide having a portion thereof
  • a nucleic acid which is a targeting carrier used to bind a desired substance and transport the substance to a target tissue.
  • Item 2 The targeting carrier according to Item 1, wherein the MAM domain has the amino acid sequence of (a) or (b);
  • Item 3 The targeting carrier according to Item 2, wherein the (b) force is an amino acid sequence having at least 90% identity to the amino acid sequence of the MAM domain of nephronectin shown in SEQ ID NO: 1.
  • Item 4 The targeting carrier according to Item 2 or 3, wherein (b) is the amino acid sequence of the MAM domain of human-derived nephronectin.
  • Item 5 The targeting according to any one of Items 2 to 4, wherein (b) 1 is an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 37 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto. Sex carrier.
  • Item 6 The targeting carrier according to claim 1, wherein the polypeptide having the ⁇ domain has the amino acid sequence of (c) or (d);
  • Item 7 The targeting carrier according to Item 6, wherein the (d) 1 is an amino acid sequence having at least 75% identity to the amino acid sequence of nephronectin shown in SEQ ID NO: 17 or 19.
  • Item 8 The targeting carrier according to Item 6 or 7, which is the amino acid sequence of nephronectin derived from (d) I human.
  • Item 9 Force Targeting according to any one of Items 6 to 8, which is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 53 or an amino acid sequence having at least 90% or more identity thereto. Sex carrier.
  • Item 10 The targeting carrier according to Item 1, wherein the nucleic acid having the gene encoding the MAM domain has the nucleotide sequence of (A) or (B);
  • (b) 80% or more, preferably 85% or more, more preferably Preferably, it is a nucleotide sequence having 90% or more identity, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence has a binding property to laminin 4 chain or ⁇ 5 chain.
  • Item 1 The target-directing carrier according to Item 10, which is the nucleotide sequence of the gene encoding the ⁇ domain of nephronectin derived from the power human ( ⁇ ⁇ ).
  • Item 1 3. The targeting carrier according to Item 1, wherein the nucleic acid having the gene encoding the ⁇ domain has the nucleotide sequence of (C) or (D);
  • nucleotide sequence having an identity of 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more with respect to the above nucleotide sequence, and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is Laminin binds to 4 or 5 chains.
  • Item 14 The targeting carrier according to Item 13, which is a base sequence of the gene encoding nephronectin derived from (D) 1S human.
  • Item 1 5. The targeting according to Item 13 or 14, wherein (D) the force is the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 54 or a nucleotide sequence having at least 90% or more identity thereto. Sex carrier.
  • Item 1 6.
  • Item 17 The targeting carrier according to Item 1, wherein the ⁇ domain has the amino acid sequence of (e) or (f);
  • Item 19 The targeting carrier according to Item 17 or 18, wherein (f) is the amino acid sequence of the MAM domain of the human-derived MAEG protein.
  • Item 20 The (f) force S, an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 39, or an amino acid sequence having at least 90% or more identity thereto, according to any one of Items 17 to 19, Targeting vehicles.
  • Item 21 The targeting carrier according to Item 1, wherein the polypeptide having a MAM domain has the amino acid sequence of (g) or (h);
  • Item 22 The targeting carrier according to Item 21, wherein the (h) force S is an amino acid sequence having at least 70% identity to the amino acid sequence of the MAEG protein shown in SEQ ID NO: 21.
  • Item 23 The targeting carrier according to Item 21 or 22, wherein (h) is the amino acid sequence of a human-derived MAEG protein.
  • Item 24 (h) Force The target-directed transport according to any one of Items 21 to 23, which is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 55 or an amino acid sequence having at least 90% or more identity thereto. body.
  • Item 25 The targeting carrier according to Item 1, wherein the nucleic acid having the gene encoding the MAM domain has the nucleotide sequence of (E) or (F); (E) SEQ ID NO: 4, The nucleotide sequence of the gene encoding the MAM domain of the MAEG protein,
  • (F) a base sequence having an identity of 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more with respect to the above base sequence, and the amino acid sequence encoded by the base sequence is It has binding properties to laminin chain.
  • Item 28 The targeting carrier according to Item 1, wherein the nucleic acid having the gene encoding the MAM domain has the nucleotide sequence of (G) or (H);
  • (H) a base sequence having an identity of 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more with respect to the above base sequence, and the amino acid sequence encoded by the base sequence is Those that have a 1 "bond to the laminin ⁇ 3 chain.
  • Item 29 The target-directing carrier according to Item 28, which is the base sequence of the gene encoding the MAEG protein derived from human (II).
  • Item 31 The targeting carrier according to any one of claims 17 to 30, wherein the carrier has directivity to a hair follicle, skin (epidermal), or lung.
  • Item 32 The targeting carrier according to any one of Items 1 to 31, which is in the form of an expression vector.
  • Item 33 A targeting drug conjugate obtained by binding a drug for transport to a target tissue to the targeting carrier according to any one of Items 1 to 31.
  • the target-targeting drug conjugate has a polypeptide form obtained by binding a peptide or protein drug or a polynucleotide form obtained by binding a nucleic acid (including a gene) drug 34.
  • the targeting drug conjugate of claim 33 which is:
  • Item 35 A pharmaceutical composition comprising the targeting conjugate described in Item 33 or 34 as an active ingredient.
  • Item 36 A drug delivery system or targeting therapy, comprising using the targeting drug conjugate according to Item 33 or 34 as the targeting drug.
  • a desired substance of a MAM domain or a polypeptide partially having the same or a nucleic acid having a gene encoding a polypeptide partially containing the MAM domain is bound to a desired substance to bind the substance.
  • Item 38 Use of the targeting carrier according to any one of Items 1 to 32 for the preparation of a targeting drug conjugate to which a drug for transport to a target tissue is bound. .
  • Item 39 A drug is locally transported to a target tissue or cell of a targeting drug conjugate in which a drug is bound to the targeting carrier described in any one of Items 1 to 32. Use in drug delivery systems or targeting therapies to treat.
  • laminin is a major constituent protein of the basement membrane that exhibits tissue-specific and development-stage-specific expression based on its chain.
  • the present invention has a property of selectively recognizing and specifically binding to such a tissue-specifically expressed laminin ⁇ -chain, and therefore has a target-directing carrier having directivity to a target tissue. Is provided.
  • the targeting carrier of the present invention is a ⁇ domain or a polypeptide having a part thereof, which is used for binding a desired drug and transporting the drug to a target tissue.
  • Targeted carriers are included.
  • the ⁇ domain is an abbreviation of “meprin, A5 protein, receptor protein-tyrosine phosphatase ⁇ -domain (mephrin, octa white, receptor-type protein tyrosine dephosphorylation enzyme mu domain)”.
  • Nephronectin, MAEG protein for humans ("Genomics 62, p. 304-307, 1999", for mice “Genomics 65, p. 1623, 2000"), Meprin and meprin ⁇ (The Journal of Biochemistry, Vol. 276, No. 25, p. 23207-23211, 2001), neuropilin 1 and neuroporin 1 (Neuron, Vol. 21, p. 1283-1290, 1998), RPTP (Receptor Protein-Tyrosine)
  • Phosphatase ⁇ and RPTP ⁇ are both proteins having a MAM domain in common (Beckmann, G., and Bork, P. Trends in Biochemical Science Vol. 18, 1993, p. 40-41).
  • the MAM domain is said to be required for the interaction between MAM domains and for the formation of dimers and multimers for mepulin, neuropilin (A5 protein and neuropilin are synonymous), RPTP / z, etc.
  • detailed functions are not known.
  • SEQ ID NO: 1 for the amino acid sequence
  • SEQ ID NO: 3 for the amino acid sequence of the MAM domain of the MAEG protein
  • SEQ ID NO: 5 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the amino acid sequence of the MAM domain of meplin
  • SEQ ID NO: 7 for the
  • amino acid sequence of the MAM domain described herein is derived from a mouse, one example of which is a species similar to or similar to the species from which the sequence is derived (for example, a species belonging to a mammal, Preferable examples include amino acid sequences of MAM domain of various proteins derived from human).
  • the following table shows the relationship between the amino acid sequences of various MAM domains derived from the mouse and the amino acid sequences of various MAM domains derived from human.
  • amino acid sequence identity is based on the homology search engine of GENETIX-Mac ver. 12.2.4 of Genetics, Inc. gene analysis software [The amino acid sequence described below and The same applies to the identity (homology) of nucleotide sequences. ].
  • MAM domain is identical to human sequence of mouse human and protein derived from mouse Amino acid sequence Amino acid sequence Sequence identity Nephronectin SEQ. NO. 1 SEQ. NO. 37 99.3%
  • Neuropilin 1 SEQ. NO. 9 SEQ. NO. 45 96.4%
  • Neuropilin 2 SEQ. NO. 11 SEQ. NO. 47 89.5%
  • MAM domain of the MAEG protein Mention may be made of the MAM domain of the MAEG protein.
  • SEQ ID NO: 1 shows the amino acid sequence of the MAM domain of nephronectin derived from mouse.
  • the MAM domain of the targeting carrier of the present invention is not limited to this, and may be, for example, an equivalent having homology to the amino acid sequence of the MAM domain.
  • Such an equivalent has an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and has a binding property to laminin sp 4 or 5 chains.
  • Those having an amino acid sequence can be mentioned.
  • the homology range is as follows: the amino acid sequence has an equivalence of 80% or more, preferably 85% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more with respect to SEQ ID NO: 1.
  • the MAM domain of human-derived nephronectin has an identity of 90% or more, preferably 95% or more, to SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence IJ of the MAM domain of mouse-derived nephronectin). Can be mentioned.
  • SEQ ID NO: 37 The MAM domain of human nephronectin shown in the above table (SEQ ID NO: 37) is one example.
  • the binding of laminin to the ⁇ 4 or ⁇ 5 chain was determined by the solid-phase binding assay (enzyme-linked immunosorbent assay) described in Experimental Example 3 (1) or the immunoassay described in Experimental Example 3 (2). Sedimentation assay (enzyme-linked immunosorbent assay), etc. It can be evaluated using a method known to those skilled in the art.
  • SEQ ID NO: 3 shows the amino acid sequence of the MAM domain of the MAEG protein derived from mouse.
  • the MAM domain of the targeting carrier of the present invention is not limited to this, and may be, for example, an equivalent having homology to the amino acid sequence of the MAM domain.
  • Such equivalents include an amino acid having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in which one or more amino acids have been deleted, replaced or added, and which has binding property to laminin 3 chain. Those having a sequence can be mentioned.
  • the range of homology is a range in which the amino acid sequence has an equivalence of 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, and still more preferably 85% or more with SEQ ID NO: 3. Can be mentioned.
  • the MAM domain of the human-derived MAEG protein has an identity of 80% or more, preferably 85% or more with SEQ ID NO: 3 (amino acid sequence IJ of the MAM domain of the mouse-derived MAEG protein). Can be mentioned.
  • Specific examples include the MAM domain (SEQ ID NO: 39) of the human-derived MAEG protein shown in the above table.
  • the binding of laminin to the three chains was determined by the solid-phase binding assay (enzyme-linked immunosorbent assay) described in Experimental Example 3 (1) or the co-immunoprecipitation assay described in Experimental Example 3 (2). It can be evaluated using a method known to those skilled in the art, such as an enzyme-linked immunosorbent assay.
  • the target directing carrier of the present invention may be composed of a polypeptide partially having a MAM domain.
  • a polypeptide include a wide range of polypeptides partially containing a MAM domain, as long as the effects of the present invention are not impaired.
  • a full-length protein of nephronectin, a MAM domain of nephronectin, Conjugate with RGD linker site, Nef-mouth Nectin MAM domain and EGF domain or its repetitive sequence, MAEG protein, meprin, meplin ⁇ , neuropilin 1, new-mouth pilin 2, RPTP ⁇ , and ⁇ RPTP i can be exemplified.
  • the sequence of the nephronectin equivalent derived from human is described in “Journal of Biological Chemistry, Vol. 276, No. 45, pp. 42172-42181, 2001”, MA EG protein (also referred to as EGFL6 in human). ) Is “thigh_015507”, the sequence of meplin ⁇ is “Marauder-005588 (Genbank accesion Number, the same applies hereinafter)”, the sequence of mepulin is “ ⁇ —005925”, and the sequence of neuropilin 1 is “ Marauder—003873 ”, the sequence of neuropilin 2 is“ AF281074 ”, and the sequence of R ⁇ is
  • Preferred polypeptides having a MAM domain in part include nephronectin (full length) and MAEG protein.
  • nephronectin derived from mouse has a short form consisting of 561 amino acids and a long form consisting of 609 amino acids by alternative splicing (The Journal of Cell Biology, Vol. 154, No. 2, 2001, 447-458).
  • the amino acid sequence of short form nephronectin (mouse) is shown in SEQ ID NO: 17, and the amino acid sequence of long form nephronectin (mouse) is shown in SEQ ID NO: 19.
  • nephronectin has a “MAM domain” in its 420-561 amino acid region (in order from the N-terminus, “signal peptide”-19aa) and “EGF repeat sequence” (“ EGF-like domain 1 ”(57-88aa),“ EGF-like domain 2 ”(89_127aa),“ EGF-like domain 3 ”(128-168aa),“ EGF-like domain 4 ”(169-212aa),
  • EGF-like domain 5 (213-253aa)
  • RGD linker partial site (254_419aa)
  • MAM domain (420-561aa)
  • long form nephronectin mouse
  • M AM domain long form nephronectin
  • the polypeptide possessed by the targeting carrier of the present invention is not limited thereto, and may be, for example, an equivalent having homology to the amino acid sequence of nephronectin derived from the mouse.
  • human-derived nephronectin those having an identity of 75% or more, preferably 80% or more with respect to SEQ ID NO: 17 [mouse-derived nephronectin (short form) amino acid sequence] can be used. Can be listed.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 53 is the amino acid sequence of nephronectin derived from human which is currently reported.
  • the nephronectin has an identity of 80% or more (more specifically, 82.6%) to mouse-derived nephronectin (SEQ ID NO: 17: short form).
  • human-derived nephronectin has a “MAM domain” in the 391 to 509 amino acid region, and “signal peptide” (1 to 19aa) and “EGF repeat sequence [J” (“ “EGF-like domain 1" (57-88aa), “EGF-like domain 2" (89-127aa), “EGF-like domain 3" (128-168aa), “EGF-like domain 4" (169-212aa), “EGF-like Domain 5 "(213-253aa)),” RGD linker partial site “(254-390aa), and” MAM domain "(391-509aa).
  • human-derived nephronectin targeted by the present invention is not limited thereto, and as described above, a human having 75% or more, preferably 80% or more identity to SEQ ID NO: 17 Any nephronectin may be used.
  • the amino acid sequence of the mouse-derived MA EG protein is shown in SEQ ID NO: 21.
  • the MAEG protein is composed of 550 amino acids, and has a MAM domain in its 395-550 amino acid region.
  • the targeted carrier of the present invention The polypeptide having the present invention is not limited thereto, and may be, for example, an equivalent having homology to the amino acid sequence of the MAEG protein.
  • Such equivalents include an amino acid having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added, and which has binding property to laminin 3 chain. Those having a sequence can be mentioned.
  • the range of homology is a range in which the amino acid sequence has 65% or more, preferably 70% or more, more preferably 75% or more equivalence to SEQ ID NO: 21.
  • Specific examples include MAEG proteins derived from animals other than mice, preferably mammals. Particularly preferred is a human-derived MAEG protein.
  • Examples of the human-derived MAEG protein include those having 70% or more, preferably 75% or more identity to SEQ ID NO: 21 [amino acid sequence of mouse-derived MAEG protein]. it can.
  • the amino acid sequence of the currently reported human MAEG protein is shown in SEQ ID NO: 55, and the MAEG protein is about 75% of the mouse MAEG protein shown in SEQ ID NO: 21. They have the same identity as above (77.76% in detail).
  • the target substance that can be transported to a target cell or tissue by the above-described target carrier having the peptide or polypeptide form includes amino acids, polyamino acids, peptides, polypeptides, and proteins. And the like.
  • the targeting carrier of the present invention may be in the form of a nucleic acid in addition to the above-described form of the polypeptide. That is, the target-directed carrier of the present invention is a nucleic acid having a gene encoding a MAM domain or a polypeptide partially having the MAM domain, and the desired drug is bound to the target tissue. And targeting vehicles used for transport to the target.
  • Examples of the gene encoding the MAM domain include genes encoding the MAM domains of various proteins such as nephronectin, MAEG protein, meplin, meprin ⁇ , europulin 1, neuropilin 2, RPTP ⁇ , or R ⁇ . it can.
  • the nucleic acids of the present invention include genes encoding MAM domains of the above-mentioned various proteins derived from animals other than mice, preferably mammals. More preferably, it is a gene encoding a MAM domain (polypeptide) of the above-mentioned various proteins derived from human.
  • Preferred examples of the gene encoding the MAM domain include a gene encoding the MAM domain of nephronectin and a gene encoding the MAM domain of the MAEG protein.
  • the gene possessed by the targeting carrier (nucleic acid) of the present invention is not limited thereto, and may be, for example, a functional equivalent having homology to the base sequence of the MAM domain gene. There may be.
  • Such functional equivalents include a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a sequence complementary to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, and an expression product (polypeptide) of the S4 laminin ⁇ 4 chain Or those having binding property to ⁇ 5 chain can be mentioned.
  • the range of homology is that the nucleotide sequence has an equivalence of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, and still more preferably 90% or more with respect to SEQ ID NO: 2.
  • a range can be mentioned. Specific examples include a gene encoding a ⁇ domain of nephronectin derived from animals other than mice, preferably mammals.
  • a preferred example is a gene encoding a ⁇ ⁇ domain of nephronectin derived from human.
  • SEQ ID NO: 2 the nucleotide sequence encoding the ⁇ domain of nephronectin derived from mouse
  • the base sequence (SEQ ID NO: 38) encoding the human domain gene of nephronectin shown in the above table is an example.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding the ⁇ domain of the mouse-derived MAEG protein is shown in SEQ ID NO: 4, but the target carrier (nucleic acid) of the present invention includes, but is not limited to, For example, it may be a functional equivalent having homology to the base sequence of the ⁇ domain gene.
  • Such functional equivalents include a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the complementary sequence to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 and whose expression product (polypeptide) is a laminin three-chain. And those having a binding property.
  • the range of homology is 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more, even more preferably 85% or more of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • Specific examples include a gene encoding the ⁇ domain of MAEG protein derived from animals other than mice, preferably mammals.
  • a preferred example is a gene encoding the MAM domain of a human-derived MAEG protein.
  • MA of human origin The gene encoding the MAM domain of the EG protein has an identity of 80% or more, and preferably 85% or more, to SEQ ID NO: 4 (base sequence encoding the MAM domain of the mouse-derived MA EG protein). What you have can be mentioned.
  • the base sequence (SEQ ID NO: 40) encoding the gene of the MAM domain of the human-derived MAEG protein shown in the above table is an example.
  • the targeting carrier (nucleic acid) of the present invention may have a gene encoding a polypeptide partially having a MAM domain.
  • polypeptides (including proteins) partially having a MAM domain include, but are not limited to, a full-length protein of nephronectin, a conjugate of the MAM domain of nephronectin and a part of the RGD linker, and a MAM of nephronectin. Examples include a conjugate of a domain with an EGF domain or its repetitive sequence, MA EG protein, mepulin, meplin j8, neuropilin 1, neuropilin 2, RPTPK, 'and RPTP ⁇ .
  • a gene encoding a polypeptide partially having a domain a gene encoding nephronectin (full length) and a gene encoding MAEG protein can be preferably mentioned.
  • nucleotide sequences of the gene encoding nephronectin derived from mouse are shown in SEQ ID NOs: 18 (short form) and 20 (long form).
  • the nucleic acid of the target directing carrier of the present invention is not limited to this, and may be, for example, a functional equivalent having homology to the nucleotide sequence of the nephronectin gene.
  • Such functional equivalents have a nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to the complementary sequence of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18 or 20, and the expression product (polypeptide) of laminin Those having a binding property to the ⁇ 4 chain or the 5th chain can be mentioned.
  • the range of homology is a range in which the base sequence has 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more equivalence to SEQ ID NO: 18 or 20.
  • Specific examples include a gene encoding nephronectin derived from an animal other than a mouse, preferably a mammal. Particularly preferred is a gene encoding human nephronectin.
  • the gene encoding human-derived nephronectin includes SEQ ID NO: 18 [mouse-derived nephronectin (short). base sequence of the gene encoding form) is 75% or more, preferably 80% or more.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54 is the nucleotide sequence of a currently reported gene encoding human nephronectin.
  • the nucleotide sequence has an identity of 80% or more (more specifically, 82.6%) to the nucleotide sequence of a mouse-derived gene (SEQ ID NO: 18: short form).
  • SEQ ID NO: 22 shows the nucleotide sequence of the gene encoding the MAEG protein derived from mouse.
  • the nucleic acid of the targeting carrier of the present invention is not limited thereto, and may be, for example, a functional equivalent having homology to the nucleotide sequence of the gene of the MAEG protein.
  • Examples of the range of homology include a range in which the nucleotide sequence has 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more equivalence to SEQ ID NO: 22.
  • Specific examples include genes encoding MAEG proteins derived from animals other than mice, preferably mammals. Particularly preferred is a gene encoding a MAEG protein derived from human.
  • the gene encoding a human-derived MAEG protein has 75% or more, preferably 80% or more identity to SEQ ID NO: 22 [base sequence of a gene encoding a mouse-derived MAEG protein].
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 56 is the nucleotide sequence of a currently reported gene encoding a human MAEG protein.
  • the nucleotide sequence has 80% or more (specifically, 82.6%) identity to the nucleotide sequence of the mouse-derived gene (SEQ ID NO: 22).
  • the target substance that can be transported to a target cell or tissue by the above-described target carrier having the form of a polynucleotide includes those having a form of an oligonucleotide, a polynucleotide, or the like. Can be done.
  • the target carrier (nucleic acid form) is obtained by incorporating a gene encoding a MAM domain or a polypeptide partially having a MAM domain into another nucleotide sequence in an expressible state. It may be in the form of a so-called expression vector (expression cassette).
  • the expression vector used in the present invention comprises a gene encoding the above MAM domain or a polypeptide partially having the MAM domain (hereinafter collectively referred to as “target polypeptide”) in a target cell (preferably a mammal). It may be contained in a state where it can be expressed and operable in the cell of origin and more in this human organism.
  • an expression vector contains a promoter functional region, (2) a liposome binding site, and (3) translation initiation, as necessary, in the downstream direction of transcription in order to express a target polypeptide in a target host.
