WO2005049864A1 - 癌診断方法 - Google Patents

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WO2005049864A1
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Norimasa Miura
Goshi Shiota
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Norimasa Miura
Goshi Shiota
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing cancer, and more particularly to a method for diagnosing cancer, which can diagnose the presence or absence of cancer cells at an early stage.
  • cancer patients do not die from complications associated with the cancer or cancer treatment.
  • Many cancer patients have metastasized cancer, or multiple tumor colonies formed from malignant cells that separate from the original tumor cells and migrate to a different site from where the original tumor cells are located. You lose. Therefore, the patient's early tumors can be found and detected, and such early tumors can be identified by medical resection, medical anticancer treatment, surgery, radiation therapy, chemotherapy with anticancer drugs, However, if these combinations can be shrunk or eliminated, patients will have a very high probability of overcoming and prolonging their cancer.
  • metastatic colonies which characterize metastatic tumors, are difficult to detect and difficult to remove, and from a clinical point of view, it is difficult to treat cancer. There is.
  • cancer metastasis involves the following complicated events.
  • tumor cells are in the early stages, then invade surrounding tissue, so destroy tissue burrs A, tumor cells very early stage of development of solid tumors (i.e., tumor, 1 0 4 or more 1 It is assumed that at a time point of containing no more than 6 tumor cells), it penetrates into the tissue space and capillaries and eventually reaches the blood. At this point, most of the tumor cells are eliminated by apoptosis or immunocompetent cells, or die or become dormant by the killing function of immunocompetent cells.
  • tumor cells In the early stages of breast cancer, most of the tumor cells are shed Is said to die. However, tumor cells, when grown to 1 0 6 or more 1 0 9, Ri cotton something generations, click b Ichin genetically unstable tumor cells, further undergone a change in the genetic level This can result in aggressive mutant cells that grow faster. Such mutant cells are very likely to survive as a secondary tumor.
  • the radioimmunoassay method which is an immunochemical technique
  • Enzyme-Linked Immuno-Sorbent Assay Enzyme immunoassay (also referred to as EIA (or ELISA)).
  • CEA as a tumor marker RIA (bead solid phase method), reverse passive erythrocyte aggregation reaction (R—PHA) and RIA (bead solid phase method) using ⁇ - protein ( ⁇ - fetoprotein; AFP) as a tumor marker
  • Enzym Imnoassay (EIA) and RIA (bead solid phase method) using prostate specific antigen as a marker
  • RIA (bead solid phase method) using CA15-3 as a tumor marker
  • RIA (bead solid phase method) using CA125 as a marker
  • PIV KA II [ Numerous enzymatic assays using proteinindueedbyv
  • antigens such as CEA, AFP, CA15-3, CA50, CA125, and PIVKAII are usually not expected to appear in the blood, and are already detected when detected.
  • these diagnostic methods have been evaluated as somewhat fruitless because the patient's cancer has already progressed considerably and the patient has little hope of survival.
  • this one tumor marker is “telomerase (hTERRT)”.
  • telomere This telomerase (hTERT) is a malignant tumor-specific antigen (enzyme) produced and expressed in 90% of carcinomas, and since its activity was discovered in 1994 (Kim NW. Science. 2 3; 26 6: 210 1 1 210 15 (1994)), and then gene discovery and functional analysis have been carried out. Nevertheless, for clinical applications, tumors It was detected only in resected tissues after formation and metastasis, but could not be easily detected in blood as in current clinical tests. In addition, even if this telomerase (hTERT) can be detected, the effects of other cells (such as lymphocytes) that are slightly contaminated and produced and expressed cannot be ignored, and qualitatively cannot be ignored. It could not be detected accurately.
  • a blood test could be developed that could detect the presence of a single tumor cell in 1 ml of blood, it would be on average comparable to a total of 300-400 cells in circulation. I do. In animals, in an inoculation experiment to engraft the tumor, such a number of cells actually allow the engraftment of the tumor. In addition, if 30000 to 40000 circulating cells represent 0.01% of the total cells in the tumor, a total of about 4 x 107 cells may be included. Thus, tumors containing such a number of cells cannot be seen by any of the current methods.
  • tumor cells flow into the blood with some association with tumor size. If so, a quantitative test to assess tumor burden would be beneficial.
  • a wide variety of DNAs, proteins and RNAs in the tumor cells and immunocompetent cells flow out into the blood, and RNA is detected. Is also conceivable. If so, the detection of tumor-specific RNA may indicate the earliest event of metastasis. However, previously there was no information on the presence of circulating tumor cells at a very early stage.
  • a method for fixing circulating cells having metastatic potential before establishment of a secondary tumor particularly a method for identification in the early stage of cancer.
  • Clinically the ability to detect evidence of the presence of cancer cells in blood, recognize the expression level in normal cells, and detect cancer cell-derived RNA with a high sensitivity of 1 to 10 copy levels It will provide extremely useful information. With the development of equipment, it became possible to quantify cancer tissues, and the era in which such highly sensitive quantification methods became possible has enabled entry of various cancer cell-derived RNAs. Preparations for the realization of quantification are considered to be technically complete.
  • the present invention has been made in order to solve the above-mentioned problems, and in particular, has an object to provide a cancer diagnosis method capable of detecting the presence of cancer cells in blood in the early stage of cancer. are doing. Disclosure of the invention
  • the method for diagnosing cancer comprising: a step of obtaining a sample containing only RNA as a somatic cell / cancer cell component from a body fluid; and PCR using a reverse transcriptase reaction and a fluorescent dye that generates chromosome as primers hTERT uses CGG AA GAGTGTCTGGAGC AA and GGATGAAGCGGAGTCTGGA And quantitatively measuring the PCR product amplified by PCR using a fluorescent dye combined with the PCR product.
  • body fluid used in the present specification means blood, lymph fluid, and other body fluids.
