WO2007099934A1 - 安定同位体標識脂肪族アミノ酸、その標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質のｎｍｒ構造解析方法 - Google Patents

安定同位体標識脂肪族アミノ酸、その標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質のｎｍｒ構造解析方法 Download PDF

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Tsutomu Terauchi
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    • C07B2200/05—Isotopically modified compounds, e.g. labelled

Definitions

  • the present invention relates to a stable isotope-labeled aliphatic amino acid useful for NMR structural analysis of proteins, a method for incorporating the same into a target protein, and a method for analyzing the NMR structure of a protein.
  • the NMR method is currently the only method for observing the three-dimensional structure and movement of proteins in solution with atomic resolution.
  • Research based on the three-dimensional structure of this protein is being actively used not only in basic research fields such as universities and research institutes, but also in industrial applications such as drug discovery.
  • NMR is a powerful new technology that was developed only about 20 years ago, and has a number of barriers that must be overcome.
  • One of these problems is the problem of the molecular weight limit of the NMR method (Non-patent Document 1).
  • Patent Documents 1 and 2 are techniques that enable high-precision automatic analysis of a protein having a molecular weight of about 40,000 that exceeds the molecular weight limit, as well as being able to determine the structure with high precision. In the future, there is a need for the development of new technologies capable of precise structural automatic analysis of high molecular weight proteins and membrane proteins exceeding 60 kDa.
  • Non-patent Document 2 the residual signal sensitivity of the protein was further improved by efficiently increasing the deuterium density of the protein, and the molecular weight limit was extended from the conventional 30 kDa to 40 kDa or more.
  • Non-patent Document 2 The structure of high molecular weight proteins exceeding 60 kDa
  • the structure analysis cannot be easily analyzed simply by applying conventional SAIL amino acids because of the increase in signal line width due to the decrease in molecular mobility and the overlap of signals due to the increase in the number of signals.
  • the membrane protein dissolves in the presence of lipids and surfactants, so that the substantial molecular weight increases and the protein mobility decreases. Analysis was not as easy as high molecular weight proteins. For these reasons, development of a means for acquiring structural information on membrane proteins and high molecular weight proteins, which are targets for drug development, is currently awaited.
  • Patent Document 1 International Publication WO03 / 053910A1 Publication
  • Patent Document 2 International Publication WO2005 / 042469A1 Publication
  • Non-Patent Document 1 Wuthrich K (1986), NMR of proteins and nucleic acids. Wiley, New York, Wuthrich K (1991), Structural analysis of protein and nucleic acid by two-dimensional NMR, Tokyo Chemical Doujin
  • Non-Patent Document 2 Kainosho M, Torizawa T, Iwashita Y, Terauchi T, Ono M, Guntert P. Nature 2006; in press.
  • An object of the present invention is to provide a stable isotope-labeled aliphatic amino acid combination that enables structural analysis of high molecular weight proteins, particularly high molecular weight proteins exceeding 60 kDa.
  • An object of the present invention is to provide a stable isotope-labeled amino acid combination that enables structural analysis of a high molecular weight protein.
  • An object of the present invention is to provide a method for incorporating a stable isotope-labeled amino acid into a target protein.
  • An object of the present invention is to provide a method for preparing a target protein composed of a stable isotope-labeled amino acid.
  • An object of the present invention is to provide a method for determining the NMR structure of a protein with further improved sensitivity.
  • Patent Document 1 Deuteration (partial deuteration) of one or more methylene groups of methylene groups in stable isotope-labeled aliphatic amino acids having two or more methylene groups with two hydrogen atoms
  • Patent Document 1 Deuteration (partial deuteration) of one or more methylene groups of methylene groups in stable isotope-labeled aliphatic amino acids having two or more methylene groups with two hydrogen atoms
  • using both deuterated (fully deuterated) of two methylene hydrogens in one or more methylene groups as stable isotope-labeled aliphatic amino acids can further reduce signal overlap. This is based on the knowledge that the above problems can be solved.
  • the present invention provides a stable isotope-labeled amino acid combination characterized in that all aliphatic amino acids constituting the target protein satisfy the following labeling pattern as stable isotope-labeled amino acids.
  • the present invention is also characterized in that arginine (Arg), glutamine (Gin), glutamic acid (Glu), lysine (Lys), methionine (Met), and proline (Pro) satisfy the following labeling pattern.
  • arginine Arg
  • glutamine Gin
  • glutamic acid Glu
  • lysine Lys
  • methionine Metal
  • Pro proline
  • the aliphatic amino acid constituting the target protein is the above stable isotope-labeled aliphatic amino acid
  • the aromatic amino acid constituting the target protein is selected from the following strengths.
  • the carbon atom of the phenyl group bonded to the amino acid residue represented by the formula A is 13 C, and 2 to 4 carbon atoms out of the remaining five carbon atoms constituting the phenyl group are 12 C.
  • the carbon atom of the phenyl group bonded to the amino acid residue represented by the formula A is 13 C, and the carbon atom bonded to the hydroxyl group (OH group) of the phenyl group is 12 C or 13 C.
  • the remaining 4 carbon atoms constituting the phenyl group 2 to 4 carbon atoms are 12 C, deuterium is bonded thereto, and the remaining carbon atoms are 13 C.
  • Stable isotope-labeled tyrosine characterized by the bonding of hydrogen atoms
  • the carbon atom of the indolyl group bonded to the amino acid residue represented by Formula A is 13 C, and 1 to 5 carbon atoms out of the remaining seven carbon atoms constituting the indolyl group are 12 C, Deuterium is bonded to this, the remaining carbon atoms are 13 C, hydrogen atoms are bonded to this, and the nitrogen atom of the NH group constituting the indolyl group is 15 N or 14 N. Featured stable isotope-labeled tributophan, and
  • a carbon atom is 13 C imidazolyl group linked to an amino acid residue of the formula A, both this hydrogen atom a carbon atom 13 C of the remaining two carbon atoms constituting the ⁇ I imidazolyl group Or one carbon atom is 12 C and deuterium is bonded thereto, the remaining carbon atom is 13 C, and a hydrogen atom is bonded thereto,
  • a stable isotope-labeled histidine characterized in that one of the two nitrogen atoms constituting the imidazolyl group is 15 N and the remaining is 14 N, and the hydrogen atom constituting the NH group is not deuterium.
  • the present invention is also a method for incorporating the above stable isotope-labeled amino acid into a target protein, wherein a microorganism or animal or plant cell is cultured using a culture solution to which the amino acid is added, and a gene encoding the target protein is obtained.
  • a stable isotope-labeled amino acid characterized by incorporating Provide a method for incorporation into a target protein.
  • the present invention also provides a method for synthesizing a target protein, comprising using the combination of the stable isotope-labeled amino acids as all amino acids constituting the target protein and synthesizing the target protein by a chemical synthesis method. .
  • the present invention also provides a method for NMR structure analysis of a protein, which comprises incorporating the above stable isotope-labeled aliphatic amino acid into a target protein and measuring the NMR spectrum to analyze the structure.
  • the present invention partially loses the NMR information necessary for determining the precise structure of the protein by further deuteration.
  • the lost signal is estimated from other database groups based on the database. Therefore, it is possible to apply the conventional SA IL method as it is according to the present invention. This makes it possible to more accurately determine the three-dimensional structure of high molecular weight proteins exceeding 50 kDa.
  • stable isotope-labeled aliphatic amino acids having (a), (c), (d) and (e) can be synthesized by the method described in Patent Document 1. it can.
  • the contents described in Patent Document 1 are incorporated in the description of this specification.
  • Arginine (Arg), glutamine (Gin), glutamic acid (Glu), lysine (Lys), methionine (Met), and proline (Pro), which are stable isotope-labeled amino acids having (b) and (d), are defined herein. It can be easily synthesized by the method described in the examples.
  • a stable isotope-labeled aromatic amino acid having the formula A can be synthesized by the method described in Patent Document 2.
  • the contents described in Patent Document 2 are incorporated in the description of this specification.
  • Figure 1 shows the chemical shift distribution of each atom in a lysine residue determined from the BMRB database.
  • the horizontal axis indicates the chemical shift
  • the vertical axis indicates the number of atoms present in the database.
  • the amino acid residue side chain and the overall three-dimensional structure can be determined if the position information of protons in one or more of the amino acid residue side chains is obtained from simulation experiments. It was proved.
