WO2005078078A1 - ラクトパーオキシダーゼの製造方法 - Google Patents

ラクトパーオキシダーゼの製造方法 Download PDF

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WO2005078078A1
WO2005078078A1 PCT/JP2005/002356 JP2005002356W WO2005078078A1 WO 2005078078 A1 WO2005078078 A1 WO 2005078078A1 JP 2005002356 W JP2005002356 W JP 2005002356W WO 2005078078 A1 WO2005078078 A1 WO 2005078078A1
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lactoperoxidase
cation exchanger
producing
precipitate
eluate
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PCT/JP2005/002356
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Nobuo Ichihashi
Koji Yamauchi
Kouichirou Shin
Tetsuya Ando
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Morinaga Milk Industry Co., Ltd.
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    • B01D2311/04—Specific process operations in the feed stream; Feed pretreatment

Definitions

  • TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing high-purity lactoperoxidase from a milk material.
  • BACKGROUND ART Lactoperoxidase is an oxidoreductase contained in secretions such as milk of mammals such as milk, saliva, tears, airway mucus, etc. (for example, American 'Journal Ob'). Respiratory and Critical Care Medicine (American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine; Zomelica, Vol. 166, 2002, p.
  • Raici Topoxidase has a molecular weight of approximately Lactoperoxidase contains one heme per molecule as a coenzyme, and has a maximum absorption wavelength of 412 nm, which makes it highly purified lactoperoxidase.
  • Oxidase has a brown color (eg, British Journal of Nutrition, UK, Vol. 84, 2000, p. S. 19-S25).
  • Lactoperoxidase has been reported to have various biological functions such as antibacterial activity, antiviral activity, antioxidant activity, anticancer activity, and immunomodulatory activity (for example, the above-mentioned British * Giananore * Nutto).
  • lactoperoxidase The industrial use of lactoperoxidase has already been Use of lactoperoxidase, peroxide donor and thiosinate for the manufacture of a medicament for the treatment of bacta pylori infection (for example, JP-T-2000-509367), prevention of pathogenic bacterial infection added to formulated feed of cultured aquatic animals,
  • therapeutic agents for example, Patent No. 3103615
  • anti-aging agents for example, Patent No. 3103167
  • liver function improving agents for example, JP-A-2001-226289
  • prevention and treatment of peroxidase For example, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-501453
  • corneal disorder therapeutic agents for example, Japanese Patent No. 2840795).
  • the present applicant has applied a technique relating to a protease-inactivating composition, a food or drink (for example, JP-A-2002-238554), an intestinal flora improving agent and a food or drink (for example, JP-A-2003-246753). Is disclosed.
  • casein is isoelectrically precipitated by adding an acid such as hydrochloric acid to milk, and whey as a supernatant is prepared.
  • the obtained whey is brought into contact with a cation exchanger, and the positively charged lactoperoxidase in the whey is adsorbed on the cation exchanger.
  • a method is known in which the cation exchanger is washed with a buffer having a low salt concentration, and then lactoperoxidase is eliminated with a buffer having a high salt concentration.
  • a high-pressure pump is used to increase the purity of lactoperoxidase using a high-pressure pump using a power ram packed with a high-density gel-like cation exchanger with a small particle size.
  • the method of performing is common (eg, Journal of Chromatography, Netherlands, Vol. 795, 1998, p. 277-287).
  • additives to milk raw materials changes the flavor and physical properties of milk, which is inconvenient for purifying proteins from milk raw materials. Furthermore, if a large amount of additives are used for the purpose of washing the cation exchanger and desorbing the protein from the cation exchanger, it is necessary to remove those additives from the purified protein. However, the manufacturing method becomes complicated.
  • U.S. Pat. No. 4,666,018 discloses a method for purifying proteins such as lactoferrin-peroxidase from milk and its derivatives.
  • milk and its organisms are brought into contact with a cation exchanger composed of a cationic polysaccharide, the cation exchanger is washed with a low-concentration saline solution, and then the cation exchanger is added with a high-concentration saline solution.
  • Methods for desorbing proteins from exchangers have been published.
  • the protein produced by the method described in this patent document has a problem that it is not high in purity because it is obtained as a mixture, and it is not possible to produce high-purity lactoperoxidase.
  • Patent No. 2,985,158 discloses a method for recovering a highly active lactenin fraction.
  • lactoperoxidase is also used.
  • high-purity lactobar oxidase could not be produced.
  • EP 0 518 448 discloses a method using a metal chelate carrier as a method for isolating proteins in milk. Even in this method, the isolated protein is a mixture composed of immunoglobulin, lactofurin, and ratatoperoxidase, so that there is a problem that high-purity ratatoperoxidase cannot be produced. Was.
  • Patent No. 3403066 discloses a method for recovering a cell growth factor or a composition containing one or more cell growth factors from milk or milk derivative. Since the composition obtained in the above method is a mixture, it has a problem that it is not a method for producing high-purity lactoperoxidase.
  • inorganic porous particles coated with dextran having a carboxyl group or a sulfonic acid group are disclosed.
  • the purity of lactoperoxidase produced by this method is at most about 50%, and in order to produce high-purity lactoperoxidase, it is necessary to increase the purity by another step. There was a problem that there is.
  • Patent No. 25553180 discloses a method for extracting pure fractions of lactoperoxidase and lactofurin from whey.
  • whey treated by microfiltration is used as a raw material as a means of solving the problem of clogging caused by a change in the volume of the ion exchanger.
  • This method had a problem that the applicable range was narrow because milk ingredients other than whey could not be used.
  • microfiltration is required as a pretreatment of the milk raw material, which complicates the manufacturing process.
  • a strong cation exchanger is used as the cation exchanger, and lactoperoxidase and ratatoferin are selectively eliminated from the cation exchanger by buffers having different salt concentrations.
  • Patent No. 26686831 discloses a method for separating and purifying an iron-binding protein using a polysaccharide affinity carrier into which a strongly cationic sulfone group is introduced as a cation exchanger. .
  • This method produces lactoperoxidase of relatively high purity (85% purity).
  • a washing treatment with a buffer adjusted to pH 5 or less is essential.
  • selective desorption of lactoperoxidase and lactoferrin required a buffer having a different salt concentration and a pH of 5 or less.
  • US Pat. No. 5,596,082 discloses a method for purifying ratatoferrin and lactoperoxidase from milk and dairy products.
  • a gel having a large particle size and high physical stability is used as a positive ion exchanger so that milk and dairy products can be passed at a high flow rate.
  • the pH needs to be adjusted by using a buffer solution in order to wash the cation exchanger after the adsorption treatment and to selectively remove lactoperoxidase. I was Since there is no description about the purity of lactoperoxidase produced in this patent, it is unclear whether high-purity lactoperoxidase can be produced.
  • lactoperoxidase recovered from milk raw materials is obtained as a mixture with other proteins, and its purity is sufficiently high. Did not. Further, in order to increase the purity of lactoperoxidase, a separate purification step was required, which required time and production costs. In addition, even in a production method in which the purity of lactoperoxidase is relatively high, selective adsorption of lactoperoxidase contained in milk raw materials, washing of cation exchanger, selective desorption of protein, etc. are performed. Therefore, it was necessary to adjust the pH in each step, and this involved the problem that a large amount of added kamitsu was required.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, by performing a treatment process using an ion exchange method and an ultrafiltration membrane method, pH adjustment was not performed throughout the entire production process.
  • the present inventors have found a method for industrially producing high-purity lactoperoxidase directly from milk raw materials, and have completed the present invention.
  • the method for producing lactoperoxidase of the present invention comprises the following steps: (1) a step of bringing a milk raw material into contact with a cation exchanger having a weakly acidic group as an ion exchange group to perform an adsorption treatment;
  • the present invention has been made in view of problems and circumstances such as the prior art.
  • the present invention provides a simpler process, a shorter time, a lower cost, and a high purity lactopoxidase while preventing a change in the composition and quality of the milk raw material due to the use of additives.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing ratatoperoxidase, which can be applied to industrial scale production. Preferred conditions and the effects obtained in the present invention are described below.
  • the ratatoferin-adsorbing ability when 1 Oml of the cation exchanger is introduced into 1 kg of unheated skim milk is 85 mg / l 0 ml or more.
  • the ion exchange group is a carboxymethyl group.
  • the eluate is concentrated so that the protein content in the eluate is 0.9 to 15% to form a precipitate.
  • the ionic strength of the elution solvent used in the step (3) is preferably from 0.07 to 0.3.
  • the elution solvent used in the step (3) is preferably an aqueous solution containing at least one selected from the group consisting of sodium chloride, potassium chloride, potassium chloride, and magnesium chloride.
  • the method further comprises a step of obtaining a solid form of lactoperoxidase by removing the solvent of the lactopoxidase solution obtained in the step (5).
  • the purity of the solid lactic acid oxidase obtained in the above step is 80% or more.
  • lactoperoxidase when eluting ratatoperoxidase adsorbed on the cation exchanger into the elution solvent, lactoperoxidase is obtained in a state of being mixed with other fractions (impurities). Then, when concentrating using an ultrafiltration membrane, other fractions (impurities) are selectively separated and removed due to the difference in solubility. As a result, pure lactoperoxidase can be obtained.
  • Lactoperoxidase can be selectively recovered without a step requiring pH adjustment.
  • Milk raw materials other than whey can be widely applied as raw materials to be brought into contact with the cation exchanger.
  • the protein content in the present specification was expressed as a percentage obtained by measuring the nitrogen content in a sample by the Kjeldahl method and converting it using a nitrogen / protein conversion coefficient of 6.38.
  • lactoperoxidase The purity of lactoperoxidase was analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) and expressed as a percentage of the peak area of lactopoxidase with respect to the total peak area derived from proteins in the sample.
  • any milk material can be used as long as it contains at least lactobar oxidase.
