WO2005039599A1 - ポリ乳酸混合物を含むマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤 - Google Patents

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reaction
polylactic acid
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cyclic
lactic acid
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PCT/JP2004/015871
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Takayuki Takahashi
Yasukazu Nagato
Masahiro Murakami
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Amato Pharmaceutical Products, Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a matrix meta-oral protease inhibitor, and more particularly to a matrix meta-oral protease inhibitor comprising a mixture of cyclic and Z- or linear polylactic acid.
  • the matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention is useful for treating and / or preventing a disease associated with matrix metallo-oral protease overproduction. Background Art, ..
  • Ma Bok 1 helix meth port protease (matrix metalloproteinases) (hereinafter sometimes abbreviated as MM P) is the extracellular matrix of the constituent proteins (e.g., joint lining, interstitial connective tissue, basement membrane or cartilage etc.
  • MM P matrix metalloproteinases
  • MMP-1, MMP-8 and MMP_13 collagenases (MMP-1, MMP-8 and MMP_13), gelatinases (MMP-2 and MMP-9), stromelysins (MMP3 and MMP-3) MMP-10), membrane-bound matrix meta-oral proteases (MMP-14, MMP-15, MMP-16 and ⁇ MMP-17), and others (MMP-7, MMP-11, MMP-12) It is divided into five groups.
  • MMPs In normal tissues, the activity of MMPs is determined by (1) production of the latent enzyme (pro-MMP), (2) activation of the latent enzyme, and (3) Tissue Inhibitor of Metalloproteinases; It is controlled by the control of the activating enzyme by TIMPs), which balances the degradation of connective tissue by MMPs and the synthesis of new matrix tissue.
  • pro-MMP latent enzyme
  • TIMPs Tissue Inhibitor of Metalloproteinases
  • TIMPs present in the living body become uncontrollable, and extracellular matritus is degraded, and arteriosclerosis and joint Inflammation (eg, rheumatoid arthritis and osteoarthritis), periodontal disease, ectopic vasculogenesis, neoplastic invasion, neoplastic metastasis, tissue ulceration (eg, corneal ulcer, gastric ulcer, epidermal ulcer)
  • intractable diseases such as bone diseases (eg, osteoporosis, bone resorbable diseases such as loosening after artificial joint replacement), vascular reocclusion, vascular restenosis, HIV infection and diabetes complications It is one of the major causes.
  • MMP inhibitors are considered to be useful as agents for preventing and treating these intractable diseases. Controlling the increase in MMP activity under pathological conditions with an MMP inhibitor is useful for the treatment of various diseases, and various MMP inhibitors have been reported.
  • MMP inhibitor include marimastat having a hydroxamic acid skeleton (3R- (2,2-dimethyl-1S-methylcarbamoyl loop-opening pill force rubamoyl) -2S-hydroxy-5-methyl-hexano-1 Hydroxamic acid), flavonoids anthocyanidin, estaletin derivatives, sulfonyl amino acid derivatives, etc. are known, but from the viewpoints of activity, absorption in the body, toxicity, etc., the development of new MMPs inhibitors Is desired.
  • An object of the present invention is to provide a novel inhibitor of matrix metalloproteinase by evaluating the inhibitory effect of cyclic and / or chain polylactic acid mixture on matrix metalloproteinase.
  • Another object of the present invention is to provide a food or drink using the matrix meta-oral protease inhibitor.
  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems, and as a result, lactic acid or Used lactide and evaluated the inhibition of matrix meta-oral protease using a polylactic acid mixture produced by polymerizing them.As a result, a cyclic, Z- or chain-like polylactic acid mixture having a condensation degree of 3 to 20 was obtained. Matrix meta-oral protease demonstrated its inhibitory effect.
  • the present invention has been completed based on these findings.
  • a matrix meta-oral protease inhibitor comprising a cyclic and Z- or chain-like polylactic acid mixture having a condensation degree of 3 to 20.
  • the matrix meta-oral protease is Matrix Meta-oral protease-13 (MMP-3).
  • the lactic acid, a repeating unit in the polylactic acid consists essentially of L-lactic acid.
  • the matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention can be used for treating or preventing a disease associated with overproduction of matrix metalloprotease.
  • a food or drink comprising the above-described matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention.
  • a cyclic and Z- or linear polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20 in the production of a matrix meta-mouth protease inhibitor.
  • a matrix meta-oral protease comprising administering an effective amount of a cyclic and / or linear polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20 to a mammal such as a human.
  • a method is provided for suppressing.
  • FIG. 1 shows a mass spectrum of the polylactic acid mixture obtained in Synthesis Example 1.
  • FIG. 2 shows the MS spectrum of the reaction product obtained in Synthesis Example 2.
  • FIG. 3 shows an overall NMR diagram of the reaction product obtained in Synthesis Example 2.
  • FIG. 4 shows an enlarged view of a part of FIG.
  • FIG. 5 shows an enlarged view of a part of FIG.
  • FIG. 6 shows an overall view of the positive mode F ABMS spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3. Range: m / z 10.0000 ⁇ : 1305/5900
  • FIG. 7 shows an overall view of the negative mode F ABMS spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3. Range: m / z 10.0000 to 20000000
  • FIG. 8 is an enlarged view of the negative mode F ABMS spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3. Range: m / z 10.0000-501.9260
  • FIG. 9 shows an enlarged view of the negative mode FABMS spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3. Range: m / z 490.2980 ⁇ : 1003 7700
  • FIG. 10 shows an enlarged view of the negative mode F ABMS spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3. Range: m / z 999.9500 ⁇ : 1504 3400
  • FIG. 11 shows an enlarged view of the negative mode FABMS spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3. Range: m / z 1484.5300-20000000
  • FIG. 12 shows an overall view of the NMR spectrum of the product obtained in Synthesis Example 3.
  • FIG. 13 is a view showing the effects of X01, ⁇ 02 and ⁇ 03 on ⁇ -3 expression of mouse B16 melanoma cells.
  • ( ⁇ ) shows amplification of the ⁇ -3 fragment by PCR.
  • the arrow (-) indicates the position of the ⁇ ⁇ -3 fragment (468 bases) amplified by PCR.
  • ( ⁇ ) shows quantified data of the PCR product.
  • the matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention contains, as an active ingredient, a cyclic and / or chain polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20, and is, for example, involved in the overproduction of matrix meta-oral protease.
  • a cyclic and / or chain polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20, and is, for example, involved in the overproduction of matrix meta-oral protease.
  • a cyclic and / or chain polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20
  • For treatment or prevention of disease Can be used. '
  • matrix meta-oral protease as used herein includes all cases where the activity of matrix meta-oral protease is suppressed in a living body, and preferably, the expression of matrix meta-oral protease is suppressed. means.
  • diseases associated with overproduction of matrix meta-oral protease include both diseases caused by overproduction of matrix meta-oral protease and diseases associated with overproduction of matrix meta-oral protease.
  • diseases associated with overproduction of matrix metalloprotease include arthritis diseases (eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoarthritis), bone resorption diseases (eg, osteoporosis), and diabetes Increased collagen breakdown, arteriosclerosis, aneurysm, cirrhosis, pulmonary fibrosis, periodontal disease, tissue ulceration (eg, corneal ulcer, gastric ulcer, epidermal ulcer), tumor invasion / metastasis, ectopic Angiogenesis, skin aging, vascular restenosis, vascular restenosis, HIV infection, diabetic complications and the like.
  • arthritis diseases eg, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, osteoarthritis
  • bone resorption diseases eg, osteoporosis
  • diabetes Increased collagen breakdown, arteriosclerosis, aneurysm, cirrhosis, pulmonary fibrosis, periodontal disease, tissue ulceration (eg, corneal ulcer, gastric ulcer, epidermal ulcer), tumor invasion
  • a cyclic and / or chain polylactic acid mixture having a condensation degree of 3 to 20 is used as an active ingredient.
  • polylactic acid mixture refers to a mixture in which cyclic and / or linear polylactic acid having a condensation degree of 3 to 20 is present at an arbitrary ratio. That is, the term “mixture” means a mixture of polylactic acids having any of the degrees of condensation of 3 to 20 and is also used as a concept including a mixture of cyclic and chain-like polylactic acids. . Such a “polylactic acid mixture” can be obtained by dehydrating and condensing acetic acid and purifying it by an appropriate method, as described below in this specification. In this specification, the term “polylactic acid mixture” is used for convenience, but includes a single component such as cyclic polylactic acid having a certain degree of condensation or chain polylactic acid having a certain degree of condensation. Also included are polylactic acids consisting of
  • the degree of condensation means the number of lactic acid units which are repeating units in polylactic acid.
  • the lactic acid includes all of L-lactic acid, D-lactic acid or a mixture of these in any proportion.
  • the lactic acid consists essentially of L-lactic acid.
  • the term "substantially” used herein means the ratio of L-lactic acid units in the polylactic acid mixture [that is, (L-lactic acid units ZL-lactic acid units + D-lactic acid units) X 100] It means 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, further preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more. Note that the ratio of L-lactic acid units in the polylactic acid mixture depends on the ratio of L-lactic acid and D-lactic acid present in lactic acid used as a starting material.
  • the method for producing a cyclic and / or chain-like polylactic acid mixture having a condensation degree of 3 to 20 is not particularly limited.
  • Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Japanese Patent Application No. 0-1303053 or Japanese Patent Application No. 11-39894 (the contents of these patent specifications are all incorporated by reference into the disclosure of the present specification). Can be obtained by the production method described in (1).
  • a cyclic and / or chain polylactic acid mixture having a condensation degree of 3 to 20 can be obtained by the following method A.
  • lactic acid preferably, lactic acid substantially composed of L-lactic acid
  • inert atmosphere examples include nitrogen gas and argon gas, and it is preferable to use nitrogen gas.
  • the dehydration / condensation reaction is carried out at a temperature of 110 to 210 ° C, preferably 130 to 190 ° C, under a reduced pressure of normal pressure to about ImmHg. It is particularly preferred to do so.