  • 8 hydrogen nuclei are required to precisely determine the structure up to the end of the side chain of a long amino acid residue, which is preferably 1 in determining the precise folded structure of the protein. It was also shown that the hydrogen nucleus at the end of the amino acid residue side chain is preferably 1 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ .
  • the signal intensity of the methine proton is weaker than that of the conventional method, and it is expected that it will not be observed in high molecular weight proteins. Therefore, this methine proton was deuterated to improve the deuteration rate.
  • all carbons are 13C.
  • One of the hydrogen atoms of the j8-position methylene group is preferably deuterated. Also, it is preferable that all or part of the nitrogen atoms constituting the amino acid are substituted with 15N.
  • Preferred stable isotope-labeled aliphatic amino acids are represented by the following general formulas (1) to (13).
  • the most preferred labeling patterns for (Leu), lysine (Lys), methionine (Met), proline (Pro), threonine (Thr), and parin (Val) are as follows.
  • the following sign pattern The configuration of the side-chain stereoselective stable isotope label is not particularly specified, and either R or S may be used.
  • 8th-position hydrogen provides stereoselective deuterium labeling, as it provides important distance information in determining protein conformation.
  • the ⁇ position has a high probability of overlapping with the hydrogen at the j8 position, and the 0 position is preferably completely deuterated in order to facilitate the assignment of the hydrogen at the j8 position.
  • the carbon at the 0-position that does not carry proton information is preferably 12 C.
  • the guazide group moiety may or may not be isotopically labeled.
  • 8th-position hydrogen provides stereoselective deuterium labeling because it gives distance information important in determining protein conformation.
  • the hydrogen at the ⁇ position is completely deuterated.
  • the carbon of the ⁇ -position is 12 C is good preferable.
  • j8 position is 13 CD, 12 CD, or 12 CD
  • ⁇ position is 12 C.
  • the ⁇ position of 13 C and Gin cannot be affected by either 14 15 or 15 ⁇ .
  • the lack of information associated with deuteration of hydrogen at j8 position can be identified as 13 CD at ⁇ position.
  • 12 C is preferred for carbon with only deuterium.
  • the methyl group at the ⁇ position is preferably 13 CDH-labeled.
  • the ⁇ -position methylene prefers stereoselective deuterium labeling.
  • 8th-position hydrogen provides stereoselective deuterium labeling because it gives distance information important in determining protein conformation.
  • the ⁇ and ⁇ positions have a high probability of overlapping with the ⁇ -position hydrogen.
  • do not carry proton information. 12 C is preferred for these carbons.
  • the ⁇ -position hydrogen is preferably completely deuterated to prevent overlap with other hydrogens and to sharpen adjacent hydrogen signals.
  • the carbon at the j8 position is preferably 12C.
  • methyl group ⁇ -position is 1 3 CD H labels are preferred because it is effective in determining the conformation of Mechionin residue side chains.
  • Stereoselective deuterium labeling is preferred because the hydrogen at the ⁇ and ⁇ positions provides important distance information in determining the protein's conformation.
  • the ⁇ position is preferably fully deuterated to facilitate the assignment of other hydrogens that have a high probability of overlapping with other hydrogens.
  • 12 C is preferred for this carbon, which does not carry proton information.
  • the chemical shift of carbon 13 C at the ⁇ position is 13 CHD to reflect the cis and trans structure of the peptide bond between the proline residue and the immediately preceding ( ⁇ terminal side) residue, and the ⁇ position is 12 It may be a CD.
  • Structural information derived from the hydrogen signal at the ⁇ -position can be replaced by substituting the methyl group at the ⁇ -position with 13 CHD and using that information, considering the tetrahedrality at the j8 position.
  • the carbon at the j8 position is preferably 12 C.
  • the methyl group at the ⁇ -position is completely deuterated, structural information useful for precise structure determination is given.
  • the j8 position is preferably 13 CH.
  • the structural information derived from the hydrogen signal at the ⁇ -position is obtained by stereoselectively substituting one of the two ⁇ -methyl groups with 13 CHD and the other with 12 CD, considering the tetrahedrality at the j-position.
  • the carbon at the j8 position is preferably 12 C.
  • the 13 position is preferably 13 CH in order to provide useful structural information for precise structure determination! / ,.
  • the above stable isotope-labeled amino acid is used as an amino acid constituting the target protein to synthesize a cell-free protein and the like to prepare a target protein composed of the stable isotope-labeled amino acid, and its NMR ⁇ Ability to measure the structure of proteins by measuring vectors
  • Vectors are used in combination with the stable isotope-labeled aliphatic amino acids in combination with those described in Patent Document 2 as aromatic amino acids constituting the target protein. Is preferred!
  • Arginine Arg
  • glutamine Gin
  • glutamic acid Glu
  • isoleucine lie
  • leucine Leu
  • lysine Lys
  • methionine Met
  • proline Pro
  • Thr threonine
  • stable isotope-labeled aliphatic amino acids other than Norin (Val) those described in Patent Document 1 are preferably used.
  • Figure 2 shows the chemical structure of a typical stable isotope-labeled amino acid.
  • stable isotope-labeled amino is incorporated into the target protein.
  • one or more or all of the amino acids constituting the target protein are arbitrarily selected, and the structure of the present invention having a pattern that makes the most effective acquisition of three-dimensional structure information and NMR spectrum analysis as shown here. It can be substituted with a stable isotope-labeled amino acid.
  • all aliphatic amino acids constituting the target protein are substituted with the stable isotope-labeled aliphatic amino acids of the present invention, and all the remaining amino acids constituting the target protein, that is, all aromatic amino acids are also included.
  • Stable isotope labeled aromatic amino Is preferably substituted.
  • Substitution of the amino acid constituting the target protein with a stable isotope-labeled amino is a conventionally known method, for example, a normal high-expression protein synthesis system (preferably cell-free protein synthesis) using cultured biological cells, organic chemistry It can be carried out using any method such as a chemical, enzymatic chemical peptide, protein synthesis method, or a protein preparation method using a cell-free extract.
  • a normal high-expression protein synthesis system preferably cell-free protein synthesis
  • cultured biological cells preferably cell-free protein synthesis
  • organic chemistry it can be carried out using any method such as a chemical, enzymatic chemical peptide, protein synthesis method, or a protein preparation method using a cell-free extract.
  • the amino acids used in the present invention have the greatest feature in having various labeling patterns, and when they are incorporated into proteins, they are difficult to obtain by conventional methods. Three-dimensional structure analysis is possible.
  • stereo-selective deuteration SSD
  • regio-selective deuteration RSD
  • stereo-array deuteration Stepo-array Deuteration
  • SAD SAD
  • Proton—density Minimization PDM
  • TRL Tailored ring-labeling
  • Protein NMR structure analysis method is preferred In the following, as an example, how to prepare proteins labeled with amino acids having various labeling patterns, and how excellent their NMR spectra are to obtain a three-dimensional structure. An example is given as to whether or not it has characteristics.
  • the decrease in the number of NOEs can directly reduce the overlap between signals and facilitate structural analysis, but may lead to loss of distance information essential for structure determination. It was essential to examine the relationship between the NOE number and structural accuracy.
  • the automatic analysis program CYANA has developed an algorithm (Herrmann T, Guntert P, Wuthrich KJ Mol. Biol. 2002; 319: 209-227) for NOE analysis. Therefore, it was necessary to confirm how the decrease in NOE number (decrease in density) and the resulting decrease in connection information affect the automatic analysis algorithm.
  • model proteins for simulation include calmodulin (Babu YS, Bugg CE, Cook WJ. J. Mol. Biol. 1988; 204: 191-204), LpxC deacetylase (Whittington DA, Rusche KM, Shin H , Fierke CA, Christianson DW. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 8146-8150), OmpA (Pautsch A, Schulz GE. Nat. Struct. Biol. 1998; 5, 1 013-1017), and above Three types of proteins were adopted.
  • Calmodulin is a protein that has already been subjected to high-accuracy structural analysis by the conventional SAIL method, and was adopted because it is optimal for comparative studies of SAIL amino acids and the amino acids of the present invention.
  • LpxC protein is the most high molecular weight protein that is currently assigned 90% or more by NMR method (Coggins BE, Li X, McClerren A, Hindsgaul O, Raetz CRH, Zhou P. Nat. Struct. Biol 2003; 10: 645—651 and Coggins BE, McClerren AL, Jiang L, Li X, Rudolph J, Hindsgaul O, Raetz CRH, Zhou P.
  • OmpA protein was used for analysis because it had a molecular weight size within the range of NMR analysis possible among membrane proteins (Arora A, Abildgaar d F, Bushweller JH, Tamm LK. Nat. Struct. Biol. 2001; 8: 334-338).