  • the method for diagnosing cancer according to claim 2 includes the steps of: obtaining a sample containing only RNA as a somatic cell / cancer cell component from a body fluid; and A reverse transcriptase reaction that generates NA and PCR using a fluorescent dye were used as primers, and AFP was performed using CCAG AA ACTAGTCCTGGATGT and CGTGGTCAGTTTGCAGCATT. And quantitatively measuring using a fluorescent dye.
  • the method for diagnosing cancer according to the present invention can detect evidence of the presence of cancer cells in blood at an early stage of cancer, so that cancer cells can be eradicated early by medical practice.
  • telomerase hTERT
  • AFP AFP
  • Fig. 1 shows that the T lymphocyte fraction (CD3, CD8, and the PCR product amplified by PCR was combined with the PCR product) in the RNA extracted by this method using the PCR method.
  • FIG. 7 shows that only quantitative detection using a fluorescent dye to be performed was detected, and removal of blood cell components was confirmed.
  • Figure 2 shows in copy numbers that the expression of the telomerase gene and AFP was detected in multiple stages as the disease progressed from chronic liver disease (hepatitis and cirrhosis) to hepatocarcinogenesis. The statistically significant differences between each lesion are indicated by numbers at the top of the table. An error bar indicates the 95% confidence interval on the left side of the scatter plot, and the square surrounded by the error bar indicates the average value.
  • FIG. 3 shows that the method for diagnosing cancer based on gene expression (hTERT mRNA) according to the present invention is superior to the conventional tumor markers. It is a box mustache figure shown using the difference. .
  • Fig. 4 shows the results of multivariate analysis of clinical test items and test findings, and the expression of two quantified genes (hTERT mRNA and AFP mRNA). .
  • FIG. 5 is an ROC curve showing the sensitivity and specificity of quantification of the expression of two genes (hTERT mRNA and AFPmRNA) by a cancer diagnostic method. (The ROC curve does not show the receiver curve characteristic curve analysis.)
  • Fig. 6 shows the process from chronic liver disease to liver cancer, the cancer diagnosis method using conventional tumor markers (AFP, AFP-L3, DCP), and 2
  • FIG. 9 is a diagram showing the results of multivariate analysis of correlations with each clinical test result and test findings, including quantitative values of cancer diagnosis methods based on two gene expressions (hTERT mRNA and AFP mRNA).
  • FIG. 7 shows the results of conventional tumor markers (AFP, AFP-L3, DCP) in liver cancer and the expression of two genes (hTERT mRNA and AFP mRNA) used in the method.
  • FIG. 7 is a diagram comparing sensitivity and specificity in the process of converting a disease to liver cancer.
  • blood of a subject is collected.
  • a sample containing RNA is obtained from the blood.
  • RNA circulating in the blood must be selectively extracted so as not to be affected by other blood cells as much as possible.
  • a body fluid is collected from the subject (patient) and then promptly processed as follows.
  • the obtained body fluid (about 1 to 2 ml) is centrifuged at 700 to 800 xg for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant is collected. Transfer the supernatant to an RNasefree tube, centrifuge at 150 xg for 10 minutes at 4 ° C, transfer the supernatant to another RNasefree tube, and finally Centrifuge at 00 xg for 10 minutes at 4 ° C, and store at 80 ° C as a stock sample containing RNA until ready for use.
  • the body fluid obtained in the same manner as in 1) above is centrifuged at 150 to 16 OO xg for 10 minutes at 4 ° C, and the supernatant is transferred to another RNasefree tube. Centrifuge at 0 ⁇ g or more at 4 ° C for 10 minutes, filter the supernatant with a 0.22 micrometer filter, and use immediately as an RNA-containing raw sample or wait until use. Store at 80 ° C. Next, PCR is performed using the RNA-containing sample as a primer and, in the case of hTERT, CGG AA GAGTGTCTGGAGC AA and GGATGAAGCGGAGTCTGGA, and the PCR product amplified by PCR is combined with the PCR product. Quantitatively measure using dyes'.
  • PCR is performed using CCAG AAA CTAGTCCTGGATGT and CGTGGTCAGTTTGCAGCATT as primers, and the PCR product amplified by PCR is quantitatively measured using a fluorescent dye that binds to the PCR product.
  • RNA isolation system a sample solution containing RNA prepared in 1) or 2) above, which contains 100 microliters of RNA ( ⁇ 1), and 1 microliter of microliters ( ⁇ 1) )
  • dilution buffer di1utionbuffer
  • 1ysisbuffer SV total RNA isolation system
  • TRI zo1 reagent a dilution buffer
  • SV tota 1 RNA extraction system
  • RNA in RNasefr ew a t e r 20 0 m i c ro l i t e r obtained by the two elutions is referred to as 20 m i c ro o 1 16 3:! ⁇ T—
  • a reverse transcriptase reaction that generates cDNA from RNA using reverse transcriptase and a fluorescent dye (in this example, SYBRG reen 1, manufactured by Roche) were used. Perform the quantitative PCR method using a single tube.
  • the reaction conditions were as follows: 1) reverse transcription reaction at 50 ° C for 30 minutes, 2) reaction activation step at 95 ° C for 15 minutes, and then 3) 3 steps. Perform about 55 cycles of PCR.
  • the annealing temperature depends on the primer.
  • primers hTERT is used for CGGAAGGAGTGTCTCTGGGAGCA and GGATGGAGGCCGGAGTCTCGGGA, and AFP is used for CCGAGGAATCTAGTCCTGGGATGTGTCGTCGTCATC.
  • the number of measurements obtained is compared with the optimal cut-off value statistically processed for each tumor (cut-off values of multiple markers are used to enhance the specificity depending on the type of cancer). Then, the presence or absence of the target cancer cells in the collected blood patient is determined. Next, the test results will be described.