  • milk, skim milk, whey, etc. derived from mammals such as humans, sea lions, buffaloes, sheep, goats, and horses can be used. Among them, it is preferable to use those having mild heat treatment conditions and those not heated.
  • a solution in which skim milk powder, whole fat milk powder, whey powder, whey protein concentrate (WPC), whey protein isolate (WPI), and the like are dissolved in water or a buffer solution can be used.
  • casein which has been removed by isoelectric focusing casein which has been eliminated by rennet, or cheese whey discharged during cheese production can also be used.
  • These milk raw materials can be used without removing the precipitate by a clarifier, microfiltration, filtration, etc. in advance.
  • the above milk raw materials may be used alone or in combination of two or more.
  • the manufacturing method of the present invention will be described below.
  • the milk material is brought into contact with a cation exchanger to perform an adsorption treatment.
  • a cation exchanger those having a weakly acidic group as an ion exchange group are used.
  • an exchange group having a desired function as an ion exchange group can be arbitrarily selected.
  • the weakly acidic ion exchange group include a carboxyl group, a carboxymethyl group, and a phenol group. Preferably it is a carboxymethyl group.
  • the cation exchanger is not particularly limited, and can be arbitrarily selected as needed.
  • preferred cation exchangers include crosslinked polysaccharides (agarose, dextran, cellulose, etc.), porous silica gel, and porous particles made of synthetic polymers, etc., into which weakly acidic ion exchange groups are introduced.
  • No. Specific examples include Sepabeads FP-CM13 (manufactured by Mitsubishi Kasei Corporation, exchange group: carboxymethyl group), CM-Seph Adex C-50 (manufactured by Amersham, exchange group: carboxymethyl group), CM-cephalo Preferred is FF (manufactured by Amersham, exchange group: carboxymethyl group).
  • the shape, size, surface condition, material, etc. of the resin of the cation exchanger are arbitrary and can be selected as necessary.
  • Examples of the use form include a pre-packed column II already filled with an ion exchanger resin, and a resin such as a cation exchanger filled with a medium such as a force ram. In these cases, it is preferable to use one kind of cation exchanger in combination with one medium from the viewpoint of simplicity. However, if necessary, a plurality of media each packed with resin beads may be connected in series or in parallel to carry out mouth chromatography.
  • the shape of the medium can be selected as needed, but it is preferable that the shape is such that it is easy to clean and that a large number of contact surfaces are provided to the contained resin beads, etc., and the inner wall is a flat surface with no irregularities Is preferred.
  • a shape having a circular surface such as a cylindrical shape (a cylindrical shape or a rod shape) or a conical shape, can be preferably used as the shape of the medium.
  • the material of the medium can be arbitrarily selected, but preferably, stainless steel, glass, polypropylene, polyethylene, polyethylene terephthalate, polycarbonate, acrylic resin and the like can be used.
  • the size of the medium may be appropriately selected depending on the processing scale, and can be arbitrarily selected, for example, from several cubic centimeters to several cubic meters.
  • commercially available pre-packed Examples of the rum include Hiprepl OZl 6 CMFF (manufactured by Amersham, exchange group: carboxymethyl group), CM—TOYOPEARL PAK650 series (manufactured by Tosoichi Co., exchange group: carboxymethyl group) and the like.
  • the elution solvent in order to increase the recovery of lactopoxidase, in a later step, when the elution solvent is brought into contact with the cation exchanger after the adsorption treatment, it is adsorbed by the cation exchanger. It is preferred that the protein is easily desorbed and eluted in the elution solvent. Therefore, in the present invention, it is preferable that the binding of the protein in the milk raw material to the cation exchanger is not too strong.
  • Cation exchangers having strongly acidic groups as ion exchange groups have dissociated ion exchange groups over a wide pH range.
  • the cation exchanger having a weakly acidic group as the ion exchange group changes its charge depending on pH.
  • those in which the acid dissociation constant of the ion exchange group is less than 3 can be defined as a strongly acidic group, and those having an acid dissociation constant of 3 or more as a weakly acidic group.
  • Each of the carboxymethyl groups can be exemplified.
  • the porosity or adsorptivity scale of the cation exchanger used in the present invention can be arbitrarily selected, and a protein having almost the same isoelectric point and molecular weight as lactopoxidase, specifically, a molecular weight
  • the ability to adsorb to proteins with 70,000 to 90,000 daltons and isoelectric points 7 to 9 can be expressed as an index.
  • the ability to adsorb to lactofurin mo weight: about 80,000; It is preferred to represent as
  • the adsorption capacity of the cation exchanger for ratatofurin can be determined, for example, by a method described in Japanese Patent Publication No. 13560/1994.
  • the sodium-type cation exchanger swelled to 10 ml with water is poured into 1 kg of unheated skim milk (pH 6.7), and the mixed solution is stirred at 4 ° C for 16 hours. After stirring, the cation exchanger is separated and washed with water. The washed cation exchanger is brought into contact with 150 ml of 10% saline solution to elute lactoferrin from the cation exchanger into the saline solution. The lactoferrin content in the recovered solution obtained by this elution was measured by the Lowry method (Analytical Biochemistry, USA, Vol. 15, 1966, p. 45-52). Calculate the adsorption capacity (unit: mg / ml).
  • the amount of lactoperoxidase recovered by the method of the present invention can be increased. That is, in accordance with the above method, a cation exchanger having a lactoflurin adsorption capacity of 7 Omg or more when 1 Om1 of the cation exchanger is added to 1 kg of unheated skim milk is preferable, and 85 mg or more. Is more preferable, and a cation exchanger having 9 O mg or more is more preferable. The higher the value of the adsorption capacity is, the more preferable it is.
  • the content of lactofurin in 1 kg of milk is about 10 mg, and a cation exchanger capable of adsorbing the whole amount is ideal. is there.
  • the Sepabeads FP_CM13 listed above has a lactoferrin adsorption capacity of 85 mg / 10 m1
  • CM-Sephadex C-50 has a lactoferrin adsorption capacity of 91 mg / 10 m 1, all of which are cation exchangers showing high lactoferrin adsorption ability.
  • the adsorption treatment (contact) between the milk raw material and the cation exchanger can be arbitrarily selected.
  • the adsorption treatment can be performed, for example, by a batch stirring method, a column continuous method, or the like. Either treatment can be performed as long as the raw material and the cation exchanger can be sufficiently contacted. It can be performed in one process or in combination of multiple adsorption processes.
  • the mixing volume ratio of the dairy raw material and the cation exchanger in the batch system can be arbitrarily adjusted according to the adsorption capacity of the cation exchanger and the specific adsorption treatment method.
  • the characteristics of the cation exchanger are roughly classified into two types, a hard type and a soft type, and either type can be used in the present invention.
  • the volume of the ion exchanger itself hardly changes due to ionic strength or pH, and even if the pressure applied to the cation exchanger changes due to a change in flow rate, the volume of the cation exchanger itself changes. Is almost unchanged. Therefore, the rigid type is more suitable for the continuous column method in which the cation exchanger is retained in the column and passed at a high flow rate.
  • the volume of the ion exchanger itself changes greatly depending on the ionic strength or pH, and the cation exchanger itself changes when the pressure applied to the cation exchanger changes due to a change in flow rate or the like. Changes easily.
  • soft-type cation exchangers are suitable exclusively for batch processes.
  • the temperature at which the milk material and the cation exchanger are adsorbed is less than o ° C, the milk material may freeze or increase in viscosity, and if it exceeds 60 ° C, lactoperoxidase may be denatured. Therefore, it is preferable that the heating is performed in the range of 0 to 60 ° C. Even at 25 to 60 ° C, lactoperoxidase may be denatured little by little if the adsorption takes a long time. Preferably. When using unpasteurized milk raw materials, it is desirable to carry out at 0 to 1 ° C to prevent bacterial growth.
  • the adsorption treatment time (contact time) between the milk raw material and the cation exchanger appropriate conditions can be selected in consideration of the temperature during the adsorption treatment and the adsorption treatment method (batch type or column continuous method) to be used. it can.
  • the adsorption treatment time between the milk raw material and the cation exchanger is preferably from 1 minute to 24 hours, more preferably from 10 minutes to 6 hours.
  • the linear flow rate is preferably from 10 cmZh to 100 cmZh.
  • the cation exchanger after the adsorption treatment is washed.
  • a washing solution at this time a saline solution having an ionic strength as low as less than 0.07 or a buffer solution in a neutral or weakly acidic region can be used, but water is considered from the viewpoint of production cost. It is preferable to wash with water.
  • the used milk raw material may be washed and removed by any method.
  • the cation exchanger may be moved from the container containing the dairy material and the cation exchanger and washed at another place, or the dairy material may be transferred from the container. And then wash the cation exchanger in the vessel.
  • the elution solvent used in this step preferably has an ionic strength in the range of 0.07 to 0.3, more preferably 0.10 to 0.25, and more preferably 0.15 to 0.25. Those having a range of at least 0.22 are more preferable.
  • lactoperoxidase can be efficiently eluted from the cation exchanger.
  • a buffer in a neutral or weakly acidic region whose ionic strength has been adjusted to the above range can also be used.
  • an aqueous solution in which only salts are dissolved salt solution.
  • salt solution One or a combination of two or more salts can be arbitrarily selected as needed in the present application.
  • a preferred salt solution is an aqueous solution of a salt consisting of one or a mixture of two or more selected from the group consisting of sodium chloride, chlorine chloride, calcium chloride, magnesium chloride and the like.
  • the operation method of the ultrafiltration membrane includes a normal ultrafiltration method in which water and components having a molecular weight equal to or lower than the molecular weight cut off are removed by passing through the membrane, and water equivalent to the permeated liquid permeating the membrane is applied to the membrane And continuous operation while adding to the retentate.
