WO2005079813A1

WO2005079813A1 - Ｎｋｔ細胞活性化用組成物

Info

Publication number: WO2005079813A1
Application number: PCT/JP2005/003234
Authority: WO
Inventors: Yoshio Kumazawa; Katsumi Murata; Kazuyoshi Kawahara; Hiroaki Takimoto
Original assignee: Kibun Food Chemifa Co., Ltd.
Priority date: 2004-02-19
Filing date: 2005-02-21
Publication date: 2005-09-01
Also published as: EP1716857A1; US20060269524A1; EP1716857A4; CA2526905A1

Description

明細書

NKT細胞活性化用組成物

NKT細胞活性化用組成物、 I L一 4産生促進用組成物、 I F N _ _Ύ産生促進用組成物、榭状細胞活性化用組成物、 I L一 1 2産生促進用組成物、 I L一 1 0産生促進用組成物、 ΝΚ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性増強用組成物、抗ウィルス作用組成物、 I L一 6摩生促進用組成物、 NO産出促進用組成物背景技術

本願発明は、特定の構造からなるスフインゴ糖脂質を含む N K T細胞活性化用組成物、 I L— 4産生促進用組成物、 I F N— γ産生促進用組成物、樹状細胞活性化用組成物、 I L一 1 2産生促進用組成物、 I L一 1 0産生促進用組成物、 ΝΚ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性增強用組成物、抗ウィルス作用組成物、 I L一 6産生促進用組成物、 N O産出促進用組成物に関する。

従来から、スフインゴ糖脂質は動物細胞等の表層に存在している物質であり、認識機構に関与するものと考えられている。一方、グラム陰性細菌はその細胞表層に、リポ多糖、蛋白質及びリン酸よりなる外膜を持っており、これを介して外界とのやりとりを行っている。従って、外膜の主要成分であるリポ多糖は全てのグラム陰性菌に共通に存在し、必須なものであると考えられてきた。ところ力 S、近年になって、好気性グラム陰性菌であって、以前シユードモナスパゥシモビリス（Pseudomonas paucimobilis) と呼ばれていたスフインゴモナスパゥシモビリス（Sphingomonas paucimobilis) は、リポ多糖を全く保有しないこと及ぴこの菌は菌体脂質としてスフインゴ糖脂質を含有していることが知られてきた。

そこで、本願出願人は、上記スフインゴモナスパゥシモビリスの菌体から糖脂質を単離し、さらに、その化学構造を解析し、同定することに成功している（国際公開 W092/12986号公報)。そして、本願出願人は、上記スフインゴ糖脂質が優れた保湿効果と肌荒れ防止効果を有しているため化粧品として広く採用しうることを開示している（特開平 11— 43437号公報)。加えて、本願出願人は、上記スフインゴ糖脂質が優れた乳化作用を有することも明らかにしている（特開 2 000-51676号公報）。

加えて、本願出願人は、他のスフインゴモナス科の菌株から得られたスフインゴ糖脂質についても化粧組成物及び医薬組成物として優れてレ、ることを開示している（特開 2002— 010797号公報)。

一方、 T細胞レセプター（TCR) を発現する NKT細胞は、 L a r g e Gr a n u 1 a r Lymp h o c y t e (L G L)様の形態を示すこと、 I L—2R β 鎖を常時表出すること、パーフォリンを有する点などでは、 ΝΚ細胞と類縁の細胞である力 T C Rを有するという点で ΝΚ細胞とは決定的に異なる細胞群であることが報告されている (J. Immunol. , 155， 2972 (1995))。

かかる状況のもと、 J. Immunol. , 154, 4333(1995)、 J. Immunol. , 88， 82(1996) には、マウスでは I L一 12により活性化された T細胞^)中でも NK1. 1を発現している NKT細胞力腫瘍の肝臓や肺への血行性転移抑制の重要なエフヱクター細胞であることが報告されている。

以上のように、この NKT細胞は、近年、新しい細胞群として非常に注目を集めている細胞群である。

さらに国際公開 WO 98/44928号公報は、特定の構造をする α _グリコシルセラミドが ΝΚΤ細胞活性剤として有効であると述べている。しかしながら、より効果的な ΝΚΤ細胞活性化剤が求められている。発明の開示本願発明の目的は、上記課題を解決することであって、より効果的な NKT細胞活性ィ匕用組成物を提供することを目的とする。さらに、スフインゴ糖脂質を含む I 一 4産生促進用組成物、 I FN— γ産生促進用組成物、榭状細胞活性ィ匕用組成物、 I L一 12産生促進用組成物、 I L_ 10産生促進用組成物、 ΝΚ細胞活性ィ匕用組成物、抗腫瘍作用組成物抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性増強用組成物、抗ウィルス作用組成物、 I L一 6産生促進用,袓成物、 NO産出促進用組成物を提供することを目的とする。

上記課題のもと、本願発明者は下記手段により上記課題を解決しうることを見出 -した。

(1) 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする N K T細胞活性化用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式 (1-1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、

R²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、ひ一グルコース基、 α—マンノース基、ひ一ダルコサミン基若しくは一ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

(2) 前記式（1).は、下記式（3) で表される、（1) に記載の ΝΚΤ細胞活性化用組成物。

式 (3)

(式（3) 中、 R⁵は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、 R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷⁸を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R ⁶⁴又は R ⁶⁵を表す。）

_R51 ： _R52 . R⁵³ ：

e

fCZ£00/S00∑df/X3d £186Z.0/S00Z OAV 9

t£Z£00/S00Zd£/13d CT86.0/S00Z OAV ム

£Z£00/S00Zdr/13d £186 OOZ OAV

(3)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L— 4産生促進用組成物。

(4) 前記式（1) は、式（3) で表される、（3) に記載の I L一 4産生促進用組成物。

(5)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I F N— γ産生促進用組成物。

(6) 前記式（1) は、式（3) で表される、（5) に記載の I FN— γ産生促進用組成物。

(7)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする樹状細胞活性化用組成物。

(8) 式（1) は、式（3) で表される、（7) に記載の樹状細胞活性化用組成物。

(9)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L一 1 2産生促進用組成物。

(1 0) 式（1) は、式（3) で表される、（9) に記載の I L一 1 2産生促進用組成物。 ,

(1 1)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L一 1 0産生促進用組成物。

(1 2) 式（1) は、式（3) で表される、（1 1) に記載の I L一 1 0産生促進用組成物。

(1 3)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする N K細胞活性ィヒ用組成物。

(14) 式（1) は、式（3) で表される、（1 3) に記載の NK細胞活性化用組成物

(1 5) 式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗腫瘍作用組成物。

(1 6) 式（1) は、式（3) で表される、（1 5) に記載の抗腫瘍作用組成物。

(1 7) 式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗ァレルギ一作用組成物。

(1 8) 式（1) は、式（3) で表される、（1 7) に記載の抗アレルギー作用組成物。

(1 9)式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする感染抵抗性增強用糸且成物。 (20) 式（1) は、式（3) で表される、（19) に記載の感染抵抗性増強用組成物。

(21) 式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗ウィルス作用組成物。

(22) 式（1) は、式（3) で表される、 .（21) に記載の抗ウィルス作用組成物。

(23) 式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L一 6産生促進用組成物。

(24) 式（1) は、式（3) で表される、（23) に記載の I L一 6産生促進用組成物。

(25) 式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする N O産出促進用糸且成物。

(26) 式（1) は、式（3) で表される、（25) に記載の NO産出促進用組成物。図面の簡単な説明 '