  • the reaction time can be set as appropriate, and for example, the reaction can be performed for 1 to 20 hours. When stepwise decompression and stepwise heating are used, the reaction time is divided into two or more partial reaction times, and the reaction is performed by setting the pressure and temperature in each part.
  • the pressure can be reduced, for example, from normal pressure to 150 mmHg to 3 mmHg, and when stepwise heating is used, for example, the temperature is increased from 145 ° C to 155 ° C to 185 ° C. Can be warmed. In practice, they are combined, for example, at 145 ° C for 3 hours at normal pressure, at 145 for 3 hours at 150 mmHg, at 155 for 3 hours at 3 mmHg and at 185 at 3 mmHg. 1. The reaction can be performed for 5 hours.
  • ethanol and methanol are added to the reaction mixture obtained by the dehydration-condensation reaction, and the mixture is filtered and the filtrate is dried to obtain ethanol and methanol soluble components.
  • the term “ethanol- and methanol-soluble matter” as used herein means a fraction that is soluble in a mixture of ethanol and methanol.
  • the order and method of adding ethanol and methanol to the reaction mixture are not limited and may be appropriately selected.For example, it is possible to first add ethanol to the reaction mixture for the dehydration condensation reaction, and then add methanol. it can.
  • Method B As another method for producing a cyclic and / or chain-like polylactic acid mixture having a condensation degree of 3 to 20 used in the present invention, for example, the method described in Japanese Patent Application No. 11-265711 is disclosed in Japanese Patent Application No. 11-265715. (Method B) or the method described in Japanese Patent Application No. 11-265572 (Method C) can be used (described in these patent specifications). Are all incorporated herein by reference.) Hereinafter, Method B and Method C will be specifically described.
  • a lactic acid oligomer is obtained by polymerizing lactide in the presence of a lithium compound represented by RYL i (where R represents an aliphatic group or an aromatic group, and Y represents an oxygen atom or a zeo atom). It is a method of manufacturing.
  • the use ratio of the lithium compound (RYLI) is 1 to 0.1 mol, preferably 0.2 to 0.3 mol, per 1 mol of lactide.
  • the reaction temperature is from ⁇ 100 ° C. to 0 ° C., preferably from 178 ° C. to 150 ° C.
  • the reaction is preferably started at a temperature between 178 ° C. and ⁇ 50 ° C. and gradually raised to room temperature.
  • the reaction is preferably performed in the presence of a reaction solvent.
  • a reaction solvent in addition to cyclic ethers such as tetrahydrofuran, etc., ethyl ether, dimethoxyethane and the like can be used.
  • a reaction atmosphere an atmosphere of an inert gas such as nitrogen gas or argon is used.
  • the reaction pressure is not particularly limited, and is preferably normal pressure.
  • composition of the lactic acid oligomer obtained as described above (that is, the mixing ratio of the cyclic lactic acid oligomer and the chain lactic acid oligomer) varies depending on the lithium compound used as a reaction aid.
  • Method C This method comprises the steps of (i) heating lactic acid to a temperature in the range of 120 to 140 ° C under a pressure of 350 to 400 mmH to cause a dehydration-condensation reaction and not to distill lactide. A first heating step to distill and remove only by-product water
  • the linear lactic acid oligomer is cyclized by heating at 150 to 160 ° C. under a pressure condition of 0.1 to 3 mmHg to form a cyclic oligomer.
  • Third heating step After completion of the second heating step, the linear lactic acid oligomer is cyclized by heating at 150 to 160 ° C. under a pressure condition of 0.1 to 3 mmHg to form a cyclic oligomer.
  • lactic acid is heated under reduced pressure to cause a dehydrocondensation reaction.
  • the reaction time in this case is 3 to 12 hours, preferably 5 to 6 hours.
  • by-product water generated by dehydration-condensation of lactic acid is distilled off so that the reaction proceeds smoothly. Carry out so as not to evaporate.
  • the reaction pressure is reduced, preferably kept at 300 to 500 mmHg, more preferably at 350 to 400 mmHg. Heat to 40 ° C, preferably in the range of 130 to 140 ° C.
  • the reaction in the first heating step mainly produces a reaction product mainly composed of a dehydrated condensate of 3 to 23 molecules of lactic acid.
  • the reaction pressure is lowered to a pressure of 10 to 50 mmHg, preferably 15 to 20 mmHg.
  • this reaction is also carried out under the condition that by-product water is distilled off in order to make the reaction proceed smoothly, but lactide is not distilled off.
  • the rate at which the reaction pressure is reduced to a pressure within the above range is 0.25 to 5 mmHgZ, preferably 0.5 to 5 in order to avoid lactide distillation and to increase the reaction efficiency. It is usually necessary to keep it in the range of lmmHg Z minutes. If the pressure reduction rate is lower than the above range, the time required to reduce the pressure to the predetermined pressure becomes longer, which is not preferable.On the other hand, if the pressure reduction rate is higher than the above range, the lactide is distilled off along with the by-product water. Is not preferred.
  • the heating time in this case is 3 to 12 hours, preferably 5 to 6 hours.
  • a lactic acid oligomer having an average degree of polymerization of 3 to 30, preferably 3 to 23 is obtained.
  • the ratio of the cyclic oligomer in the oligomer is usually 70 to 80. % By weight.
  • the reaction pressure is maintained at 0.25 to 5 mmHg, preferably 0.5 to LmmHg, and the temperature at 145 to 180 ° C, preferably 150 to 160 To continue the reaction.
  • the reaction time is 3 to 12 hours, preferably 5 to 6 hours.
  • the by-product water generated in this case is also distilled off. In this case, it is preferable to avoid the distillation of lactide. However, since the reaction product contains almost no lactide, it is not necessary to reduce the rate of pressure reduction particularly.
  • lactide is reacted in the presence of an alkali metal compound represented by the formula (3): Me—N (R 1 ) (R 2 ).
  • an alkali metal compound represented by the formula (3): Me—N (R 1 ) (R 2 ) will be described.
  • Me represents an alkali metal.
  • R 1 and R 2 each independently represent an aliphatic group or an aromatic group.
  • Examples of the aliphatic group include linear or branched, cyclic, or saturated or unsaturated aliphatic hydrocarbon groups having 1 to 12 carbon atoms, preferably 1 to 6 carbon atoms, and combinations thereof. Specifically, alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, t-butyl, octyl, dodecyl, cyclopropyl, cyclopentyl, cyclooctyl, cyclooctyl And a cycloalkyl group such as dodecyl.
  • the aliphatic group may be an unsaturated hydrocarbon group having a double bond or a triple bond.
  • examples of the aromatic group include an aryl group and an arylalkyl group having 6 to 30 carbon atoms, preferably 6 to 20 carbon atoms, more preferably 6 to 12 carbon atoms, and still more preferably 6 to 10 carbon atoms.
  • examples of the aryl group include phenyl, tolyl, and naphthyl
  • examples of the arylalkyl group include benzyl, phenethyl, and naphthylmethyl.
  • the aliphatic group and the aromatic group may have one or more substituents.
  • the type of the substituent is not particularly limited, for example, a linear or branched, chain or cyclic alkyl group, a linear or branched, chain or cyclic alkenyl group, a linear or branched, chain or cyclic alkynyl group , Aryl group, acyloxy group, alkoxycarbonyl group, aryloxycarponyloxy group, carbamoyloxy group, carboxamide group, sulfonamide group, carbamoyl group, sulfamoyl group, alkoxy group, aryloxy group , Aryloxycarbonyl, alkoxycarbonyl, N-hole, arylsulfonyl, alkoxycarbonylamino, aryloxycarbonylamino, amino, ammonio, cyano, nitro, carboxyl Group, hydroxyl group, sulfo group, mercapto group
  • Me represents an alkali metal.
  • the alkali metal include Li, Na and K, and preferably Li.
  • the compound represented by the formula (3) having an asymmetric carbon may be any of the (R) form, the (S) form, the (R) and the (S) form.
  • the method for obtaining the alkali metal compound represented by the formula (3) is not particularly limited, and those skilled in the art can appropriately obtain it. It can be obtained by reacting a dialkylamine such as diisopropylamine with an alkylated alkali metal such as n-butyllithium. More specifically, this reaction is performed, for example, under a condition inert to the reaction such as under a nitrogen atmosphere, in a solution containing a dialkylamine in an inert solvent such as THF, and in an inert solvent such as hexane. And a solution containing an alkylated alkali metal, followed by stirring.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 1 78 ° C to room temperature.
  • the reaction time can be appropriately set.
  • the amount of the compound of the formula (3) (M e -N (R 1 ) (R 2 )) is preferably 1 to 0 per mol of lactide. 1 mole, more preferably 0.2 to 0.3 mole.
  • the reaction temperature at the time of conducting the polymerization reaction of lactide is not particularly limited as long as the reaction proceeds, but is preferably from 1100 ° C. to room temperature, more preferably from ⁇ 78 to room temperature.
  • the polymerization reaction of lactide is preferably carried out in the presence of a reaction solvent.
  • the reaction solvent is not particularly limited as long as it is a solvent inert to the reaction.
  • a cyclic ether such as tetrahydrofuran, getyl ether, dimethoxyethane or the like can be used.
  • As the reaction atmosphere use an inert gas atmosphere such as nitrogen gas or argon gas. Can be used.
  • the reaction pressure is not particularly limited, and is preferably normal pressure.
  • composition of the linear and cyclic lactic acid oligomer mixture obtained by the above method varies depending on the type of the compound of the formula (3) used as the reaction aid, the reaction conditions, and the like, but is preferably a chain rather than a cyclic lactic acid oligomer. High lactic acid oligomer content.
  • the matrix metalloprotease inhibitor of the present invention may further contain, in addition to the above-mentioned essential components, as necessary, components used in pharmaceuticals, quasi-drugs, and the like within a range not impairing the effects of the present invention. Additives can be arbitrarily selected and used in combination.