  • DNA having a nucleotide sequence encoding a signal peptide (5) DNA having a nucleotide sequence encoding a target polypeptide, (6) Translation termination codon, (7) Terminator, (8) ) It is constructed so as to contain an autonomously replicating sequence (rebricon) capable of self-replication in a host, and (10) a homologous region.
  • “expressible” means that when the expression vector is introduced into a desired cell or a living body, the expression vector functions to express a gene encoding a desired polypeptide. Also, operable means that, when the expression vector is introduced into a living body, the expression vector functions to express the gene encoding the target polypeptide and produce the target polypeptide. I do.
  • Such an expression vector can be prepared by using a genetic engineering technique in the art.
  • an expression vector capable of expressing a gene in mammalian cells
  • an expression cassette capable of expressing a gene in human cells.
  • Gene promoters used in expression cassettes include, for example, adenovirus, cytomegalovirus, human immunodeficiency virus, simian virus 40, musculoskeletal heavy inoles, simple heterozygous inoles, mouse leukemia virus, shinbis virus, Sendai virus , Hepatitis A virus, hepatitis B virus, hepatitis C virus, bapilloma virus, human Promoters derived from viruses such as T cell leukemia virus, influenza virus, Japanese encephalitis virus, JC virus, valvovirus ⁇ 19, poliovirus, promoters derived from mammals such as albumin and heat shock protein, chimeric promoters such as CAG promoter Etc. are included.
  • the interleukin a signal sequence for secreting extracellular secretion of the target substance (transported substance) encoded by the gene or retaining it locally in the cell, 2 derived signal peptides (Tomisao Komada, Proceedings of the 115th Annual Meeting of the Pharmaceutical Society of Japan 4, 12, 1995) and adenovirus Ela that promotes nuclear localization, poliovirus large T antigen
  • a native peptide, a peptide derived from SV40 large T antigen, a peptide derived from nucleoplasmin, a peptide derived from HTLVlp24 post-transcriptional regulatory protein (Kalderon, D., et al., Cell, 39, 499, 1984) can be used. it can.
  • the above-mentioned expression vector is provided with a gene for a desired target substance (transported substance) (for example, a gene encoding a bioactive peptide) (hereinafter referred to as “drug gene”). )
  • a desired target substance for example, a gene encoding a bioactive peptide
  • drug gene for example, a gene encoding a bioactive peptide
  • One method for introducing a drug gene into an expression vector (expression cassette) is to use the MAM domain or the above-mentioned “(5) DNA having a base sequence encoding the target polypeptide” to be incorporated into the expression vector (expression cassette).
  • a method of using a gene encoding a polypeptide (target polypeptide) obtained by fusing a polypeptide (partially containing a MAM domain) with a drug (such as a bioactive peptide) can be used.
  • the present invention provides gene therapy by autologous transplantation in which target cells are removed from a patient, a drug gene is introduced into the cells using the above-mentioned “targeting drug complex”, and the cells are returned to the patient again.
  • Ex vivo gene therapy It can also be used for gene therapy (in vivo gene therapy) in which a drug gene is directly administered to a patient using the “targeting drug conjugate”.
  • gene therapy methods can be broadly classified into a method of adding a new (normal) gene while leaving the abnormal (cause) gene as it is (Augmentation Gene Therapy), and a method of replacing an abnormal gene with a normal gene (Replacement Gene Therapy). it can Force The expression vector (nucleic acid carrier) of the present invention can be used for both.
  • the present invention also provides a composition in which the desired target substance is bound to the above-described target-directed carrier as a composition for prevention and / or treatment or a cosmetic composition.
  • a target substance a substance having a medicinal effect or a physiological activity can be exemplified.
  • these substances are simply referred to as “drugs” in this specification.
  • the drug used by binding to the targeting carrier of the present invention is not particularly limited as long as it can bind to the drug, but when the targeting carrier of the present invention is in the form of a polypeptide, it is physiologically acceptable.
  • examples thereof include an active peptide antibody and, in the case of a nucleic acid form, a gene encoding a physiologically active peptide, iRNA, antisense and the like.
  • the bioactive peptide is a general term for peptides, polypeptides and proteins having various physiological activities, and includes, for example, cytokines and cell growth factors.
  • cytokines fibroblast growth factor (FGF) family, transforming growth factor j3 (TGF-) family, epidermal growth factor (EGF) family, platelet-derived growth factor (PDGF), insulin-like growth factor (IGF), nerve growth Cell growth factors including the NGF family, cell growth factors such as vascular endothelial growth factor (VEGF), hepatocyte growth factor (HGF) and cell differentiation factors such as bone morphogenetic factors (BMPs)
  • cytokines including interferon (IFN), interleukin (IL), colony stimulating factor (CSF), erythropoietin, tumor necrosis factor (TNF), etc.
  • IFN interferon
  • IL interleukin
  • CSF colony stimulating factor
  • erythropoietin tumor necrosis factor
  • TNF tumor
  • the targeting drug complex is provided as a hybrid polypeptide of the targeting carrier and, for example, the above-mentioned bioactive peptide.
  • the hybrid polypeptide Using a nucleic acid in which a gene encoding a targeting carrier (polypeptide) and a gene encoding a bioactive peptide or the like are linked by a genetic engineering technique, bacteria (preferably Esherichia coli) are used. ), Eukaryotic cells (yeast), insect cells or animal cells can be used for industrial production.
  • the targeting drug complex is a hybrid of the targeting carrier (nucleic acid) and, for example, a gene encoding the above-mentioned bioactive peptide. It is provided as a gene and is produced as a hybrid polypeptide in cells or in vivo.
  • the hybrid polypeptide (targeting drug conjugate) of the present invention or the hybrid polypeptide produced from the hybrid gene (targeting drug conjugate) of the present invention comprises a target carrier (or a target carrier thereof). It has tissue tropism based on the specific binding activity of the expressed product to a specific laminin.
  • the targeting drug conjugate of the present invention can be effectively used for a drug delivery system or targeting therapy.
  • the MAM domain of nephronectin is used as a target-directed carrier (including a part including the MAM domain of nephronectin, for example, nephronectin itself)
  • the target-directed carrier is used.
  • the desired drug can be directed to these tissues based on the specific tissue binding to the new blood vessels, large vessels, kidneys, lungs, or knees provided, resulting in the concentration in the organ (local concentration) Can be kept high and the effectiveness of the drug can be increased. At the same time, it can also prevent side effects caused by drug diffusion to other sites.
  • a targeting conjugate using HGF as a drug can treat nephritis more effectively than HGF alone. It becomes possible.
  • the anticancer drug can be specifically directed to the above organs (kidney, lung, or kidney), thereby suppressing side effects. It is possible to treat cancer in these organs and prevent its progress.
  • the effective rate of interleukin-12 and interferon-1 ⁇ conventionally used for the treatment of renal cancer is only about 15%, but the target-directed carrier of the present invention It is expected that its use will increase the translocation and localization to the kidney and further improve the efficacy rate.
  • Herceptin (antibody drug) and the like are also known as therapeutic agents for lung cancer, and the same applies to this.
  • angiogenesis inhibitor for example, an integrin ⁇ 2 inhibitor or the like
  • the targeting conjugate using an angiogenesis inhibitor for example, an integrin ⁇ 2 inhibitor or the like
  • the specificity of the targeting vessel to the neovessels possessed by the targeting carrier is high. It is expected that the angiogenesis inhibitor can be directed to new blood vessels based on the specific binding, and that the effective rate can be further improved.
  • the directional carrier can direct the drug to these tissues, resulting in a concentration in the organ (local concentration) Can be kept high and the effectiveness of the drug can be increased. At the same time, it can also prevent side effects caused by drug diffusion to other sites.
  • skin cancer is one of the diseases that has been increasing in recent years but lacks a good therapeutic agent. Therefore, the previously developed anticancer drug can be specifically directed and localized on the skin by using the above-mentioned targeting carrier, thereby reducing systemic side effects. However, it is expected that effective treatment of these skin cancers will be possible.
  • a 5-reductase inhibitor is known as a hair-growth agent, but by using the targeting carrier of the present invention to form a targeting drug conjugate, the drug can be converted into a hair. It can be specifically transferred to the follicle and localized, and as a result, it is thought that the effect can be further enhanced.
  • EGF or KGF keratinocyte growth factor
  • it can be specifically transferred to a skin wound site or an incision site by forming it into the form of the targeting conjugate of the present invention. As a result, it can be cured in a short time.
  • the targeting conjugate according to the present invention is preferably used by being administered to a living body as a pharmaceutical composition, but the method of administering to the living body is not particularly limited.
  • parenteral administration such as injection administration can be mentioned.
  • a pharmaceutically acceptable carrier and various additives can be added to such a pharmaceutical composition.
  • the dose of the pharmaceutical composition according to the present invention varies depending on the method of use, purpose of use, and the like, but those skilled in the art can easily select and optimize the dose appropriately.
  • E D T A ethylenediaminetetraacetic acid
  • EGF epidermal growth factor
  • H R P horseradish peroxidase (horseradish peroxidase)
  • mAb monoclonal antibody, monoclonal antibody
  • MAM domain meprin, Ao protein, receptor protein-tyrosine phosphatase- ⁇ domain (meprin, A5 protein, receptor-type protein tyrosine phosphatase mu domain)
  • PCR polymerase chain reaction ( ⁇ ; PVDF: polyvinilidene difluoride (polyvinylidene difluoride)
  • PMS F phenylmethylsulfonyl fluoride (phenylmethanesulfonyl fluoride)
  • electrophoresis sodium dodecyl sulfate-polyatarylamide gel electrophoresis
  • Tris-buffered saline Tris-buffered saline
  • Experimental Example 1 Construction of expression vector for nephronectin with FLAG (full length) and its mutant, and purification of the expression product
  • Nephronectin is composed of an EGF-like repeat (EGF-like repeat), a linker site containing an RGD cell adhesion motif, and a MAM domain (MAM domain).
  • Nephronectin derived from mouse ( ⁇ , using NN (full length), EGF-like repeated arrangement (abbreviated as ⁇ -EGF), NN with MAM domain deleted (abbreviated as ⁇ - ⁇ ), RGD
  • ⁇ full length
  • EGF-like repeated arrangement abbreviated as ⁇ -EGF
  • NN full length
  • MAM domain deleted abbreviated as ⁇ - ⁇
  • RGD for each of the linker position (abbreviated as ⁇ -RGD) and the MAM domain (abbreviated as ⁇ -MAM), an expression vector was constructed in which a FLAG tag (Sigma) was added to the C-terminus. The domain structure of each protein with a FLAG tag added to the C-terminus is shown (however, NN-EGF is not shown).
  • ⁇ -FLAG was prepared by inserting the full-length NN (mouse) cDNA into the pFLAG-CMV vector so that the codon matches the 3′-end FLAG tag. Specifically, first, the cDNA sequence of NN (mouse) (2541 bp containing the 5'-untranslated region, open reading frame (0RF), and 3'-untranslated region) is indicated by the primer indicated by the arrow in the figure.
  • the cDNA sequence of NN (mouse) (2541 bp containing the 5, -untranslated region, open reading frame (ORF), and 3, -untranslated region) was inserted into the pBlueScript multi-cloning site (5'-Sal I /
  • the vector prepared by introducing into Xho I, 3'-Bam HI site is designated as type II, and two types of primers indicated by arrows in the figure [forward: 5,-GAATTCGAGATCCCGGGACGC-3, (sequence number) 23), reverse: '5'-GTCGACGTCGTCCTTTCATTCCTC-3' (SEQ ID NO: 24)]] was used to amplify the -61 to 1242 bp region by PCR (K0D plus DNA polymerase, T0Y0B0).
  • the obtained PCR product was subcloned into pBlueScript II KS + treated with EcoR V cut / BAP, and the sequence was confirmed.Then, the fragment was cut with EcoRI / SalI, which was also cut with EcoRI / SalI. Ligation was performed with the pFLAG-CMV5a vector to construct a MAM domain-deficient nephronectin ( ⁇ ⁇ ⁇ _ ⁇ MAM-FLAG) expression vector having a FLAG tag at the C-terminus.
  • cDNA sequence of NN (mouse) (5'-untranslated region, open reading frame (ORF), and 2541 bp including all of the 3-untranslated region) was converted into the multi-cloning site (5'- SalI / XhoI, 3'-BamHI site) and the prepared vector as type II, two types of primers [forward: 5, -GAATTCGAGATCCCGGGACGC-3, Using SEQ ID NO: 25), reverse: 5'-GGGCCCGTCGAAGTCGGCAGC-3 '(SEQ ID NO: 26)], the -61 to 69 bp region was amplified by PCR (K0D plus DNA polymerase, T0Y0B0).
  • the obtained Hiroko PCR product was subcloned into pBlueScript II KS + treated with EcoR V cut / BAP to confirm the sequence.
  • the vector containing the cDNA sequence of the above NN is designated as type II, and two types of primers indicated by arrows in the figure [forward: 5'-GGGCCCAAAGTCATGATTGAAC-3 '(sequence No. 27), reverse: The 569-1242 bp region was amplified by PCR (using LA taq polymerase, TAKARA, and GCI buffer) using 5'-GTCGACGTCGTCCTTTACTTCCTC-3 '(SEQ ID NO: 28). .
  • the obtained PCR product was subcloned into pBlueScript II KS + treated with EcoR V cut / BAP to confirm the sequence.
  • the vector containing the above NN (mouse) cDNA sequence is designated as type II, and two types of primers indicated by arrows in the figure [forward: 5'-GGGGCGCGGTATTCTCATACACAGC-3 '(sequence number No. 31 1), the 1243-1683 bp region was amplified by PCR (using LA taq polymerase, TAKARA, and GCI buffer) using 5′-GTCGACGCAGCGACCTCTTTTCAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 32). The resulting PCR product was subcloned into Eco RI / BAP-treated pBlueScript II KS + to confirm the sequence.
  • each expression vector prepared above was transiently transfected into Freestyle TM 293-F cells (Invitrogen). Sixty hours after the gene transfer, the culture supernatant was collected and centrifuged to remove cell-insoluble material. Then, Triton X-100 (final concentration 1%), EDTA (5mM), PMSF (ImM), and sodium azide (0.02%) were added to the supernatant, respectively, to 0, and the anti-FLAG affinity beads ( Sigma) and stirred at 4 ° C.
  • the anti-FLAG affinity beads were transferred to an empty column, and the beads were washed with TBS (10 mM Tris-HCl (pH 7.4) and 150 mM NaCl). After washing, each protein bound to the beads was eluted with TBS containing 100 ⁇ g / ml FLAG peptide. Each eluted protein was dialyzed against 2 mM CAPS buffer (pH 11.4) containing 0.5 mM EDTA to remove the peptide, and a purified protein was obtained.
  • the expected molecular weights of the full length NN-FLAG, ⁇ - ⁇ MAM-FLAG, NN-RGD-FLAG, and ⁇ ⁇ -MAM-FLAG are 65 kD, 47 kD, 15 kD, and 18 kD, respectively. is there.
  • These proteins were purified using an anti-FLAG affinity column (anti-FLAG monoclonal antibody (anti-FLAG mAb) was obtained from Sigma) and developed on SDS-PAGE under reducing conditions, as shown in Figure 5. However, all proteins except for MAM were detected with a molecular weight larger than the expected size.
  • anti-FLAG affinity column anti-FLAG monoclonal antibody (anti-FLAG mAb) was obtained from Sigma
  • the right side shows the results of CBB (Coomassie Brilliant Blue R-250) staining after electrophoresis
  • the left side shows the results of immunization with anti-FLAG M2 monoclonal antibody (anti-FLAG mAb) after electrophoresis.
  • the results of blocking are shown.
  • the purified NN solution (75 Mg / ml, 3 ⁇ l) was stained with an equal volume of 2% uranium acetate solution for 30 seconds (negative staining), and then analyzed using a transmission electron microscope (JEM-100CX, JE0L). did.
  • the microscope was run at an accelerating voltage of 100 kilovolts, and the images were recorded as digital images at a resolution of 2k x 2k pixels with a 14-bit deep CCD camera (TVIPS).
  • FIG. 6A As a result, it was confirmed that the NN monomer had a V-shaped structure.
  • Figure 6C shows the molecular structure of the full-length band deduced from the analysis of electron micrographs.
  • KA8 cells leukemia cells stably expressing the integrin ⁇ 8 chain
  • their parental cells ⁇ 562 cells
  • ⁇ 8 cells and ⁇ 562 cells were previously coated with 30 ⁇ of NN-FLAG, ⁇ - ⁇ MAM-FLAG, NN-RGD-FLAG, or NN-MAM-FLAG, respectively.
  • the cells were seeded on a microtiter plate (5.0 ⁇ 10 4 cells / well), and allowed to stand at 37 ° C. in a humidified air containing 5% carbon dioxide for 2 hours.
  • the adherent cells were then fixed for 15 minutes with 3.7% formaldehyde, non-adherent cells were removed by washing 4 times with PBS, and stained with 0.1% toluidine-purified PBS for 10 minutes. .
  • KA8 cells are composed of full-length NN-FLAG (denoted as marauder in the figure), NN- ⁇ -FLAG (denoted as ⁇ in the figure), and NN-RGD-FLAG (shown as RGD in the figure) adhered to the coated plate surface, and all of them were well elongated.
  • the K562 cells did not adhere or spread on the plate surface coated with the full-length ⁇ -FLAG, NN- ⁇ MAM-FLAG, and ⁇ ⁇ -RGD-FLAG.
  • nephronectin has binding activity and cell spreading activity for integrin ⁇ 8] 31, but has no binding activity for integrin ⁇ 531.
  • the above results indicate that the main adhesive active site of nephronectin ( ⁇ ⁇ ) is a part of the RGD linker, and that the cell spreading activity requires the presence of an EGF-like repeat sequence.
  • Nephronectin ( ⁇ ) is known to be distributed in the basement membrane
  • Mouse LN-1 was purified from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor tissue according to Paulsson's method (Paulsson, M., et al., (1987) Eur J Biochera 166, 11-19).
  • Human LN-2 / 4 was purified from human placenta by immunoaffinity chromatography using a monoclonal antibody against human LN-human 2 chain.
  • Human LN-5, LN-8, And LN-10 / 11 were derived from culture supernatants of human gastric cancer cells MKN45 (LN-5), human glioma cells T98G CLN-8), and human lung adenocarcinoma cells A549 (LN-10 / 11), respectively.
  • Various basement membrane proteins (10 nM) diluted with PBS were added to a 96-well plate at 50 ⁇ l / volume, and allowed to stand at 4 ° C. for coating. Thereafter, 200 ⁇ l of PBS containing 1% skim milk was added to each well, and left at room temperature for 2 hours to perform blocking. Thereafter, the wells were washed three times with PBS containing 1% BSA and 0.1% Tween-20, and nephronectin with FLAG (NN-FLAG) (0.3 nM, 3 ⁇ , and 30 ⁇ ) diluted appropriately was added thereto. For 1 hour.
  • each anti-FLAG antibody (Sigma) diluted 1000 times with the washing solution was added thereto, and incubated at room temperature for 1 hour.
  • HRP-conjugated goat anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) was rapidly diluted 3,000, and 50 ⁇ l was added to each well, and the mixture was allowed to stand for 1 hour.
  • the color of the ortho-diene diamine solution was calorie-differed into each gel 501 and allowed to stand for 10 minutes to develop color. Thereafter, 2.5 M sulfuric acid was added to each well 501 to stop the color development.
  • the amount of FLAG-attached nephronectin (band-FLAG) bound to each basement membrane protein was calculated by measuring the absorbance at 490 nm (0D 490 nm).
  • Fig. 8 shows the results. Note that the absorbance values at 490 nm shown in the figure are obtained by adding NN-FLAG after blocking. The value obtained when the anti-FLAG antibody was not added and the value obtained when only the anti-FLAG antibody was added was subtracted. As can be seen from FIG.
  • Type II collagen is a basal lamina protein that is specifically expressed and localized in normal cartilage tissue, and this result is related to the power that has been linked to reports that NN is involved in cartilage and bone formation. Shirenare (Morimura, N. et al., (2001) J Biol Chem 276, 42172-42181) o
  • NN is LN-2 / 4 ( ⁇ 2) 31 / having the same j3 chain and ⁇ chain as LN-8 ( ⁇ 4) 31 ⁇ 1) and LN-10 / 11 (a5j3l / 2y1).
  • No binding activity to 2 ⁇ 1) so the binding of ⁇ to LN-8 (a4: ⁇ lyl) and LN-10 / 11 ( ⁇ 5 ⁇ 1/2 ⁇ 1) depends on the LN chain. it seems to do.
  • N The binding specificity of N for LN-8 ( ⁇ ⁇ ⁇ ) and LN-10 / 11 ( ⁇ 5 ⁇ 1 / 2 ⁇ 1) shown above is expressed as LN- 2/4 (a2j3 l / 2y 1). This was further confirmed by co-immunoprecipitation atssy using LN-10 / 11 ( ⁇ 5] 31/2 1).
  • the precipitate was developed by SDS-PAGE, transferred to a PVDF membrane, and the obtained PVDF membrane was blocked with 5% skim milk and 0.1% Tween-20 in TBS (procking buffer) for 1 hour. Soak the PVDF membrane with anti-hytraminin 7 1-chain antibody (MAB1920) diluted 2000-fold with blocking buffer, 0.1 ° /. After the membrane was washed with TBS containing Tween-20, HRP-added Egret anti-mouse IgG (secondary antibody, manufactured by ICN Parmaceuticals, Inc.) was reacted with the PVDF membrane. Thereafter, the cells were washed with TBS containing 0.1% Tween-20 and detected with an ECL kit (Amersham).
  • full-length NN-FLAG, ⁇ - ⁇ MAM-FLAG, NN- Solid phase binding to laminin (LN-10 / 11) was performed using RGD-FLAG and NN-MAM-FLAG.
  • a 96-well plate coated with laminin (LN-10 / 11) was blocked with 1% skim milk, and serially diluted nephronectin with FLAG (NN-FLAG) or its mutant ( ⁇ ⁇ - ⁇ -FLAG, NN-RGD-FLAG, NN-MAM-FLAG), and allowed to stand for 1 hour to react.
  • NN-FLAG bound to laminin and its deficient mutant were purified according to the method of Experimental Example 2 using a goat anti-mouse IgG antibody (secondary antibody) fused with anti-FLAG M2 mAb (Sigma) and HRP.
  • An enzyme-linked immunosorbent assay was used to quantify the results. The results are shown in FIG.
  • Figure 12 shows an enlarged photograph of the medulla of the kidney (scale bar: 50 ⁇ m).
  • the results in Figures A and B show that the outside of the tubule was stained like a basement membrane by NN-MAM-FLAG and layer-FLAG, respectively (stained in brown).
