WO2005042469A1 - 安定同位体標識芳香族アミノ酸、その標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質のnmr構造解析方法 - Google Patents

安定同位体標識芳香族アミノ酸、その標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質のnmr構造解析方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a stable isotope-labeled aromatic amino acid useful for analyzing the NMR structure of a protein, a method for incorporating the aromatic amino acid into a target protein, and a method for analyzing the NMR structure of a protein.
  • Patent Literature 1 discloses an invention that enables the simultaneous determination of high accuracy.
  • the specification regarding the labeling pattern of the aromatic ring portion of the aromatic amino acid has been made.
  • aromatic amino acids such as Phe, Tyr, and Trp, together with amino acids having long-chain alkyl groups such as Leu, Val, and lie, play an important part in the formation of the three-dimensional structure of the hydrophobic core of globular proteins.
  • aromatic amino acids utilize a functional group such as hydroxyl group of Tyr, indole nitrogen of Trp, or a pi electron common to the aromatic ring to form not only a three-dimensional structure of a protein but also a protein function such as substrate recognition.
  • Patent Document 1 International Publication WO03 / 053910A1
  • the present invention provides a stable isotope labeling method that can remove the complexity of aromatic ring NMR signals, which is the biggest reason that conventional homogeneously labeled amino acid residues make NMR analysis difficult, and can significantly improve the sensitivity. It is intended to provide an aromatic amino acid.
  • An object of the present invention is to provide an aromatic amino acid having a labeling pattern for extending the chain assignment of a main chain signal to a ring portion.
  • An object of the present invention is to provide a combination of stable isotope-labeled amino acids, in which all of the amino acids constituting the target protein are stable isotope-labeled amino acids.
  • An object of the present invention is to provide a method for incorporating a stable isotope-labeled amino acid into a target protein.
  • An object of the present invention is to provide a method for preparing a target protein composed of a stable isotope-labeled amino acid.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining the NMR structure of a protein with further improved sensitivity.
  • Patent Document 1 relates to associating a main chain NMR signal with a chain assignment of an NMR signal via a C ⁇ carbon signal.
  • Patent Document 1 relates to associating a main chain NMR signal with a chain assignment of an NMR signal via a C ⁇ carbon signal.
  • the present invention provides a stable isotope-labeled amino acid selected from the following.
  • the carbon atom of the fuel group bonded to the amino acid residue represented by the formula A is 13 C, and 2 to 4 carbon atoms of the remaining five carbon atoms constituting the fuel group are 12 C
  • the carbon atom of the phenol group bonded to the amino acid residue represented by the formula A is 13 C, and the carbon atom bonded to the hydroxyl group (OH group) of the phenol group is 12 C or 13 C.
  • the remaining four carbon atoms constituting the fuel group have 2 to 4 carbon atoms of 12 C, to which deuterium is bonded, and the remaining carbon atoms of 13 C.
  • the carbon atom of the indolyl group bonded to the amino acid residue represented by Formula A is 13 C, and among the remaining seven carbon atoms constituting the indolyl group, 115 carbon atoms are 12 C; The deuterium is bonded to this, the remaining carbon atom is 13 C, the hydrogen atom is bonded to this, and the nitrogen atom of the NH group constituting the indolyl group is 15 N or 14 N.
  • a carbon atom is 13 C imidazolyl group linked to an amino acid residue of the formula A, both this hydrogen atom a carbon atom 13 C of the remaining two carbon atoms constituting the ⁇ I imidazolyl group Or one of the carbon atoms is 12 C and deuterium is bonded thereto, and the other carbon atom is 13 C and a hydrogen atom is bonded thereto.
  • a stable isotope-labeled histidine characterized in that one of the two nitrogens constituting the imidazolyl group is 15 N and the remaining is 14 N, and the hydrogen atom constituting the NH group is not deuterium.
  • the aromatic amino acid constituting the target protein is the above-mentioned stable isotope-labeled aromatic amino acid, and the aliphatic amino acid constituting the target protein has the following labeling pattern.
  • a stable isotope-labeled aliphatic amino acid which is a stable isotope-labeled aliphatic amino acid that satisfies the above condition.
  • the present invention also provides a method for incorporating the above-mentioned stable isotope-labeled aromatic amino acid into a target protein, which comprises incorporating the stable isotope-labeled amino acid into a target protein by cell-free protein synthesis. Provide a method.
  • the present invention also relates to a target comprising a stable isotope-labeled amino acid, including performing cell-free protein synthesis using a combination of the above-mentioned stable isotope-labeled amino acids as all amino acids constituting the target protein.
  • a method for preparing a protein is provided.
  • the present invention also provides a method for analyzing the structure of a protein, which comprises incorporating the above-mentioned stable isotope-labeled amino acid into a target protein and analyzing the structure by measuring an NMR spectrum.
  • the present invention also provides a method for analyzing the structure of a target protein, comprising analyzing the structure of the target protein in which all the amino acids constituting the target protein are substituted with the above stable isotope-labeled amino acids by NMR spectrum measurement. I do.
  • the aim was to link the chemical shift of the ring protons to C ⁇ and thus to the main chain signal.
  • the aim is to link the chemical shifts of the ring protons to C ⁇ and thus to the main chain signal.
  • the aim was to link the chemical shift of the ring protons to C ⁇ and thus to the main chain signal.
  • the labeling pattern of the isotopic directional amino acid disclosed in Patent Document 1 is defined as: Via the oxygen signal backbone of consider associating with a chain assignment of NMR signals far septum 13 c- 13 c, and the remote 13 C-IH designed to ensure sufficient ⁇ I spoon movement path by spin coupling The idea is different in that it did.
  • Patent Document 1 when there are magnetically equivalent 1H nuclear forces such as a methyl group or more, one hydrogen is left and the other is deuterated.
  • the hydrogen nuclei at the ⁇ 1, ⁇ 2 and ⁇ 1, ⁇ 2 positions are magnetically equivalent, so one of the nuclei at the ⁇ and ⁇ positions is deuterated. It showed a sign pattern of doing.
  • the three-dimensional structure of the amino acid side-chain aromatic ring site present in the protein is different from that of the methyl group because it is difficult to rotate on the (R)-( c ) axis (on two axes). , Protons on the aromatic ring are magnetically non-equivalently observed.
  • the carbon atom of the fuel group bonded to the amino acid residue represented by the formula A is 13 C, and three or four carbon atoms of the remaining five carbon atoms constituting the fuel group are 12 C.
  • the carbon atom of the phenol group bonded to the amino acid residue represented by the formula A is 13 C, and the carbon atom bonded to the hydroxyl group (OH group) of the phenol group is 12 C or 13 C. 3 or 4 carbon atoms of the remaining four carbon atoms constituting the fuel group are 12 C, deuterium is bonded thereto, and the remaining carbon atoms are 13 C, A stable isotope-labeled tyrosine characterized by having a hydrogen atom bonded thereto,
  • the carbon atom of the indolyl group bonded to the amino acid residue represented by Formula A is 13 C, and 3 to 5 carbon atoms of the remaining seven carbon atoms constituting the indolyl group are 12 C;
  • the deuterium is bonded to this, the remaining carbon atom is 13 C, the hydrogen atom is bonded to this, and the nitrogen atom of the NH group constituting the indolyl group is 15 N or 14 N.
  • a stable isotope-labeled tributophan and
  • the carbon atom of the imidazolyl group bonded to the amino acid residue represented by Formula A is 13 C, and one of the remaining two carbon atoms constituting the imidazolyl group is 12 C, And the remaining carbon atom is 13 C, to which a hydrogen atom is bonded, one of the two nitrogens constituting the imidazolyl group is 15 N and the remaining is 14 N
  • the stable isotope-labeled aromatic amino acids used in the of the invention, C in the amino acid residue represented by the formula A, * 2 C, and * 3 C is preferably respectively a 13 C. More preferably, it is a stable isotope-labeled aromatic amino acid represented by the following general formula (1)-(15).
  • C represents 12 C or 13 C
  • N represents 14 N or 15 N
  • Z represents a hydrogen atom or a deuterium atom
  • R represents the following group:
  • X, Y and Z each represent a hydrogen atom or a deuterium atom.
  • stable isotope-labeled aromatic amino acids represented by the general formulas (1), (2), (3), (4), (7) or (8).
  • the stable isotope-labeled aromatic amino acid used in the present invention can be synthesized by combining various conventionally known chemical synthesis methods or by modifying them. For example, it may be prepared by chemical synthesis according to a reaction scheme as exemplified in Examples described later.
  • a target protein composed of a stable isotope-labeled amino acid is prepared by performing cell-free protein synthesis using the above-mentioned stable isotope-labeled aromatic amino acid as an amino acid constituting the target protein, and its NMR ⁇
  • the vector can be measured to analyze the structure of the protein, but the stable amino acids that constitute the target protein together with the stable isotope-labeled aromatic amino acids are those that satisfy the (a)-(D labeling pattern. It is preferable to use in combination with an isotope-labeled aliphatic amino acid.
  • the stable isotope-labeled aliphatic amino acids satisfying the labeling pattern of (a)-(1) include hydrogen atoms after deuteration in (a), (b) and (d).
  • all of the carbons of the methylene and methyl groups having are substituted with 13 C.
  • the stable isotope-labeled aliphatic amino acid is substituted with a carbon atom S 13 C constituting a carbonyl group and a guanyl group.
  • (a), (b) and in (d) Te you, after being deuterated, 13 C / 12 C carbon methylene group and a methyl group having a hydrogen atom 15/8 5 (atomic ratio) More than or all at 12 C, preferably U.
  • FIG. 1 of Patent Document 1 shows the stable isotope-labeled aliphatic amino acid shown in FIG. 1 for reference.
  • stable isotope-labeled amino is incorporated into the target protein.
  • all the aromatic amino acids constituting the target protein were replaced with the stable isotope-labeled aromatic amino acids of the present invention, and all the remaining amino acids constituting the target protein, namely, Preferably, all aliphatic amino acids are also substituted with the stable isotope-labeled amino.