  • the matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention can be used not only as a single pharmaceutical product but also as a compound in pharmaceutical products, quasi-drugs and the like.
  • the form of the matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention is not particularly limited, and an appropriate form most suitable for the purpose can be selected from preparation forms for oral administration or parenteral administration.
  • Formulations suitable for oral administration include, for example, tablets, capsules, powders, drinks, granules, fine granules, syrups, solutions, emulsions, suspensions, and chewables.
  • Pharmaceutical forms suitable for parenteral administration include, for example, injections (subcutaneous injection, intramuscular injection, or intravenous injection, etc.), external preparations, infusions, inhalants, sprays, etc. However, it is not limited to these.
  • Liquid preparations suitable for oral administration include water, sucrose, sorbitol, fructose and other sugars, polyethylene glycol, propylene glycol and other daricols, sesame oil, olive oil, and Oils such as bean oil, p
  • hydroxybenzoic acid esters can be manufactured using preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, flavors such as strawberry flavor, and peppermint.
  • preservatives such as hydroxybenzoic acid esters, flavors such as strawberry flavor, and peppermint.
  • solid preparations such as capsules, tablets, powders, and granules
  • excipients such as lactose, glucose, sucrose, mannitol, starch, disintegrants such as sodium alginate, and stearinic acid Lubricants such as magnesium and talc
  • binders such as polyvinyl alcohol, hydroxypropyl cellulose, gelatin, surfactants such as fatty acid esters, and plasticizers such as glycerin can be used.
  • Formulations for injection or infusion suitable for parenteral administration preferably contain the active substance in a sterile aqueous medium which is isotonic with the blood of the recipient, in dissolved or suspended form.
  • a solution can be prepared using a salt solution, a glucose solution, or an aqueous medium composed of a mixture of saline and a glucose solution.
  • Formulations for enteral administration can be prepared using carriers such as cocoa butter, hydrogenated fats, or hydrogenated carboxylic acids, and are provided as suppositories.
  • the above-mentioned substance as an active ingredient can be dispersed as fine particles, so that it does not irritate the recipient's oral and airway mucous membranes and that the active ingredient is easily absorbed.
  • a carrier for tightening can be used.
  • Specific examples of the carrier include lactose and glycerin.
  • Preparations in the form of aerosol or dry powder can be prepared depending on the substance as the active ingredient and the properties of the carrier used. These preparations for parenteral administration include one selected from glycols, oils, flavors, preservatives, excipients, disintegrants, lubricants, binders, surfactants, plasticizers, etc. Alternatively, two or more foods can be added.
  • the dose and the number of administrations of the matrix meta-oral protease inhibitor of the present invention can be appropriately set depending on various factors including the purpose of administration, administration form, conditions such as the age, weight, or sex of the ingestor.
  • the dose of the active ingredient is 1 to 10,000 mg / kg, preferably 10 to 2000 mg / kg, more preferably 10 to 200 mg / kg per day. It is preferable to administer the above dose of the preparation in 1 to 4 divided doses per day.
  • the present invention further relates to a food or drink for inhibiting matrix meta-oral proteases, which contains a cyclic and / or linear polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20. That is, the cyclic or linear polylactic acid mixture having a degree of condensation of 3 to 20 used in the present invention is used not only in the form of a single preparation as described above, but also used in a food or drink. be able to.
  • the food and drink of the present invention are not particularly limited as long as they can be blended without decomposing the polylactic acid mixture.
  • Specific examples of the food and drink products of the present invention include soft drinks, drinks, health foods, specified health foods, functional foods, functionally active foods, dietary supplements, supplements, feeds, feed additives, and the like.
  • foods and drinks include, for example, sweets such as chewing gum, chocolate, candy, tablet confectionery, jelly, cookies, biscuits, yogurt, ice cream, frozen desserts such as ice confections, tea, soft drinks (juice, coffee) Cocoa, etc.), drinks such as nutritional drinks, beauty drinks, etc., and any foods and drinks such as bread, ham, soup, jam, spaghetti, frozen foods and the like.
  • the polylactic acid mixture used in the present invention can be used by adding it to a seasoning or a food additive. By ingesting the food or drink of the present invention, a matrix meta-oral protease inhibitory effect is exhibited, and a safe food or drink that does not substantially exhibit harmful side effects can be provided.
  • the food and drink of the present invention is obtained by directly mixing a polylactic acid mixture with general raw materials used for food. In this case, it can be obtained by dispersing and processing into a desired form by a known method.
  • the foods and drinks of the present invention include all forms of foods and drinks, and the types thereof are not particularly limited.
  • the composition of such foods and beverages should include proteins, lipids, carbohydrates, vitamins, and Z or minerals in addition to the cyclic and Z- or chain-like polylactic acid mixtures having a condensation degree of 3 to 20.
  • the form of the food and drink is not particularly limited, and may be any of solid, powder, liquid, gel, slurry, etc. as long as it is easy to ingest.
  • the content of the polylactic acid mixture in the food or drink is not particularly limited, but is generally 0.1 to 20% by weight, more preferably 0.1 to 10% by weight. / 0 or so.
  • the amount of the polylactic acid mixture contained in the food or drink is preferably contained to such an extent that the objective of the present invention is to exert the inhibitory effect on the matrix-meta-protease. It is from about 1 ⁇ to about 108 , more preferably from about 0.5 to about 3 g.
  • Synthesis Example 1 Production of polylactic acid mixture (hereinafter also referred to as XO1)
  • the obtained polylactic acid was kept at 100 ° C., and after adding 1 O Oml of ethanol and 40 Om 1 of methanol, the mixture was allowed to cool. This was added to 50 Oml of methanol, stirred well, allowed to stand, and then filtered and purified. The filtrate was dried under reduced pressure and dissolved in acetate nitrile to make a total volume of 200 ml (stock solution).
  • reaction temperature was increased to 150 to 160 ° C, and the reaction pressure was gradually reduced from 40 OmmHg over about 6 hours to 15 to 20 mmHg (pressure reduction rate: lmmHg / min).
  • pressure reduction rate pressure reduction rate: lmmHg / min.
  • FIG. 2 shows the MS spectrum of the reaction product obtained in Synthesis Example 2. Also, the synthesis example FIG. 3 shows an overall view of NMR of the reaction product obtained in 2, and FIGS. 4 and 5 show enlarged views of a part of FIG. Synthesis Example 3: Production of lactic acid oligomer mixture (hereinafter also referred to as X03)
  • n-butyllithium (1.6 M hexane solution) 0.63 mL (lmmo 1) was added to a solution of 0.101 g (lmmol) of diisopropylamine in 5 mL of THF and stirred for 10 minutes. Then, after adding lithium diisopropylamide (LDA), 0.577 g (4 mmol) of L- (1-)-lactide in 4 mL of THF was added, and the mixture was stirred and reacted for 15 minutes. To this reaction mixture, 20 mL of a saturated aqueous solution of ammonium chloride was added to process the reaction, and 1 OmL of water was further added.
  • LDA lithium diisopropylamide
  • the mixture was extracted five times with THF (5 OmL), and the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate. After the anhydrous sodium sulfate was filtered off, the organic solvent was concentrated under reduced pressure to obtain 0.53 g of a crude product. 6 mL of ether was added to the obtained crude product, which was immersed in an ultrasonic cleaner for 10 minutes, and filtered to obtain 0.39 g of a white solid product having a melting point of 125 to 129 ° C.
  • the physical property data of the obtained product is shown in FIGS.
  • the FABMS and NMR data shown in Figures 6 to 12 indicate that the solid product contains a trimer to 21-mer cyclic lactic acid oligomer and a trimer to 27-mer chain lactic acid oligomer.
  • Mouse B16 melanoma cell line (RCB 0557) was obtained from RIKEN Cell Bank (Tsukuba).
  • B 16 melanoma cells (1 x 10 5 initial meniscus) were treated with fetal bovine serum (10%), L-glutamine (0.3 mg / ml), penicillin (lOOunit / ml)
  • the cells were cultured at 37 ° C for 48 hours using 20 ml of a DMEM culture solution containing streptomycin and 0.1 mg / ml.
  • the cells were further cultured at 37 ° C. for 48 hours in the above culture solution containing lactoalbumin hydrolysate instead of fetal bovine serum.
  • RNA was prepared from the mouse B16 melanoma cells obtained by the above (1) using IS0GEN (RNA extraction reagent, Futaba Gene). That is, 1 ml of IS0GEN was added to B16 melanoma cells collected from a plate having a diameter of 10 cm, and the cells were lysed by aspirating with a pipet. After leaving the mixture at room temperature for 5 minutes, 0.2 ml of a mouthpiece was added, and the mixture was shaken vigorously for 15 seconds, and then left at room temperature for 3 minutes. The aqueous phase was collected by centrifugation at 12, OOOrpm for 15 minutes at 4 ° C.
  • IS0GEN RNA extraction reagent, Futaba Gene
  • RA / primer mixture was prepared with the following composition.
  • the mixture was heated at 70 ° C. for 10 minutes. Place on ice for 1 minute and add the following reagents in order.
  • nucleotide sequence of mouse MMP-3 (Accession No. III-010809) already published in public databases, the following nucleotides were synthesized as primers to specifically amplify only the gene by PCR. That is, 5′-TGGGACTCTACCACTCAGCCAAGG-3, (24-mer) (SEQ ID NO: 1) is used as the sense primer, and 5′-CCAGGGTGTGAATGCTTTTAGG- is used as the 3 ′ antisense primer. 3 ′ (22-mer) (SEQ ID NO: 2) was synthesized. The synthesized oligonucleotides were chemically synthesized using a fully automatic DNA synthesizer (Applied Biosystems).
  • PCR was performed using the cDNA prepared in (3) above as the type III and the primers prepared in (4) above.
  • the composition of the PCR reaction solution is as follows.