  • the method is classified into two types, and any of these methods can be used in the present invention. In particular, the latter method of running water filtration is more preferable because it can perform desalting simultaneously with concentration and can highly remove low molecular weight components from the retentate.
  • any commercially available ultrafiltration membrane can be used. Specific examples are the IRIS 308 film and the IRIS 372 film (both low Nu-Pulan) or GR-61 pp membrane (DDS).
  • the material of the ultrafiltration membrane may be either organic or inorganic, and may be selected in consideration of cost, versatility, and the like.
  • the temperature of the eluate during the ultrafiltration process can be set as long as it is lower than the heat resistance temperature of the membrane to be used (for example, 80 ° C or lower for GR-61 pp membrane).
  • lactoperoxidase may be thermally denatured at 60 ° C or higher, and microbial growth is remarkable in the range of 10 to 60 ° C. Therefore, it is preferable to perform in the range of 0 to 10 ° C.
  • the pressure during ultrafiltration can be any pressure as long as it is below the pressure limit of the membrane used (eg, 0.6 MPa or less for GR-61 pp membranes). Since the use near the withstand voltage limit may shorten the life of the film, it is recommended to use the withstand voltage of 2 to 3 or less (for example, 0.4 MPa or less for GR-61 pp film). preferable.
  • the ultrafiltration membrane module to be used can be any of a tube type, a hollow fiber type, a flat membrane type, a spiral type and the like.
  • a hollow fiber type internal pressure type module or the like when a precipitate is formed in the hollow fiber, there is a possibility that the flow path will be blocked.
  • the eluate obtained in the previous step (3) is preferably a clear brown solution.
  • proteins other than lactoboxidase form a precipitate in the retentate on the ultrafiltration membrane due to the difference in protein solubility.
  • the protein in order to efficiently precipitate proteins other than lactoperoxidase, that is, proteins as impurities, the protein must be concentrated so that the protein content in the concentrated eluate is 0.9% or more. Is preferred. If the protein content in the eluate exceeds 15%, the viscosity of the eluate will increase and the efficiency of ultrafiltration membrane treatment may decrease. Is more preferably in the range of 0.9 to 15%, further preferably 1.5 to 12%, and most preferably 3 to 10%.
  • the amount of lactoperoxidase mixed in the precipitate can be reduced, and a precipitate containing no lactobaoxidase can be generated. It is. (5) Next, the precipitate is removed from the eluate (retentate) in which the precipitate has been formed. As a result, proteins as impurities are removed from the eluate to obtain a solution containing high-purity lactoperoxidase (lactoperoxidase solution).
  • the method of removing the precipitate can be arbitrarily selected.
  • the precipitate may be collected by leaving the eluate (retentate) in which the precipitate has formed to recover the precipitate, or by subjecting the precipitate to a clarification treatment such as centrifugation or microfiltration.
  • a method of recovering the removed clarified solution (lactoperoxidase solution) may be used.
  • the ratato peroxidase solution obtained in this step is preferably subjected to a sterilization treatment if necessary.
  • calcium ions such as calcium chloride are added so as to have a concentration of about 2 OmM, and in 72, 15 to 90 seconds. It is preferable to perform a sterilization treatment by heat sterilization for about a time.
  • the method for removing the solvent is not particularly limited and can be selected as needed.
  • a method of further concentrating using an ultrafiltration membrane and then freeze-drying by a conventional method to remove water can be suitably used.
  • a high-purity lactoperoxidase powder can be produced.
  • the solid lactoperoxidase thus obtained can achieve a high purity of 80% or more.
  • the step (6) of removing the solvent is not essential, and the lactoperoxidase solution obtained in the step (5) can be used in the form of a solution as high-purity lactoperoxidase.
  • CM-Sephadex C-50 manufactured by Amersham having a carboxymethyl group and a lactoferrin adsorption capacity of 91 mg / 1 Oml was used as the weakly acidic cation exchanger.
  • Protein was adsorbed to the exchanger by adding 20 liters of skim milk to a column packed with 170 ml of the weakly acidic cation exchanger. Next, after washing the weakly acidic cation exchanger in the column with water, adding 20 Oml of 1.6% saline (ion intensity: 0.27) as an elution solvent into the column to weakly acidic cation exchanger The protein adsorbed on the body was eluted in the saline. About 200 ml of the collected eluate was used as the test sample. The protein content in the obtained test sample was measured by the Kjeldahl method and found to be 0.26%.
  • centrifugal ultrafiltration filter units Three types of centrifugal ultrafiltration filter units (fraction molecular weights: 10,000 daltons, 30,000 daltons, and 50,000 daltons, all manufactured by Millipore) were prepared.
  • the volume of the retentate was concentrated to 0.15 ml, the total protein content in the retentate was 0.9%. From this, it was confirmed that when the retentate was concentrated so that the total protein content of the retentate after concentration was 0.9% or more, a precipitate was formed in the retentate.
  • test sample used in this test was the same test sample as in Test Example 1 (eluate obtained by dissolving protein in 1.6% saline, protein content: 0.26%).
  • Three stirred cell units (manufactured by Millipore) equipped with an ultrafiltration membrane having a molecular weight cutoff of 30,000 daltons were prepared, and 50 ml of a test sample was added to each cell unit.
  • the pressure inside the cell unit was increased to about 0.3 MPa using nitrogen gas, and the solution was concentrated until the retained liquid in the cell unit became 10 ml.
  • the entire amount of retentate in the cell unit is transferred to a centrifuge tube, and the liquid is separated into solid and liquid by centrifugation at 10,000 rpm.
  • the precipitate (precipitate sample 1) was recovered.
  • the dry weight of the precipitated samples 1 to 3 was measured by a conventional method.
  • CM-Sephadex C_50 manufactured by Amersham having a carboxymethyl group and having a lactoferrin adsorption capacity of 91 mg / 1 Oml was prepared.
  • a skim-derived skim milk (pH 6.7, sample 1 described later) was prepared as a milk raw material.
  • the adsorption treatment was performed by passing 2,000 liters of the skim milk through the column under the conditions of a temperature of 4 ° C and a flow rate of 60 liter_h.
  • the collected supernatant fraction ( ⁇ silata topoxidase solution) was subjected to microfiltration using a microfiltration membrane with a pore size of 1.4 to further remove a small amount of precipitate, and A purified sample containing was prepared. Furthermore, the obtained purified sample was freeze-dried to produce 26 g of a powdery freeze-dried sample (sample 4 described below) containing peratasidase.
  • Samples 1 to 4 obtained during the manufacturing process namely skim milk (milk raw material): sample 1, eluate from cation exchanger: sample 2, supernatant fraction of retentate after ultrafiltration membrane treatment : For sample 3, freeze-dried sample: sample 4, the protein content and the peroxidase activity were measured, respectively, to determine the specific activity.
  • the protein content was measured by the Kjeldahl method, and the ⁇ ⁇ -lactoperoxidase activity was measured by the method of Putter et al., Edited by Bergmeyer, edited by Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edition. , Vol. 3, 1983, p. 286-293], and the peroxidase activity (specific activity) per mg of protein was determined.
  • the results are shown in Table 1.
  • sample 1 As shown in Table 1, the protein content of sample 1 was 3.30%, and the specific activity was 0.20 unitZmg. Sample 2 had a protein content of 0.26% and a specific activity of 132.5 unitZmg. From these results, it can be seen that, among the proteins in skim milk (milk raw material), ⁇ -peroxidase was selectively eluted into the eluate.
  • the sample 4 (freeze-dried sample) was analyzed for the purity of lactoperoxidase by high performance liquid chromatography.
  • purified ⁇ peroxidase manufactured by Sigma was used as a standard in advance, and the peak of the standard was confirmed to have an elution time of about 18 minutes by the above analysis method.
  • Sample 4 was analyzed by the above-described analysis method, and the purity of perillatase was measured by an automatic integration method of peak areas.
  • the present invention can produce highly pure lactoperoxidase in a simpler process, in a shorter time, at lower cost, and can be applied to production on an industrial scale. Provided is a method for producing lactoperoxidase.

