Be s ehr e ibung
Elektrochemisches Transducer-Array und dessen Verwendung
Die Erfindung bezieht sich auf ein elektrochemisches Transducer-Array und weiterhin auf spezifische Verwendungen eines solchen Transducer-Arrays.
Elektrochemische Transducer werden im Allgemeinen in die drei Gruppen potentiometrisch, konduktometrisch und amperometrisch unterteilt. Bei den potentiometrischen Transducern wird das Potenzial gegen eine Referenzelektrode gemessen. Auf dieser Basis funktionieren ionenselektive Sensoren. Dabei wird die Elektrode mit einer ionenselektiven Membran beschichtet. Das Potenzial der Elektrode ist dann ein Maß für die Konzentration der entsprechenden Ionen. Mittels einer gaspermeablen Membran kann so auch ein potentiometrischer pC02-Sensor realisiert werden.
Bei den amperometrischen Transducern hingegen wird eine Spannungsdifferenz zwischen zwei Elektroden erzeugt, bei der die zu detektierende Substanz umgesetzt wird. Die bei der Reduktion oder Oxidation fließenden Ströme ergeben das Messsignal. Eine breite Anwendung finden sie als Sauerstoffsensoren oder biochemische Sensoren. Beim Clark-analogen Sauerstoffsensor wird eine gaspermeable Membran auf den. amperometrischen Sensor gebracht. Bei den biochemischen Sensoren werden molekulare ErkennungsSysteme, z. B. Haptene, Antigene oder Antikörper, auf oder in der Nähe der Elektroden platzieren. Das Zielmolekül bindet daran und wird entweder direkt oder über Zwischenschritte mit einem Enzymlabel versehen. Wird nun das entsprechende Enzymsubstrat zugegeben, setzt das Enzym eine Substanz frei, die detektiert werden kann. Dies geschieht entweder optisch oder elektrochemisch. Es handelt sich hier um den so genannten ELISA-Test (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) . Auf ähnlichem Weg lassen sich auch DNA-Analyseverfahren durchführen.
Die für die elektrochemische Detektion verwendeten Transducer müssen Elektroden beinhalten, die elektrisch einzeln kontaktiert sind. Im Anwendungsfall des potentiometrischen Transdu- cers muss das sich einstellende Gleichgewichtspotenzial gegen eine Referenzelektrode messbar sein. Bei amperometrischen und konduktometrisehen Transducern müssen die Elektroden potenti- ostatierbar sein und der Stromfluss über die Elektroden muss einzeln erfasst werden können.
Ein Beispiel für planare ionenselektive Sensoren ist in E. Jacobs et al, "Analytical Evaluation of i-STAT Portable Clinical Analyzer and Use by Nonlaboratory Health-Care Professionals", Clinical Chemistry, 39, 1069 ff. (1993) be— schrieben. Es handelt sich hier um ein Siliziumsubstrat mit Dünnfilm-Elektroden und ionenselektiven Membranen. Sensorelektroden und Kontakte liegen dabei auf derselben Seite des Silizium-Substrats. Um daher die Kontaktflächen und die Durchflusszelle für den Analyten zu trennen, muss das Sub- strat deutlich größer sein als die eigentlich von den Sensoren benötigte Fläche.
Ebenfalls in Silizium-Technologie sind verschiedene Biochips gefertigt und in R. Thewes et al, "Sensor Arrays for Fully Electronic DNA Detection on CMOS", ISSCC Digest of Tech. Pa- pers, 2002, 350 ff., beschrieben. Vorteilhaft ist hier die Integration von CMOS-Schaltungstechnik, SignalVerarbeitung (Multiplexing) und Analog-Digital-Wandlung in die Sensorplattform selbst. So kann eine hohe Anzahl von Sensoren auf kleinster Fläche realisiert werden. Nachteilig wirken sich die Kosten für die Herstellung eines solchen Chips und die aufwändige Handhabung (Kontaktierung) aus . Für die so genannten low-density Arrays mit weniger als 100 Sensoren pro Quadratzentimeter sind daher die Kosten pro Einzelsensor hoch.