  • FIG. 1 shows that the T lymphocyte fraction (CD3, CD8, the PCR product amplified by PCR) was contained in the RNA extracted by the cancer diagnostic method of the present invention by the PCR method. Is quantitatively measured using a fluorescent dye that binds to the PCR product.) This figure shows that only the detection was possible, and the removal of the blood cell component was confirmed.
  • the present inventor found that blood cell depletion, which is an important affirmation for the cancer diagnosis method according to the present invention, is performed using the blood cell markers CD3, CD8, and GDI. 9, mRNA of CD22, CD45 and CD68 were confirmed.
  • Figure 2 shows the number of copies of telomerase gene and AFP expression detected in multiple stages as liver disease (hepatitis and cirrhosis) progressed to hepatocarcinogenesis. The statistically significant difference between each lesion They are indicated by numbers at the top of the table. On the left side of the scatter plot, the 95% confidence interval is indicated by an error bar, and the square surrounded by error bars indicates the average value.
  • FIG. 3 shows that the method for diagnosing cancer according to the present invention is superior to the conventional method for diagnosing cancer using a tumor marker by using a statistically significant difference of liver cancer patients with healthy subjects.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of multivariate analysis of clinical test items and test findings, and quantified expression of two genes (hTERTmRNA and AFPmRNA).
  • FIG. 5 is an ROC curve showing the sensitivity and specificity of quantification by a cancer diagnostic method based on the expression of two genes (hTERTmRNA and AFPmRNA). It should be noted that the ROC curve does not have the following characteristics: Rec e i v e r o p e r a t o r c h a r a c c t e r i st t i c c u r v e a n l y s i ss.
  • the sensitivity of the cancer diagnosis method using gene expression (hTERT mRA) according to the present invention in liver cancer which is the fourth highest in cancer mortality, is 88.2%.
  • the specificity was 68.7%.
  • the method for diagnosing cancer by gene expression had a sensitivity of 70.1% and a specificity of 65.8%.
  • liver carcinogenesis process most liver carcinogenesis is viral chronic liver
  • the sensitivity of the method for diagnosing cancer by gene expression (hTERT mRNA) according to the present invention is 85.9%.
  • the specificity was 70.0%, which was not inferior to other tumor markers.
  • FIG. 6 shows the process from chronic liver disease to liver cancer, a conventional tumor marker (AFP, AFP-L3, DCP), and a cancer diagnosis method using two gene expressions (hTERT mRNA and AFP mRNA).
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of multivariate analysis of the correlation with each clinical test result and laboratory findings including the quantitative value of.
  • FIG. 7 shows the results of a cancer diagnosis method using conventional tumor markers (AFP, AFP-L3, DCP) in liver cancer and a cancer diagnosis method using two gene expressions (hTERT mRNA and AFP mRNA).
  • FIG. 4 is a diagram comparing sensitivity and specificity in the process from chronic liver disease to liver cancer.
  • alpha-protein which is one of the tumor markers for liver cancer and has the highest performance, was expressed by two genes (hTERT mRNA and AFP mRNA).
  • the cancer diagnosis method using the gene expression (hTERT mRNA) according to the present invention is better than the conventional cancer diagnosis method using the gene expression (AFP) (sensitivity 69.3%, specificity). It was clarified that it exhibited higher sensitivity (sensitivity: 85.9%, specificity: 70.0%).
  • the cancer diagnosis method using gene expression (AFP mRNA) according to the present invention is more effective than the conventional cancer diagnosis method using gene expression (AFP) (sensitivity 69.3%, specificity 60.0%). It also became clear that the sample also showed high sensitivity (sensitivity 71.6%, specificity 67.5%).
  • the method for diagnosing cancer based on gene expression (hTERT mRNA) according to the present invention is effective for all metastatic malignant tumors.
  • screening of cancer cells using RNA in body fluid can be screened even at a health checkup level.
  • AFP mRNA gene expression
  • screening of cancer cells using RNA in body fluid can be performed at a screening level even at a medical examination level. Many patients believe that early and recurrent detection can significantly improve their prognosis.
  • RNA is extracted from blood
  • the cancer diagnostic method according to the present invention has been described.
  • the method is not limited to extracting RNA from blood, and RNA may be extracted from body fluids other than blood.
  • the cancer diagnostic method according to the present invention can detect the presence of cancer cells in the blood in the early stage of cancer, and thus can eradicate cancer cells by medical treatment at an early stage. .
  • telomerase AFP
  • the cancer diagnostic method according to the present invention is highly useful in the medical field.