  • Main chain RMSD compared to X-ray (A) c -0. 95 0. 89 0. 95 0. 97 1. 01 0. 94 1. 24 It was obtained by comparing 20 structures output by CYANA for a main chain atoms N, C a , and C '. b Calculated by comparison between 20 structures output by CYANA at heavy atoms (amino acid residue numbers 82-146 (calmodulin), 1-255 (LpxC), and 1-172 (0 mpA)).
  • the average of 20 structures output by eCYANA was compared with the X-ray crystal structure.
  • CYANA is an automated NMR structure analysis software (Guntert P. Prog. NMR Spectrosc. 20 03; 43: 105-125, Guntert P, Mumenthaler C, Wuthrich KJ Mol. Biol. 1997; 273: 283-298, Guntert P. Automated NMR structure calculation. In: NMR Techniques in Structural Biology-From Liquid to Solid State, Springer, New York. 2006).
  • the RMSD value of the main chain of the simulation using the aliphatic amino acid of the present invention is 1 A or less, and the structure is still sufficiently accurate. Is held.
  • the simulation results using the aliphatic amino acids of the present invention showed almost the same force as the conventional SAIL method and better than the RMSD values compared with the X-ray crystal structure. In terms of convergence, the RMSD value increased slightly compared with the conventional method, but the NOE number decreased to almost half that of the uniform label sample.
  • Table 2 shows the structural statistical data when one type of amino acid of the present invention is substituted in SAIL calmodulin.
  • the average of 20 structures output by eCYANA was compared with the X-ray crystal structure.
  • the conclusion of the simulation results is that the amino acid of the present invention is designed to achieve optimal deuteration in determining the structure of the protein. It was suggested that accurate and highly accurate structure determination was possible on an automated analysis system even when applied to proteins.
  • Isoleucine was synthesized according to the following synthesis route.
  • Compound 5 which is the base of this synthesis was synthesized with reference to literature (Eur. J. Org. Chem. 2003, 4664-4678).
  • Threonine was synthesized according to the following synthetic route.
  • FIG. 1 Chemical shift distribution of each atom in lysine residues determined from BMRB database.
  • the horizontal axis shows the chemical shift, and the vertical axis shows the number of atoms present in the database.
  • FIG. 3 shows the structure of a calmodulin protein whose structure has been determined using the conventional SAIL method (experimental data) and the amino acid of the present invention (simulation data).
  • SAIL method ribbon model
  • SAIL method strip structure
  • C Structure using the amino acid of the present invention.
  • FIG. 4 shows the structure of an LpxC protein whose structure was determined using the conventional SAIL method (experimental data) and the amino acid of the present invention (simulation data).
  • SAIL method ribbon model
  • SA SA
  • FIG. 5 shows the structure of an OmpA protein whose structure was determined using the conventional SAIL method (experimental data) and the amino acid of the present invention (simulation data).
  • SAIL method ribbon model
  • S AIL method strip structure
  • C Structure using the amino acid of the present invention.

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Abstract

　高分子量タンパク質、特に60kDaを超える高分子量タンパク質の構造解析を可能にする安定同位体標識脂肪族アミノ酸の組み合わせを提供する。これは、アルギニン（Arg）、グルタミン（Gln）、グルタミン酸（Glu）、リジン（Lys）、メチオニン（Met）、プロリン（Pro）が、次の標識パターンを満たすことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の組み合わせである。 （b）一ヶ所以上のメチレン基のメチレン水素のうちの一つが重水素化され、一ヶ所以上のメチレン基の２つのメチレン水素の両方が重水素化されている、 （d）メチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他は重水素化されているか、又は該メチル基が完全に重水素化されている。

Description

明 細 書
安定同位体標識脂肪族アミノ酸、その標的蛋白質への組み込み方法並 びに蛋白質の NMR構造解析方法
技術分野
[0001] 本発明は蛋白質の NMR構造解析に有用な安定同位体標識脂肪族アミノ酸、その 標的蛋白質への組み込み方法並びに蛋白質の NMR構造解析方法に関する。
[0002] (発明の背景）
NMR法は、溶液中でのタンパク質の立体構造やその動きを原子レベルでの分解 能で観測する現在唯一の方法である。このタンパク質の立体構造にもとづく研究は、 大学や研究機関などの基礎研究分野のみならず、現在創薬などへの産業利用も盛 んに行われている。し力しながら NMR法は、僅か 20年ほど前に開発されたば力りの 新しい技術であり、今後乗り越えなければならない壁をいくつも抱えている。それらの 問題の 1つに、 NMR法が抱える分子量限界の問題がある（非特許文献 1)。
NMR法によるタンパク質の構造決定にぉ 、て分子量の増大は、シグナル数の増 大と急速な緩和によるシグナル強度の低下力 シグナルの重なり合 、を招き、特に 分子量が 2万を超えてくると誤りのな 、解析には熟練した技術が必要になってくる。 高度安定同位体標識タンパク質を用いた構造解析法「Stereo-Array Isotope-Label ing法 (SAIL法)」は、タンパク質 (SAILタンパク質)を徹底的な選択的重水素化により不 要な1 H-NMR構造情報を削減し、 NMR構造解析に必要且つ十分な情報のみを残 すことにより、測定'解析に要する時間を著しく短縮することを可能にした方法である 。特許文献 1及び 2に記載の方法は、高精度で構造決定可能であるだけでなぐ分 子量限界を超えた分子量 4万程度のタンパク質の高精度自動解析を可能にする技 術である。今後は、 60kDaを超える高分子量タンパク質や膜タンパク質の精密構造自 動解析が可能な新しい技術の開発が求められている。
SAIL法では、タンパク質の重水素密度を効率的に向上させることにより、タンパク質 の残余シグナル感度をさらに向上させ、分子量限界を従来の 30kDaから 40kDa以上 に拡張させた (非特許文献 2)。し力しながら 60kDaを超える高分子量タンパク質の構 造解析は、分子の運動性の低下によるシグナル線幅の増大やシグナル数増大によ るシグナル同士の重なり合いのため、従来の SAILアミノ酸を適用しただけでは容易に は解析することができない。また、膜タンパク質においては、タンパク質自体の分子量 は大きくなくても脂質や界面活性剤の存在下で溶解させるために、実質的な分子量 が大きくなりタンパク質の運動性が低下することから、 NMRを用いた解析は高分子 量タンパク質と同様に容易ではない。それらの理由により現在は薬剤開発の対象と なる膜タンパク質や高分子量タンパク質の構造情報の取得手段の開発が待たれて いる。
[0003] 特許文献 1：国際公開 WO03/053910A1公報
特許文献 2：国際公開 WO2005/042469A1公報
非特許文献 1： Wuthrich K (1986), NMR of proteins and nucleic acids. Wiley, New Y ork、 Wuthrich K (1991),タンパク質と核酸の NMR-二次元 NMRによる構造解析， 東京化学同人
非特許文献 2： Kainosho M, Torizawa T, Iwashita Y, Terauchi T, Ono M, Guntert P. Nature 2006; in press.