  • Replacing the amino acids constituting the target protein with a stable isotope-labeled amino acid can be performed by a conventionally known method, for example, a conventional method using cultured biological cells. It can be carried out by any method such as a high expression protein synthesis system, an organic chemistry, an enzymatic chemical peptide, a protein synthesis technique, or a protein preparation method using a cell-free extract. Among these, a protein synthesis method using a cell-free extract is preferred. That is, it is easy to control isotope dilution and diffusion due to amino acid metabolism, which is a problem with ordinary culture organism cells, and it is possible to incorporate labeled amino acids that are difficult to synthesize in large quantities into proteins with extremely high efficiency This is because
  • amino acids used in the present invention are most characterized by having various labeling patterns, and when they are incorporated into proteins, they are difficult to obtain by conventional methods. Three-dimensional structure analysis becomes possible.
  • stereo-selective deuteration (Stereo-selective Deuteration, SSD), regio-selective deuteration (RSD), stereo-alignment deuteration (Stereo-array Deuteration, SAD) described in Patent Document 1 ), Minimize proton concentration
  • all the amino acids constituting the target protein are the stable isotope-labeled amino acids, that is, the aromatic amino acids are the stable isotope aromatic amino acids, and the other amino acids are the amino acids.
  • a target protein NMR structure analysis method including analyzing the structure of a target protein in which an aliphatic amino acid is substituted with the above stable isotope aliphatic amino acid by NMR spectrum measurement is preferable.
  • the following effects can be obtained. Since the dipole interaction is reduced by deuterium labeling the amino acid residue in the protein, the measurement sensitivity of the signal of the proton on the aromatic ring and the proton near the aromatic ring is improved.
  • Figure 2 shows a flow chart for synthesizing stable isotope labels of phenylalanine, tyrosine, and tryptophan from acetone.
  • dicarboxylic acid a8) 19.1 g (101 mmol) were combined and mixed in a mortar,
  • Hyd (35) (2.86 mmol), sodium acetate (5.15 mmol) and acetic anhydride (20 mmol) were added, and the mixture was stirred at 120 ° C for 8 hours under an argon atmosphere.
  • the resulting mixture was cooled in an ice bath, and the resulting crystals were collected by filtration, washed with a small amount of cold water, and dried under reduced pressure.
  • the obtained crystals were added to a 0.5 M aqueous solution of sodium carbonate (20 ml). The mixture was refluxed at 140 ° C for 4 hours.
  • N-acetyltryptophan was dissolved in a 1 M aqueous sodium hydroxide solution (50 ml), 1 M hydrochloric acid (50 ml) was added thereto, and anhydrous cobalt chloride (10 mg) was added thereto.
  • the substrate (22) was dissolved in formic acid (45 ml), and acetic anhydride (45 ml) was added little by little. After heating at 100 ° C for about 1 to 2 hours, the mixture was concentrated to remove formic acid and acetic acid. Methylene chloride is added for extraction, and the organic phase is washed four times with a saturated NaHCO aqueous solution, then with water, and then with a saturated NaCl aqueous solution.
  • the target product (46) was obtained (0.625 g, 2.06 mmol, yield: 65.0%).
  • the target product 53 (1.042 g, 3.38 mmol, 38%) was obtained.
  • globular proteins have a hydrophobic core consisting of aromatic amino acids such as Phe, Trp, and Tyr and amino acids having alkyl side chains such as Leu, Val, and lie. Many. Therefore, when determining the three-dimensional structure of a protein by the NMR method, it is necessary to experimentally find a distance limit for knowing the relative positional force between these amino acids. Normally, such a distance limitation is based on the Nuclear Overhauser effect (NOE;), which utilizes the fact that the dipole interaction between 1H-1H is proportional to one third of the spatial distance.
  • NOE Nuclear Overhauser effect
  • the present invention relates to a small high molecular weight protein that could be a target of NMR structure analysis due to restrictions on NOE measurement experiments, including the aromatic amino acid hydrogen nucleus, which is indispensable for structure determination experiments. This makes it possible to measure NOE more accurately and more accurately.
  • Microorganisms or other cells are cultured in a medium to which the novel stable isotope-labeled aromatic amino acids of the present invention are added, and the amino acids residues in the proteins produced by them or the proteins incorporated as foreign genes Can be specifically labeled.
  • NOE information on all of the hydrogen nuclei on the aromatic ring is not necessarily indispensable. If hydrogen nuclei remain, it is enough for structure determination NOE information is available. Therefore, if Phe is taken as an example, only C ⁇ and C ⁇ are labeled in type (1) and only C ⁇ -C ⁇ ⁇ is labeled in type (2) because they are labeled with 13 C.
  • regular HSQC can be used instead of constant time HSQC to eliminate 13 C- 13 C spin coupling ( Figure 5).
