WO2005037311A1 - Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico - Google Patents

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Julio César AGUILAR RUBIDO
Enrique IGLESIAS PÉREZ
Yadira Lobaina Mato
Daymir GARCIA GONZÁLEZ
Verena Lucila MUZIO GONZÁLEZ
Gerardo Enrique GUILLÉN NIETO
Nelson Acosta Rivero
Raimundo UBIETA GÓMEZ
Julio Cesar ÁLVAREZ OBREGÓN
Santiago DUEÑAS CARRERA
Carlos Duarte Cano
Peter Vanlandshoot
Luis Saturnino Herrera Martinez
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    • C12N2770/24234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention relates to the field of Biotechnology specifically with the branch of therapeutic vaccines against pathogens that cause chronic diseases. Fundamentally it is related to the use of hepatitis B virus surface antigen (HBsAg), produced recombinantly from Pichia pastoris in a formulation as the main component of pharmaceutical compositions for therapeutic use.
  • HBsAg hepatitis B virus surface antigen
  • HBV Hepatitis B virus
  • Interferon- ⁇ treatment and therapy with the nucleotide analog Lamivudine. Both treatments have important limitations, Interferon- ⁇ therapy combines the antiviral and immunostimulatory properties of interferon, resulting in sustained suppression of HBV replication in only one third of patients. Lamivudine leads to a rapid and almost absolute decrease in HBV replication, but treatments for short periods of time lead to frequent relapses. In long-term treatments, relapses are increased with an annual incidence of 15 to 20%.
  • These limitations of both HBV antiviral therapies highlight the need to find therapeutic alternatives, including new nucleotide analogs and specific or non-specific immunotherapeutic strategies with the aim of improving the poor T-cell response in chronically infected patients.
  • immunotherapeutic strategies are passive transfer of specific immunity from HBV, immunomodulatory drugs (cytokines, thymic derivatives, growth factors) and vaccine therapies (recombinant HBV vaccine, DNA vaccine and T cells).
  • immunomodulatory drugs cytokines, thymic derivatives, growth factors
  • vaccine therapies recombinant HBV vaccine, DNA vaccine and T cells.
  • HBV is not a cytopathic virus and liver damage during infection is mainly mediated by the host's immune response against infected cells and by the production of inflammatory cytokines.
  • a vigorous, polyclonal and multispecific cellular response of cytotoxic, helper and cytokine cells against HBV is easily and quickly detectable in the peripheral blood of patients with acute and self-limited Hepatitis B.
  • this response is weak, antigenically restricted or undetectable. It has been shown that this T-cell response is responsible for the elimination of HBV, as opposed to what has been observed during acute hepatitis B, Th1 cytokines (interferon- ⁇ , lnterlukine-2).
  • Hepatitis B vaccines have been tested as a product for immunotherapy.
  • the immunization of transgenic mice constitutively expressing HBsAg in the liver showed the possibility of overcoming functional tolerance to HBsAg by inducing a specific immune response (Mancini M, et al., Induction of anti-hepatitis B surface antigen ( HBsAg) antibodies ⁇ n HBsAg transgenic mice: a possible way of circumventing "nonresponse" to HBsAg. J Med Virol. 1993; 39: 67-74.).
  • the present invention describes the use of the Hepatitis B Virus surface antigen produced from Pichia pastor ⁇ s to obtain pharmaceutical compositions for therapeutic use, for which we have taken into account new properties of the HBV surface antigen, evidenced from the comparison of the antigen produced in Pichia pastor ⁇ s by the described method and other Hepatitis B antigens.
  • the HBsAg of the present invention can be used in vaccine formulations for the treatment of chronic Hepatitis B infection and even in chronic coinfection by other viruses, given the ability of this antigen to promote the cellular and functional response of other co-administered antigens.
  • antigens that have been co-administered with the HBsAg of the present invention are antigens of other viruses that are capable of generating chronic infections, such as in Hepatitis C Virus and HIV-1 among others.
  • results which are described in the examples of the present invention, were obtained with the Hepatitis C Virus nucleocapsid antigen and with an HIV-1 chimeric protein, which contains epitopes related to the cellular response in humans against said pathogens
  • This property according to the evidence that has been obtained in our laboratory, is extended to homologous or heterologous proteins that can be used in co-administration with the HBsAg obtained from this process.
  • HBV or HBcAg nucleocapsid protein which contribute to the final effect of the formulation is the HBV or HBcAg nucleocapsid protein.
  • This protein is capable of receiving an immunopotentiating effect of its cellular response when co-administered with the HBsAg of the present invention.
  • the subject of the present invention is the pharmaceutical compositions in which the hepatitis B virus surface antigen obtained in Pichia pastoris is used by the method described for the therapeutic anti chronic hepatitis B, both in solution and conveniently adjuvant in aluminum salts or another adjuvant of choice for this purpose.
  • the pharmaceutical composition for use in therapeutics is object of the present invention, in which the Hepatitis B antigen obtained in Pichia pastoris by the described method is administered in combination with other homologous or heterologous antigens, which would receive an effect adjuvant of importance for therapeutic activity.