Eine Alternative bietet theoretisch die Verwendung von Polymerträgern mit aufgebrachten Elektroden. Diese können aufge-
dampft oder aufgedruckt sein. Mit dieser Methode lassen sich preisgünstig einzelne Sensoren, z. B. Glucose-Sensoren realisieren [WO2002/02796-A2] . Für Arrays ist sie jedoch weniger geeignet, da die Leiterbahnstrukturen grob sind und daher die Zahl der elektrischen Kontakte stark eingeschränkt ist.
Im vorbekannten eSensor™ von der Fa. Motorola wird zur Realisierung eines λlow-density"-DNA-Detektions-Systems Leiterplattentechnik verwendet . Dabei werden auf der Metallisie- rungsebene sowohl die Sensorflächen als auch die Leiterbahnen und Kontakte ausgeführt . Das Produkt ist eine starre Leiterplatte mit Sensoren und Kontakten auf der gleichen Seite. Rückseitige Kontakte sind mit einer Durchkontaktierung zu realisieren. Diese Technik ist bei großtechnischen Fertigungen aber nur teuer umzusetzen.
Weiterhin sind beispielsweise aus der EP 0 504 196 Bl sowie der DE 197 17 809 Ul so genannte Mikroelektroden-Arrays bekannt, bei denen die Sensorkavitäten eine möglichst geringe Fläche haben. Aus der DE 199 16 921 AI ist ein Verfahren zur Herstellung von paarweise angeordneten Arrays aus Mikroelek- troden bekannt, bei denen der Träger entweder Siliciu oder Kunststoff ist. Dabei sollen die einzelnen Elektroden separat ansteuerbar sein. Als Anwendung wird speziell die DNA-Analyse genannt.
Schließlich ist aus der WO 2004/001404 AI ein Array von Mik- roelektroden bekannt, bei dem die Struktur variiert werden kann. Träger des Arrays sind hier Glas und/oder Captanfolien, wobei eine einzige Bezugselektrode benutzt wird. Schließlich ist aus der DE 199 29 264 AI ein Universaltransducer für Che- mo- und Biosensoren bekannt, bei dem ein mehrlagiges System mit isolierenden Schichten und Elektrodenschichten, die als Arbeits-, Bezugs- und Gegenelektroden genutzt werden, vorhan- den sind.
Bei der Vielzahl der bekannten Transducer-Aarrays wird also insbesondere Wert auf spezifische Mikroelektroden gelegt, wobei die Kontaktierung immer von oben erfolgt .
Ausgehend von dem gesamten umfassend abgehandelten Stand der Technik ist es Aufgabe der Erfindung, ein geeignetes Transdu- cer-Array zu schaffen, das einfach zu handhaben und preiswert in der Herstellung ist. Daneben sollen vorteilhafte Verwendungen des Transducer-Arrays vorgeschlagen werden.
Die Aufgabe ist erfindungsgemäß durch die Merkmale des Patentanspruches 1 gelöst. Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Bevorzugte Verwendungen des erfindungsgemäßen Transducer-Arrays sind Gegenstand der Ansprüche 26 und 27.
Beim erfindungsgemäßen Transducer-Array ist wenigstens ein flexibles, planares Metallsubstrat vorhanden, auf dem mindestens ein flexibler Isolator mit fester Verbindung von Metall- Oberfläche und Isolatoroberfläche angeordnet ist. Dabei sind sowohl das freitragende Metallsubstrat als auch der Isolator derart strukturiert, dass elektrisch gegeneinander isolierte Metallflächen, die Sensorflächen realisieren, gebildet werden, wobei die strukturierten Metallbereiche des freitragen- den Metaus bstrates von der der Sensorfläche abgewandten bzw. von der dem Sensor gegenüberliegenden Seite e kontak- tierbar sind. Dadurch ergibt sich eine einfache Messmöglichkeit mittels Nadelkontakte, insbesondere bei der dezentralen Messung mittels Chipkarten.