第 1図は、正常マウスに GS L— 1を投与した場合の.フローサイトメトリーによる解析結果を示す。第 2図は、正常マウスに GSL— 2を投与した場合のフローサィトメトリーによる解析結果を示す。第 3図は、正常マウスに GSL— 6を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。第 4図は、正常マウスに G S L— 7を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。第 5図は、 TLR4欠損マウスに GS L— 1を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。第 6図は、 TLR 4欠損マウスに GS L— 2を投与した場合のフローサイトメトリーによる解析結果を示す。第 7図は、正常マウスに各種 GSL— 1、 2、 6、 7を投与した場合の NTK細胞の変化を示す。第 8図は、正常マウスにおける GSL— 1又は GSL— 2投与後の I FN—ッの濃度を示す。第 9図は、正常マウスにおける G S L— 1又は G S L— 2を投与した場合の I N F— 0産生 NTK細胞の変化を示す。第 10図は、 TLR4欠損マウスにおける GS L— 1又は GSL— 2投与後の I L— 4の濃度を示す。発明の詳細な説明

以下において、本願発明の内容について詳細に説明する。尚、本願明細書において Γ〜」とはその前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む意味で使用される。また、本願明細書において、上記式（3) 中、 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、

R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷

⁶、 R⁷⁷、 R⁷⁸を、「R⁵¹〜R⁷⁸」と示すことがある。

本願発明で採用するスフインゴ糖脂質（以下、「GSL」と呼ぶことがある）は、上記式 (1) で表される構造を有するものである。ここで、式（1) の R¹に含まれる R³のアルキル基は、シクロアルキル基を有していてもよく、該シクロアルキル基は、 R³のアルキル末端でもよいし、鎖の中に含まれていてもよい。好ましいシクロアルキル基としては、シク άプロパン基があげら'れる。 R³の.アルキル基の炭素数としては、好ましくは 13〜23、より好ましくは 15、 16、 17、 18、

19、 20又は 21である。また、 R ³のアルキル基及びアルケニル基は、好ましくは置換または無置換の直鎖のものである。また、アルケニル基に含まれる 2重結合は、いずれの位置にあってもよい。

—方、 R ⁴のアルキル基の炭素数は好ましくは 10〜20、より好ましくは 10、

1 1、 12、 13、 14、 15又は 16であり、さらに好ましくは、 10、 11、

1'2、 13、 14または 15である。さらに、 R⁴のアルキル基は、置換または無置換の直鎖アルキル基であることが好ましい。

さらに好ましくは、 R ¹が上記 R ⁵¹〜R ⁷⁸のいずれかである。また、式（1) の R¹は、下記式（1一 2) の立体構造をとるものが好ましい。式（1— 2)

ここで、上記式（1— 2) 中の R³および R⁴は、上記式（1— 1) の R³および R⁴と同義である。従って、上記 R⁵¹〜R⁷⁸も上記立体構造をとるものがより好ましい。

また、上記式（1) は、好ましくは、式（2)、式（3)、式（4) 又は式（5) で表されるものである。ここで、式（2) は、

式（2)

式（2) 中、 R¹は及び R²は式（1) と同義であり、好ましい範囲も同義である。また、式（3) において、好ましくは、 R⁵が、 R⁵¹〜R⁷⁸のいずれかであって、 R⁶が水素原子の場合（以下、構造 Aということがある）、 R⁵が、 R⁵¹〜R⁷⁸のいずれかであって、 R⁶が R⁶²の場合（以下、構造 Bということがある）、 R⁵が、 R ⁵¹〜R⁷⁸のいずれかであって、 R⁶が R⁶³の場合（以下、構造 Cということがある）、 R⁵が、 R⁵¹〜R⁷⁸のいずれかであって、 R⁶が R⁶⁴の場合（以下、構造 Dということがある）、 R⁵が、 R⁵¹〜R⁷⁸のいずれかであって、 R⁶が R⁶⁵の場合（以下、構造 Eということがある）である。さらにまた、構造 Aの中でも、 R⁵が、 R⁵¹、 R ⁵²又は R ⁵³のものをより好ましく採用できる。式 (4)

式（4) 中、 R¹は、上記式 (1) の R¹と同義である。また、 R¹の好ましい範囲も上記と R¹と同義である（式（4) で表される化合物の少なくとも一種を含むものを以下、構造 AAと呼ぶことがある）。

式（5)

式（5) 中、 R¹は、上記式（1) の R¹と同義である（以下、構造 Fということがある）。また、 R¹の好ましい範囲も上記 R¹と同義である。

さらに、本願発明のスフインゴ糖脂質は 1種類のみを探用しても良いし、 2種類以上を採用しても良い。 2種以上を組み合わせて含有させる場合の各成分の比率は特に制限されない。例えば、上記構造 Aに該当する 3種類の化合物のうち 1種類以上を含むもの、上記構造 Bに該当する 3種類の化合物のうち 1種類以上を含むもの、上記構造 Fに該当する化合物を少なくとも 1種以上含むもの等を挙げることができる。この中でも好ましくは、； ¹が、 R⁵¹、 R ⁵²又は R ⁵³のいずれかの場合である（以下、構造 FAと呼ぶことがある）。

本願発明で開示する糸且成物には、上記に加えて、上記式（1) において、式（1) 中の式（1一 1) が式（1— 1— 1) の立体構造で表されるものも含まれていてもよい。式（1一 1一 1)

式（1— 1— 1) 中、 R³及び R⁴は、それぞれ、上記式（1— 1) と同義であり、好ましい範囲も同義である。

式（1一 1一 1) は、さらに好ましくは、下記式（1— 1一 2) で表される立体構造のものである。

式（1— 1一 2)

式（1一 1一 2) 中、 R³及び R⁴は、それぞれ、上記式（1— 1) と同義であり、好ましい範囲も同義である。 .

式（1) で表されるスフインゴ糖脂質は、スフインゴ糖脂質を有する菌体から抽出することによって得ることができる。例えば、国際公開 W092/1 2986号パンフレツトゃ特開 2002- 10797号公報に記載の方法を採用することができる。スフインゴ糖脂質は、スフインゴモナス科に属する菌体中に含まれていることから、スフインゴモナス科に属する菌のいずれかを用いて抽出すれば式（1) で表されるスフインゴ糖脂質を得ることができる。ここで、スフインゴモナス科に属する菌とは、従来から一般的に「スフインゴモナス属」（Sphingomonas) に属する菌と言われているものの他、該菌と実質的に同じ科に属するものとして分類される菌を含む趣旨である。本願発明で採用できる菌株としては、例えば、 Microbiol. Immunol.， 2000, 44, 563-575に示されるいずれの菌株も採用することができる。式（1 ) で表されるスフインゴ糖脂質は、アセトンに対して不溶性であることから、抽出操作を行なう前に菌体をアセトンで洗浄しておくのが好ましい。式（1 ) のスフインゴ糖脂質の抽出に用いる溶媒は、メタノールなどのアルコール系溶媒またはアルコール系溶媒とクロロホルムなどの極性溶媒の混合溶媒にするのが収率の点で好ましい。ただし、スフインゴ糖脂質溶解性の溶媒であれば、これらの以外の溶媒を用いても構わない。