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Abstract

癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる、癌診断方法を提供する。体液中から体細胞・癌細胞成分として、ＲＮＡのみを含む試料を得る工程と、ＲＮＡを含む試料から逆転写酵素でｃＤＮＡを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いたＰＣＲを、プライマーとして、ｈＴＥＲＴでは、ＣＧＧＡＡＧＡＧＴＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＡとＧＧＡＴＧＡＡＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡを用いて行い、ＰＣＲにより増幅されたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物と結合した蛍光色素を用い、定量的に計測する工程とを備える。

Description

明 細 書 癌診断方法 技術分野
本発明は、 癌診断方法に関し、 特に、 早期に癌細胞の存在の有無を診 断できる、 癌診断方法に関する。 背景技術
日本において、 毎年、 新たに、 3 0 0 , 0 0 0件の癌の症例が診断さ れている。
また、 日本において、 4人から 5人に 1 人が、 癌又は癌治療に関連し た合併症で死亡している。 このため、 癌治療又は癌治療に関連した合併 症の治療の改善に相当な努力が継続して行われている。
また、 癌は早期に発見される と治癒率が高いこ とから、 癌を早期に発 見でき、 精度の高い癌の診断方法の開発や改良が行われている。
即ち、 大部分の癌患者は、 その癌又は癌治療に関連した合併症腫瘍に よっては死亡しない。 癌患者の多く は、 転移した癌、 即ち、 元の腫瘍細 胞から分かれて、 元の腫瘍細胞が存在している部位と は別の部位に移動 する悪性細胞から形成される複数の腫瘍コ ロニーに負けるのである。 従って、 患者の初期の腫瘍が発見 · 検出でき、 そのよ う な初期の腫瘍 を、 内科的切除術や、 内科的抗がん治療、 手術、 放射線治療、 抗がん剤 による化学療法、 及ぴ、 これらの組み合わせによ り 、 縮小したり 、 除去 できれば、 患者は、 癌を克服した り 、 延命するこ とができ る確立が非常 に高く なる。
しかしながら、 患者の腫瘍の早期発見 · 検出が困難であ り 、 また、 悪 性腫瘍を特徴づける、 転移性コロニーは、 その検出が困難であり 、 除去 も困難である、 という現状があり 、 臨床的観点から言えば、 癌治療は困 難なものとなっている、 という現状がある。
と ころで、 癌の転移は、 以下に示すよ う な複雑な出来事を含む。
1 ) 最初の癌の発生位置から周囲組織への癌の拡張。
2 ) 体腔及び血管中への腫瘍細胞の浸透。
3 ) 循環系によ り腫瘍細胞が離れた部位への輸送 · 放出。
4 ) 滞留部位における腫瘍細胞の組織への再侵入。
5 ) 新たな部位における腫瘍細胞の生存と、 腫瘍増殖をするための 血管形成等の新たな環境への適応。
即ち、 腫瘍細胞は、 初期の段階で、 周囲組織に侵入し、 組織バリ アを 破壊するので、 腫瘍細胞は、 固形腫瘍の発達の非常に初期段階 （即ち、 腫瘍が、 1 0 4個以上 1 0 6個以下の腫瘍細胞を含む時点） において、 組 織空間及び毛細血管中に侵入し、 結局は、 血液中に至るものと仮定され る。 この時点においては、 腫瘍細胞の大部分は、 アポ トーシスや、 免疫 担当細胞によ り排除された り 、 免疫担当細胞の殺傷機能によ り細胞死す るか休眠状態となる。
これは、 このよ うな段階では、 腫瘍細胞は、 異所性環境において未だ 生き残るこ とができず、 また、 成長する こ とができないからである。
と ころで、 本発明者等の知る限り 、 このよ う な初期段階の小さな腫瘍 を検出する検出方法は未だ開発されていない。
現時点では、 腫瘍がある程度大き く なつた場合に、 特定タイプの癌の 診断に使用可能な高感度方法が開発されているに過ぎない。
そのよ う な診断方法と しては、 例えば、 乳房中の 2 X 1 0 8個の乳腫 瘍細胞を検出できる、 乳房撮影が開発されている。
乳癌の場合、 その初期段階においては、 腫瘍細胞の大部分の流出細胞 が死ぬと されている。 しかしながら、 腫瘍細胞が、 1 0 6個以上 1 0 9 個まで増殖する と、 何世代かにわた り 、 遺伝子的に不安定な腫瘍細胞の ク ロ一ンは、 更に、 遺伝子レベルの変化を遂げ、 よ り迅速に増殖する攻 搫的な変異細胞を生じう る。 そして、 このよ う な変異細胞は、 二次腫瘍 と して生着する可能性が非常に高い。
しかしなが ら、 上述したよ う に、 現状では、 癌の診断は、 初期段階で は行えないため、 例えば、 脬臓、 胃、 卵巣、 腎臓、 肺、 肝臓などの大部 分の癌は、 通常、 1 0 1 °個〜 1 0 1 2個の腫瘍細胞が存在するよ う な、 癌の非常に後期の段階において行われており 、 この時点においては、 腫 瘍が既に周囲組織に侵入し、 転移している可能性がある。
従来は、 癌の初期段階における癌診断ができないこ と、 癌の根治治療 が困難なこ と、 癌転移の複雑さ、 化学療法に用いる薬剤の副作用の問題 や、 癌患者の治療に対する欲求不満を考慮して'、. 治療方針を立て、 癌の 転移又は再発に対する治療効果をモニターするための診断試験の開発が 行われてきた。
そして、 最近 2 0数年に亘る研究成果と して、 種々の診断試験方法が 開発され、 その有用性が評価されてきている。
よ り詳しく 述べる と、 最初の試みと して、 胎児の消化器で生産される 胎児性のガン抗原と考えられていたが、 結腸 ' 直腸ガン、 瞵ガン、 胆道 系ガンなどの消化器ガンや、肺ガンなどの特定の腫瘍細胞上に出現する、 癌胎児性抗原 ( c a r c i n o e m b r y o n i c a n t i g e n ； C E A) に関するィムノアツセィの定式化がある。