Besonders vorteilhaft ist bei der Erfindung die gute Handhabbarkeit des Produktes. Es handelt sich um einen Werkstoffverbund, der nur 100 μm bis 200 μm dick ist und eine beliebige Fläche einnehmen kann. Dadurch ist das Sensorarray hoch fle- xibel und kann bei entsprechender Geometrie auf Rollen geführt werden. Der Verbund besteht im einfachsten Fall aus einer Metall- und einer Isolatorschicht. Die Vorderseite des
Metallsubstrats ist von dem Isolator bedeckt, wobei nur kleinere Metallflächen frei bleiben, welche die Sensoren darstellen. In der Regel ist es erforderlich, dass die Sensoren im wässrigen Elektrolyten beständig sind und auch eine katalyti- sehe Aktivität für die Umsetzung der zu detektierenden chemischen Substanz haben. Um dies zu erreichen, können sie mit Edelmetallen wie Platin, Gold oder Silber beschichtet sein. Einige Flächen können je nach den Erfordernissen der Schaltungstechnik als Referenzelektroden oder Gegenelektroden aus- geführt werden. Insbesondere kann eine mit Silber beschichte-, te und chlorierte Sensorfläche als Referenzelektrode dienen.
Vorteilhafterweise wird die Metallschicht kann beidseitig genutzt . Die Sensoren liegen wie beschrieben auf der Vordersei- te. Die Rückseite dient der Kontaktierung der Sensoren. Dabei ist die Metallschicht so strukturiert, dass jeder Sensor e- lektrisch von den anderen isoliert ist. Die dadurch entstehende rückseitige Metallfläche, die vorderseitig einem einzelnen Sensor entspricht, ist deutlich größer als die Sensor- fläche. Daher kann die Kontaktierung an einer Stelle erfolgen, die nicht direkt unterhalb einer Sensorfläche liegt und von dem Isolator verstärkt ist. Da das Metallsubstrat selbsttragend ist, kann die Rückseitenkontaktierung aber auch unmittelbar unterhalb der Sensorfläche erfolgen, um somit eine besonders platzsparende Ausführungsform zu ermöglichen. Ein vorgeschlagener Weg zur Kontaktierung ist der Einsatz von Nadelkarten, die auch in den Anwendungsbeispielen zum Einsatz kame .
Bei einem sehr großen bandförmigen Sensorarray ist es möglich die Sensoren nicht alle gleichzeitig zu kontaktieren, sondern in Form eines Magazins durch die Messvorrichtung zu schieben. Die Nadeln würden automatisch die aktuellen Sensorflächen kontaktieren und das Teilarray eines "Endlosarrays" stünde für die Messungen bereit. Dieses Vorgehen ist insbesondere für die Anwendung bei automatisierter Überwachung von Prozessen wichtig.
Eine wichtige Rolle in der Analytik (z. B. HTS : High Through- put Screening) spielen Titerplatten. Diese enthalten 96 (8*12), 384 (16*24) bzw. 1536 (32*48) Plastikreaktionstöpf- chen in den Rastermaßen 9 mm, 4,5 mm bzw. 2,25 mm. Teilweise können in solchen Titerplatten optische Detektionsvorgänge direkt durchgeführt werden. Dazu besitzen die Titerplatten z. B. planare, optisch transparente Böden. Die erfindungsgemäßen Transducer-Arrays können hier vorteilhaft zur elektro- chemischen Detektion eingesetzt werden. Dazu werden diese an die äußeren Abmessungen der Titerplatten bzw. an das Raster der Reaktionstöpfchen angepasst. Sie bilden den Boden der Titerplatten, so dass jedem Reaktionstöpfchen mindestens eine Elektrode zugeordnet ist. Aufgrund der rückseitigen Kontak— tierungsmoglichkeit der erfindungsgemäßen Transducer-Arrays können alle Elektroden der Titerplatte gleichzeitig kontaktiert und somit ausgelesen werden.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Transducer-Arrays vor allem gegenüber der Silizium-Chip-Technologie besteht in der Struktur der. Arrayoberflache . Sie ist nicht eben. Statt-,•_.. dessen befindet sich jeder Sensor in einer Vertiefung, die durch die Dicke des verwendeten Isolators vorgegeben wird. Diese Kavitäten sind besonders geeignet, um Beschichtungen aufzunehmen. Sie können die erwähnten Fänger für die DNA- Analyse enthalten, Antikörper oder selektive Membranen.