スフインゴ糖脂質の混合物が得られた場合は、本技術分野で周知の方法にしたがつて各成分を分離することができる。たとえば、クロマトグラフィー法によって、スフィンゴ糖脂質は完全に分離することができる。溶出液としてクロ口ホルム/メタノール混合溶液を用いた場合は、構造 A、構造 F、構造 C、構造 Bあるいは構造 D あるいは構造 Eの順に各スフインゴ糖脂質が溶出し、構造 B、 D、 Eは、一般的に異なる菌株が産生するため、極めて簡便に分離することができる。充填剤、溶出液、溶出速度、圧力、温度などのクロマトグラフィーの分離条件については、適宜調節することができる。また、スフインゴ糖脂質の混合物に含まれる特定の物質のみに選択的に反応する試薬を作用させて該物質の誘導体を調製し、その誘導体の化学的性質または物理的性質を利用して分離を行なうこともできる。菌として、スフインゴモナスパゥシモビリス（Sphingonionas paucimobilis) を用いた場合には、一般に構造 Aのスフインゴ糖脂質と構造 Bのスフインゴ糠脂質が得られる。また、スフインゴモナスカプスフータ (Sphingomonas capsulata (¾Τ名 '· Novosphingobium capsulatum) を用いた場合には、一般に構造 Aのスフインゴ糖脂質と構造 Cのスフインゴ糖脂質が得られる。さらに、スフインゴモナスアドハエシバ（Sphingomonas adhaesiva)を用いた場合には、一般に構造 Aのスフィンゴ糖脂質と構造 Dのスフィンゴ糖脂質が得られる。加えて、スフインゴモナススピーシーズ M K 3 4 6 ((SSpphhiinnggoommoonnaass sspp.. MMKK334466))をを用用いいたた場場合合ににはは、、一一般般にに構構造造 AAののススフフイインンゴゴ糖糖脂脂質質とと構構造造 EEののススフフイインンゴゴ糖糖脂脂質質がが得得らられれるる。。ままたた、、ススフフイインン

(Sphingomonas wittichii 、スフィンゴモナスマク口ゴノレタビダス (Sphingomonas macrogoltabidus) 新名： Sphingopyxis macrogoltabida)、スフィンコモ "ステラェ (Sphingomonas terrae) 又はスフィンゴモナスヤノイクヤエ (Sphingomonas yanoikuyae) (新名： Sphingobium yanoikuyae)を用いた場合には、一般に構造 A A

(例えば、構造 A) のスフインゴ糖脂質と構造 F (例えば、構造 FA) のスフインゴ糖脂質が得られる。したがって、これらの情報に基づいて菌を選択すれば、目的とするスフインゴ糖脂質を効率よく得ることができる。

式（1) で表されるスフインゴ糖脂質は、周知の合成法を組み合わせることによつて合成することもできる。たとえば、糖とスフインゴシン部分をあらかじめ合成するか、菌体から抽出しておき、アミド結合を形成することによって式（1) で表される各スフインゴ糖脂質を調製することができる。

本願発明の NKT細胞とは、例えば、ヒト Va 24+NKT細胞及ぴマウス 1 4+NKT細胞を含む趣旨である。また、 NKT細胞活性ィ匕とは細胞傷害活性の増強、サイト力イン産生増強及び NKT細胞の増殖促進を'含む意図である。さらに、本願発明の NKT細胞活性化用組成物は、結果として、 . I L一 4の産生及ぴ I FN 一 yの産生を促進する。従って、 I L一 4又は I FN— γによって促進される各種機能の促進用組成物としても使用することができる。 Ν Κ丁細胞活性化用組成物としては、本願発明で採用する GSLのうち、ガラタツロン酸型のスフインゴ糖脂質な構造を有するものが特に好ましい。

I L— 4によって促進されるものの例としては、 Th 2の誘導、抗体のクラススイッチの誘導が挙げられ、 .1 FN—ッによって促進されるものの例としては、 I F N— γによって促進される Th lの誘導、マクロファージ活性化作用が挙げられる。ここで、サイト力インの増強として、上記のほ力、各種 I L、 I FN— 、 I F N— β、腫瘍壌死因子（TNF)、リンホトキシン、造血因子のコロニー刺激因子 (CSF), エリスロポエチン、造血因子の上皮増殖因子（EGF)、繊維芽細胞増殖因子（FGF) 産生又は活性化促進作用組成物としても利用することができる。さらに、本願発明で開示した上記スフインゴ糖脂質は、上記以外の免疫活性化組成物や、がん細胞のァ.ポトーシス誘導化組成物、 NF— k a p p a B活性化促進、 I k a p p a Bの分解、 p 38のリン酸化、 A k tのリン酸化等を目的とした、産生又は活性化促進用組成物としても利用できる。

本願発明でいう、樹状細胞活性化とは、例えば、抗原提示能宂進を含む意図である。

本願発明の GS Lは I L一 1 2の産生及び I L一 1 0の産生を促進する。従って、 I L一 1 2の産生及び I L一 1 0の産生によって促進される各種機能の促進用組成物としても使用することができる。特に、本願発明の I L一 1 2の産生及び Zまたは

I L一 1 0の産生組成物としては、グルクロン酸型のスフインゴ糖脂質を用いることが好ましい。

本願楽明でいう、 NK細胞活性化とは、例えば、感染細胞傷害を含む.意図である。 NK細胞活性化用組成物としては、本願発明で採用する G S Lのうち、単糖型のスフィンゴ糖脂質であるものが特に好ましい。

本願発明でいう、抗腫瘍作用とは、例えば、ヘルパー T細胞おょぴキラー T細胞活性化を含む意図である。抗腫瘍作用組成物としては、本願発明で採用する GS L のうち、四糖型のスフインゴ糖脂質であるものが特に好ましい。

本願発明でいう、抗アレルギー作用とは、例えば、好酸球浸潤抑制、肥満細胞抑制作用、 I g E産生抑制、化学伝達物質放出抑制を含む意図である。

さらに、本願発明の抗アレルギー作用組成物は、副作用が弱い傾向にあり、花粉症、気管支喘息、アトピー性皮膚炎等への利用に特に有用である。本願発明でいう、感染抵抗性増強作用とは、例えば、ヘルパー T細胞およびキラ一 τ細胞活性ィヒを含む意図である。本願発明の感染抵抗性増強作用組成物は、サルモネラ感染症、結核への利用に特に有用である。感染抵抗性増強作用組成物としては、本願発明で採用する G S Lのうち、四糖型のスフインゴ糖脂質であるものが特に好ましい。

本願発明でいう、抗ウィルス作用とは、例えば、 I型インターフエ口ン産生増強、ヘルパー T細胞およびキラー T細胞活性化を含む意図である。本願発明の抗ウィルス作用組成物は、サイトメガロウィルス感染症、ヘルぺスウィルス感染症などヘルぺスウィルス科感染症への利用に特に有用である。

