JP6183859B2 - 安定同位体標識脂肪族アミノ酸及びこれを利用したタンパク質のｎｍｒ構造解析法 - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質のＮＭＲ法による構造解析法に使用するのに好適な、安定同位体標識脂肪族アミノ酸、これを含む組成物、安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法、及びタンパク質のＮＭＲ構造解析法に関する。
多種多様なタンパク質が有する生物学的機能は、各タンパク質に固有なアミノ酸の一次配列を有するペプチド鎖が、アミノ酸の一次配列に応じて独自の立体構造を形成することにより発現することが広く知られている。このため、タンパク質の立体構造情報は極めて重要な知的資産となっていて、国際的な情報集積機関（Protein Data Bank （以下、ＰＤＢともいう）；例えば、"RCSB Protein data bank", [online], 構造バイオインフォマティクス研究共同体, ［平成２４年７月２５日検索］, インターネット(http://www.pdb.org/pdb/home/home.do)参照）等に集積されており、医学・生物学等の基礎研究や医薬品開発等の応用研究において広く利用されている。
タンパク質の立体構造を決定する実験的手法として、現在最も有力な方法はタンパク質の単結晶のＸ線回折を用いるＸ線結晶構造解析法であり、ＰＤＢに毎年集積されるタンパク質の立体構造情報の９０％以上はこのＸ線結晶構造解析法により得られたものである。
一方、１９８０年代に登場したタンパク質の新たな構造決定手法であるＮＭＲ法は、現時点までにＰＤＢ等に提供された立体構造情報の僅か１０％以下を占めるに過ぎないものの、タンパク質が結晶化された状態ではなく、タンパク質が生物学的機能を果たす環境に類似した環境である、水溶液中、ミセル中、及び脂質二重膜中等において、タンパク質中のアミノ酸残基が自由に動き回れる状態での構造決定が可能であり、所謂、「動的構造情報」を得ることが可能であるために、一般に「静的構造情報」を与えるＸ線結晶構造解析法とは全く異なった情報が提供されている。
このように、静的構造情報に加えて動的構造情報を利用できることは、タンパク質の立体構造情報を基礎研究や応用研究に活かしていくためには大きな利点となる。このため、ＮＭＲ法による新たな解析技術の開発には、国際的にも多大な関心が集まっており、世界各地で様々な技術革新競争が展開されている。
タンパク質の立体構造を決定する実験的手法として、現在最も有力な方法はタンパク質の単結晶のＸ線回折を用いるＸ線結晶構造解析法であり、ＰＤＢに毎年集積されるタンパク質の立体構造情報の９０％以上はこのＸ線結晶構造解析法により得られたものである。
一方、１９８０年代に登場したタンパク質の新たな構造決定手法であるＮＭＲ法は、現時点までにＰＤＢ等に提供された立体構造情報の僅か１０％以下を占めるに過ぎないものの、タンパク質が結晶化された状態ではなく、タンパク質が生物学的機能を果たす環境に類似した環境である、水溶液中、ミセル中、及び脂質二重膜中等において、タンパク質中のアミノ酸残基が自由に動き回れる状態での構造決定が可能であり、所謂、「動的構造情報」を得ることが可能であるために、一般に「静的構造情報」を与えるＸ線結晶構造解析法とは全く異なった情報が提供されている。
このように、静的構造情報に加えて動的構造情報を利用できることは、タンパク質の立体構造情報を基礎研究や応用研究に活かしていくためには大きな利点となる。このため、ＮＭＲ法による新たな解析技術の開発には、国際的にも多大な関心が集まっており、世界各地で様々な技術革新競争が展開されている。
ここで、構造解析法として、既に半世紀もの実績を有するＸ線結晶構造解析法は技術として成熟している一方、誕生以来僅か２０年余しか経過していない構造解析法であるＮＭＲ法は、依然、解決すべき多くの問題点を抱えている。そのような問題点のうち、可及的速やかな解決が求められている問題点は、ＮＭＲ法により構造解析が可能なタンパク質が、分子量の比較的小さいタンパク質に限られている点である。
実際、ＮＭＲ法により構造が特定され、ＰＤＢに登録されているタンパク質は、その分子量が概ね１万から２万程度のものである。このような現状での問題を解決するため、（１）安定同位体により標識されたタンパク質試料の調製技術、（２）多次元多核種ＮＭＲ測定技術、（３）ＮＭＲスペクトル情報を利用した立体構造解析技術等、３つの基本的技術分野のそれぞれについて技術改良が進められており、最近では２万から２．５万程度の分子量を有するタンパク質の立体構造についても、ＮＭＲ法を利用して決定できるようになった。しかしながら、これまでの改良技術を利用したＮＭＲ法の全てにおいては、分子量のより大きなタンパク質の構造を決定するため、構造解析の精度をある程度犠牲にすることを前提としていた。このため、従来の技術を利用し、ＮＭＲ法により得られた高分子量タンパク質の立体構造情報においては、その構造解析の精度が不十分となり、このような構造解析の精度の問題が、得られた立体構造情報を医薬品開発等の分野において活用する際の大きな障害となっていた。
実際、ＮＭＲ法により構造が特定され、ＰＤＢに登録されているタンパク質は、その分子量が概ね１万から２万程度のものである。このような現状での問題を解決するため、（１）安定同位体により標識されたタンパク質試料の調製技術、（２）多次元多核種ＮＭＲ測定技術、（３）ＮＭＲスペクトル情報を利用した立体構造解析技術等、３つの基本的技術分野のそれぞれについて技術改良が進められており、最近では２万から２．５万程度の分子量を有するタンパク質の立体構造についても、ＮＭＲ法を利用して決定できるようになった。しかしながら、これまでの改良技術を利用したＮＭＲ法の全てにおいては、分子量のより大きなタンパク質の構造を決定するため、構造解析の精度をある程度犠牲にすることを前提としていた。このため、従来の技術を利用し、ＮＭＲ法により得られた高分子量タンパク質の立体構造情報においては、その構造解析の精度が不十分となり、このような構造解析の精度の問題が、得られた立体構造情報を医薬品開発等の分野において活用する際の大きな障害となっていた。
本発明者らは、これまで、上記（１）から（３）の基本的技術分野の全てに関連する技術を最適化する方法を開発することにより、ＮＭＲ法における分子量の制限を大幅に超えて構造解析が可能な技術を開発するとともに、構造解析の精度の大幅な改善や解析時間の大幅な短縮を図ることが可能であることを実証した（国際公開２００３／０５３９１０号参照）。後に本発明者らがＳＡＩＬ（Stereo-array isotope labeling; 立体整列同位体標識）法と命名したこの新規技術は、革新的な新技術としてＮＭＲ法により構造解析が可能な分子量の範囲を４万から５万程度に向上させ、同時に構造解析の精度も向上させることを可能にした。ＳＡＩＬ法の基本となる考えは、タンパク質を構成するアミノ酸残基の水素原子（1Ｈ）数を、得られる立体構造情報の情報量を低下させることなく大幅に低減させ、より高精度の構造情報を迅速に得ようとするものである。近年、カナダのＮＭＲ研究グループは、タンパク質の疎水性コアを形成するアミノ酸残基のうち、ロイシン（Ｌｅｕ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）のメチル基のみを選択的に13Ｃ1Ｈ3とし、残りの水素原子を全て重水素化することにより分子量１００ｋＤａを越える高分子量タンパク質においてもこれらのアミノ酸残基のメチル基の鋭いＮＭＲシグナルの観測でき、タンパク質のペプチド鎖における折れ曲がり構造を決定できることを報告した。この手法は、得られる構造情報の精度は不十分ながらも、容易に入手可能な上記のメチル標識アミノ酸を利用し簡便に試料を調製できたことと、従来は適用が不可能であると思われていた高分子量のタンパク質へのＮＭＲ法の適用が可能となったことにより、革新的な技術として応用が拡大しつつある。
一方、本発明者らは国際公開２００７／０９９９３４号において、より確実且つ高感度でアミノ酸残基側鎖の13Ｃ、1Ｈシグナルを帰属するための安定同位体標識アミノ酸を開発した。これらの安定同位体標識アミノ酸は、側鎖メチレンプロトン（1Ｈ）を、近傍の水素原子を重水素化することにより孤立させ当該メチレンプロトンに由来するＮＭＲシグナルを高感度で観測することを可能にすると同時に、３Ｊ（13Ｃ−13Ｃ）や３Ｊ（13Ｃ−1Ｈ）等のスピン結合によりシグナル帰属を容易に達成することができる。
一方、本発明者らは国際公開２００７／０９９９３４号において、より確実且つ高感度でアミノ酸残基側鎖の13Ｃ、1Ｈシグナルを帰属するための安定同位体標識アミノ酸を開発した。これらの安定同位体標識アミノ酸は、側鎖メチレンプロトン（1Ｈ）を、近傍の水素原子を重水素化することにより孤立させ当該メチレンプロトンに由来するＮＭＲシグナルを高感度で観測することを可能にすると同時に、３Ｊ（13Ｃ−13Ｃ）や３Ｊ（13Ｃ−1Ｈ）等のスピン結合によりシグナル帰属を容易に達成することができる。
しかしながら、国際公開２００７／０９９９３４号の発明を使用した場合、分子量が８０ｋＤａを超える高分子量タンパク質における13Ｃ−13Ｃ結合の存在は、ＮＭＲスペクトルの測定においてconstant time展開技術を利用することを要求するため、結果としてＮＭＲスペクトルの感度や精度が大きく低下し連鎖帰属などの解析が著しく困難となる。
そこで本発明では、同一アミノ酸残基側鎖のＮＭＲシグナルの観測感度を最高に高め、かつアミノ酸残基内のプロトン間におけるＮＯＥ（nuclear Overhauser effect）を観測可能にすることにより、アミノ酸残基側鎖のシグナルの帰属を可能にする安定同位体標識脂肪族アミノ酸を提供する。即ち、８０ｋＤａを超えるタンパク質の側鎖メチレンプロトンの立体特異的帰属をも可能とし、高分子量タンパク質の詳細な構造情報を入手可能とする新しい安定同位体標識脂肪族アミノ酸を提供する。