  • the homologous antigen is comprised between the Hepatitis B Virus antigens, preferably the nucleocapsid antigen of said virus.
  • Other antigens that may be included in the formulations object of the present invention are those that belong to Viruses that have a chronic course in humans such as Hepatitis C Virus, HIV-1, but are not restricted thereto, antigens may be used of other viruses that have these characteristics.
  • compositions object of the present invention can be used mucosally, parenterally or by combinations of mucosal-parenteral routes in order to favor the type of therapeutic response that is required.
  • pharmaceutical compositions object of the present invention are compositions whose antigenic content is dependent on the antigens used in each of them, with HBsAg being an amount of antigen in a range between 5 and 300 micrograms per dose. , being in a proportion with co-administered antigens ranging from 5: 1 to 1: 5, whose value is dependent on the specific treatment considered.
  • FIG. 1A Graph showing the kinetics of the anti-HBsAg IgG response in serum of immunized mice on days 0, 15, 30 and 90, with different commercial hepatitis B vaccines, including the Heberbiovac-HB vaccine which It contains the HBsAg obtained from its expression in Pichia pastoris and other vaccines whose HBsAg is produced in other hosts.
  • 1 C IFN gamma secretory cell response after stimulation with murine mastocytoma p815 cells carrying the envelope peptide S28-39.
  • Figure 3 Study of the immune response induced by combined HBsAg formulations for therapeutic use with a protein antigen from HIV-1.
  • Figure 4 Study of the immune response induced by combined HBsAg formulations for therapeutic use with a protein antigen from HIV-1.
  • Figure 6. CD14 receptor binding capacity.
  • Group 1) HBsAg produced in Saccharomyces scerevisiae.
  • Example 1 Comparison of the immunogenicity of different hepatitis B vaccines whose antigen comes from different hosts with respect to their ability to induce humoral and cellular responses.
  • an immunization scheme was carried out in Balb / C mice. Five groups of 10 mice each, 8 to 12 weeks old, were immunized on days 0, 15, 30 and 90 with doses of 2 ⁇ g (micrograms) of HBsAg intramuscularly. Blood extractions were carried out 10 days after each immunization to assess the humoral response and after the third and fourth doses, 3 to 4 animals from each group were sacrificed to perform cell response studies, depending on the type of study.
  • the immunization scheme groups were 1) the Heberbiovac HB vaccine, which contains the HBsAg antigen produced in Pichia pastoris, 2) the Shanvac B vaccine, also produced in Pichia pastoris but by another method 3) the Hepavax Gene Vaccine and 4) the Euvax B vaccine produced in Saccharomyces and Hansénula respectively.
  • a fifth group was the placebo, mice that were only given aluminum hydroxide in PBS.
  • the humoral immune response was evaluated by ELISA for the determination of total serum IgG.
  • Serum IgG titers were tested two weeks after the second, third and fourth doses and also before the fourth dose.
  • the results of IgG antibody response are shown in Figure 1 A.
  • the lymphoproliferation assay is an indication of the splenocyte proliferation in spleen, in this case there is no selection of a specific cell group, although fundamentally for the time in which the assay is performed what is determined is the proliferation of T lymphocytes CD4 + memory. These CD4 + T lymphocytes that proliferated specifically after stimulation with the antigen are cooperative and can interact with B lymphocytes for the development of humoral response or with CD8 + T cells for cytotoxic response development. Ten days after the third dose, 3 mice from each group were sacrificed and an ELISPOT assay was carried out, the results of which are shown in Figure 1 C.
  • HBsAg in alumina is capable of inducing a strong response of INF ⁇ secretion after restimulation with S 2 peptide 8-39 derived from HBsAg.
  • a direct ELISPOT trial carried out showed a low response compared to that obtained after restimulation (results not shown).
  • the results of Figure 1C show that the Heberbiovac HB vaccine has the ability to induce a higher frequency of INF ⁇ secreting cells in spleen of immunized animals compared to the rest of the vaccines studied.
  • the secretion of INF ⁇ is indicative of the development of a Th1 cell response, of importance in the control of viral replication of chronic diseases including hepatitis B.
  • this result shows that the cellular response that is obtained is superior to from the use of the Hepatitis B antigen produced in Pichia pastoris with respect to the antigens produced in other hosts, which is of great importance in the therapeutic use of this vaccine, given the correlation that in the case of Hepatitis B has the type of cellular response that is evaluated here - lymphoproliferative and secretion of IFN gamma.
  • Example 2 Enhancement effect of the cellular response by HBsAg obtained by the described method.
  • HBsAg in nasal immunizations as an antigen and at the same time as immunopotentiator of the specific cell-type response within therapeutic vaccines
  • Female Balb / c mice CENPALAB, Cuba
  • the animals were immunized in different groups by the intranasal route as follows: 1. PBS, 2. HBcAg + HBsAg, 3. CR3, 4. HBcAg + CR3, 5. HBsAg + CR3, 6. HBcAg + HBsAg + CR3.