In einer speziellen Anwendungsform kann die Kavität sogar ein abgeschlossenes elektrochemisches System darstellen. Dazu wird mindestens eine zweite Elektrode pro Kavität benötigt. Diese kann entweder durch Teilung der Sensorfläche gebildet werden oder durch die Einführung einer weiteren Elektrode, die als Deckel über die Kavität gelegt wird. Wobei dieser Deckel kein fester Bestandteil des Sensorarrays ist, da zu- nächst der Analyt in die Kavität eingebracht werden muss. Er kann z. B. ebenfalls als Band mit dem Sensorarray zusammengeführt werden. Der Vorteil einer solchen geschlossenen Anord-
nung liegt darin, dass die zu detektierende Substanz in der Kavität eingeschlossen ist. Sie kann weder wegdiffundieren und damit das Signal schwächen, noch an einen anderen Sensor gelangen und dort eine falsches Signal auslösen.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbei- spielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen.
Es zeigen jeweils in schematischer Vereinfachung
Figur 1 und Figur 2 die Vorderseite und die Rückseite eines Transducer-Arrays, Figur 3 eine Schnittdarstellung eines Transducer-Arrays gemäß Figur 1/2, Figur 4 ein zweidimensionales Array in der Draufsicht, Figur 5 eine Schnittdarstellung als Teilausschnitt des Transducer-Arrays gemäß Figur 4 mit zugehöriger Kontaktierung,
Figuren 6 bis 14 -Schnittdarstellungen verschiedener Varianten eines Transducer-Arrays gemäß Figur 1/2, Figur 15 eine Messvorrichtung unter Verwendung eines Transducer-Arrays aus Figur 3 bis 14, Figur 16 Ergebnisse der Anwendung eines Transducer-Arrays als ionenselektiver Sensor und Figur 17 Ergebnisse der Anwendung eines Transducer-Arrays entsprechend einer der Figuren 1 bis 14 als DNA- Sensor.
Die Figuren 1 und 2 zeigen die Vorder- und Rückseite eines Sensorarrays bestehend aus einem Metallsubstrat 1 und einer Isolatorschicht 2. Auf der Vorderseite sind beispielsweise kreisförmige Vertiefungen 3ι, die als Kavitaten bezeichnet werden, dargestellt. Die Kavitaten 3± entstehen durch die
Strukturierung des Isolators 2. Auf dem Grund der Vertiefungen 3i liegt die Oberfläche des Metallsubstrats frei.
Die Darstellung der Rückseite zeigt durch Striche die Auftrennung des Metallsubstrats 1 in voneinander isolierte Teile lOi. Jede Metallinsel 10ι korrespondiert mit der Kavität 3χ einer Isolatoraussparung auf der Vorderseite. Auf der Rückseite sind durch Punkte die möglichen Kontaktstellen für eine sog. Nadelkarte zur selektiven elektrischen Kontaktierung der Metallflächen angedeutet.
Figur 3 zeigt ein Sensorarray in Seitenansicht und im Schnitt durch eine Reihe von Elektroden bzw. Sensoren. Die Trennlinien im Metallsubstrat 1 sind als singuläre Messelektroden 10ι mit Messfläche 12x und gegenüberliegender Seite als Kon- taktierungsfläche lli verdeutlicht . Darüber befindet sich der Isolator 2 aus einzelnen Elementen 20if welche die freitragenden Metallflächen zusammenhält und gegeneinander isoliert.
Figur 4 zeigt die Draufsicht auf ein zweidimensionales mxn- Sensorarray, bei dem die Kavitaten 3± mit den Messflächen 12± eng beieinander liegen. Angedeutet sind im Array die benach- barten Kavitaten 3χ und 3i+l mit Messflächei, wobei das Array auf der der Sensorfläche 12j. abgewandten bzw. gegenüberliegenden Seite lli her kontaktierbar sein soll. Während in der Fläche des mxn-Arrays ein Sensor mit den anderen Sensoren un- mittelbar benachbart ist, bleibt an der äußeren Sensorreihe ein seitlicher Metallbereich an der Rückseite zur Kontaktierung frei .
Figur 5 zeigt einen Ausschnitt des Sensorarrays gemäß Figur 4 mit von der Unterseite des Metallsubstrats 1 angesetzten
Elektroden zwecks MessSignalabnahme. Auf die Messtechnik mit der zugehörigen Messvorrichtung und der dabei vorteilhafterweise verwendeten Elektrodenanordnung wird weiter unten anhand Figur 10 im Einzelnen eingegangen.
Bei der ersten Sensorfläche ist ein Kontakt 4a unmittelbar gegenüber der Sensorfläche zentrisch an der beidseitig frei-
liegenden Metallfläche lli angesetzt. Bei der zweiten Sensorfläche können dagegen Kontaktierungen 4b gegenüber den Sensorflächen seitlich versetzt an der einseitig freiliegenden Metallfläche angesetzt werden, da hier hinreichend Platz ver- bleibt .