そこで本発明では、同一アミノ酸残基側鎖のＮＭＲシグナルの観測感度を最高に高め、かつアミノ酸残基内のプロトン間におけるＮＯＥ（nuclear Overhauser effect）を観測可能にすることにより、アミノ酸残基側鎖のシグナルの帰属を可能にする安定同位体標識脂肪族アミノ酸を提供する。即ち、８０ｋＤａを超えるタンパク質の側鎖メチレンプロトンの立体特異的帰属をも可能とし、高分子量タンパク質の詳細な構造情報を入手可能とする新しい安定同位体標識脂肪族アミノ酸を提供する。
本発明の発明者らは、上記課題に鑑み、鋭意研究を行った。その結果、２個以上の炭素原子を、互いに隣接しないように13Ｃにより標識し、13Ｃで標識した２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基以外の炭素原子には、１個の1Ｈを直接結合させ、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈを直接結合させた安定同位体標識脂肪族アミノ酸によれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成するに至った。
具体的には、本発明は以下のものを提供する。
具体的には、本発明は以下のものを提供する。
［１］タンパク質を構成する安定同位体標識脂肪族アミノ酸であって、次の（１）から（３）の条件を全て充足する安定同位体標識脂肪族アミノ酸：
（１）２個以上の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（２）13Ｃにより標識された２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基の炭素原子以外の炭素原子には、１個の1Ｈが直接結合しており、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈが直接結合している、及び
（３）全ての13Ｃに隣接する他の炭素原子が、全て12Ｃである。
［２］（４）1Ｈが直接結合する13Ｃと、1Ｈが直接結合する他の炭素原子との間に介在する炭素原子が３個以下である、［１］に記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［３］（５）1Ｈが直接結合する前記他の炭素原子が13Ｃにより標識されている、［２］に記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［４］（６）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、少なくとも１つのメチレン鎖の炭素原子が13Ｃにより標識され、この13Ｃに直接結合する２個の水素原子の一方が2Ｈにより立体選択的に標識されている、［１］から［３］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［５］（７）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、12Ｃである炭素原子に直接結合する２個の水素原子が、一方が2Ｈにより標識されているか、２個の水素原子の両方が、共に1Ｈ又は2Ｈである［１］から［４］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［６］（８）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のｇｅｍ−メチル基を12Ｃ2Ｈ3又は13Ｃ2Ｈ3により標識する、［１］から［５］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［７］グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、［１］から［６］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［８］以下の１０種の構造式のうちの１つにより表される［１］から［７］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
（式中、Ｒは13Ｃ1Ｈ3、13Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は13Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｈは1Ｈと同義であり、Ｄは2Ｈと同義であり、Ｃは12Ｃと同義であり、＊は立体中心を示し、上記アミノ酸は当該立体中心についていずれか一方のエナンチオマーである。ｎは０から２であり、ｎが１の場合は、上記アミノ酸は対象となる重水素の結合する炭素原子についてラセミ体でもいずれか一方のエナンチオマーであってもよい。）
（１）２個以上の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（２）13Ｃにより標識された２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基の炭素原子以外の炭素原子には、１個の1Ｈが直接結合しており、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈが直接結合している、及び
（３）全ての13Ｃに隣接する他の炭素原子が、全て12Ｃである。
［２］（４）1Ｈが直接結合する13Ｃと、1Ｈが直接結合する他の炭素原子との間に介在する炭素原子が３個以下である、［１］に記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［３］（５）1Ｈが直接結合する前記他の炭素原子が13Ｃにより標識されている、［２］に記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［４］（６）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、少なくとも１つのメチレン鎖の炭素原子が13Ｃにより標識され、この13Ｃに直接結合する２個の水素原子の一方が2Ｈにより立体選択的に標識されている、［１］から［３］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［５］（７）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、12Ｃである炭素原子に直接結合する２個の水素原子が、一方が2Ｈにより標識されているか、２個の水素原子の両方が、共に1Ｈ又は2Ｈである［１］から［４］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［６］（８）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のｇｅｍ−メチル基を12Ｃ2Ｈ3又は13Ｃ2Ｈ3により標識する、［１］から［５］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［７］グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、［１］から［６］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［８］以下の１０種の構造式のうちの１つにより表される［１］から［７］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
［９］以下の１０種の構造式のうちの１つにより表される［１］から［７］のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
（式中、Ｒは13Ｃ1Ｈ3、13Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は13Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｒ2は1Ｈ又は2Ｈを示し、Ｒ3は12Ｃ1Ｈ3、12Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は12Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｈは1Ｈと同義であり、Ｄは2Ｈと同義であり、Ｃは12Ｃと同義であり、＊は立体中心を示し、上記アミノ酸は当該立体中心についていずれか一方のエナンチオマーである。ｎは０から２であり、ｎが１の場合は、上記アミノ酸は対象となる重水素が結合する炭素原子についてラセミ体でもいずれか一方のエナンチオマーであってもよい。）
［１０］本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物。
［１１］［８］又は［９］に記載された安定同位体標識脂肪族アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物であって、更に、以下の９種の構造式のうちの１つにより表される安定同位体標識アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物。
（式中、Ｒは13Ｃ1Ｈ3、13Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は13Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｈは1Ｈと同義であり、Ｄは2Ｈと同義であり、Ｃは12Ｃと同義である。＊は立体中心を示し、上記アミノ酸は当該立体中心についていずれか一方のエナンチオマーである。）