  • PCR reaction was performed. PCR was first heated at 94 ° C for 3 minutes, followed by heat denaturation at 94 ° C for 30 seconds, annealing at 55 ° C for 30 seconds, and 72 ° C for 30 seconds. The conditions for the elongation reaction were 1 cycle, and 30 cycles were performed. After the reaction was completed, the PCR product was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis. PCR products were detected by UV irradiation after immersing the electrophoresis gel in a buffer containing ethidium promide for 30 minutes. The amplified product was DNA consisting of about 470 nucleotides. In mouse B16 melanoma cell culture, the amount of PCR product was significantly reduced by adding X01, X02, and X03 to the culture at a concentration of 500 ⁇ g / ml. ( Figure 13).
  • the PCR product amplified in (5) above was excised and purified from agarose gel using Gene Clean Kit (Q-BIO gene).
  • the PCR product was ligated into a T-Vector, and the recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli (JM109).
  • JM109 Escherichia coli
  • a single colony is cultured in a Terrific Broth medium, the plasmid is purified, and an automated fluorescent DNA sequencer (Applied Biosystems, 373) is purified using ABI PRISM Big-Dye Terminator Cycle Sequence Kit Version 1.1 (Applied Biosystems). (Type). This confirmed that the PCR product was a fragment of the mouse MMP-3 gene (468 bases, corresponding to SEQ ID NO: 753-1220 in Accession No. M_010809).
  • the polylactic acid mixture used as an active ingredient in the present invention is a low condensate of lactic acid derived from a biological component, and therefore has high biocompatibility and has few side effects.

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Abstract

本発明の目的は、環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物が示すマトリックスメタロプロテアーゼ抑制作用を評価することにより、新規なマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤を提供することである。本発明によれば、縮合度３～２０の環状及び／又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む、マトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤が提供される。

Description

明細書
ポリ乳酸混合物を含むマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤 技術分野
本発明はマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤、 より詳細には、 環状及ぴ Z 又は鎖状のポリ乳酸混合物を含むマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤に関す る。 本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤は、 マトリックスメタロプ 口テアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療及ぴ z又は予防に有用である。 背景技術 ，..
マ卜 1リックスメタ口プロテアーゼ (matrix metalloproteinases) (以下、 MM Pと略記する場合がある） は、 細胞外マトリックスの構成タンパク質 (例えば、 関節のライニング、 間質性の結合組織、 基底膜又は軟骨などに存在するタンパク 質であるコラーゲン、 ラミニン、 エラスチン、 フイブロネクチン、 又はプロテ才 ダリカンなど） の分解および再構築に関連する一群のタンパク分解酵素である。
MM Pはその一次構造と基質特異性の違いから、コラゲナーゼ群 (MM P— 1、 MMP— 8および MMP_ 13) 、 ゼラチナーゼ群 （MMP— 2および MMP— 9) 、 ス トロメライシン群 （MMP 3および MMP— 10) 、 膜結合型マトリ ックスメタ口プロテアーゼ群（MMP— 14、 MMP - 15、 MMP— 16およ ぴ MMP— 1 7) 、 その他 （MMP— 7、 MMP— 1 1、 MMP— 12) の 5つ のグループに分類されている。 正常組織においては、 MMPの活性は、 （1) 潜 在型酵素 （p r o— MMP) の産生、 （2) その潜在型酵素の活性化、 及ぴ （3 ) 組織阻害剤 （Tissue Inhibitor of Metalloproteinases; T I MP s ) による活 性化酵素の制御によって制御され、これにより、MMPによる結合組織の分解と、 新しいマトリックス組織の合成とは平衡が保たれている。
しかしながら、 MMP活性が上昇する病的条件下では、 生体に存在する T IM P sでは制御不能となり、 細胞外マトリツタスの分解が亢進し、 動脈硬化、 関節 炎 （例えば、 慢性関節リウマチおよび変形性関節症） 、 歯周疾患、 異所性脈管形 成、 腫瘍性浸潤、 腫瘍性転移、 組織の潰瘍形成 （例えば、 角膜潰瘍、 胃潰瘍、 表 皮性潰瘍） 、 骨疾患 （例えば、 骨粗しょう症、 人工関節置換術後の弛みなどの骨 吸収性疾患） 、 血管再閉塞、 血管再狭窄、 H I V感染および糖尿病合併症などの 難治性疾患の治癒を遅延させる主要な原因の一つとなっている。 従って、 MMP 抑制剤は、これら難治性疾患の予防および治療剤として有用であると考えられる。 このように病的条件下における MM P活性の上昇を、 MM P阻害剤により制御 することは各種疾患の治療に有用であり、 各種の MM P阻害剤について報告され ている。 MM P阻害剤としては、 例えば、 ヒドロキサム酸骨格をもつマリマスタ ット （3R- (2， 2-ジメチル- 1S-メチルカルバモイループ口ピル力ルバモイル） -2S- ヒ ドロキシ一 5-メチルーへキサノ一ヒ ドロキサム酸） 、 フラボン類おょぴアント シァニジン、 エスタレチン誘導体、 スルフォニルアミノ酸誘導体などが知られて いるが、 活性、 体内での吸収、 毒性などの観点から、 新しい MM P s阻害剤の開 発が望まれている。
これまでの研究により、 縮合度 3 〜 2 0の環状及ぴノ又は鎖状のポリ L—乳酸 混合物は、 抗悪性腫瘍剤として有用であることが報告されている （特開平 9一 2 2 7 3 8 8号公報および特開平 1 0— 1 3 0 1 5 3号公報)。 しかしながら、縮合 度 3 〜 2 0の環状及ぴ Z又は鎖状のポリ乳酸混合物がマトリックスメタ口プロテ ァーゼ産生に及ぼす効果については報告されていない。 発明の開示
本発明は、 環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物が示すマトリックスメタロブ 口テアーゼ抑制作用を評価することにより、 新規なマトリックスメタ口プロテア ーゼ抑制剤を提供することを解決すべき課題とした。 本発明はまた、 上記マトリ ックスメタ口プロテアーゼ抑制剤を利用した飲食品を提供することを解決すべき 課題とした。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、 原料として乳酸又 はラクチドを使用し、 これらを重合させることにより製造されるポリ乳酸混合物 を用いてマトリックスメタ口プロテアーゼ阻害作用を評価した結果、 縮合度 3〜 2 0の環状及び Z又は鎖状のポリ乳酸混合物がマトリックスメタ口プロテアーゼ 阻害作用を示すことを実証した。 本発明はこれらの知見に基づいて完成したもの である。
即ち、 本発明によれば、 縮合度 3〜2 0の環状及ぴ Z又は鎖状のポリ乳酸混合 物を含む、 マトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤が提供される。
好ましくは、 マトリックスメタ口プロテアーゼは、 マトリックスメタ口プロテ ァーゼ一 3 (MMP-3) である。
好ましくは、 ポリ乳酸中における反復単位である乳酸は実質的に L—乳酸から 成る。
好ましくは、 本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤は、 マトリック スメタロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療又は予防のために使用す ることができる。