また、本願発明の組成物を医薬品若しくは医薬部外品やその有効成分として利用する場合、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な医薬組成物として投与することができる。医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及ぴシロップ剤等をあげることができる。上記の医薬組成物は、薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物を加えて製造することができる。薬理学的、製剤学的に許容し得る添加物の例としては、例えば、賦形剤、崩壌剤ないし崩壌補助剤、結合剤、滑沢剤、コーティング剤、色素；希釈剤、基剤、溶解剤ないし崩壌捕助剤、等張化剤、 p H調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等をあげることができる。上記の医薬組成物には、本願発明の趣旨を逸脱しない範囲内で、他の効能を有する成分を 1種又は 2種以上配合してもよい。本願発明の医薬の投与量は特に限定されず、有効成分の種類などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、成人一日あたり、 0 . 0 0 1 〜1 0 O m g好ましくは 0 . 0 1〜1 O m gの範囲で用いることができる。また、投与方法も特に限定されず、注射剤、輸液剤等として、静脈注射により投与してもよいし、経口的に投与してもよい。実施例

以下に実施例を挙げて本願発明をさらに具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本願発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更すること.ができる。従って、本願発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。

本実施例においては、 GSLとして、スフインゴモナスパゥシモビリスから産生された構造 Aのもの（GSL—1)、スフインゴモナスパゥシモビリスから産生された構造 Bのもの（GSL— 2)、スフインゴモナスカプスラータから産生された構造 Cのもの（GSL— 3)、スフインゴモナスアドハエシバから産生された構造 Dのもの（GSL— 4)、スフインゴモナススピーシーズ MK346から産生された構造 Eのもの（GSL— 5)、スフインゴモナスヤノイクヤエから産生された構造 AAのもの（GSL— 6)、スフインゴモナスヤノイクヤエから産生された構造 Fのもの（GSL— 7)、スフインゴモナスウイッテイチアイから産生された構造 AAのもの（GSL— 8)、スフインゴモナスウイッテイチアイから産生された構造 Fのもの（GS L— 9)、スフインゴモナスマクロゴルタビダスか.ら産生された構造 AAのもの（GSL— 10)、スフインゴモナスマクロゴルタビダスから産生された構造 Fのもの（GSL— 11)、スフインゴモナステラエから産生された構造 AAのもの（GSL— 12)、スフインゴモナステラエから産生された構造 Fのもの（GS L— 13) を採用した。これらは、国際公開 WO 92/12986号公報、特開 2002— 010797号公報に記載の方法に従って分離した。実施例 1 N K T細胞活性化作用の測定

動物：

試験用マウスとして、 C57BL/l O S c Snマウス（以下、正常マウスという。）及び C 57BL/l O S cC rマウス（TLR4欠損 I L一 12 R 2鎖変異マウス）（以下、 TLR4欠損マウスという。）（マックスプランク免疫生物学研究所、ドイツ、フライブルグ巿）（7週齢、雌）を使用した。 GSL— 1および G S L— 2は T L R 4を介して正常マウスのマクロファージを活性化し、 I L- 12 産生を誘導する。丁 LR4欠損マウスは、 I L— 12受容体の鎖に変異があり、 I L— 12が作用しないものである。 I L一 12は免疫系を強力に活性化する物質であるが、本実施例の TLR4欠損マウスを用いると本願発明で採用するスフインゴ糖脂質の ΝΚΤ細胞に対する活性化促進を I L一 12の作用を受けない状態で、より明確にすることができる。，サンプルの作成：

各 GSLのいずれか 10 μ gを、正常マウス及び TLR 4欠損マウスに投与した, 投与は、尾静脈内投与により行った。そして、対照として生理食塩水を投与したもの（コントロール)、投与後 1日経過時（1日目）及ぴ 2日経過時（2日目）の血清及び肝臓を採取した。

肝臓内白血球の分離：

採取した^ ^:臓を 2枚のスライドガラスを用いてつぶした。細胞浮遊液を 500 r pm 1分間遠心した。得られた上清を 1200 r pm (300 g)、 5分間遠心した。その沈渣を 30%のパーコール（フアルマシア社製）に懸濁し、さらに、これを、 67. 5% パーコールの上に重層して、 20°C、 2000 r pm (800 g)、 30分間遠心し、 30%と 67. 5%パーコールの境界に白血球を集積させ回収した。得られた細胞をハンクス液で 3回洗浄して肝臓内白血球を得た。

フローサイトメトリー：

F c Rを介した蛍光標識抗体の非特異的結合を防ぐため、抗 F c yR (2. 4G

2) を用いた。抗体は、 PE標識抗 NK1. 1抗体（日本べタトン 'ディツキソン

(株）製、 P K 136 ) 及びピオチン標識抗 T CRa β抗体（日本べクトン ·ディツキソン（株）製、 H57— 597) を用いた。細胞に各抗体を添カ卩した後、 4°C、喑所で 30分反応させた。尚、ビォチン標識抗体を用いた綱胞は、 Cy— c h r o me結合ストレプトアビジン（日本べクトン'ディヅキソン株式会製、 55406 2) を 4 °C、 β音所で 30分反応させた。上記抗体、 Cy— c h r ome結合ストレプトァビジンの染色及び細胞の洗浄には 0. .1 %N a N ₃含有 1。/。血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、 1%パラホルムアルデヒド含有 PBS (-)で固定した。測定は自動細胞解析分離装置（ベックマンコールター（株）、 COULTER EPICS ELITE ESP)で行った。また、 PE標識抗 NK1. 1抗体を、 F I TC標識抗 CD 11 a抗体（日本べクトン'ディツキソン株式会社製、 Ml 7 Z4)に代えて同様に行った。上記 PE標識抗 NK1. 1抗体（又は CD11 a) を用いた方法によって得られたフローサイトメトリーの結果を第 1図〜第 6図に示した。ここで、第 1図〜第 4 図は、それぞれ、正常マウスを用いた場合で、順に、 GSL— 1、 2、 6、 7を投与した場合を、第 5図及ぴ第 6図は、それぞれ、 TLR4欠損マウスを用いた場合で、順に、 G S L— 1、 2を投与した場合を示した。

ここで、図中に示した数字は、 NK1. 1 (又は CD 11 a) と TCRa j3の両方を発現した細胞の割合（％) を示している。尚、 NK'l. 1 (又は CD 11 a) と TCRa ]3の両方を発現したものは、 NKT細胞である。

また、日を変えて、上記と同様に、 PE標識抗NK1. 1抗体を用いた方法によつて得られた正常マウスのフローサイトメトリーの結果（NKT細胞の割合）を第 7図に示す。ここで、図中に示した数字は両方を発現した細胞の割合（％)を示し、図中の米印は、 t検定により統計的にコントロールと有意な差が認められたものである。

I FN— γ の存在の確認：

03 ー1又は&3しー2を添加した場合の血中の I FN— y量について検討した。正常マウス及び TLR 4欠損マウスに、 031^—1又は031：—2を上記と同様の方法により投与し、血清中に含まれる I FN— T/を解析した。

I FN-y は、捕捉抗体として精製抗 I FN— γ抗体（R4— 6Α2) (日本べクトン 'ディツキソン株式会製）と、検出抗体としてピオチン結合抗 I FN-y 抗体（AN— 18) (日本べタトン ·ディツキソン株式会製）を用いたサンドイツチ EL I S A法で行った。ビォチン結合抗体に続く反応でアルカリ性フォスファターゼ標識ストレプトアビジン（ZYMED製、 43— 4822) を結合させ、パラニトロフエ二ルリン酸塩（S I GMA製、 N—4645 )を基質として発色させた。マイクロプレートリーダー（日本バイオラドラポラトリーズ株式会社、 Mo d e l 550)で 405 nmと対照として 540 n mの波長の吸光度を観察した。この結果、正常マウスにおいて、第 8図に示すように、 I FN— yの産生が促進されていることが認められた。尚、 TLR 4欠損マウスの場合、 I L— 12に反応しないため、 GSL— 1又は GSL— 2を投与しても I F N— γは検出されなかった。