  • the CR3 antigen corresponds to a multiepitopic polypeptide obtained recombinantly and containing numerous HIV1 epitopic sequences specific for human T cells.
  • the antigens were dissolved in PBS and dispensed in 50 ⁇ l (25 ⁇ l in each nostril). The following doses of 5, 5 and 10 ⁇ g per mouse of HBsAg (CIGB, Cuba), HBcAg (CIGB, Cuba) and CR3 (CIGB, Cuba), respectively, were used.
  • the anti-CR3 specific IFN gamma secretory cell response of CD8 + lymphocytes was measured by spleen 10 days after the last inoculation as well as in total spleen lymphocytes.
  • IFN ⁇ secretion by CD8 + lymphocytes was measured through an ELISPOT type assay using the P815CR3 line constitutively expressing the CR3 protein.
  • the latter is processed intracellularly and presented in the context of mouse H-2 molecules belonging to MHC-I; since P815 mast cell cells do not express MHC-II molecules on their surface. It was shown that only the groups immunized with HBsAg + CR3 and HBcAg + HBsAg + CR3 had positive responses (Fig. 3A).
  • Example 4 Use of HBsAg in therapeutic vaccines combined with HIV-1 immunogens by the parenteral route.
  • female Balb / c mice CENPALAB, Cuba
  • 6- were immunized 8 weeks of age, on days 0, 14, 35.
  • the animals were immunized in different groups by the subcutaneous route as follows: 1) HBsAg, 2) CR3, 3) HBsAg + CR3, 4) HBsAg + HBcAg + CR3. All immunogens were adjuvant in 1 mg / ml aluminum phosphate.
  • HBsAg CIGB, Cuba
  • HBcAg CIGB, Cuba
  • CR3 CIGB, Cuba
  • the specific cellular response of IFN gamma secretory cells was measured by ELISPOT anti-CR3 in CD8 lymphocytes and in total lymphocytes in spleen 10 days after the last inoculation.
  • the response was determined by evaluating IFN ⁇ secretion by CD8 + lymphocytes (Fig. 4A). This was measured through an ELISPOT type test using the P815CR3 line as detailed above.
  • Group 2 was inoculated with 5 ⁇ g of the Co.120 protein.
  • Group 3 was inoculated with the mixture of 5 ⁇ g of the Co.120 protein and 5 ⁇ g of HBsAg.
  • Group 4 was immunized with 5 ⁇ g of HBsAg.
  • the animals were challenged intraperitoneally with 10 6 plaque-forming units of a recombinant vaccinia virus for the HCV capsid antigen, 2 weeks after the last dose. The animals were sacrificed 5 days after the challenge and the ovaries were extracted and processed. Serial dilutions were made and BSC-40 cells were infected for 2 days to determine viral titer after crystal violet staining.
  • Figure 5 shows the ovary viral titer of the animals of the different groups.
  • HBsAg in parenteral immunizations as an antigen and at the same time as immunopotentiator of the type response specific cell within combined or simple therapeutic vaccines against chronic diseases
  • co-administration experiments of HBsAg were developed using antigens of the viruses included in the following pathologies: Human Immunodeficiency Virus, we worked with attenuated viral antigens containing HIV1-1 sequences, with peptide antigens and with multi-epitope polypeptides; Human papillomavirus, worked with virus-like particles or HPV VLP 16, 18 and 33; Hepatitis C virus: antigens containing nucleocapsid and viral envelope antigen sequences were used as well as segments of non-structural regions; antigens from other pathologies that generate chronicity such as cancer were also administered, these were tumor associated antigens and tumor specific to liver, lung, breast and prostate cancer. In all these cases, an increase in the secretory activity of IFN gamma was
  • Example 7 Studies of CD14 binding capacity of different batches of HBsAg obtained from Pichia pastoris by the method described in comparison to batches of HBsAg produced in other hosts.
  • the analysis of HBV surface antigens obtained recombinantly from different hosts showed that there are among the same differences that influence their greater immunogenicity at the cellular level, as is the case of their ability to bind to the CD14 receptor present in macrophages and related to the development of immunological tolerance processes. It has been possible to verify, after the immunofluorometric analysis that there is a marked reduction in the capacity of binding to CD14 in the antigen that comes from the host yeast Pichia pastoris by the method described here, when compared with the antigen from Saccharomyces cerevisiae Fig. 6). This aspect influences the immunological behavior and at the same time justifies the differential immunological behavior of the antigens tested in the present invention.

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Abstract

Vacunas terapéuticas contra patógenos que causan enfermedades crónicas. Uso del antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), producido por vía recombinante a partir de Pichia pastoris, como componente principal, para la obtención de composiciones farmacéuticas con fines terapéuticos. Las mismas pueden comprender la combinación del antígeno de hepatitis b con otros antigenos coadministrados. Estas formulaciones son capaces de generar una potente respuesta linfoproliferativa y de linfocitos T citotóxicos, además de una considerable respuesta de anticuerpos específicos, lo que las hace muy efectivas para el tratamiento de estas enfermedades en humanos.