発明の開示
[0004] 本発明は、高分子量タンパク質、特に 60kDaを超える高分子量タンパク質の構造解 析を可能にする安定同位体標識脂肪族アミノ酸の組み合わせを提供することを目的 とする。
本発明は、高分子量タンパク質の構造解析を可能にする安定同位体標識アミノ酸 の組み合わせを提供することを目的とする。
本発明は、安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法を提供するこ とを目的とする。
本発明は、安定同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋白質の調製方法を提供す ることを目的とする。
本発明は、一層感度の向上した蛋白質の NMR構造決定方法を提供することを目的 とする。
[0005] 本発明者らは、上記課題を達成するために、鋭意検討を重ねた結果、特許文献 1 に記載の水素原子を 2つ有するメチレン基が 2つ以上存在する安定同位体標識脂肪 族アミノ酸における、一ヶ所以上のメチレン基のメチレン水素のうちの一つを重水素 化 (部分重水素化）し、一ヶ所以上のメチレン基の 2つのメチレン水素の両方を重水 素化 (完全重水素化)したものを、安定同位体標識脂肪族アミノ酸として用いると、シ グナルの重なり合いをさらに低減させることができ、上記課題を解決できるとの知見に よりなされたものである。
すなわち、本発明は、安定同位体標識アミノ酸として、標的蛋白質を構成する全て の脂肪族アミノ酸が、次の標識パターンを満たすことを特徴とする安定同位体標識ァ ミノ酸の組み合わせを提供する。
(a)水素原子を 2つ有するメチレン基が 1つ存在する場合には、メチレン水素のうちの 一つが重水素化されて ヽる、
(b)水素原子を 2つ有するメチレン基が 2つ以上存在する場合には、一ヶ所以上のメ チレン基のメチレン水素のうちの一つが重水素化され、一ヶ所以上のメチレン基の 2 つのメチレン水素の両方が重水素化されて 、る、
(c)プロキラルな gem—メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水 素が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されて 、る、
(d)上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他 は重水素化されて 、る力、又は該メチル基が完全に重水素化されて 、る、
(e)メチン水素は重水素化されている。
[0006] 本発明は、又、アルギニン (Arg)、グルタミン（Gin)、グルタミン酸（Glu)、リジン（Lys )、メチォニン (Met)、プロリン (Pro)が、次の標識パターンを満たすことを特徴とする 安定同位体標識アミノ酸の組み合わせを提供する。
(b)一ヶ所以上のメチレン基のメチレン水素のうちの一つが重水素化され、一ヶ所以 上のメチレン基の 2つのメチレン水素の両方が重水素化されている、
(d)メチル基が存在する場合には、該メチル基の一つの水素を残して他は重水素化 されて 、る力、又は該メチル基が完全に重水素化されて 、る。
[0007] 本発明は、又、標的蛋白質を構成する脂肪族アミノ酸が、上記安定同位体標識脂 肪族アミノ酸であり、標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸が、下記力 選ばれる安 定同位体標識芳香族アミノ酸であることを特徴とする標的蛋白質を構成する安定同 位体標識アミノ酸の組み合わせを提供する。
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基を構成する残り 5つの炭素原子のうち 2〜4個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しているこ とを特徴とする安定同位体標識フエ二ルァラニン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基のヒドロキシル基 (OH基）に結合する炭素原子が12 C又は13 Cであり、該フエ- ル基を構成する残り 4つの炭素原子のうち 2〜4個の炭素原子が12 Cであり、これに重 水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合していることを 特徴とする安定同位体標識チロシン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するインドリル基の炭素原子が13 Cであり、該イン ドリル基を構成する残り 7つの炭素原子のうち 1〜5個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、 該インドリル基を構成する NH基の窒素原子が15 N又は14 Nであることを特徴とする安 定同位体標識トリブトファン、及び
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するイミダゾリル基の炭素原子が13 Cであり、該ィ ミダゾリル基を構成する残り 2つの炭素原子の両方の炭素原子が13 Cであってこれに 水素原子が結合して 、るか、片方の炭素原子が12 Cであってこれに重水素が結合し ており、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、該イミダゾリ ル基を構成する 2つの窒素の 1つが15 Nであり残りが14 Nであって、 NH基を構成する 水素原子が重水素ではないことを特徴とする安定同位体標識ヒスチジン。
— "C (X) (Y)— *2C (Z) (15NH) (*3COOH) (A)
(式中、 rtC、 *2C及び *3Cは、それぞれ12 C又は13 Cを示し、 X、 Y及び Zは、それぞれ水 素原子又は重水素原子を示す。 )
本発明は、又、上記安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法であ つて、該アミノ酸を添加した培養液を用いて微生物又は動植物細胞を培養し、標的タ ンパク質をコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の 標的蛋白質への組み込み方法を提供する。
本発明は、又、標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸として上記安定同位体標識ァ ミノ酸の組み合わせを用い、化学合成法により標的タンパク質を合成することを特徴 とする標的蛋白質の合成方法を提供する。
本発明は、又、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸を標的蛋白質に組み込み NM Rスペクトルを測定して構造解析することを含む蛋白質の NMR構造解析方法を提供 する。
[0009] 本発明によれば、次に示す効果が得られる。
(0本発明はタンパク質の精密構造決定に必要な NMR情報を更なる重水素化により 一部失っている。し力しながら、失われたシグナルはデータベースを利用した推定か ら他の原子団のシグナルと重なりある確率の高いものであり、また近傍の原子団によ り構造情報が概ね補填可能なものを選択している。従って、本発明により、従来の SA IL法をそのままの適用することが困難な 50kDaを超える高分子量タンパク質の立体 構造をより正確に求めることが可能になる。
(ii)膜タンパク質の立体構造を正確に求めることが可能になる。
発明を実施するための最良の形態
[0010] 本発明にお 、ては、（a)、 (c)、 (d)及び (e)を有する安定同位体標識脂肪族ァミノ 酸は、特許文献 1に記載の方法により合成することができる。特許文献 1の記載内容 は、本明細書の記載に組み込まれるものとする。
(b)及び (d)を有する安定同位体標識アミノ酸であるアルギニン (Arg)、グルタミン（ Gin)、グルタミン酸（Glu)、リジン（Lys)、メチォニン（Met)、プロリン（Pro)は、本明細 書の実施例に記載の方法により容易に合成することができる。
式 Aを有する安定同位体標識芳香族アミノ酸は、特許文献 2に記載の方法により合 成することができる。特許文献 2の記載内容は、本明細書の記載に組み込まれるもの とする。
以下に、（b)及び (d)を有する安定同位体標識アミノ酸であるアルギニン (Arg)、グ ルタミン（Gin)、グルタミン酸（Glu)、リジン（Lys)、メチォニン（Met)、プロリン（Pro)、 及び安定同位体標識イソロイシン (lie)、ノ リン (Val)、スレオニン (Thr)又はロイシン（ Leu)について詳しく説明する。
例えば、 BMRBデータベースから求めたリジン残基における各原子の化学シフト分 布を図 1に示す。図中、横軸は化学シフトを示し、縦軸はその原子がデータベース中 に存在した数を示す。ここで用いた BMRBデータベース（http：〃 www.bmrb.wisc.edu/ )の統計分布（Seavey BR, Farr EA, Westler WM, Markley JL. J. Biomol. NMR 1991 ； 1: 217-236)に基づいて行った。この結果から、リジンの j8、 γ、 δプロトンは化学シ フト値が近く (図 1)、まれにシグナルのオーバーラップにより SAILタンパク質でさえそれ ぞれの帰属が困難になる場合があるため、リジンやアルギニンなどの長鎖アミノ酸残 基側鎖のメチレンプロトンは位置選択的に CD標識 (完全重水素化)する方が好まし
2