I FN— γ産生 ΝΚΤ細胞のフローサイトメトリー：

G S L— 1又は G S L— 2を投与した場合の正常マウスについて、上記と同様の方法でフローサイトメトリーを行い、 PE標識抗NK1. 1抗体、ピオチン標識抗 TCRa j3抗体、 F I TC標識抗 I FN—γ抗体（日本クトンディ.ッキンソン株式会社製、 554410) にて染色して、 I FN— γ産.生 NKT細胞の割合を測定した。その結果を第 9図に示す。ここで、図中の数字は、 NK1. 1と TCRa i3 の両方を発現した、 I FN— γ産生 NKT細胞の割合に相当する。

I L-4の量の測定：

GS L— 1又は GS L— 2を添加した場合の血中の I L一 4の量が增加するかについて検討した。上記正常マウス及び TLR 4欠損マウスに、 031^—1又は〇 S L— 2を上記と同様の方法により投与し、血清中に含まれる I L一 4を解析した。

I L— 4の測定は、マウス I L一 4 BD Op t i E I A EL I SA S e t (日本べタトン ·ディツキソン株式会社製、 555232) を用いて該マニュアルに従って測定した。結果、いずれのマウスについても、 I L— 4の増加が認められた。特に、第 1 0図に示すとおり、 TLR4欠損マウスにおいて、 I L一 4の顕著な産生促進が認められた。

&3しー1又は031^—2を添カ卩した場合、上記フローサィトメトリーにおいて. NKl . 1と T CR Q: ]3の両方に発現したもの割合の増加が認められたこと、及び、これらの増加が大きいものについては、 I FN— γと I L一 4の両方が産生されていることが確認できたことから、 GS L— 1又は GS L— 2が NKT細胞の活性化に有効であることが認められた。実施例 2 I FN- 産生促進作用

試験用マウスとして、 C 5 7 B L/6マウスを用いた。各 GS Lは、各 GS Lは、 20 % ペンタジオールで最終濃度が 1 0 mgZm lとなるように溶角军した後、生理食塩水で希釈した溶液（以下、「P」と示すことがある。）、または、 0. 5%ぺンタンジオール、 0. 5 %N—ラウロイルサルコシン、 9. 8%ショ糖溶液で最終濃度が 5mg_/mlとなるように溶解した後、生理贪塩水で希釈した溶液（以下、

「P + S」と示すことがある。）を用いた。各 GS Lは、'マウス尾静脈から投与した（投与量は 1 00 g)。対照として溶媒のみを投与レた（コントロール)。投与

1 6時間後に摘出した肝臓から細胞浮遊液を調製し、 4 5%パーコールと 6 7.

5%パーコールを用いた比重遠心法により肝臓内白血球を得た。白血球は、抗 F c

T/ R抗体（2. 4G2)で処理した後、 F I TC標識抗 I FN— γ抗体、 Ρ Ε標識抗 NKl. 1抗体、ピオチン標識抗 TCRa 抗体を用いて処理した。白血球に抗体を添加した後、 4 °C、暗所で 30分間反応させた。ピオチン標識抗体を用いた白血球は、 Cy— c h r ome結合ストレプトァビジンを 4 °C、喑所で 30分反応させた。抗体おょぴ CY— c h r ome結合ストレプトアビジンの染色および細胞の洗浄には、 0. 1% N a N₃含有 1%血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、 1%パラホルムアルデヒド含有リン酸緩衝生理食塩（PBS (—））で固定した。測定は、上記に記載の E P I CS EL I TE E S Pで行った。その結果を、表 1 に示した。ここで、表 1は、 I FN- γ産生 NKT細胞の割合（％) を示している。なお、本実験は、実験 1、 2、 3の 3回に分けて行なった。

表 1

I FN-γ産生 ΝΚΤ細胞

試料の割合（％)

(平均値士標準偏差）

コント口ール 2.0±0.2

GSL-1 3.6±0.3

GSL-2 2.6±0.3

GSL-6 4.3±1.4

GSL-7 14.0土 1.4

：3ン卜 Π ル 3.7±0· 5

GSL-3 4.6±0.6

実験 2

GSL-4 5.2±1.0

GSL-5 4.2±0.3

コント口ール 2.5±0.5

GSL-8 4.7±0.8

GSL-9 5.4土 1.2

GSL-10 3.8±0.4

GSL-11 5.7±0.5

GSL-12 3.2±0.2 GSL-13 7.3±3·0 表 1から明らかなとおり、 I FN- γ産生促進作用が認められた。特に、 GSL 一 1、 2、 4、 6〜11および 13についてより効果的であり、 GSL—6〜9、 11、 13についてさらに効果的であり、 GSL— 7について顕著に効果的であつた。実施例 3 樹状細胞活性化作用

樹状細胞活性ィ匕作用について確認した。マウスは、 C 57B LZ6マウス (7週令、メス）を用いた。各 GSLは、上記実施例 2と同様の方法で溶解した。各試料は、マウス尾静脈から投与した（投与量は 100 μ g)。投与 12時間後に摘出した脾臓から細胞浮遊液を調製した。白血球は、抗 F c R抗体（2. 4G2)で処理した後、 P E標識抗 C D 11 c抗体（日本べクトンディツキンソン株式会社製）、ビォチン標識抗 C D 40 (日本べタトンディツキンソン株式会社製）、ビォチン標識抗 C D 80抗体（日本べタトンディツキンソン株式会社製）、ビォチン標識抗 C D 86抗体（日本べクトンディッキンソン株式会社製）用いた。細胞に抗体を添加した後、 4°C、喑所で 30分間反応させた。ビォチン標識抗体を用いた細胞は、 Cy— c h r ome結合ストレプトァビジンを 4 °C、 B音所で 30分反応させた。抗体または Cy— c h r o me結合ストレプトアビジンの染色および細胞の洗浄には 0. 1 % Na N₃含有 1 %血清アルブミンを用いた。細胞は染色後、 1 %パラホルムアルデヒド含有 P B S (一）で固定した。測定は E P I CS EL I TE ES Pで行った。 CD 11 c陽性細胞中の CD 40、 CD 80および CD 86陽' 1"生細胞の割合（％) を表 2に示した。表 2 CD 40 (%) CD 80 (%) CD 86 (%) 試料 (平均値士標準偏差） (平均値士標準偏差） (平均値土標準偏差）