Description

COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS PARA USO TERAPÉUTICO.
Campo de la técnica
La presente invención se relaciona con el campo de la Biotecnología específicamente con la rama de vacunas terapéuticas contra patógenos que causan enfermedades crónicas. Fundamentalmente se relaciona con el uso antígeno de la superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg), producido por vía recombinante a partir de Pichia pastoris en una formulación como componente principal de composiciones farmacéuticas para uso terapéutico Arte Previo
Alrededor de 350 millones de personas en el mundo están crónicamente infectados por el virus de la Hepatitis B (VHB). El mayor riesgo de pacientes con infección del HBV es la ocurrencia de cirrosis resultando en un incremento de la mortalidad relacionado al desarrollo de carcinoma hepatocelular o complicaciones no carcinomatosas de cirrosis (hipertensión portal y fallo hepático).
El control de la replicación viral reduce significativamente estos riesgos dado que la patología de la infección del VHB es principalmente mediada por el sistema inmunológico.
En la actualidad sólo hay dos terapias ampliamente reconocidas para la hepatitis crónica causada por el VHB con efecto clínico beneficioso: el tratamiento con Interferón-α y la terapia con el análogo de nucleótido Lamivudina. Ambos tratamientos tienen importantes limitaciones, la terapia con Interferón-α combina las propiedades antivirales e ¡nmunoestimulatorias del ¡nterferón, lo cual resulta en una supresión sostenida de la replicación del VHB en sólo un tercio de los pacientes. La Lamivudina conduce a una rápida y casi absoluta disminución de la replicación del VHB, pero tratamientos por cortos períodos de tiempo conducen a frecuentes recaídas. En tratamientos por períodos largos se incrementan las recaídas con una incidencia anual del 15 al 20%. Estas limitaciones de ambas terapias antivirales del VHB resaltan la necesidad de encontrar alternativas terapéuticas, incluyendo nuevos análogos nucleotídicos y estrategias inmunoterapéuticas específicas o no específicas con el objetivo de mejorar la pobre respuesta de células T en pacientes crónicamente infectados.
Entre estas estrategias inmunoterapéuticas se encuentran la transferencia pasiva de inmunidad específica del VHB, las drogas inmunomoduladoras (citoquinas, derivados tímicos, factores de crecimiento) y las terapias vacunales (vacuna recombinante anti VHB, vacuna de ADN y células T).
El VHB no es un virus citopático y el daño hepático durante la infección es principalmente mediado por la respuesta inmune del hospedero contra las células infectadas y por la producción de citoquinas inflamatorias. Una respuesta celular vigorosa, policlonal y multiespecífica de células citotóxicas, auxiliadoras y de citoquinas contra el VHB es fácil y rápidamente detectable en la sangre periférica de pacientes con Hepatitis B aguda y autolimitada. En cambio, en pacientes con infección crónica dicha respuesta es débil, restringida antigénicamente o indetectable. Se ha demostrado que esta respuesta de células T es responsable de la eliminación del VHB, en oposición a lo que ha sido observado durante la hepatitis B aguda, citoquinas Th1 (interferón-γ, lnterlukina-2).
Igualmente han sido ensayadas vacunas anti Hepatitis B recombinantes como producto para la inmunoterapia. En un primer paso, la inmunización de ratones transgénicos que expresan constitutivamente al HBsAg en el hígado evidenció la posibilidad de sobreponer la tolerancia funcional al HBsAg induciendo una respuesta inmune específica (Mancini M, et al., Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies ¡n HBsAg transgenic mice: a possible way of circumventing "nonresponse" to HBsAg. J Med Virol. 1993; 39:67-74.). En un segundo paso, los estudios clínicos piloto establecieron que la terapia vacunal específica por vacunación convencional sería capaz de eliminar o reducir la replicación del VHB en cerca del 50% de los sujetos portadores crónicos (Pol S, et al. Lancet 1994; 342 (Letter), Wen Y-M, et al. Lancet 1995; 345: 1575-1576 (Letter), Pol S, et al. Acta Gastroenterologica Bélgica 1998; 61 :228-33). Finalmente, un estudio multicéntrico controlado mostró el alcance actual de las vacunas antihepatitis B en el tratamiento de la infección crónica (Pol S, et al. J Hepatol 2001 ; 34: 917-21). Se evaluaron vacunas comerciales conteniendo antígenos de las regiones pre S/S o solamente conteniendo al antígeno S. Luego de un seguimiento de un año y cinco inyecciones no hubo diferencias en el porciento de negativización del ADN viral, y la desaparición del HBsAg de la sangre de los pacientes no ocurrió en ningún caso, siendo el porciento de negativización del antígeno "e" igualmente pobre aunque a favor de la vacuna. Todos estos resultados conllevaron a plantearse la búsqueda de nuevas estrategias para el control de la Hepatitis B a partir de la inmunoterapia por parte de los mismos grupos y a concluir que se requiere el refuerzo de las estrategias de inmunización. Recientemente se ha evidenciado que en aquellos antígenos que presentan menor capacidad de unión a CD14 se pueden obtener proliferaciones significativamente superiores a partir de células mononucleares de sangre periférica de individuos que generaron una alta respuesta al HBsAg. Esto sugiere una correlación entre la capacidad de unión a células CD14 y la inmunosupresión (Valandschoot P, et al. J. Med Virol 2003, 70: 513-519). Un antígeno que demuestra que induce una mayor ¡nmunogenicidad desde el punto de vista celular, incluso actividad inmunopotenciadora superior a otros antígenos producidos en diferentes hospederos y cuyo método de producción conlleva a la selección de una variante cuya caracterización fisico-química evidencia una significativa disminución en el reconocimiento al receptor CD14 que justifica su actividad inmunológica, es novedoso, y puede ser considerado para su uso en la terapéutica antiviral contra el Virus de la Hepatitis B e incluido en formulaciones de múltiples antígenos para el tratamiento de infecciones crónicas o coinfecciones crónicas.