本発明の別の側面によれば、 上記した本発明のマトリックスメタ口プロテア一 ゼ抑制剤を含む、 飲食品が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 マトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤の 製造における、 縮合度 3〜2 0の環状及ぴ Z又は鎖状のポリ乳酸混合物の使用が 提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 縮合度 3〜2 0の環状及び/又は鎖状のポ リ乳酸混合物の有効量をヒトなどの哺乳動物に投与することを含む、 マトリック スメタ口プロテアーゼを抑制するための方法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 合成例 1で得られたポリ乳酸混合物の質量スぺクトルを示す。
図 2は、 合成例 2で得られた反応生成物の M Sスぺク トルを示す。
図 3は、 合成例 2で得られた反応生成物の NMRの全体図を示す。 図 4は、 図 3の一部分の拡大図を示す。
図 5は、 図 3の一部分の拡大図を示す。
図 6は、合成例 3で得た生成物の positiveモード F ABMSスぺク トルの全体 図を示す。 Range: m/z 10.0000〜： 1305· 5900
図 7は、合成例 3で得た生成物の negativeモード F ABMSスぺク トルの全体 図を示す。 Range: m/z 10.0000〜2000· 0000
図 8は、合成例 3で得た生成物の negativeモード F ABMSスぺクトルの拡大 図を示す。 Range: m/z 10.0000〜501.9260
図 9は、合成例 3で得た生成物の negativeモード F ABMSスぺク トルの拡大 図を示す。 Range: m/z 490.2980〜： 1003· 7700
図 10は、合成例 3で得た生成物の negativeモード F ABMSスぺクトルの拡 大図を示す。 Range: m/z 999.9500〜： 1504· 3400
図 1 1は、合成例 3で得た生成物の negativeモード FABMSスぺク トルの拡 大図を示す。 Range: m/z 1484.5300〜2000· 0000
図 12は、 合成例 3で得た生成物の N M Rスぺクトルの全体図を示す。
図 1 3は、 マウス B16メラノーマ細胞の ΜΜΡ - 3発現に及ぼす X 01、 Χ02及 ぴ Χ03の影響を示す図である。 （Α)は PCRによる ΜΜΡ- 3フラグメントの増幅 を示す。矢印（―）は PCR増幅された ΜΜΡ- 3断片（468塩基）の位置を示す。（Β) は PC R産物の定量化したデータを示す。 上記 （A) の解析結果に基づき、 それ ぞれの実験における対照実験 （B16) のバンド強度を 100%として、 その他のバン ド強度の相対値として示した。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施方法及び実施態様について詳細に説明する。
本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤は、 縮合度 3〜 20の環状及 び/又は鎖状のポリ乳酸混合物を有効成分として含むものであり、 例えば、 マト リックスメタ口プロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療又は予防のために 使用することができる。 '
本明細書で言うマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制とは、 生体内におけるマ トリックスメタ口プロテアーゼの活性を抑制する全ての場合を包含するが、 好ま しくは、 マトリックスメタ口プロテアーゼの発現量を抑制することを意味する。 また、 マトリックスメタ口プロテアーゼの過剰産生に関連する疾患としては、 マ トリックスメタ口プロテアーゼの過剰産生を原因とする疾患、 並びにマトリック スメタ口プロテアーゼの過剰産生を伴う疾患の両方を包含する。 マトリックスメ タロプロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の具体例としては、 関節炎疾患 （例 えば、 慢性関節性リウマチ、 骨関節症、 変形性関節症） 、 骨吸収疾患 （例えば、 骨粗鬆症） 、 糖尿病に付随するコラーゲン崩壊の増大、 動脈硬化症、 動脈瘤、 肝 硬変、 肺繊維症、 歯周病、 組織の潰瘍形成 （例えば、 角膜潰瘍、 胃潰瘍、 表皮性 潰瘍） 、 腫瘍浸潤 ·転移、 異所性脈管形成、 皮膚の老化、 血管再閉塞、 血管再狭 窄、 H I V感染、 糖尿病合併症等が挙げられる。
本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤においては、 縮合度 3〜2 0 の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物が有効成分として用いられる。
本明細書で言う 「ポリ乳酸混合物」 とは、 縮合度 3〜 2 0の環状及び/又は鎖 状のポリ乳酸が任意の割合で存在する混合物を意味する。即ち、 「混合物」 という 用語は、 縮合度 3〜2 0の何れかを有するポリ乳酸の混合物であることを意味す ると同時に、環状および鎖状のポリ乳酸の混合物を含む概念としても用いられる。 このような 「ポリ乳酸混合物」 は、 本明細書中以下に述べるように、 轧酸を脱水 縮合し、 適当な方法で精製することにより得ることができる。 なお、 本明細書で は便宜上 「ポリ乳酸混合物」 という用語を用いたが、 この中には一定の縮合度を 有する環状のポリ乳酸または一定の縮合度を有する鎖状のポリ乳酸といった単一 成分から成るポリ乳酸も含まれる。
縮合度とは、 ポリ乳酸中における反復単位である乳酸単位の数を意味する。 例 えば、 環状のポリ乳酸は下記の構造式を有することが推測されるが、 式中の nが 縮合度を表す （即ち、 n = 3〜2 0 )。
Figure imgf000008_0001
本明細書で単に 「乳酸」 と称する場合、 この乳酸には L一乳酸、 D—乳酸また はこれらの任意の割合の混合物の全てが包含される。 本発明においては好ましく は、 乳酸は実質的に L—乳酸から成る。 ここで言う 「実質的に」 とは、 ポリ乳酸 混合物中における L—乳酸単位の比率 [即ち、 （L一乳酸単位数 Z L—乳酸単位数 + D—乳酸単位数） X 1 0 0 ] 力 例えば 7 0 %以上、 好ましくは 8 0 %以上、 より好ましくは 8 5 %以上、さらに好ましくは 9 0 %以上、特に好ましくは 9 5 % 以上であることを意味する。 なお、 ポリ乳酸混合物中における L一乳酸単位の比 率は、 出発物質として使用する乳酸中に存在する L一乳酸と D—乳酸の比率に依 存する。
縮合度 3〜 2 0の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物の製造方法は、 特に限 定されるものではないが、 例えば、 特開平 9一 2 2 7 3 8 8号公報、 特開平 1 0 - 1 3 0 1 5 3号公報、 または特願平 1 1一 3 9 8 9 4号明細書 （これらの特許 明細書に記載の内容は全て引用により本明細書の開示として含める。）などに記載 の製造方法により得ることができる。
より具体的には、 例えば、 縮合度 3〜 2 0の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混 合物は、 下記の方法 Aにより得ることができる。 方法 A：
先ず、 乳酸 （好ましくは、 実質的に L一乳酸から成る乳酸） を不活性雰囲気下 で脱水縮合させる。 不活性雰囲気としては、 例えば、 窒素ガス、 アルゴンガスな どが挙げられるが、 窒素ガスを用いるのが好ましい。 脱水縮合反応は、 常圧〜 ImmHg程度の減圧下、 110〜210°C、 好まし くは 130〜 190°Cの温度で行われるが、 段階的減圧おょぴ段階的昇温によつ て行うのが特に好ましい。 反応時間は適宜設定できるが、 例えば 1〜20時間反 応を行うことができる。 段階的減圧および段階的昇温を用いる場合には、 反応時 間を 2以上から成る部分的な反応時間に分け、 それぞれの部分において圧力と温 度を設定して反応を行う。 段階的減圧を用いる場合は、 例えば、 常圧→150m mHg→3mmHgと減圧することができ、段階的昇温を用レヽる場合は、例えば、 145°C→155°C→185°Cと昇温することができる。 実際には、 これらを組 み合わせて、 例えば、 145 °Cで常圧で 3時間、 145でで 150 mmH gで 3 時間、 155でで 3 mmH gで 3時間そして 185でで 3 mmH gで 1. 5時間 反応を行うことができる。
次いで、 この脱水縮合反応により得られた反応混合物にエタノールおよびメタ ノールを加え、 濾過して濾液を乾燥してエタノールおよびメタノール可溶分が得 られる。 即ち、 本明細書で言う 「エタノールおよびメタノール可溶分」 とはエタ ノールとメタノールの混合液に可溶な画分を意味する。 なお、 エタノールおよび メタノール可溶分を得る際には、 脱水縮合反応の反応混合物をエタノールおよび メタノールと混合するが、 その際のエタノールとメタノールの比率は適宜設定す ることができ、 例えばエタノール：メタノール =1 ： 9である。 なお、 反応混合 物にエタノールとメタノールを添加する順番、 方法などは限定されず、 適宜選択 することができ、例えば、脱水縮合反応の反応混合物に先ずエタノールを添加し、 次いでメタノールを添加することができる。
上記で得られたエタノール ·メタノール可溶分を逆相カラムクロマトグラフィ 一、 特にォクタデシルシラン (ODS) カラムを用いたクロマトグラフィーに付 し、 まず pH2〜3の 25〜50重量0 /0のァセトニトリル水溶液で溶離する画分 を除去し、 次いで pH2〜3の 90重量％以上のァセトニトリル水溶液、 好まし くは 99重量％以上のァセトニトリル水溶液で溶離してくる画分を採取すると、 縮合度 3〜 20の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物が得られる。 上記のようにして得られた環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物は、 水酸化ナ トリウムなどのアルカリ物質で中和し、 減圧乾燥後、 常法により下記に述べるよ うな所望の形態に製剤化することができる。
本発明で用いる縮合度 3〜 2 0の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物を製造 するための別法としては、 例えば、 特願平 1 1— 2 6 5 7 1 5号明細書に記載さ れた方法 （方法 Bとする） または特願平 1 1— 2 6 5 7 3 2号明細書に記載され た方法 （方法 Cとする） を挙げることができる （これらの特許明細書に記載の内 容は全て引用により本明細書の開示として含める。）。 以下、 方法 Bおよび方法 C について具体的に説明する。
方法 B ：