  • FIG. 1 shows a stable isotope-labeled aliphatic amino acid preferably used in the present invention.
  • FIG. 2 shows a schematic diagram of the synthesis route for stable isotope labels of phenalanine, tyrosine, and tryptophan.
  • FIG. 3 shows the synthesis route of stable isotope-labeled tyrosine (4) from acetone ().
  • FIG. 4 shows a synthesis route of a stable isotope-labeled phenylalanine).
  • FIG. 5 shows a synthesis route of stable isotope-labeled tributophan (8).
  • FIG. 6 shows a synthetic pathway for stable isotope-labeled histidine (48).
  • FIG. 7 shows 1H- 13C (ct-) HSQC spectrum of Tyr-selectively labeled calmodulin.
  • FIG. 8 shows the lH- 13C (ct-) TROSY spectrum of Phe-selectively labeled calmodulin.
  • FIG. 9 shows the step of assigning the H ⁇ proton of Phe-selectively labeled calmodulin.
  • FIG. 10 shows the ⁇ ⁇ ⁇ proton assignment steps of Tyr and Phe selectively labeled calmodulin.
  • FIG. 11 shows a synthetic pathway for stable isotope-labeled histidine (55).
  • FIG. 13 shows a 1 H- 13 C HSQC spectrum of a protein (EPPI) incorporating stable isotope-labeled tributophan (8).

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Abstract

　アミノ酸残基に結合するフェニル基の炭素原子が13Ｃであり、該フェニル基を構成する残り５つの炭素原子のうち２～４個の炭素原子が12Ｃであり、これに重水素が結合し、残りの炭素原子が13Ｃであって、これに水素原子が結合している安定同位体標識フェニルアラニンや、アミノ酸残基に結合するフェニル基の炭素原子が13Ｃであり、該フェニル基のヒドロキシル基（ＯＨ基）に結合する炭素原子が12Ｃ又は13Ｃであり、該フェニル基を構成する残り４つの炭素原子のうち２～４個の炭素原子が12Ｃであり、これに重水素が結合し、残りの炭素原子が13Ｃであって、これに水素原子が結合している安定同位体標識チロシンなどを提供する。これにより、従来の均一標識アミノ酸残基がNMR解析を困難にする最も大きな理由であった芳香環NMRシグナルの複雑さを取り除き、その感度を著しく向上させることができる安定同位体標識芳香族アミノ酸を提供できる。

Description

明 細 書
安定同位体標識芳香族アミノ酸、その標的蛋白質への組み込み方法並 びに蛋白質の NMR構造解析方法
技術分野
[0001] 本発明は蛋白質の NMR構造解析に有用な安定同位体標識芳香族アミノ酸、その 標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質の NMR構造解析方法に関する。 背景技術
[0002] NMRを用いて蛋白質の構造解析を行う時には、常に NMRシグナルの重なり合いや 、緩和によるシグナル強度の減少などの問題を考慮しなければならない。この問題を 解決するためには NMR測定 ·解析技術の進歩が不可欠であつたが、 1990年代初頭 に開発された多核種多次元 NMR法の蛋白質への応用と、それとともに発展した安定 同位体標識蛋白質の大量発現技術よつて現在では分子量力 ¾万程度であればほぼ 誤りのない解析が可會 になつてきた。
しかしながら、これらの従来の手法は全て立体構造決定の精度を犠牲にして高分子 量蛋白質の立体構造情報を得る手法であったため、その適用対象や有用性には限 界があった。この従来の問題点を解消し、さらに蛋白質の重水素置換を残余水素核 の NMR感度を損なうことなく達成し、従来の限界を越えた高分子量蛋白質の NMR スペクトルの迅速'確実な解析、立体構造の高精度決定を同時に達成することを可 能にする発明を、特許文献 1において開示した。し力しながら、この発明では芳香族 アミノ酸の芳香環部位の標識パターンに関する指定はな力つた。
[0003] 一方、 Phe、 Tyr、 Trpなどの芳香族アミノ酸は、 Leu、 Val、 lieなど長鎖アルキル基を 持つアミノ酸類とともに球状蛋白質の疎水性コア部分の立体構造形成において重要 な部分を担っている。また、これらの芳香族アミノ酸は、 Tyrの水酸基、 Trpのインドー ル窒素などの官能基、或いは芳香環に共通するパイ電子を利用し、蛋白質の立体 構造形成のみならず、基質認識をはじめ蛋白質機能の発現に重要な役割を果たし ている。しかしながら、特許文献 1に記載の均一安定同位体 (13C、 15N、 2H)試料、或 いは天然存在比（非標識)試料を用いると、芳香族アミノ酸、特に Pheや Trpなどでは 環部分のプロトン NMRシグナルは互 、ィ匕学シフトが近接し、またそれらの結合する炭 素（13c)間の化学シフトも近接するために均一標識体においてはシグナルが極めて 複雑となり、 NMR測定感度が低下し、また各シグナルを個別に観測し、配列帰属を行 うことを困難としている。
これらの困難さを乗り越え、立体構造決定にとって重要な距離制限情報である芳香 環プロトンを含む核オーバーハウザー (NOE)効果を収集し、また芳香環の局所的構 造情報を精密に計測するための手法が様々試みられてきた。し力しながら、従来の 手法は全て試料調製が容易である均一安定同位体 (13C、 15N、 2H)試料を対象に開 発されてきたものば力りであり、実用的にみて優れた手法はこれまで存在していなか つ 7こ。
[0004] 特許文献 1：国際公開 WO03/053910A1公報
発明の開示
[0005] 本発明は、従来の均一標識アミノ酸残基が NMR解析を困難にする最も大きな理由 であった芳香環 NMRシグナルの複雑さを取り除き、その感度を著しく向上させること ができる安定同位体標識芳香族アミノ酸を提供することを目的とする。
本発明は、主鎖シグナルの連鎖帰属を環部分にまで展開するための標識パターン をもった芳香族アミノ酸を提供することを目的とする。 本発明は、標的蛋白質を構成するアミノ酸の全てが、安定同位体標識アミノ酸とな つている、安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを提供することを目的とする。
本発明は、安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法を提供するこ とを目的とする。
本発明は、安定同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法を提供す ることを目的とする。
本発明は、一層感度の向上した蛋白質の NMR構造決定方法を提供することを目的 とする。
[0006] 本発明者らは、上記課題を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、特許文献 1と は、 C β炭素シグナルを経由して主鎖の NMRシグナルの連鎖帰属と関連付けること を考慮し、遠隔13 C-13C及び遠隔13 C」Hスピン結合による磁ィ匕移動経路を十分確保 することにより、すなわち、直接に結合する炭素の化学シフトが近接する可能性が高 い場合には両方とも13 Cで標識することを避け、しかも非標識 (12c)炭素部分の水素は 選択的に重水素化することにより、 1H-NMRのみならず、 13C- NMRスペクトルも高次の スピン結合による複雑さを回避できるとの知見により、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、下記から選ばれる安定同位体標識アミノ酸を提供する。 式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基を構成する残り 5つの炭素原子のうち 2— 4個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しているこ とを特徴とする安定同位体標識フエ二ルァラニン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基のヒドロキシル基 (OH基）に結合する炭素原子が12 C又は13 Cであり、該フエ- ル基を構成する残り 4つの炭素原子のうち 2— 4個の炭素原子が12 Cであり、これに重 水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合していることを 特徴とする安定同位体標識チロシン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するインドリル基の炭素原子が13 Cであり、該イン ドリル基を構成する残り 7つの炭素原子のうち 1一 5個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、 該インドリル基を構成する NH基の窒素原子が15 N又は14 Nであることを特徴とする安 定同位体標識トリブトファン、及び
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するイミダゾリル基の炭素原子が13 Cであり、該ィ ミダゾリル基を構成する残り 2つの炭素原子の両方の炭素原子が13 Cであってこれに 水素原子が結合して 、るか、片方の炭素原子が12 Cであってこれに重水素が結合し ており、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、該イミダゾリ ル基を構成する 2つの窒素の 1つが15 Nであり残りが14 Nであって、 NH基を構成する 水素原子が重水素ではないことを特徴とする安定同位体標識ヒスチジン。
- ^ (X) (Y)- 2C (Z) (15NH) (*3COOH) (A)
(式中、 rtc、 *2C及び *3Cは、それぞれ12 C又は13 Cを示し、 X、 Y及び Zは、それぞれ水 素原子又は重水素原子を示す。 )
[0008] 本発明は、又、標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸が、上記安定同位体標識芳 香族アミノ酸であり、標的蛋白質を構成する脂肪族アミノ酸が、次の標識パターン
(a)水素原子を 2つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一 つが重水素化されている、
(b)プロキラルな gem—メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素 が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されて 、る、
(d)上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他 は重水素化されて 、る力、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されて 、る