Figur 6 zeigt ein Sensorarray mit zwei Elektroden pro Kavität. Dazu wird das Metallsubstrat an dieser Stelle geteilt. Der entstandene Spalt wird durch eine zusätzliche Tsolator- schicht 40i von der Unterseite her verschlossen. Dabei bleiben Kontaktflächen frei, die Messelektroden definieren. Eingetragen sind abwechselnd eine Arbeitselektrode WE und eine Gegenelektrode CE.
Figur 7 zeigt, dass mehrere Kavitaten vom gleichen Elektrolyten benetzt werden. Dann kann die Metallfläche der einen gegen die Metallfläche einer anderen Kavität polarisiert werden.
Figur 8 zeigt, dass eine der offenen Metallflächen auf der
Vorderseite von .einer dünnen Silber/Silberchloridschicht be- ... deckt ist. Diese Schicht 40χ kann zusammen mit zwei weiteren benetzten Metallflächen in einer Dreielektrodenanordnung als Arbeitselektrode (WE) , Counterelektrode (CE) und Referenz- elektrode (Ref) mit einem Potentiostaten verbunden werden.
Figur 9 zeigt die Verwendung einer externen Referenzelektrode 15, die in den gemeinsamen Elektrolyten eintaucht, der auch mindestens zwei Metallflächen benetzt . Zusammen können sie in einer Drei-Elektrodenanordnung mit einem Potentiostaten verbunden werden.
Figur 10 zeigt eine externe Referenzelektrode, die in den gleichen Elektrolyten eintaucht, der auch mehrere Kavitaten mit jeweils zwei Elektroden benetzt. Die zwei Elektroden bilden zusammen mit der Referenzelektrode jeweils eine Dreielektrodenanordnung.
Figur 11 zeigt, dass die Elektrolyträume in jeder Kavität von den anderen Elektrolyträumen elektrisch isoliert sein können.
Figur 12 zeigt, dass ein elektrischer Leiter, der über den Kavitaten liegt als gemeinsame Gegenelektrode CE für alle Kavitaten verwendet werden kann. Jeweils zwischen der Metallfläche in der Kavität und der gemeinsamen Gegenelektrode wird eine Spannung angelegt .
Figur 13 zeigt, dass bei einem Sensorarray mit zwei Elektroden pro Kavität 3± und 3i eine der beiden Elektroden mit Silber/Silberchlorid (Ag/AgCl) beschichtet ist. Diese beschichtete Elektrode wird als Referenzelektrode zusammen mit der zweiten Elektrode in der Kavität als Arbeitselektrode und der bedeckenden Gegenelektrode in einer Dreielektrodenanordnung mit einem Potentiostaten verbunden.
Figur 14 zeigt, dass eine die Messanordnung bedeckende Elek- trode auf der Elektrolytseite mit Silber/Silberchlorid beschichtet ist . _ Das Sensorarray hat pro Kavität zwei Elektroden. Damit lässt sich mit diesen zwei Elektroden als Arbeitselektrode WE und Gegenelektrode CE und der Deckelektrode als Referenzelektrode eine Drei-Elektrodenanordnung realisieren.
Aus der Figur 15 ist die Messvorrichtung im Einzelnen ersichtlich. Dabei wird von der Methodik des "gepulsten" Redox- Cyclings gebraucht gemacht, das im Einzelnen in einer parallelen Anmeldung der Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität und der Bezeichnung "Verfahren zur Messung der Konzentration oder Konzentrationsänderung einer redoxaktiven Substanz und zugehörige Vorrichtung" beschrieben.
Außer durch ein Transducer-Array 100, das anhand der Figuren 3 bis 14 in verschiedenen Varianten beschrieben wurde, ist der Messaufbau im Wesentlichen durch einen geeigneten Potentiostaten 5 in Kombination mit einem Pulsgenerator 6 reali-
siert, der optional Rechteck-, Dreieck- oder Sinuspulse liefert. Durch zwei Operationsverstärker 7 bzw. 7Λ, von denen, von denen einer mit "Ground"-Potenzial verbunden ist und einem definierten Messwiderstand wird der Potentiostat 5 derart konzipiert, dass geeignete Potenziale bereitgestellt werden. Dabei können die Pulslänge, die Wiederholrate und die Höhe des Potenzials vorgegeben werden. Insbesondere die Pulslängen der Messphasen und die Relaxationsphasen können separat einstellbar und unterschiedlich lang sein. Auch die Potenziale können unterschiedlich groß sein.