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Abstract

(1)イオン交換基として弱酸性基を有する陽イオン交換体に乳原料を接触させて吸着処理する工程、(2)前記吸着処理の後の陽イオン交換体を洗浄処理する工程、(3)前記洗浄処理の後の陽イオン交換体に溶出溶媒を接触させ、該溶出溶媒中にラクトパーオキシダーゼが溶出された溶出液を得る工程、(4)前記溶出液を限外濾過膜で濃縮することにより、該濃縮された溶出掖中に沈澱を生成させる工程、および(5)前記濃縮された溶出液から沈澱を除去してラクトパーオキシダーゼ溶液を得る工程を有する、ラクトパーオキシダーゼの製造方法。

Description

ラク トパーォキシダ一ゼの製造方法 技術分野 本発明は、 乳原料から高純度のラク トパーォキシダーゼを製造する方法に関す る。 本願は、 2004年 2月 1 7日に出願された特願 2004— 039704号 に対し優先権を主張し、 その内容を明ここに援用する。 背景技術書 ラクトパーォキシダーゼは、 牛乳等の哺乳類の乳汁をはじめ、 唾液、 涙液、 気 道粘液等の分泌液に含有される酸化還元酵素である （例えば、 アメリカン 'ジャ ーナル ·ォブ ' レスピラトリー · アンド · クリティカル ·ケア一 · メディスン (American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine; 、 ゾメ リカ、 第 166卷、 2002年、 p. S 57〜S 6 1 ) 。 ラタ トパ一ォキシダーゼは、 分子量約 8万の蛋白質である。 ラクトパーォキシダーゼは、 補酵素として一分子 当り一つのヘムを含有している。 このヘムの極大吸収波長は 41 2 nmに存在す るため、 高度に精製したラク トパーォキシダーゼは茶色を呈している （例えば、 ブリティッシュ · ジャーナ /レ ·ォブ '二ユートリシヨン （British Journal of Nutrition) 、 イギリス、 第 84卷、 2000年、 p. S 1 9〜S 25) 。
ラク トパーォキシダーゼには、 抗菌性、 抗ウィルス活性、 抗酸化活性、 抗がん 作用、 免疫調節作用等の多様な生物機能が報告されており （例えば、 前記ブリテ ィッシュ *ジヤーナノレ*ォフ ニュー卜ジショ - (British Journal of Nutrition) % イギリス、 第 84卷、 2000年、 p. S 1 9〜S 25、 及びライフ 'サイェン シ一ズ （Life Sciences) 、 イギリス、 第 43卷、 1 988年、 p. 739〜 74 5) 、 生体防御に関与する蛋白質として極めて重要であることが明らかにされて いる。 このようなラク トパーォキシダーゼの産業上の利用に関して、 既にへリコ バクタピロリ感染の治療用医薬を製造するためのラク トペルォキシダーゼ、 ペル ォキシドドナーおよびチオシァネー卜の使用 （例えば、 特表 2000— 5093 67号公報） 、 養殖水生動物の配合飼料に添加される病原菌感染予防及び治療剤 (例えば、 特許第 31036 15号公報） 、 老化防止剤 （例えば、 特許第 310 31 67号公報）、肝機能改善剤（例えば、特開 2001— 226289号公報）、 ペルォキシダーゼの予防および治療への応用 （例えば、 特表平 6— 501453 号公報） 、 角膜障害治療剤 （例えば、 特許第 2840795号公報） 等に関する 技術が開示されている。 さらに、 本出願人によってゥレアーゼ不活性化組成物お よび飲食品 （例えば、 特開 2002— 238554号公報） および腸内フローラ 改善剤および飲食品 （例えば、 特開 2003— 246753号公報） に関する技 術が開示されている。
実験室規模でのラク トパーォキシダーゼの精製法に関しては、ァクタ'ケミカ · スカンジナビ力 （ActaChemicaScandinavica) 、 デンマーク、 第 23巻、 1 96 9年、 ρ· 1 71〜 1 84や、 フエブス ' レターズ （FEBSLetters) 、 オランダ、 第 1 1 0巻、 1 980年、 ρ· 200〜 204や、 ジャーナル ·ォブ ' クロマト グラフィー （Journal of Chromatography) 、オランダ、第 795巻、 1998年、 p. 277〜287にて報告されている。
その典型的な方法としては、 塩酸等の酸を牛乳に添加してカゼインを等電点沈 澱させ、 上清であるホエーを調製する。 得られたホエーを陽イオン交換体に接触 させ、 ホェ一中で正に帯電しているラク トパーォキシダ一ゼを陽イオン交換体に 吸着させる。 次に陽イオン交換体を塩濃度の低い緩衝液で洗浄した後、 塩濃度の 高い緩衝液でラク トパーォキシダーゼを脱離させる方法が知られている。
実験室規模での精製法では、 ラク トパーォキシダーゼの純度を高めるために、 粒子径の小さなゲル状の陽ィオン交換体を高密度に充填した力ラムを用い、 高圧 ポンプで高速の通液を行う方法が一般的である （例えば、 ジャーナル ·ォブ - ク 口マトグラフィー （Journal of Chromatography) 、 オランダ、 第 795卷、 1 9 98年、 p. 277〜 287) 。
これに対して、 カラムに粒子径の比較的大きな陽イオン交換体を充填し、 自然 落下で通液を行う場合には、 更に時間を要する （例えば、 ァクタ ·ケミカ ·スカ ンジナビ力 （Acta Chemica Scandinavica) 、デンマーク、第 2 3卷、 1 9 6 9年、 p . 1 7 1〜1 8 4やフエブス · レターズ （FEBS Letters) 、 オランダ、 第 1 1 0卷、 1 9 8 0年、 p . 2 0 0〜 2 0 4 ) 。
近年の工業的規模における分離技術の進歩にともない、 牛乳に含有される生理 活性物質を高純度に分離 ·精製し、 大量に製造することが可能になってきた。 殆 どの場合、 実験室規模で最適化された蛋白質の精製法を.、 そのまま工業的規模に スケールアップする事は現実的には困難である。 その要因として、 実験室で汎用 されるィォン交換体や力ラムの特性が、 必ずしも原料の大量処理には向いていな いことが挙げられる。
また、 乳原料への添加物の添加は、 乳の風味および物性を変化させるので、 乳 原料からの蛋白質の精製には不都合である。 さらに、 陽イオン交換体の洗浄およ び陽イオン交換体からの蛋白質の脱離の目的で大量の添加物を使用した場合、 精 製された蛋白質からそれらの添加物を除去する必要が生じるため、 製造法が複雑 になる。
なお、 乳原料からの高純度の蛋白質の製造における、 これらの問題点を解決し た製造法として、 髙純度牛ラク トフヱリンの製造法 （例えば、 特公平 6 _ 1 3 5 6 0号公報） が当出願人によって既に提案されている。
ラク トパーォキシダーゼの工業的な製造方法については以下のものが開示され ている。
米国特許第 4 6 6 7 0 1 8号の明細書では、 牛乳およびその派生物からラク ト フェリンゃラク トパーォキシダーゼ等の蛋白質を精製する方法が開示されている。 この方法では、 陽イオン性の多糖類からなる陽イオン交換体に牛乳およびその派 生物を接触させ、 陽イオン交換体を低濃度の塩類溶液で洗浄した後、 高濃度の塩 類溶液で陽イオン交換体からの蛋白質の脱離を行う方法が公開されている。 しか しながら、 この特許文献に記載の方法で製造される蛋白質は混合物として得られ るため純度が高くなく、 純度の高いラク トパーォキシダーゼの製造はできないと いう問題点を有していた。
特許第 2 9 8 5 1 5 8号公報では、 活性の高いラクテニン画分の回収方法が開 示されている。 この特許文献に記載の方法においても、 ラク トパーォキシダーゼ はラクテ二ンを構成する一成分として蛋白質の混合物に含まれた状態で得られる ため、 高純度のラク トバーオキシダ一ゼの製造は出来ないという問題点を有して いた。
欧州特許第 0 5 1 8 4 4 8号明細書では、乳中の蛋白質を単離する方法として、 金属キレート担体を使用した方法が開示されている。 この方法でも単離される蛋 白質が免疫グロブリン、 ラク トフヱリンおよびラタ トパーォキシダーゼから構成 される混合物であるため、 高純度のラタ トパーォキシダーゼの製造は不可能であ るという問題点を有していた。
特許第 3 4 0 3 0 6 6号公報では、 牛乳あるいは牛乳誘導物から細胞増殖因子 あるいは 1種または 2種以上の細胞増殖因子を含む組成物を回収する方法が開示 されているが、 この方法で得られる組成物は混合物であることから、 高純度のラ ク トパーォキシダーゼ製造法ではないという問題点を有していた。
特許第 2 7 1 0 2 8 3号公報では、 乳清からの金属蛋白質の選択的抽出法とし て、 カルボキシル基またはスルホン酸基を備えたデキストランで被覆された無機 の多孔性粒子 （シリカ粒子） に乳清を接触させる工程を有する方法が開示されて いる。 この方法で製造されたラク トパーォキシダーゼの純度は高くても 5 0 %程 度であり、 高純度のラク トパーォキシダーゼを製造するためには、 さらに別のェ 程によって精製度を高める必要があるという問題点を有していた。
特許第 2 5 5 3 1 8 0号公報では、 乳清からのラク トパーォキシダーゼおよび ラク トフヱリンの純粋な画分の抽出法が開示されている。 この方法では、 陽ィォ ン交換体の容積変化によって起こる目詰まりの問題を解決する手段として、 マイ クロ濾過で処理した乳清が原料として使用されている。 この方法には、 乳清以外 の乳原料が使用できないため、 適応範囲が狭いという間題点を有していた。 さら に、 乳原料の前処理として、 マイクロ濾過も必要とされており、 製造工程が複雑 である。 また、 陽イオン交換体には、 強陽イオン交換体が使用されており、 ラク トパーォキシダーゼおよびラタ トフエリンは、 それぞれ塩濃度の異なる緩衝液に よって選択的に陽イオン交換体から脱離される。 この方法では、 陽イオン交換体 の洗浄と、 蛋白質の選択的脱離を可能にするため、 用いる緩衝液の p Hを調整す る必要があり、 かかる緩衝液を調製するためには多量の添加物を必要とする。 ま た、 精製された蛋白質から添加物を除去する必要があり、 さらに工程を複雑化さ せる要因となるというような様々な問題点を有していた。