Descripción detallada de la invención
En la presente invención se describe el uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B producido a partir de Pichia pastorís para la obtención de composiciones farmacéuticas para uso terapéutico, para lo que hemos tenido en cuenta nuevas propiedades del antígeno de superficie del VHB, evidenciadas a partir de la comparación del antígeno producido en Pichia pastorís por el método descrito y otros antígenos de Hepatitis B.
En la presente invención se ha encontrado que el método descrito en la patente EP 0480525 B1 "Method for obtaining recombinant surface antigen of Hepatitis B Virus" proporciona nuevas propiedades al antígeno resultante. El HBsAg producido en Pichia pastoris, a partir de un proceso cuyos pasos fundamentales son: lisado de las células en presencia de un buffer de ruptura que comprende un agente caotrópico; precipitación de contaminantes a un pH ácido; sometimiento de la preparación del antígeno a una cromatografía de ¡nmunoafinidad empleando una anticuerpo monoclonal específico para antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B; y el sometimiento del antígeno eluído a un tratamiento térmico a una temperatura entre 30 y 40°C, presenta nuevas propiedades que lo diferencian de los otros antígenos de Hepatitis B descritos que avalan su uso terapéutico. Entre las diferencias encontradas se pueden señalar la superior inmunogenicidad de este antígeno comparado con aquellos que provienen de otros hospederos y otros métodos, el efecto inmunopotenciador que se ha evidenciado sobre otros antígenos que son candidatos a vacunas terapéuticas y aspectos de la estructura del mismo antígeno que evidencian una diferencia en composición química, lo cual influye marcadamente en su comportamiento frente al sistema inmunológico. El HBsAg de la presente invención puede utilizarse en formulaciones vacunales para el tratamiento de la infección crónica por Hepatitis B e incluso en la coinfección crónica por otros virus, dada la capacidad de este antígeno de promover la respuesta celular y funcional de otros antígenos coadministrados.
Entre los antígenos que han sido coadministrados junto al HBsAg de la presente invención se encuentran antígenos de otros virus que son capaces de generar infecciones de curso crónico, como por ejemplo en Virus de la Hepatitis C y el VIH-1 entre otros. Estos resultados que se describen en los ejemplos de la presente invención, fueron obtenidos con el antígeno de la nucleocápsida del Virus de la Hepatitis C y con una proteína quimérica del VIH-1 , que contiene epítopes relacionados con la respuesta celular en humanos frente a dichos patógenos. Esta propiedad, de acuerdo a las evidencias que se han obtenido en nuestro laboratorio, se hace extensiva a proteínas homologas u heterólogas que con dicha finalidad puedan ser usadas en coadministración con el HBsAg obtenido a partir de este proceso. Entre las proteínas homologas, que aportan al efecto final de la formulación se encuentra la proteína de la nucleocápsida del VHB o HBcAg. Esta proteína es capaz de recibir un efecto inmunopotenciador de su respuesta celular cuando se coadministra junto al HBsAg de la presente invención. Del mismo modo, se refleja en esta invención la posibilidad de utilizar las formulaciones multivalentes en individuos que están padeciendo el curso crónico de otra enfermedad distinta a la Hepatitis B crónica y que les permitiría utilizar las mismas en el tratamiento de su padecimiento y al mismo tiempo inducir una respuesta preventiva contra la infección por el VHB. Son objeto de la presente invención las composiciones farmacéuticas en que se utilice el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B obtenido en Pichia pastoris por el método descrito para la terapéutica anti Hepatitis B crónica, tanto en solución como convenientemente adyuvado en sales de aluminio u otro adyuvante de elección con esta finalidad. Entre ellos, y no restringido a los mismos, se encuentran las sales de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio que se muestran en los ejemplos así como los adyuvantes que puedan servir en la administración de la vacuna para uso terapéutico.