Dem Transducer-Array 100 sind die einzelnen Elektroden zugeordnet, die bestimmungsgemäß eine Referenzelektrode RE (— re- ference electrode) , eine Gegenelektrode CE (= counter elec- trode) und wenigstens eine Messelektrode WE (= working electrode) realisieren. Diese Elektroden sind als Drei-Elektrodenanordnung mit dem Potentiostaten 5 verbunden. Das Signal des Potentiostaten 5 wird an eine in Figur 9 nicht im Einzelnen dargestellte Signalverarbeitungseinheit angeschlossen, mit welcher eine Auswertung unter Berücksichtigung obiger Ausführungen zur Messmethodik und Genauigkeit erfolgt. Im Allgemeinen ergibt sich Uout~ I als zur Auswertung des in Figur 15 dargestellten Signalverlaufes.
In spezifischer Weiterbildung wird ein Transducer-Array gemäß einem der vorstehend beschriebenen Beispiele als ionenselektiver Sensor verwendet : Für diese Beispielanwendung kommt ein Sensorarray bestehend aus einer Metall- und einer Isolatorschicht zum Einsatz. Der Durchmesser der Kavitaten beträgt 0,8 mm, die Tiefe 90 μm und der Abstand zwischen zwei benachbarten Elektroden 1 mm. Die Elektrodenoberflächen sind mit einer 2,3 μm dicken Goldschicht bedeckt. Insgesamt besteht das Array aus 4 Elektroden, wovon eine als Silberchlorid- Re erenzelektrode ausgeführt ist . Die anderen 3 Elektroden wurden mit einer ionenselektiven Membran beschichtet. Als Beispiel sei hier die Ammonium-selektive Membran angeführt .
Die Membranzusammensetzung entsprach der Empfehlung von Flu— ka: - 1.00 wt% Ammonium Ionophore I (Fluka 09877) - 33-00 wt% Poly(vinyl chlorid) high molecular weight (Fluka 81392) - 66.00 wt% Dibutyl sebacate (Fluka 84838)
Insgesamt 100 mg der Reagenzien wurden in 550 μl eines Ge- ischs aus Cyclohexan und THF im Verhältnis 8:2 gelöst. Von dieser Lösung wurden jeweils 35 nl, 45 nl und 60 nl in die drei Sensorkavitäten gespottet, so dass drei Membranen unterschiedlicher Dicke entstanden sind. Sie wurden mehrere Stunden an der Luft getrockne .
Das Sensorarray wurde in einen 100 μm tiefen Durchflusskanal eingesetzt und dann Lösungen verschiedener NH4N03-Konzentra- tionen darübergepumpt . Die Lösungen enthielten außerdem 100 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan/Salzsäure zur Pufferung bei pH8. Über einen hochohmigen Widerstandsmesser wurde dann die Potenzialdifferenz zwischen den membranbeschichteten
Elektroden und--der Bezugselektrode gemessen. Die folgende Abbildung zeigt die Potenzialänderung des Sensors als Funktion der NH4 +-Konzentration für die drei Membrandicken.
Die Figur 16 zeigt die Abhängigkeit des Potenzials von der
Säurekonzentration. Aufgetragen auf der Abszisse ist die Konzentration von NH4NO3 in mol/1 und auf der Ordinate das elektrochemische Potenzial φ gegenüber einer Ag/AgCl~Elek- ■ trode. Die Graphen 161 bis 164 zeigen Kennlinien für unter- schiedliche Membranen.
Die Steigungen der Ausgleichsgeraden betragen von der dünnsten zur dicksten Membran 54 mV, 52 mV und 48 mV. Diese Werte liegen etwas unterhalb des theoretischen Werts bei Raumtempe- ratur von 59 mV.