  • NN-MAM-FLAG and marauder-FLAG bind specifically to LN-10 / 11 or LN-8 present in the renal basement membrane, and are specifically associated with the basement membrane. It is considered to be connected.
  • the peptide nephronectin
  • this result suggests that a MAM domain and a polypeptide having a MAM domain are useful in a drug delivery system targeting a basement membrane.
  • Experimental example 6 MAEG protein binding to basement membrane protein
  • GST fusion proteins were firstly 5'-GAATTCCACAGCTGCAATTTTGACCAT-3 '(forward) (sequence number 33) and 5'-GTCGACTCAGCAGCGACCTCTTTTCAA-3', respectively.
  • FIG. Figure A shows the results of the GST fusion protein (GST-MAEG-MAM) binding to laminin
  • Figure B shows the results of the GST fusion protein (GST-NN-MAM) binding to laminin.
  • the MAM domain of the MAEG protein binds specifically to LN-8 and LN-10 / 11
  • the MAM domain of the MAEG protein binds to laminin (LN-5).
  • the specific tissue localization of bandits and MAEG proteins may be related to the laminin binding specificity of the MAM domains of ⁇ and MAEG proteins.
  • the tissue localization and binding specificity of NN and MAEG proteins are determined by the MAM domain of each protein. Proteins with different tissue specificities (expression, binding) depending on the MAM domain (NN and MAEG proteins) function in the basement membrane of each specific tissue to control organ formation and various phenomena. Conceivable.
  • Experimental Example 7 Nephronectin and laminin (LN-10) binding mode
  • nephronectin ( ⁇ ) expressed by epithelial cells accumulates in the basement membrane and has some effect on mesenchymal cells (Brandenberger, R. et al., (2001) J Cell Biol 154). in 447-458) 0 one, laminin (LN- 10) has been reported to transmit signals to epithelial cells via G domains present in the basement membrane (Ido, H. et al., ( 2003) J Biol Chem). This suggests that the identification of the NN-binding site in LN-10 may provide important information for elucidating the physiological and molecular functions of the phenotype.
  • the binding of full length NN (NN-FLAG) to LN-10AG was reduced to about 40% as compared to the binding to rLN-10.
  • the binding strength of NN MAM domain (NN-MAM-FLAG) to LN-10AG and rLN-10 were almost at the same level.
  • the binding of the NN MAM domain (NN-MAM-FLAG) to rLN-10 was a weaker level of binding than the full length NN hybrid, but this level was the LN-10 AG of the full length NN. Almost the same level as binding to
  • the immunohistochemical staining was performed as follows. First, kidneys were collected from adult mice, fixed in 4% paraformaldehyde for 15 minutes at room temperature, and embedded in OCT compound (Tissue Tek). 3-5 m frozen sections of the kidney were blocked with PBS containing 1% BSA (Procking Buffer) and washed with a blocking buffer. Then, the sections were diluted with blocking buffer at 12 ⁇ g / ml of anti-POEM / nephronectin antibody (anti-NN antibody: Transgenic) or 100-fold diluted anti-LN-H5 chain antiserum (U.S. University JH Miner Expo And then allowed to stand at room temperature for 1 hour. Thereafter, detection was performed using an ABC kit (Vector Laboratories).
  • FIG. Figure A shows the results of immunostaining with an anti-POEM / nephronectin antibody (anti-NN antibody)
  • Figure B shows the results of immunostaining with an anti-LN-a 5-chain antiserum.
  • anti-NN antibody anti-nephronectin antibody
  • Figure B shows the results of immunostaining with an anti-LN-a 5-chain antiserum.
  • the results is localized in the glomerular basement membrane, where the LN-a5 chain was similarly strongly expressed. This suggests that the customer co-localizes with the LN- ⁇ 5 chain in vivo. Discussion>
  • Nephronectin ( ⁇ ) is selective for laminin LN-8 (hi 4) 8 1 ⁇ 1) and LN-10 / 11 (hi 51 / 2 ⁇ 1), which are the major proteins that make up the basement membrane To join.
  • LN-8 (hi 4) 8 1 ⁇ 1) and LN-10 / 11 (hi 51 / 2 ⁇ 1) which are the major proteins that make up the basement membrane To join.
  • the same as these laminins] does not bind to LN-2 / 4 ( ⁇ 21 / 2 ⁇ 1) having 3 chains and ⁇ chain.
  • a band of MAM domain binds to a site other than the G domain of laminin, Then, it is possible that an EGF-like repeat sequence binds to the G domain of laminin to stabilize the binding, thereby stabilizing the binding of full-length NN.
  • multimeric formation of full-length NN was observed, but it is considered that this may be formed by combining a marauder bound to LN-10 / 11 with another marauder.
  • integrin alpha 8 1 is a protein expressed abundantly in mesenchymal nascent kidneys, mice Integurinhi 8 j3 1 deficient are known to exhibit severe kidney development defects ( Muller, U.,, et al., (1997) Cell 88, 603-613).
  • integrin ⁇ ; 8'i31 is a receptor for nephronectin (NN), which has been demonstrated in both in vitro and in vivo systems (Brandenberger, R., et al., (2001) J Cell Biol 154, 447-458).
  • kidney morphogenesis there are at least two essential pathways for kidney morphogenesis.
  • the first is the pathway that regulates the induction of metanephric mesenchymal differentiation via the ⁇ and hi 8 jS1 integrin, and the second is the ureter via the LN o; 5 and ⁇ 3] 31 integrin. It is a pathway that regulates the extension and branching of bud epithelium.
  • the above experiments suggest that these pathways are not mutually independent and may be linked by the interaction of the orchid with the LN- ⁇ 5 chain.
  • nephronectin specifically interacts with the LN-4 and ⁇ 5 chains of laminin, a constituent protein of the basement membrane.
  • ⁇ is one of the rare ECM proteins containing the ⁇ domain.
  • Other known ⁇ domain-containing proteins include MAEG, mepulin, neuropilin (A5 protein), and receptor protein tyrosine phosphatase / ⁇ .
  • the ⁇ domain of ⁇ is strongly involved in binding to laminin, and that the laminin binding specificity differs depending on the type of ⁇ domain.
  • the ⁇ domain of the fraction binds selectively to LN-8 and LN-10 / 11, whereas the EG domain of MAEG does not bind to LN-8 and LN-10 / 11, and LN- Selectively bind to 5.
  • the ⁇ domain is thought to be required for protein-protein interactions, especially homophilic interactions between ⁇ domains.
  • mepulin a type of metalloprotease, forms a large multimer via its ⁇ domain (Ishmael, FT, et ah, (2001) J Biol Chem 276, 23207-23211).
  • europulin a transmembrane protein and receptor for semaphorins
  • the MAM domains interact with each other on the cell surface to form dimers (Chen, H., et al., (1998) Neuron 21 , 1283-1290).
  • the receptor-type protein tyrosine phosphatase ⁇ and ⁇ show homophilic interactions between cells through the MAM domain (Zondag, GC, et al., (1995) J Biol Chem 270, 14247-14250).
  • the results of the present invention suggest that the MAM domain confers binding specificity to each protein containing it. That is, the findings in the above experiments show that the MAM domain and the protein containing it have a specific tissue tropism in accordance with the tissue specificity of each MAM domain. It indicates the possibility of being used as a carrier for transporting substances.
  • the targeting carrier of the present invention exerts tissue-specific targeting on the basis of its selective binding to laminin, thereby providing a drug (1) useful for a target tissue or cell of interest.
  • a drug (1) useful for a target tissue or cell of interest.
  • it can be used as a transporter for transporting bioactive peptides and their genes, antibody drugs, antisense molecules and interfering RNA factors.
  • the targeting carrier is used as a targeting drug complex by introducing a target substance (eg, a drug) to be usually carried.
  • Such a targeting conjugate can be effectively used for a drug delivery system or a targeting therapy.
  • the targeting carrier for example, NN itself
  • the specific targeting of the new blood vessel, large blood vessel, kidney, lung, or knee of the living carrier is concerned.
  • the targeting carrier for example, the MA EG protein itself
  • specific tissues for the hair follicle, skin (epidermis), and lungs provided by the targeting carrier are used.
  • the local concentration can be kept high and the efficacy of the drug can be increased, and at the same time, the side effects caused by diffusion to other sites can be prevented. it can.

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Abstract

本発明は、生体内の標的細胞または組織に選択的に所望の薬物（例えば生理活性ペプチドまたはそれをコードする遺伝子）を輸送しえる標的指向性運搬体を提供する。具体的には、これは、ＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチド、またはＭＡＭドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、所望の薬物を結合させて、該薬物を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体である。さらに、本発明は、上記標的指向性運搬体に、標的組織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体を提供する。

Description

明 細 書
標的指向性運搬体 技術分野
本発明は、生理活性ぺプチドやそれをコードする遺伝子などの目的物質を、 標的細胞または組織に、 選択的に輸送ないしは結合させるための運搬体に関 する。
本発明の標的指向性運搬体は、 医学 ·薬学分野並びに化粧品分野等におい て、 有用物質の生体内デリバリーシステム （例えば、 ドラックデリパリーシ ステム） に利用可能なバイオマテリアルとして有用である。 背 景 技術
通常、 薬物の治療効果は、 その薬物若しくはそれから生じる有用物質が特 定の標的部位に到着し、 そこで作用することによって有効に発現される。 そ の一方で、 薬物が不必要な部位に作用することによって副作用が生じること も知られている。 よって、 薬物を有効かつ安全に使用するために、 ドラッグ デリバリーシステム （D D S ) の開発,が求められている。
一方、 サイト力インや細胞成長因子などの生理活性ペプチドの中には医薬 品としての用途が期待されてレヽるものが多い （例えば、 Journal of Cell Biology, 第 109卷、 第 1号、 1〜6頁 （1989) ； R. A. F. Clark編、 The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, 第 2版、 第 6章、 237〜248頁 （1988) ； Zieglerら編、 Growth Factors and Wound Healing, 第 3部、 第 12章、 206 〜228頁 （1997) , Springer- Verlag, New Yorkなど参照のこと） 。 しかしな がら、 一般的に生理活性ペプチドは生体内での安定性が悪く、 局所保持ゃ徐 放が困難なために標的組織での効果が低く、 他部位での副作用もある。 この ため、 実用化がなかなか進んでいないのが現状であり、 効率の良いドラッグ デリバリーシステムが切望されている。 この問題を解決するために、 生理活 性べプチドに生体適合性を有する高分子を融合もしくは混合することにより、 生体内での標的指向性もしくは徐放性を確保しようとする試みが数多くなさ れている。 また、 生理活性ペプチドを他のペプチドと遺伝子工学的にハイブ リッド化し、 これを生体内で発現させることにより、 生理活性ぺプチドのタ ーゲッティングを達成しようとする試みもなされている。
これらに関連する技術として、 特開平 5— 1 7 8 8 9 7号公報には、 細胞 外マトリ ックス成分の一つであるフイブロネクチン （F N) の細胞接着ドメ ィン配列と、 塩基性線維芽細胞増殖因子 （ b F G F ) とをハイブリッド化し た機能性ポリペプチドが開示されている。 また、 細胞外マトリックスを介し ての徐放性をねらったものとして、 ゥシフォンビルブランド由来のコラーゲ ン結合性デカペプチドとトランスフォーミング増殖因子 i3 (TGF- j3 ) とのハ イブリツドポリペプチドであるコラーゲンターゲッティング T G F— j3が報 告されている （Tuanら、 Connective Tissue Reserch, 第 34卷、 1号、 1〜9 M (19%ゾ ； Hanら、 Protein Expression and Purif ication^ 第 11巻、 169 〜178頁（1997) ； Gordonら、 Human Gene Therapy,第 8卷、 1385〜1394頁（1997) ；米国特許第 5 8 0 0 8 1 1号公報） 。 また、 西らによって、 嫌気性のグラ ム陽性桿菌であるクロス トリジゥム ヒス トリチカム （Clostridium histolyticum) のコラゲナーゼ由来のコラーゲン結合†生ポリべプチドと b F G Fまたは上皮増殖因子 （E G F ) とのハイブリッドポリペプチドが、 コラ 一ゲン結合性細胞増殖因子として提案されている（Nishiら、 Proc. Nat. Acad, of Sci, USA、 第 95卷、 7018〜7023頁 (1998) ) 。 さらに、 機能性蛋白質を糸田 胞外マトリックスにターゲッティングする技術として、フイブロネクチン（F N) 分子の N末端 7 O kDa領域と C末端 3 7 kDa領域との間に異種蛋白質また はぺプチドのアミノ酸鎖を挿入してなるキメラ蛋白質の利用も提案されてい る （特開平 8— 1 4 0 6 7 7号公報） 。
ところで、 細胞と細胞外マトリックス （ECM) 蛋白質との相互作用は、 細胞 の生存、増殖、移動や分化において非常に重要である。これらの相互作用は、 インテグリンゃ膜結合型プロテオダリカンのような細胞表面受容体を介して 起こり、 細胞内にシグナルを伝達する。 上皮細胞では、 細胞に直接接着して いる E CM蛋白質は基底膜に存在している。 基底膜は、 上皮 ·実質細胞の直 下に位置し、 主にラミニン （LN) 、 I V型コラーゲン、 ニドゲン、 及びパー ルカンにより構成され、 ここにさらに多様なマトリックス分子が編み込まれ る （図 1参照） 。 かかるマトリックス分子の中には、 組織発生時一過性に、 または組織特異的に発現するものがあり、 これらは組織特異的な形態形成の 決定や器官形成の制御に関わっていると考えられている。