Del mismo modo es objeto de la presente invención aquella composición farmacéutica para uso en la terapéutica, en la que el antígeno de la Hepatitis B obtenido en Pichia pastoris por el método descrito es administrado en combinación con otros antígenos homólogos o heterólogos, que recibirían un efecto adyuvante de importancia para la actividad terapéutica. El antígeno homólogo está comprendido entre los antígenos del Virus de la Hepatitis B, preferentemente el antígeno de la nucleocápsida de dicho virus. Otros antígenos que pueden estar comprendidos en las formulaciones objeto de la presente invención son aquellos que pertenecen a Virus que poseen un curso crónico en humanos como los Virus de la Hepatitis C, VIH-1 , pero no se restringen a los mismos, pudiendo utilizarse antígenos de otros virus que presenten estas características. Es importante destacar que la utilización de las composiciones farmacéuticas objeto de la presente invención pueden utilizarse por vía mucosal, parenteral o por combinaciones de rutas mucosal-parenteral con el objetivo de favorecer el tipo de respuesta terapéutica que se requiere. Del mismo modo las composiciones farmacéuticas objeto de la presente invención son composiciones cuyo contenido antigénico está en dependencia de los antígenos utilizados en cada una de ellas, siendo para el HBsAg una cantidad de antígeno que se encuentra en un rango entre 5 y 300 microgramos por dosis, encontrándose en una proporción con los antígenos coadministrados que va desde 5:1 a 1 :5, cuyo valor está en dependencia del tratamiento específico que se considere.
Descripción de las figuras
Figura 1. 1A) Gráfico que muestra la cinética de la respuesta de IgG anti-HBsAg en suero de ratones inmunizados los días 0, 15, 30 y 90, con diferentes vacunas antihepatitis B comerciales, entre ellas se incluye la vacuna Heberbiovac-HB que contiene al HBsAg obtenido a partir de su expresión en Pichia pastoris y otras vacunas cuyo HBsAg es producido en otros hospederos. (1 B) Respuesta linfoprσliferativa generada por las diferentes vacunas luego de la dosis de refuerzo en el día 90; 1 C) Respuesta de células secretoras de IFN gamma luego de estimulación con células de mastocitoma murino p815 portando el péptido de la envoltura S28-39.
Figura 2. Estudio comparativo del antígeno producido por Pichia pastoris y el antígeno producido en células de organismos superiores (CHO) respecto a su capacidad de potenciar la respuesta celular contra otro antígeno coadministrado, en este caso se utilizó como modelo al HBcAg.
Figura 3. Estudio de la respuesta inmune inducida por formulaciones combinadas del HBsAg para uso terapéutico con un antígeno proteico proveniente de VIH-1. Esquema de inmunización nasal. 3A) Respuesta de linfocitos CD8+ anti-CR3 secretores de IFN gamma. 3B) Respuesta de linfocitos secretores de IFN gamma por estimulación directa con CR3.
Figura 4. Estudio de la respuesta inmune inducida por formulaciones combinadas del HBsAg para uso terapéutico con un antígeno proteico proveniente de VIH-1. Esquema de inmunización parenteral. 4A) Evaluación de la actividad secretora de IFN gamma en linfocitos CD8+. 4B) Evaluación de la actividad secretora de IFN gamma en linfocitos totales estimulados directamente con CR3. Figura 5. Título viral en ovario de los animales de los diferentes grupos. Figura 6. Capacidad de unión al receptor CD14. Grupo 1) HBsAg producido en Saccharomyces scerevisiae. Grupos 2-9) HBsAg producido en Pichia pastoris.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN
Ejemplo 1: Comparación de la inmunogenicidad de diferentes vacunas de hepatitis B cuyo antígeno procede de diferentes hospederos respecto a su capacidad de inducir respuestas humorales y celulares. Con el objetivo de estudiar las respuestas humoral y celular generadas por diferentes vacunas comerciales anti-hepatitis B, se llevó a cabo un esquema de inmunización en ratones Balb/C. Cinco grupos de 10 ratones cada uno, de 8 a 12 semanas de vida fueron inmunizados los días 0, 15, 30 y 90 con dosis de 2μg (microgramos) de HBsAg por vía intramuscular. Las extracciones de sangre se llevaron a cabo 10 días después de cada inmunización para evaluar la respuesta humoral y luego de la tercera y la cuarta dosis se sacrificaron entre 3 y 4 animales de cada grupo para realizar los estudios de respuesta celular, dependiendo del tipo de estudio. En este estudio se seleccionó la dosis de 2μg de HBsAg por ratón ya que esta se consideró lo suficientemente baja para permitir la detección de cualquier diferencia entre productos muy similares (todas las vacunas ensayadas emplean cantidades similares de HBsAg adyuvado en alúmina). Los grupos del esquema de inmunización fueron 1) la vacuna Heberbiovac HB, que contiene al antígeno HBsAg producido en Pichia pastoris, 2) la vacuna Shanvac B, producida igualmente en Pichia pastoris pero por otro método 3) la Vacuna Hepavax Gene y 4) la vacuna Euvax B producidas en Saccharomyces y Hansénula respectivamente. Un quinto grupo fue el placebo, ratones a los que solo se les administro hidróxido de aluminio en PBS.