その後、免疫化学的手法であるラジオィムノ アツセィ法（ R I A ) や、 ェンザィム ' ィムノ アッセィ (E n z y m e — L i n k e d I m m u n o - S o r b e n t A s s a y (酵素免疫測定法 （ E I A (又は E L I S Aと も称される。））） の出現によ り 、 C E Aを腫瘍マーカーと して 用いた R I A (ビーズ固相法） や、 α フヱ トプロテイ ン （ α — f e t o p r o t e i n ； A F P ) を腫瘍マーカーと して用いた逆受身赤血球凝 集反応（R— P H A)や R I A (ビーズ固相法） や、 前立腺特異性抗原を マーカーと して用いたェンザィム · ィムノアッセィ （ E I A) や R I A (ビーズ固相法） や、 C A 1 5 — 3 を腫瘍マーカーと して用いた R I A (ビーズ固相法） や、 C A 5 0 をマーカ'一と して用いたェンザィム ' ィ ムノア ッセィ （ E I A) や、 C A 1 2 5 をマ一カーと して用いた R I A (ビーズ固相法） や、 P I V KA I I ([ p r o t e i n i n d u e e d b y v 1 t a m 1 n e K a b s e n c e o r a n t a g o n i s t ] I I ) を用いたェンザィ ム ' ィ ムノアッセィ （E I A) などが多数開発されてきた。
しかしながら、 これらの診断方法では、 C E A、 A F P、 C A 1 5 - 3、 C A 5 0 、 C A 1 2 5 、 P I V K A I I といった抗原は、 通常、 血中への出現が予想されず、 検出された時には、 既に、 患者の癌が既に 相当進行しており 、 既に、 患者の生存の望みが殆どないので、 これらの 診断方法は、 幾分、 実り の無いものである、 という評価を受けている。
しかしながら、 最近 1 0年間において、 ある一つの腫瘍マーカーが、 癌の早期検出に有用である と期待され、 その臨床応用に向けた研究開発 が継続されてきた。
即ち、このある一つの腫瘍マーカーとは、「テロメ レース（ h T E R T)」 である。
このテロメ レース （ h T E R T) は、 9 0 %の癌腫で産生し且つ発現 する悪性腫瘍特異的抗原 （酵素） であり 、 その活性が 1 9 9 4年に発見 されて以来 （K i m N W. S c i e n c e . 2 3 ; 2 6 6 : 2 0 1 1 一 2 0 1 5 ( 1 9 9 4 ) を参照）、 その後、 遗伝子の発見及び機能解析が 行われてきたが、 その特異性にも関わらず、 臨床応用に関しては、 腫瘍 形成、 転移後の切除組織中からの検出に留ま り 、 現行の臨床検查のよ う に血液中から簡易に検出する こ とができなかった。 また、 このテロメ レ ース （ h T E R T) は、 たと え、 検出できても、 混入しわずかに産生し 発現している他の細胞 （ リ ンパ球など） の影響が無視できず、 定性的に 検出するこ とが正確にはできなかった。
2 0 0 0年には、 乳癌患者の血液から h T E R Tの定性的検出に関す る報告がなされたが （ C h e n X Q . C l i n C a n c e r R e s . 6 ： 3 8 2 3 - 3 8 2 6 ( 2 0 0 0 ))、 感度力 S 6 0 %以下であり 臨床応用にはほど遠かった （K i m N W. S c i e n c e . 2 3 ; 2 6 6 : 第 2 0 1 1 頁〜第 2 0 1 5頁 （ 1 9 9 4 )、 C h e n X Q . C 1 i n C a n c e r R e s . 6 : 第 3 8 2 3頁〜第 3 8 2 6頁 （ 2 0 0 0 ) を参照。）。
と ころで、 有用な診断試験をするためには、 非常に高感度且つ信頼で きる定量性が必要と される。
また、 血液 1 m 1 中における 1個の腫瘍細胞の存在が検出できる血液 試験が開発できれば、 それは、 平均して循環している全部で 3 0 0 0個 〜 4 0 0 0個の細胞に匹敵する。 動物において、 腫瘍を生着させるため の接種実験において、 実際にそのよ う な数の細胞が腫瘍の生着を可能に する。 さ らに、 3 0 0 0個〜 4 0 0 0個の循環細胞が腫瘍中の全細胞の 0 . 0 1 %である場合、 全部で、 約 4 X 1 0 7個の細胞が含まれるこ と にな り 、 そのよ う な数の細胞を含む腫瘍は、 現在のいずれの方法によつ ても見るこ とができない。
それゆえ、 腫瘍細胞が癌の初期の段階において流出する場合、 上記の 感度を有する試験が開発できれば、 その試験によ り 、 癌を検出するこ と ができ る。
また、 腫瘍細胞が腫瘍サイズといく らかの関連性を持って血液中に流 出する場合、 腫瘍負荷を評価するための定量的試験は、 有益である。 また、 流出した腫瘍細胞と生体内の免疫細胞との闘いの末、 腫瘍細胞 や免疫担当細胞内の多種多様な D NAや蛋白質や R N Aなどが血液中に 流れ出る結果、 R NAが検出される と も考えられる。も しそ う であれば、 腫瘍特異的 R N Aの検出は、 転移の最も早期での出来事を物語っている のかも知れない。 しかしながら、 従来は、 非常に初期段階の循環腫瘍細 胞の存在に関する情報がなかった。
上記のこ と よ り 、 二次腫瘍の確立の前に転移能を有する循環中の細胞 を固定するための方法、 特に癌の初期において同定する方法が渴望され る。 癌細胞の存在証拠を血液中から検出でき、 正常細胞での発現レベル を認識でき、 癌細胞由来の R N Aを 1 〜 1 0 コ ピーレベルの高感度で検 出でき るこ とは、 臨床上、 極めて有用な情報を提供するこ と になる。 機器開発の向上に伴い、癌組織の定量化が可能になったこ と を受けて、 そのよ う な高感度な定量法が可能となる時代に入ってきたこ とで、 各種 癌細胞由来 R NAの定量化の実現の準備は技術的にも整っている と考え られる。
本発明は、 上記した問題を解決するためになされたものであって、 特 に、 癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる、 癌診 断方法を提供する こ と を目的と している。 発明の開示
請求の範囲第 1 項に記載の癌診断方法は、 体液中から体細胞 · 癌細胞 成分と して、 R N Aのみを含む試料を得る工程と、 R N Aを含む試料か ら逆転写酵素で c D NAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた P C Rを、 プライマーと して、 h T E R Tでは、 C G G AA G A G T G T C T G G A G C AAと G G A T G A A G C G G A G T C T G G Aを用 いて行い、 P C Rによ り増幅された P C R産物を P C R産物と結合した 蛍光色素を用い、 定量的に計測する工程と を備える。