基底膜を構成する蛋白質の一種であるラ'ミニン （LN) は、 ひ、 j3、 y鎖か ら成るヘテロ三量体の糖蛋白質である。 恒常的に基底膜に存在していること から、 ラミニンは組織の恒常性と器官形成の制御に重要な役割を果たすと考 えられている。 現在までに 5つの α鎖、 3つの 鎖、 及び 3つの γ鎖が同定 されており、 これらの組み合わせで少なくとも 1 4種類の異なったラミニン ァイソフォームが構成されることが示されている（Miner, J. H. , and Patton, B. L. (1999) Int J Biochem Cell Biol 31, 811-816)。 図 2 Aに示すように、 ラミニンは a鎖のタイプによって大きく 5種類に分類される。 これは、 ラミ ニンと細胞の相互作用が主に a鎖の C末端領域でおこるからであり、 Q; 3 J3 1 や a 6 ]3 1のようなラミニン結合个生ィンテグリンやひ-ジス トロダリカン、シン. デカンのような非ィンテグリン受容体は、 ラミニンひ鎖の C末端領域にある 球状ドメインに結合する （図 2 B ) 。 また、 ラミニンの各 a鎖は組織特異的 ·発生段階特異的な発現を示す。 このことから、 a鎖の種類に応じて各種ラ ミニンはそれぞれ組織特異的に発現分布しており、 各部位で異なる機能を発 揮している （図 2 A参照） 。 例えば、 ，(¾ 1鎖を有するラミニン （a l鎖ラミ ニン： 《 1鎖 1^) は発生段階の組織のみで発現しているため、 胚性幹細胞 の分化とマトリ ックス会合に必須だと考えられている（Li， S.， Edgar, D.， Fassler, R.， Wadsworth, W. , and Yurchenco, P. D. (2003) Dev Cell 4, 613-624； Li, S.， Harrison, D. , Carbonetto, S.， Fassler, R. , Smyth, N.， Edgar, D.， and Yurchenco, P. D. (2002) J Cell Biol 157, 1279—1290)。 α 2鎖を有するラミニン （ひ 2鎖ラミニン ： α 2鎖 L N) は主に骨格筋と心 筋で発現しており、 筋細胞の生存に必要である（Kuang, W. , Xu, H. , Vachon, P. H.， Liu, L.， Loechel, F. , Wewer, U. M.， and Engvall, E. (1998) J Clin Invest 102, 844 - 852； Miyagoe, Y.， Hanaoka, K.， Nonaka, I.， Hayasaka, M. , Nabeshima, Y. , Arahata, K.， and Takeda, S. (1997) FEBS Lett 415， 33 - 39 ；)。 a 3鎖を有するラミニン （α 3鎖ラミニン： 3鎖 L N) は 主として表 皮下の基底膜に局在し、 表皮細胞の生存に必須である（Ryan， M. C. , Lee, K. , Miyashita, Υ.， and Carter, W. G. (1999) J Cell Biol 145, 1309—1323) 。 α 4鎖を有するラミニン （α 4鎖ラミニン： 《 4鎖 L N) は主に血管に局在 しており、 毛細血管の成熟に必要である（Thyboll, J. , Kortesmaa, J. , Cao, R. , Soininen, R.， Wang, L.， Iivanainen, A. , Sorokin, L.， Risling, M. , Cao, Y.， and Tryggvason, K. (2002) Mol Cell Biol 22, 1194 - 1202)。 a 5 鎖を有するラミニン （ひ 5鎖ラミニン： 《 5鎖 1^) は成体組織でもっとも 幅広く発現しており、 それを欠損させたマウスは胎盤の脈管構造、 神経管の 閉鎖、 そして腎糸球体の欠失のために胎生致死となる（Miner, J. Η·， Cunningham, J. , and Sanes, J. R. (1998) J Cell Biol 143, 1713-1723； Miner, J. H. , and Li, C. (2000) Dev Biol 217， 278-289) 。 さらに、 最近の報告 では α: 5鎖 L Nが毛、 肺、 そして顎下腺の形態形成にも関わることが示され ている（Li, J. , Tzu, J. , Chen, Y. , Zhang, Y. P. , Nguyen, N. T.， Gao, J. , Bradley, M.， Keene, D. R.， Oro, A. E. , Miner, J. H. , and Marinkovich, M. P. (2003) Embo J 22, 2400-2410； Nguyen, N. M. , Miner, J. H.， Pierce, R. A.， and Senior, R. M. (2002) Dev Biol 246, 231—244 ； Kadoya, Y. , Mochizuki, M.， Nomizu, M. , Sorokin, L.， and Yamashina, S. (2003) Dev Biol 263, 153—164)。
このように、 ラミニンの各 α鎖が組織特異的 ·発生段階特異的な発現を示 すことは、細胞外環境因子としてのラミニンの役割を考える上で重要である。 実際、 心臓という一つの器官を取り上げても、 それを構成する細胞のタイプ の違いによって、基底膜を構築するラミニンのタイプは大きく異なっている。 心筋基底膜はひ 2鎖 L Nで構築されているが、 心筋周囲に張り巡らされてい る毛細血管基底膜はひ 4 L N鎖で、 また、 太い血管の基底膜はひ 5鎖 L Nで 構築されている。 このような各ラミニンァイソフォームの細胞特異的な発現 の意義は、 ノックァゥトマウスなどの解析からも次第に明らかにされつつあ る。 図 3に示すように、 様々なラミニン構成鎖のノックアウトマウスは特異 的な表現型を示す（R. Nishiuchi et al.： J. Biochem. , 134, 497 (2003) ； J. H. Miner, et al.： J Cell Biol 143, 1713 (1998) ； B. L. Patton, et al.： Nat Neurosci 4， 597 (2001) ； J. Thyboll, et al.： Mol Cell Biol 22, 1194 (2002) )。 また皮膚の基底膜では o; 3鎖が 3鎖と y 2鎖とヘテロ三量体（α 3 ]3 3 y 2 ) を組んだラミニン- 5が強く発現しているが、 ヒ トにおいて α 3 鎖や他のラミニン- 5の構成鎖遺伝子異常は表皮が基底膜から剥離する表皮 水疱症をきたす。 筋細胞の基底膜に選択的に発現する α 2鎖の変異は、 ヒト においてもマウスにおいても筋ジストロフィーを起こす。 一方、 多くの細胞 •組織に幅広く発現する α 5鎖や多くのラミニンに共通して含まれる γ 1鎖 のノックアウトマウスは胎生致死となる。 胎児期に高い発現が見られる α 1 鎖のノックアウトマウスも同様に胎生致死となり、 その発生 ·器官形成にお ける重要性が窺われる。
このようなラミニン （LN) を始めとして、 I V型コラーゲン、 ニドゲン及 びパールカン等は、 細胞や組織の種類によらず、 どの基底膜でも構成的に発 現している基底膜構成蛋白質であるが、 最近の研究によって、 基底膜には、 これら以外にも組織特異的 ·発生段階特異的に発現する蛋白質が数多く存在 することが知られるようになつている。
その一つが、 ネフロネクチン (丽) である。 ネフロネクチンはインテグリ ン結合に必要な R G D (Arg-Gly-Asp) 配列 （細胞接着モチーフ） の他、 5つ の E G F様繰り返し配列と MAMドメインから構成されている （図 4参照の こと。 但し、 ネフロネクチン (丽) は、 ここで示す ΓΝΝ-FLAGJ のうち FLAG タグを除く領域から構成される） 。 ネフロネクチンは基底膜に局在し、 しか もひ 8 j8 1インテグリンと共在していることから、 インテグリンとの結合を 介して腎の形成において関わっていることが強く示唆されている。 事実、 発 生中の腎臓において選択的に尿管芽上皮細胞に発現されることが報告されて いる (Brandenberger, R. , Schmidt, A. , Linton, J. , Wang, D. , Backus, C. , Denda, S.， Muller, U.， and Reichardt, L. F. (2001) J Cell Biol 154, 447-458)。 また、 近年、 腎臓以外のさまざまな臓器形成期の基底膜にも発現 していることも明らかとなっている （R. Brandenberger, et al.： J Cell Biol 154， 447 (2001) ) 。
また、 組織特異的 ·発生段階特異的に基底膜に発現する蛋白質として、 M A E G (扉- and - containing gene)蛋白質も知られている。 これは、 ネ フロネクチンと同様に MAMドメィンを有するなど、 ネフロネクチンと分子 構造が非常によく似た蛋白質であり、 これもまた限定された局在を示す。 M A E Gは発達中の毛胞基底膜へ特異的に存在し、 その発現は毛胞が成熟する につれて減少することもわかっている（長田ら、 投稿中につき未発表) 図面の簡単な説明
図 1は、 基底膜と間質マトリックスの構造を示す模式図である。
図 2の Aは、 ラミニンァイソフォームの種類とその組織特異性を示す表で あり、 Bはラミニンの構造を示す模式図である。
図 3は、 ラミニンサブュニット遺伝子ノックァゥトマウスの表現径と！:伝 性疾患との関係を示す図である。
図 4は、組み換えネフロネクチン（NN)とその欠失変異体（丽- Δ MAM- FLAG 、 NN-RGD- FLAG、 及ぴ丽 -MAM- FLAG) が有するドメイン構造の概略図である。
ΓΝΝ-FLAGJにおいて、 E G F様繰り返し配列と M AMドメインに挟まれた領 域が R G Dリンカ一部位である （ 「麵- Δ ΜΑΜ- FLAG」 では E G F様繰り返し配' 列と FLAGタグに挟まれた領域、 また 「NN- RGD - FLAGJ ではシグナルペプチドと FLAGタグに挟まれた領域が、 それぞれ R G Dリンカ一部位である） 。 なお、 図には示していないが、 R G Dリンカ一部位は、 多くの O結合型糖鎖で 飾 されている。 「匪- FLAGJ は FLAG付き全長ネフロネクチン、 「画- Δ MAM - FULGJ は MAMドメインを欠失した FLAG付き全長ネフロネクチン、 「丽- RGD - FLAG」 は FLAG付き R G Dリンカ一部位、及ぴ「NN-MAM- FLAGJ は FLAG付き MAMドメ ィ ンを示す。 · 図 5は、 精製した全長 NN- FLAG (図 A中、 NNと示す） 、 丽- Δ ΜΑΜ- FLAG 〔図 A中、 Δ ΜΑΜと示す） 、 NN - RGD-FLAG (図 B中、 RGDと示す）、及び NN- MAM - Fし AG (図 B中、 MAMと示す） の電気泳動像 （15%ゲル） を示す。 図 5の A及ぴ B に おいて、 それぞれ右側は電気泳動後 CBB (Coomass ie Bri l l iant Blue R-25 0) 染色した結果を、 左側は電気泳動後、 抗 FLAG M2モノクローナル抗体を用 、て 免疫ブロッテイングを行った結果を示す。
図 6は、 実験例 1においてネガティブ染色したネフロネクチン （匪） （^電 子顕微鏡写真画像図 （A， B ) 及びそれから推定される N Nの分子構造を示 す図 （C ) である。 図 Aにおいて、 三角 （V) 印は N Nの単量体を指し、 矢 印は N Nの多量体を指し示す。 スケールパーは lOOnmを表す。 図 Bの左及 右 の図は、 図 Aの三角 （V) 印の部分を高倍率にした画像である （スケーノレバ 一は lOOnm) 。
図 7は、実験例 2において、全長 NN - FLAG (NN：図 A)、 ΝΝ- Δ MAM-FLAG ( ΔΜΑΜ ：図 Β ) 、 NN-RGD-FLAG (RGD：図 C)、 及び NN- MAM- FLAG (MAM：図 D) に対す る KA8細胞（インテグリン α 8鎖を安定に発現する白血病細胞）の接着性及ぴ 細胞の伸展を調べた結果を示す図である。
図 8は、実験例 3において、各種の基底膜蛋白質〔ラミニン（LN-1、 LN-2/4、 LN - 5、 LN- 8、 LN- 10/11) 、 フイブロネクチン (FN) 、 ビトロネクチン (VN) 、 コラーゲン I型、 II型、 IV型及ぴ V型〕 に対するネフロネクチン (匪 -FLAG) の 結合性を調べた結果を示す図である。
図 9は、 N Nの結合特異性を、 ラミニン （LN- 2/4 ( α 2 ]3 1/2 γ 1) ) とラミ ニン （LN- 10/11 ( a 5 j3 1/2 y 1) ) を用いた免疫共沈降アツセィで調べた結果 を示す図である。
図 1 0は、 ラミニン (LN-8) 、 ラミニン (LN-10/11) 、 及びフイブロネク チン （FN) に対する N Nの結合を、 それぞれ 10 mM EDTA、 0. 5 M NaCl、 また は 1 μ g/mlへパリン存在下、 ならびにこれら非存在下 （コントロール） で、 固 相結合ァッセィにより評価した結果を示す図である。
図 1 1は、 実験例 4において、 ネフ,ロネクチン （全長） (NN-FLAG) 及びそ の欠損変異体 （丽- ΔΜΑΜ- FLAG 、 NN-RGD-FLAG, 及び丽 -MAM-FLAG) のラミニ ン （LN-10/11) に対する結合活性を、 固相結合アツセィにより評価した結果 を示す図である。
図 1 2は、 実験例 5において、 成体マウス腎臓の基底膜に対する、 ネフ口 ネクチン （全長） （NN- FLAG) 及びその欠損変異体 （NN- MAM- FLAG) の結合を 調べた結果を示す図である。 図 Aは爾- FLAGの結果、 図 Bは丽 -MAM - FLAGの結 果、 及ぴ図 Cはコントロール （no- probe) である。
図 1 3の Aは、 G S T融合蛋白質（GST- MAEG - MAM) の各種ラミニン（LN-1、 LN- 2/4、 LN- 5、 LN-8、 LN-10/11) に対する結合性をみた結果であり、 図 Bは G S T融合蛋白質 （GST -願- MAM) の各種ラミニン （上記と同じ） に対する結 合性をみた結果を示す図である （実験例 6 ) 。
図 1 4は、 実験例 7において、 全長 N N (NN - FLAG) とその MAMドメイン (NN-MAM - FLAG) について、 それぞれ組換え LN-10 (rLN - 10) とその Gドメイ ン欠損変異体 （LN- 10AG) に対する結合活性を調べた結果を示す図である。 図 15は、 実験例 8において、 マウスの腎臓組織における NN及ぴ LN- α5 鎖の局在を、 免疫組織化学的染色法によって調べた結果を示す図である （原 図はカラー図） 。 図 Αは、 抗 POEM/nephronectin抗体 （抗 NN抗体） で免疫染 色した結果を、 図 Bは、 抗 LN-a 5鎖抗血清 （抗 LN-a5抗体） で免疫染色した 結果である。 矢印は腎糸球体を示す。 発明の開示
本発明は、 各種組織に特異的に存在する基底膜蛋白質に対して特異的な結 合活性を有するポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子から構成される 運搬体であって、 生体内の標的細胞または組織に選択的に所望の薬物 （例え ば生理活性べプチドまたはそれをコードする遺伝子） を輸送しえる標的指向 · 性運搬体を提供することを目的とする。 より詳細には、 本発明は各種組織に 特異的に存在する各種ラミニンに対して選択的結合性を有し、 その特性に基 づいてラミニンを発現する標的細胞または組織に、 選択的に目的物質を輸送 ないしは結合させることのできる、 組織指向性を備えた運搬体 （標的指向性 運搬体） を提供することを目的とする。
かかる標的指向性運搬体に、 所望の薬物 （例えば生理活性ペプチドまたは それをコードする遺伝子）を結合させて、薬物を運搬体との複合体（例えば、 生理活性ペプチド複合体または生理活性ペプチド遺伝子複合体） として調製 することにより、 組織特異的なドラッグデリバリー、 並びにターゲッティン グ療法が可能となる。 よって、 本発明はかかるシステムを提供することも目 的とする。
本発明者らは、鋭意研究を進める中で、前述するネフロネクチン（丽）力 基底膜構成蛋白質の各種ラミニンのうち、 LN- 10/11 (a5j31/27D と LN - 8 (a4j31y 1) には選択特異的に結合するものの、 LN- 10/11及び LN-8と同じ 鎖と γ鎖を有する LN- 2/4 (a2j3 I/27I) には結合しないことから、 ネフロネ クチン （丽） がラミニンの a 5鎖または a 4鎖を特異的に認識して結合する ことを見いだした （後述する実験例 3、 図 8参照）。 さらに、本発明者らは、 ネフロネクチンとこれらのラミニンアイソフォームとの結合は、 ネフロネク チンの MAMドメインを欠失させることによって消失することから、 ネフ口 ネクチンの MAMドメインを介して行われることを見出した （後述する実験 例 4、 図 1 1参照） 。 さらに、 本発明者らは、 ネフロネクチン （丽） と類似 の構造を有する MA E G蛋白質は、 その MAMドメインを介して、 ラミニン (LN-5 ( « 3 ]3 3 7 2) ) と選択特異的に結合することを見いだした （後述する 実験例 5、 図 1 2参照） 。
前述するように、 ラミニンはそれが有する 鎖に応じてそれぞれ異なる組 織や部位に発現し局在していることが知られている。 具体的には、 ネフロネ クチン （丽） 及ぴその MAMドメインが選択的結合性を示す、 LN- 8 (ひ 4鎖を 有する）は、血管の中でも毛細血管や新生血管に特異的に局在しており、 LN-10 及び LN-11 (ひ 5鎖を有する） は、 血管の中でも太い血管 （大血管） 、 腎臓、 肺及ぴ膝臓組織に特異的に局在している。 また MA E G蛋白質及びその ΜΑ · Μドメインが選択的結合性を示す、 LN- 5 ( « 3鎖を有する）は、皮膚（表皮）、 毛包及び肺組織に特異的に局在している。
これらの知見から、 本発明者らは、 ネフロネクチンまたはその ΜΑΜドメ イン、 並びに MA E G蛋白質またはその ΜΑΜドメインが、 その特異的ラミ ニン結合性に基づいて組織特異的に標的指向性を発揮し （後述する実験例 7 参照） 、 これにより当該標的部位に有用な薬物 （例えば、 生理活性ペプチド またはその遺伝子など） を輸送する運搬体として利用できる可能性を見いだ した。 本発明はかかる知見に基づいて完成したものである。
すなわち、 本発明は下記の態様を包含するものである；
¾ 1 . MAMドメイン (meprin, 5A protein, receptor protein- tyrosine phosphatase μ -domain) もしくはそれを一部に有するポリぺプチド、 または MAMドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝 子を有する核酸であって、 所望の物質を結合させて、 該物質を標的組織に輸 送するために用いられる標的指向性運搬体。
項 2 . MAMドメインが、 （a ) または （b ) のアミノ酸配列を有するも のである項 1記載の標的指向性運搬体；
( a ) 配列番号 1に示される、 ネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸 配列、 (b) 上記ネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸配列において、 1若 しくは複数のァミノ酸が欠失、 置換または付加されたァミノ酸配列を有し、 かつラミニンの α 4鎖または α 5鎖に結合性を有するァミノ酸配列。
項 3. 上記 （b) 力 配列番号 1に示されるネフロネクチンの MAMドメ インのァミノ酸配列と、 少なくとも 90 %の同一性を有するァミノ酸配列で ある、 項 2記載の標的指向性運搬体。
項 4. 上記 （b) 、 ヒ ト由来ネフロネクチンの MAMドメインのァミノ 酸配列である、 項 2または 3記載の標的指向性運搬体。
項 5. 上記 （b) 1 配列番号 37に示されるアミノ酸配列である力、 ま たはそれと少なくとも 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、 項 2乃至 4のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項 6. ΜΑΜドメインを有するポリペプチドが、 （c) または （d) のァ. ミノ酸配列を有するものである請求項 1記載の標的指向性運搬体；
(c)配列番号 1 7または 19に示される、ネフロネクチンのアミノ酸配列、 (d) 上記ネフロネクチンのアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンの α 4鎖または α 5鎖に結合性を有するァ,ミノ酸配列。
項 7. 上記 （d) 1 配列番号 1 7または 1 9に示されるネフロネクチン のァミノ酸配列と、少なくとも 75 %の同一性を有するァミノ酸配列である、 項 6記載の標的指向性運搬体。
項 8. 上記 （d) I ヒ ト由来ネフロネクチンのアミノ酸配列である、 項 6または 7記載の標的指向性運搬体。
項 9. 上記 （d) 力 配列番号 53に示されるアミノ酸配列であるか、 ま たはそれと少なくとも 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、 項 6乃至 8のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項 10. MAMドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、 （A) また は （B) の塩基配列を有するものである項 1記載の標的指向性運搬体；
(A) 配列番号 2に示される、 ネフロネクチンの MAMドメインをコードす る遺伝子の塩基配列、
( b ) 上記塩基配列に対して、 80 %以上、 好ましくは 85 %以上、 より好 ましくは 90 %以上の同一性を有する塩基配列であって、 かつ当該塩基配列 によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのひ 4鎖または α 5鎖に結合 性を有するもの。
項 1 1. 上記 （Β) 力 ヒ ト由来ネフロネクチンの ΜΑΜドメインをコー ドする遺伝子の塩基配列である、 項 1 0記載の標的指向性運搬体。
項 1 2. 上記 （Β) 力 配列番号 38に示される塩基配列である力、 また はそれと少なくとも 90%以上の同一性を有する塩基配列である、 項 10ま たは 1 1に記載の標的指向性運搬体。
項 1 3. ΜΑΜドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、 （C) また は （D) の塩基配列を有するものである項 1記載の標的指向性運搬体；
(C) 配列番号 1 8または 20に示される、 ネフロネクチンをコードする遺 伝子の塩基配列、
(D) 上記塩基配列に対して、 70 %以上、 好ましくは 75 %以上、 より好 ましくは 80 %以上の同一性を有する塩基配列であって、 かつ当該塩基配列 によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのひ 4鎖または 5鎖に結合 性を有するもの。
項 14. 上記 （D) 1S ヒ ト由来ネフロネクチンをコードする遺伝子の塩 基配列である、 項 1 3記載の標的指向性運搬体。
項 1 5. 上記 （D) 、 配列番号 54に示される塩基配列である力、 また はそれと少なくとも 90%以上の同一性を有する塩基配列である、 項 1 3ま たは 14に記載の標的指向性運搬体。
項 1 6. 腎臓、 新生血管、 肺、 膝臓、 または大血管に対して指向性を有す ることを特徴とする項 2乃至 15のいずれかに記載する標的指向性運搬体。 項 1 7. ΜΑΜドメインが、 （e) または （f ) のアミノ酸配列を有する ものである項 1記載の標的指向性運搬体；
(e) 配列番号 3に示される、 MAEG蛋白質の MAMドメインのアミノ酸 配列、
( f ) 上記 MAEG蛋白質の MAMドメインのアミノ酸配列において、 1若 しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンのひ 3鎖に結合性を有するァミノ酸配列。 項 18. 上記 （f ) 力 S、 配列番号 3に示される MA EG蛋白質の MAMド メィンのァミノ酸配列と、 少なくとも 80 %の同一性を有するアミノ酸配列 である、 項 1 7記載の標的指向性運搬体。
項 19. 上記 （f ) 、 ヒ ト由来 MAEG蛋白質の MAMドメインのアミ ノ酸配列である、 項 1 7または 18記載の標的指向性運搬体。
項 20. 上記 （f ) 力 S、 配列番号 39に示されるアミノ酸配列であるか、 またはそれと少なくとも 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、 項 1 7乃至 1 9のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項 21. MAMドメインを有するポリペプチドが、 （g) または （h) の 了ミノ酸配列を有するものである項 1記載の標的指向性運搬体；
(g) 配列番号 21に示される、 MAEG蛋白質のアミノ酸配列、
(h) 上記 MA EG蛋白質のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、かつラミニンの α 3 鎖に結合性を有するァミノ酸配列。
項 22. 上記 （h) 力 S、 配列番号 21に示される MAEG蛋白質のァミノ 酸配列と、 少なくとも 70 %の同一性を有するァミノ酸配列である、 項 21 記載の標的指向性運搬体。
項 23. 上記 （h) 、 ヒ ト由来 MAEG蛋白質のアミノ酸配列である、 項 21または 22記載の標的指向性運搬体。
項 24. 上記 （h) 力 配列番号 55に示されるアミノ酸配列であるか、 またはそれと少なくとも 90%以上の同一性を有するアミノ酸配列である、 項 21乃至 23のいずれかに記載の標的指向性運搬体。
項 25. MAMドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、 （E) また は （F) の塩基配列を有するものである項 1記載の標的指向性運搬体； (E) 配列番号 4に示される、 MAEG蛋白質の MAMドメインをコードす る遺伝子の塩基配列、
(F) 上記塩基配列に対して、 75%以上、 好ましくは 80%以上、 より好 ましくは 85 %以上の同一性を有する塩基配列であって、 かつ当該塩基配列 によってコードされるアミノ酸配列がラミニンのひ 3鎖に結合性を有するも の。 項 26. 上記 （F) 力 ヒ ト由来 MAEG蛋白質の MAMドメインをコー ドする遺伝子の塩基配列である、 項 25記載の標的指向性運搬体。