い。この標識法は、重水素化率が増加するためシグナル総数は減少するものの、少 なくとも一方の NMR情報は得られるために全体構造はむしろ向上する。事実、本発 明によりアミノ酸残基側鎖および全体の大ま力な立体構造は、シミュレーション実験よ りアミノ酸残基側鎖の一力所以上のプロトンの位置情報が得られれば決定可能であ ることが証明された。また、 α及び |8水素核は、タンパク質の精密な折れたたみ構造 を決定する上で1 Ηであることが好ましぐ長鎖アミノ酸残基側鎖の末端までの構造を 精密に求めるためには、アミノ酸残基側鎖末端の水素核は1 Ηであることが好ましいこ とも示された。
分岐鎖アミノ酸のメチンプロトンにおいては、従来法よりメチンプロトンのシグナル強 度が弱!、ことから、高分子量タンパク質にお 、ては観測されな 、ことが多くなることが 予想されている。そこで、このメチンプロトンにおいては重水素化し、重水素化率の向 上を図った。
また、炭素原子の標識に関しては、完全に重水素化された炭素原子は、 13C及び /又は 12Cに置換されているのがよいが、近傍の1 Ηの緩和の最適化を考慮し 12Cで あることが好ましい。
重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメチレン基および Ζまたはメチル基 の炭素の全てが 13Cに置換されて!、るのが好まし!/、。
又、全ての炭素が 13Cであるのが好ましぐ j8位のメチレン基の水素原子の一方が 重水素化されて 、るのが好まし 、。 又、アミノ酸を構成する窒素原子の全て、或いは一部が 15Nに置換されているのが 好ましい。
安定同位体標識脂肪族アミノ酸として、好ましいものを下記一般式（1)〜（13)で示 す。
[化 1]
Figure imgf000009_0001
[化 2]
Figure imgf000009_0002
[化 3]
Figure imgf000009_0003
[化 4]
Figure imgf000009_0004
[化 5]
Figure imgf000009_0005
[化 6]
Figure imgf000009_0006
Figure imgf000009_0007
Figure imgf000010_0001
[0014] [ィ匕 9]
Figure imgf000010_0002
[化 10]
Figure imgf000010_0003
[化 11]
Figure imgf000010_0004
[化 12]
Figure imgf000010_0005
[化 13]
Figure imgf000010_0006
(式中、炭素は12 C又は13 Cを示し、窒素は14 N又は15 Nを示し、 Hは水素原子、 Dは重 水素原子を示す。 )
[0015] アルギニン (Arg)、グルタミン（Gin)、グノレタミン酸（Glu)、イソロイシン（lie)、ロイシン
(Leu)、リジン（Lys)、メチォニン (Met)、プロリン（Pro)、スレオニン (Thr)、パリン (Val )における最も好ましい標識パターンは以下の通りである。なお、下記標識パターン にお 、て側鎖立体選択的安定同位体標識の立体配置は特に規定はせず、 R及び S のどちらでも良い。
[0016] Arg
H D D H 13C02H
H2 Ν·12 Ni .1 ·15 ΝΗ2
14ΝΗ Η D D Η
|8位の水素はタンパク質の立体構造を決定する上で重要な距離情報を与えるため 立体選択的な重水素標識が好まし 、。
γ位は、 j8位の水素と重なり合う確率が高く j8位の水素の帰属を容易にする為に は、 0位は完全に重水素化することが好ましい。また、プロトン情報を担わないこの 0 位の炭素は12 Cが好ましい。
δ位の水素はアルギニン残基側鎖の立体配座を決定する上で有効であるため立 体選択的なモノ重水素標識が好ま 、。
グァ -ジド基部分は同位体標識を施しても、施さなくても構わない。
[0017] Gln、Glu
Figure imgf000011_0001
|8位の水素はタンパク質の立体構造を決定する上で重要な距離情報を与えるため 立体選択的な重水素標識が好ま 、。
他の水素との重なり合 、を防ぐため、及び隣接水素のシグナルを先鋭ィ匕するため に γ位の水素は完全に重水素化することが好ましい。またこの γ位の炭素は12 Cが好 ましい。
y炭素付近の立体構造が正確に知りた 、場合には、 γ位に13 CHDを持つ標識体 が好ましい。この場合、 j8位は13 CD、 12CD、或いは12 CDの何れでも、また δ位は12 C
2 2 2
或いは13 C、 Ginの ε位は14 Ν或いは15 Νの何れでも力まわない。
[0018] lie
Figure imgf000011_0002
j8位の水素は線幅の増加により観測が困難である場合が多い。そのため重水素化 によりシグナルを取り除いても、 j8位の四面体性を考慮すれば γ位のメチル基の位
2
置情報があれば、 j8位の水素を重水素化したことに伴う情報の欠落を γ位の13 CD
2 2
Hシグナル、或いは/及び γ位の 13CHDシグナルで補うことができる。
1
何れの場合にぉ 、ても重水素のみを持つ炭素は12 Cが好まし 、。
δ位のメチル基は13 CD H標識が好ましい。
2
[0019] Leu
Figure imgf000012_0001
β位のメチレンは立体選択的な重水素標識が好ま 、。
重水素のみを持つ炭素は12 Cが好ま 、。
γ位の水素は線幅の増加により観測が困難である場合が多い。そのため重水素化 によりシグナルを取り除いても β位の四面体性を考慮すれば δ位の二つメチル基の 内一方の位置情報があれば、構造精度は保てる。
δ位の二つのメチル基の内、一方を12 CD、他方を13 CD Hで立体選択的に標識す
3 2
ることが好ましい。
[0020] Lys
D H D D H 3C02H
13。, 12 13Q
H 2 1 5N , 1 1 3C 1 5N H 2
D H
|8位の水素はタンパク質の立体構造を決定する上で重要な距離情報を与えるため 立体選択的な重水素標識が好ま 、。
γ位及び δ位は、 β位の水素との重なり合う確率が高ぐ β位の水素の帰属を容 易にするためには完全に重水素化することが好ま 、。またプロトン情報を担わな ヽ これらの炭素は12 Cが好まし 、。
ε位の水素はリジン残基側鎖の立体配座を決定する上で有効であるため立体選 択的な重水素標識が好ま 、。
[0021] Met
Figure imgf000013_0001
β位の水素は、タンパク質の立体構造を決定する上で重要な距離情報を与えるた め立体選択的な重水素標識が好ましい。
γ位の水素は、他の水素との重なり合いを防ぐため、及び隣接水素のシグナルを 先鋭ィ匕するために完全に重水素化することが好ましい。またこの j8位の炭素は 12C が好ましい。
ε位のメチル基はメチォニン残基側鎖の立体配座を決定する上で有効であるため1 3CD H標識が好ましい。
2
[0022] Pro
D D D. i 3 .、、、H
H' 15N 13C〇2H
H
β位及び δ位の水素は、タンパク質の立体構造を決定する上で重要な距離情報を 与えるため立体選択的な重水素標識が好ま 、。
γ位は、他の水素との重なり合う確率が高ぐ他の水素の帰属を容易にするために 完全に重水素化することが好ま 、。またプロトン情報を担わな 、この炭素は12 Cが好 ましい。しかしながら、 γ位の炭素13 Cの化学シフトはプロリン残基とその一つ手前 (Ν 末端側)残基とのペプチド結合のシス、トランス構造を反映するために、 13CHDとし、 δ位を12 CDとしても良い。
2
[0023] Thr
Figure imgf000013_0002
β位の水素シグナルに由来する構造情報は、 j8位の四面体性を考慮すれば γ位 メチル基を13 CHDに置換し、その情報を利用することにより代替できる。
2
j8位を重水素化する場合には、 j8位の炭素は12 Cが好ましい。逆に、 γ位のメチル 基を完全な重水素化する場合には、精密な構造決定に有用な構造情報を与えるた めに、 j8位は13 CHであるのが好ましい。
[0024] Val
Figure imgf000014_0001
β位の水素シグナルに由来する構造情報は、 j8位の四面体性を考慮すれば二つ γ位メチル基の一方を13 CHD、他方を12 CDに立体選択的に置換し、その構造情報
2 2
を利用することにより代替できる。
j8位を重水素化する場合には、 j8位の炭素は12 Cが好ましい。逆に、 γ位の二つメ チル基を同時に完全な重水素化する場合には、精密な構造決定に有用な構造情報 を与えるために、 13位は13 CHであるのが好まし!/、。
[0025] 本発明では、標的蛋白質を構成するアミノ酸として上記安定同位体標識アミノ酸を 用いて、無細胞蛋白質等合成を行って安定同位体標識アミノ酸で構成される標的蛋 白質を調製し、その NMR ^ベクトルを測定して蛋白質の構造解析することができる 力 上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸とともに、標的蛋白質を構成する芳香族アミ ノ酸として特許文献 2に記載のものと組み合わせて用 、るのが好まし!/、。
又、アルギニン (Arg)、グルタミン（Gin)、グルタミン酸（Glu)、イソロイシン（lie)、ロイ シン（Leu)、リジン（Lys)、メチォニン（Met)、プロリン（Pro)、スレオ-ン（Thr)、ノ リン（ Val)以外の安定同位体標識脂肪族アミノ酸としては、特許文献 1に記載のものを用 いるのが好ましい。
代表的な安定同位体標識アミノ酸の化学構造を図 2に示す。