［１１］［８］又は［９］に記載された安定同位体標識脂肪族アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物であって、更に、以下の９種の構造式のうちの１つにより表される安定同位体標識アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物。
［１２］本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の存在下、培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成する工程を含む安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法。
［１３］本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法により得られた精製されたタンパク質の溶液のＮＭＲスペクトルを測定する工程を含むタンパク質のＮＭＲ構造解析法。
［１３］本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法により得られた精製されたタンパク質の溶液のＮＭＲスペクトルを測定する工程を含むタンパク質のＮＭＲ構造解析法。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、２個以上の炭素原子を、互いに隣接しないように13Ｃにより標識し、13Ｃで標識した２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基以外の炭素原子には、１個の1Ｈを直接結合させ、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈを直接結合させているので、ＮＭＲ法によるタンパク質の構造解析に際して、アミノ酸残基側鎖のＮＭＲシグナルの観測感度が十分に高められ、アミノ酸残基内のプロトン間におけるＮＯＥを観測可能なものとして、これによりアミノ酸残基側鎖のシグナル帰属を可能とする。このため、従来不可能であった８０ｋＤａを越えるタンパク質の側鎖メチレンプロトンの立体構造解析をも可能とし、高分子量タンパク質の詳細な構造情報を入手することを可能とする。
以下、本発明について、図面を参照して詳細に説明する。
＜安定同位体標識脂肪族アミノ酸＞
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、以下の（１）から（３）の条件を全て充足する。
（１）２個以上の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（２）13Ｃにより標識された２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基の炭素原子以外の炭素原子には、１個の1Ｈが直接結合しており、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈが直接結合している、及び
（３）全ての13Ｃに隣接する他の炭素原子が、全て12Ｃである。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸を利用することにより、ＮＭＲ法によるタンパク質の構造解析に際して、アミノ酸残基のＮＭＲシグナルの観測感度が十分に高められ、アミノ酸残基内のプロトン間におけるＮＯＥを観測可能なものとして、これによりアミノ酸残基側鎖のシグナル帰属を可能とする。このため、従来不可能であった８０ｋＤａを越えるタンパク質の側鎖メチレンプロトンの立体構造解析をも可能とし、高分子量タンパク質の詳細な構造情報を入手することを可能とする。
即ち、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（１）及び（３）を充足することにより、スピン結合による13Ｃシグナルの複雑化を回避することができる。国際公開２００３／０５３９１０号及び２に記載される方法を含め、従来公知の方法では、13Ｃ−13Ｃのスピン結合を利用して安定同位体標識脂肪族アミノ酸に由来する13Ｃシグナルの帰属を行っていたため、ＮＭＲスペクトルの感度や分解能を犠牲にする手法であるconstant time展開技術を採用して、スペクトルの複雑化を回避する必要があったが、安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（１）及び（３）を充足することにより、constant time展開技術を採用しなくとも、安定同位体標識脂肪族アミノ酸に由来する13Ｃシグナルの複雑化を回避することが可能になる。このため、より高分子量のタンパク質であっても、高感度・高分解能でＮＭＲ構造解析法を実施することが可能となる。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（２）を充足するので、ＮＯＥを利用した1Ｈシグナルの帰属により決定される立体構造情報が保持されると共に、安定同位体標識脂肪族アミノ酸の側鎖中の1Ｈが過剰に残存することがないため、1Ｈに由来するシグナルが双極子相互作用により広幅化することを回避できる。これにより、より高分子量のタンパク質であっても、高感度・高分解能でＮＭＲ構造解析法を実施することが可能となる。
つまり、本発明においては、13Ｃに結合する1Ｈが、アミノ酸中で他の13Ｃ−1Ｈから孤立しているため、この1ＨのＮＭＲシグナルの複雑化が防止され、13Ｃ−1Ｈに由来するシグナルを高感度・高解像度で観測することができる。
＜安定同位体標識脂肪族アミノ酸＞
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、以下の（１）から（３）の条件を全て充足する。
（１）２個以上の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（２）13Ｃにより標識された２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基の炭素原子以外の炭素原子には、１個の1Ｈが直接結合しており、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈが直接結合している、及び
（３）全ての13Ｃに隣接する他の炭素原子が、全て12Ｃである。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸を利用することにより、ＮＭＲ法によるタンパク質の構造解析に際して、アミノ酸残基のＮＭＲシグナルの観測感度が十分に高められ、アミノ酸残基内のプロトン間におけるＮＯＥを観測可能なものとして、これによりアミノ酸残基側鎖のシグナル帰属を可能とする。このため、従来不可能であった８０ｋＤａを越えるタンパク質の側鎖メチレンプロトンの立体構造解析をも可能とし、高分子量タンパク質の詳細な構造情報を入手することを可能とする。
即ち、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（１）及び（３）を充足することにより、スピン結合による13Ｃシグナルの複雑化を回避することができる。国際公開２００３／０５３９１０号及び２に記載される方法を含め、従来公知の方法では、13Ｃ−13Ｃのスピン結合を利用して安定同位体標識脂肪族アミノ酸に由来する13Ｃシグナルの帰属を行っていたため、ＮＭＲスペクトルの感度や分解能を犠牲にする手法であるconstant time展開技術を採用して、スペクトルの複雑化を回避する必要があったが、安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（１）及び（３）を充足することにより、constant time展開技術を採用しなくとも、安定同位体標識脂肪族アミノ酸に由来する13Ｃシグナルの複雑化を回避することが可能になる。このため、より高分子量のタンパク質であっても、高感度・高分解能でＮＭＲ構造解析法を実施することが可能となる。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（２）を充足するので、ＮＯＥを利用した1Ｈシグナルの帰属により決定される立体構造情報が保持されると共に、安定同位体標識脂肪族アミノ酸の側鎖中の1Ｈが過剰に残存することがないため、1Ｈに由来するシグナルが双極子相互作用により広幅化することを回避できる。これにより、より高分子量のタンパク質であっても、高感度・高分解能でＮＭＲ構造解析法を実施することが可能となる。
つまり、本発明においては、13Ｃに結合する1Ｈが、アミノ酸中で他の13Ｃ−1Ｈから孤立しているため、この1ＨのＮＭＲシグナルの複雑化が防止され、13Ｃ−1Ｈに由来するシグナルを高感度・高解像度で観測することができる。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、更に、以下の条件（４）から（８）からなる群から選ばれる少なくとも１以上の条件を充足することが好ましい。
（４）1Ｈが直接結合する13Ｃと、1Ｈが直接結合する他の炭素原子との間に介在する炭素原子が３個以下である、
（５）条件（４）において、1Ｈが直接結合する前記他の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（６）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、少なくとも１つのメチレン鎖の炭素原子が13Ｃにより標識され、この13Ｃに直接結合する２個の水素原子の一方が2Ｈにより立体選択的に標識されている、