項 27. 上記 （F) 力 配列番号 40に示される塩基配列である力、 また はそれと少なくとも 90%以上の同一性を有する塩基配列である、 項 25ま たは 26に記載の標的指向性運搬体。
項 28. MAMドメインをコードする遺伝子を有する核酸が、 （G) また は （H) の塩基配列を有するものである項 1記載の標的指向性運搬体；
(G) 配列番号 22に示される、 MAEG蛋白質をコードする遺伝子の塩基 配列、
(H) 上記塩基配列に対して、 70 %以上、 好ましくは 75 %以上、 より好 ましくは 80%以上の同一性を有する塩基配列であって、 かつ当該塩基配列 によってコードされるアミノ酸配列がラミニンの α 3鎖に結合 1"生を有するも の。
項 29. 上記 （Η) 力 ヒ ト由来 MAEG蛋白質をコードする遺伝子の塩 基配列である、 項 28記載の標的指向性運搬体。
項 30. 上記 （Η) 力 配列番号 56に示される塩基配列である力、 また はそれと少なくとも 90%以上の同一性を有する塩基配列である、 項 28ま たは 29に記載の標的指向性運搬体。
項 31. 毛包、 皮膚 （表皮） 、 または肺に対して指向性を有することを特 徴とする請求項 1 7乃至 30のいずれかに記載する標的指向性運搬体。 項 32. 発現ベクターの形態を有する、 項 1乃至 31のいずれかに記載す る標的指向性運搬体。
項 33. 項 1乃至 31のいずれかに記載の標的指向性運搬体に、 標的組織 に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体。
項 34. 標的指向性薬物複合体が、 ペプチドまたはタンパクからなる薬物 を結合してなるポリペプチド形態を有するか、 または核酸 （遺伝子を含む） からなる薬物を結合してなるポリヌクレオチド形態を有するものである、 請 求項 33に記載する標的指向性薬物複合体。
項 35. 項 33または 34に記载する標的指向性薬物複合体を有効成分と して含む医薬組成物。 項 3 6 . 標的指向性薬物として、 項 3 3または 3 4に記載する標的指向性 薬物複合体を用いることを特徴とする、 ドラッグデリバリーシステムまたは ターゲッティング療法。
項 3 7 . MAMドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチド、 また は MAMドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺 伝子を有する核酸の、 所望の物質を結合させて該物質を標的組織に輸送する ために用いられる標的指向性運搬体の調製のための使用。
項 3 8 . 項 1乃至項 3 2のいずれかに記載の標的指向性運搬体の、 標的組 織に輸送するための薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体の調製のた めの使用。
項 3 9 . 項 1乃至項 3 2のいずれかに記載の標的指向性運搬体に薬物が結 合されてなる標的指向性薬物複合体の、 標的組織や細胞に局所的に薬物を輸 送して治療するドラッグデリバリーシステムまたはターゲッティング療法に おける使用。 発明を実施するための最良の形態
( 1 ) 標的指向性運搬体
前述するように、 ラミニンは、 そのひ鎖に基づいて組織特異的 ·発生段階 特異的な発現を示す基底膜主要構成蛋白質である。
本発明は、 こうした組織特異的に発現するラミニンの α鎖を選択的に認識 して特異的に結合する特性を有し、 それがゆえに標的の組織に対して指向性 を有する標的指向性運搬体を提供するものである。
具体的には、 本発明の標的指向性運搬体には、 ΜΑΜドメインまたはそれ を一部に有するポリペプチドであって、 所望の薬物を結合させて、 該薬物を 標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体が含まれる。
ここで ΜΑΜドメインとは、 「meprin， A5 protein, receptor protein - tyrosine phosphatase μ -domain (メフリン、 八。 白¾、 受容体型 蛋白質チロシン脱リン酸ィ匕酵素ミュードメイン） 」 の略である。 ネフロネク チン （nephronectin) 、 MA E G蛋白質 （ヒ トについては （"Genomics 62, p. 304-307, 1999」 、 マウスについては 「Genomics 65, p. 1623, 2000」 ) 、 メプリン (meprin) 及びメプリン β (The Journal of Biochemistry, Vol. 276, No. 25, p. 23207-23211, 2001) 、 ニューロピリン （neuropilin) 1及ぴニュ 一口ピリン 2 (Neuron, Vol. 21, p. 1283- 1290， 1998) 、 R P T P (受容体型 蛋白質チロシン脱リン酸ィ匕酵素： Receptor Protein -Tyrosine
Phosphatase) κ及ぴ R P T P μ (The Journal of Biological Chemistry p. 14247-14250, 1995)などは、 いずれも共通して MAMドメインを有する蛋 白質で ¾>る (Beckmann, G. , and Bork, P. ； Trends in Biochemical Science Vol. 18, 1993, p. 40-41) 。 なお、 MAMドメインは、 メプリン、 ニューロピ リン （A5 proteinとニューロピリンは同義である） 、 R P T P /zなどについ て、 MAMドメィン間での相互作用、 及び二量体や多量体形成に必要といわ れているものの、 詳細な機能については知られていない。
Figure imgf000016_0001
ミノ酸配列を配列番号 1 ； M A E G 蛋白質の MAMドメインのアミノ酸配列を配列番号 3 ； メプリンひの MAM ドメインのアミノ酸配列を配列番号 5 ；メプリン ]3の MAMドメインのアミ ノ酸配列を配列番号 7 ；ニューロピリン 1の MAMドメインのアミノ酸配列 を配列番号 9 ：ニューロピリン 2の M AMドメインのアミノ酸配列を配列番 号 1 1 ： R P T P /Cの MAMドメインのアミノ酸配列を配列番号 1 3 ： R P T P μの MAMドメインのァミノ酸配列を配列番号 1 5に示す。 ここに記載 する MAMドメインのアミノ酸配列はその一例であるマウスに由来するもの であるが、 他の例としては、 上記配列が由来する生物種に類似もしくは近似 する種 （例えば、 哺乳類に属する種、 好ましくはヒ ト） に由来する、 各種蛋 白質の MAMドメィンのァミノ酸配列を挙げることができる。
例えば、 上記マウス由来の各種 MAMドメインのアミノ酸配列と、 ヒ ト由 来の各種 MAMドメィンのァミノ酸配列との関係を示すと、 下表の通りであ る。 なお、 ここでアミノ酸配列の同一性 （相同性） は、 ゼネテイツクス社製 遺伝子解析ソフトの GENETIX- Mac ver. 12. 2. 4の、 homology search engineに 基づくものである 〔以下に述べるアミノ酸配列、並びに塩基配列の同一性（相 同性） においても同じ。 〕 。 MAMドメインが マウスの ヒ トの ヒト配列とマウス 由来する蛋白質 アミノ酸配列 アミノ酸配列 配列との同一性 ネフロネクチン SEQ. NO. 1 SEQ. NO. 37 99. 3 %
MA E G蛋白質 SEQ. NO. 3 SEQ. NO. 39 85. 2%
メプリン α SEQ. NO. 5 SEQ. NO. 41 79. 4 %
メプリン 13 SEQ. NO. 7 SEQ. NO. 43 77. 1 %
ニューロピリン 1 SEQ. NO. 9 SEQ. NO. 45 96. 4 %
ニューロピリン 2 SEQ. NO. 11 SEQ. NO. 47 89. 5 %
R P T P κ SEQ. NO. 13 SEQ. NO. 49 98. 8 %
R P T P ζ SEQ. NO. 15 SEQ. NO. 51 93. 9 %
MA E G蛋白質の MAMドメインを挙げることができる。
マウスに由来するネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸配列を配列 番号 1に示す。但し、本発明の標的指向性運搬体が有する MAMドメインは、 これに限定されることなく、 例えば当該 MAMドメィンのァミノ酸配列と相 同性を有する同等物であってもよい。 かかる同等物としては、 上記配列番号 1のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換または 付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンのひ 4鎖またはひ 5鎖に結合 性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。 なお、 相同性 の範囲としては、 ァミノ酸配列が配列番号 1に対して 8 0 %以上、 好ましく は 8 5 %以上、 より好ましくは 9 0 %以上、 さらに好ましくは 9 5 %以上の 同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、 好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチンの MAMドメインを挙げること ができる。 特に好ましくはヒ ト由来のネフロネクチンの MAMドメインであ る。 ヒ ト由来のネフロネクチンの MAMドメインとしては、 配列番号 1 (マ ウス由来のネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸配歹 IJ)に対して 9 0 %以 上、好ましくは 9 5 %以上の同一性を有しているものを挙げることができる。 上記の表に示すヒト由来のネフロネクチンの MAMドメイン（配列番号 3 7 ) はその一例である。
なお、 ラミニンの α 4鎖または α 5鎖に対する結合性は、 後述する実験例 3 ( 1 ) に記載する固相結合アツセィ （酵素結合免疫吸着検定） または実験 例 3 ( 2 ) に記載する免疫共沈降アツセィ （酵素結合免疫吸着検定） など、 当業者に公知の方法を用いて評価することができる。
マウスに由来する M A E G蛋白質の M AMドメインのァミノ酸配列を配列 番号 3に示す。 上記と同様、 本発明の標的指向性運搬体が有する MAMドメ インは、 これに限定されることなく、 例えば当該 MAMドメインのアミノ酸 配列と相同性を有する同等物であってもよい。 かかる同等物としては、 上記 配列番号 3のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置 換または付カ卩されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンのひ 3鎖に結合性を 有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。 なお、 相同性の範 囲としては、 アミノ酸配列が配列番号 3に対して 70%以上、 好ましくは 7 5%以上、 より好ましくは 80%以上、 さらにより好ましくは 85%以上の 同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、 好ましくは哺乳類に由来する MAE G蛋白質の MAMドメィンを挙げること ができる。 特に好ましくはヒ ト由来の MA EG蛋白質の MAMドメインであ る。 ヒ ト由来の MAEG蛋白質の MAMドメインとしては、 配列番号 3 (マ ウス由来の MAEG蛋白質の MAMドメインのアミノ酸配歹 IJ)に対して 80 %以 上、好ましくは 85%以上の同一性を有しているものを挙げることができる。 具体的には上記表に示すヒ ト由来の MAEG蛋白質の MAMドメイン （配列 番号 39) を挙げることができる。
なお、 ラミニンのひ 3鎖に対する結合性は、 後述する実験例 3 (1) に記 載する固相結合アツセィ （酵素結合免疫吸着検定） または実験例 3 (2) に 記載する免疫共沈降アツセィ （酵素結合免疫吸着検定） など、 当業者に公知 の方法を用いて評価することができる。
また本発明の標的指向性運搬体は、 MAMドメィンを一部に有するポリぺ プチドからなるものであってもよい。 かかるものとしては、 本発明の効果を 損なわないことを限度として、 MAMドメインを一部に含むポリペプチドを 広く例示することができるが、 具体的には、 ネフロネクチンの全長蛋白質、 ネフロネクチンの MAMドメインと RGDリンカー部位との結合体、 ネフ口 ネクチンの M AMドメインと EGFドメインまたはその繰り返し配列との結 合体、 MAEG蛋白質、 メプリンひ、 メプリン β、 ニューロピリン 1、 ニュ —口ピリン 2、 RPTP κ、 及ぴ RPTP iなどを例示することができる。 なお、 ヒ トに由来するネフロネクチン相当物の配列は、 「Journal of Biological Chemistry, Vol.276, No.45, pp.42172 - 42181， 2001」 に、 MA EG蛋白質 （ヒ トでは EGFL6とも称される） の配列は 「腿 _015507」 に、 メプ リン αの配列は 「匪— 005588 (Genbank accesion Number, 以下同じ） 」 に、 メプリン の配列は「ΝΜ— 005925」に、ニューロピリン 1の配列は「匪— 003873」 に、 ニューロピリン 2の配列は 「AF281074」 に、 及ぴ R ΡΤΡ κの配列は
「Ζ70660」 に， RPTP/ の配列は 「匪— 002845」 に、 それぞれ記載されてい る。
MAMドメインを一部に有するポリべプチドとして、 好ましくはネフロネ クチン （全長） 、 及ぴ MAEG蛋白質を挙げることができる。
マゥス由来のネフロネクチンには、選択的スプライシングによつて 561ァミ ノ酸からなる short formと 609アミノ酸からなる long formとが存在すること が知られている (The Journal of Cell Biology, Vol.154, No.2, 2001， 447-458) 。 short formのネフロネクチン （マウス） のアミノ酸配列を配列番 号 1 7に、 long formのネフロネクチン （マウス） のアミノ酸配列を配列番号 1 9にそれぞれ示す。 なお、 short formのネフロネクチン （マウス） は、 そ の 420〜561アミノ酸領域に 「MAMドメイン」 を有しており 〔N末端から順 に、 「シグナルペプチド」 - 19aa) 、 「EGF繰り返し配列」 （ 「EGF 様ドメイン 1」 （57- 88aa) 、 「EGF様ドメイン 2」 （89_127aa) 、 「EG F様ドメイン 3」 （128 - 168aa) 、 「EGF様ドメイン 4」 （169 - 212aa) 、
「EGF様ドメイン 5」 （213-253aa))、 「RGDリンカ一部位」 （254_419aa)、 及ぴ 「MAMドメイン」 （420- 561aa) から構成される〕 、 long formのネフ ロネクチン （マウス） は、 その 468〜609アミノ酸領域に 「M AMドメイン」 を有している 〔N末端から順に、 「シグナルペプチド」 （l_19aa) 、 「alternative splicing region 1」 (59- 75aa)、 「EGF ドメイン 1」
(76-105aa) 、 「alternative splicing region 2」 (106 - 136aa)、 「EGF 様ドメイン 2」 （137— 175aa) 、 「EGF様ドメイン 3」 （176-215aa) 、 「E GF様ドメイン 4」 （216- 260aa)、 「EGF様ドメイン 5」 （261- 301aa) 、 「RGDリンカー部位」 （302-467aa)、及ぴ「MAMドメイン」 （468_609aa) から構成される〕 。 ただし、 本発明の標的指向性運搬体が有するポリペプチドは、 これに限定 されることなく、 例えば当該マウス由来のネフロネクチンのアミノ酸配列と 相同性を有する同等物であってもよい。 かかる同等物としては、 上記マウス 由来のネフロネクチンのアミノ酸配列を示す配列番号 1 7 (short form) ま たは配列番号 1 9 (long form)において、 1若しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンの α 4鎖またはひ 5鎖に結合性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。 な お、 相同性の範囲としては、 ァミノ酸配列が配列番号 1 7または 1 9に対し て 7 0 %以上、 好ましくは 7 5 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上の同等性 を有する範囲を挙げることができる。 具体的には、 マウス以外の動物、 好ま しくは哺乳類に由来するネフロネクチンを挙げることができる。 特に好まし くはヒ ト由来のネフロネクチンである。ヒト由来のネフロネクチンとしては、' 配列番号 1 7 〔マウス由来のネフロネクチン (short form) のァミノ酸配列〕 に対して 7 5 %以上、 好ましくは 8 0 %以上の同一性を有しているものを挙 げることができる。 配列番号 5 3に示すアミノ酸配列は、 現在報告されてい るヒ ト由来のネフロネクチンのアミノ酸配列である。当該ネフロネクチンは、 マウス由来のネフロネクチン （配列番号 1 7 ： short form) に対して、 8 0 %以上 （詳細には 8 2 . 6 %) の同一性を有している。 このヒト由来のネフ ロネクチンは、 その 391〜509アミノ酸領域に 「MAMドメイン」 を有してお り、 N末端から順に 「シグナルペプチド」 （1 - 19aa) 、 「E G F繰り返し配 歹 [J」 （「E G F様ドメイン 1」 （57 - 88aa)、 「E G F様ドメイン 2」 （89— 127aa)、 「E G F様ドメイン 3」 （128- 168aa)、 「E G F様ドメイン 4」 （169 - 212aa)、 「E G F様ドメイン 5」 （213- 253aa) )、 「R G Dリンカ一部位」 （254 - 390aa)、 及び 「MAMドメイン」 （391 - 509aa) から構成されている。 伹し、 本発明が 対象とするヒト由来のネフロネクチンはこれに限定されず、前述するように、 配列番号 1 7に対して 7 5 %以上、 好ましくは 8 0 %以上の同一性を有する ヒ ト由来ネフロネクチンであればよい。
マウス由来の MA E G蛋白質のアミノ酸配列を配列番号 2 1に示す。 当該 MA E G蛋白質は 5 5 0アミノ酸から構成され、 その 395〜550アミノ酸領域 に MAMドメインを有している。 上記と同様、 本発明の標的指向性運搬体が 有するポリペプチドは、 これに限定されることなく、 例えば当該 MAEG蛋 白質のアミノ酸配列と相同性を有する同等物であってもよい。 かかる同等物 としては、 上記配列番号 2 1のアミノ酸配列において、 1若しくは複数のァ ミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンの ひ 3鎖に結合性を有するアミノ酸配列を有するものを挙げることができる。な お、 相同性の範囲としては、 ァミノ酸配列が配列番号 2 1に対して 6 5 %以 上、 好ましくは 70%以上、 より好ましくは 7 5%以上の同等性を有する範 囲を挙げることができる。 具体的には、 マウス以外の動物、 好ましくは哺乳 類に由来する MAEG蛋白質を挙げることができる。 特に好ましくはヒト由 来の MAEG蛋白質である。 ヒ ト由来の MAEG蛋白質としては、 配列番号 2 1 〔マウス由来の MAEG蛋白質のアミノ酸配列〕 に対して 7 0%以上、 好ましくは 7 5%以上の同一性を有しているものを挙げることができる。 現' 在報告されているヒト由来の MAEG蛋白質のアミノ酸配列を配列番号 5 5 に示すが、 当該 MAEG蛋白質は、 配列番号 2 1で示されるマウス由来の M AEG蛋白質に対して、約 7 5%以上 （詳細には 7 7. 6%) の同一性を有し ている。
以上のぺプチド又はポリべプチドの形態を有する標的指向性運搬体によつ て、 標的細胞または組織に運搬することのできる目的物質としては、 ァミノ 酸、 ポリアミノ酸、 ペプチド、 ポリペプチド、 及び蛋白質等の形態を有する ものを挙げることができる。
また本発明の標的指向性運搬体は、 上記ポリぺプチドの形態を有するもの 以外に、 核酸の形態を有するものであってもよい。 すなわち、 本発明の標的 指向性運搬体には、 MAMドメインもしくはそれを一部に有するポリべプチ ドをコードする遺伝子を有する核酸であって、 所望の薬物を結合させて、 該 薬物を標的組織に輸送するために用いられる標的指向性運搬体が含まれる。
MAMドメインをコードする遺伝子としては、 ネフロネクチン、 MAEG 蛋白質、 メプリンひ、 メプリン β、 ェユーロピリン 1、 ニューロピリン 2、 RP TP κ、 または R ΡΤΡ μなどの各種蛋白質の MAMドメインをコード する遺伝子を挙げることができる。 マウス由来のネフロネクチンの MAMド メイン （ポリぺプチド） をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号 2 ； MA E G蛋白質の MAMドメイン （ポリペプチド） をコードする遺伝子の塩基配 列は配列番号 4 ；メプリン αの MAMドメイン （ポリぺプチド） をコードす る遺伝子の塩基配列は配列番号 6 ； メプリン βの MAMドメイン （ポリぺプ チド） をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号 8 ；ニューロピリン 1の M AMドメイン （ポリペプチド） をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号 1 0 ： ニューロピリン 2の MAMドメイン （ポリペプチド） をコードする遺伝 子の塩基配列は配列番号 1 2 ： R P T P Kの MAMドメイン （ポリぺプチド） をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号 1 4 ： R P T P の MAMドメイ ン （ポリぺプチド） をコードする遺伝子の塩基配列は配列番号 1 6に記載の 通りである。 なお、 これらに限定されることなく、 本発明が対象とする核酸 には、 マウス以外の動物、 好ましくは哺乳類に由来する上記各種蛋白質の M AMドメインをコードする遺伝子が含まれる。 より好ましくはヒ ト由来する' 上記各種蛋白質の MAMドメイン （ポリペプチド） をコードする遺伝子であ る。
例えば、 上記マウス由来の各種 MAMドメインをコードする遺伝子の塩基 配列と、 ヒ ト由来の各種 M AMドメインをコードする遺伝子の塩基配列との 関係は、 下表の通りである。
Figure imgf000022_0001
MAMドメインをコードする遺伝子として、 好ましくはネフロネクチンの MAMドメインをコードする遺伝子及び MA E G蛋白質の MAMドメインを コードする遺伝子を挙げることができる。
マウスのネフロネクチンの M AMドメインをコードする遺伝子の塩基配列 を配列番号 2に示すが、 本発明の標的指向性運搬体 （核酸） が有する遺伝子 は、 これに限定されることなく、 例えば当該 MAMドメイン遺伝子の塩基配 列と相同性を有する機能同等物であってもよい。かかる機能同等物としては、 上記配列番号 2の塩基配列の相補的配列に対してストリンジェントな条件で ハイブリダイスする塩基配列を有し、 かつその発現産物 （ポリペプチド） 力 S ラミニンの α 4鎖または α 5鎖に結合性を有するものを挙げることができる。 なお、 相同性の範囲としては、 塩基配列が配列番号 2に対して 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好ましくは 8 5 %以上、 更に好ましくは 9 0 % 以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。 具体的には、 マウス以外 の動物、 好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチンの ΜΑΜドメインをコ ードする遺伝子を挙げることができる。 好ましくはヒトに由来するネフロネ クチンの ΜΑΜドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。 ヒト由 · 来のネフロネクチンの ΜΑΜドメインをコードする遺伝子としては、 配列番 号 2 (マウス由来のネフロネクチンの ΜΑΜドメインをコードする塩基配列） に 対して 8 5 %以上、 好ましくは 9 0 %以上の同一性を有しているものを挙げ ることができる。 上記の表に示すヒト由来のネフロネクチンの ΜΑΜドメイ ンの遺伝子をコードする塩基配列 （配列番号 3 8 ) はその一例である。