この方法は、 ラクチドを R Y L i (式中、 Rは脂肪族基又は芳香族基を示し、 Yは酸素原子又はィォゥ原子を示す） で表されるリチウム化合物の存在下で重合 させることによって乳酸オリゴマーを製造する方法である。 重合反応を実施する 場合、 リチウム化合物 （R Y L i ) の使用割合は、 ラクチド 1モル当たり、 1〜 0 . 1モル、 好ましくは 0 . 2〜0 . 3モルの割合である。 反応温度は— 1 0 0 〜0 °C、 好ましくは一 7 8〜一 5 0 °Cである。 反応は、 一7 8〜― 5 0 °Cの温度 で開始し、 徐々に室温にまで昇温させるように実施するのが好ましレ、。 反応は、 好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。 反応溶媒としては、 テトラヒドロフ ラン等の環状エーテルの他、 ジェチルェ一テル、 ジメトキシェタン等を用いるこ とができる。 反応雰囲気としては、 窒素ガスやアルゴン等の不活性ガス雰囲気が 用いられる。 反応圧力は特に制約されず、 好ましくは常圧である。
なお、 上記のようにして得られる乳酸オリゴマーの組成 （即ち、 環状乳酸オリ ゴマーと鎖状乳酸オリゴマーの混合比率） は、 反応助剤として用いるリチウム化 合物によって変動する。 方法 C この方法は、 （ i ) 乳酸を 3 5 0〜 4 0 0 mmH の圧力条件で 1 2 0〜 1 4 0 °Cの範囲の温度に加熱し、 脱水縮合反応させるとともに、 ラクチドを留出させ ずに副生水のみを留出除去する第 1加熱工程、
( i i )該第 1加熱工程終了後、反応生成物を 1 5 0〜1 6 0 °Cの温度に加熱し、 該反応圧力を降圧速度 0 . 5〜1 11111111 § 分で1 5〜2 0 mmH gまで降下さ せるとともに、 その降圧に際し、 ラクチドの留出を回避させながら副生水のみを 留出除去し、 該反応圧力が 1 5〜 2 0 mmH gに降下後、 同圧力条件及ぴ反応温 度 1 5 0〜1 6 0 °Cにおいてさらに反応を継続して鎖状乳酸オリゴマーを主成分 とする脱水縮合物を生成させる第 2加熱工程、
( i i i ) 該第 2加熱工程終了後、 0 . 1〜 3 mmH gの圧力条件で 1 5 0〜 1 6 0 °Cで加熱して該鎖状乳酸オリゴマーを環化させ、 環状オリゴマーを生成させ る第 3加熱工程、
からなることを特徴とする方法である。
この方法では先ず、 第 1加熱工程において、 減圧下において乳酸を加熱し、 脱 水縮合反応させる。 この場合の反応時間は 3〜 1 2時間、 好ましくは 5〜 6時間 である。 この第 1加熱下での反応は、 その反応を円滑に進行させるために、 乳酸 の脱水縮合により生成する副生水を留去させるが、 この場合、 乳酸 2分子の脱水 縮合物であるラクチドが留去しないように実施する。 このためには、 反応圧力を 減圧、 好ましくは 3 0 0〜5 0 O mmH g、 より好ましくは 3 5 0〜 4 0 0 mm H gに保持し、 この圧力条件下において、 1 0 0〜1 4 0 °C、 好ましくは 1 3 0 〜1 4 0 °Cの範囲に加熱するのがよレ、。この第 1加熱工程での反応により、主に、 乳酸の 3〜 2 3分子の脱水縮合物を主成分とする反応生成物が生じる。
上記第 1加熱工程の終了後、 第 2加熱工程において、 高められた平均重合度の オリゴマーが得られるように、 前記第 1加熱工程における反応温度よりも高めら れた温度、 好ましくは 1 4 5〜 1 8 0 Ό、 より好ましくは 1 5 0〜 1 6 0 °Cの温 度に加熱するとともに、 反応圧力を 1 0〜5 O mmH g、 好ましくは 1 5〜2 0 mmH gの圧力に降下させてさらに脱水縮合反応を継続する。 この反応も、 前記第 1加熱工程の反応の場合と同様に、 反応を円滑に進行させ るために副生水を留去させるが、 ラクチドが留去しない条件で実施する。 反応圧 力を前記範囲の圧力にまで降下させる速度 （降圧速度） は、 ラクチドの留出を回 避し、 且つ反応効率を高めるためには、 0. 25〜5mmHgZ分、 好ましくは 0. 5〜lmmHg Z分の範囲に保持することが通常は必要である。 前記範囲よ り低い降圧速度では、 その所定圧まで降圧させるのに必要な時間が長くなるため 好ましくなく、 一方、 前記範囲より高い降圧速度では、 ラクチドが副生水ととも に留去するようになるので好ましくない。
反応圧力が所定圧力にまで降下後、 この反応圧力において、 さらに反応を継続 する。 この場合の加熱時間は、 3〜 12時間、 好ましくは 5〜 6時間である。 前記第 2加熱工程での反応により、 平均重合度が 3〜 30、 好ましくは 3〜 2 3の乳酸オリゴマーが得られるが、 この場合のオリゴマ一中の環状オリゴマーの 割合は、 通常、 70〜80重量％程度である。
上記第 2加熱工程終了後、 第 3加熱工程において、 反応圧力を 0. 25〜5m mHg、 好ましくは 0. 5〜： LmmHgに保持し、 145〜 180 °C、 好ましく は 150〜 160での温度でさらに反応を継続する。 反応時間は 3〜 12時間、 好ましくは 5〜 6時間である。この場合に生じる副生水も留去させる。この場合、 ラクチドの留去も回避させることが好ましいが、 反応生成物にはラクチドは殆ん ど含まれないので、 その降圧速度を格別遅くする必要はない。
前記第 3加熱工程での反応により、 平均重合度 3〜30、 好ましくは 3〜 23 で、 かつ環状オリゴマーの割合が 90重量％以上、 好ましくは 99重量0/。以上の 乳酸オリゴマーが生成される。 方法 D：
本発明の特に好ましい態様では、 ラクチドを式 （3) : Me— N (R1) (R2) で表されるアルカリ金属化合物の存在下で反応させる。 以下、式（3)： Me— N (R1) (R2) について説明する。 式 （3 ) において、 M eはアルカリ金属を示し。 R 1及ぴ R 2は各々独立に脂肪 族基又は芳香族基を示す。
ここで脂肪族基としては、 炭素数 1から 1 2、 好ましくは 1から 6の直鎖状、 分枝状、 環状又はそれらの組み合わせの飽和又は不飽和の脂肪族炭化水素基が挙 げられ、 具体的には、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 i一プロピル、 n—ブチ ル、 i—プチル、 tーブチル、 ォクチル、 ドデシル等のァルキル基、 シクロプロ ピル、 シク口プチル、 シク口ォクチル、 シク口ドデシル等のシク口アルキル基が 挙げられる。 脂肪族基は二重結合または三重結合を有する不飽和の炭化水素基で あよい。
ここで芳香族基としては、 炭素数は 6〜3 0、 好ましくは 6〜 2 0、 より好ま しくは 6〜1 2、 さらに好ましくは 6〜 1 0のァリール基及びァリールアルキル 基が挙げられる。 ァリール基としては、 フエニル、 トリル、 ナフチル等が挙げら れ、 ァリールアルキル基としては、 ベンジル、 フエネチル、 ナフチルメチル等が 挙げられる。
脂肪族基および芳香族基は 1以上の置換基を有していてもよい。 置換基の種類 は特に限定されないが、例えば、直鎖または分岐、鎖状または環状のアルキル基、 直鎖または分岐、 鎖状または環状のアルケニル基、 直鎖または分岐、 鎖状または 環状のアルキニル基、 ァリール基、 ァシルォキシ基、 アルコキシカルボ二ルォキ シ基、 ァリールォキシカルポニルォキシ基、 カルパモイルォキシ基、 カルボンァ ミ ド基、スルホンアミ ド基、力ルバモイル基、スルファモイル基、アルコキシ基、 ァリールォキシ基、 ァリールォキシカルボニル基、 アルコキシカルボニル基、 N ホ-ル基、 ァリールスルホニル基、 アルコキシカルボニルァミノ基、 ァリールォ キシカルボニルァミノ基、 アミノ基、 アンモニォ基、 シァノ基、 ニトロ基、 カル ポキシル基、 ヒ ドロキシル基、 スルホ基、 メルカプト基、 アルキルスルフィエル 基、 ァリ一ルスルフィニル基、 アルキルチオ基、 ァリ一ルチオ基、 ゥレイド基、 複素環基 （例えば、 窒素、 酸素およびィォゥ等を少なくとも 1個以上含み、 3な いし 12員環の単環、縮合環）、複素環ォキシ基、複素環チォ基、 ァシル基、 スル ファモイルァミノ基、 シリル基、 ハロゲン原子などが挙げられる。 上記において アルキル、 アルケニル、 アルキニル及びアルコキシの炭素数は一般的には 1から 1 2であり、 好ましくは 1から 6であり、 ァリールの炭素数は一般的には 6から 20であり、 好ましくは 6から 10である。
式（3)おいて、 Meはアルカリ金属を示す。 アルカリ金属としては、例えば、 L i、 N a又は Kが挙げられ、 好ましくは L iである。
式（3)で表される化合物で不斉炭素を有するものは、各々 （R)体、 （S)体、 (R) , (S) 体の何れでもよい。
式 （3) で表されるアルカリ金属化合物の入手方法は特に限定されず、 当業者 であれば適宜入手できる。 ジィソプロピルァミン等のジアルキルァミンと n—ブ チルリチウム等のアルキル化アルカリ金属を反応させることによって得ることが できる。 より具体的には、 この反応は、 例えば、 窒素雰囲気下などの反応に不活 性な条件下において、 THF等の不活性溶媒中にジアルキルアミンを含む溶液と、 へキサン等の不活性溶媒中にアルキル化アルカリ金属を含む溶液とを混合して攪 拌することで行うことができる。 反応温度は、 反応が進行する限り特に限定され ないが、 好ましくは一 78 °Cから室温である。 反応時間は適宜設定できる。
ラクチドを式 (3) の化合物の存在下で重合させる場合、式 (3) の化合物 (M e -N (R1) (R2)) の使用量は、 ラクチド 1モル当たり好ましくは 1〜0. 1 モルであり、 より好ましくは 0. 2〜0. 3モルである。
ラクチドの重合反応を行う際の反応温度は、 反応が進行する限り特に限定され ないが、 好ましくは一 100°C〜室温であり、 より好ましくは _ 78 〜室温で ある。
ラクチドの重合反応は、 好ましくは反応溶媒の存在下で実施される。 反応溶媒 は反応に不活性な溶媒であれば特に制限されないが、 好ましくはテトラヒドロフ ラン等の環状エーテル、 ジェチルエーテル、 ジメトキシェタン等を用いることが できる。 反応雰囲気としては、 窒素ガスやアルゴンガス等の不活性ガス雰囲気を 使用することができる。 反応圧力は特に制約されず、 好ましくは常圧である。 上記方法で得られる鎖状及び環状の乳酸オリゴマー混合物の組成は、 反応助剤 として用いる式 （3 ) の化合物の種類や反応条件などによって変化するが、 好ま しくは、 環状乳酸オリゴマーよりも鎖状乳酸オリゴマーの含有量が高い。
上記した方法によれば、 下記式 （1 ) 又は （2 ) ：
Figure imgf000015_0001
(式中、 mは 1〜1 8の整数を示し、 nは 1〜 1 8の整数を示す）
で表される鎖状及び環状の乳酸オリゴマー混合物が製造される。