特許第 2 6 8 6 8 3 1号公報では、 強陽イオン性のスルホン基を導入した多糖 類ァフィ二ティ担体を陽ィオン交換体として使用した鉄結合性蛋白質の分離精製 法が開示されている。 この方法では、 比較的高純度 （純度 8 5 %) のラク トパー ォキシダーゼが製造される。 しかし、 吸着処理後の陽イオン交換体の洗浄工程に おいて、 p H 5以下に調整された緩衝液による洗浄処理が必須である。 また、 ラ クトパーォキシダーゼおよびラク トフエリンの選択的脱離には、 それぞれ塩濃度 の異なる p H 5以下の緩衝液が必要であった。
特開平 5— 2 0 2 0 9 8号公報では、 乳原料からの生理活性物質の製造法とし て、 スルホン基を持つ強陽イオン交換体と、 カルボキシル基を持つ弱陽イオン交 換体のどちらでも使用可能な技術が開示されている。 しかしながら、 この方法に おいても、 やはり吸着処理後の陽イオン交換体の洗浄と、 ラク トバーオキシダ一 ゼの選択的脱離を可能にするために p H 5以下の緩衝液が必要であるという問題 点を有していた。
米国特許第 5 5 9 6 0 8 2号公報では、 乳および乳製品からのラタトフエリン およびラク トパーォキシダーゼの精製法が開示されている。 この特許では、 乳お よび乳製品を高流速で通液することを可能とするために、陽ィォン交換体として、 粒子径が大きく、 物理的に安定性の高いゲルが使用されている。 この方法におい ても、 吸着処理後の陽イオン交換体の洗浄とラク トパーォキシダーゼの選択的脱 離のためには、 緩衝液の使用による p Hの調整が必要であるという問題点を有し ていた。 なお、 この特許で製造されるラク トパーォキシダーゼはその純度に関す る記述がないことから、 高純度のラク トパーォキシダーゼの製造が可能であるか どうかについては不明である。
上述のように、 従来のラク トパーォキシダーゼの製造方法のほとんどにおいて は、 乳原料から回収されたラク トパーォキシダーゼは他の蛋白質との混合物とし て得られ、 その純度は充分に高いとは言えなかった。 また、 ラク トパーォキシダ ーゼの純度を高めるためには、 別の精製工程が必要であり、 そのための時間と製 造コス卜が必要であった。 また、 ラク トパーォキシダーゼの純度が比較的高くなる製造方法であっても、 乳原料に含まれるラク トパーォキシダ一ゼの選択的吸着、陽イオン交換体の洗浄、 蛋白質の選択的脱離等を行うために、 各工程で P Hを調整する必要があり、 これ によって多量の添カ卩物の使用が必要であるという問題点も含まれていた。
発明の開示
本発明者らは、 前記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、 イオン交換法 と限外濾過膜法を用いた処理工程を行うことにより、 製造工程全体をとおして p H調整を行わなくても、 乳原料から直接、 高純度のラク トパーォキシダーゼをェ 業的に製造できる方法を見出し、 本発明を完成するに至った。
すなわち本発明のラク トパーォキシダーゼの製造方法は、 （1 ) イオン交換基 として弱酸性基を有する陽イオン交換体に乳原料を接触させて吸着処理する工程、
( 2 ) 前記吸着処理の後の陽イオン交換体を洗浄処理する工程、 （3 ) 前記洗浄 処理された陽イオン交換体にラク トパーォキシダーゼを溶出させる溶出溶媒を接 触させ、該溶出溶媒中にラク トパーォキシダーゼが溶出された溶出液を得る工程、
( 4 ) 前記溶出液を限外濾過膜で濃縮することにより、 濃縮された溶出液中に沈 澱を生成させる工程、 および （5 ) 前記濃縮された溶出液から沈澱を除去してラ ク トパーォキシダーゼ溶液を得る工程、 とを有するラク トパーォキシダーゼの製 造方法である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好ましい実施態様について詳細に説明する。 ただし、 本発明は 以下の好ましい実施態様に限定されず、 本発明の範囲内で自由に変更することが できるものである。
本発明は従来技術など問題や事情に鑑みてなされたものである。 本発明は、 添 加物の使用による乳原料の組成および品質の変化を防止しつつ、 従来より簡単な 工程で、 より短時間に、 より低コス トで、 純度の高いラク トパ一ォキシダーゼを 製造することができ、 また工業的規模での製造にも適用することができる、 ラタ トパーォキシダーゼの製造方法を提供することを目的とする。 本発明における好ましい条件や得られる効果を以下に記載する。
本発明において、 未加熱の脱脂乳 1 k g中に前記陽イオン交換体 1 Om lを投 入したときのラタ トフエリン吸着能は 85mg/l 0m 1以上であることが好ま しい。
前記イオン交換基はカルボキシメチル基であることが好ましい。
前記 （4) 工程において、 溶出液中の蛋白質含有量は 0. 9〜1 5%となるよ うに濃縮して沈澱を生成させることが好ましい。
前記 （3) 工程で用いる溶出溶媒のイオン強度は 0. 07〜0. 3であること が好ましい。
前記 （3) 工程で用いる溶出溶媒は、 塩ィヒナトリウム、 塩化カリウム、 塩化力 ルシゥム、 および塩化マグネシウムからなる塩類群から選ばれる少なくとも 1種 を含む水溶液であることが好ましい。
さらに、 前記 （5) 工程で得られたラクトパ一ォキシダーゼ溶液の溶媒を除去 することにより固体状のラク トパーォキシダーゼを得る工程を有することが好ま しい。
前記の工程で得られる固体状のラク トバーオキシダ一ゼの純度は 80%以上で あることが好ましい。
本発明にあっては、 陽イオン交換体に吸着されたラタ トパーォキシダーゼを溶 出溶媒中に溶出させる際には、 ラク トパーォキシダーゼを他の画分 （不純物） と 混合された状態で得、 この後、 限外濾過膜を用いて濃縮する際に、 溶解度の差異 によって他の画分 （不純物） を選択的に分離 ·除去する。 このことによって髙純 度のラクトパーォキシダーゼを得ることができる。
したがって、 本発明によれば、 以下のような効果が得られる。
(1) pH調整を必要とする工程を経ずにラク トパーォキシダーゼを選択的に回 収することができる。
(2) 簡単な工程により、 より短時間に、 より低コス トで高純度のラク トバーオ キシダーゼを製造することができる。
(3) 緩衝液や多量の添加物を必要としないことから、 低コスト化の点で有利で ある。 ( 4 ) 添加物の使用による乳原料の組成および品質の変化を防止することができ る。
( 5 ) 工業的スケールに容易に適用することができる。
( 6 ) 陽イオン交換体に接触させる原料として乳清以外の乳原料も広く適用する ことができる。
次に、 本発明の好ましい実施態様についてさらに詳細に説明する。
なお、 本明細書における蛋白質含有量については、 試料中の窒素含有量をケル ダール法で測定し、 窒素/蛋白質換算係数 6 . 3 8を用いて換算した百分率とし て表示した。
また、 ラク トパーォキシダーゼの純度については、 高速液体クロマトグラフィ 一 (H P L C ) で分析し、 試料中の蛋白質に由来する全ピーク面積に対する、 ラ ク トパ一ォキシダーゼのピーク面積の百分率として表示した。
本明細書において、 上記蛋白質含有量および純度以外の百分率は特に断りのな い限り質量による表示である。
本発明で用いることのできる乳原料としては、 少なくともラク トバーオキシダ ーゼが含有されていればいかなるものも使用することができる。 例えば、 ヒ ト、 ゥシ、 水牛、 ヒッジ、 ャギ、 ゥマ等の哺乳類由来の、 乳、 脱脂乳、 ホェ一等を用 いることができる。 なかでも熱処理条件の緩やかなものや未加熱のものを用いる ことが好ましい。 また、脱脂粉乳、 全脂粉乳、 ホエー粉、 ホエー蛋白質濃縮物 （W P C ) 、 ホエー蛋白質分離物 （W P I ) 等を水又は緩衝液に溶解させた溶液も使 用できる。 さらに、 等電点沈澱によってカゼインを除去したり、 レンネットによ つてカゼインを排除した上清、 或いはチーズ製造時に排出されるチーズホエーも 使用することができる。 これらの乳原料は、 予めクラリファイヤー、 マイクロフ ィルトレーシヨン、 濾過等の操作によって沈澱物を除去しなくても使用できる。 本発明において、 特に、 乳原料としてゥシ由来の乳原料を用いてゥシラクトパ 一ォキシダーゼを製造することが好ましい。
なお上記乳原料は単独で用いても二種以上を組み合わせて用いても良い。 本発明の製造方法について以下に説明する。 ( 1 ) まず、 乳原料を陽イオン交換体に接触させて吸着処理を行う。 陽イオン交 換体としては、 イオン交換基として弱酸性基を有するものが用いられる。 弱酸性 のイオン交換基としては、 イオン交換基としての目的とする働きを有する交換基 を任意で選択することができる。 弱酸性のイオン交換基の例としては、 カルボキ シル基、 カルボキシメチル基、 フエノール基等が挙げられる。 好ましくはカルボ キシメチル基である。
陽イオン交換体は特に限定されず、 必要に応じて任意で選択可能である。 好ま しい陽イオン交換体の例としては、架橋型の多糖類（ァガロース、デキストラン、 セルロース等） 、 親水性シリカゲル、 合成ポリマー等からなる多孔性粒子に弱酸 性のイオン交換基を導入したもの等が挙げられる。 具体例としては、 セパビーズ F P - C M 1 3 (三菱化成社製、 交換基：カルボキシメチル基） や、 CM—セフ アデックス C— 5 0 (アマシャム社製、 交換基：カルボキシメチル基） 、 C M— セファロ一ス— F F (アマシャム社製、 交換基：カルボキシメチル基） を好適に 用いることができる。