マウス由来の MA E G蛋白質の ΜΑΜドメインをコードする遺伝子の塩基 配列を配列番号 4に示すが、 本発明の標的指向性運搬体 （核酸） が有する遺 伝子は、 これに限定されることなく、 例えば当該 ΜΑΜドメイン遺伝子の塩 基配列と相同性を有する機能同等物であってもよい。 かかる機能同等物とし ては、 上記配列番号 4の塩基配列の相補的配列に対してストリンジヱントな 条件でハイブリダイスする塩基配列を有し、 かつその発現産物 （ポリべプチ ド）がラミニンの 3鎖に結合性を有するものを挙げることができる。なお、 相同性の範囲としては、 塩基配列が配列番号 4に対して 7 0 %以上、 好まし くは 7 5 %以上、 より好ましくは 8 0 %以上、 更に好ましくは 8 5 %以上の 同等性を有する範囲を挙げることができる。具体的には、マウス以外の動物、 好ましくは哺乳類に由来する MA E G蛋白質の ΜΑΜドメインをコードする 遺伝子を挙げることができる。 好ましくはヒトに由来する MA E G蛋白質の MAMドメインをコードする遺伝子を挙げることができる。 ヒト由来の MA E G蛋白質の MAMドメインをコードする遺伝子としては、 配列番号 4 (マ ウス由来の MA E G蛋白質の MAMドメインをコードする塩基配列）に対して 8 0 %以上、 好ましくは 8 5 %以上の同一性を有しているものを挙げることが できる。 上記の表に示すヒト由来の MA E G蛋白質の MAMドメインの遺伝 子をコードする塩基配列 （配列番号 4 0 ) はその一例である。
また本発明の標的指向性運搬体 （核酸） は、 MAMドメインを一部に有す るポリべプチドをコ一ドする遺伝子を有するものであってもよい。 MAMド メインを一部に有するポリペプチド （蛋白質を含む） としては前述するよう に、 具体的には、 ネフロネクチンの全長蛋白質、 ネフロネクチンの MAMド メインと R G Dリンカ一部位との結合体、 ネフロネクチンの MAMドメィン と E G Fドメインまたはその繰り返し配列との結合体、 MA E G蛋白質、 メ プリンひ、 メプリン j8、ニューロピリン 1、ニューロピリン 2、 R P T P K 、 ' 及ぴ R P T P μなどを例示することができる。
ΜΑΜドメインを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子として、 好ましくはネフロネクチン （全長） をコードする遺伝子、 及び MA E G蛋白 質をコードする遺伝子を挙げることができる。
マウスに由来するネフロネクチンをコードする遺伝子の塩基配列を配列番 号 1 8 (short form) 及び 2 0 (long form) に示す。 ただし、 本発明の標的 指向性運搬体が有する核酸は、 これに限定されることなく、 例えば当該ネフ ロネクチンの遺伝子の塩基配列と相同性を有する機能同等物であってもよい。 かかる機能同等物としては、 上記配列番号 1 8または 2 0の塩基配列の相補 的配列に対してストリンジェントな条件でハイブリダイスする塩基配列を有 し、 かつその発現産物 （ポリペプチド） がラミニンの α 4鎖またはひ 5鎖に結 合性を有するものを挙げることができる。 なお、 相同性の範囲としては、 塩 基配列が配列番号 1 8または 2 0に対して 7 0 %以上、 好ましくは 7 5 %以 上、より好ましくは 8 0 %以上の同等性を有する範囲を挙げることができる。 具体的には、 マウス以外の動物、 好ましくは哺乳類に由来するネフロネクチ ンをコードする遺伝子を挙げることができる。 特に好ましくはヒト由来のネ フロネクチンをコードする遺伝子である。 ヒト由来のネフロネクチンをコー ドする遺伝子としては、配列番号 1 8 〔マウス由来のネフロネクチン （short form) をコードする遺伝子の塩基配列〕 に対して 75 %以上、 好ましくは 8 0%以上の同一性を有しているものを挙げることができる。 配列番号 54に 示すアミノ酸配列は、 現在報告されているヒト由来のネフロネクチンをコー ドする遺伝子の塩基配列である。 当該塩基配列は、 マウス由来の遺伝子の塩 基配列 （配列番号 1 8 ： short form) に対して、 80 %以上（詳細には 82. 6%) の同一性を有している。
マウスに由来する MAEG蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列を配列番 号 22に示す。 上記と同様、 本発明の標的指向性運搬体が有する核酸は、 こ れに限定されることなく、 例えば当該 MAE G蛋白質の遺伝子の塩基配列と 相同性を有する機能同等物であってもよい。 力かる機能同等物としては、 上 記配列番号 22の塩基配列の相補的配列に対してストリンジェントな条件で ハイブリダイスする塩基配列を有し、 かつその発現産物 （ポリペプチド） が' ラミニンのひ 3鎖に結合性を有するものを挙げることができる。 なお、相同性 の範囲としては、 塩基配列が配列番号 22に対して 70 %以上、 好ましくは 75%以上、 より好ましくは 80%以上の同等性を有する範囲を挙げること ができる。 具体的には、 マウス以外の動物、 好ましくは哺乳類に由来する M AEG蛋白質をコードする遺伝子を挙げることができる。 特に好ましくはヒ ト由来の MAEG蛋白質をコードする遺伝子である。 ヒト由来の MAEG蛋 白質をコードする遺伝子としては、 配列番号 22 〔マウス由来の MAEG蛋 白質をコードする遺伝子の塩基配列〕 に対して 75%以上、 好ましくは 80 %以上の同一性を有しているものを挙げることができる。 配列番号 56に示 すアミノ酸配列は、 現在報告されているヒト由来の MAEG蛋白質をコード する遺伝子の塩基配列である。 当該塩基配列は、 マウス由来の遺伝子の塩基 配列 （配列番号 22) に対して、 80%以上 （詳細には 82. 6%) の同一 性を有している。
以上のポリヌクレオチド （核酸） の形態を有する標的指向性運搬体によつ て、 標的細胞または組織に運搬することのできる目的物質としては、 オリゴ ヌクレオチド、 ポリヌクレオチド等の形態を有するものを挙げることができ る。 なお、 当該標的指向性運搬体 （核酸形態） は、 MAMドメイン若しくは M AMドメインを一部に有するポリべプチドをコ一ドする遺伝子を、 発現可能 な状態で他の塩基配列に組み込まれてなる、 所謂発現ベクター （発現カセッ ト） の形態で有するものであってもよい。
本発明で用いられる発現ベクターは、 上記 MAMドメイン若しくは MAM ドメインを一部に有するポリペプチド （以下、 これらを纏めて 「目的のポリ ペプチド」 という） をコードする遺伝子を、 標的細胞内 （好ましくは哺乳類 由来の細胞内、 よりこのヒ ト生体内） で発現 ·機能可能な状態で含むもので あればよい。
一般に発現ベクターは、 目的のポリペプチドを、 対象とする宿主内で発現 させるために、 転写の下流方向順に必要に応じて（1)プロモーター機能領域、 (2)リポソーム結合部位、 （3)翻訳開始コドン、 （4)シグナルべプチドをコ一ド する塩基配列をもつ D N A、 (5) 目的のポリペプチドをコードする塩基配列 をもつ D N A、 （6)翻訳終始コドン、 （7)ターミネータ一、 （8)宿主中で自己複 製可能な自律性複製配列 (レブリコン) 、 （10)相同領域等を、 含むように構 築される。
なお、 ここで発現可能とは、 発現ベクターを所望の細胞若しくは生体内に 導入した場合に、 発現ベクターが目的のポリぺプチドをコ一ドする遺伝子を 発現するように機能することを意味する。 また、 機能可能とは、 発現べクタ 一を生体内に導入した場合に、 発現ベクターが目的のポリペプチドをコード する遺伝子を発現し、 目的のポリぺプチドを産生するように機能することを 意味する。 かかる発現ベクターは、 当業界の遺伝子工学的手法を用いること によって作成することができる。
より好ましくは、 哺乳類由来の細胞内で遺伝子発現が可能な発現ベクター (発現カセット） であり、 特に好ましくは、 ヒト由来の細胞内で遺伝子発現 が可能な発現カセットである。 発現カセットに用いられる遺伝子プロモータ 一には、 例えばアデノウィルス、 サイトメガロウィルス、 ヒト免疫不全ウイ ノレス、 シミアンウィルス 40、 ラウス肉月重ゥイノレス、 単純へノレぺスゥイノレス、 マウス白血病ウィルス、 シンビスウィルス、 センダイウィルス、 A型肝炎ゥ ィルス、 B型肝炎ウィルス、 C型肝炎ウィルス、 バピローマウィルス、 ヒ ト T細胞白血病ウィルス、 インフルエンザウイルス、 日本脳炎ウィルス、 J C ウィルス、 バルボウイルス Β 1 9、 ポリオウイルス等のウィルス由来のプロ モーター、 アルブミンや熱ショック蛋白等の哺乳類由来のプロモーター、 C A Gプロモーター等のキメラ型プロモーター等が含まれる。
遺伝子によってコードされた目的の運搬物質 （被運搬物質） を、 細胞外に 分泌おょぴ zまたは細胞内の局所に滞留させるためのシグナル配列としては、 細胞外への分泌を補助するィンターロイキン 2由来のシグナルぺプチド （駒 田富佐夫、 日本薬学会第 115年会講演要旨集 4, 12, 1995) や核局在化を促進 するアデノウィルス Ela由来のぺプチド、ポリオ一マウィルスラージ T抗原由 来のペプチド、 SV40ラージ T抗原由来のペプチド、 ヌクレオプラスミン由来 のペプチド、 HTLVlp24転写後調節蛋白質由来のペプチド （Kalderon, D. , et al. , Cell, 39, 499, 1984) 等を用いることができる。
上記の発現ベクター （発現カセット） は、 遺伝子工学的手法に従って、 所 望の目的の運搬物質 （被運搬物質） の遺伝子 （例えば、 生理活性ペプチドを コードする遺伝子など） （以下、 「薬物遺伝子」 ともいう） を導入すること により、 いわゆる 「標的指向性薬物複合体」 の形態として、 遺伝子治療に使 用することができる。 発現ベクター （発現カセット） に薬物遺伝子を導入す る一つの方法として、 発現ベクター (発現カセット) に組み込む上記 「（5) 目的のポリペプチドをコードする塩基配列をもつ D N A」 として、 MAMド メイン若しくは M AMドメインを一部に有するポリペプチドと薬物 （生理活 性ペプチドなど） とが融合したポリペプチド （目的のポリペプチド） をコー ドする遺伝子を用レ、る方法を挙げることができる。
本発明は、 患者から標的細胞を体外に取り出し、 これに薬物遺伝子を上記 「標的指向性薬物複合体」 を用いて導入した後に、 再びその細胞を患者の体 内に戻すという自家移植による遺伝子治療 （ex vivo遺伝子治療） に使用可能 である。 また、 薬物遺伝子を上記 「標的指向性薬物複合体」 を用いて直接患 者に投与する遺伝子治療 （in vivo遺伝子治療） にも使用可能である。 また、 遺伝子治療の方法として、異常 （原因）遺伝子をそのままにして、新しい （正 常） 遺伝子を付け加える方法 （Augmentation Gene Therapy) と、 異常遺伝子 を正常遺伝子で置き換える方法 （Replacement Gene Therapy) に大別できる 力 本発明の発現ベクター （核酸運搬体） はどちらにも使用可能である。
(2) 標的指向性薬物複合体
このように、 本発明は、 前述する標的指向性運搬体に所望の目的物質を結 合させたものを予防 ·治療用組成物または化粧料組成物として提供するもの でもある。 当該目的物質としては、 薬効や生理学的活性を有する物質を挙げ ることができる。 以下、 こうした物質を、 本明細書中では単に 「薬物」 と称 する。
本発明の標的指向性運搬体に結合して用いられる薬物としては、 それに結 合できるものであれば特に制限されないが、 本発明の標的指向性運搬体がポ リぺプチドの形態の場合は生理活性べプチドゃ抗体などを、 また核酸の形態 の場合は生理活性ペプチドをコードする遺伝子、 iRNA、アンチセンスなど を例示することができる。
ここで生理活性べプチドとは、 種々の生理活性を有するぺプチド、 ポリべ プチド及ぴタンパク質の総称であり、 例えばサイトカイン、 細胞成長因子が 挙げられる。 例えば、 繊維芽細胞増殖因子 （FGF) ファミリー、 トランス フォーミング増殖因子 j3 (TGF— ） ファミリー、 上皮増殖因子 （EGF) フアミリー、血小板由来増殖因子（PDGF) 、インシュリン様増殖因子（I GF) 、 神経増殖因子 （NGF) ファミリー、 血管内皮細胞増殖因子 （VE GF) 、肝細胞増殖因子 （HGF)等の細胞増殖因子類及び骨形成因子類（B MP類）等の細胞分化因子類を含む細胞成長因子並ぴにィンターフェロン（ I FN) 類、 インターロイキン （I L) 類、 コロニー刺激因子 （CS F) 類、 エリスロポエチン、 腫瘍壊死因子 （TNF) 等を含むサイトカイン類、 若し くはインシュリン、 パラチロイ ドホルモン （PTH) 等の各種ホルモン類ま たはマトリックスメタ口プロテアーゼ （MMP) 類等のプロテアーゼ等の酵 素類、 並びに T IMP (Tissue Inhibitor of Metalloprotease) 等の酵素阻 害剤などを挙げることができる。
本発明の標的指向性運搬体が、 ポリペプチドの形態である場合、 標的指向 性薬物複合体は、 標的指向性運搬体と例えば上記生理活性べプチド等とのハ イブリッドボリぺプチドとして提供される。 当該ハイブリッドボリぺプチド は、 標的指向性運搬体 （ポリペプチド） をコードする遺伝子と生理活性ぺプ チド等をコードする遺伝子とが遺伝子工学的手法により連結された状態の核 酸を用いて、バクテリア （好ましくは Esherichia coli)、真核細胞（酵母）、 昆虫細胞または動物細胞を利用して工業的に生産することができる。 また、 本発明の標的指向性運搬体が、 核酸の形態である場合、 標的指向性薬物複合 体は、 標的指向性運搬体 （核酸） と例えば上記生理活性ペプチドをコードす る遺伝子等とのハイプリッド遺伝子として提供され、 細胞内もしくは生体内 でハイブリッドポリべプチドとして産生される。
本発明のハイブリッドボリぺプチド （標的指向性薬物複合体） 、 もしくは 本発明のハイブリッド遺伝子 （標的指向性薬物複合体） 力 ら生成されるハイ プリッドポリペプチドは、 標的指向性運搬体 （またはその発現物） が有する 特定のラミニンに対する特異的な結合活性に基づいて、 組織指向性を備えで いる。
ゆえに本発明の標的指向性薬物複合体は、 ドラッグデリパリ一システムま たはターゲッティング療法に有効に利用することができる。 特に、 標的指向 性運搬体としてネフロネクチンの MAMドメインを利用した場合 （一部にネ フロネクチンの MAMドメインを含むものを含む。 例えばネフロネクチンそ のものも含まれる。） は、 当該標的指向性運搬体が備える新生血管、大血管、 腎臓、 肺、 または膝臓に対する特異的組織結合性に基づいて、 所望の薬物を これらの組織に指向させることができ、その結果、当該臓器における濃度（局 所濃度） を高く維持し、 薬物の有効性を高めることができる。 またそれと同 時に、 薬物が他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐこともできる。 具体的に は、 例えば従来より腎炎治療に H G Fが使用されていることから、 薬物とし て H G Fを用いた標的指向性薬物複合体によれば、 H G F単独よりも腎炎を 効果的に治療することが可能となる。 また、 薬物として抗癌剤を用いた標的 指向性薬物複合体によれば、 上記臓器 （腎臓、 肺、 または脖臓） に特異的に 抗癌剤を指向させることができ、 これにより、 副作用を抑制しながら、 これ らの臓器における癌の治療、及ぴ進展予防を行うことが可能である。例えば、 従来より腎癌の治療に使用されているインターロイキン一 2やインターフエ ロン一 αの有効率は 1 5 %程度に過ぎないが、 本発明の標的指向性運搬体を 利用することで腎臓への移行性及び局在性を高め、 有効率をより向上させる ことが可能であると期待される。 また、 肺癌治療剤としてハーセプチン （抗 体医薬） などが知られているが、 これについても同様である。
また近年、 血管の新生を抑制することによって癌の進展や転移を抑制でき ることが知られている。 従って、 薬物として血管新生抑制剤 （例えば、 イン テグリン α 2阻害剤などが知られている。 ) を用いた標的指向性薬物複合体 によれば、標的指向性運搬体が有する新生血管への特異的結合性に基づいて、 血管新生抑制剤を新生血管に指向させることができ、 その有効率をより向上 させることが可能であると期待される。
また、 標的指向性運搬体として MA E G蛋白質の ΜΑΜドメインを利用し た場合は （一部に MA E G蛋白質の ΜΑΜドメインを含むものを含む。 例え ば MA E G蛋白質そのものも含まれる。 ) 、 当該標的指向性運搬体が備える' 毛包、 皮膚 （表皮） 、 肺に対する特異的組織結合性に基づいて、 薬物をこれ らの組織に指向させることができ、 その結果、 当該臓器における濃度 （局所 濃度） を高く維持し、 薬物の有効性を高めることができる。 またそれと同時 に、 薬物が他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐこともできる。 例えば、 皮 膚癌は、 近年増加する傾向にありながらもよい治療薬がない疾患の一つであ る。 従って、 これまでに開発された抗癌剤を上記標的指向性運搬体を利用す ることによつて皮膚に特異的に指向させて局在化させることができ、 その結 果、 全身性の副作用を低減しながらも、 これらの皮膚における有効な癌の治 療を行うことが可能であると期待される。
またこの手法は、 癌領域以外の疾患にも適用できる。 たとえば、 5ひリダ クターゼ阻害剤は頭髪の育毛剤として知られているが、 本発明の標的指向性 運搬体を利用して標的指向性薬物複合体の形態にすることで、 当該薬剤を頭 髪の毛包に特異的に移行させて局在化させることが可能であり、 その結果、 その効果をより一層高めることが可能であると考えられる。 また、 薬物とし て E G Fや K G F (keratinocyte growth factor) を用いた場合、 これを本 発明の標的指向性薬物複合体の形態にすることで皮膚創傷部位や切開部位に 特異的に移行させることができ、 その結果、 短時間に治癒させることが可能 である。 本発明に係る標的指向性薬物複合体は、 このように、 好ましくは医薬組成 物として生体に投与して使用されるが、 生体への投与の方法については、 特 に制限はない。例えば非経口的投与、例えば注射投与を挙げることができる。 かかる医薬組成物中には薬学的に許容できる担体や種々の添加剤を添加する ことができる。 また、 本発明に係る医薬組成物の用量は、 その使用方法、 使 用目的等により異なるが、 当業者は容易に適宜選択、 最適化することが可能 である。 例えば、 注射投与して用いる場合には、 標的指向性薬物複合体に含 まれる有効成分の量として、 1日あたり約 0. 1 // § ¾§〜100011^/1¾を投与す るのが好ましい。 より好ましくは、 1日あたり約 l i g/kg〜100 mgZkgであ る。 実 施 例
以下、 本発明を詳細に説明するために実験例を記載する。 伹し、 本発明は これらの実験例によって何ら限定されるものではない。 なお、 下記の実験例 において使用される略語の正式名称は、 下記の通りである。
B S A： bovine serum albumin (ゥシ血清ァノレブミン)
C B B ： Coomasie Brilliant Blue (クーマシープリリアントブルー） E C M： extracellular matrix (細胞外マトリックス）
E D T A： ethylenediaminetetraacetic acid (エチレンジァミン四酉乍酸) E G F ： epidermal growth factor (上皮増殖因子）
G S T ： glutathione S- transferase (グルタチオン転移酵素）
k D ： kilo dalton (キロダノレトン）
H R P ： horseradish peroxidase (西洋ヮサビ過酸化酵素）
mA b ： monoclonal antibody 、モノクロ一ナノレ 体)
MAM domain： meprin, Ao protein, receptor protein - tyrosine phosphatase- μ domain (メプリン、 A5蛋白質、 受容体型蛋白質チロシン脱リ ン酸化酵素ミュードメイン）
MB P ： maltose-binding protein (マノレ卜ース結合蛋白質)
P B S ： phosphate- buffered saline (リン酸緩衝化生理食塩水）
P C R： polymerase chain reaction (^；リメラーセ連叙反 ) PVDF ： polyvinilidene difluoride (ポリビニリデンジフルオリ ド） PMS F ： phenylmethylsulfonyl fluoride (フエニルメタンスルホニルフル オリ ド）
Figure imgf000032_0001
： sodium dodecy丄 sulfate po丄 yacrylamide gel
electrophoresis (ドデシル硫酸ナトリウム一ポリアタリルァミ ドゲル電気泳 動）
TB S ： Tris-buffered saline (トリス緩衝化生理食塩水） 実験例 1 FLAG付きネフロネクチン （全長） 及びその欠損変異体の発 現ベクターの構築、 並びにその発現産物の精製
(1) 発現ベクターの構築
ネフロネクチン （NN) は、 EGF様繰り返し配列 （EGF- like repeat) 、· RGD細胞接着モチーフを含むリ ンカ一部位、 及ぴ MAMドメイン （MAM domain) 力 ら構成されてレヽる（Brandenberger, R. et al. , (2001) J Cell Biol 154, 447-458； Morimura, N. et al.， (2001) J Biol Chem 276, 42172 - 42181)。 マウス由来のネフロネクチン （^ を用いて、 NN (全長） 、 EGF様繰り 返し配歹 (!（丽- EGFと略）、 NNから MAMドメインを欠失させたもの（ΝΝ-ΔΜΑΜ と略） 、 RGDリンカ一部位 （丽 - RGDと略） 、 及び M AMドメイン （丽- MAM と略） の各々について、 それぞれ C末端に F LAGタグ（Sigma社）を付加した 発現ベクターを構築した。 図 1に、 C末端に FLAGタグを付加した各タン パク質のドメイン構造を示す （但し、 NN - EGFは示さず） 。
(a) F LAG付き全長ネフロネクチン（NN-FLAG)の発現ベクターの構築（図 2)
丽- FLAGは、 全長 NN (マウス) の cDNAを、 3 '末端の FLAGタグとコドンが 合うように pFLAG-CMVベクターに揷入することによって作成した。具体的には、 まず、 NN (マウス）の cDNA配列（5' -非翻訳領域、 open reading frame (0RF)、 及び 3'-非翻訳領域の全てを含む 2541bp) を、 図中矢印で示すプライマー (forward primer：— 5bp力、らスタート、 Eco RI部 付さ、 reverse： 1683bp (ストップコドン削除） からスタート、 Not I部位付き） を用いて PCR増幅し、 得られた PCR産物を、 pCI-kanaベクターの Eco RI/Not I部位に揷入してベ クターを作成した。 次いで、 このベクターを Not Iで切断し、 T4 polymerase で平滑末端に処理した後、 Eco RIで切断した。 これを、 同様に処理した pFLAG- CMV5aベクター （Pst Iで切断し、 T4 polymeraseで平滑末端に処理した 後、 Eco RIで切断処理） とライゲーシヨンして、 C末端に FLAGタグを有する 全長ネフロネクチン発現ベクターを構築した。
( b ) F L A G付き MAMドメイン欠損丽 （匪- Δ MAM-FLAG) の発現ベクターの 溝築
N N (マウス） の cDNA配列 （5， -非翻訳領域、 open reading frame (ORF)、 及び 3，-非翻訳領域の全てを含む 2541bp) を、 pBlueScriptの multi- cloning 部位 （5' -Sal I/Xho I、 3' -Bam HI部位） に揷入して調製したベクターを鎵型 と して、 図 中矢印で示す 2 種類のプライ マー 〔 forward ： 5， - GAATTCGAGATCCCGGGACGC- 3， （ 配 列 番 号 2 3 ) 、 reverse ：' 5' -GTCGACGTCGTCCTTTCATTCCTC-3' (配列番号 2 4 ) 〕 を用いて、 PCR法 （K0D plus DNA polymerase, T0Y0B0) により、 その- 61〜1242bpの領域を増幅した。 得られた PCR産物を、 EcoR V cut/BAP処理した pBlueScript II KS +にサブク ローニングして配列を確認した後、 Eco RI/Sal Iで切断してこれを、 同じく Eco RI/Sal Iで切断した pFLAG- CMV5aベクターにライゲーシヨンして、 C末端 に FLAGタグを有する MAMドメイン欠損ネフロネクチン （丽_ Δ MAM-FLAG) 発現 ベクターを構築した。
( c ) F L A G付き R G Dリンカ一部位 （丽- RGD- FLAG) の発現ベクターの構 築
i ) N N (マウス）の cDNA配列（5' -非翻訳領域、 open reading frame (ORF)、 及ぴ 3，-非翻訳領域の全てを含む 2541bp) を、 pBlueScriptの multi-cloning 部位 （5' -Sal I/Xho I、 3' -Bam HI部位） に揷入して調製したベクターを錶型 と して、 図 中矢印で示す 2 種類のプライ マー 〔 forward ： 5， -GAATTCGAGATCCCGGGACGC- 3， （ 配 列 番 号 2 5 ) 、 reverse ： 5' -GGGCCCGTCGAAGTCGGCAGC-3' (配列番号 2 6 )〕 を用いて、 PCR法（K0D plus DNA polymerase, T0Y0B0) により、 その- 61〜69bpの領域を増幅した。 得られ 广こ PCR産物を、 EcoR V cut/BAP処理した pBlueScript II KS +にサブクロー二 ングして配列を確認した。 ii) 一方、 上記 N N (マウス） の cDNA配列を含むベクターを铸型として、 図 中 矢 印 で'示 す 2 種 類 の プ ラ イ マ ー 〔 forward ： 5' -GGGCCCAAAGTCATGATTGAAC-3' ( 配 列 番 号 2 7 ) 、 reverse ： 5' -GTCGACGTCGTCCTTTACTTCCTC-3' (配列番号 2 8 ) を用いて、 PCR法 （LA taq polymerase, TAKARA, GCI buffer使用） により、 その 769- 1242bpの領域を増 幅した。 得られた PCR産物を、 EcoR V cut/BAP処理した pBlueScript II KS + にサブクローエングして配列を確認した。