なお、 上記方法 A、 B、 C及び Dは本発明で用いるポリ乳酸混合物の製造方法 の具体例の一部を示したものにすぎず、 本発明においては他の方法で製造された ポリ乳酸混合物を用いることもできる。
本発明のマトリックスメタロプロテアーゼ抑制剤は、 前記の必須成分に加えて さらに必要に応じ、 本発明の効果を損なわない範囲内で、 医薬品類、 医薬部外品 類などの製剤に使用される成分や添加剤を任意に選択 ·併用して製造することが できる。 本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤は、 単独の医薬品類と して使用できる以外に、 医薬品類や医薬部外品類などに配合して用いることもで きる。
本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤の形態は特に限定されず、 経 口投与又は非経口投与用の製剤形態の中から目的に最も適した適宜の形態のもの を選択することが可能である。
経口投与に適した製剤形態としては、 例えば、 錠剤、 カプセル剤、 散剤、 ドリ ンク剤、 顆粒剤、 細粒剤、 シロップ剤、 溶液剤、 乳剤、 懸濁剤、 チユアブル剤な どを挙げることができ、 非経口投与に適する製剤形態としては、 例えば、 注射剤 (皮下注射、 筋肉内注射、 又は静脈内注射など)、 外用剤、 点滴剤、 吸入剤、 噴霧 剤などが挙げられるが、 これらに限定されることはない。
経口投与に適当な液体製剤、 例えば、 溶液剤、 乳剤、 又はシロップ剤などは、 水、 ショ糖、 ソルビット、 果糖などの糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレ ングリコールなどのダリコール類、 ごま油、 ォリーブ油、 大豆油などの油類、 p
—ヒ ドロキシ安息香酸エステル類などの防腐剤、 ストロベリーフレーバー、 ぺパ 一ミントなどのフレーバー類などを用いて製造することができる。 また、 カプセ ル剤、 錠剤、 散剤、 又は顆粒剤などの固体製剤の製造には、 乳糖、 ブドウ糖、 蔗 糖、 マンニットなどの賦形剤、 澱粉、 アルギン酸ソーダなどの崩壌剤、 ステアリ ン酸マグネシゥム、 タルクなどの滑沢剤、 ポリビニールアルコール、 ヒドロキシ プ口ピルセルロース、ゼラチンなどの結合剤、脂肪酸ェステルなどの界面活性剤、 グリセリンなどの可塑剤などを用いることができる。
非経口投与に適当な注射用又は点滴用の製剤は、 好ましくは、 受容者の血液と 等張な滅菌水性媒体に有効成分である上記の物質を溶解又は懸濁状態で含んでい る。 例えば、 注射剤の場合、 塩溶液、 ブドウ糖溶液、 又は塩水とブドウ糖溶液と の混合物からなる水性媒体などを用いて溶液を調製することができる。 腸内投与 のための製剤は、 例えば、 カカオ脂、 水素化脂肪、 又は水素化カルボン酸などの 担体を用いて調製することができ、 座剤として提供される。 また、 噴霧剤の製造 には、 有効成分である上記の物質を微細な粒子として分散させることができ、 受 容者の口腔おょぴ気道粘膜を刺激せず、 かつ有効成分の吸収を容易ならしめる担 体を用いることができる。 担体としては、 具体的には、 乳糖又はグリセリンなど が例示される。 有効成分である物質及び使用する担体の性質に応じて、 エアロゾ ル又はドライパウダーなどの形態の製剤が調製可能である。 これらの非経口投与 用製剤には、 グリコール類、 油類、 フレーバー類、 防腐剤、 賦形剤、 崩壌剤、 滑 沢剤、 結合剤、 界面活性剤、 可塑剤などから選択される 1種又は 2種以上の飲食 品を添加することもできる。 本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤の投与量及ぴ投与回数は、 投 与の目的、 投与形態、 摂取者の年齢、 体重又は性別などの条件などを含む種々の 要因により適宜設定することができるが、 一般的には、 有効成分の投与量として 一日当り 1〜 10， 000mgZk g、 好ましくは 10〜2000mg/k g、 より好ましくは 10〜200mg/k gである。 上記投与量の製剤を一日 1〜4 回程度に分けて投与することが好ましい。
本発明はさらに、 縮合度 3〜20の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物を含 むマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制のための飲食品にも関する。 即ち、 本発 明で用いる縮合度 3〜 20の環状及ぴ 又は鎖状のポリ乳酸混合物は、 上記した ような単独の製剤の形態で使用するのみならず、 飲食品の中に配合して用いるこ とができる。
本発明の飲食品は、 ポリ乳酸混合物を分解させることなく配合し得るものであ れば、 その配合形態には特に制限はない。
本発明の飲食品の製品の具体例としては、 清涼飲料、 ドリンク剤、 健康食品、 特定保健用食品、 機能性食品、 機能活性型食品、 栄養補助食品、 サブレメント、 飼料、 飼料添加物などと一般に呼称される、 飲料を含む健康食品または補助食品 が挙げられる。
飲食品の具体例としては、 例えば、 チューインガム、 チョコレート、 キャンデ ィー、 錠菓、 ゼリー、 クッキー、 ビスケット、 ヨーグルト等の菓子類、 アイスク リーム、氷菓等の冷菓類、茶、清涼飲料（ジュース、コーヒー、ココア等を含む）、 栄養ドリンク剤、 美容ドリンク剤等の飲料、 パン、 ハム、 スープ、 ジャム、 スパ ゲティー、 冷凍食品など任意の飲食品を挙げることができる。 あるいは、 本発明 で用いるポリ乳酸混合物は調味料又は食品添加剤などに添加して用いることもで きる。 本発明の飲食品を摂取することによりマトリックスメタ口プロテアーゼ抑 制効果が発揮され、 実質的に有害な副作用を示さない安全な飲食品を提供するこ とができる。
本発明の飲食品は、 ポリ乳酸混合物を、 食品に使われる一般的な原料に直接混 合、 分散したのち、 公知の方法により所望の形態に加工することによって得るこ とができる。
本発明の飲食品はあらゆる形態の飲食品を包含するものであり、 その種類は特 に制限されず、 上記したような各種飲食物、 あるいは各種栄養組成物、 例えば各 種の経口又は経腸栄養剤や飲料等に、 本発明のマトリックスメタ口プロテアーゼ 抑制剤を配合して飲食品として提供することができる。 このような飲食品の組成 としては、 縮合度 3〜 2 0の環状及び Z又は鎖状のポリ乳酸混合物の他に、 蛋白 質、 脂質、 糖質、 ビタミン及ぴ Z又はミネラル類などを含めることができる。 飲 食品の形態は特に限定されず、 摂取しやすい形態であれば、 固形、 粉末、 液体、 ゲル状、 スラリー状等のいずれであってもよい。
飲食品中におけるポリ乳酸混合物の含有量は特には限定されないが、 一般的に は 0 . 1〜2 0重量％、 より好ましくは 0 . 1〜1 0重量。 /0程度である。
飲食品に含まれるポリ乳酸混合物の量は、 本発明の目的とするマトリックスメ タ口プロテアーゼ抑制作用を発揮できる程度に含まれることが好ましく、 好まし くは摂取される飲食物 1食中に 0 . 1 §から 1 0 8程度、 より好ましくは 0 . 5 から 3 g程度である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つていかなる点においても限定されることはない。 実施例
合成例 1 ：ポリ乳酸混合物 （以下、 X O 1とも称する） の製造
マントルヒーターに収めたセパラブルフラスコに L—乳酸 （D—乳酸も混入し ているもの） 5 0 0 m lを入れた。 窒素ガス 3 0 O m 1 分の流入及び撹拌を行 レ、、 溜出水は保温した下降型接続管を経て還流冷却器付フラスコに導きながら、 1 4 5でで 3時間加熱した。 更に 1 5 0 mmH gに減圧して同温度で 3時間加熱 した後、 3 mmH gの減圧下 1 5 5 °Cで 3時間、 最後に 3 mmH gの減圧下 1 8 5でで1 . 5時間加熱し、 反応生成物であるポリ乳酸を得た。 得られたポリ乳酸は 100°Cに保ち、 エタノール 1 O Omlに続いてメタノー ル 40 Om 1をそれぞれ加えた後放冷した。 これをメタノール 50 Om l中に加 え、 よく撹拌して静置した後濾過して精製した。 その濾液を減圧乾燥してァセト 二トリルに溶解し、 全量を 200m l (原液） とした。
この原液を、予め平衡化した逆相 OD Sカラム （TSK g e 1 ODS- 80TM) に かけ、 0. 01M塩酸を含む 30%、 50%および 100%ァセトニトリル （p H2. 0) でステップワイズに溶離し、 ァセトニトリル 100%溶出画分である ポリ乳酸 （縮合度 3〜20) を得た。 得られた物質の質量スペク トルを図 1に示 す。 図 1中の規則的なフラグメントイオンピークから明らかなように、 得られた ポリ乳酸の混合物は、環状縮合体と直鎖状縮合体とが混在した状態になっている。 合成例 2 ：環状ポリ乳酸混合物 （以下、 X02とも称する） の製造
( s ) — （ + ) —乳酸 10. 0 gを内容積 100m lのナス型フラスコに入れ、 これをロータリ一エバポレータにセットする。 フラスコ内の圧力を 350〜40 OmmHgに調節し、 140°Cまで加熱し、 同圧力及び同温度で 6時間反応を続 ける （第 1加熱工程)。 この反応により生成した副生水はこれを留去した。 また、 前記反応条件下では、 ラクチドは殆んど系外へ留去しなかった。
次に、 反応温度を 1 50〜160°Cに上昇させ、 反応圧力を約 6時間かけて 4 0 OmmHgから徐々に下げ、 15〜 20 mmH gまで降下させた （降圧速度： lmmHg/分)。 この降圧速度の条件では、副生水は留去されたが、 ラクチドは 殆んど留去されなかった。 その後、 圧力を 1 5〜2 OmmHgに保ち、 6時間反 応を継続した （第 2加熱工程)。
次に、 圧力を 30分かけて 1〜3 mmH gにまで下げ、 160°Cの反応温度で 5時間反応を続けた （第 3加熱工程)。 ·
前記反応終了後、 反応生成物を分析した結果、 平均重合度が 3〜 21の環状ォ リゴマー 6. 80 g (収率 85 %) が得られた。
合成例 2で得られた反応生成物の MSスペク トルを図 2に示す。 また、 合成例 2で得られた反応生成物の NMRの全体図を図 3に、 図 3の一部分の拡大図を図 4及ぴ図 5に示す。 合成例 3 ：乳酸オリゴマー混合物 （以下、 X 03とも称する） の製造