（７）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、12Ｃである炭素原子に直接結合する２個の水素原子が、一方が2Ｈにより標識されているか、２個の水素原子の両方が、共に1Ｈ又は2Ｈである、
（８）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のｇｅｍ−メチル基を12Ｃ2Ｈ3又は13Ｃ2Ｈ3により標識する。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、これら任意の条件のうち、（４）から（６）の条件を同時に充足することが好ましい。
（４）1Ｈが直接結合する13Ｃと、1Ｈが直接結合する他の炭素原子との間に介在する炭素原子が３個以下である、
（５）条件（４）において、1Ｈが直接結合する前記他の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（６）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、少なくとも１つのメチレン鎖の炭素原子が13Ｃにより標識され、この13Ｃに直接結合する２個の水素原子の一方が2Ｈにより立体選択的に標識されている、
（７）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、12Ｃである炭素原子に直接結合する２個の水素原子が、一方が2Ｈにより標識されているか、２個の水素原子の両方が、共に1Ｈ又は2Ｈである、
（８）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のｇｅｍ−メチル基を12Ｃ2Ｈ3又は13Ｃ2Ｈ3により標識する。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、これら任意の条件のうち、（４）から（６）の条件を同時に充足することが好ましい。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（４）を充足することにより、複数の1Ｈの間で観察されるＮＯＥを利用して1Ｈシグナルの帰属を行うことが容易となり、従来行われていた連鎖帰属法を利用せずにタンパク質中のアミノ酸残基の構造を帰属することが容易になる。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（５）を充足することにより、複数の1Ｈの間で観察されるＮＯＥを利用して1Ｈシグナルの帰属を行うことが更に容易となり、従来行われていた連鎖帰属法を利用せずにタンパク質中のアミノ酸残基の構造を帰属することが更に容易になる。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（６）を充足することにより、13Ｃ−1Ｈに由来するシグナルを単純化できると共に、1Ｈが立体選択的に13Ｃに結合しているので、−13Ｃ1Ｈ2Ｈ−全体の立体特異的帰属も可能となる。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（７）を充足することにより、12Ｃに結合する両方の水素原子が2Ｈにより標識されている場合には、他の炭素原子に結合している1Ｈシグナルを単純化できると共に、12Ｃに結合する水素原子の少なくとも一方が、1Ｈである場合には、他の炭素原子に結合している1Ｈとの間で観測されるＮＯＥにより、タンパク質中のアミノ酸残基の構造を帰属することが可能となる。
更に、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（８）を充足することにより、メチル基のシグナルの数を低減することができるため、シグナルの複雑化を回避することができる。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（５）を充足することにより、複数の1Ｈの間で観察されるＮＯＥを利用して1Ｈシグナルの帰属を行うことが更に容易となり、従来行われていた連鎖帰属法を利用せずにタンパク質中のアミノ酸残基の構造を帰属することが更に容易になる。
本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（６）を充足することにより、13Ｃ−1Ｈに由来するシグナルを単純化できると共に、1Ｈが立体選択的に13Ｃに結合しているので、−13Ｃ1Ｈ2Ｈ−全体の立体特異的帰属も可能となる。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（７）を充足することにより、12Ｃに結合する両方の水素原子が2Ｈにより標識されている場合には、他の炭素原子に結合している1Ｈシグナルを単純化できると共に、12Ｃに結合する水素原子の少なくとも一方が、1Ｈである場合には、他の炭素原子に結合している1Ｈとの間で観測されるＮＯＥにより、タンパク質中のアミノ酸残基の構造を帰属することが可能となる。
更に、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸が、条件（８）を充足することにより、メチル基のシグナルの数を低減することができるため、シグナルの複雑化を回避することができる。
安定同位体脂肪族アミノ酸としては、上記条件（１）から（３）を充足し、タンパク質を構成する脂肪族アミノ酸であれば、特に限定されるものではないが、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）であることが好ましい。
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、具体的には、以下の１０種の構造式のうちの１つにより表されるものであることが好ましい。
（式中、Ｒは13Ｃ1Ｈ3、13Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は13Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｈは1Ｈと同義であり、Ｄは2Ｈと同義であり、Ｃは12Ｃと同義であり、＊は立体中心を示し、上記アミノ酸は当該立体中心についていずれか一方のエナンチオマーである。ｎは０から２であり、ｎが１の場合は、上記アミノ酸は対象となる重水素の結合する炭素原子についてラセミ体でもいずれか一方のエナンチオマーであってもよい。）
また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、具体的には、以下の１０種の構造式のうちの１つにより表されるものであることが好ましい。
更に、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、以下の１０種の構造式のうちの１つにより表されるものであることが更に好ましい。
（式中、Ｒは13Ｃ1Ｈ3、13Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は13Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｒ2は1Ｈ又は2Ｈを示し、Ｒ3は12Ｃ1Ｈ3、12Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は12Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｈは1Ｈと同義であり、Ｄは2Ｈと同義であり、Ｃは12Ｃと同義であり、＊は立体中心を示し、上記アミノ酸は当該立体中心についていずれか一方のエナンチオマーである。ｎは０から２であり、ｎが１の場合は、上記アミノ酸は対象となる重水素が結合する炭素原子についてラセミ体でもいずれか一方のエナンチオマーであってもよい。）
これらの安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、従来公知の調製方法を採用し、脂肪族アミノ酸中における同位体標識部位に応じて、特異的に13Ｃや2Ｈにより標識された反応原料を用いることにより調製することができる。即ち、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、例えば、国際公開２００３／０５３９１０号に記載されたアミノ酸の調製方法に準じて調製することができ、使用される安定同位体標識された反応原料についても、大陽日酸株式会社等から上市されている反応原料等（「Acetic acid-2-13C」、「Acetic acid-1-13C」、「deuterium oxide」、「Deuterium」、「Glycine-2-13C,15N」等）を使用すればよい。また、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸は、以下の文献１から４に記載されたアミノ酸の調製方法に準じて調製してもよい。なお、国際公開２００３／０５３９１０号の記載内容については、参照により本明細書の記載に組み込まれるものとする。
［文献１］Oba, M.; Ueno, R.; Fukuoka (nee Yoshida), M.; Kainosho, M.; Nishiyama, K., Synthesis of L-threo- and L-erythro-[1-13C, 2,3-2H2]amino acids: novel probes for conformational analysis of peptide side chains., J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1995, 1603.