ii i) 上記 i)及び ii)で調製した PCR産物をそれぞれ Eco RI/Apa I及び Apa 1/ Sal Iで切断してこれらを、 Eco Rl/Sal Iで切断した pFLAG - CMV5aベクターに ライゲーシヨンして、 C末端に FLAGタグを有する R G Dリンカー部位 (N -RGD-FLAG) 発現べクタ一を構築した。
( d ) F L A G付き MAMドメイン （丽- MAM-FLAG) の発現ベクターの構築
i ) N N (マウス）の cDNA配列（5，-非翻訳領域、 open reading frame (ORF)、 及び 3，-非翻訳領域の全てを含む 2541bp) を、 pBlueScriptの multi-cloning 部位 （5' - Sal I/Xho I、 3' -Bam HI部位） に揷入して調製したベクターを錄型 と して、 図 中矢印で示す 2 種類のプラ イ マー 〔 forward ： 5' -GAATTCGAGATCCCGGGACGC-3' ( 配 列 番 号 2 9 ) 、 reverse ： 5' -GGGCCCGTCGAAGTCGGCAGC-3' (配列番号 3 0 )〕 を用いて、 PCR法（KOD plus DNA polymerase, T0Y0B0) により、 その- 61〜69bpの領域を増幅した。 得られ た PCR産物を、 EcoR V cut /BAP処理した pBlueScript II KS +にサブクロー二 ングして配列を確認した。
ii) 一方、 上記 N N (マウス） の cDNA配列を含むベクターを铸型として、 図 中 矢 印 で 示 す 2 種 類 の プ ラ イ マ ー 〔 forward ： 5' - GGGCCCGGTATTCTCATACACAGC- 3' ( 配 列 番 号 3 1 ) 、 5' -GTCGACGCAGCGACCTCTTTTCAAG-3' (配列番号 3 2 ) を用いて、 PCR法（LA taq polymerase, TAKARA, GCI buffer使用） により、 その 1243- 1683bpの領域を増 幅した。 得られた PCR産物を、 Eco RI/BAP処理した pBlueScript II KS +にサ ブクローニングして配列を確認した。
iii) 上記 i)及ぴ ii)で調製した PCR産物をそれぞれ Eco RI/Apa I及ぴ Apa 1/ Sal Iで切断してこれらを、 Eco Rl/Sal Iで切断した pFLAG- CMV5aベクターに ライゲーシヨ ンして、 C末端に FLAGタグを有する M A M ドメイン (NN-MAM-FLAG) 発現べクタ一を構築した。
( 2 ) 発現、 及ぴ発現産物の精製
Freestyle™ 293 Expression system (Invitrogen) の説明書に従って、 上 記で調製した各発現ベクターを Freestyle™ 293-F細胞（Invitrogen)に一過的 に遺伝子導入した。 遺伝子導入から 6 0時間後、 培養上清を集め、 細胞ゃ不 溶物を取り除くため遠心した。 その後 Triton X- 100 (終濃度 1 %)、 EDTA (同 5mM) 、 PMSF (同 ImM) 、 アジ化ナトリウム （同 0. 02 %) をそれぞれ上清に添 力 0し、 さらに抗 FLAG affinity beads (Sigma)を添加して 4 °Cでー晚撹拌した。 抗 FLAG affinity beadsを空のカラムに移し、 TBS (10 mM Tris-HCl (pH7. 4) and 150 mM NaCl)でビーズを洗浄した。 洗浄後、 ビーズに結合した各蛋白質を、 · 100 μ g/mlの FLAGぺプチドを含む TBSで溶出した。溶出した各蛋白質を、 0. 5 mM EDTA を含む 2 mM CAPS緩衝液（pH 11. 4)で透析してペプチドを除去し、 精製 された蛋白質を取得した。
以上の全長 NN- FLAG、 顺- Δ MAM- FLAG、 NN- RGD- FLAG、 及ぴ丽- MAM- FLAGにつ いて予想される分子量は、 それぞれ 65 kD、 47 kD、 15 kD、 及び 18 kDである。 し力 し、 これらの蛋白質を抗 FLAG affinityカラム 〔抗 FLAGモノクローナル抗 体 （抗 FLAG mAb)は Sigmaから入手〕 で精製し、 還元条件下で SDS-PAGEで展開 したところ、 図 5に示すように、 画- MAM以外の全ての蛋白質は予想されたサ ィズより大きな分子量となって検出された。なお、図 5の A及び Bにおいて、 それぞれ右側は電気泳動後 CBB (Coomassie Brilliant Blue R-250) 染色した 結果を、 左側は電気泳動後、 抗 FLAG M2モノクローナル抗体 （抗 FLAG mAb) を用いて免疫プロッキングを行った結果を示す。
上記の理由として、以前より報告されているように、 RGDリンカ一部位が多 量の 0 -結合型糖鎖による修飾を受けている可能性が考えられた (Brandenberger, R. et al. , (2001) J Cell Biol 154, 447-458； Morimura, N. et al. , (2001) J Biol Chem 276, 42172-42181)。 また、 これらの蛋白質を シァリダーゼで処理したところ、 SDS - PAGEによる見かけの分子量が低下した。 このことからも、 上記に示すように精製した蛋白質の見かけの分子量が予想 と大きく異なるのが、シアル酸による翻訳後修飾のためであると考えられた
( 3 ) ネフロネクチンの分子像 （電子顕微鏡） （図 6 )
精製した NN溶液 （75 M g/ml, 3 μ 1) を等量の 2 %酢酸ウラン溶液で 3 0 秒間染色し（ネガティブ染色）、その後、透過型電子顕微鏡 (JEM- 100CX, JE0L) で解析した。顕微鏡は加速電圧 1 0 0キロボルトで実行し、映像は 14 bit deep CCD camera (TVIPS)で、 2k x 2kピクセルの解像度でデジタル映像として記録 した。 結果を図 6 Aに示す。 その結果、 NNの単量体は V字型の構造であるこ とが確認できた。 電子顕微鏡写真の解析から推測される全長匪の分子構造を 図 6 Cに示す。 これに示すように、 EGF様繰り返し配列と MAMドメインは互い に向き合い、 リンカー部位が蝶つがいのようにこれらのドメインを繋いでい ると推測された。 また、 単量体に加えて、 多くの凝集した多量体も観察され た。 これは NNが丽自身と相互作用しうる可能性を示唆している。 実験例 2 ネフロネクチン （全長） 及ぴその欠損変異体の α 8 1インテ ダリンへの結合活性
ネフロネクチン （全長） 及びその欠損変異体のひ 8 1インテグリンに対 する結合活性を調べるために、全長丽- FLAG、 NN- Δ MAM- FLAG、顧- RGD- FLAG、 及び NN- MAM- FLAGを用いて、 KA8細胞 （インテグリン α 8鎖を安定に発現する 白血病細胞） 及びその親細胞である Κ562細胞に対する細胞接着アツセィを行 つた
具体的には、まず、 ΚΑ8細胞及ぴ Κ562細胞をそれぞれ、予め 30ηΜの NN- FLAG、 ΝΝ- Δ MAM-FLAG 、 NN- RGD- FLAG、 または NN- MAM- FLAGでコーティングしておい た 96穴マイクロタイタープレートに播種し（5. 0 X 104細胞/ゥエル）、 37°C、 5 %の二酸化炭素を含む加湿した空気内で 2時間静置した。 その後、 接着し た細胞を 15分間、 3. 7%ホルムアルデヒドで固定化し、接着していない細胞を PBSで 4回洗 することによって除去し、 0. 1%トルイジンプル一入り PBSで 10 分間染色した。
KA8細胞に関する結果を図 7に示す。 図に示すように、 KA8細胞は、 全長 NN-FLAG (図中、 匪と表記）、 NN- Δ ΜΑΜ-FLAG (図中、 Δ ΜΑΜと表記） 、 及び NN-RGD-FLAG (図中、 RGDと表記）をコーティングしたプレート表面に接着し、 いずれもよく伸長していた。 しかし、 図には示さないが、 K562細胞は、 上記 の全長丽- FLAG、 NN- Δ MAM-FLAG 、 及ぴ丽- RGD- FLAGをコーティングしたプレ ート表面に接着 ·伸展しなかった。 一方、 NN- MAM- FLAG (図中、 MAMと表記） をコーティングしたプレート表面には、 KA8細胞及び K562細胞のいずれも接 着 ·伸展しなかった。 また、 図 7からわかるように、 全長 NN-FLAG (顯） また は丽- A MAM-FLAG ( A MAM)をコーティングしたプレート上の方力 S、丽- RGD- FLAG をコーティングしたプレート上よりも、 細胞がよく伸展していることが観察 された。
この結果から、 全長のネフロネクチン （NN) は、 インテグリン α 8 ]3 1に 対して結合活性と細胞伸展活性を有しており、 インテグリン α 5 3 1には結 合活性を持たないことがわかる。 また、 上記の結果は、 ネフロネクチン （丽) の主な接着活性部位は、 RGDリンカ一部位であること、 そして、 細胞伸展活性 には EGF様繰り返し配列の存在が必要であることを示している。 実験例 3 基底膜蛋白質に対するネフロネクチンの結合性
ネフロネクチン （丽） は、 基底膜に分布していることが知られている
(Brandenberger, R. et al. , (2001) J Cell Biol 154, 447-458； Miner, J. H. (2001) J Cel l Biol 154, 257-259) 。 そこで、 匪の基底膜蛋白質 （ECM蛋白質） との結合性について調べた。 基底膜蛋白質として、 異なるひ鎖をもつ一連の ラミニン 〔マウス LN - 1 ( a l) 、 ヒ ト LN-2/4 (ひ 2) 、 ヒ ト LN— 5 ( a 3) 、 ヒ ト LN-8 ( α 4) 、 ヒ ト LN - 10/11 ( α 5) 〕 、 ヒ ト血漿フイブロネクチン （FN) 、 ビトロネクチン （VN) 、 及ぴ各種コラーゲン 〔ヒ ト I型、 IV型、 V型コラーゲ ン、 ニヮトリ II型コラーゲン〕 を使用した。
( 1 ) 基底膜蛋白質の調製
なお、 マウス LN - 1は Paulssonの手法（Paulsson, M.， et al. , (1987) Eur J Biochera 166, 11-19)に従い、 マウス Engelbreth- Holm-Swarm腫瘍組織から精製 した。 ヒ ト LN- 2/4は、 ヒ ト LN-ひ 2鎖に対するモノクローナル抗体を用いた免 疫親和性クロマトグラフィーにより、ヒ ト胎盤より精製した。ヒ ト LN-5、LN- 8、 及び LN- 10/11はそれぞれ、ヒト胃癌細胞 MKN45 (LN- 5)、 ヒト神経膠腫細胞 T98G CLN-8) 、 及びヒ ト肺腺癌細胞 A549 (LN- 10/11) の培養上清より、 免疫親和 'I生クロマトグラフィーを用いて、 既述の通りに精製した（Fujiwara, H. et al . , (2001) J Biol Chem 276, 17550—17558 ; Fukushima, Y. et al, (1998) Int J Cancer 76, 63- 72 ; Gu， J, , et al, (2002) J Biol Chem 277, 19922- 19928) ( ヒ ト血漿フイブロネクチン（FN) とビトロネクチン（VN)は、 ヒ ト血漿から、 それぞれゼラチン及びへパリン親和性クロマトグラフィ一によつて、 過去の 文献に記載されている通りに精製した（Sekiguchi, K. , et al, (1983) J Biol Chem 258, 14359—14365、 Yatohgo, T. , et al,， (1988) Cell Struct Funct 13， 281-292) o ヒ ト I型、 IV型及び V型コラーゲンと、 ニヮトリ II型コラーゲン は Sigma社より購入した。 コラーゲンの分類型は Bornstein and Traubの報告 (Bornstem, P. et al, 、丄 979) 上' he Chemistry and Bio丄 ogy oi Collagen, Third Ed. The Proteins (Neurath, H. , and Hill, R. し， Eds. )， IV. 4 vols. , ACADEMIC PRESS, New York)に従った。
( 2 ) 固相結合アツセィ （酵素結合免疫吸着検定）
96穴プレートに、 PBSにて希釈した各種の基底膜蛋白質 （10nM) を、 各ゥェ ノレ 50 μ 1ずつ添加して、 4 °Cでー晚静置してコーティングした。 その後、 各ゥ エルに 200 μ 1の 1 %スキムミルク入り PBSを添加して室温で 2時間静置して ブロッキングした。 その後 1%BSAと 0. 1% Tween- 20入りの PBS で 3回ゥエル を洗浄して、これに適時希釈した FLAG付きネフロネクチン（NN-FLAG) (0. 3nM、 3ηΜ、 及び 30ηΜ) を添加して 1時間静置した。 洗浄後、 これに洗浄溶液で 1000 俊希釈した抗 FLAG抗体 （Sigma) を各ゥ ル 50 μ 1ずつ添加して 1時間室温で ^置した。洗浄後、 HRPを結合させたャギ抗マウス IgG抗体（二次抗体） を 3000 俊希釈して各ゥエルに 50 μ 1ずつ加え、 1時間静置した。
これを洗浄した後、 オルトフヱ二レンジァミン溶液を各ゥヱル 50 1ずつ カロえて 10分間静置し発色させ、 その後 2. 5 M硫酸を各ゥエル 50 1加えて発色 を停止した。 各基底膜蛋白質に結合した FLAG付きネフロネクチン （匪- FLAG) の量は、 490 nmの吸光度 （0D490 nm) を測定することで算出した。 結果を図 8に示す。 尚、 図に示す各 490 nm吸光度値は、 ブロッキング後、 NN- FLAGを添 加したときの値と、 NN- FLAGを加えず抗 FLAG抗体だけを添加したときの値をそ れぞれ差し引いて算出した。 図 8からわかるように、 ネフロネクチン （丽） は、 LN- 8、 LN- 10/11およぴフイブロネクチン （FN) に特異的に、 濃度依存的 に結合した。 ニヮトリ II型コラーゲンにも弱いながら結合が認められた。 II 型コラーゲンは.正常軟骨組織に特異的に発現 ·局在している基底膜蛋白質で あり、 この結果は NNが軟骨形成 ·骨形成に関係しているという報告と関係し ている力、もしれなレヽ（Morimura, N. et al. , (2001) J Biol Chem 276, 42172-42181) o
このアツセィにおいて、 N Nは、 LN- 8 ( α4]31γ 1) 及ぴ LN- 10/11 (a5j3 l/2y 1) と同じ j3鎖及ぴ γ鎖を有する LN- 2/4 (α2]31/2γ 1) に対し て結合活性を示さなかったことから、 丽の LN- 8 ( a4：β lyl) や LN- 10/11 (α5β 1/2Ύ 1) への結合は LNのひ鎖に依存していると考えられる。
(3) 免疫共沈降アツセィ （酵素結合免疫吸着検定）
上記で示された、 LN-8 (αΑβ Ιγ ΐ) 及ぴ LN- 10/11 (α5β1/2γ 1) に対す る ΝΝの結合特異性を、 LN- 2/4 (a2j3 l/2y 1) と LN-10/11 (α5]31/2 1) を用いた免疫共沈降アツセィでさらに確認した。
具体的には、 まず、 1· 5μ gの LN- 2/4もしくは LN- 10/11と 1.8 gの FLAGタ グ付き NN (NN-FLAG)を、 500 μ 1の 1% BSAと 0.1% Tween - 20を含む PBSに希釈し、 抗 FLAG抗体（4· 9μ§)または抗ヒ トラミニン y 1鎖抗体 （ΜΑΒ1920、 Ιμ ΐ) と Protein G-Sepharose (Amersham)を添加して 4 °Cでー晚混和した。 その後溶 液を遠心して Sepharoseビーズを回収し、 ビーズを 1% BSAと 0.1% Tween- 20を 含む PBSで 3回洗浄した。 沈降物を SDS- PAGEで展開し、 PVDF膜に転写し、 得ら れた PVDF膜を 5 %スキムミルクと 0.1% Tween- 20入り TBS (プロッキング緩衝 液） で 1時間ブロッキングした。 ブロッキング緩衝液で 2000倍希釈した抗ヒ トラミニン7 1鎖抗体 （MAB1920) でその PVDF膜を浸し、 0.1°/。 Tween- 20入り TBSで膜を洗浄後、 HRPを付加したゥサギ抗マウス IgG (二次抗体、 ICN Parmaceuticals, Inc.社製） を PVDF膜と反応させた。 その後、 0.1% Tween - 20 入り TBSで洗浄し、 ECLキット（Amersham)で検出した。
結果を図 9に示す。 図中、 「F」 は抗 FLAG抗体 （モノクローナル抗体） と の結合反応を、 「M」 は抗ヒトラミニン γ 1鎖抗体 （モノクローナル抗体）
(MAB1920) (Chemicon社製） との結合反応を意味している。 図 9からわかる ように、丽は、 LN-10/11 ( α 5 ;8 1/2 γ 1)と共沈降したが、 LN - 2/4 (ひ 2 j3 1/2 γ 1) とは共沈降しなかった。 このことから、 固相結合アツセィの場合と同様に、 匪の結合は LNの α鎖に依存していると考えられる。
( 4 ) ネフロネクチンのラミニン （LN- 8、 LN-10/11) への結合における二価 イオン、 NaCl及びへパリンの影響
基底膜蛋白質間の蛋白一蛋白間相互作用は、 アミノ酸側鎖の静電的相互作 用、 または疎水的相互作用 （場合によってはその両方） を介して生じる。 ま たある時は、 二価金属イオンやへパリンのような糖鎖も基底膜蛋白間の相互 作用に関わっている。 上記で得られた NNの LN- 8、 LN- 10/11、 FNに対する結合 を媒介する相互作用はどのようなものかを解析するために、 それぞれ 10 raM EDTA、 0. 5 M NaCl、 または 1 μ g/mlへパリン存在下で、 上記 （1 ) と同様の方 法によって、 NNの LN- 8、 LN-10/11, 及ぴ FNに対する固相結合アツセィを行つ た。 なお、 コントロールとして、 上記成分の非存在下で同様に固相結合アツ セィを行った。結果を図 1 0に示す。図 1 0からわかるように、 N Nの LN_8、 LN-10/11に対する結合は、 0. 5 M NaClまたは l ^ g/mlへパリンの存在で抑制さ れたが、 EDTAの依存の有無によっては殆ど変化がなかった。 このことから、 これらの結合が二価イオンに依存しないことが判明した。
また、 0. 5 M NaClの存在下では、顺は LN- 8や LN-10/11には結合しなかった。 このことは、 蘭が LN-8、 LN- 10/11に対して、 静電的相互作用によって結合し ていることを示唆している。同様の結果は 1 /2 g/mlへパリン存在下でも見られ た。 この結果は、 へパリンが のラミニン （LN) への相互作用に必要な も しくは LN内部の正電荷を覆っていることを示している。 興味深いことに、 顺 の FNへの結合は 0. 5 M NaCl存在下や 1 μ g/mlへパリン存在下で増加した。 これ は應が FNへ疎水的相互作用で結合していることを示唆している（Eriksson, K. 0.， et al.， (1989) Hydrophobic Interaction Chromatography. PROTEIN PURIFICATION - Principles, High Resolution Methods, and Applications - (Janson, J. -C. , and Ryden, L. , Eds. ) . 7 vols. , VCH Publishers, Inc. , New York) これらの結果から、雨の LNへの結合特性は、 FNへの結合特性とは全く 異なるものであることが示された。 実験例 4 ネフロネクチン （全長） 及ぴその欠損変異体のラミニン (LN-10/11) に対する結合活性
ネフロネクチン （全長） 及びその欠損変異体のラミニン （LN-10/11) に対 する結合活性を調べるために、図 4に示すドメィン構造を有する全長 NN- FLAG、 ΝΝ- Δ MAM-FLAG 、 NN- RGD- FLAG、 及ぴ NN- MAM- FLAGを用いて、 ラ ミニン (LN-10/11) に対する固相結合アツセィを行った。
具体白勺には、 ラミニン （LN-10/11) でコーティングした 96穴プレートを 1 %スキムミルクでブロッキングし、 これに段階希釈した FLAG付きネフロネク チン （NN- FLAG) またはその欠損変異体 （ΝΝ- Δ ΜΑΜ-FLAG 、 NN- RGD- FLAG、 NN-MAM - FLAG) を添カ卩して 1時間静置して反応させた。 洗浄後、 ラミニンに結 合した NN- FLAG及びその欠損変異体を、 実験例 2の方法に従って、 抗 FLAG M2 mAb (Si gma) 及び HRPを融合させたャギ抗マウス IgG抗体 （二次抗体） を用い た酵素結合免疫吸着検定を行い定量化した。 結果を図 1 1に示す。
図 1 1からわかるように、 NN - RGD- FLAGの結果から、 全長丽-FLAGから MAM ドメインと EGF様繰り返し配列を欠失させることにより、ラミニン（LN- 10/11) に対する結合活性が完全に消失することが分かった。一方、 MAMドメインを有 する画- MAM- FLAGは、 全長 NN- FLAGより弱いもののラミニン （LN- 10/11) に対 して結合活性を示し、 また MAMドメインを欠損した丽- ΔΜΑΜ- FLAG (EGF様繰り 返し配歹 (Iと RGDリンカー部位を有する） もまた丽 -MAM-FLAGより弱いが、 ラミ ニン (LN-10/11) に対して結合活性を示した。
これらのことから、 ネフロネクチンのラミニン (LN-10/11) への結合は主 に MAMドメインが担っており、 EGF様繰り返し配列も弱いながらもラミニン (LN-10/11) に対する結合部位であることが判明した。 し力 し、 いずれもド メインも単独ではラミニン （LN- 10/11) に対する結合活性は低く、 全長のネ フロネクチンが最も高い結合活性を示した。 実験例 5 ネフロネクチン （全長） 及ぴその欠損変異体 （NN- MAM- FLAG) の 成体マウス腎臓 （髄質） の基底膜に対する結合性
成体マウスの腎臓を 70%エタノール中で固定し、 その後パラフィン中に包 埋し、 6 μ πιの厚さの切片にした。 切片は脱パラフィン操作をした後、 DAK0 peroxi dase blocking reagent (Dako Cytomation USA) (こより内在个生ぺノレォキ シダーゼをブロッキングし、 続いて 1 %BSAを含む PBS (ブロッキングバッフ ァー） で 1時間、 室温でインキュベートして切片をブロッキングした。 その 後、 PBSで希釈した画- FLAG (12 g/ml)、 丽-匪- FLAG (16 μ§/πι1) , もしく はブロッキングバッファー （PBS) をそれぞれ切片に添加して、 1時間、 室温 でインキュベートした。 次いで、 得られた切片を、 PBSで洗浄して結合してい ない丽- FLAG及び ΝΝ-ΜΑΜ- FLAGを除去した後、プロッキングバッファーで 1 : 200 に希釈した HRP- conjugated ant i -FLAG M2 monoclonal antibody (SIGMA)を添 カロし、 1時間、室温でィンキュベートした。洗浄後、ジァミノベンジジン（DAB) によつて発色反応を行い、 腎臓組織における顯 -FLAGまたは丽 -MAM-FLAGの結 合の有無を顕微鏡にて確認した。 結果を図 1 2に示す。
図 1 2に示しているのは腎臓の髄質部分の拡大写真である （スケールバー ： 50 μ m) 。 図 A及ぴ Bの結果から、 尿細管の外側が、 それぞれ NN - MAM- FLAG 及び層 - FLAGにより、基底膜様に染色されていることが分かる（褐色に染色）。 これまでの実験結果から総合すると、 NN- MAM-FLAG及び匪- FLAGは、 腎臓の基 底膜に存在する LN- 10/11もしくは LN- 8と結合することによって、 基底膜に特 異的に結合しているものと考えられる。 ペプチド （ネフロネクチン） は、 LN- 10/11もしくは LN- 8への結合性に基づい て、 実際の生体組織の基底膜に対しても配向性及び結合性を有していること を示すものである。 また、 この結果は、 基底膜をターゲットとしたドラッグ デリバリ一システムにおいて、 MAMドメイン及び MAMドメインを有するポリぺ プチドが有用であることを示唆するものである。 実験例 6 基底膜蛋白質に対する MAEGタンパクの結合性
上記実験例 4の結果から、 ネフロネクチン （丽） の MAMドメインがラミニン (LN-10/11)に対する主要な結合部位であることが判明した。このことから、 同様に MAMドメィンを有し顺と相同性を有する MAEG (MAM-and EGF - containing gene) 蛋白質もまたラミニン （LN - 10/11) と結合する能力を有していると考 えられた （The Journal of Cell Biology, Vol. 154, No. 2, 2001, 447-458 ； Genomics 65, 16 23 (2000) ) 。