窒素雰囲気下、 0°Cでジイソプロピルアミン 0. 101 g (lmmo l) の 5 mL THF溶液に n—ブチルリチウム（1. 6Mへキサン溶液） 0. 63mL (l mmo 1 ) を加え、 10分間攪拌し、 リチウムジイソプロピルアミ ド （LDA) とした後、 L- (一） ーラクチド 0. 577 g (4mm o 1 ) の 4mL THF溶 液を加え、 1 5分間攪拌し反応させた。 この反応混合物に飽和塩化アンモニゥム 水溶液 20m Lを加え、 反応を処理し、 さらに水 1 OmLを加えた。 THF (5 OmL) で 5回抽出し、 有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。 無水硫酸ナト リウムを濾別した後、 有機溶媒を減圧濃縮し、 粗生成物 0. 53 gを得た。 得ら れた粗生成物にエーテル 6 mLを加え、 超音波洗浄器にて 10分間浸漬し、 濾過 し、 融点 125〜 129 °Cの白色固体生成物 0. 39 gを得た。
得られた生成物の物性データを図 6から図 12に示す。 図 6から図 1 2に示し た F ABMS及び NMRデータから、 固体生成物中に 3量体から 21量体の環状 乳酸オリゴマーと 3量体から 27量体の鎖状乳酸オリゴマーが存在することが確
試験例 1 ：
(1) マウス B 16メラノ一マ細胞の培養
マウス B 16メラノーマ細胞株（RCB 0557)は RIKEN Cell Bank (つくば） から 入手した。
直径 10 cmのプレートにおいて、 B 1 6メラノーマ細胞 （1 X 105の初期 細月包数） を、 fetal bovine serum (10%), L-glutamine (0.3mg/ml)、 ペニシリン (lOOunit/ml)、およぴストレプトマイシン（0. lmg/ml)を含む DMEM培養液 20ml を用いて、 37°Cで 48時間培養した。細胞増殖により Confluentとなったところで、 細胞を phosphate - buffered salineを用レヽて 2回洗った後、 fetal bovine serum の代わりに lactoalbumin hydrolysateを含む上記の培養液により、 さらに 37°C で 48時間培養を継続した。 最終過程の 48時間の培養においては、 合成例 1〜 3 で製造した X 0 1、 X 0 2、 及ぴ X 0 3をそれぞれ 100 μ g/mlと 500 μ g/mlの濃 度で添加した。対照実験では、これらの薬物が溶解している溶媒のみを添加した。 薬物存在下あるいは不在下で 48時間培養した B 1 6メラノーマ細胞を回収した。
( 2 ) トータル R NAの調整
上記 （1 ) により得られたマウス B 1 6メラノーマ細胞から、 IS0GEN(RNA抽出 用試薬、 二ツボンジーン社）を用いてトータル RNA を調製した。 すなわち、 直径 10cmのプレートから回収した B 1 6メラノーマ細胞に、 1 mlの IS0GENを加えて ピぺットで吸い出して溶解した。 室温に 5分間放置した後、 0. 2mlのクロ口ホル ムを加えて 15秒間激しく振盪し、その後 3分間室温に放置した。 4°Cで 12, OOOrpm で 15分間遠心を行い、水相を回収した。回収したサンプルに 0. 5mlのィソプロパ ノールを加えて室温に 10分間放置した後、 4°Cで 12， OOOrpmで 15分間遠心した。 ここで生じた沈殿画分に 70%エタノールを加えて vortexした後、 4°Cで 7, 500rpm で 5分間遠心をした。 沈殿画分を失わないように 70%エタノ一ル層を捨て、 さら に残存する 70%エタノールを乾燥により完全に除いた後、 沈殿画分を 44 μ 1 の Milli-Q水に溶解した。 得られたサンプルからゲノム由来の DNAを完全除去する ために以下のように DNase処理を行った。 すなわち、 Milli- Q水（44 μ 1)に溶解し た粗トータル RNA画分に、 1 μ ΐの DNase ( 1 unit/ // 1、 プロメガ社製）と 5 μ 1の DNase添付緩衝液を加えて 37°Cで 1時間反応させた。 反応終了後、 50 μ 1のフエ ノール液と 50 μ 1の CIAA液を加えて激しく振盪し、室温にて、 13，000rpmで 5分 間遠心した。 水相を集め、 これに 50 μ 1の CIAA液を加えて激しく振盪し、 再度、 室温にて 13, 000rpm、 5分間の遠心により水相を集めた。 回収した水相に 125 μ 1 の 100%エタノールと 5 μ 1の 3Μ酢酸ナトリゥム緩衝液 (ρΗ5. 2)を加えて一 80°Cで 15分間放置後、 4°Cで 13, OOOrpmで 10分間遠心して沈殿画分を得た。得られた沈 殿画分に 4°Cの 70%エタノールを 400 1加えて遠心（4°C、 13, 000rpm、 5分間）し た。 上清のエタノールを捨て、 さらに乾燥によって完全にエタノールを除去した 後、沈殿画分を 300μ 1の milli-Q水に溶解した。 この一連の操作によって、ゲノ ム DNAを含まない高品質のトータル RNAを約 lmg/mlの濃度で得られた。
(3) 逆転写酵素による cDNA合成
上記 （2) により得られたマウス B 1 6メラノーマ細胞由来のトータル R Aを 铸型として、 Superscript First Strand Synthesis System for RT-PCR (インビ トロゲン社） を用いて 1本鎖 DNAの合成を行った。 すなわち、 まず R A/プライマ 一混合液を以下の組成で作製した。
トータル腿溶液（lmg/ml) 2μ 1(2μ )
oligo (dT) 12_18?« (0.5 μ g/ml) 1 μ 1 (0.5 μ g)
DEPC処理済み milli-Q zR ^μΐ
全量 12μ1 上記混合物を、 70°Cで 10分間加温した。氷上に 1分間置き、以下の試薬を順に 加えた。
R A/プライマー混合液 12 μ 1
10XPCR緩衝液 2μ 1
25 mM MgCl2 2 μ 1
10 mM dNTPミックス 1 μ 1
Figure imgf000022_0001
全量 19 μ 1 上記混合物を、 42°Cで 5 分間プレインキュペートした。次いで SUPERSCRIPT II (逆転写酵素）を 1 μ 1 (200 units)加えよく混合後、 42tで 60分間ィンキュベー トした。次いで 70°Cで 15分間ィンキュベートし反応を停止させた。氷上で冷やし た後、 RNaseHを l/zl(2units)加え、 37°Cで 20分間インキュベートすることによ り铸型 RNAを分解し、 一本鎖 cDNAを得た。
(4) MMP- 3特異的プライマーの合成
すでに公共のデータベースにおいて公開されているマウス MMP-3のヌクレオチ ド配列（Accession No.丽— 010809)から、 PCR によって当該遺伝子のみを特異的に 増幅するためプライマーとして、以下のヌクレオチドを合成した。すなわち、 5， センスプライマーとして、 5' -TGGGACTCTACCACTCAGCCAAGG-3， (24-mer) (配列番 号 1 ) を 、 3' ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー と し て 、 5' -CCAGGGTGTGAATGCTTTTAGG-3 ' (22-mer) (配列番号 2) を合成した。 なお、 合 成ォリゴヌクレオチドは、 全自動 DNA合成機 （Applied Biosystems社） を使用し て化学合成した。
(5) MMP-3 cDNA断片の PCR増幅
上記 （3) で作製した cDNAを铸型として、 上記 （4) で作製したプライマーを 用いて PCRを行った。 PCR反応液の組成は以下の通りである。
cDNA溶液 1 μ 1
Milli- Q水 34.5μ1
10XPCR緩衝液（15 πιΜ MgCl2含む、 TAKARA社） 5 1
10 πιΜ dNTPミックス 4/z 1
10 μΜプライマー（センス） 2.5μ1
10 μΜプライマー（アンチセンス） 2.5μ1
Ex tag ポリメラーゼ (5 units/ u 1， Takara社） 0.5 1
全量— 50 1 上記反応液をよく混合後、 PCR反応を行った。 PCRは、 最初に 94°Cで 3分間熱 した後、 94°Cで 30秒間の熱変性、 55°Cで 30秒間のァニーリング、 72°Cで 30秒間 の伸長反応の条件を 1サイクルとして、 30サイクル行った。反応終了後、この PCR 産物を 1. 5%ァガロースゲル電気永動に供試した。 PCR産物は、電気泳動のゲルを、 ェチジゥムプロマイドを加えた緩衝液に 30分間浸した後に、 UV照射により検出 した。 増幅された産物は、 約 470ヌクレオチドからなる DNAであった。 マウス B 1 6メラノ一マ細胞培養において、 培養液に X01、 X02、 及ぴ X03を 500 μ g/mlの 濃度で添加することによって、 PCR産物量は顕著に減少した。 （図 1 3 )。
( 6 ) PCR産物の抽出とヌクレオチド配列決定
上記 （ 5 ) で増幅された PCR産物を、 ジーンクリーンキット（Q- BIO gene社）を 用いて、 ァガロースゲルから切り出し精製を行った。 次いで、 この PCR産物を、 T- Vector に連結し、 この組換えプラスミドを大腸菌（JM109)に形質転換した。 単 —コロニーを Terrific Broth培地中で培養し、プラスミドを精製して、 ABI PRISM Big-Dye Terminator Cycle Sequence Kit Version 1. 1 (Applied Biosystems社) を用い、 蛍光自動 DNAシークェンサ一（Applied Biosystems社、 373型）により解 析した。これによつて、 PCR産物が、マウス MMP- 3遺伝子の断片（468塩基、 Accession No. M_010809における配列番号 753-1220に相当）であることが確認された。 産業上の利用可能性
本発明により、 新規なマトリ ックスメタ口プロテアーゼ抑制剤、 並びにそれを 利用した飲食品を提供することが可能になった。 また、 本発明において有効成分 として用いられるポリ乳酸混合物は、 生体成分に由来する乳酸の低縮合体である ことから、 生体適合性が高く、 副作用が少ない。

Claims

請求の範囲
1 . 縮合度 3〜 2 0の環状及び/又は鎖状のポリ乳酸混合物を含む、 マトリ ックスメタ口プロテァーゼ抑制剤。
2 . マトリックスメタ口プロテアーゼが、 マトリックスメタ口プロテアーゼ - 3 (MMP-3)である、請求項 1に記載のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤。
3 . ポリ轧酸中における反復単位である乳酸が実質的に L—乳酸から成る、 請求項 1又は 2に記載のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制剤。
4 . マトリックスメタ口プロテアーゼの過剰産生に関連する疾患の治療又は 予防のために使用する、 請求項 1から 3の何れかに記載のマトリックスメタロブ 口テアーゼ抑制剤。
5 . 請求項 1から 4の何れかに記載のマトリックスメタ口プロテアーゼ抑制 剤を含む飲食品。
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