(e)上記 (a)、 (b)及び (d)にお 、て重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメ チレン基および/またはメチル基の炭素の 15原子0 /0以上が13 Cに置換されているか 、全てが12 Cになっている、
(f)窒素が全て15 Nに置換されて 、る
を満たす安定同位体標識脂肪族アミノ酸であることを特徴とする標的蛋白質を構成 する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを提供する。
[0009] 本発明は、又、上記安定同位体標識芳香族アミノ酸の標的蛋白質への組み込み 方法であって、無細胞蛋白質合成により組み込むことを特徴とする安定同位体標識 アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法を提供する。
本発明は、又、標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として上記安定同位体標識ァ ミノ酸の組み合わせを用いて、無細胞蛋白質合成を行うことを含む、安定同位体標 識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法を提供する。
本発明は、又、上記安定同位体標識アミノ酸を標的蛋白質に組み込み NMRスぺ タトルを測定して構造解析することを含む蛋白質の NMR構造解析方法を提供する。 本発明は、又、標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が上記安定同位体標識アミノ 酸で置換されてなる標的蛋白質の構造を NMRスペクトル測定により解析することを 含む標的蛋白質の NMR構造解析方法を提供する。
発明を実施するための最良の形態 [0010] 本発明においては、基本的には直接に結合する炭素の化学シフトが近接する可能 性が高い場合には両方とも13 Cで標識することを避け、しかも非標識 (12c)炭素部分 の水素は選択的に重水素化することにより 1H -NMRのみならず、 13C- NMR ^ベクトル も高次のスピン結合による複雑さを回避でき、し力も、 C|8炭素シグナルを経由して主 鎖の NMRシグナルの連鎖帰属と関連付けることを考慮し遠隔13 C-13C及び遠隔13 C-1 Hスピン結合による磁ィ匕移動経路を十分確保する設計が必要であるため、フエニルァ ラニン (Phe)に関しては以下に示した 3種類を設計し合成した。
(1) [γ, ε 1, ε 2- 13C； δ 1, δ 2, ζ ~Η ]- Phe： 'Η ε - 13C γ間のスピン結合定数が
3 3
7Hz程度と比較的大きいことを利用し、環プロトンの化学シフトを C βひいては主鎖シ グナルへと関連付けることをめざしたものである。
(2) [γ,ζ— 13C； δ 1, 62, ε 1, ε 2~Η ]— Phe： 13C ζ— 13C βのスピン結合が 9Hz程度
2 4
と大きい事を利用すし環プロトンの化学シフトを C βひいては主鎖シグナルへと関連 付けることをめざしたものである。
(3) [γ, δ 1, δ 2-13C； ε 1, ε 2, ζ ~Η ]- Phe： 13C δ - 13C y間の大きなスピン結合 (約
3 3
60Hz)を利用し環プロトンの化学シフトを C βひいては主鎖シグナルへと関連付ける ことをめざしたものである。
[0011] V、ずれの場合もプロトン間のスピン結合は観測されな 、ために著しくスペクトルは単 純化され、また感度も大きく向上するなど、 NMR解析上様々な利点が予期される。 チロシン (Tyr)に関しては z位炭素には水酸基が結合して 、るためにもともと1 Hシグ ナルは比較的簡単であるがフエ-ルァラニン (Phe)と同様に
(3) [γ, ε 1, ε 2- 13C； δ 1, δ 2,~Η ]- Tyr
3 2
(4) [γ, δ 1, δ 2- 13C； ε 1, ε 2~Η ]- Tyr
3 2
の二種類を設計した。（1)、（2)は Pheのケースと全く同じ有効性を持つ。
トリブトファン (Trp)に関しては環部分が非対照な双環性であるためにより考慮すベ き要素が多いが、
(5) [ζ2,ζ3;γ,δ,ε 1, ε 2, r? 2] -Tyr
を設計し合成した。
[0012] 本発明は、特許文献 1に開示の同位体方向族アミノ酸の標識パターンとは、 C 炭 素シグナルを経由して主鎖の NMRシグナルの連鎖帰属と関連付けることを考慮し遠 隔 13c-13c,及び遠隔13 C-1Hスピン結合による磁ィ匕移動経路を十分確保するように設 計した点で発想が異なる。
特許文献 1では、メチル基のような磁気的に等価な 1H核力 種類以上あった場合は 、一つの水素を残して他は重水素化されていた。これと同様に Pheや Tyrに関しても δ 1、 δ 2位及び ε 1、 ε 2位の水素核はそれぞれ磁気的に等価であるため、 δ位及 び ε位の水素核の一方を重水素化するといった標識パターンを示していた。しかし ながら、一般にタンパク質内部に存在するアミノ酸側鎖芳香環部位の立体構造はメ チル基のそれとは異なり (R) - (c)軸上（2軸上)で回転することは困難であることから 、芳香環上のプロトンは磁気的に非等価に観測される。そのため特許文献 1に開示 の Phe及び Tyrを用いてタンパク質の構造を解析した場合、その芳香環部位のプロト ン感度従来法に比べても低下する可能性がある。 |8位までの標識パターンは、特許 文献 1におけるものと同じであってもよい。
本発明で用いる安定同位体標識芳香族アミノ酸としては、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基を構成する残り 5つの炭素原子のうち 3又は 4個の炭素原子が12 Cであり、これ に重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合している ことを特徴とする安定同位体標識フエ-ルァラニン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基のヒドロキシル基 (OH基）に結合する炭素原子が12 C又は13 Cであり、該フエ- ル基を構成する残り 4つの炭素原子のうち 3又は 4個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しているこ とを特徴とする安定同位体標識チロシン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するインドリル基の炭素原子が13 Cであり、該イン ドリル基を構成する残り 7つの炭素原子のうち 3— 5個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、 該インドリル基を構成する NH基の窒素原子が15 N又は14 Nであることを特徴とする安 定同位体標識トリブトファン、及び 式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するイミダゾリル基の炭素原子が13 Cであり、該ィ ミダゾリル基を構成する残り 2つの炭素原子の片方の炭素原子が12 Cであってこれに 重水素が結合しており、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合して おり、該イミダゾリル基を構成する 2つの窒素の 1つが15 Nであり残りが14 Nであって、 N H基を構成する水素原子が重水素ではないことを特徴とする安定同位体標識ヒスチ ジンが好ましい。
本発明で用いる安定同位体標識芳香族アミノ酸としては、式 Aで表されるアミノ酸 残基中の C、 *2C及び *3Cは、それぞれ13 Cを示すのが好ましい。より好ましくは、下記 一般式 (1)一 (15)で表される安定同位体標識芳香族アミノ酸である。
d
D -
C H
Figure imgf000008_0001
T HO 1 ¾ D
Η ' 1
D D
Figure imgf000008_0002
(4) (5)
[0015]
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
(15)
(式中、 Cは12 C又は13 Cを示し、 Nは14 N又は15 Nを示し、 Zは水素原子又は重水素原 子を示し、 Rは下記の基
[0016]
尸2 H
3C^ 5NH2
Z Y
[0017] (式中、 X、 Y及び Zは、それぞれ水素原子又は重水素原子を示す。 )である。 ) これらのうち、特に、一般式 (1)、（2)、（3)、（4)、（7)又は (8)で表される安定同位体標識 芳香族アミノ酸が好ましい。
本発明で用いる上記安定同位体標識芳香族アミノ酸は、従来公知の種々化学合 成方法を組み合わせて、又はそれらを改変して合成することができる。例えば、後述 の実施例に例示したような反応スキームに沿って化学合成により調製してもよい。 本発明では、標的蛋白質を構成するアミノ酸として上記安定同位体標識芳香族ァ ミノ酸を用いて、無細胞蛋白質合成を行って安定同位体標識アミノ酸で構成される 標的蛋白質を調製し、その NMR ^ベクトルを測定して蛋白質の構造解析することが できるが、上記安定同位体標識芳香族アミノ酸とともに、標的蛋白質を構成する脂肪 族アミノ酸が、（a)— (Dの標識パターンを満たすものである安定同位体標識脂肪族アミ ノ酸と組み合わせて用いるのが好まし 、。
ここで、（a)— (1)の標識パターンを満たすものである安定同位体標識脂肪族アミノ酸 としては、（a)、（b)及び (d)において重水素化された後において、水素原子を持つメ チレン基およびメチル基の炭素の全てが13 Cに置換されて 、るものが好まし 、。又、 安定同位体標識脂肪族アミノ酸のカルボニル基及びグァ-ジル基を構成する炭素 力 S13Cに置換されているものが好ましい。又、（a)、（b)及び (d)において重水素化され た後にお 、て、水素原子を持つメチレン基およびメチル基の炭素の13 C/12Cが 15/8 5 (原子比）以上又は全てが12 Cになって 、るのが好ま U、。
尚、（a)— (Dの標識パターンを満たすものである安定同位体標識脂肪族アミノ酸とし て特に好ましいものは、特許文献 1の図 1にその構造式が記載されており、又、特許 文献 1に記載の方法により、容易に調製することができる。尚、特許文献 1の記載内 容は本明細書の記載に含まれるものとする。図 1中、安定同位体標識脂肪族アミノ酸 には、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸も含まれる。参考のため、特許文献 1の図 1〖こ 示された安定同位体標識脂肪族アミノ酸を図 1に示す。
NMRによる蛋白質の構造解析のために、安定同位体標識アミノを、標的とする蛋 白質に組み込む。この際、標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸のうちで任意に選 定した一つ、複数、或は全てをここで示すような立体構造情報の入手、 NMRスぺタト ル解析を最も有効ならしめるパターンを有する本発明の安定同位体標識芳香族アミ ノ酸で置換することができる。しカゝしながら、標的蛋白質を構成する全ての芳香族アミ ノ酸を、本発明の安定同位体標識芳香族アミノ酸で置換し、さらに、標的蛋白質を構 成する残りの全てのアミノ酸、すなわち、全ての脂肪族アミノ酸も、上記安定同位体 標識ァミノで置換するのが好ましい。標的蛋白質を構成するアミノ酸を安定同位体標 識ァミノで置換することは、従来公知の方法、例えば、培養生物細胞を用いた通常の 高発現蛋白質合成系、有機化学的 ·酵素化学的ペプチド ·蛋白質合成手法、或は無 細胞抽出液を用いる蛋白質調製法などの何れの手法を利用して行うことができる。こ れらのうち、無細胞抽出液を用いる蛋白質合成法が好ましい。すなわち、通常の培 養生物細胞を用いる手法で問題となるアミノ酸代謝による同位体希釈や拡散の制御 が容易であること、また多量合成が困難な標識アミノ酸を極めて高効率で蛋白質に 取り込むことが可能となるからである。
[0019] NMRによるスペクトル測定や蛋白質の構造解析のための手法も様々であってよい 。また、リガンド結合による構造変化部位の特定等も可能である。