NMRによる蛋白質の構造解析のために、安定同位体標識アミノを、標的とする蛋 白質に組み込む。この際、標的蛋白質を構成するアミノ酸のうちで任意に選定した一 つ、複数、或は全てをここで示すような立体構造情報の入手、 NMRスペクトル解析 を最も有効ならしめるパターンを有する本発明の安定同位体標識アミノ酸で置換する ことができる。しかしながら、標的蛋白質を構成する全ての脂肪族アミノ酸を、本発明 の安定同位体標識脂肪族アミノ酸で置換し、さらに、標的蛋白質を構成する残りの全 てのアミノ酸、すなわち、全ての芳香族アミノ酸も、上記安定同位体標識芳香族ァミノ で置換するのが好ましい。標的蛋白質を構成するアミノ酸を安定同位体標識ァミノで 置換することは、従来公知の方法、例えば、培養生物細胞を用いた通常の高発現蛋 白質合成系 (好ましくは無細胞蛋白質合成)、有機化学的 ·酵素化学的ペプチド ·蛋 白質合成手法、或は無細胞抽出液を用いる蛋白質調製法などの何れの手法を利用 して行うことができる。
[0026] NMRによるスペクトル測定や蛋白質の構造解析のための手法も様々であってよい 。また、リガンド結合による構造変化部位の特定等も可能である。
いずれにしても、本発明で使用するアミノ酸は、様々な標識パターンを持つことに 最大の特徴があり、それらが蛋白質に取り込まれた際には従来の手法によっては得 ることが困難な蛋白質の立体構造解析が可能になるものである。
本発明では、特許文献 1に記載の立体選択重水素化 (Stereo-selective Deuteratio n,SSD)、位置選択重水素化 (Regio- selective Deuteration, RSD)、立体整列重水素 ィ匕 (Stereo— array Deuteration, SAD)、プロトン濃度最小ィ匕 (Proton— density Minimizati on, PDM)及びテーラー環移転 (Tailored ring-labeling, TRL)を組み合わせることに より蛋白質の立体構造情報の取得に最適なアミノ酸をデザインすることができる。 本発明の蛋白質の NMR構造解析方法としては、標的蛋白質を構成する全てのァ ミノ酸が上記安定同位体標識アミノ酸で置換されてなる標的蛋白質の構造を NMRス ベクトル測定により解析することを含む標的蛋白質の NMR構造解析方法が好ましい 以下に、実施例として、様々な標識パターンを持つアミノ酸を用いて標識した蛋白 質の調製と、それらの NMRスペクトルが、立体構造を入手する上でどのような優れた 特徴を有するかに関して例示する。
もちろん、下記の実施例はこの出願の発明についての具体的な理解を得るための 例示であって、これらの例示によってこの出願の発明が限定されることはない。
実施例
[0027] 実施例 1 合成法とシミュレーション実験結果について
上記で述べた構造の精密さ、正確さの評価のため、ここでのシミュレーションは、以 下の点に特に注目して解析を行った。 (1)本発明の脂肪族アミノ酸をタンパク質に取り込ませた際の NOE数の減少量の推定
(2)距離情報の減少に伴う構造の精密さ、正確さへの影響。
(3) NOE数減少に伴う自動帰属への影響。
(1)及び (2)において、 NOE数の減少は、シグナル間の重なりを直接軽減でき構造解 析を容易にする一方で、構造決定に必要不可欠な距離情報の消失を招く可能性が あるため、 NOE数と構造精度との関係の検討が必須であった。（3)については、自動 解析プログラム CYANAは、 NOE解析に「各 NOE間のつながりを頼りに解析をすすめ る」アルゴリズム（Herrmann T, Guntert P, Wuthrich K. J. Mol. Biol. 2002; 319: 209- 227)を採用しているため、 NOE数の減少 (密度の減少)、及びそれに伴うつながり情報 の減少が、 自動解析アルゴリズムにどのような影響を与えるカゝ確認する必要があった
[0028] シミュレーションのモデルタンパク質としては、カルモジュリン（Babu YS, Bugg CE, Cook WJ. J. Mol. Biol. 1988; 204: 191- 204)、 LpxC脱ァセチル化酵素（Whittington DA, Rusche KM, Shin H, Fierke CA, Christianson DW. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2003; 100: 8146-8150)、 OmpA(Pautsch A, Schulz GE. Nat. Struct. Biol. 1998; 5, 1 013-1017)、以上 3種類のタンパク質を採用した。カルモジュリンは、従来の SAIL法で 高精度の構造解析がすでになされたタンパク質であり、 SAILアミノ酸と本発明のァミノ 酸の比較検討に最適であると考え採用した。 LpxCタンパク質は、現在 NMR法で 90% 以上の帰属がなされている最も高分子量のタンパク質で、（Coggins BE, Li X, McCle rren Aし, Hindsgaul O, Raetz CRH, Zhou P. Nat. Struct. Biol. 2003; 10: 645— 651及 び Coggins BE, McClerren AL, Jiang L, Li X, Rudolph J, Hindsgaul O, Raetz CRH, Zhou P. Biochemistry 2005; 44: 1114-112)化学シフトデータをそのままシミュレーショ ンに適用できるためであり、 OmpAタンパク質は、膜タンパク質のうちで NMR解析可能 な範囲の分子量サイズであったため、それぞれ解析に採用した（Arora A, Abildgaar d F, Bushweller JH, Tamm LK. Nat. Struct. Biol. 2001; 8: 334—338)。
[0029] 実際のシミュレーションでは、初めに、本発明の脂肪族アミノ酸個々についての構 造解析への有効性を評価することとした。具体的には、 1種類の脂肪族アミノ酸のみ を SAIL力も本発明の脂肪族アミノ酸に変換したカルモジュリンタンパク質について構 造解析シミュレーションを行い、タンパク質の正確さ、精密さと NOE減少数との関係を 推定した。この計算では、 NOEの減少量は、本発明の脂肪族アミノ酸 1種類当たり 6- 216個であり、アミノ酸 1つ当たりでは、 6-21個であった。最も効率よく NOE数を減少さ せたアミノ酸は、リジンであり、アミノ酸 1つ当たりおおよそ 21個の NOEシグナルを減少 させた。一方で、これらの RMSD値は従来の SAIL法と比較してわず力 0.01-0.08A程 度の上昇にとどまった。この程度の上昇であれば、シグナルの重なりと線幅の減少に よる解析の効率化の効果で十分に補えるものと期待され、実際の実験では従来法よ り高解像度の構造決定が可能であると想定できる。
次に、本発明よりさらに重水素化率を上げたアミノ酸の構造解析への影響を調べる ために、グリシン残基を除く 19種類のアミノ酸すべての H原子を2 Hに置換したシミュレ ーシヨンを実行した。この結果は、正確さ、精密さともに RMSD値は従来法よりかなり大 きな値となった。このことは、本発明の脂肪族アミノ酸よりもさらに1 H原子数を減少さ せると、構造の正確さ、精密さのいずれも著しい低下を招くことを示す。このことはま た、本発明の脂肪族アミノ酸が最小限度且つ最適に重水素化設計された試料である ことを示している。
最後に、カルモジュリン、 LpxC、および OmpAタンパク質に関して、すべての安定同 位体標識アミノ（図 2に記載)を適用した構造解析シミュレーションを行った。その結果 を、表 1、図 3 4及び 5に示す。
表 1 ユニフォームラベル (UL),従来の SAIL法および本発明のアミノ酸で解析され たカルモジュリン， LpxCおよび OmpAタンパク質 calmodu l i n LpxC OmpA
UL SAIL 本発明 Uし SAIL 本発明 UL SAIL 本発明
N0ESYピーク数 - 4814 3457 11079 7615 6111 8893 5435 4197 帰属された N0ESYピーク数 - 4568 3159 10941 7532 6036 8574 5232 3941 主鎖 RMSD (A) a - 0. 37 0. 61 0. 40 0. 50 0. 80 0. 37 0. 58 重原子 RMSD (A) b - 0. 69 1. 04 0. 95 1. 03 1. 37 0. 58 0. 81 0. 94
X線と比較した主鎖 RMSD (A) c - 0. 95 0. 89 0. 95 0. 97 1. 01 0. 94 1. 24 a主鎖原子 N, C a , C'において CYANAが出力した 20構造間の比較によって求めた。 b重原子（アミノ酸残基番号 82- 146 (カルモジュリン)、 1-255 (LpxC)、および 1-172 (0 mpA))において CYANAが出力した 20構造間の比較によって求めた。
eCYANAが出力した 20構造の平均と X線結晶構造の比較から求めた。
ここで、 CYANAは、 NMR自動構造解析ソフト（Guntert P. Prog. NMR Spectrosc. 20 03; 43: 105-125、 Guntert P, Mumenthaler C, Wuthrich K. J. Mol. Biol. 1997; 273: 283—298、 Guntert P. Automated NMR structure calculation. In: NMR Techniques i n Structural Biology - From Liquid to Solid State, Springer, New York. 2006)である