陽イオン交換体の樹脂の形、 サイズ、 表面状態、 材質等は任意であり必要に応 じて選択可能である。 使用形態の例としては、 イオン交換体樹脂が既に充填され たプレパックカラムゃ、 陽ィオン交換体の樹脂ビーズを力ラム等の媒体に充填し たもの等が挙げられる。 これらの場合、 一種類の陽イオン交換体を 1つの媒体と 組み合わせて用いる事が簡便性の面から好ましい。 しかしながら、 必要に応じて 複数の媒体のそれぞれに榭脂ビーズを詰めたものを直列または並列に接続してク 口マトグラフィーを行ってもよレ、。 媒体の形状は必要に応じて選択できるが、 洗 浄が容易で、 かつ含まれる樹脂ビーズ等に多くの接触面を与える形状であること が好ましく、 また内壁は凹凸の無い平らな表面であることが好ましい。 具体的に は円筒形 （円柱状、 棒状） や円錐状など、 円形面を有する形状が媒体の形状とし て好ましく使用できる。 媒体の材質は任意で選択できるが、 好ましくはステンレ ス、 ガラス、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリエチレンテレフタレート、 ポ リカーボネート、 アクリル樹脂等が使用できる。 媒体のサイズは、 適宜処理スケ ールによって選択してよく、 例えば数立方センチメートルから数立方メートルの 規模まで任意に選択できる。 本発明に好ましく使用してょレ、市販のプレパックカ ラムとしては、 H i p r e p l OZl 6 CM F F (アマシャム社製、 交換基： カルボキシメチル基）、 CM— TOYOPEARL PAK650シリーズ（東ソ一 社製、 交換基：カルボキシメチル基）等が挙げられる。
ここで、 ラク トパ一ォキシダーゼの回収率を高めるためには、 これより後のェ 程において、 吸着処理後の陽イオン交換体に溶出溶媒を接触させたときに、 陽ィ オン交換体に吸着された蛋白質が容易に脱離されて該溶出溶媒中に溶出すること が好ましい。 したがって、 本発明においては、 乳原料中の蛋白質の陽イオン交換 体への結合が強すぎない方が好ましい。 イオン交換基として強酸性基を有する陽 イオン交換体は広い pH範囲でイオン交換基が解離している。 これに対して、 ィ オン交換基として弱酸性基を有する陽イオン交換体は pHに依存して電荷が変化 する。 このため、 蛋白質の結合能も変化するという特性を持つので、 本発明の製 造方法において好適である。 なお本発明においてイオン交換基の酸解離定数が 3 未満のものを強酸性基、 及び 3以上のもの弱酸性基として定義することができ、 強酸性基としてはスルホン酸基、 弱酸性基としてはカルボキシメチル基を、 それ ぞれ例示することができる。
また、 本発明で用いられる陽ィォン交換体の多孔性または吸着性のスケールは 任意で選択でき、 さらにラク トパ一ォキシダーゼとほぼ同じ等電点と分子量を有 するような蛋白質、 具体的には分子量 7〜 9万ダルトン、 等電点 7〜9である蛋 白質に対する吸着能を指標として表すことができ、 中でもラク トフユリン （分子 量:約 8万。 等電点：約 8) に対する吸着能を指標として表すことが好ましい。 な お、 陽イオン交換体のラタトフヱリンに対する吸着能は、 例えば特公平 6_ 1 3 560号公報に記載された方法で求めることができる。
すなわち、 ナトリウム形の陽イオン交換体を水で膨潤させて 10m l としたも のを、 未加熱の脱脂乳 l k g (pH6. 7) 中に投入し、 これらの混合液を 4°C で 16時間攪拌した後、 陽イオン交換体を分取して水洗する。 水洗した陽イオン 交換体を濃度 10%の食塩水 1 50m lに接触させ、 陽イオン交換体から食塩水 中にラク トフエリンを溶出させる。 この溶出によって得られた回収液中のラク ト フェリン含量をローリー法 〔アナリティカル 'バイオケミストリー （Analytical Biochemistry) 、 アメリカ、 第 1 5卷、 1 966年、 p. 45〜 52〕 により測 定することによって吸着能 （単位： m gノ 1 0 m l ) を算出する。
上記方法で測定されるラク トフエリン吸着能がより高い陽イオン交換体を選択 することにより、 本発明の方法によるラク トパーォキシダーゼの回収量を高める ことができる。 すなわち上記方法に従い、 未加熱の脱脂乳 1 k g中に陽イオン交 換体 1 O m 1を投入したときのラク トフヱリン吸着能が 7 O m g以上である陽ィ オン交換体が好ましく、 8 5 m g以上である陽イオン交換体がより好ましく、 9 O m g以上である陽イオン交換体がさらに好ましい。 該吸着能の値は高い方がよ り好ましく、 一般的に、 牛乳 1 k g中のラク トフヱリン含有量は約 1 0 O m g程 度であり、 その全量を吸着できる陽イオン交換体が理想的である。 具体的に、 上 記で挙げたセパビーズ F P _ CM 1 3のラク トフエリン吸着能は 8 5 m g / 1 0 m 1、 CM—セフアデックス C— 5 0のラク トフエリン吸着能は 9 1 m g / 1 0 m 1であり、 いずれも高いラクトフエリン吸着能を示す陽イオン交換体である。 乳原料と陽イオン交換体との吸着処理 （接触） は任意で選択可能である。 吸着 処理は例えば、 バッチ式攪拌法、 カラム連続法等の方法で行うことができる。 乳 原料と陽イオン交換体を十分に接触させることができれば、 いずれの処理も実施 可能である。 1つの処理で行っても、 複数の吸着処理を組み合わせて行っても良 レ、。
バッチ式の場合、 一定量の乳原料から多くの収量を望む場合には多くの陽ィォ ン交換体を用い、 一定量の陽イオン交換体で多くの収量を望む場合には多くの乳 原料を用いることが適当である。 バッチ式における乳原料と陽イオン交換体の混 合体積比率は、 陽ィオン交換体の吸着能や具体的な吸着処理方法に応じて任意に 調整することができる。
ここで、 陽イオン交換体の特性は、 硬質タイプと軟質タイプの 2つに大きく区 分されるが、 本発明ではいずれのタイプも使用可能である。
硬質タイプは、 イオン強度または p Hによってイオン交換体自身の体積はほと んど変化せず、 また流速の変化などにより陽ィオン交換体にかかる圧力が変化し ても陽イオン交換体自体の体積はほとんど変わらない。 したがって、 硬質タイプ は、 陽イオン交換体をカラム内に保持して高流速で通液するカラム連続法により 適している。 —方、 軟質タイプの陽ィオン交換体はイオン強度または p Hによってイオン交 換体自身の体積が大きく変化し、 また流速の変化などにより陽イオン交換体にか かる圧力が変化すると陽イオン交換体自体の体積が容易に変化する。 そのため、 軟質タイプの陽ィオン交換体を力ラム内に保持して高流速で通液することは困難 である。 特に脱脂乳ゃホエー等を通液する時は他の塩類溶液等を通液する時に比 ベて陽イオン交換体層内で大きな圧力損失が生じる。 したがって、 軟質タイプの 陽イオン交換体は、 もっぱらバッチ法に適している。
なお、前記のセパビーズ F P— CM 1 3 (三菱化成社製）は硬質タイプであり、 C M—セフアデックス C— 5 0 (アマシャム社製） は軟質タイプである。
乳原料と陽イオン交換体を吸着処理させる温度は、 o °c未満では乳原料の凍結 や、 粘度上昇などが生じる恐れがあり、 6 0 °Cを超える場合はラク トパーォキシ ダーゼが変性する可能性があるため、 0〜 6 0 °Cの範囲で行われる事が好ましい。 なお、 2 5〜 6 0 °Cであっても、 吸着に長時間を要する場合等では、 ラク トパー ォキシダーゼが少しずつ変性していく可能性があることから、 特に 0〜 2 5 °Cで 行われることが好ましい。 また、 未殺菌の乳原料を使用する場合は、 細菌の繁殖 を防ぐため、 0〜 1 o °cで実施することが望ましい。
乳原料と陽イオン交換体の吸着処理時間 （接触時間） については、 吸着処理時 の温度、 採用する吸着処理方式 （バッチ式またはカラム連続法） 等を勘案して適 宜条件を選択することができる。 例えば、 バッチ式の場合は、 乳原料と陽イオン 交換体の吸着処理時間は 1分以上 2 4時間以下が好ましく、 1 0分以上 6時間以 下がより好ましい。 また、 カラム連続法の場合は、 線流速 1 0 c mZ h以上 1 0 0 0 c mZ h以下であることが好ましい。
( 2 ) 次に、 吸着処理後の陽イオン交換体を洗浄処理する。 このときの洗浄液と しては、 イオン強度が 0 . 0 7未満と低い塩類水溶液、 又は中性若しくは弱酸性 領域の緩衝液を用いることも可能であるが、 製造コス トの面から考慮すると水で 洗浄することが好ましい。
吸着処理後の陽イオン交換体については、 使用された乳原料をどのような方法で 洗浄除去してもよい。 たとえば乳原料と陽ィオン交換体が入つた容器から陽ィォ ン交換体のみを移動して他の場所で洗浄しても良いし、 前記容器から乳原料を移 動させてその後陽イオン交換体を容器中で洗浄しても良い。
( 3 ) 次いで、 洗浄処理を終えた陽イオン交換体に溶出溶媒を接触させる。 これ により、 陽イオン交換体から該溶出溶媒中にラク トパーォキシダーゼを溶出させ て溶出液を得る。
この工程で使用する溶出溶媒は、 イオン強度が 0 . 0 7以上 0 . 3以下の範囲 のものが好ましく、 0 . 1 0以上 0 . 2 5以下の範囲のものがより好ましく、 0 . 1 5以上 0 . 2 2以下の範囲のものがさらに好ましい。 イオン強度が上記範囲の 溶出溶媒を用いることにより、 陽イオン交換体からラク トパーォキシダーゼを効 率良く溶出させることができる。