いずれにしても、本発明で使用するアミノ酸は、様々な標識パターンを持つことに 最大の特徴があり、それらが蛋白質に取り込まれた際には従来の手法によっては得 ることが困難な蛋白質の立体構造解析が可能になるものである。
本発明では、特許文献 1に記載の立体選択重水素化 (Stereo-selective Deuteration,SSD)、位置選択重水素化 (Regio- selective Deuteration, RSD)、立体 整列重水素化 (Stereo- array Deuteration, SAD)、プロトン濃度最小化
(Proton-density Minimization, PDM)及びテ ~~ T ~~環移転 (Tailored ring-labeling, T RL)を組み合わせることにより蛋白質の立体構造情報の取得に最適なアミノ酸をデザ インすることができる。
本発明の蛋白質の NMR構造解析方法としては、標的蛋白質を構成する全てのァ ミノ酸が上記安定同位体標識アミノ酸、すなわち、芳香族アミノ酸を安定同位体芳香 族アミノ酸で、これ以外のアミノ酸、つまり、脂肪族アミノ酸が上記安定同位体脂肪族 アミノ酸で置換されてなる標的蛋白質の構造を NMRスペクトル測定により解析するこ とを含む標的蛋白質の NMR構造解析方法が好ましい。
[0020] 本発明によれば、次に示す効果が得られる。蛋白質中のアミノ酸残基を重水素標 識することで双極子相互作用を低減させることから、芳香環上のプロトン及びその近 傍にあるプロトンのシグナルの測定感度が向上する。
( 蛋白質中のアミノ酸残基を重水素標識することで双極子相互作用を低減させる ことから、芳香環上のプロトン及びその近傍にあるプロトンのシグナルの測定感度が 向上する。 (ii)主鎖シグナルの連鎖帰属を環部分にまで展開することが可能になり芳香環シグ ナルの配列特異的帰属が可能になる。
(iii) NMR ^ベクトル解析の精度が向上する。
(iv) NMR ^ベクトル解析の解析時間を短縮することができる。
(V)芳香環プロトンの関与した NOEの収集が可能となり従って蛋白質コア部分の立 体構造決定がより精密に可能となる。
(vi)芳香族アミノ酸残基側鎖シグナルを利用した構造決定、構造情報の取得が可 能になり、蛋白質の標識アミノ酸残基近傍の詳細な構造情報を入手することが可能 になる。
(vii)又、本発明の標識芳香族アミノ酸をアミノ酸残基選択的に蛋白質に導入した 場合には、上記 (0— (vi)の効果が期待できる。
以下に、実施例として、様々な標識パターンを持つアミノ酸を用いて標識した蛋白 質の調製と、それらの NMRスペクトルが、立体構造を入手する上でどのような優れた 特徴を有するかに関して例示する。
もちろん、下記の実施例はこの出願の発明についての具体的な理解を得るための 例示であって、これらの例示によってこの出願の発明が限定されることはない。 (実施例 1)
フエ二ルァラニン、チロシン、トリブトファンの安定同位体標識体の合成
アセトンからのフエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファンの安定同位体標識体の合 成フローチャートを図 2に示す。
アセトン (16)から安定同位体標識チロシン (4)の合成 (図 3)
(i)[3,5-13C ]— Diethyl 2,4,6-Trioxoheptanoate (17)
2 ―
文献（1)を参考にして合成を行った。 [1,3-13C ]-アセトン Οβ) 10g(167mmol)とシユウ
2
酸ジェチルエステル 25ml(l 84mmol)に 21 %-EtONaエタノール溶液 65ml(l 74mmol)を 水浴下、 2時間かけて滴下した。室温で 1時間攪拌後、シユウ酸ジェチルエステル 25ml(184mmol)を加え、水浴下 21%- EtONaのエタノール溶液 65ml(174mmol)を滴下 した。 105°Cで 2時間攪拌しながら溶媒を留去した。 0°Cで濃塩酸 40ml、続いて氷水 140mlを加え、ろ過後、残渣を乾燥し、 [3.5-13C ]-ジェチル 2,4,6-トリオキソヘプタ ンエステル (jj) 27.8g(107mmol,64%)を得た。
(ii)[3,5-13C ;1,3,5,7— 2H ]— 4— Oxo— 4H— Pyrane— 2,6— dicarboxylic Acid(18)
2 4
文献（2)を参考にして合成を行った。ヘプタンエステル (12) 27.8g(107mmol)を conc-DCl 30mlに懸濁し、 102°Cで 24時間攪拌し、冷却、ろ過し、その残渣を冷 D 0 (
2
5ml X 2)で洗浄後、オートクレーブに入れ D 0 200mlに溶かし、 120°Cで 12時間攪拌
2
した。冷却し、室温で 12時間放置し、結晶を析出させた。これをろ過し、残渣をビーカ 一に入れ、油浴下、 110°Cで 2時間、 160°Cで 2時間、乾燥し、 目的の 4-ォキソ -4H-ピ ラン- 2,6-ジカルボン酸 19.1g(lS)(101mmol,94%)を得た。
[0022] (iii)[3,5-13C ;2,3,5,6— 2H ]— 4H— Pyrane— 4— one(_19)
2 4
文献（2)を参考にして合成を行った。 Cu粉末 19.0gを 2N-DC1 10mlと超音波で一分 間処理し、デカンテーシヨン後、 D 0 10mlカ卩え、 160°Cで 1時間、加熱乾燥した。これ
2
とジカルボン酸 a8)19.1g(101mmol)を合わせ、乳鉢で混合し、 D 0 15mlを加え、 160
2
°Cで 1時間加熱後、常圧で蒸留（240°Cで 1時間、 250°Cで 1時間、 260°Cで 3時間、段 階的に加熱）し、 目的の 4-ォキソ -4H-ピラン (!£) 7.39g(72.6mmol,72%)を得た。
(iv)[l,3',5し13 C ;2',3',5',6し2 H ]— Ethyl 4'-hydroxybenzoate(20)
3 4
文献（3)を参考にして合成を行った。ピラン (12)7.39g(72.6mmol)と [1,2,3-13C3]-マ ロン酸ェチルエステル 13.0ml(79.8mmol)を t- BuOD 50mlに溶解し、 t- BuOK
2.9g(17.8mmol)の t-BuOD (80ml)溶液を 105°Cで 1時間かけて滴下した。 105°Cで 18時 間、攪拌後、室温にし、 D 0 150ml、次いで 2N-DC1 50mlをカ卩え、減圧濃縮し、酢酸
2
ェチル 500mlと蒸留水 100mlを加え分液後、有機相を飽和食塩水 100mlで洗浄した。 減圧濃縮し、シリカゲルカラムクロマト（酢酸ェチル：へキサン = 1 : 1)で精製し、ヒドロ キシ安息香酸エステル 10.7g(61.4mmol,37%)を得た。
[0023] (v)[l,3',5し13 C ;2',3',5',6し2 H ]— Ethyl 4'-methoxybenzoate(21)
3 4
文献 (4)を参考にして合成を行った。ヒドロキシ安息香酸エステル 3.39g (19.4mmol)を脱水アセトン 100mlに溶解し、ヨウ化メチル 1.56ml (25.1mmol)と炭酸カリ ゥム 12.1gズ 87.6mmol)をカ卩え、窒素雰囲気下、 75°Cで 16時間攪拌した。蒸留水 30ml を加え、約 30mほで減圧濃縮し、ジェチルエーテル (50ml X 3)で抽出後、減圧濃縮し 、シリカゲルカラムクロマト（酢酸ェチル：へキサン = 1： 1)で精製し、メトキシ安息香酸 エステル (21) 3.40g(18. lmmol,93%)を得た。
(vi) [l,3',5し13 C ;1,2',3',5',6し2 H ]— 4'-methoxybenzaldehyde(22)
3 5
文献 (4)を参考にして合成を行った。メトキシ安息香酸エステル ( )
3.40g(18.1mmol)を脱水 THF 20mlに溶解し、 LiAlDの 1M- THF溶液 19ml(19.0mmol)
4
を 0°Cでカ卩えた。室温で 30分反応後、 1N-HC1 80mlをカ卩え、約 80mlまで減圧濃縮し、 酢酸ェチル (60ml X 3)で抽出後、減圧濃縮し、メトキシベンジルアルコールを得た。ァ ルコールを塩化メチレン 200mlに溶解し、 0°Cでモレキュラーシーブズ 4A 10g、 PCC 3.89g(36.2mmol)を加え、 0°Cで 3時間攪拌し、 30 φのクロマト管に充填し、ノヽィフロス 一パーセルを 12cmカ卩え、ジェチルエーテル 1000mlで溶出後、減圧濃縮し、メトキシ ベンズアルデヒド (22)1.81g(l 1.6ml)を得た。
(vii) [l,2,3,3',5'-13C ;3,2',3',5',6し2 H ;2— 15N ]— 4-methoxybenzylideneazlactone(23)
5 5 1
文献（5)を参考にして合成を行った。 [1,2- 13C； 2-15N ]- N-ァセチルダリシン 1.81g
2 1
(15.1 mmol)にメトキシべンズアルデヒド (22)1.81g (11.6 mmol)と酢酸ナトリウム 900mg (11.0 mmol)と無水酢酸 3mlをカ卩え、窒素雰囲気下, 105°Cで 14時間攪拌した。得られ た混合物を濃縮し、氷浴下、生じた結晶を濾取した後、冷水で洗浄し、減圧乾燥し、 4しメトキシ-ベンジリデンァズラクト (22) 1.23g (5.3mmol,46%)を得た。
(viii)[l,2,3,3',5'-13C ;3,2',3',5',6' -2 H ;2— 15N ] -
5 5 1
dehydro- N- acethyl- 4 -metnoxyphenylalanine methyl ester(24)
文献 (6)を参考にして合成を行った。ァズラタトン (22) 1.23g (5.3mmol)を脱水 MeOH 50mlに溶解し、室温でトリェチルァミン 0.5ml加え、室温で 1時間、攪拌した。 溶媒を減圧留去後、シリカゲルカラム（20 X 70mm)にアプライし、酢酸ェチル 200mlで 溶出した。
溶媒を留去すると目的のデヒドロ体 ( ) 1.03g (3.9mmol,74%)を得た。
(ix)(2S,3R)-[l,2,3,3',5'-13C ;3,2',3',5',6'-2H ;2— 15N ]— N— acethyト 4'— methoxyphenyla
5 5 1
lanine methyl ester(25)
文献（7)を参考にして合成を行った。デヒドロ体 ( ) 1.03g (3.9mmol)を脱水メタノー ル 15mlに溶解し、（S,S)-Et- DuPhos-Rh触媒 55mgを入れ中圧還元装置を用いて水素 圧 2気圧、室温で 12時間攪拌する。シリカゲルカラム（15 X 40mm)にアプライし、酢酸 ェチル 200mlで溶出し、 目的のメトキシフエ-ルァラニンメチルエステル (^を
1.02g(3.8mmol,98%)得た。
(x)(2S,3R)-[l,2,3,3',5'-13C ;3,2',3',5',6'-2H ;2— 15N ]-Tyrosine(26)
5 5 1
文献（8)を参考にして合成を行った。チロシンメチルエステル 1.02 g (3.8mmol) を IN- HC1 50mlに溶解し、 105°Cで 12時間、攪拌した。冷却後、得られた混合物を濃 縮後、 Dowex- 50w- X8にてイオン交換しメトキフエ-ルァラニン 775mg(3.77mmol)を得 た。これとヨウ化ナトリウム 623mg (4.15mmol)を 48%-臭化水素酸 45mlに溶解し、セプタ ムでふたをして針金で堅く止めて、 92°Cで 4時間半攪拌した。室温で冷却後、得られ た混合物を濃縮後、 DoweX-50w-X8にてイオン交換し、チロシン④を得た。
[0025] 安定同位体標識フエ二ルァラニンの合成 (図 4)
(0[1,3',5し13 C ;2', 6し2 H ]- Ethyl 4'-hydroxybenzoate (26)
3 2
文献（9)を参考にして行った。ヒドロキシ安息香酸 ( ) 3.8g(21.9mmol)を 6Ν- HC1 80mlに懸濁し、 102°Cで 12時間、攪拌した。冷却後、溶媒を留去し、氷浴下、塩化チ ォニル 660 1と脱水エタノール 10mlを加え、 90°Cで 4時間攪拌した。溶媒留去後、シ リカゲルカラムクロマト (酢酸ェチル：へキサン = 1： 1)で精製し、ヒドロキシ安息香酸ェ ステル 3.0g(l7.4mmol,80%)を得た。