[0031] 表 1から分かるように、カルモジュリン、 LpxCおよび OmpAいずれにおいても、本発 明の脂肪族アミノ酸を用いたシミュレーションの主鎖の RMSD値は 1 A以下であり、ま だ十分な精度の構造が保持されている。また、 X線結晶構造と比較した RMSD値でも 、本発明の脂肪族アミノ酸を用いたシミュレーション結果は、従来の SAIL法とほぼ同 等力 それより良い結果を示した。収束度においては、従来法より若干の RMSD値の 上昇が見られたが、 NOE数はユニフォームラベル試料と比べておおよそ半分近くま で減少して 、る。ユニフォームラベル試料のシミュレーション上での収束度は極端に 良いが、実際の実験では、約 11000個 (LpxC)や 9000個 (OmpA)のような膨大な数のシ グナルを含むスペクトルの解析は、シグナル間の重なりによってほぼ不可能である推 測される。一方、本発明の脂肪族アミノ酸適用によるわず力な精度低下は、 NOE数の 減少による解析の効率ィ匕によって、十分に補うことができるものであると考えられる。 また、 NOEの密度低下による自動解析への影響についても、 CYANAプログラムは、 すべての NOEの 94-96%の NOEを自動帰属したことから、本発明のアミノ酸における1 H原子の減少であるならば、自動解析もまだ十分可能であることが示された。
[0032] 次に、 SAILカルモジュリン中に本発明のアミノ酸を 1種類置換した際の構造統計デ 一タを表 2に示す。
表 2 SA I L ARG H I S I LE LEU し YS MET PRO PHE THR VAL GLN GLU noH'
NOESYピーク数 4814 4738 4808 468 1 4692 4647 4710 4777 4665 4698 4700 471 9 4598 3030 帰属された NOE
4568 448 7 4567 4428 4440 4400 4459 4521 441 1 4446 445 1 4493 4336 2724 SY ピーク数
主鎖 RMSD
0. 37 0. 44 0. 40 0. 43 0. 42 0. 39 0. 44 0. 41 0. 38 0. 40 0. 42 0. 45 0. 4 1 0. 92 重原子 RMSD
0. 69 0. 79 0. 72 0. 74 0. 76 0. 74 0. 76 0. 72 0. 46 0. 73 0. 75 0. 78 0. 80 1 . 38
(A) b
X線と比較した
0. 95 1 . 08 0. 95 1. 00 1 . 06 0. 97 0. 94 1. 08 1. 03 1. 00 0. 88 0. 89 0. 93 1 . 3 1 主鎖（人） ' a主鎖原子 N, C" , C'において CYANAが出力した 20構造間の比較によって求めた。 b重原子（アミノ酸残基番号 82- 146 (カルモジュリン)、 1-255 (LpxC)および 1-172 (Om pA))において CYANAが出力した 20構造間の比較によって求めた。
eCYANAが出力した 20構造の平均と X線結晶構造の比較から求めた。
[0033] 以上の点から、シミュレーション結果の結論として、本発明のアミノ酸は、タンパク質 の構造決定を行う上で最適な重水素化を実現するように設計されており、超高分子 量タンパク質や膜タンパク質に適応した際も、正確かつ高精度の構造決定が自動解 析システム上で十分に可能であることが示唆された。
同位体標識アミノ酸の合成
上記シミュレーション結果により、本発明で示した同位体標識脂肪族アミノ酸が超 高分子量タンパク質や膜タンパク質に適していることが証明されたため、実際に下記 に示す同位体標識アミノ酸を合成した。合成した化合物は、 1H-NMRを用い重水素 化した箇所のシグナルが消失していること、および 13C- NMRを用いて重水素化され た同位体シフトした炭素核が 2Hとカップリングしていることを確認することにより同定し た。
[0034] 実施例 2 グルタミン酸の合成
文献 (M. Oba, et al.， J. Org. Chem. 64, 9275, 1999)記載の手法を用いて均一に 1 3C標識した L グルタミン酸から誘導した (2S,3S,4R)-〔l,2,3,4,5-13C5;2-15N;3,4-2 H2〕グルタミン酸を重水素化塩酸中、加熱することにより GS^S^ tl^^AS-lSCS^- lSN^AA-SHS]グルタミン酸を合成した。 実施例 3 リジンの合成
(2S,5S,6R)-〔1,2,3,4,5,6- 13C6;2, 6- 15N2;3,4,4,5,5,6-2H6〕リジンの合成は、（2S,3S) -〔1,2,3,4,5- 13C5;2-15N;3,4,4-2H3〕グルタミン酸を用いて PCT/JP02/13303に従い 合成した。このときデヒドロヒスチジンの接触還元の際に重水素ガスを使用し、得られ た (2S,5S,6R)—〔1,2,3,4,5,6-13C6;2,6-15N2;2,3,3,4,4,5,6-2H7〕リジンを軽水中ラセミ 化し、光学分割することによりえられる。また、 [ィ匕 8]のリジンに関しても原料に [1,2,3,4 ,5- 13C5;2- 15N;3,4- 2H]グルタミン酸を用いることにより合成可能である。
[0035] 実施例 4 ロイシンの合成
(2S,3S,4S)- [1,2,3,4,5-13C5;2-15N;3,4,5,5,5',5',5'-2H6]ロイシンの合成は、 PCT/J P02/13303及び文献 (M. Oba, et al, J. Org. Chem. 64, 9275, 1999)を参考に合成 した。
[0036] 実施例 5 メチォニンの合成
まず (2S,3R)-〔1,2,3,4,6- 13C5;2-15N;3,4,4,6,6-2H4〕メチォニンの合成は、 PCT/JP 02/13303にしたがい、末端のアルデヒドの不斉還元をせずに SMe化することにより 合成した。
[0037] 実施例 6 プロリンの合成
文献記載の手法 (M. Oba et al., J. Org. Chem. 64, 9275-9278, 1999)を均一に 13C 、 15N標識した L グルタミン酸力 誘導し、 δ位の不斉還元の段階をすベて重水素 化試薬を用いて行うことにより合成した。また、 [化 10]のプロリンに関しては、原料に（ 2S.3S)- [1,2,3,4,5- 13C5;2-15N;3,4,4-2H3]グルタミン酸を用いることにより合成可能 である。
[0038] 実施例 7 アルギニンの合成
(2S,4S,5R)-〔1,2,3,4,5- 13C5;2,6- 15N2;3,3,4,5- 2H4〕アルギニンの合成は、（2S,3S) -〔1,2,3,4,5- 13C5;2- 15N;3,3- 2H2〕グルタミン酸を用いて PCT/JP02/13303に従い合 成した。また、 [ィ匕 1]のアルギニンに関しても原料に [1,2,3,4,5-13C5;2-15N;2,3,3,4,4 -2H5]グルタミン酸を用いることにより合成可能である。
[0039] 実施例 8 グルタミンの合成
(2S,3S)—〔1,2,3,4,5— 13C5;2—15N;3,4,4—2H3〕グルタミンの合成は、（2S,3S)—〔1,2,3,4, 5-13C5;2-15N;3，4，4 - 2H3〕グルタミン酸を用いて PCT/JP02/13303に従い合成した。 実施例 9 イソロイシン
イソロイシンは、下記合成経路に従い合成した。なお本合成の鏈となる化合物 5は 文献（Eur. J. Org. Chem. 2003, 4664-4678 )を参考に合成した。
l)PPh:
Br' H2C02Me
2)NaOH , ヽ
,CD H
Figure imgf000021_0001
Figure imgf000021_0002
実施例 10 スレオニン
スレオニンは、下記合成経路に従い合成した。
Figure imgf000022_0001
Figure imgf000022_0002
[0042] 実施例 11 パリン
ノ リンは、下記合成経路に従い合成した。なお本合成の鍵となる化合物 7は文献 (E ur. J. Org. Chem.2003, 4664-4678 )を参考に合成した。
ICH^ldC0^H ― Br.^CH2^C -0
2)MeOH Γ - 2Me— ——一 ^ PhqP^ 、 CO
2)NaOH
Figure imgf000022_0003
(S?S)-EtDuPOS
D2>MeONa
Figure imgf000022_0004
^CD3 D CD3
l
C、 ^COat-Bu } 3 2 - 。■、 J C02t-Bu
2)NaBD4 2)Bu3SnH?AIBN HD 3C, 13C,
1) ' TFA,H2乙0
2) S02CI2,NBS,H20
Figure imgf000022_0005
[0043] 上記の方法で合成した同位体標識脂肪族アミノ酸の構造を以下に示す。 3c
H D D 、D
Figure imgf000023_0001
Arg Gli Glu
Figure imgf000023_0002
Leu Met Pro
Figure imgf000023_0003
Thr Val
図面の簡単な説明
[図 1]BMRBデータベースから求めたリジン残基における各原子の化学シフト分布。横 軸は化学シフトを示し、縦軸はその原子がデータベース中に存在した数を示す。 圆 2-1]代表的な安定同位体標識アミノ酸の化学構造を示す。
圆 2- 2]代表的な安定同位体標識アミノ酸の化学構造を示す (図 2—1の続き)。 圆 2- 3]代表的な安定同位体標識アミノ酸の化学構造を示す (図 2—1の続き)。
[図 3]従来の SAIL法 (実験データ)および本発明のアミノ酸 (シミュレーションデータ)を 用いて構造決定したカルモジュリンタンパク質の構造を示す。（A)SAIL法 (リボンモデ ル)、（B)SAIL法 (バンドル構造)、（C)本発明のアミノ酸を用いた構造。
[図 4]従来の SAIL法 (実験データ)および本発明のアミノ酸 (シミュレーションデータ)を 用いて構造決定した LpxCタンパク質の構造を示す。（A)SAIL法 (リボンモデル)、 (B)SA