該溶出溶媒としては、 イオン強度を上記の範囲に調整した中性又は弱酸性領域 の緩衝液を用いることもできる。 しかしながら、 製造コストの面から考慮すると 塩類のみを溶解した水溶液 （塩類溶液） を用いることがより好ましい。 本願で使 用できる塩類は必要に応じて一種あるいは二種以上の組合せを任意で選択可能で あ 。
好ましい塩類溶液は、 塩化ナトリゥム、 塩化力リゥム、 塩化カルシウム、 およ び塩化マグネシゥム等からなる群から選ばれる 1種又は 2種以上の混合物からな る塩類の水溶液である。
( 4 ) 次に、 得られた溶出液に対して、 限外濾過膜を用いた膜分離法によって膜 処理を行う。 これによつて溶出液を濃縮し、 該溶出液中に沈澱を生成させる。 限外濾過膜の運転方法は、 水および分画分子量以下の分子量を有する成分を透 過させて除去する通常の限外濾過法と、 膜を透過した透過液と等量の水を、 膜上 の保持液に添加しながら連続運転する流水濾過法 （ダイァフィルトレーシヨン） の 2つに区分されるが、 本発明においてはいずれの方法も使用できる。 特に、 後 者の流水濾過法は、 濃縮と同時に脱塩処理を行うことができるとともに、 保持液 からの低分子量成分を高度に除去できる点でより好ましい。
なお、 前者の通常の限外濾過法を用いた場合には、 限外濾過の後に、 透析ゃゲ ル濾過等の方法で脱塩処理を行うことが好ましい。
限外濾過膜は、 一般に市販されている限外濾過膜であれば何れも使用できる。 具体例としては、 I R I S 3 0 3 8膜および I R I S 3 0 7 2膜 （いずれもロー ヌ .プーラン社製） 、 あるいは GR— 61 p p膜 （DDS社製） などが挙げられ る。
限外濾過膜の材質は有機材料製又は無機材料製の何れであっても使用可能であ り、 コスト面、 汎用性等を考慮して選択すればよい。
限外濾過処理時の溶出液の温度は、 使用する膜の耐熱温度以下であれば （例え ば GR—61 p p膜なら 80°C以下） 実施可能である。 ただし 60°C以上ではラ ク トパーォキシダーゼが熱変性する可能性があり、 また 1 0〜 60°Cの範囲では 微生物の繁殖が著しいことから、 0〜10°Cの範囲で行うことが好ましい。 限外濾過時の圧力は、 使用する膜の耐圧限界以下であれば （例えば GR— 6 1 p p膜なら 0. 6MP a以下） いずれの圧力でも可能である。 尚、 耐圧限界値付 近での使用は膜の寿命を縮める可能性があるため、 耐圧限界の 2ノ 3以下 （例え ば GR— 6 1 p p膜なら 0. 4 MP a以下） で行うことが好ましい。
使用する限外濾過膜モジュールは、 管型、 中空糸型、 平膜型、 スパイラル型な どいずれの形式でも可能である。 ただし、 中空糸型内圧式等のモジュールでは、 中空糸内に沈澱物が生成した場合に流路閉塞を起こす可能性があるので、 圧力等 を考慮して行うことが好ましい。
前段の （3) 工程において得られる溶出液は、 茶色の清澄な溶液であることが 好ましい。 そして、 この溶出液に対して限外濾過膜による濃縮を行うと、 蛋白質 の溶解性の違いから、 限外濾過膜上の保持液中において、 ラク トバーオキシダ一 ゼ以外の蛋白質が沈澱を形成する。 ここで、 ラク トパーォキシダーゼ以外の蛋白 質、 すなわち、 不純物としての蛋白質を効率良く沈澱させるためには、 濃縮後の 溶出液中における蛋白質含有量が 0. 9 %以上となるように濃縮することが好ま しい。 尚、 溶出液中における蛋白質含有量が 1 5%を越えると溶出液の粘性が上 昇し、 限外濾過膜処理の効率が低下する恐れがあることから、 濃縮後の溶出液の 蛋白質含有量は 0. 9〜 1 5%の範囲内であることがより好ましく、 1. 5〜1 2 %であることがさらに好ましく、 3〜 10 %であることが最も好ましい。
沈殿を生成させるまでの各工程の条件等を整えることにより、 沈殿中に混入す るラク トパーォキシダーゼの量を低減させることができ、 ラク トバーオキシダ一 ゼを全く含まない沈殿を生成させることも可能である。 ( 5 ) 次に、 沈澱が生成した溶出液 （保持液） から沈澱を除去する。 これにより 溶出液から不純物としての蛋白質を除去して、 高純度のラク トパーォキシダーゼ を含有する溶液 （ラク トパーォキシダーゼ溶液） を得る。
沈澱の除去方法は任意で選択できる。 沈澱が生成した溶出液 （保持液） を静置 して沈澱物を回収する方法でもよく、 あるいは遠心分離や、 精密濾過 （マイクロ フィルトレーシヨン） 等による清澄化処理を行うことによって、 沈澱物が除去さ れた清澄化処理液 （ラク トパーォキシダーゼ溶液） を回収する方法でもよい。 この工程で得られたラタ トパーォキシダーゼ溶液は、 必要に応じて殺菌処理を 行うことが好ましい。 その際、 ラク トパーォキシダーゼの熱安定性を高めるとい う観点から、 塩化カルシウムなどのカルシウムイオンを 2 O mM程度の濃度にな るように添加し、 7 2でで、 1 5〜 9 0秒程度の時間、 加熱殺菌することにより 殺菌処理を行うことが好ましい。
( 6 ) この後、 得られたラク トパーォキシダーゼ溶液の溶媒を除去することによ り固体状のラク トパーォキシダーゼを得ることができる。
溶媒を除去する方法は、 特に限定されず必要に応じて選択できる。 例えば限外 濾過膜を用いてさらに濃縮した後、 常法により凍結乾燥して水分を除去する方法 を好適に用いることができる。 これにより高純度のラク トパーォキシダーゼ粉末 を製造することができる。
このようにして得られる固体状のラク トパーォキシダーゼは、 純度 8 0 %以上 の高純度を達成することができる。
なお、 （6 ) 溶媒を除去する工程は必須ではなく、 高純度ラク トパーォキシダ ーゼとして、 （5 ) 工程で得られたラク トパーォキシダーゼ溶液を溶液の状態で 用いることもできる。
実施例
次に試験例を示して本発明を詳細に説明する。 ただし、 本発明は以下の各実施 例に限定されるものではない。 例えば本願においてはこれら実施例の構成要素お よび実施例に含まれない構成要素同士を適宜組み合わせてもよい。 また特に断り のない限り上記蛋白質含有量および純度以外において、 ％は質量％を表す。
[試験例 1 ] 本試験では、 工程 （1) 〜 （3) に続く、 弱酸性陽イオン交換体から回収した 溶出液を限外濾過膜で濃縮し、 沈澱を生成させる （4) 工程において、 濃縮液中 で沈澱を生成するのに好ましい条件を検討するために行った。
(1) 試料
弱酸性陽イオン交換体として、 カルボキシメチル基を有し、 ラク トフエリン吸 着能が 91 mg/1 Om lである CM—セフアデックス C— 50 (アマシャム社 製） を用いた。
該弱酸性陽イオン交換体 1 70m lを充填したカラムに、 脱脂乳 20リッ トル を添加することにより、 交換体に蛋白質を吸着させた。 次いで、 カラム内の弱酸 性陽イオン交換体を水洗した後、 カラム内に溶出溶媒として 1. 6%食塩水 （ィ オン強度 0. 27) 20 Om lを添加することにより、 弱酸性陽イオン交換体に 吸着された蛋白質を該食塩水中に溶出させた。 回収した約 200m lの溶出液を 試験試料とした。 尚、 得られた試験試料中の蛋白質含有量をケルダール法によつ て測定したところ、 0. 26%であった。
(2) 試験方法
3種の遠心分離式限外濾過フィルターユニット （分画分子量： 1万ダルトン、 3万ダルトン、 及び 5万ダルトン。 いずれもミリポア社製） を用意した。
それぞれのフィルターユニットに試験試料 0. 5m lを添加し、 毎分 6, 00 0回転で遠心分離して限外濾過を行い、 沈澱生成の有無を観察した。 その際、 遠 心分離の時間をコントロールすることによって、 フィルターユニット内の保持液 の体積を段階的に変化させた。
(3) 試験結果
本試験の結果、 分画分子量が異なる 3種のフィルターュニットのいずれにおい ても、フィルターュニット内の保持液の体積が 0. 1 5m lに濃縮された場合に、 フィルターの上に白色の沈澱が観察された。 保持液の体積が 0. 1 5m l以下の 場合にも沈澱の生成が観察されたが、 0. 1 5 m 1以上では沈澱の生成は全く観 察されなかった。
また、 保持液の体積が 0. 1 5m 1に濃縮されたときの、 該保持液中における 全蛋白質含有量は 0. 9%であった。 このことから、 濃縮後の保持液の全蛋白質含有量が 0. 9%以上となるように 濃縮すると、 保持液中に沈澱が生成されることが認められた。
[試験例 2]
本試験は、 限外濾過膜を用いた濃縮によって生成された沈澱の溶解性に及ぼす 脱塩処理の影響を検討するために行った。
(1) 試料
本試験の試料は、 試験例 1と同様の試験試料 （1. 6%食塩水に蛋白質を溶出 させた溶出液、 蛋白質含有量： 0. 26%) を使用した。
(2) 試験方法
分画分子量 3万ダルトンの限外濾過膜を装着した攪拌式セルュニット （ミリポ ァ社製）を 3つ用意し、それぞれのセルュニットに試験試料 50 m 1を添加した。 窒素ガスを用いて、 セルユニット内が約 0. 3 MP aとなるように加圧し、 セル ュニット内の該保持液が 10m lになるまで濃縮した。
一つ目のセルは、 保持液が 1 Om 1になったところで、 セルユニット内の保持 液全量を遠心チューブに移し、 毎分 10， 000回転で遠心分離することによつ て固液分離し、 沈澱 （沈澱試料 1) を回収した。
二つ目のセルは、 保持液が 1 Om 1になったところで、 セルユニット内の保持 液全量を遠心チューブに移し、 毎分 10, 000回転で遠心分離することによつ て固液分離し、 沈澱を回収した。 この沈澱に 1 Om 1の精製水を添加し、 ボルテ ックスミキサーで 1分間撹拌した。 こうして得られた沈澱懸濁液を遠心チューブ に移し、 さらに毎分 10, 000回転で遠心分離することによって固液分離し、 沈澱 （沈澱試料 2) を回収した。