La respuesta inmune humoral, así como la duración de la misma se evaluó por ELISA para la determinación de IgG total en suero. Los títulos de IgG séricos fueron testados dos semanas después de la segunda, la tercera y la cuarta dosis y también previo a la cuarta dosis. Los resultados de respuesta de anticuerpos IgG se muestran en la figura 1 A.
Durante el periodo de tiempo analizado no se encontraron diferencias significativas entre los títulos de anticuerpos IgG anti-HBsAg generados para las vacunas Heberbiovac HB y Shanvac B. Ambas vacunas generaron títulos similares entre sí y estadísticamente superiores en ambos casos a los generados después de segunda y tercera dosis por las vacunas Euvax B y Hepavax Gene.
Diez días después de la cuarta dosis se sacrificaron 4 ratones de cada grupo del estudio para realizar ensayos de LPA de manera individualizada. En las condiciones de nuestro experimento (bajas dosis de antígeno) solamente la vacuna Heberbiovac HB fue capaz de inducir una respuesta linfoproliferativa claramente detectable luego de la dosis de refuerzo. No se detectó ninguna respuesta positiva para el resto de las vacunas en estudio (fig. 1 B).
El ensayo de linfoproliferación es un indicativo de la proliferación de los esplenocitos en bazo, en este caso no hay una selección de un grupo celular específico, aunque fundamentalmente por el tiempo en que se realiza el ensayo lo que se determina es la proliferación de linfocitos T CD4+ de memoria. Estos linfocitos T CD4+ que proliferaron específicamente luego de estimulación con el antígeno son de tipo cooperador y pueden ¡nteractuar con linfocitos B para el desarrollo de respuesta humoral o con linfocitos T CD8+ para el desarrollo de respuesta citotóxica. Diez días después de la tercera dosis se sacrificaron 3 ratones de cada grupo y se llevó a cabo un ensayo de ELISPOT cuyos resultados se muestran en la figura 1 C. Los resultados obtenidos evidencian que el HBsAg en alúmina es capaz de inducir una fuerte respuesta de secreción de INFγ después de reestimulación con el péptido S28-39 derivado del HBsAg. Un ensayo de ELISPOT directo llevado a cabo mostró una baja respuesta comparada con la obtenida luego de reestimulación (resultados no mostrados). Los resultados de la figura 1C evidencian que la vacuna Heberbiovac HB tiene la capacidad de inducir una mayor frecuencia de células secretoras de INFγ en bazo de animales inmunizados en comparación con el resto de las vacunas estudiadas.
La secreción de INFγ es indicativa del desarrollo de una respuesta de células Th1 , de importancia en el control de la replicación viral de enfermedades crónicas entre ellas la hepatitis B. En su conjunto, este resultado evidencia que es superior la respuesta celular que se obtiene a partir del uso del antígeno de Hepatitis B producido en Pichia pastoris respecto a los antígenos producidos en otros hospederos, lo cual es de gran importancia en el uso terapéutico de esta vacuna, dada la correlación que para el caso de la Hepatitis B tiene el tipo de respuesta celular que aquí se evalúa -linfoproliferativa y de secreción de IFN gamma. Ejemplo 2: Efecto potenciador de la respuesta celular por el HBsAg obtenido por el método descrito.
Con el objetivo de evaluar las potencialidades del HBsAg obtenido a partir de Pichia pastoris respecto al antígeno obtenido en otro hospedero, nos dimos a la tarea de comparar el efecto potenciador de estos antígenos sobre la respuesta celular al antígeno de la nucleocápsida del VHB. Para esto se comparó la respuesta de células secretoras de IFN gamma estimulando con el antígeno de la nucleocápsida a cultivos de células totales de bazo en un ensayo de ELISPOT. Las determinaciones se realizaron en grupos inmunizados con el HBsAg procedente de Pichia pastoris y un antígeno procedente de células de organismos superiores (CHO), en ambos casos coadministrados con el antígeno de la nucleocápsida. Además se evaluaron los placebos correspondientes (datos no mostrados) y el control conteniendo solamente antígeno de nucleocápsida (grupo C, fig. 2). Este resultado demuestra un incremento superior de la frecuencia de células secretoras de IFN gamma en el grupo inmunizado con el HBsAg obtenido en Pichia pastoris (grupo A) respecto al grupo que contenía al HBsAg producido en células CHO (grupo B, fig. 2). De esta forma se avala el uso del antígeno producido en Pichia en formulaciones terapéuticas que incluyan otros antígenos, homólogos como es este caso u heterólogos como se demuestra en los ejemplos posteriores. Ejemplo 3: Uso de HBsAg en vacunas terapéuticas combinadas a inmunógenos de HIV-1 por la ruta nasal.