［文献２］Terauchi, T.; Kamikawai, T.; Vinogradov, M. G.; Starodubtseva, E. V.; Takeda, M.; Kainosho, M. Synthesis of stereoarray isotope labeled (SAIL) lysine via the "head-to-tail" conversion of SAIL glutamic acid. Org. Lett., 2011, 13, 161-163.
［文献３］Okuma, K.; Ono, A. M.; Tsuchiya, S.; Oba, M.; Nishiyama, K.; Kainosho, M.; Terauchi, T. Assymetric synthesis of (2S,3R)- and (2S,3S)-[2-13C;3-2H] glutamic acid. Tetrahedron Lett., 2009, 50, 1482-1484.
［文献４］Terauchi, T.; Kobayashi, K.; Okuma, K.; Oba, M.; Nishiyama, K.; Kainosho, M. Stereoselective synthesis of triply isotope-labeled Ser, Cys, and Ala: amino acids for stereoarray isotope labeling technology. Org. lett., 2008, 10, 2785-7.
［文献２］Terauchi, T.; Kamikawai, T.; Vinogradov, M. G.; Starodubtseva, E. V.; Takeda, M.; Kainosho, M. Synthesis of stereoarray isotope labeled (SAIL) lysine via the "head-to-tail" conversion of SAIL glutamic acid. Org. Lett., 2011, 13, 161-163.
［文献３］Okuma, K.; Ono, A. M.; Tsuchiya, S.; Oba, M.; Nishiyama, K.; Kainosho, M.; Terauchi, T. Assymetric synthesis of (2S,3R)- and (2S,3S)-[2-13C;3-2H] glutamic acid. Tetrahedron Lett., 2009, 50, 1482-1484.
［文献４］Terauchi, T.; Kobayashi, K.; Okuma, K.; Oba, M.; Nishiyama, K.; Kainosho, M. Stereoselective synthesis of triply isotope-labeled Ser, Cys, and Ala: amino acids for stereoarray isotope labeling technology. Org. lett., 2008, 10, 2785-7.
＜安定同位体標識脂肪族アミノ酸を含む組成物＞
本発明は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸を含む組成物にも関する。本発明の組成物は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸からなる群から選ばれる少なくとも１種と、担体とを含む。本発明の組成物における、各安定同位体標識脂肪族アミノ酸の組合せ、及びその濃度は、本発明の組成物の使用目的に応じて適宜調整すればよい。
なお、本発明の組成物が、安定同位体標識脂肪族アミノ酸として、上記した２０種の具体的な構造式で表されるＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、及びＶａｌから選ばれる少なくとも１種を含む場合、本発明の組成物は、更に、以下の９種の構造式のうちの１つにより表される安定同位体標識アミノ酸のうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。
（式中、Ｒは13Ｃ1Ｈ3、13Ｃ1Ｈ2Ｄ、又は13Ｃ1ＨＤ2を示し、Ｈは1Ｈと同義であり、Ｄは2Ｈと同義であり、Ｃは12Ｃと同義である。＊は立体中心を示し、上記アミノ酸は当該立体中心についていずれか一方のエナンチオマーである。）
本発明は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸を含む組成物にも関する。本発明の組成物は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸からなる群から選ばれる少なくとも１種と、担体とを含む。本発明の組成物における、各安定同位体標識脂肪族アミノ酸の組合せ、及びその濃度は、本発明の組成物の使用目的に応じて適宜調整すればよい。
なお、本発明の組成物が、安定同位体標識脂肪族アミノ酸として、上記した２０種の具体的な構造式で表されるＡｒｇ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｔｈｒ、及びＶａｌから選ばれる少なくとも１種を含む場合、本発明の組成物は、更に、以下の９種の構造式のうちの１つにより表される安定同位体標識アミノ酸のうちの少なくとも１種を含むことが好ましい。
＜安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法＞
本発明は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法にも関する。ここで、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸の存在下、培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成する工程を含む方法である。
即ち、本発明においては、ＮＭＲ法による構造解析の目的とするタンパク質をコードする遺伝子断片を、上記培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系等において過剰発現可能な態様でこれらの系に導入し、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸の存在下、タンパク質を過剰発現させることにより、特定のアミノ酸残基が本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸に由来するアミノ酸残基により置換されたタンパク質を合成するものである。
このような安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法を実施する際の詳細な条件は、培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系を使用した従来のタンパク質の過剰発現の方法に準じた条件とすればよい。
本発明は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法にも関する。ここで、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸の存在下、培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成する工程を含む方法である。
即ち、本発明においては、ＮＭＲ法による構造解析の目的とするタンパク質をコードする遺伝子断片を、上記培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系等において過剰発現可能な態様でこれらの系に導入し、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸の存在下、タンパク質を過剰発現させることにより、特定のアミノ酸残基が本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸に由来するアミノ酸残基により置換されたタンパク質を合成するものである。
このような安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法を実施する際の詳細な条件は、培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系を使用した従来のタンパク質の過剰発現の方法に準じた条件とすればよい。
＜タンパク質のＮＭＲ構造解析法＞
本発明は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法により得られた精製タンパク質の溶液のＮＭＲスペクトルを測定する工程を含むタンパク質のＮＭＲ構造解析法にも関する。ＮＭＲスペクトルの測定方法は、従来公知の手法を採用すればよく、ＮＭＲスペクトルの測定にあたって、当該タンパク質を、従来公知のリガンドや、他のタンパク質に結合させた状態とし、当該タンパク質、リガンド、及び他のタンパク質が複合体を形成した状態で、ＮＭＲスペクトルを測定してもよい。
これらのＮＭＲ構造解析法を実施する際の詳細な条件は、従来のＮＭＲ構造解析法に準じたものとすればよい。
本発明は、上記安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法により得られた精製タンパク質の溶液のＮＭＲスペクトルを測定する工程を含むタンパク質のＮＭＲ構造解析法にも関する。ＮＭＲスペクトルの測定方法は、従来公知の手法を採用すればよく、ＮＭＲスペクトルの測定にあたって、当該タンパク質を、従来公知のリガンドや、他のタンパク質に結合させた状態とし、当該タンパク質、リガンド、及び他のタンパク質が複合体を形成した状態で、ＮＭＲスペクトルを測定してもよい。
これらのＮＭＲ構造解析法を実施する際の詳細な条件は、従来のＮＭＲ構造解析法に準じたものとすればよい。
以下、本発明について、実施例を挙げて詳細に説明する。なお、本発明は、以下に示す実施例に何ら限定されるものではない。
＜安定同位体標識ロイシンの合成＞
上記［文献１］から［文献３］、及び以下の［文献５］に記載された手法に準じ、公知の合成法によって、化学式１及び２で示される２種の安定同位体標識ロイシン（以下、それぞれ「Ｌｅｕ（１）」及び「Ｌｅｕ（２）」と表示することがある）を合成した。各安定同位体標識ロイシンの合成方法を以下に示す。
［文献５］Nahm, S.; Weinreb, S. M., N-Methoxy-N-methylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 38153818.