三つ目のセルは、 保持液が 1 Om lになるまで濃縮されたセルュニット内に、 精製水 4 Om 1を添加し、 前回と同様に加圧しながら、 再び保持液が 10m lに なるまで濃縮した。 保持液が 1 Om 1になったところで、 このセルユニット中の 保持液全量を遠心チューブに移し、 毎分 10， 000回転で遠心分離することに よって固液分離し、 沈澱 （沈澱試料 3) を回収した。
沈澱試料 1〜 3の乾燥重量を常法により測定した。
(3) 試験結果 本試験の結果、 いずれのセルにおいても、 セルュニット内の保持液が 1 Om l になった状態で保持液中には沈澱が形成されていた。
また、沈澱試料 1、沈澱試料 2、および沈澱試料 3の質量に殆ど差は無かつた。 したがって、 濃縮工程によりー且生成された沈澱に精製水を添加しても、 沈澱は 再溶解しないことが確認された。
また、 溶出液中で一旦生成された沈澱は、 脱塩処理により塩濃度が変化しても その影響を受けず、 沈澱は再溶解しないことが認められた。
次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、 本発明は以下の実施例に 限定されるものではない。
(実施例 1 )
弱酸性陽イオン交換体として、 カルボキシメチル基を有し、 ラクトフエリン吸 着能が 91 mg/ 1 Om lである CM—セフアデックス C _ 50 (アマシャム社 製） を用意した。
この陽イオン交換体 1 7リツトルを内径 50 c mのカラムに充填し、 該カラム に 1. 5%食塩水 40リットルを通液した後、 水洗してカラム内の陽イオン交換 体をナトリゥム形に調製した。
乳原料としてゥシ由来の脱脂乳 （pH6. 7、 後述の試料 1) を用意した。 こ の脱脂乳 2000リツトルを温度 4°C、 流速 60リツトル _ hの条件で上記カラ ムに通液して吸着処理を行つた。
吸着処理後のカラムに水を通液して、 陽イオン交換体に非特異的に吸着した乳 成分を洗浄処理した。
次いで、 溶出溶媒として 1. 6%食塩水 （イオン強度 0. 27) 20リ ッ トル を 30リツトル/ hの流速で通液し、 陽イオン交換体に吸着した蛋白質の溶出処 理を行った。 これにより、 ゥシラクトパーォキシダーゼを含む溶出液 （後述の試 料 2) 2 1リッ トルを回収した。
次に、 溶出液 21 リットルを分画分子量 2万の限外濾過膜 （DDS社製） ュニ ットを用いて平均圧力 0. 3 MP aで限外濾過し、 保持液量が 2リットルになる まで濃縮を行った。
この後、水を添加しながらさらに限外濾過することにより保持液を脱塩処理し、 最終的に 2リットルの保持液を回収した。 保持液中には白色の沈澱が生成してい た。
次いで、 白色の沈澱を含む保持液を静置して清澄化し、 上清画分 （後述の試料 3 ) 1 . 9 5 リッ トルをゥシラク トバーオキシダ一ゼ溶液として回収した。
回収した上清画分 （ゥシラタ トパ一ォキシダーゼ溶液） に対して、 ポアサイズ 1 . 4 の精密濾過膜を用いたマイクロフィルトレーシヨンを行って、 さらに 微量の沈澱物を除去し、ゥシラタトパーォキシダーゼを含む精製標品を製造した。 さらに、 得られた精製標品を凍結乾燥し、 ゥシラタ トパーォキシダーゼを含む 粉末状の凍結乾燥標品 （後述の試料 4 ) 2 6 gを製造した。
製造工程中に得られた前記試料 1〜4、 すなわち脱脂乳 （乳原料） ：試料 1、 陽イオン交換体からの溶出液：試料 2、 限外濾過膜処理後の保持液の上清画分： 試料 3、 凍結乾燥標品：試料 4について、 それぞれ蛋白質含有量及びゥシラク ト パーォキシダーゼ活性を測定し、 比活性を求めた。 ここで、 蛋白質含有量はケル ダール法により測定し、 ゥシラク トパーォキシダーゼ活性はピュッターらの方法 レくーグマイヤー （Bergmeyer) 編、 メソッズ ·ォブ'ェンザイマチック 'アナリ シス （Methods of Enzymatic Analysis) 第 3版、 第 3卷、 1 9 8 3年、 p . 2 8 6〜 2 9 3〕 で測定し、 蛋白質 l m g当たりのパーォキシダーゼ活性 （比活性） を求めた。 その結果を表 1に示す。
試料 蛋白質含有量 (％) 比活性 (unit/mg) 試料 1 3.30 0.2 試料 2 0.26 132.5 s¾^ 3 1.64 220.3 試料 4 92.30 224.4
表 1に示すように、 試料 1の蛋白質含有量は 3. 30 %であり、 比活性は 0. 20 u n i tZmgであった。 また、 試料 2の蛋白質含有量は 0. 26%、 比活 性は 1 3 2. 5 u n i tZmgであった。 これらの結果より、 脱脂乳 （乳原料） 中の蛋白質のうち、 ゥシラク トパーォキシダーゼが選択的に溶出液中に溶出され たことがわかる。
また、 試料 3の蛋白質含有量は 1. 64 %、 比活性は 220. 3 u n i t /m gであり、 試料 4の比活性は 2 24. 4 u n i t /m gであった。
試料 2と試料 3, 4の結果を比較すると、溶出液を限外濾過膜を用いて濃縮し、 生成した沈澱物を除去することによって、 ゥシラタ トパ一ォキシダーゼの比活性 が格段に高まっている。 このことから、 かかる沈澱物の除去によりゥシラク トパ 一ォキシダーゼ以外の不純物としての蛋白質が効果的に除去され、 ゥシラタトパ 一ォキシダーゼの精製効率が向上していることがわかる。
また、 前記試料 4 (凍結乾燥標品） について、 ラク トパーォキシダーゼの純度 を高速液体クロマトグラフィーにて分析した。
この分析には、 Shodex Asahipak C4P - 50カラム、 および測定波長 280 nmの 紫外部吸収検出器を装備した H P LC装置を用いた。 移動相は、 流速 0. 8m l /m i nであり、 A液 （トリフルォロ酢酸 0. 0 3%を含む、 ァセトニトリノレ： 0. 5M塩化ナトリウム = 1 0 ： 90の混合液） および B液 （トリフノレオ口酢酸 0. 03%を含む、 ァセトニトリノレ： 0. 5M塩化ナトリウム = 50 ： 5 0の混 合液） について、 3 0分間で A： B = 5 0 ： 5 0→A： B = 0 ： 1 0 0の濃度変 ィ匕とする直線濃度勾配法により溶出を行った。試料は約 2 O m g秤量し、 2 . 9 % 塩化ナトリゥム水溶液 1 O m lに溶解して、 その 2 5 μ 1を前記分析方法にて試 験した。
ここで、 予め標準品として精製ゥシラク トパーォキシダーゼ （シグマ社製） を 使用し、 前記分析方法で標準品のピークが溶出時間約 1 8分であることを確認し た。
続いて、 前記分析方法で試料 4を分析し、 ゥシラタトパーォキシダーゼ純度を ピーク面積の自動積分法により測定した。
その結果、 試料 4のゥシラタ トパーォキシダーゼ純度は 8 9 %であることが確 認された。 したがって、 本発明の方法により、 乳原料から高純度にラク トバーオ キシダーゼを製造できることが確認された。
産業上の利用の可能性
本発明は、 従来より簡単な工程で、 より短時間に、 より低コストで、 純度の高 いラク トパーォキシダーゼを製造することができ、 また工業的規模での製造にも 適用することができるラク トパーォキシダーゼの製造方法を提供する。

Claims

請求の範囲
1. (1) イオン交換基として弱酸性基を有する陽イオン交換体に乳原料を接 触させて吸着処理する工程、 （2) 前記吸着処理の後の陽イオン交換体を洗浄処 理する工程、 （3) 前記洗浄処理された陽イオン交換体にラク トバーオキシダ一 ゼを溶出させる溶出溶媒を接触させ、 該溶出溶媒中にラタ トパーォキシダーゼが 溶出された溶出液を得る工程、 （4) 前記溶出液を限外濾過膜で濃縮することに より、 濃縮された溶出液中に沈澱を生成させる工程、 および （5) 前記濃縮され た溶出液から沈澱を除去してラク トパーォキシダーゼ溶液を得る工程、 とを有す るラク トパーォキシダーゼの製造方法。
2. 前記陽イオン交換体におけるラク トフエリン吸着能が 85mgZl Om 1 以上である、 請求項 1に記載のラク トパーォキシダーゼの製造方法。
3. 前記イオン交換基がカルボキシメチル基である、 請求項 1または 2に記載 のラタ トパーォキシダーゼの製造方法。
4. 前記 （4) 工程において、 前記濃縮された溶出液中の蛋白質含有量が 0. 9〜1 5%となるように濃縮して沈澱を生成させる、 請求項 1〜3のいずれか一 項に記載のラタ トパーォキシダーゼの製造方法。
5. 前記（3) 工程で用いる溶出溶媒のイオン強度が 0. 07〜0. 3である、 請求項 1〜4のいずれか一項に記載のラタ トパーォキシダーゼの製造方法。
6. 前記 （3) 工程で用いる溶出溶媒が、 塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 塩 化カルシウム、 および塩化マグネシゥムからなる塩類群から選ばれる少なくとも 一種を含む水溶液である、請求項 5に記載のラク トパーォキシダーゼの製造方法。
7. さらに、 前記 （5) 工程で得られるラク トパーォキシダーゼ溶液の溶媒を 除去することにより固体状のラタ トパーォキシダーゼを得る工程を有する、 請求 項 1〜6のいずれか一項に記載のラタ トパーォキシダーゼの製造方法。
8 . 固体状のラク トパーォキシダーゼの純度が 8 0 %以上である、 請求項 7に 記載のラクトパーォキシダーゼの製造方法。
PCT/JP2005/002356 2004-02-17 2005-02-08 ラクトパーオキシダーゼの製造方法 WO2005078078A1 (ja)

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