In anderer Weiterbildung wird ein Transducer-Array gemäß einem der anhand der Figuren 3 bis 14 angegebenen Beispiele als DNA-Sensor verwendet:
Das verwendete Sensorarray entspricht der in vorangehendem Beispiel bereits beschriebenen Anordnung, wobei vier Elektrodenflächen verwendet werden. Eine der Elektrodenflächen ist als Referenzelektrode Ref ausgeführt, eine andere wird als Gegenelektrode CE (Counter Electrode) verwendet und die zwei weiteren Elektrodenflächen dienen als Messelektroden bzw. sog. Arbeitselektrode WE (Working Electrodes) . Auf der einen Arbeitselektrode wird eine synthetische Oligonukleotidsequenz der Länge 25 mittels einer endständigen Thiolgruppe an der Goldoberfläche verankert. Die zweite Messelektrode bleibt frei.
Es wurden beide Oberflächen mit einer Lösung von 1 mg Rinderserumalbumin pro ml 15 Minuten inkubiert und anschließend das Sensorarray in einen 100 μm tiefen Durchflusskanal einge- setzt. Zunächst werden 10 μl einer 10 μM biotinilierten Zielsequenz innerhalb von ca. 5 Minuten über die Elektroden gepumpt. Dann wird nach einem Waschschritt eine Lösung von Streptavidin markierter alkalischer Phophatase darüber gegeben. Das Waschen erfolgt mit einer Pufferlösung von 100 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan titriert auf pH8 mit Salzsäure, 130 mM NaCl. Nach abermaligem Waschen wird eine 2 mM Lösung des Enzymsubstrats Paraaminophenylphosphat (pAPP) in der Pufferlösung über das Sensorarray gepumpt. Bei Anwesenheit des Enzyms alkalische Phosphatase wird das Enzymsubstrat pAPP zu Paraaminophenol (pAP) umgesetzt. Das pAP wird bei entsprechendem Potenzial an der Elektrode zu Chinoni in oxidiert . Dieser Vorgang lässt sich auch umkehren, wobei das Chinonimin zu pAP wieder reduziert wird. Es gilt:
![Figure imgf000015_0001](https://patentimages.storage.googleapis.com/d6/fe/f4/4d26220fb4a269/imgf000015_0001.png)
Paraaminophenol Chinonimin
Referenzelektrode, Gegenelektrode und jeweils eine der beiden Messelektroden befinden sich in einer Dreielektrodenanordnung an einen Potentiostaten angeschlossen. Aufgrund der großen Elektrodenflächen würde ein potentiostatisches Messverfahren zu einer starken Verarmung des pAP führen. Es wird daher ein geeignetes Pulsverfahren verwendet .
Zu Beginn der Messung ist die Positivprobe, also die Elektrode mit der Fängersequenz angeschlossen. Die Lösung mit dem Enzymsubstrat fließt zunächst über die Negativprobe, dann über die Positivprobe. Durch die Fließbewegung wird von dem Enzym gebildetes pAP von den Elektroden weggespült, so dass bei eingeschalteter Pumpe der Strom konstant und gering ist- Wird nun die Pumpe gestoppt steigt die pAP-Konzentration durch die Enzymaktivität mit der Zeit an. In der Messung zeigt sich dies durch einen starken Anstieg des Stromsignals mit 20 nA/s. Wird die Pumpe wieder eingeschaltet, so sinkt das Signal wieder auf den ursprünglichen Wert. Dieser Vorgang kann beliebig oft wiederholt werden.
In Figur 17 ist der Verlauf des Messstromes bei Pumpe "on"/"stopp" am Sensor mit positiver und negativer Probe gezeigt. Aufgetragen ist auf der Abszisse die Zeit t in s und auf der Ordinate der Strom I in nA. Der Graph 171 zeigt den Messstrom im Verlauf bei einer experimentellen Untersuchung.
Bei t = 400s wurde auf die Negativprobe umgeschaltet . Hier sinkt der Strom beim Stoppen der Pumpe zunächst, bleibt dann kurze Zeit konstant und steigt dann langsam an. Dieser Anstieg wird durch die Diffusion von pAP von der positiven zur negativen Probe hin verursacht . Bei Pumpe on kommt ein Peak— ström hinzu, da der Elektrolyt zunächst von der positiven zur negativen Probe fließt und damit eine erhöhte pAP-Konzentration zur benachbarten Elektrode transportiert. Insgesamt ist die Diskriminierung von positiver und negativer Probe sehr gut .