3ン卜 π

ール 51.2±0.6 72.8±1.3 26.3±1.8

GSL - 1 67.8±1.9 . 81.9±1.2 45.5±0.9

GSL-2 65.0±9.8 76.2±1.8 31.5±1.7

GSL - 3 58.1±2.9 79.9±1.3 35.4±2.7

GSL - 4 63.3±0.1 80.6±2.6 35.0±0.2

GSL - 5 59.8±0.7 77·4±1· 1 42.7±17.7

GSL - 6 65.4±2.5 81.0±0.4 28.7±3.0

GSL - 7 78.1±3.5 85.4±1.7 61.3±22.5

GSL - 8 73.8±4.2 83.9±1.0 56.6±24.6

GSL - 9 76.4±1.1 84.9±1.3 48.7±6.1

GSL-10 64.3±4.6 78·9±0·4 55.6±30.4

GSL - 11 71.9±2.4 80.9土 1.2 55.4±19.8

GSL - 12 64.1±2.1 81.3±2.0 34.2±51.2

GSL-13 77.3土 0.8 85.2±1.3 46.5±1.7 表 2から明らかなとおり、樹状細胞活性化作用が認められた。特に、 G S L— 1、 2、 4、 6〜13についてより効果的であり、 GSL— 7〜9、 1 1、 13について顕著に効果的であった。実施例 4 I L一 12の誘導おょぴ I L一 10の誘導

実施例 1で採用した正常マゥスの骨髄細胞を、 GM- CSFおよび I L一 4存在下で 8日間培養し、骨髄由来の樹状細胞を得た。下記表に示した各 GS Lは、エタノール：ドデカン（98： 2) で 0. 5 mg /mlで溶後し、 96穴プレートに 2 0 μ 1ずつ分注し、溶媒を揮発させ各 GS Lをプレートに固相化した。対照群としてエタノール：ドデカン（98: 2) のみを分注し揮発させた。 GSLを固相化したプレートに骨髄由.来の樹状細胞を加え、 24時間後の培養上清を回収した。培養上清は、 EL I S Α法により I L一 12 p 70の量および I L一 10の量を BD Op t E I A K i tを用いて測定した。 I L— 12 p 70の量の測定結果を表 3 に、 I L _ 10の量の測定結果を表 4に示した。表 3

表 4

IL-10

B¾料 (pg/ml) 対照群 129.0

GSL - 4 ' 147.4

GSL - 10 431.1

GSL - 12 583.2

GSL - 13 155.9 上記表から明らかなとおり、 I L— 12 D 70の誘導および I L_ 10の誘導が認められた。特に、 I L一 12 p 70の誘導については、 GSL— 2、 4、 6、 8、 10、 12についてさらに効果的であり、 GSL— 6、 8、 10、 12について顕著に効果的であった。また、 I L— 10の誘導については、 031 —10ぉょぴ1 2について顕著に効果的であった。実施例 5 NK細胞活性化作用

マウスは、 C57BLZ6マウス（7週令、メス）を用いた。各 GSLは上記実垴例 2と同様の方法で溶解した。各試料は、マウス尾静脈から投与した（投与量は 100 μ g)。対照として溶媒のみを投与した（コントロール）投与.16時間後に摘出した脾臓から細胞浮遊液を調製した。脾臓細胞と ⁵¹.C r標識 YAC_ 1細胞を 50: 1の比率で混合し、 4時間培養した。 4時間後の培養上清中の ⁵¹ C r量を、 T/カウンター（WALL AC製）を用いて測定した。結果を表 5に示す。なお、本実験は、実験 1、 2、 3の 3回に分けて行なった。表 5

試 ^ NK 活性 (%)

(平均値土標準偏差）：3ン卜 CIール 26.1±5.1

GSL-2 34.1±6.2

GSL-3 33.2±8.2

GSL-5 35.7土 4.8

ン卜ロル 17.7土 2.0

GSL-1 30.1±3.8

GSL-6 27.3±4.5

GSL-7 33.5±5.1

iン卜 in ル 8.3±3.6

GSL - 8 22.2±1.7

GSL-9 14.8土 2.1

GSL- 10 12.5±3.0

GSL-12 11.2±3.4

GSL- 13 14.4±3.1 ここで、表 5から明らかなとおり、 GS L— 1、 5、 6〜9及び 13についてより効果的であり、 GSL—1、 7、 8について顕著に効果的であった。実施例 6 抗腫瘍作用

マウスは、 C57BLZ6マウス（7週令、メス）を用いた。腫瘍細胞 B 16— F 10 (北海道大学遺伝子病制御研究所）（2 x l 0⁵個）を尾静脈から移植した。各 G S Lは、上記実施例 2と同様の方法で溶解した。 G S Lの投与量は、 100 μ gとし、腫瘍細胞移植後 1日、 5日、 9日目に腹腔内投与した。移植 14日目に解剖し、肺の転移巣数を測定した。結果を表 6に示す。表 6

表 6力ら明らかなとおり、上記!/、ずれの G S Lにおいても効果的に肺の転移を抑制した。特に、 GS L— 2はその効果が顕著であった。実施例 7 抗ァレルギ一作用 ·

B ALBZcマウスに卵白アルブミン（OVA) 100 ju gと水酸化アルミニゥムゲル 1. 6 mgを混合した抗原を 0日おょぴ 7日に皮下接種した。 14、 15、 16日目に OVA10 gを生理食塩水に溶解し、点鼻接種 3日後（初回接種から 18日目）に解剖した。各 GSLは、 0. 5%ペンタンジオール、 0. 5%N—ラゥロイルサルコシン、 9. 8 %ショ糖溶液で最終濃度が 5 m g Zm 1となるように溶解した後、生理食塩水で希釈した。生理食塩水で希釈した各 G S L溶液は、 1曰、 5日、 9日、 13日目に腹腔內投与した。肺胞洗浄液中の全細胞数および好酸球数を計測した。全細胞数はチュルク液（和光純薬工業製）で、好酸球数はギムザ染色液（メルク株式会社製）で染色し計測した。抗 OVA抗体価（I gG、 I gGl、 I gG2 a)は OVAをコーティングした 9.6穴プレートに段階希釈した血清を添加した。検出抗体には、アルカリホスファターゼ標識した抗マウス I gG抗体（Z YMED社製）、抗マウス I _§01抗体（1 CN社製）、抗マウス I gG2 a抗体（Z YMED社製）を用いた。パラ-トロフエニルリン酸塩を基質として発色させ、 3 Nの N a OHで反応停止後、マイクロプレートレーダーで 405 nmの吸光度を測定した。抗 OVA I gE抗体価は、抗マウス I gE抗体（日本べクトンディツキンソン株式会社製）をコーティングした 96穴プレートに段階希釈した血清を添加した。次いで、各穴にビォチン標識した OVAを添加後、パーォキシダーゼ標識ストレブトアジビンを用い、 Su r eB 1 u e (フナコシ株式会社製）を基質として発色させた。 2N H₂P0₄で反応停止後、マイクロプレートレーダーで 450 n mの吸光度を測定した。

また、コントロールは、 BALB/cマウスに、 GS Lを投与しないで同時に行つたものである。

白血球数に関する測定結果を表 7に示す。好酸球数を表 8に示す。 . 表 7

白血球数

1 X 10⁵細胞/ m 1

(平均値士標準偏差）

正常マウス . 32.7±9.9

3ン卜ロール 147.0±50.1

GSL - 1 88.5±34.6 表 8

表 7およぴ表 8から明らかなとおり、肺胞洗浄液中の白血球数および好酸球数は顕著に減少した。

実施例 8 感染抵抗性増強作用

マウスは、 C 5 7 B L 6マウス（7週令、メス）を用いた。各 G S Lは、実施例 2の「P」と同様の方法で溶解した。溶解したものを、 Salmonella typhimurium S L 7 2 0 7 aroA株（スタンフォード大学医学部、米国）に感染させる 1時間前に腹腔内投与した。感染 3日目に解剖し、腹腔内生菌数測定した。腹腔内生菌数の結果を表 9に示した。 .