尚、 本明細書で用いる用語、 「体液」 は、 血液、 リ ンパ液その他の体液 を意味する。
請求の範囲第 2項に記載の癌診断方法は、 体液中から体細胞 · 癌細胞 成分と して、 R N Aのみを含む試料を得る工程と、 R NAを含む試料か ら逆転写酵素で c D NAを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素を用いた P C Rを、 プライマーと して、 A F Pでは、 C C A G AA A C T A G T C C T G G A T G T と C G T G G T C A G T T T G C A G C A T Tを用 いて行い、 P C Rによ り増幅された P C R産物を P C R産物と結合した 蛍光色素を用い、 定量的に計測する工程と を備える。
本発明に係る癌診断方法は、 癌の初期において癌細胞の存在証拠を血 液中から検出できるので、 早期に医療行為によって癌細胞を根絶するこ とが可能になる。
また、 本発明に係る癌診断方法では、 血液中から m R N Aを含む試料 を得る よ う にしたので、 癌組織腫瘍形成、 転移後の切除組織中からテロ メ レース （ h T E R T) や A F P を検出するよ う な場合に比べ、 癌細胞 の有無を正確に検出するこ とができる。
また、 P C Rを行う際に使用するプライマーを工夫するこ とで、 癌の 初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる。 図面の簡単な説明
第 1 図は、 P C R法によ り 、 本手法で抽出された R NA中には T リ ン パ球分画 （ C D 3 、 C D 8 、 P C Rによ り增幅された P C R産物を P C R産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する）しか検出できず、 血球成分の除去を確認したこ と を示す図である。 第 2 図は、 慢性肝疾患 （肝炎および肝硬変） から肝ガン発ガンへ増悪 するにつれて、 多段階的にテロメ レース遺伝子および A F Pの発現が検 出されている こ と をコ ピー数で示しており 、 各病変間での統計学的有意 差が数字で表の上部に示されている。 散布図の左傍には 9 5 %信頼区間 をエラーバーで示し、エラーバーに囲まれた四角は平均値を示している。 第 3 図は、 本発明に係る遺伝子発現 （ h T E R T m R N A) によ る癌 診断方法が、 従来の腫瘍マーカーよ り優れた方法であるこ と を、 健常者 に対する肝ガン患者の統計学的有意差を用いて示している箱ヒゲ図であ る。 .
第 4 図は、 臨床上の各検査項目や検査所見と、 定量化した 2つの遣伝 子発現 （ h T E R T m R NA及ぴ A F P m R N A ) を多変量解析した 結果を示している図である。
第 5 図は、 2つの遺伝子発現 （ h T E R T mR NA及び A F P m R N A) の癌診断方法による定量化の感度と特異度を示している R O C曲 線である。 ( R O C曲線は、 R e c e i v e r o p e r a t o r c h a r a c t e r i s t i c c u r v e a n a l y s i s を不す。) 第 6 図は、慢性肝疾患から肝ガンへの過程と、従来の腫瘍マーカー （ A F P、 A F P — L 3 、 D C P ) による癌診断方法と、 2つの遺伝子発現 ( h T E R T mR NA及び A F P m R NA) による癌診断方法の定量 値を含めた各臨床検査結果や検査所見との相関を多変量解析した結果を 示す図である。
第 7 図は、 肝ガンにおける従来の腫瘍マーカー （ A F P、 A F P — L 3、 D C P ) と該方法で用いた 2つの遺伝子発現 （ h T E R T m R N A 及ぴ A F P m R NA) の結果を、 慢性肝疾患から肝ガンへの過程で、 感 度おょぴ特異度について比較した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明に係る癌診断方法の一例を更に詳しく説明する。
本発明に係る癌診断方法では、 まず、 被験者 （患者） の血液を採取す る。
次に、 血液中から R NAを含む試料を得る。
この工程においては、 血液中を循環している R N Aを、 他の血液細胞 の影響を極力受ける事のないよ う に、 選択的に抽出する必要がある。 この目的を達成するために、被験者（患者） から体液を採液してから、 迅速に以下のよ う に処理をする。
1 ) 採血管に E D T Aが混入していない場合
患者の同意の下に、 採液によ り得られた体液 （約 1 〜 2 ml) を 7 0 0 〜 8 0 0 X g で 1 0分間、 4 °Cで遠心分離し、 上清を他の R N a s e f r e e のチューブに移し、 それを 1 5 0 0 x g で 1 0分間、 4 °Cで遠心 分離し、 上清を別の R N a s e f r e e のチューブに移し、 最後に、 1 6 0 0〜 3 0 0 0 x gで 1 0分間、 4 °Cで遠心分離し、 R N Aを含む 原試料と して、 直ぐに用いるカ 使用まで一 8 0 °Cに貯蔵する。
2 ) 採血管に E D T Aが混入している場合
上記 1 ) と同様にして得られた体液を 1 5 0 0〜 1 6 O O x gで 1 0 分間、 4 °Cで遠心分離し、 上清を他の R N a s e f r e e のチューブ に移し、 1 5 , 0 0 0 χ g以上で 1 0分間、 4 °Cで遠心分離し、 その上清 を 0. 2 2 m i c r o m e t e r のフィルターで濾過して、 R N Aを 含む原試料と して、 直ぐに用いるか、 使用まで一 8 0 °Cに貯蔵する。 次に、 R N Aを含む試料を、 プライマーと して、 h T E R Tのと きは、 C G G AA G A G T G T C T G G A G C AAと G G A T G A A G C G G A G T C T G G Aを用い、 P C Rを行い、 P C Rによ り増幅された P C R産物を P C R産物と結合する蛍光色素を用い、定量的に計測する'。尚、 A F Pでは、 プライマーと して、 C C A G AAA C T A G T C C T G G A T G T と C G T G G T C A G T T T G C A G C A T Tを用レ、、 P C R を行い、 P C Rによ り增幅された P C R産物を P C R産物と結合する蛍 光色素を用い、 定量的に計測する。