IL法 (バンドル構造)、（C)本発明のアミノ酸を用いた構造。
[図 5]従来の SAIL法 (実験データ)および本発明のアミノ酸 (シミュレーションデータ)を 用いて構造決定した OmpAタンパク質の構造を示す。（A)SAIL法 (リボンモデル)、 (B)S AIL法 (バンドル構造)、（C)本発明のアミノ酸を用いた構造。

Claims

請求の範囲
[1] 安定同位体標識アミノ酸として、標的蛋白質を構成する全ての脂肪族アミノ酸が、 次の標識パターンを満たすことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
(a)水素原子を 2つ有するメチレン基が 1つ存在する場合には、メチレン水素のうちの 一つが重水素化されて ヽる、
(b)水素原子を 2つ有するメチレン基が 2つ以上存在する場合には、一ヶ所以上のメ チレン基のメチレン水素のうちの一つが重水素化され、一ヶ所以上のメチレン基の 2 つのメチレン水素の両方が重水素化されて 、る、
(c)プロキラルな gem—メチル基が存在する場合には、一方のメチル基の全ての水 素が完全に重水素化され、他方のメチル基の水素が部分重水素化されて 、る、
(d)上記以外のメチル基が存在する場合には、該メチル基が部分重水素化されてい る力、又は該メチル基が完全に重水素化されて 、る、
(e)メチン水素は重水素化されている。
[2] アルギニン (Arg)、グルタミン（Gin)、グルタミン酸（Glu)、リジン（Lys)、メチォニン（ Met)、プロリン (Pro)が、次の標識パターンを満たすことを特徴とする安定同位体標 識アミノ酸の組み合わせ。
(b)一ヶ所以上のメチレン基のメチレン水素のうちの一つが重水素化され、一ヶ所以 上のメチレン基の 2つのメチレン水素の両方が重水素化されている、
(d)メチル基が存在する場合には、該メチル基が部分重水素化されている力、又は 該メチル基が完全に重水素化されて ヽる。
[3] (f)重水素化された後にお 、て、水素原子を持つメチレン基および Zまたはメチル 基の炭素の全てが 13Cに置換されている、請求項 1又は 2記載の安定同位体標識ァ ミノ酸の組み合わせ。
[4] (g)完全に重水素化されたメチレン基の炭素が 13C及び/又は 12Cに置換されて
V、る、請求項 1又は 2記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[5] (h)完全に重水素化されたメチレン基の炭素が 12Cに置換されている、請求項 1又 は 2記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[6] 全ての炭素が 13Cである請求項 2記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。 [7] β位のメチレン基の水素原子の一方が重水素化されて!/、る請求項 2記載の安定同 位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[8] 水素原子を 2つ有するメチレン基が 1つ存在するか又は 1つも存在しないアミノ酸が 、イソロイシン（He)、 ノ リン (Val)、スレオニン（Thr)又はロイシン（Leu)であり、イソロイ シン（lie)、 ノ リン（Val)及びスレオニン（Thr)の 13位及びロイシン（Leu)の γ位のメチ ン基の水素原子が重水素化されている請求項 1記載の安定同位体標識アミノ酸の組 み合わせ。
[9] イソロイシン（lie)、 ノ リン (Val)及びスレオニン（Thr)の 13位及びロイシン（Leu)の γ 位のメチン基の炭素原子が 12Cである請求項 8記載の安定同位体標識アミノ酸の組 み合わせ。
[10] アミノ酸を構成する窒素原子の全て、或いは一部が 15Nに置換されている請求項 1 又は 2記載の安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
[11] 下記一般式 (1)〜（13)で表される請求項 1記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸
[化 1]
Figure imgf000025_0001
[化 2]
Figure imgf000025_0002
[化 3]
Figure imgf000025_0003
[化 4]
Figure imgf000025_0004
[化 5]
Figure imgf000026_0001
[化 6]
Figure imgf000026_0002
[化 8]
Figure imgf000026_0003
[化 9]
Figure imgf000026_0004
[化 10]
Figure imgf000026_0005
[化 11]
Figure imgf000026_0006
[化 12]
Figure imgf000027_0001
[化 13]
Figure imgf000027_0002
(式中、炭素は12 C又は13 Cを示し、窒素は14 N又は15 Nを示し、 Hは水素原子、 Dは重 水素原子を示す。 )
標的蛋白質を構成する脂肪族アミノ酸が、請求項 1〜11のいずれか 1項記載の安 定同位体標識脂肪族アミノ酸であり、標的蛋白質を構成する芳香族アミノ酸が、下記 から選ばれる安定同位体標識芳香族アミノ酸であることを特徴とする標的蛋白質を構 成する安定同位体標識アミノ酸の組み合わせ。
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基を構成する残り 5つの炭素原子のうち 2〜4個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しているこ とを特徴とする安定同位体標識フエ二ルァラニン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するフエ-ル基の炭素原子が13 Cであり、該フエ -ル基のヒドロキシル基 (OH基）に結合する炭素原子が12 C又は13 Cであり、該フエ- ル基を構成する残り 4つの炭素原子のうち 2〜4個の炭素原子が12 Cであり、これに重 水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合していることを 特徴とする安定同位体標識チロシン、
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するインドリル基の炭素原子が13 Cであり、該イン ドリル基を構成する残り 7つの炭素原子のうち 1〜5個の炭素原子が12 Cであり、これに 重水素が結合し、残りの炭素原子が13 Cであって、これに水素原子が結合しており、 該インドリル基を構成する NH基の窒素原子が15 N又は14 Nであることを特徴とする安 定同位体標識トリブトファン、及び
式 Aで表されるアミノ酸残基に結合するイミダゾリル基の炭素原子が13 Cであり、該ィ ミダゾリル基を構成する残り 2つの炭素原子の両方の炭素原子が13 Cであってこれに 水素原子が結合して 、るか、片方の炭素原子が12 cであってこれに重水素が結合し ており、残りの炭素原子が13 cであって、これに水素原子が結合しており、該イミダゾリ ル基を構成する 2つの窒素の 1つが15 Nであり残りが14 Nであって、 NH基を構成する 水素原子が重水素ではないことを特徴とする安定同位体標識ヒスチジン。
— "C (X) (Y)— *2C (Z) (15NH) (*3COOH) (A)
(式中、 rtC、 *2C及び *3Cは、それぞれ12 C又は13 Cを示し、 X、 Y及び Zは、それぞれ水 素原子又は重水素原子を示す。 )
[13] 請求項 1〜11のいずれか 1項記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の標的蛋白 質への組み込み方法であって、該アミノ酸を添加した培養液を用いて微生物又は動 植物細胞を培養し、標的タンパク質をコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする 安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法。
[14] 請求項 12記載の安定同位体標識アミノ酸の標的蛋白質への組み込み方法であつ て、該アミノ酸を添加した培養液を用いて微生物又は動植物細胞を培養し、標的タン パク質をコードする遺伝子を組み込むことを特徴とする安定同位体標識アミノ酸の標 的蛋白質への み込み方法。
[15] 無細胞蛋白質合成により組み込む請求項 13又は 14記載の安定同位体標識アミノ 酸の標的蛋白質への組み込み方法。
[16] 請求項 1〜11のいずれか 1項記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸を用い、化学 合成法により標的タンパク質を合成することを特徴とする標的蛋白質の合成方法。
[17] 請求項 12記載の安定同位体標識アミノ酸を用い、化学合成法により標的タンパク 質を合成することを特徴とする標的蛋白質の合成方法。
[18] 請求項 1〜11のいずれか 1項記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸を標的蛋白 質に組み込み NMR ^ベクトルを測定して構造解析することを含む蛋白質の NMR構 造解析方法。
[19] 標的蛋白質を構成する全てのアミノ酸が請求項 12記載の安定同位体標識アミノ酸 で置換されてなる標的蛋白質の構造を NMRスペクトル測定により解析することを含 む標的蛋白質の NMR構造解析方法。
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