上記［文献１］から［文献３］、及び以下の［文献５］に記載された手法に準じ、公知の合成法によって、化学式１及び２で示される２種の安定同位体標識ロイシン（以下、それぞれ「Ｌｅｕ（１）」及び「Ｌｅｕ（２）」と表示することがある）を合成した。各安定同位体標識ロイシンの合成方法を以下に示す。
［文献５］Nahm, S.; Weinreb, S. M., N-Methoxy-N-methylamides as effective acylating agents. Tetrahedron Lett., 1981, 22, 38153818.
＜安定同位体標識ロイシンを組み込んだタンパク質の調製＞
Ｌｅｕ（１）を組み込んだリンゴ酸合成酵素Ｇ（分子量８２ｋＤａ；以下、「ＭＳＧ」と表示することがある）は、以下の文献６の方法に準じて公知の手法により調製したが、ロイシンの添加及び培養方法は以下のように変更した。リンゴ酸合成酵素Ｇ（ＭＳＧ）をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドＭＳＧ−ｐＥＴ２８ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ形質転換した後、この形質転換された大腸菌を、軽水を用いて調製されたＬＢ培地（２ｍｌ）中で増殖させた。増殖した菌体を集菌し、これを、重水を用いて調製されたＭ９培地（３ｍｌ）中、各種ビタミン存在下、３７℃で、２０時間培養した後、Ｌｅｕ（１）（０．６７ｍｇ）を溶解させた本培養用培地（１００ｍｌ）に植菌し、３７℃でＯＤ600が０．３程度になるまで培養した。得られた培養液に、Ｌｅｕ（１）（１．３３ｍｇ）及びＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を更に添加してＭＳＧの合成を誘導し、３７℃で８時間培養後、菌体を遠心集菌した。得られた菌体からタンパク質を文献６の方法に準じた公知の方法で精製することにより［Ｌｅｕ（１）；2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧを得た。［Ｌｅｕ（２）；2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧについてもＬｅｕ（１）と同様の手法を用いて調製した。
［文献６］Tugarinov V, Muhandiram R, Ayed A, Kay LE, Four-dimensional NMR spectroscopy of a 723-residue protein: Chemical shift assignments and secondary structure of malate synthase G. J Am Chem Soc, 2002, 124: 10025-10035.
Ｌｅｕ（１）を組み込んだリンゴ酸合成酵素Ｇ（分子量８２ｋＤａ；以下、「ＭＳＧ」と表示することがある）は、以下の文献６の方法に準じて公知の手法により調製したが、ロイシンの添加及び培養方法は以下のように変更した。リンゴ酸合成酵素Ｇ（ＭＳＧ）をコードするＤＮＡ配列を有するプラスミドＭＳＧ−ｐＥＴ２８ｂを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ形質転換した後、この形質転換された大腸菌を、軽水を用いて調製されたＬＢ培地（２ｍｌ）中で増殖させた。増殖した菌体を集菌し、これを、重水を用いて調製されたＭ９培地（３ｍｌ）中、各種ビタミン存在下、３７℃で、２０時間培養した後、Ｌｅｕ（１）（０．６７ｍｇ）を溶解させた本培養用培地（１００ｍｌ）に植菌し、３７℃でＯＤ600が０．３程度になるまで培養した。得られた培養液に、Ｌｅｕ（１）（１．３３ｍｇ）及びＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を更に添加してＭＳＧの合成を誘導し、３７℃で８時間培養後、菌体を遠心集菌した。得られた菌体からタンパク質を文献６の方法に準じた公知の方法で精製することにより［Ｌｅｕ（１）；2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧを得た。［Ｌｅｕ（２）；2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧについてもＬｅｕ（１）と同様の手法を用いて調製した。
［文献６］Tugarinov V, Muhandiram R, Ayed A, Kay LE, Four-dimensional NMR spectroscopy of a 723-residue protein: Chemical shift assignments and secondary structure of malate synthase G. J Am Chem Soc, 2002, 124: 10025-10035.