内生菌数を測定した。腹腔内生菌数の結果を表 9に示した。

内生菌数の結果を表 9に示した。

した。

表 9 腹腔内生菌数

料

X 10⁶ cfu (平均値土標準偏差）

コン卜ロー

20.9±3.5

ル

GSL-1 12.1±8.2

GSL-2 . 6.7±3.6

表 9中、 cfu は、コロニー形成単位の略を意味する。表 9から明らかなとおり GS Lの投与により、感染抵抗性の増強作用が認められた。実施例 9 抗ウィルス作用

マウスは、 C57BL/6マウス（7週令、メス）を用いた。各 GSLは、実施例 2と同様の方法で溶解した。溶解したものを、マウスに静脈投与した。投与 1時間後に、マウスに、マウスサイトメガロウィルス（Sm i t h株） 1 x 10⁴p f u ( p f u：プラーク形成単位の略である）を腹腔内接種した。感染 3日目に解剖し、肝臓おょぴ脾臓内ウィルス価を測定した。その結果を、表 10に示した。また、脾臓の 3日後の NK活性および血清中 I FN_γを測：iした。その結果を表 11

(NK活性）およぴ表 12 (I FN-7) を示す。 . 表 10

試料脾臓内ウィルス肝臓内ウィルス

X 10³pfu X 10³pfu

(平均値土標準偏差） (平均値士標準偏差）

:πン卜ロール 2.4±0.5 63.0±19.5 GSL- 1 0.2±0.1 7.5±4.1

GSL- 2 0.2±0.1 3.3±1.9

GSL- 6 0.2±0.1 2.7±1.2

GSL - 7 0.2±0· 1 4·8±1.9 表 1 1

その結果、表 10に示すとおり、 GSLを前投与することにより、感染抵抗性の増強作用が認められた。また、表 11に示すとおり、 NK活性は顕著に増強し、 I FN-7レベルはコントロール群と比較して増強した。特に、 GS L— 6についてその効果が顕著であることが認められた。

実施例 10 I L— .6産生促進作用およぴ N O産出促進

実施例 1で用いた正常マウスに 4%のチォダルコール酸 3 m 1を腹腔内投与し、 4日後に腹腔滲出細胞を採取し実験に用いた。マクロファージ細胞株 RAW264 細胞（理化学研究所）も実験に用いた。各 GSLは、エタノール：ドデカン（98: 2 )溶媒で濃度が 0. 5mgZmlとなるように溶後し、 96穴プレートに 20 1ずつ分注し、溶媒を揮発させて GS Lをプレートに固相化した。 GS Lを固相化したプレートにマクロファージを加え、 24時間後の培養上清を回収した。この培養上清については、 EL I S A法により I L一 6を、グリース試薬を用いて一酸ィ匕窒素（NO) も測定した。 I L— 6の測定結果を、表 13に、一酸化窒素の測定結果を、表 14に示した。

表 13

IL-6 (pg/ml)

試料

(平均値土標準偏差）

対照群 3491.0±492.1

GSL-1 3921.7±665.1

GSL-4 3453.0±252.5

GSL-5 4742.0± 525.2

GSL-6 5389.7±1003.7

GSL-7 6948.0± 457.1 GSL-8 6264.0± 1075.0

GSL-9 6711.3±485.1

GSL-10 7474.0 ±920.3

GSL-11 10046.0 ±340.0

GSL-12 7303.3 ±640.2

GSL-13 7619.3 ±774.3

表 14

NO M) 試料

(平均値 ±標準偏差）対照群 0.7±0.2

GSL-2 6.8土0.7

GSL-3 3.5±0.2

GSL-4 3.8±0.5

GSL-5 5.2±0.5

GSL-6 4.4±0.8

GSL-7 3.9±0.3

GSL-8 4.2±1.1

GSL-9 9.0士0.5

GSL-10 8.4±0.8

GSL-11 11.3±1.0

GSL-12 7.7土 0.5

GSL-13 7.1±0.1 表 1 3から明らかなとおり、 I L一 6誘導作用が認められた。特に、 GSL— 5 〜13についてより効果的であり、 GSL— 6〜13についてさらに効果的であり GSL—7〜13について顕著に効果的であった。

また、表 14から明らかなとおり、 NO産出促進作用が認められた。特に、 GS L一 2、 5、 9〜13についてより効果的であり、 GS L— 11についてさらに効果的であった。実施例 1 1

本願発明の GS L組成物についての毒性について確認した。マウスは、 C57B L/6マウス（7週令、メス）を用いた。 2 Omgのガラクトサミンを腹腔内投与直後に、リポ多糖（以下、「L P S」と示すことがある）（Salmonella abortus equi 由来、マックスプランク免疫生物学研究所、ドイツ、フライブルグ市）（溶媒は生理食塩水）、または、下記表 15に示した GS L (溶媒は「P + S」）の下記表 1 5 に示した量を、マウス尾静脈から投与した。投与 24時 ¾後、マウスの生死を観察した。その結果を表 1 5に示した。，表 15

LPSまたは GS L 添加量死亡数実験数

GS L- 1 100 g 0/3

GS L- 2 100 g 0/3

GS L- 3 100 ^ g 0/3

GS L-4 100 g 0/3

LPSを添加した場合、 10 n gの添加でもすベてのマウスが死亡した。一方、 GS Lでは 100 g添加してもすべてのマウスが生存していた。このように本願発明の組成物はきわめて毒性が低！/、ことが認められた。実施例 10 '

ェンドトキシントレランスが誘導される力否かについて確認した。マウスは、 C 57BL/6マウス（7週令、メス）を用いた。 LPS (溶媒は生理食塩水）または各 GSLの下記表 16に示す量をマウス尾静脈ら投与した。投与後 24時間に、ガラクトサミン（ 20 m g ) および L PS ( 100 n g、溶媒は生理食塩水）を腹. 腔内投与し、マウスの生死を観察した。その結果を、表 16に示す。表 16 LP Sまたは GS L 添カロ量死亡数 Ζ実験数

GS L- 1 100 μ g 3/3

GS L-2 100 g 3/3 '

GS L- 6 100 g 3/3

GS L- 7 100 μ g 3/3

LPS 100 η g 0/3 表 16力ら明ら力なとおり、 GSL—1、 GSL— 2、 GSL— 6および GSL 一 7を 100/z g添加してもエンドトキシントレランスは誘導されず、すべてのマウスが死亡した。一方、 LPSは 100η gの添加でもエンドトキシントレランスが誘導された。産業上の利用可能性

本願発明の組成物を採用することにより、より効果的な NKT細胞活性化用組成物が得られた。また、 I L一 4産生促進用組成物、 I F N— γ産生促進用組成物、樹状細胞活性化用組成物、 I L一 12産生促進用組成物、 I L一 10産生促進用組成物、 ΝΚ細胞活性化用組成物、抗腫瘍作用組成物、抗アレルギー作用組成物、感染抵抗性增強用組成物、抗ウィルス作用組成物、 I L一 6産生促進用組成物、 NO 産出促進用組成物が得られた。特に、これらを併せ持つという点でも本願発明の組成物は有意である。

さらに、本願発明の組成物は、毒性が低く、ェンドトキシントレランスが誘導されないため、副作用が低いという観点からも有用である。

Claims

1. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする NKT細胞活性化用組成物。式（1) .