よ り詳しく 説明する と、 上記 1 ) 又は 2 ) によ り調製した、 R N Aを 含む試料液 1 0 0 マイク ロ リ ッ トル （ μ 1 ) に対し 1 7 5 マイ ク ロ リ ッ トル （ μ 1 ) の希釈緩衝液 （ d i 1 u t i o n b u f f e r ), 1 y s i s b u f f e r (S V t o t a l R N A i s o l a t i o n s y s t e m), または、 T R I z o 1 試薬を用いて、 その後、 D N a s e処理を含んだ R NA抽出をマニュアル （この例では、 S V t o t a 1 R N A i s o l a t i o n s y s t e mのマ二ユアノレ） に従って執り •行う。
2回の溶出によ り得られた R N a s e f r e e w a t e r 2 0 0 m i c r o l i t e r 中の R NAを、 2 0 m i c r o 1 1 6 3： を！^ T— P C R反応に用レヽる力、、 1 0 m i c r o l i t e r相当の溶媒 になる よ う に調製し、 その 1 マイ ク ロ リ ツ トノレ I ) を R T— P C R 反応に用いる。
次いで、 ワ ンステ ップで定量化するために、 R N Aから逆転写酵素で c D N Aを生成する逆転写酵素反応と蛍光色素 （この例では、 S Y B R G r e e n 1 、 ロ ッシュ （ R o c h e )社製を用いている。） を用いた定 量的 P C R法をシングルチューブで行う。
よ り詳細に説明する と、 総反応液量 2 5 マイ ク ロ リ ッ トル ( μ 1 ) に 対し、 1 マイ ク ロ リ ッ トル ( a 1 ) 以上 2マイ ク ロ リ ッ トル ( μ 1 ) の 蛍光色素 （この例では、 S Y B R G r e e n 1 、 ロ ッシュ （R o c h e ) 社製を用いている。） を用レ、、 マニュアル （この例では、 O n e S t e p R T— P C R k i t (Q I A G E N)のマニュアル）に従って反応液 を調製し、 定量計測器（例えば、 L i g h t C y c 1 e r (ロ ッシュ （R o c h e ) 社製）にセッ ト して、 マ-ユアル （この例では、 O n e S t e p R T— P C R k i t (Q I A G E N)のマニュアル）の指示通り に 作動させ、 原試料中の R N Aの発現量を定量化する。
その際、 反応条件と して、 1 )逆転写反応を 5 0 °Cで 3 0分、 2 )反応 活性化段階と して、 9 5 °Cで 1 5分、 その後、 3 ) 3 ステ ップの P C R反 応を 5 5サイ クル程度行う。ァニーリ ング温度はプライマーに依存する。 例えば、 プライマーと して、 h T E R Tでは、 C G G A A G A G T G T C T G G A G C A Aと G G A T G A A G C G G A G T C T G G Aを用レ、、 A F Pでは、 C C A G AA A C T A G T C C T G G A T G T と C G TG G T C A G T T T G C A G C A T Tを用いる。 得られた計測数は、 各腫 瘍に応じて統計処理された最適カ ツ トオフ価 （ガンの種類によっては特 異性を高めるために複数のマーカーのカ ッ トオフ値を用いる。）と比較分 析され、採血された患者における、目的とする癌細胞の有無を判定する。 次に、 試験結果を説明する。
第 1 図は、 P C R法によ り 、 本発明に係る癌診断方法で抽出された R NA中には、 T リ ンパ球分画 （C D 3 、 C D 8 、 P C Rによ り増幅され た P C R産物を P C R産物と結合する蛍光色素を用い、 定量的に計測す る。） しか検出できず、 血球成分の除去を確認したこ と を示す図である。 第 1 図よ り 明 らかなよ う に、 本発明者は、 本発明に係る癌診断方法に とって重要な肯定である、 血球細胞除去は、 血球細胞マーカーである C D 3 、 C D 8、 G D I 9、 C D 2 2、 C D 4 5 、 C D 6 8 の mR N Aな どで確認した。
第 2図は、 肝疾患 （肝炎および肝硬変） から肝ガン発ガンへ增悪する につれて、 多段階的にテロメ レース遺伝子および A F Pの発現が検出さ れているこ と をコ ピー数で示しており 、 各病変間での統計学的有意差が 数字で表の上部に示されている。 散布図の左傍には 95%信頼区間をエラ 一パーで示し、 エラーバーに囲まれた四角は平均値を示している。
また、 第 3図は、 本発明に係る癌診断方法が、 従来の腫瘍マーカーに よる癌診断方法よ り も優れた方法であるこ と を、 健常者に対する肝ガン 患者の統計学的有意差を用いて示している箱ヒゲ図である。
第 2図及び第 3 図の結果から、 本発明に係る癌診断方法では、 肝病変 の進行および増悪につれて、 h T E R T mR N Aの発現は多段階的に高 まっている こ とが、 明らかになった。
第 4 図は、 臨床上の各検査項目や検査所見と、 定量化した 2つの遺伝 子発現 （ h T E R T m R N A及び A F P m R N A ) を多変量解析した 結果を示している図である。
第 4図から、 臨床上の検査項目 （肝機能についての生化学的検査ゃゥ ィルス量などの血清学的検査）、 検査所見 （腫瘍径、 腫瘍数、 腫瘍の分化 度） との多変量解析による比較によ り 、 特に、 h T E R T m R NAの発 現は、 発ガンとい う こ と に関しては腫瘍径、 腫瘍数、 腫瘍の分化度との 強い相関があるこ とが、 明らかになった。