＜ＮＭＲ法による構造解析＞
本発明のＮＭＲ構造解析法と、従来法との比較を行うため、図１にその構造を示す［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｌｅｕ、図２にその構造を示すＳＡＩＬ−Ｌｅｕ、図３にその構造を示すｏｒｏ−ＳＡＩＬ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）を用いて調製した［2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧのＣＴ ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣを測定した（図１から図５）。これらのサンプルのＨα水素は、重水中で培養されているため代謝により重水素原子で標識されている。ＭＳＧは７２３残基のアミノ酸からなる高分子量タンパク質であり、ロイシン残基だけでも７０残基存在する。［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｌｅｕを組み込んだＭＳＧではβ位のシグナルは１４０個観測されるはずであるものの、実際には、隣接する13Ｃ及び1Ｈ核間の緩和現象の影響によりシグナルの広幅化が顕著となり、β位のシグナルはほとんど観測されなかった（図１）。また、ＳＡＩＬ−Ｌｅｕにおいては、βプロトンの片方が重水素化されていることから測定感度は［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｌｅｕと比べて若干向上しているものの、７０残基のうち３３残基分のシグナルしか観測されなかった（図２）。また、ｏｒｏ−ＳＡＩＬ−Ｌｅｕにおいては、βプロトンのビシナル位に存在する水素がすべて重水素化されている効果により、ＳＡＩＬ−Ｌｅｕと比べ観測されるβ位のシグナル数が増加しているものの、依然13Ｃ核間の緩和現象の影響により、十分な感度が得られず７０残基のうち３８残基のみが観測されるに過ぎなかった（図３）。一方、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の一例であるＬｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）では、β位とδ位の炭素原子及び水素原子が、特異的に13Ｃ及び2Ｈにより標識されており、緩和の影響を極限まで排除している。その結果、Ｌｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）を組み込んだＭＳＧにおいては、それぞれ６６残基及び６７残基分のβプロトンに由来するシグナルを観測することが可能となった（図４、図５）。
本発明のＮＭＲ構造解析法と、従来法との比較を行うため、図１にその構造を示す［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｌｅｕ、図２にその構造を示すＳＡＩＬ−Ｌｅｕ、図３にその構造を示すｏｒｏ−ＳＡＩＬ−Ｌｅｕ、Ｌｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）を用いて調製した［2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧのＣＴ ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣを測定した（図１から図５）。これらのサンプルのＨα水素は、重水中で培養されているため代謝により重水素原子で標識されている。ＭＳＧは７２３残基のアミノ酸からなる高分子量タンパク質であり、ロイシン残基だけでも７０残基存在する。［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｌｅｕを組み込んだＭＳＧではβ位のシグナルは１４０個観測されるはずであるものの、実際には、隣接する13Ｃ及び1Ｈ核間の緩和現象の影響によりシグナルの広幅化が顕著となり、β位のシグナルはほとんど観測されなかった（図１）。また、ＳＡＩＬ−Ｌｅｕにおいては、βプロトンの片方が重水素化されていることから測定感度は［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｌｅｕと比べて若干向上しているものの、７０残基のうち３３残基分のシグナルしか観測されなかった（図２）。また、ｏｒｏ−ＳＡＩＬ−Ｌｅｕにおいては、βプロトンのビシナル位に存在する水素がすべて重水素化されている効果により、ＳＡＩＬ−Ｌｅｕと比べ観測されるβ位のシグナル数が増加しているものの、依然13Ｃ核間の緩和現象の影響により、十分な感度が得られず７０残基のうち３８残基のみが観測されるに過ぎなかった（図３）。一方、本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の一例であるＬｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）では、β位とδ位の炭素原子及び水素原子が、特異的に13Ｃ及び2Ｈにより標識されており、緩和の影響を極限まで排除している。その結果、Ｌｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）を組み込んだＭＳＧにおいては、それぞれ６６残基及び６７残基分のβプロトンに由来するシグナルを観測することが可能となった（図４、図５）。
Ｌｅｕ（１）とＬｅｕ（２）を利用することにより、高分子量タンパク質においても、高感度で且つ立体特異的にβプロトンを観測する事が可能となることが分かった（図６、図７）。さらに、アミノ酸残基内のアミドプロトンやδメチルプロトンと、βプロトンとのＮＯＥを解析することで、配列特異的な連鎖帰属やＬｅｕ側鎖の立体配座を簡便に決定する事が可能となる。例として、ＭＳＧの１８０番目のロイシン（Ｌ１８０）の残基内ＮＯＥのスペクトルを図８に示す。Ｌ１８０のδ１メチルプロトン（図１０のａ）、δ２メチルプロトン（図１０のｂ）及びアミドプロトン（図１０のｃ）から、Ｌ１８０のβ２、β３プロトンのシグナルが観測されたが、各々のシグナル強度の関係が異なっていることが分かる。つまり、この結果から、δ１メチルプロトンとβ２、β３プロトンは同程度の距離にあり、δ２メチルプロトンからは、β３プロトンがβ２プロトンよりも近い位置にあることが分かる。一方、アミドプロトンからはβ２プロトンの方がβ３プロトンよりも近い位置にあることが分かる。
これらの結果から、Ｌ１８０の各原子団の相対配置が明らかとなり、立体配座を正確に決定できる（図９）。
ここで、Ｌｅｕ残基は一般に、タンパク質内部に存在し、他のアミノ酸残基と疎水性相互作用を介したコア構造を形成することが多い。従って、Ｌｅｕ残基由来の情報は、タンパク質の立体構造解析において非常に有用である。本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の一例であるＬｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）は、高分子量タンパク質中においても高感度のシグナルを与え、且つ立体配座の情報も与えることができるため、溶液ＮＭＲ法による高分子量タンパク質の立体構造解析法に新しい道を示すものとなる。
これらの結果から、Ｌ１８０の各原子団の相対配置が明らかとなり、立体配座を正確に決定できる（図９）。
ここで、Ｌｅｕ残基は一般に、タンパク質内部に存在し、他のアミノ酸残基と疎水性相互作用を介したコア構造を形成することが多い。従って、Ｌｅｕ残基由来の情報は、タンパク質の立体構造解析において非常に有用である。本発明の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の一例であるＬｅｕ（１）及びＬｅｕ（２）は、高分子量タンパク質中においても高感度のシグナルを与え、且つ立体配座の情報も与えることができるため、溶液ＮＭＲ法による高分子量タンパク質の立体構造解析法に新しい道を示すものとなる。
＜安定同位体標識プロリンの合成＞
下記［文献７］から［文献９］に記載された手法に準じ、公知の合成法によって、化学式３で示される安定同位体標識プロリン（以下、Ｐｒｏ（３）と表示することがある）を合成した。各安定同位体標識プロリンの合成方法を以下に示す。
下記［文献７］から［文献９］に記載された手法に準じ、公知の合成法によって、化学式３で示される安定同位体標識プロリン（以下、Ｐｒｏ（３）と表示することがある）を合成した。各安定同位体標識プロリンの合成方法を以下に示す。
［文献７］Iida, K.; Kajiwara, M. J. Label. Compd. Radiopharm. 1991, 29, 201.
［文献８］Kajiwara, M.; Lee, S.-F.; Scott, A. I.; Akhtar, M.; Jones, C. R.; Jordan, P. M. Chem. Commun. 1978, 967.
［文献９］Reddy, L. R.; Reddy, B. V. S.; Corey, E. J. Org. lett., 2006, 8, 2819.
［文献８］Kajiwara, M.; Lee, S.-F.; Scott, A. I.; Akhtar, M.; Jones, C. R.; Jordan, P. M. Chem. Commun. 1978, 967.
［文献９］Reddy, L. R.; Reddy, B. V. S.; Corey, E. J. Org. lett., 2006, 8, 2819.