(ii)[l,3',5'-13C ;2',4',6'-2H ]- Ethyl benzoate (27)
3 3 ―
文献（10)を参考にして行った。ヒドロキシ安息香酸エステル (26) 4.5g(26.2mmol)を 脱水アセトン 120mlに溶解し、室温で 1-フエ-ル- 5-クロロテトラゾール
5.0g(27.7mmol)と炭酸カリウム 22g(159mmol)を加え、 75°Cで 15時間、攪拌した。ろ 過後、ろ液を濃縮、 EtOD 80mlに溶解し、 Pd-C触媒 3.5gを入れ中圧還元装置で水素 圧 4気圧、室温で 12時間攪拌した。溶媒留去後、シリカゲルカラムクロマト (酢酸ェチ ル:へキサン = 1： 1)で精製し、安息香酸エステル ( ) 3.77g(24.0mmol,92 %)を得た。
[0026] (iii)[l,3',5し13 C ;1,2',4',6し2 H ]— benzaldehyde (28)
3 4 ―
文献 (4)を参考にして行った。安息香酸エステル (27) 3.77g(24.0mmol)を無水 THF 100mlに溶解し、 LiAlD 1M- THF溶液 12ml(12.0mmol)を 0°Cでカ卩えた。室温で 30分反
4
応後、 1N-HC1 80mlを加え、約 80mほで減圧濃縮し、酢酸ェチル (60ml X 3)で抽出、 減圧濃縮し、 ベンジルアルコールを得た。アルコールを塩化メチレン 200mlに溶解し、 0°Cでモレキ ユラーシーブズ 4A 10g PCC 3.89g(36.2mmol)を加え、 0°Cで 3時間攪拌し、 30 φのク 口マト管に充填し、ハイフロスーパーセルを 12cmカ卩え、ジェチルエーテル 1000mlで溶 出、減圧濃縮し、ベンズアルデヒド (2g) 1.9g(16.7mmol,69%)を得た。
(iv) [l, 2,3,3', 5'-13C ;1,2',4',6'-2H； 2— 15N ]— benzylideneazlactone (29)
3 4 1 ―
文献（5)を参考にして行った。 [1,2-13C； 2-15N ]-N-ァセチルダリシン (28) 1.50g
2 1 ―
(12.3 mmol)にべンズアルデヒド 1.28g (11.2 mmol)と酢酸ナトリウム 800mg (9.75 mmol) と無水酢酸 3.0mlを加え、窒素雰囲気下で 115°Cで 2時間攪拌した。得られた混合物 を濃縮し、氷浴下、生じた結晶を濾取後、冷水で洗浄し、減圧乾燥し、ベンジリデン ァズラタトン (22) 1.28g (6.5mmol,58%)が得られた。
(v) [l, 2,3,3', 5'-13C ;1,2',4',6'-2H； 2— 15N ]— dehydro—N—acethv卜 phenylalanine
3 4 1
methyl ester (30)
文献（6)を参考にして行った。ァズラタトン (22) 1.28g (6.5mmol)を脱水 MeOH 50ml に溶解し、室温でトリェチルァミン 500ulカ卩え、室温で 1時間、攪拌した。溶媒を減圧 留去後、シリカゲルカラム（25 X 40mm)にアプライし、酢酸ェチル 300mlで溶出した。 溶媒を留去すると目的のデヒドロ体 l-18g (5.1mmol,78%)を得た。
[0027] (vi)[l, 2,3,3', 5'-13C ;1,2',4',6 2 H； 2— 15N ]— N—acethy卜 phenylalanine methyl ester (
3 4 1
31)
文献（7)を参考にして行った。デヒドロ体 ( ) 1.46g (6.4mmol)を脱水メタノール 20ml に溶解し、（S,S)- Et- DuPhos- Rh触媒 35mgを入れ中圧還元装置で水素圧 2気圧、室 温で 16時間攪拌した。シリカゲルカラム（20 X 55mm)にアプライし、酢酸ェチル 200ml で溶出し、 目的のフエ-ルァラニンメチルエステル (ai)を 1.40g(6.0mmol,95%)を得た
(vii)[l,2,3,3',5'-13C ;1,2',4',6'-2H； 2— 15N ]— Phenylalanine (1)
3 4 1 一
フエ-ルァラニンメチルエステル (^1) 1.40 g (6.0mmol)を IN- HC1 50mlに溶解し、 105 °Cで 12時間、攪拌した。冷却後、得られた混合物を濃縮後、 DoweX-50w-X8にてィォ ン交換し、フエ-ルァラニン (1) 1.10mg(5.97mmol,99%)を得た。
[0028] 安定同位体標識トリブトファン (8)の合成憫5) (i) benzoicacid (32)
標識安息香酸エステル (27)に 2N水酸ィ匕ナトリウム水溶液を加え室温で終夜撹拌し た。
反応溶液に塩酸を加えた後塩化メチレンを用いて抽出した。有機層を乾燥後濃縮し た。
(ii) Aniline (34)
NaOH (7.2eq, 7.418g)を冷水（38ml)に溶解し、 0°Cに冷却した。
KMn04(15.49mmol, 2.45g)に concHCl(lOcc)を滴下し、生じた塩素ガスを NaOH溶液 中に吹き込んだ。そこに標識べンズアミド (33) (2.63 g, 20.76 mmol)をカ卩えた後、 100 °Cに昇温し 1時間撹拌した。反応溶液をエーテルにより抽出し有機層を Na SOで乾
2 4 燥後ろ過した。エーテル溶液に dryHClガスを吹き込、み生じたァ-リン塩酸塩をろ 過した。結晶に重水を加え濃縮後、さらに重水（60ml)を加え、耐圧管を用いて 120 度で 2日撹拌した。反応溶液を 0°Cに冷却後 2N-NaOH20ml)をカ卩ぇ塩化メチレンで 抽出、有機層を乾燥後濃縮しァ-リン (34)を得た。収量 16.8mmol
(in)inaole (35)
文献 11を参考にして合成した。ァ-リン (34) (16.8mmol)を塩化メチレンに溶解し、 - 70°Cに冷却した後、別途合成した tBuOCl (16. 8mmol)の塩化メチレン溶液（8ml) を滴下し 70°Cで 15分撹拌した。反応溶液に別途合成した MeSCH CO Et (
2 2
16.8mmol)の塩化メチレン溶液（8ml)を 1時間以上かけて滴下し、さらに 2時間撹拌し た。得られた反応溶液に TEA (16.8mmol)の塩化メチレン溶液 (8ml)を 30分以上かけ て滴下し同温度で 15分撹拌した後室温まで昇温した。水 10mlをくわえ 15分撹拌した 後、濃縮後、エーテル（20ml)、 2MCH1 ( 13ml)をカ卩え、エーテルで抽出し、乾燥濃 縮した。得られた化合物（4.25mmol)を HMPA (5ml)に溶解し、アルゴン中 LR試薬（ 2.1mmol)をカ卩えた。後処理後、 Ra- Ni (4杯）、 MeOH (60ml)をカ卩ぇ 1時間加熱還流し た。デカンテーシヨンにより RaNiを取り除き、溶液を濃縮、乾燥後カラムクロマトグラフ ィー（3cm)により精製しインドール (35)を得た。収量 3.76 mmol 収率 88%
(iv)indole-3-carboxyaldehyde (36)
[a-2H; a-13C]-DMF(7.52 mmol)を THF(4 ml)に溶解し、氷浴下で攪拌溶液中にォキ シ塩化リン (3.76 mmol)を加え、さらにインドール (35) (3.76 mmol)を溶解した THF(50 ml)溶液を加え、室温で 3時間攪拌した。 TLCで反応の終了を確認後、氷浴下で冷却 し、水 (30 ml)と 2M-水酸ィ匕ナトリウム水溶液をアルカリ性になるまでカ卩え、塩化メチレ ン-メタノール溶液 (95:5)(100 mix 3 )で抽出後、飽和塩ィ匕ナトリウム水溶液 (100 mix 3)で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。吸引濾過後、溶媒を留去し、シリカ ゲルカラムクロマトグラフィーにて精製し (展開溶媒 塩化メチレン:メタノール =94:6)、 アルデヒド (36)が得られた。収量 2.68mmol収率 71%
[0030] (v)Tryptophane (8)
[12,-13C； 2- 15N]- N-ァセチルグリシン (3.4mmol)にインドール- 3-カルボキシアルデ
2
ヒド (35) (2.86 mmol)と酢酸ナトリウム (5.15mmol)と無水酢酸 (20mmol)を加え、アルゴン 雰囲気下 120°Cで 8時間攪拌した。得られた混合物を氷浴下で冷却し、生じた結晶を 濾取した後、少量の冷水で洗浄し、減圧下で乾燥した、得られた結晶を 0.5M-炭酸 ナトリウム水溶液 (20 ml)に加え、 140°Cで 4時間還流した。氷浴下で冷却後、不溶物を ノ、ィフロスーパーセルを用いた吸引濾過により除去し、冷濃塩酸を酸性になるまで加 え、結晶を濾取した後冷水で洗い、減圧下で乾燥し N-ァセチルデヒドロトリブトファン が得られた。 N-ァセチルデヒドロトリプトファンをエタノール (30 ml)に溶解し、 PtO
2
(0.05 g)を加え、室温、常圧 (1 atm)で水素添カ卩を行った。 10日後に1 H- NMRにより原 料の消失を確認後、ハイフロスーパーセルを用いた吸引濾過により触媒を除去した 後溶媒を留去し、減圧下で乾燥し、 N-ァセチルトリブトファンが得られた。得られた N- ァセチルトリプトファンを 1M-水酸ィ匕ナトリウム水溶液 (50 ml)に溶解し、 1M-塩酸 (50ml)をカ卩えた後、無水塩化コバルト (10 mg)をカ卩えた。これに 1M-水酸化ナトリウム水 溶液あるいは 1M-塩酸を注意深く加え pH 8に調整し、糸状菌由来のアシラーゼ (150 mg)をカ卩え、 37°Cで 3日間攪拌した。ハイフロスーパーセルを用いた吸引濾過により触 媒を除去し、水を留去した後、 2M-塩酸を pH 1になるまで加え、ァセチル体を結晶化 し濾取した。濾液を濃縮後、 Amberlite CG50にてイオン交換し、トリプトファン
(8X0.315 g, 1.529 mmol)と N-ァセチル- D-トリプトファンが得られた。
[0031] 安定同位体標識ヒスチジン (48)の合成 (図 6)
(0グリシン (ai) (7.50g、 100 mmol)をメタノールに懸濁させ、氷冷下で SOC1 (11.9g、 100 mmol)を滴下した後約 1時間 refluxした。メタノールを加えて濃縮することを数回 繰り返すことにより ( )の塩酸塩の結晶をほぼ定量的に得た。
(ii) PhCH Br (17.1g、 100 mmol)を THF (lOOml)に溶解し、よく攪拌しながら Et N (
2 3
20.2g、 200 mmol)を加えた。しばらくして力ゝら基質 ( )をカ卩え、室温でー晚攪拌した 。反応後 Et NHBr塩をろ過して取り除き、ろ液を濃縮して目的物（39)を得た（15.1g、
3
84.4 mmol、 84.4%) 0
(iii)氷冷下で、基質 (22)をギ酸 (45ml)に溶解し、無水酢酸 (45ml)を少しずつ加えた。 100°Cで約 1一 2時間加熱した後濃縮し、ギ酸と酢酸を飛ばした。塩化メチレンを加え て抽出し、有機相を飽和 NaHCO水溶液で 4回洗った後、水で洗い、飽和 NaCl水溶
3
液で洗った。有機相を Na SOで乾燥し、濃縮した。シリカゲルカラム (展開溶媒 へキ
2 4
サン：酢酸ェチル = 2： 1)で精製することにより目的物（40)を得た（8.12g、 39.1 mmol 、 46.3%)。
[0032] (iv) N気流下、基質 (40)(17.17g、 81.7mmol)に H13COMe 12.4g(203.2mmol)をカ卩えて
2
氷浴上で攪拌し、 NaOMe(6.61g、 122.5 mmol)と dryトルエン（40ml)をカ卩え、 15°C以下 で約 2時間攪拌した後 0°Cで一晩放置した。反応混合物に、 dryエーテルを加え、析 出してきた Na塩 ( )の結晶をろ過して回収し、乾燥した（3.51g、 12.9 mmol, 33.0%)。