そこで、これを確認するために、顺と MAEG蛋白質の両方の MAMドメインを GST 融合蛋白質 （GST—丽 MAM、 GST - MAEG - MAM) として発現精製し、 一連のラミニ ン 〔マウス LN-1 ( α ΐ) 、 ヒ ト LN - 2/4 (ひ 2) 、 ヒ ト LN - 5 ( α 3) 、 ヒ ト LN— 8 ( « 4) 、 ヒト LN— 10/11 (ひ 5) 〕 に対する結合活性を、 抗 GSTモノクローナル 抗体 （抗 GST mAb ： Zymed Laboratories Inc. ) を用いて、 実験例 3 ( 2 ) に 記载する固相結 アツセィ （酵素結合免疫吸着検定） に準じて （ブロッキン グ溶液として、 1%スキムミルク入り PBSに代えて、 1%BSA入り PBSを使用） 、 測 定した。
なお、 上記 GST融合蛋白質 （GST - NN - MAM、 GST- MAEG- MAM) は、 まず、 それぞ れ 5' -GAATTCCACAGCTGCAATTTTGACCAT-3' (forward) (配列番号 3 3 ) と 5' -GTCGACTCAGCAGCGACCTCTTTTCAA-3' (reverse) (配列番号 3 4 ) 、 及ぴ 5' -CCGAATTCTCAGTTGACTGCAGCTTTGATC-3' (forward) (配列番号 3 5 ) と 5' -AACTCGAGTCAACCTTCTACAGATAAAAAG-3' (reverse) (配列番号 3 6 ) の各 2 種類のプライマーを用いて、 受精後 13. 5日マウス胚の cDNAライブラリーを铸 型として増幅した cDNA断片 （PCR増幅産物） を、 タグとして GSTを有する pGEX- 4T- 1ベクター (Amersham Bioscience) に、 その GST部位とコドンが合う ように揷入して、 発現ベクターを作成し、 これを大腸菌 BL21に導入して、 グ ルタチオン一セァァロースビーズ （Amersham) を用いて精製することによつ て作成した。
結果を図 1 3に示す。 図 Aが GST融合蛋白質 （GST- MAEG- MAM) のラミニンに 対する結合性をみた結果であり、 図 Bが GST融合蛋白質 （GST- NN- MAM) のラミ ニンに対する結合性をみた結果である。この結果、前述の結果で示した通り、 匪の MAMドメイン fまラミニンのうち LN - 8と LN- 10/11に特異的に結合するのに 対し、 MAEG蛋白質の MAMドメインはラミニン （LN-5) に特異的に結合した。 こ のことは MAEGタンパクの MAMドメィンはラミニンに結合するものの、その結合 特異性は匪の MAMドメインと明らかに異なっていることを示す。 前述するように、 ラミニンは α鎖のタイプによって大きく 5種類に分類さ れており、 各種が異なる組織に発現し分布していることが知られている （表 1 )。例えば LN- 5 ( α 3 β 3 Ύ 2)は皮膚 '肺.その他上皮組織に、 LN- 8 ( α 4 j3 1 γ 1) は血管（毛細血管、新生血管） に、 LN-10 ( a 5 j3 1 γ 1)及ぴ LN- 11 (ひ 5 ]3 2 γ 1) は大血管 （太い血管） 、 腎臓、 肺、 膝臓、 その他多くの上皮組織に発現し分 布している。 そして、 MAEG蛋白質と丽は、 互いに異なる組織局在性を示して いることが知られている。
こうした事実、 並びに上記実験で得られた結果から、 匪と MAEG蛋白質の特 異的な組織局在性は、 ΝΝと MAEG蛋白質の各々が有する MAMドメインのラミニン 結合特異性が関与している可能性が考えられる。すなわち、 NNと MAEGタンパ クの組織局在性 ·結合特異性は、各タンパクが有する MAMドメインによって決 められていると推測される。 そして MAMドメインに応じて異なる組織特異性' (発現，結合） を有する蛋白質 （NNと MAEG蛋白質） は、 個々に特異的な組織 の基底膜で機能し、 器官形成や各種現象を制御するものと考えられる。 実験例 7 ネフロネクチンとラミニン （LN - 10) の結合様式
上皮細胞によって発現されたネフロネクチン （丽） は基底膜に蓄積し、 間 充織細胞へ何らかの影響を及ぼしていることが知られている（Brandenberger, R. et al.， (2001) J Cell Biol 154, 447-458) 0 一方で、 ラミニン （LN- 10) は基底膜に存在し Gドメインを介して上皮細胞へシグナルを伝達していると 報告されている（Ido， H. et al. , (2003) J Biol Chem)。 このことから、 LN - 10 における NN結合部位の同定は、 顯の生理的 ·分子的機能を解明するための重 要な情報を与えてくれると思われる。 そこで、 組換え LN - 10 (rLN-10) とその Gドメイン欠損変異体 （LN- lO A G) を用いて、 LN- 10における匪の結合部位を 固相結合ァッセィにより解析した。 なお、 組換え LN-10 (rLN-10) とその Gド メイン欠損変異体 (LN-10 A G) は、文献（Ido， H. , et al. , (2003) J Biol Chem) に記載されている方法に従つて調製した。
具体的には、 全長顺 （顺- FLAG) とその MAMドメイン （丽- MAM-FLAG) につい て、 それぞれ組換え LN - 10 (rLN-10) とその Gドメイン欠損変異体 （LN- 10 A G) に対する結合活性を、 実験例 3に記載する固相結合アツセィ法に準じて調べ た。 結果を図 1 4に示す。
図 1 4に示すように、全長 NN (NN-FLAG)の LN- 10 A Gに対する結合は、 rLN-10 に対する結合と比較して約 4 0 %まで減少した。 一方、 NNの MAMドメイン (NN-MAM-FLAG)の LN-10 A Gに対する結合と rLN-10に対する結合強度はほとん ど同じレベルであった。 また、 NNの MAMドメイン （NN-MAM-FLAG) の rLN- 10に 対する結合は全長 NNの雜合に比べて弱いレベルの結合であつたが、 このレべ ルは全長 NNの LN - 10 A Gに対する結合とほとんど同レベルであった。
これらの結果は、 ネフロネクチン （丽） とラミニン （LN - 10) の結合には、 ラミエン （LN- 10) の Gドメインが重要であること、 すなわち、 NNは LN - 10の G ドメインを介して LN - 10に結合すること、 そして、 Gドメインとの結合に匪の MAMドメインは寄与していないことを示している。前述する実験例 4において、 丽は EGF様繰り返し配歹 Uと MAMドメインを介して LN - 10/11に結合することを示 した (図 1 1 ) 。 これらのことから総合すると、 NNの MAMドメインは LN - 10の G ドメイン以外の部位、恐らくロッド部位に結合し、 一方、圆の EGF様繰り返し 配列は LN - 10の Gドメィンと結合していると考えられる。 実験例 8 マウス腎臓におけるネフロネクチン （丽） と LN_ a 5鎖の局在性
LN- 10/11のひ鎖である LN- α 5鎖に対する NNの生体内での結合性を評価す るため、 マウスの腎臓,祖織における NN及び LN_ a 5鎖の局在を、 免疫組織化学 的染色法によって調べた。 なお、 丽は成体マウスの腎臓で発現していること が知られている（ Morimura, N. , et al. ， (2001) J Biol Chem 276, 42172-42181； Transgenic Inc. , Data sheet of ant i-P0EM/ nephronect in polyclonal antibody, Rabbit)。
なお、 免疫組織化学的染色は次のようにして行った。 まず、 腎臓を成体マ ウス個体から採取し、 4 % パラホルムアルデヒドで 15分間、室温で固定、 OCT コンパウンド（Tissue Tek社）に包埋した。 その腎臓の 3〜 5 m凍結切片を 1% BSAを含む PBS (プロッキング緩衝液）でブロッキングし、 ブロッキング緩 衝液で洗浄した。 その後、 切片にブロッキング緩衝液で希釈した 12 μ g /ml の抗 POEM/nephronectin抗体 （抗 N N抗体： トランスジエニック社） 、 または 同 100倍希釈の抗 LN-ひ 5鎖抗血清 （アメリカ · ヮシントン大学 J. H. Miner博 士より譲渡） を添加して、室温で 1時間静置した。その後、 ABCキット（Vector Laboratories)を用レ、て検出した。
結果を図 1 5に示す。 図 Aは抗 POEM/nephronectin抗体 （抗 N N抗体） で免 疫染色した結果であり、図 Bは抗 LN- a 5鎖抗血清で免疫染色した結果である。 この結果からわかるように、 は腎糸球体基底膜に局在しており、 そこでは LN- a 5鎖も同様に強く発現していた。このことは顧が LN - α 5鎖と生体内でも 共局在していることを示唆している。 ぐ考察 >
以上の実験から得られた知見を次のように纏めることができる。
( 1 ) ネフロネクチン （顺） は、 基底膜を構成する主要タンパクであるラミ ニン LN- 8 (ひ 4 )8 1 γ 1) と LN - 10/11 (ひ 5 1/2 γ 1) に選択的に結合する。 一 方、 これらのラミニンと同じ ]3鎖と γ鎖を有する LN - 2/4 ( α 2 1/2 γ 1) とは 結合しない。
この結果は、 丽はラミニンの α 4鎖又は α 5鎖に結合することを示唆して いる。 また、 α 5鎮を有するラミニン （LN-10と LN- 11) が特異的に発現分布 している組織は腎臓であるが、 我々は上記知見を裏付ける実験結果として、 丽と LN- α 5鎖が成体マゥス腎臓の同じ部位、つまり腎糸球体基底膜に局在す ることを確認している。
これらのことから、 発生期の腎臓において、 ΝΝはラミニンのひ 4鎖又はひ 5鎖に対する結合を介して基底膜に選択的に組み込まれると想定できる。 な お、 ラミニンの α 4鎖と α 5鎖の発生期腎臓における局在が NNの局在と非常 に似通っているという報告（Miner, J. H. (2001) J Cell Biol 154, 257-259： Miner, J. H. , et al. , (1997) J Cell Biol 137, 685—701)、 並びに LN -ひ 4 鎖及ぴ LN - α 5鎖が存在しない基底膜には NNの局在も見られないという報告 (Kanwar, Y. S. , et al. , (2004) Am J Physiol Renal Physiol 286, F202— 215) があるが、 これらは上記の見解を支持するものである。
( 2 )ネフロネクチン (丽) は、 MAMドメインを high affinity siteとして、 EGF様繰り返し配列を low affinity siteとして、 LN- 10/11と結合する。但し、 これらの各ドメインの LN- 10/11に対する結合活性は、 全長 が有する結合活 性に比して非常に弱いものである。
( 3 ) 全長のネフロネクチン (NN) は、 ラミニン (LN-10) の Gドメインを 介して LN- 10と結合している。 しかし、 ラミニン （LN - 10) の Gドメインは NN の MAMドメインとは結合しない。 このことから、 丽の基底膜の組み込みには、 基底膜の構成タ.ンパクであるラミニンの Gドメインが必要であると考えられ る。
上記 （2 ) と （3 ) のことから、 NNとラミニン （LNの ο; 5又はひ 4鎖） の結 合様式として、 まずラミニンの Gドメイン以外の部位に匪の MAMドメインが結 合し、 その後、 その結合を安定化させるように、 ラミニンの Gドメイン部位に EGF様繰り返し配列が結合して、全長 NNの結合を安定化している可能性が考え られる。 また、 全長の NNは、 多量体形成が認められたが、 これは LN- 10/11に 結合した匪に、 さらに他の匪が結合することによって形成される可能性が考' えられる。
ところで、 インテグリン α 8 1は、 発生期腎臓の間充織で豊富に発現し ている蛋白質であり、 インテグリンひ 8 j3 1が欠損したマウスは深刻な腎臓 発生欠損を示すことが知られている（Muller, U. ， ， et al. , (1997) Cell 88, 603-613)。 さらに、 インテグリン ο; 8 'i3 1はネフロネクチン （NN) の受容体 であること力 Sin vitro、 in vivo両方の系で示されてレヽる（Brandenberger, R. , et al. , (2001) J Cell Biol 154, 447-458)。 これらのことから、 NNは α 8 ;8 1インテグリンを介して後腎間充織にシグナルを伝達し、 腎臓形態形成の 制御に関与していると思われる。 さらに、 LN - 5鎖とインテグリン α 3 j3 1 もまた、腎臓の器官形成に必要不可欠であると報告されている（Miner, J. H. ， et al. , (2000) Dev Biol 217, 278-289 ; Kreidberg, J. A. , et al. , (1996) Development 122, 3537 - 3547)。
これらのことから、 腎臓形態形成に必要不可欠な経路が少なくとも 2つあ ると考えられる。 1つは丽とひ 8 jS 1インテグリンを介して後腎間充織の分 化誘導を調節する経路であり、 もう一つは、 LN o; 5と《 3 ]3 1インテグリン を介して尿管芽上皮の伸展や分岐を調節する経路である。 上記の実験から、 これらの経路は互レヽに独立したものではなく、蘭と LN - α 5鎖との相互作用に よって連結している可能性が考えられる。 以上のことから、 前述する （1 ) の見解を補足すると、 発生期の腎臓において、 丽は、 ラミニンの α 5鎖 （ま たは α 4鎖） に対する結合を介して基底膜に選択的に組み込まれ、 その部位 にある細胞に α 8 β 1インテグリン及ぴ α 3 j3 1インテグリンを介してシグ ナルを伝達してレ、ると推測される。
本発明において、 ネフロネクチン （NN) が基底膜の構成蛋白質であるラミ ニンの LN- « 4鎖と α 5鎖に特異的に相互作用することを見いだした。 丽は ΜΑΜドメインを含む珍しい ECM蛋白質の 1つである。他に知られている ΜΑΜドメ イン含有蛋白質としては、 MAEG、 メプリン、 ニューロピリン （A5蛋白質） 、 受容体蛋白質チロシン脱リン酸化酵素 /ζ Ζ κ;を挙げることができる。
さらに、本発明において、 ΝΝの ΜΑΜドメインがラミニンへの結合に強く関与 していること、 ΜΑΜドメインの種類によってラミニン結合特異性が異なること を見いだした。例えば、画の ΜΑΜドメインは LN- 8及ぴ LN-10/11に選択的に結合 するのに対し、 MAEGの ΜΑΜドメインは LN - 8及ぴ LN-10/11には結合せず、 LN- 5 に選択的に結合する。
ΜΑΜドメインは蛋白一蛋白間相互作用、 特に ΜΑΜドメイン間の同種親和的な 相互作用に必要であると考えられている。 例えば、 金属プロテアーゼの一種 であるメプリンは、 その ΜΑΜドメインを介して巨大な多量体を形成する (Ishmael, F. T.， et ah , (2001) J Biol Chem 276， 23207-23211)。 膜貫通 蛋白質でありセマフォリンの受容体である-ユーロピリンの場合、 その MAM ドメインは細胞表面上で互いに相互作用し二量体を形成する（Chen, H. , et al.， (1998) Neuron 21, 1283-1290)。 受容体型蛋白質チロシン脱リン酸化酵 素 μと κは、 MAMドメィンを介して細胞一細胞間で同種親和的な相互作用を示 す（Zondag, G. C. , et al. , (1995) J Biol Chem 270, 14247-14250)。 本発 明の結果は、 MAMドメインが、 それを含む各蛋白質に結合特異性を与えている ことを示唆している。 すなわち、 上記実験における知見は、 MAMドメイン及び それを含む蛋白質は、各 MAMドメインの組織特異性に応じて、特定の組織指向 性を備えており、 これによつて、 例えば特定の組織に有用な物質を運ぶ運搬 体として利用できる可能性を示すものである。 産業上の利用可能性 本発明の標的指向性運搬体は、 そのラミニンへの選択特異的な結合性に基 づいて、 組織特異的に標的指向性を発揮し、 これにより目的とする標的組織 または細胞に有用な薬物 （例えば、 生理活性ペプチドやその遺伝子、 抗体医 薬、 アンチセンス分子や干渉 R N A因子） を輸送する運搬体として利用する ことができる。 .当該標的指向性運搬体は、 通常運搬する目的物質 （例えば、 薬物） を導入して、 標的指向性薬物複合体として用いられる。
かかる標的指向性薬物複合体は、 ドラッグデリバリーシステムまたはター ゲッティング療法に有効に利用することができる。 特に、 標的指向性運搬体 としてネフロネクチンの MAMドメインを利用した場合 (例えば N Nそのも の） は、 当該標的指向†生運搬体が備える新生血管、 大血管、 腎臓、 肺、 また は膝臓に対する特異的組織結合性に基づいて、 所望の薬物を当該組織に指向 させることで局所濃度を高く維持し、 薬物の有効性を高めることができ、 ま たそれと同時に、 他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐことができる。
また、 標的指向性運搬体として MA E G蛋白質の MAMドメインを利用し た場合は （例えば MA E G蛋白質そのもの） 、 当該標的指向性運搬体が備え る毛包、 皮膚 （表皮） 、 肺に対する特異的組織結合性に基づいて、 薬物を当 該組織に指向させることで局所濃度を高く維持し、 薬物の有効性を高めるこ とができ、 またそれと同時に、 他部位へ拡散して生じる副作用を防ぐことが できる。

Claims

請求の範囲
1 . MAMドメイン (meprin, 5A protein, receptor protein - tyrosine phosphatase μ -domain) もしく ίまそれを一部に有するポリべプチド、 または ΜΑΜドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝 子を有する核酸であって、 所望の物質を結合させて、 該物質を標的組織に輸 送するために用いられる標的指向十生運搬体。
2 . 下記の（a )または（b )のアミノ酸配列を有する MAMドメイン（meprin: 5A protein, receptor protein— tyrosine phosphatase μ -domain) もしく ま それを一部に有するポリべプチド、 または上記 MAMドメインもしくはそれ を一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であって、 所 望の物質を結合させて、 該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的 指向性運搬体；
( a ) 配列番号 1に示される、 ネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸 配列、
( b ) 上記ネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸配列において、 1若 しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンの α 4鎖または α 5鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
3 . 上記 （b ) 力 配列番号 1 に示されるネフロネクチンの MAMドメイ ンのァミノ酸配列と、 少なくとも 9 0 %の同一性を有するァミノ酸配列であ る、 請求項 2記載の標的指向性運搬体。
4 . 上記 （b ) 、 ヒ ト由来ネフロネクチンの MAMドメインのアミノ酸 配列である、 請求項 2記載の標的 ί旨向性運搬体。
5 . 上記 （b ) 力 配列番号 3 7に示されるアミノ酸配列である、 請求項 2記載の標的指向性運搬体。
6 . 下記の（c )または（d )のアミノ酸配列を有する MAMドメイン（meprin: 5A protein, receptor protein - tyrosine phosphatase μ -domain) もし^は それを一部に有するポリペプチド、 または上記 MAMドメインもしくはそれ を一部に有するポリべプチドをコ一ドする遺伝子を有する核酸であって、 所 望の物質を結合させて、 該物質を標的組織に輸送するために用いられる標的 指向性運搬体；
)配列番号1 7または 1 9に示される、ネフロネクチンのアミノ酸配列、 ( d ) 上記ネフロネクチンのアミノ酸配列において、 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、 置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンの a 4鎖または α 5鎖に結合性を有するァミノ酸配列。
7 . 上記 （d ) I 配列番号 1 7または 1 9に示されるネフロネクチンの' ァミノ酸配列と、 少なくとも 7 5 %の同一性を有するァミノ酸配列である、 請求項 6記載の標的指向性運搬体。
8 . 上記 （d ) 1 ヒ ト由来ネフロネクチンのアミノ酸配列である、 請求 項 6記載の標的指向性運搬体。
9 . 上記 （d ) f 配列番号 5 3に示されるアミノ酸配列である、 請求項 6記載の標的指向性運搬体。
1 0 . 腎臓、 新生血管、 肺、 腾職、 または大血管に対して指向性を有する ことを特徴とする請求項 2または 6に記載する標的指向性運搬体。
1 1 . 下記の （e ) または （f ) のアミノ酸配列を有する MAMドメイン neprin, 5A protein, receptor protein— tyrosine phosphatase μ -domain; もしくはそれを一部に有するポリペプチド、 または上記 M AMドメインもし くはそれを一部に有するポリぺプチドをコ一ドする遺伝子を有する核酸であ つて、 所望の物質を結合させて、 該物質を標的組織に輸送するために用いら れる標的指向性運搬体； (e) 配列番号 3に示される、 MAEG蛋白質の MAMドメインのアミノ酸 配列、
(f ) 上記 MA EG蛋白質の MAMドメインのアミノ酸配列において、 1若 しくは複数のアミノ酸が欠失、 置換または付カ卩されたアミノ酸配列を有し、 かつラミユンの. α 3鎖に結合性を有するアミノ酸配列。
12. 上記 （f ) ヽ 配列番号 3に示される MAEG蛋白質の MAMドメ インのァミノ酸配列と、 少なくとも 8 O %の同一性を有するァミノ酸配列で ある、 請求項 1 1記載の標的指向性運搬体。
13. 上記 （f ) 、 ヒ ト由来 MAEG蛋白質の MAMドメインのァミノ 酸配列である、 請求項 1 1記載の標的 旨向性運搬体。
14. 上記 （f ) 力 配列番号 39に示されるアミノ酸配列を有するもの である、 請求項 1 1記載の標的指向性運搬体。
15. 下記の （g) または （h) のアミノ酸配列を有する MAMドメイン meprin, 5A protein, receptor protein - tyrosine phosphatase μ -domain) もしくはそれを一部に有するポリべプチド、 または上記 MAMドメインもし くはそれを一部に有するポリペプチドをコードする遺伝子を有する核酸であ つて、 所望の物質を結合させて、 該物質を標的組織に輸送するために用いら れる標的指向性運搬体；
(g) 配列番号 21に示される、 MAEG蛋白質のアミノ酸配列、
(h) 上記 MAEG蛋白質のアミノ酸酉己列において、 1若しくは複数のアミ ノ酸が欠失、置換または付加されたアミノ酸配列を有し、 かつラミニンの α3 鎖に結合性を有するァミノ酸配列。
16. 上記 （h) 1 配列番号 21に示される MAEG蛋白質のアミノ酸 配列と、 少なくとも 70 %の同一性を有するァミノ酸配列である、 請求項 1 5記載の標的指向性運搬体。
17. 上記 （h) I ヒト由来 MAEG "蛋白質のアミノ酸配列である、 請 求項 15記載の標的指向性運搬体。
18. 上記 （h) 力 配列番号 55に示されるアミノ酸配列である、 請求 項 1 5記載の標的指向性運搬体。
1 9. 毛包、 皮膚 （表皮） 、 または肺に対して指向性を有することを特徴 とする請求項 1 1または 15に記載する標的指向性運搬体。
20. 発現ベクターの形態を有する、 請求項 1に記載する標的指向性運搬 体。
21. 請求項 1に記載の標的指向性運搬体に、 標的組織に輸送するための 薬物が結合されてなる標的指向性薬物複合体。
22. 標的指向性薬物複合体が、 ペプチドまたはタンパクからなる薬物を 結合してなるポリペプチド形態を有するカ または核酸 （遺伝子を含む） か らなる薬物を結合してなるポリヌクレオヂド形態を有するものである、 請求 項 21に記載する標的指向性薬物複合体。
23. 請求項 21に記載する標的指向性薬物複合体を有効成分として含む 医薬組成物。
24. 標的指向性薬物として、 請求項 2 1に記載する標的指向性薬物複合 体を用いることを特徴とする、 ドラッグデ、リバリーシステムまたはターゲッ ティング療法。
25. MAMドメインもしくはそれを一部に有するポリペプチド、 または MAMドメインもしくはそれを一部に有するポリべプチドをコ一ドする遺伝 子を有する核酸の、 所望の物質を結合させて該物質を標的組織に輸送するた めに用いられる標的指向性運搬体の調製のための使用。
2 6 . 請求項 1記載の標的指向性運搬体の、 標的組織に輸送するための薬 物が結合されてなる標的指向性薬物複合体の調製のための使用。
2 7 . 請求項 1記載の標的指向' I·生運搬体に薬物が結合されてなる標的指向 性薬物複合体の、 標的組織や細胞に局所的に薬物を輸送して治療するドラッ グデリバリーシステムまたはターゲッティング療法における使用。
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