＜安定同位体標識プロリンを組み込んだタンパク質の調製＞
上記の安定同位体標識プロリンＰｒｏ（３）を用いたリンゴ酸合成酵素Ｇ（ＭＳＧ）は、文献６の方法に従い調製したが、安定同位体標識プロリンＰｒｏ（３）の添加方法及び培養方法は以下のように変更した。ＭＳＧ−ｐＥＴ２８ｂプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ導入した後、軽水を用いて調製されたＬＢ培地（２ｍｌ）で増殖させた。これを、重水を用いて調製されたＭ９培地（３ｍｌ）中、各種ビタミンの存在下で、３７℃、２０時間培養した後、安定同位体標識プロリン（Ｐｒｏ（３）、１ｍｇ）が溶解している本培養用培地（１００ｍｌ）に植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．３程度になるまで培養した。得られた培地に安定同位体標識プロリン（Ｐｒｏ（３）、２ｍｇ）及びＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加し、３７℃で８時間培養後、遠心集菌した。得られた菌体からタンパク質を文献６に従い精製することにより［Ｐｒｏ；2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧが得られた。
上記の安定同位体標識プロリンＰｒｏ（３）を用いたリンゴ酸合成酵素Ｇ（ＭＳＧ）は、文献６の方法に従い調製したが、安定同位体標識プロリンＰｒｏ（３）の添加方法及び培養方法は以下のように変更した。ＭＳＧ−ｐＥＴ２８ｂプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ株へ導入した後、軽水を用いて調製されたＬＢ培地（２ｍｌ）で増殖させた。これを、重水を用いて調製されたＭ９培地（３ｍｌ）中、各種ビタミンの存在下で、３７℃、２０時間培養した後、安定同位体標識プロリン（Ｐｒｏ（３）、１ｍｇ）が溶解している本培養用培地（１００ｍｌ）に植菌し、３７℃でＯＤ６００＝０．３程度になるまで培養した。得られた培地に安定同位体標識プロリン（Ｐｒｏ（３）、２ｍｇ）及びＩＰＴＧ（終濃度１ｍＭ）を添加し、３７℃で８時間培養後、遠心集菌した。得られた菌体からタンパク質を文献６に従い精製することにより［Ｐｒｏ；2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧが得られた。
＜ＮＭＲ法による構造解析＞
従来法との比較を行うため、図１０及び図１１にその構造を示す［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｐｒｏ、図１２及び図１３にその構造を示すＳＡＩＬ−Ｐｒｏ、並びに図１４から図１６にその構造を示すＰｒｏ（３）を用いて調製した［2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧのＣＴ ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣを測定した。ＭＳＧは７２３残基のアミノ酸からなる高分子量タンパク質であり、プロリン残基だけでも３１残基存在する。［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｐｒｏを組み込んだＭＳＧのα位及びγ位のシグナルはそれぞれ３１個および６２個観測されるはずだが、実際には、隣接する13Ｃ、1Ｈ核間の緩和現象の影響によりシグナルの広幅化が顕著となり、シグナルはほとんど観測されない（図１０及び１１）。また、ＳＡＩＬ−Ｐｒｏにおいても同様に側鎖のプロトンの片方が重水素化されているが、13Ｃ核間の緩和現象の影響により、十分な感度が得られず３１残基のうちのほとんどが観測されていない（図１２及び１３）。一方、本発明で示したＰｒｏ（３）では、α位とγ位が特異的に13Ｃ、1Ｈ標識されており、緩和の影響を極限まで排除している。その結果、Ｐｒｏ（３）を組み込んだＭＳＧにおいては、α位は３１残基分のプロトンに由来するシグナルを観測することが可能となる（図１４から１６）。
従来法との比較を行うため、図１０及び図１１にその構造を示す［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｐｒｏ、図１２及び図１３にその構造を示すＳＡＩＬ−Ｐｒｏ、並びに図１４から図１６にその構造を示すＰｒｏ（３）を用いて調製した［2Ｈ；15Ｎ］ＭＳＧのＣＴ ＴＲＯＳＹ−ＨＳＱＣを測定した。ＭＳＧは７２３残基のアミノ酸からなる高分子量タンパク質であり、プロリン残基だけでも３１残基存在する。［ｕｌ−13Ｃ；15Ｎ］Ｐｒｏを組み込んだＭＳＧのα位及びγ位のシグナルはそれぞれ３１個および６２個観測されるはずだが、実際には、隣接する13Ｃ、1Ｈ核間の緩和現象の影響によりシグナルの広幅化が顕著となり、シグナルはほとんど観測されない（図１０及び１１）。また、ＳＡＩＬ−Ｐｒｏにおいても同様に側鎖のプロトンの片方が重水素化されているが、13Ｃ核間の緩和現象の影響により、十分な感度が得られず３１残基のうちのほとんどが観測されていない（図１２及び１３）。一方、本発明で示したＰｒｏ（３）では、α位とγ位が特異的に13Ｃ、1Ｈ標識されており、緩和の影響を極限まで排除している。その結果、Ｐｒｏ（３）を組み込んだＭＳＧにおいては、α位は３１残基分のプロトンに由来するシグナルを観測することが可能となる（図１４から１６）。
Claims (13)
- タンパク質を構成する安定同位体標識脂肪族アミノ酸であって、次の（１）から（３）の条件：
（１）２個以上の炭素原子が13Ｃにより標識されている、
（２）13Ｃにより標識された２個以上の炭素原子のうち、水素原子が結合可能である、メチル基の炭素原子以外の炭素原子には、１個の1Ｈが直接結合しており、メチル基の炭素原子には少なくとも１個の1Ｈが直接結合している、及び
（３）全ての13Ｃに隣接する他の炭素原子が、全て12Ｃである、
を全て充足し、
前記アミノ酸がロイシンである場合には、アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、少なくとも１つのメチレン鎖の炭素原子が 13 Ｃにより標識され、この 13 Ｃに直接結合する２個の水素原子の一方が 2 Ｈにより立体選択的に標識されていることを特徴とする、安定同位体標識脂肪族アミノ酸。 - （４）1Ｈが直接結合する13Ｃと、1Ｈが直接結合する他の炭素原子との間に介在する炭素原子が３個以下である、請求項１に記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- （５）1Ｈが直接結合する前記他の炭素原子が13Ｃにより標識されている、請求項２に記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- （６）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、少なくとも１つのメチレン鎖の炭素原子が13Ｃにより標識され、この13Ｃに直接結合する２個の水素原子の一方が2Ｈにより立体選択的に標識されている、請求項１から３のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- （７）アミノ酸の側鎖に存在するメチレン鎖のうち、12Ｃである炭素原子に直接結合する２個の水素原子が、一方が2Ｈにより標識されているか、２個の水素原子の両方が、共に1Ｈ又は2Ｈである請求項１から４のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- （８）プロキラルなｇｅｍ−メチル基が存在する場合には、一方のｇｅｍ−メチル基を12Ｃ2Ｈ3又は13Ｃ2Ｈ3により標識する、請求項１から５のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- グルタミン酸（Ｇｌｕ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、リジン（Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、プロリン（Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、又はバリン（Ｖａｌ）である、請求項１から６のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- 以下の１０種の構造式のうちの１つにより表される請求項１から７のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- 以下の１０種の構造式のうちの１つにより表される請求項１から７のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸。
- 請求項１から９のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物。
- 請求項８又は９に記載された安定同位体標識脂肪族アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物であって、更に、以下の９種の構造式のうちの１つにより表される安定同位体標識アミノ酸のうちの少なくとも１種を含む組成物。
- 請求項１から９のいずれかに記載の安定同位体標識脂肪族アミノ酸の存在下、培養細胞、微生物、又は無細胞タンパク質合成系を用いてタンパク質を合成する工程を含む安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法。
- 請求項１２の安定同位体標識脂肪族アミノ酸のタンパク質への組み込み方法により得られた精製されたタンパク質の溶液のＮＭＲスペクトルを測定する工程を含むタンパク質のＮＭＲ構造解析法。
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-
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