(v)基質 (41)に、 50%MeOH (70ml)と 12N HC1 (13.6ml)を加え室温でー晚攪拌した後 、 KS13C15N (7.43g、 76.5mmol)をカ卩ぇ 80°Cで 4時間攪拌した。析出してきた結晶をろ過 して回収し乾燥し目的物 (42) (18.5g、 70.9mmol, 87%)を得た。
(vi)基質 (42)(18.5g、 70.9mmol)を dryEtOH (70ml)に溶解し、 raney Ni (約 20g)を dryEtOHに懸濁させて少しずつ加えた。 100°Cで約 1一 2時間加熱した。セライトでろ 過し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展開溶媒 へキサン:酢酸ェチル = 1： 1)で精製して目的物 (43)を得た (8.12g、 39.1 mmol,収率 56.7%)。
[0033] (vii)三つ口に LiAlD (0.41g)と dryTHF (50ml)を加えて、基質 43 (2.18g、 9.8mmol)を
4
dryTHF (15ml)に溶解して加えた。室温で 3時間攪拌し、水（10ml)をカ卩えて反応を止 めた。 6N HC1をカ卩えて pHを 8— 9に合わせて力も塩化メチレンで抽出し、有機相を 飽和食塩水で洗った。 Na SOで乾燥後、有機相を濃縮することにより目的物 (44)を得
2 4
た (0.65g、 3.3mmol、収率 34%)。 (viii)基質 (44)(0.65g、 3.3mmol )をクロ口ホルム（15ml)に溶解し、 MnO (2g)を加え、室
2
温で 2日攪拌した。セライトでろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展開 溶媒 クロ口ホルム:メタノール = 9 : 1)で精製することにより目的物 (45)を得た（0.61g 、 3.1mmol、収率 96.0%)。
(ix)均一標識ホスホリルグリシン（0.4988g, 2.06mmol)を塩化メチレン（5ml)に溶解し 氷浴下で DBU (0.487ml、 3.17mmol)を加え室温で 30分攪拌した後、基質 (45)(0.767g 、 3.17mmol)を塩化メチレン （5ml)に溶解して加え、室温で一晩攪拌した。濃縮後残 渣を酢酸ェチルに溶解して、飽和 NH C1水溶液で洗浄後、 Na SOで乾燥、濃縮する
4 2 4
ことにより目的物 (46)を得た (0.625g、 2.06mmol、収率 65.0%)。
(X)基質 (46)(0.312g、 1.03mmol)を塩化メチレン（5ml)、メタノール（5ml)に溶解し、 Pd/C (0.3g)加えて、室温、 5気圧で水素添加を行った。 3日後にセライトでろ過し、ろ 液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展開溶媒 クロ口ホルム:メタノール = 9： 1)で 精製すること〖こより目的物 (47)を得た (0.205g、 0.957 mmol、収率 92.9%)。
(xi)基質 (47)(0.205g、 0.957mmol)に IN HCl (lOml)を加えて 100°Cでー晚還流した後 濃縮し、ヒスチジン (48)の HC1塩を得た (0.0845g)。
安定同位体標識ヒスチジン (55)の合成 (闵 11)
図 11に示す合成ルートにより、同位体原料として [d-13C;15N]Gly、 2HCO Me及び KS
2
13CNを用い、前述のヒスチジンの合成法を利用して安定同位体標識ヒスチジン (55) を合成した。
(ON気流下、基質 40(7.854g, 37.4mmol)に2 HCOMe (10.87g, 178mmol)を加えて氷浴
2
上で攪拌し、 NaOMe(5.710g、 65.7 mmol)と dryトルエン（44ml)をカ卩えた。 15°C以下で 約 2時間攪拌した後 0°Cで一晩放置した。そのまま濃縮し、 50%MeOH (70ml)と 12N HC1 (13.6ml)をカ卩えて室温でー晚攪拌した。 KS13CN (3.318g, 33.8mmol)を加え、 80 °Cで 4時間攪拌した。析出してきた結晶をろ過して回収し、乾燥した。 (5.065g, 20.0mmol, 41%)
(ii) 基質 49(3.859g, 15.3mmol)を dryEtOH (70ml)に溶解し、 raney Ni (約 20g)を dryEtOHに懸濁させて少しずつ加えた。 100°Cで約 1一 2時間加熱した。セライトでろ 過し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展開溶媒 へキサン:酢酸ェチル = 1 : 1)で精製することにより目的物 2(2.312g, 10.9mmol, 71%)を得た。
(iii)三つ口に LiAlD (0.458g, 10.9mmol)と dryTHF (lOOml)をカ卩えて、基質 50 (2312g,
4
10.9mmol )を dryTHF (15ml)に溶解して加えた。室温で 3時間攪拌し、水（10ml)を加 えて反応を止めた。 6N HC1をカ卩えて pHを 8— 9に合わせて力も塩化メチレンで抽出 し、有機相を飽和食塩水で洗った。有機相を Na SOで乾燥後、濃縮すること〖こより目
2 4
的物 51(1.878g， 9.62mmol, 89%)を得た。
[0035] (iv)基質 51(1.878g， 9.62mmol)をクロ口ホルム（45ml)に溶解し、 MnO (6g)をカ卩え、室
2
温で 2日攪拌した。セライトでろ過し、ろ液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラム (展開 溶媒 クロ口ホルム：メタノール = 9 : 1)で精製し、目的物 52 (1.703g, 8.86mmol, 92% )を得た。
(V)均一標識ホスホリルグリシン（2.150g, 8.87mmol)を塩化メチレン（5ml)に溶解し氷 浴下で DBU (1.350g, 8.87mmol)を加え室温で 30分攪拌した後、基質 52(1.703g, 8.86mmol)を塩化メチレン（5ml)に溶解して加え、室温で一晩攪拌した。濃縮後酢酸 ェチルに溶解して、飽和 NH C1水溶液で洗い、有機相を Na SOで乾燥後、濃縮する
4 2 4
ことにより目的物 53(1.042g, 3.38mmol, 38%)を得た。
(vi)基質 53(0.398g, 1.29mmol)を塩化メチレン（15ml)、メタノール（15ml)に溶解し、 Pd/C (0.7g)加えて、室温、 5気圧で水素添加を行った。 3日後にセライトでろ過し、ろ 液を濃縮することにより目的物 54(0.247g, 1.20mmol, 93%)を得た。
(vii)基質 54(0.247g, 1.20mmol)に IN HCl (lOml)をカ卩えて 100°Cでー晚還流した後 濃縮し、ヒスチジン 55の HC1塩を得た (0.240g)。
[0036] (実施例 2) NMR測定解析
背景説明で述べたように、球状蛋白質は Phe,Trp,Tyrなどの芳香族アミノ酸と Leu、 Val、 lieなどのアルキル側鎖を持つアミノ酸カゝら構成される疎水性コア部分を有するも のが多い。従って、 NMR法により蛋白質の立体構造を決定する場合にはこれらのアミ ノ酸相互がどのような相対的位置関係にある力を知るための距離制限を実験的に求 める必要がある。通常はこのような距離制限は 1H-1H間の双極子相互作用が空間 距離の三乗分の一に比例することを利用した核オーバーハウザー効果 (NOE;
nuclearOverhauser effect)を各水素核（プロトン） NMRシグナルに関して実験的に求 めることによって得られる。本発明は要約すれば、従来は NOE測定実験上の制約に より、 NMR構造解析の対象となり得なカゝつた高分子量蛋白質に関して、特に構造決 定実験上不可欠である芳香族アミノ酸水素核を含む NOEの測定をより感度良ぐしか も正確に行うことを可能とするものである。本発明の新規安定同位体標識芳香族アミ ノ酸類を添加した培地を用いて、微生物或いはその他の細胞を培養し、それらの生 産する蛋白質、或いは外来遺伝子として組み込まれた蛋白質中のアミノ酸残基を特 異的に標識することができる。培養中の希釈などを避け、また標識アミノ酸に対する 蛋白質収量を高めるためには生細胞を培養するよりも、むしろそれらの細胞中の蛋 白質合成因子を抽出し、外来遺伝子を発現させる、いわゆる無細胞蛋白質発現系を 用いることが好ましい。このようにして得られた、新規標識芳香族アミノ酸を組み入れ た蛋白質試料がいかに従来の均一同位体標識試料と比べて NMR解析に利点を有 するかを説明するために、 NOE測定の実験プロセスを簡単に説明する。
高分子量蛋白質には通常複数の芳香族アミノ酸が含まれているために、芳香環 NMR ^ベクトル領域は数多くの Phe、 Tyr、 His, Trpなどのシグナルが重なり合って現 れ、芳香環のどの部位に由来するシグナルであるの力 或いはアミノ酸配列上どの位 置の残基に由来するのかを決定する"シグナルの配列帰属〃は著しく困難である。こ のための天然に存在する炭素（12C)を NMR核である13 Cに全て置換した均一13 C標識 試料を調製し、 観測軸に13 C観測軸を加えた多核種多次元 NMR技術を利用する ことが不可欠である。しかしながら、これらの既存の手法（参考文献： a) Rueterjans et al, b) Baxet al, c)Kay et al.など)においては比較的低分子量蛋白質であっても数日 力 一週間程度の測定時間を要し、し力もその結果含まれる全ての芳香族アミノ酸残 基のシグナルを観測 ·帰属することは極めて稀である。本発明で合成された新規標 識芳香族アミノ酸においては直接に結合した炭素間のスピン結合を通した磁ィ匕移動 が芳香環部分ではスピン系の複雑さのために効率的に行えない場合には、磁ィ匕移 動に十分な大きさを持つ遠隔13 C間、 13c-1H間のスピン結合定数を帰属に利用する 設計がなされている。また、芳香環上の水素核と近隣のアミノ酸残基との NOEを用い て構造決定する場合には必ずしも芳香環上の水素核全ての NOE情報が不可欠でな ぐむしろ各芳香環に少なくとも一つの水素核が残存していれば構造決定には十分 な NOE情報が入手できる。従って、 Pheを例に挙げて説明すればタイプ (1)の標識体 では C ε、 C γのみが、タイプ (2)では C γ - C ζのみが13 C標識されているために直接 結合した13 C-13Cスピン結合を除去するための定間隔（constant time) HSQCの代わり に通常の HSQCを利用できる利点が生じる（図 5)。
[0038] さらに環上の水素核は13 C標識部位以外全て重水素化されているために1 H-1!" [間の スピン結合は存在せず、また1 H-1!"!間の双極子相互作用が無くなるためにシグナル の線幅が著しく鋭くなり、従って測定感度は著しく向上する。これらの飛びラベル芳 香族アミノ酸においては極めて高分子量の蛋白質に有効とされている1 H-13C TROSY(Transverse Relaxation uptimized Spectroscopyノの適用【こも従来の J¾一標識 体と比較して遥かに有効に利用できる（図 6)。芳香環水素核の NMRシグナルは全て y位の13 C NMRシグナルを経由し C β及び Η βと関連付けられ、従って通常の手法 により主鎖 NMRシグナルの帰属に関連付けることが可能となる（図 7、図 8)。タイプ (3) の芳香族アミノ酸においては C y -C δ文字間に13 C -13C結合を有するがこれらの炭 素は一般的に化学シフトが十分大きく磁ィ匕移動に大きな障害はなぐむしろ大きな 1J (13C-13C)を通して H δの配列帰属を行うことができる利点がある。帰属の完了した芳 香環シグナルと空間的近い水素核との ΝΟΕの観測は飛びラベル芳香族アミノ酸を利 用し13 C NMRィ匕学シフト軸を含む 3D 13C NOESY法を利用することにより高感度で行う ことができる。通常の二重均一13 C,15N-標識試料を用いた実験では原理的には全て の1 H核が観測されるためにより多くの NOEシグナルが見られるはずである力 実際 には以上述べた様々な問題点力 芳香環部分の NOEシグナルは観測 ·帰属が困難 であり、本発明によって得られる NOEは蛋白質の精密な立体構造決定に極めて有用 な距離制限となる。