請

の

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1一 1)

式（1一 1) 囲

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニ'ル基であり、. R ⁴は、アルキル基である。）を表し、 .

R²は、水素原子または、ひ一ガラクトース基、 α—グルコース基、ひ一マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは —ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

2. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 1に記載の NKT細胞活性化用組成物。

式（3)

41

42

43 ff

^ 00/SOOZdf/ェ:) d CT86Z.0/S00Z OAV

3. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有するとする I L一 4産生促進用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1) 式（1一 1)

R ²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 α—グルコース基、 a—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは —ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

4. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 3に記載の I L一 4産生促進用組成物。

式（3)

(式（3) 中、 R⁵は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、 R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷⁸を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R ⁶⁴又は R ⁶⁵を表す。） Lf

£Z£00/S00Zd£/13d CT86.0/g00Z OAV 8

Ρ£Ζ£00/ζΟΟΖάΤ/Σ3ά £186Z.0/S00Z OAV 6f

l7Clf00/S00Zdf/X3d CT86Z.0/S00Z OAV

5. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I F N— γ産生促進用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（Γ—1)

式 (1-1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、，

R ²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 α—グルコース基、 a—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは J3—ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

6. 前記式 (1) は、下記式（3) で表される、請求項 5に記載の I FN— γ産生促進用組成物。

式（3)

(式（3) 中、 R⁵は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、 R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷。、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷⁸を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R⁶⁴又は R⁶⁵を表す。）

_R51： _R52； R⁵³：

ee

€I86.0/S00I ΟΛΛ

fCZC00/S00∑df/X3d Π86 οοε OAV / ssosooid/Tlwd8/ O6/.0S00ZA\

7. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有する

とする樹状細胞活性化用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1一 1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはァルケ-ル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、，

R²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 a—グルコース基、 a—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは —ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

8. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 7に記載の樹状細胞活性化用組成物。

式（3) ,

(式（3) 中、 R⁵は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、 R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷³を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R⁶⁴又は R⁶⁵を表す。）

_R51： _R52 . _R53：

8S

£ZC00/S00Zdf/X3d £186 OOZ OAV 6S

£186Z.0/S00i OAV

9. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L— 12産生促進用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1一 1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、 . '

R²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 _α—グルコース基、 _α—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは J3—ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

10. 前記式（ 1 ) は、下記式（ 3 ) で表される、請求項 9に記載の I L一 12産生促進用組成物。

式（3)

(式（3) 中、 R⁵は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R.⁵³、 R⁵⁴、 R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷⁸を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R ⁶⁴又は R ⁶⁵を表す。）

_R51： _R52 . R53：

89

00扇 idf/IDd C186.0/S001 ΟΛ\ ^9

^ OO/SOOZdf/ェ:) d £186 OOZ OAV

11. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L一 10産生促進用組成物。

式（1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1一 1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、 ' '

R²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 α—グ /レコース基、 α—マンノース基、 α—グルコサミン基若しくは —ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

12. 前記式（ 1 ) は、下記式（ 3 ) で表される、請求項 11に記載の I L一 10 產生促進用組成物。

式（3)

67 89

£Z£00/S00Zd£/L3d CT86.0/S00Z OAV

l7CZC00/S00Zdf/X3d £186 OOZ OAV

〇

13. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有する徴とする N K細胞活性化用組成物。

式（1) '

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1— 1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはァルケ-ル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、 '

R²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 α—グルコース基、 α—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは一ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

14. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 13に記載の ΝΚ細胞活性化用組成物。

式（3)

(式（3) 中、 R⁵.は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、 R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷⁸を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R⁶⁴又は R⁶⁵を表す。）

_R51： _R52 . R53：

73 fL

t£Z£00/S00Zd£/13d CT86.0/S00Z OAV

15. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗腫瘍作用組成物。

式（1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1

式（1一 1)

(式（1一 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、 '

R²は、水素原子または、 α—ガラクト^"ス基、一グルコース基、 _α—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは —ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

16. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 15に記載の抗腫瘍作用組成物。

式（3)

77 8ム

^Clf00/£00ldf/13d Π86/.0/¾00Ζ ΟΛ 6

i-cz oo/sooiJfx3d Cl86.0/S00Z: OAV

80

17. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする抗ァレノレギ一作用糸且成物。

式（1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1— 1)

(式（1— 1) 中、 R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、 '

18. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 17に記載の抗アレルギ一作用組成物。，

式（3)

82 88

^ OO/SOOZdf/ェ:) d £186 OOZ OAV

84 28

CI86Z.0/S00Z ΟΛΧ

1 9. 下記式 (1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有する徴とする感染抵抗性增強用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1一 1)

式（1— 1)

(式（1— 1) 中、 .R³は、アルキル基またはアルケニル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、

R²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、 α—グルコース基、 _α—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは ;3—ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

20. 前記式（1) は、記式 (3) で表される、請求項 19に記載の感染抵抗性增強用組成物。

式 (3)

(式（3) 中、 R⁵は、下記 R⁵¹、 R⁵²、 R⁵³、 R⁵⁴、. R⁵⁵、 R⁵⁶、 R⁵⁷、 R⁵ ⁸、 R⁵⁹、 R⁷⁰、 R⁷¹、 R⁷²、 R⁷³、 R⁷⁴、 R⁷⁵、 R⁷⁶、 R⁷⁷又は R⁷⁸を表し、 R⁶は、水素原子、 R⁶²、 R⁶³、 R⁶⁴又は R⁶⁵を表す。）

■ ε9^

^C∑C00/S00Zdf/X3d 68

Π86ん 0細 Z O 06

ei86Z,0/S00Z OW

91

21. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有する徴とする抗ウィルス作用糸且成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1一 1)

(式（1一 1) 中、 R³は、アルキル基またはァルケ-ル基であり、 R⁴は、アルキル基である。）を表し、

R ²は、水素原子または、 α—ガラクトース基、ひ一グルコース基、ひ一マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは —ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

22. 前記式（1) は、下記式（3) で表される、請求項 21に記載の抗ウィルス作用組成物。

式（3)

93 6

W OO/SOOWf/IDd fI86.0/S00∑; OAV

t£Z£00/S00Zd /13d

23. 下記式（1) で表される構造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする I L一 6産生促進用組成物。

式（1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1

式（1一 1)

24. 前記式（1) は、下記式 (3) で表される、請求項 23に記載の I L— 6産生促進用組成物。

式（3)

98 66

t'Cicoo/sooidf/iad £T86I0/S0 r O οοτ

^ OO/SOOZdf/ェ:) d £186 OOZ OAV

25. 下記式（1) で表される搆造を有するスフインゴ糖脂質を含有することを特徴とする N O産出促進用組成物。

式 (1)

(式（1) 中、 R¹は、下記式（1— 1)

式（1一 1)

R²は、水素原子または、ガラクトース基、 α—グルコース基、 _α—マンノース基、 α—ダルコサミン基若しくは j3—ダルコサミン基またはこれらの組み合わせからなる基である。）

26. 前記式 (1) は、下記式（3) で表される、請求項 25に記載の NO産出促進用組成物。

式（3)

103 fOl

^ei£0 /S00Zdf/I3d ei86L0/S00r OAV SOI

tTiC00/C00Zdf/X3d CT86.0/C00Z OAV