第 5 図は、 2つの遺伝子発現 （ h T E R T mR N A及ぴ A F P m R N A) による癌診断方法による定量化の感度と特異度を示している R O C曲線である。 尚、 R O C曲線は、 R e c e i v e r o p e r a t o r c h a r a c t e r i s t i c c u r v e a n a l y s i s を不す。 第 5 図から明らかなよ う に、ガン死亡率第 4位である肝ガンにおいて、 本発明に係る遺伝子発現 （ h T E R T m R A) による癌診断方法は、 感度が 8 8 . 2 %であり 、 特異度が 6 8 . 7 %であった。
一方、 遣伝子発現 （A F P m R NA) による癌診断方法は、 感度が 7 0. 1 %であ り 、 特異度が 6 5. 8 %であった。
また、 肝ガンの発ガン過程 （ほとんどの肝発ガンはウィルス性慢性肝 疾患から発ガンであ り 、 健常者を除いて統計処理する場合） で、 本発明 に係る遺伝子発現 （ h T E R T m R N A) による癌診断方法の感度は、 8 5 . 9 %であ り 、 また、 特異度は、 7 0 . 0 %であ り 、 他の腫瘍マー カーに劣るものではなかった。
第 6 図は、慢性肝疾患から肝ガンへの過程と、従来の腫瘍マーカー （ A F P、 A F P— L 3 、 D C P ) と、 2つの遺伝子発現 （ h T E R T m R N A及び A F P m R N A)による癌診断方法の定量値を含めた各臨床検 査結果や検査所見との相関を多変量解析した結果を示す図である。
また、 第 7図は、 肝ガンにおける従来の腫瘍マーカー （A F P、 A F P— L 3 、 D C P ) による癌診断方法と、 2つの遺伝子発現 （ h T E R T m R N A及び A F P m R N A) による癌診断方法の結果を、 慢性肝 疾患から肝ガンへの過程で、 感度おょぴ特異度について比較した図であ る。
第 6 図及び第 7 図から、 肝ガンの腫瘍マーカーの一つであ り 、 最も実 績が高かったアルファ フヱ トプロテイ ン （A F P ) を 2つの遺伝子発現 ( h T E R T m R N A及び A F P m R N A ) による癌診断方法で検出 したと ころ、 本発明に係る遺伝子発現 （ h T E R T m R N A) による癌 診断方法の方が、 従来の遺伝子発現 （A F P ) による癌診断方法 （感度 6 9 . 3 %、 特異度 6 0. 0 %) よ り も高い感度 （感度 8 5 . 9 %、 特 異度 7 0 . 0 %) を示すこ とが、 明らかになった。
また、 本発明に係る遺伝子発現 （A F P mR N A) による癌診断方法 の方が、従来の遺伝子発現（A F P ) による癌診断方法（感度 6 9 . 3 %、 特異度 6 0. 0 %) よ り も高い感度 （感度 7 1 . 6 %、 特異度 6 7. 5 %) を示すこ とが、 明 らかになった。
このこ とから、 本発明に係る遺伝子発現 （ h T E R T m R N A) によ る癌診断方法が、 転移性の悪性腫瘍全般にわた り 、 有効である と考えら れた。 更に、 本発明に係る遺伝子発現 （ h T E R T m R N A) による癌 診断方法を基礎と して、 体液中 R NAによるガン細胞存在診断が、 健診 レベルでもスク リーユングが可能にな り 、 一人でも多く の患者が早期発 見及び再発発見によ り 、 その生命予後が著しく 改善されう る と考える。 また、 本発明に係る遺伝子発現 （A F P mR N A) による癌診断方法 を基礎と して、 体液中 R N Aによるガン細胞存在診断が、 健診レベルで もスク リ 一ユングが可能にな り 、 一人でも多く の患者が早期発見及び再 発発見によ り 、 その生命予後が著しく 改善されう る と考える。
尚、 本明細書の、 発明を実施するための最良の形態では、 本発明に係 る癌診断方法と して、 血液中から R N Aを抽出した例を示したが、 本発 明に係る癌診断方法では、 血液から R N Aを抽出する場合に限られず、 血液以外の体液から R N Aを抽出するよ う にしてもよい。 産業上の利用可能性
以上のよ う に、 本発明に係る癌診断方法は、 癌の初期において癌細胞 の存在証拠を血液中から検出でき るので、 早期に医療行為によって癌細 胞を根絶するこ とが可能になる。
また、 血液中から m R N Aを含む試料を得るよ う にしたので、 癌組織 腫瘍形成、 転移後の切除組織中からテロ メ レース （ h T E R T) や A F P を検出するよ う な場合に比べ、 癌細胞の有無を正確に検出するこ とが でき る。
また、 P C Rを行う際に使用するプライマーを工夫するこ と に'よ り 、 癌の初期において癌細胞の存在証拠を血液中から検出できる。
本発明に係る癌診断方法は、 医療分野において利用する価値が高い。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 体液中から、 体細胞 · 癌細胞成分と して、 R N Aのみを含む試料を 得る工程と、
前記 R N Aのみを含む試料から逆転写酵素で c D N Aを生成する逆転写 酵素反応と蛍光色素を用いた P C Rを、 プライマーと して、 h T E R T では、 C G G AA G A G T G T C T G G A G C AAと G G A T G A A G C G G A G T C T G G Aを用いて行い、 前記 P C Rによ り増幅された P C R産物を前記 P C R産物と結合した蛍光色素を用い、 定量的に計測す る工程と を備える、 癌診断方法。
2. 体液中から、 体細胞 ' 癌細胞成分と して、 R N Aのみを含む試料を 得る工程と、 - 前記 R NAのみを含む試料から逆転写酵素で c D NAを生成する逆転写 酵素反応と蛍光色素を用いた P C Rを、プライマーと して、 A F Pでは、 C C A G A AA C T A G T C C T G G A T G T と C G T G G T C A G T T T G C A G C A T Tを用いて行い、 前記 P C Rによ り増幅された P C R産物を前記 P C R産物と結合した蛍光色素を用い、 定量的に計測する 工程と を備える、 癌診断方法。
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