[0039] (参考文献）
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[図 1]本発明で用いるのが好ましい安定同位体標識脂肪族アミノ酸を示す。
[図 2]アセトン力もフエ-ルァラニン、チロシン、トリプトファンの安定同位体標識体の 合成経路の概略図を示す。
[図 3]アセトン ( )から安定同位体標識チロシン (4)の合成経路を示す。
[図 4]安定同位体標識フエ-ルァラニン )の合成経路を示す。
[図 5]安定同位体標識トリブトファン (8)の合成経路を示す。
[図 6]安定同位体標識ヒスチジン (48)の合成経路を示す。
[図 7]Tyr選択標識カルモジュリンの 1H—13 C(ct-)HSQCスペクトルを示す。
[図 8]Phe選択標識カルモジュリンの lH-13C(ct-)TROSYスペクトルを示す。
[図 9]Phe選択標識カルモジュリンの H εプロトン帰属ステップを示す。
[図 10]Tyr及び Phe選択標識カルモジュリンの Η εプロトン帰属ステップを示す。
[図 11]安定同位体標識ヒスチジン (55)の合成経路を示す。
[図 12]安定同位体標識ヒスチジン (55)を取り込んだタンパク質 (MBP : Maltose
Binding Protein)の1 H—13 CHSQCスペクトルを示す。
[図 13]安定同位体標識トリブトファン (8)を取り込んだタンパク質 (EPPI)の1 H-13C HSQCスペクトルを示す。

Claims

請求の範囲
[1] 下記力 選ばれる安定同位体標識芳香族アミノ酸。
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基を構成する残り 5つの炭素原子のうち 2— 4個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しているこ とを特徴とする安定同位体標識フエ二ルァラニン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基のヒドロキシル基 (OH基）に結合する炭素原子が12 C又は13 Cであり、該フエ- ル基を構成する残り 4つの炭素原子のうち 2— 4個の炭素原子が12 Cであり、これに重 水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合していることを 特徴とする安定同位体標識チロシン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するインドリル基の炭素原子が13 Cであり、該イン ドリル基を構成する残り 7つの炭素原子のうち 1一 5個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、 該インドリル基を構成する NH基の窒素原子が15 N又は14 Nであることを特徴とする安 定同位体標識トリブトファン、及び
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するイミダゾリル基の炭素原子が13 Cであり、該ィ ミダゾリル基を構成する残り 2つの炭素原子の両方の炭素原子が13 Cであってこれに 水素原子が結合して 、るか、片方の炭素原子が12 Cであってこれに重水素が結合し ており、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、該イミダゾリ ル基を構成する 2つの窒素の 1つが15 Nであり残りが14 Nであって、 NH基を構成する 水素原子が重水素ではないことを特徴とする安定同位体標識ヒスチジン。
- ^ (X) (Y)- 2C (Z) (15NH) (*3COOH) (A)
(式中、 rtc、 *2C及び *3Cは、それぞれ12 C又は13 Cを示し、 X、 Y及び Zは、それぞれ水 素原子又は重水素原子を示す。 )
[2] 式 A中の "C、 *2C及び *3Cが、それぞれ13 Cを示す、請求項 1記載の安定同位体標 識芳香族アミノ酸。
[3] 下記一般式 (1)一 (15)で表される請求項 1記載の安定同位体標識芳香族アミノ酸 フ; tf レ 7^=^
EX
f DtΤΗl 1 '1
TN HN.ひI 丫 H
H 、 ¾ r¾ / )
f N H H I D
CD (2) (3)
H
3
H
D
Figure imgf000026_0001
ト ト
R
D'
Figure imgf000026_0002
H ノ D
R 1 、 R
(15)
(式中、 Cは12 C又は13 Cを示し、 Nは14 N又は15 Nを示し、 Zは水素原子又は重水素原 子を示し、 Rは下記の基
Figure imgf000027_0001
(式中、 X、 Υ及び Ζは、それぞれ水素原子又は重水素原子を示す。）である。 ) [4] 一般式 (1)、（2)、（3)、（4)、（7)又は (8)で表される請求項 3記載の安定同位体標識芳 香族アミノ酸。
[5] 標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸が、請求項 1一 4のいずれか 1項記載の安定 同位体標識芳香族アミノ酸であり、標的蛋白質を構成する脂肪族アミノ酸が、次の標 識パターン
(a)水素原子を 2つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一 つが重水素化されている、
(b)プロキラルな gem—メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素 が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されて 、る、
(d)上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他 は重水素化されて 、る力、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されて 、る
(e)上記 (a)、 (b)及び (d)にお 、て重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメ チレン基および/またはメチル基の炭素の全てが13 Cに置換されている、
(f)窒素が全て15 Nに置換されて 、る
を満たす安定同位体標識脂肪族アミノ酸であることを特徴とする標的蛋白質を構成 する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[6] (e)上記 (a)、 (b)及び (d)にお 、て重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメ チレン基およびメチル基の炭素の全てが13 Cに置換されている、請求項 5記載の安定 同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[7] 安定同位体標識脂肪族アミノ酸のカルボ-ル基及びグァ-ジル基を構成する炭素 力 S13Cに置換されて 、る、請求項 6記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。 [8] 標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸が、請求項 1一 4のいずれか 1項記載の安定 同位体標識芳香族アミノ酸であり、標的蛋白質を構成する脂肪族アミノ酸が、次の標 識パターン
(a)水素原子を 2つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一 つが重水素化されている、
(b)プロキラルな gem—メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素 が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されて 、る、
(d)上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他 は重水素化されて 、る力、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されて 、る
(e)上記 (a)、 (b)及び (d)にお 、て重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメ チレン基および/またはメチル基の炭素の 15原子0 /0以上が13 Cに置換されている、
(f)窒素が全て15 Nに置換されて 、る
を満たす安定同位体標識脂肪族アミノ酸であることを特徴とする標的蛋白質を構成 する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[9] 標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸が、請求項 1一 4のいずれか 1項記載の安定 同位体標識芳香族アミノ酸であり、標的蛋白質を構成する脂肪族アミノ酸が、次の標 識パターン
(a)水素原子を 2つ有するメチレン基が存在する場合には、メチレン水素のうちの一 つが重水素化されている、
(b)プロキラルな gem—メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水素 が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されて 、る、
(d)上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他 は重水素化されて 、る力、又は該メチル基の全てのメチル基が重水素化されて 、る
(e)上記 (a)、 (b)及び (d)にお 、て重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメ チレン基および Zまたはメチル基の炭素の全てが12 Cである、
(f)窒素が全て15 Nに置換されて 、る を満たす安定同位体標識脂肪族アミノ酸であることを特徴とする標的蛋白質を構成 する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[10] 請求項 1一 4のいずれか 1項記載の安定同位体標識芳香族アミノ酸の標的蛋白質 への組み込み方法であって、無細胞蛋白質合成により組み込むことを特徴とする安 定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法。
[11] 請求項 5— 9のいずれか 1項記載の安定同位体標識芳香族アミノ酸の標的蛋白質 への組み込み方法であって、無細胞蛋白質合成により組み込むことを特徴とする安 定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法。
[12] 標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として請求項 5— 9のいずれか 1項の安定同 位体標識アミノ酸の組み合わせを用いて、無細胞蛋白質合成を行うことを含む、安定 同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法。
[13] 請求項 1一 4のいずれか 1項記載の安定同位体標識アミノ酸を標的蛋白質に組み 込み NMRスペクトルを測定して構造解析することを含む蛋白質の NMR構造解析方 法。
[14] 標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項 5— 9のいずれ力 1項記載の安定同 位体標識アミノ酸で置換されてなる標的蛋白質の構造を NMRスペクトル測定により 解析することを含む標的蛋白質の NMR構造解析方法。
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