Para evaluar el uso del HBsAg en inmunizaciones nasales como un antígeno y al mismo tiempo como inmunopotenciador de la respuesta de tipo celular específica dentro de vacunas terapéuticas se inmunizaron ratones Balb/c hembras (CENPALAB, Cuba), de 6-8 semanas de edad, los días 0, 7, 14, 35 y 63. Los animales fueron inmunizados en diferentes grupos por la ruta intranasal como sigue: 1. PBS, 2. HBcAg + HBsAg, 3. CR3, 4. HBcAg + CR3, 5. HBsAg + CR3, 6. HBcAg + HBsAg + CR3. El antígeno CR3 se corresponde con un polipéptido multiepitópico obtenido por vía recombinante y que contiene numerosas secuencias epitópicas del VIH1 específicas para células T humanas. Los antígenos fueron disueltos en PBS y dispensados en 50μl (25μl en cada fosa nasal). Se utilizaron las siguientes dosis de 5, 5 y 10 μg por ratón de HBsAg (CIGB, Cuba), HBcAg (CIGB, Cuba) y CR3 (CIGB, Cuba), respectivamente. Se midió la respuesta celular secretora de IFN gamma específica anti-CR3 de linfocitos CD8+ por ELISPOT en bazo 10 días después de la última inoculación así como en linfocitos totales de bazo. El estudio de la respuesta celular se realizó evaluando la respuesta secretora de IFN gamma por los linfocitos de bazo. La secreción de IFNγ por linfocitos CD8+ fue medida a través de un ensayo tipo ELISPOT utilizando la línea P815CR3 que expresa constitutivamente la proteína CR3. Esta última es procesada ¡ntracelularmente y presentada en el contexto de las moléculas H-2 de ratón perteneciente el MHC-I; puesto que las células del mastocitoma P815 no expresan en su superficie moléculas MHC-II. Se pudo evidenciar que sólo los grupos inmunizados con HBsAg + CR3 y HBcAg + HBsAg + CR3 tenían respuestas positivas (Fig. 3A). Evidenciándose la actividad potenciadora de la respuesta celular anti CR3 estimulada por el antígeno de superficie del VHB. Utilizando linfocitos totales de bazo, se añadió la proteína CR3 al cultivo de las células de bazo, esta es endocitada y procesada para ser expuesta en el contexto de las moléculas de HC- II de las células presentadoras profesionales presentes en bazo como son células dendríticas y macrófagos. Nuestros resultados mostraron que sólo los mismos grupos que presentaron respuesta positiva de linfocitos T CD8+ poseían a su vez respuesta de células totales de bazo, fundamentalmente CD4+ secretoras de IFNγ: HBsAg + CR3 y HBcAg + HBsAg + CR3 (Fig. 3B). De modo general, es posible concluir que la adición del HBsAg influye positivamente en el incremento de la respuesta celular contra el HIV-1 a partir de la potenciación de la respuesta contra sus epítopes presentes en la proteína CR3. Justificando su uso como antígeno e inmunopotenciador al mismo tiempo como parte de una vacuna terapéutica anti HIV- 1 y anti HBV al mismo tiempo.
Ejemplo 4: Uso de HBsAg en vacunas terapéuticas combinadas a inmunógenos de HIV-1 por la ruta parenteral. Para evaluar el uso del HBsAg en inmunizaciones parenterales como un antígeno y al mismo tiempo como inmunopotenciador de la respuesta de tipo celular específica dentro de vacunas terapéuticas combinadas HBV-HIV, se inmunizaron ratones Balb/c hembras (CENPALAB, Cuba), de 6-8 semanas de edad, los días 0, 14, 35. Los animales fueron inmunizados en diferentes grupos por la ruta subcutánea como sigue: 1 ) HBsAg, 2) CR3, 3) HBsAg + CR3, 4) HBsAg + HBcAg + CR3. Todos los inmunógenos fueron adyuvados en 1 mg/ml de fosfato de aluminio. Se utilizaron las siguientes dosis de 2, 4 y 10 μg en 100 μl por ratón de HBsAg (CIGB, Cuba), HBcAg (CIGB, Cuba) y CR3 (CIGB, Cuba), respectivamente. Se midió la respuesta celular específica de células secretoras de IFN gamma por ELISPOT anti-CR3 en linfocitos CD8 y en linfocitos totales en bazo 10 días después de la última inoculación. Se determinó la respuesta evaluando la secreción de IFNγ por los linfocitos CD8+ (Fig. 4A). Esta fue medida a través de un ensayo tipo ELISPOT utilizando la línea P815CR3 como se detalló anteriormente. Solo tuvieron respuestas positivas los grupos inmunizados con: HBsAg + CR3 y HBcAg + HBsAg + CR3 en fosfato de aluminio (Fig 4A). Evidenciando el efecto del HBsAg sobre el antígeno coadministrado. El análisis de la respuesta de células secretoras de IFN gamma estimulando células totales de bazo en cultivo con CR3 directamente sin utilizar otra célula presentadora en placas de ELISPOT, resultó en una respuesta positiva sólo para los mismos grupos que resultaron positivos para linfocitos CD8+, ellos son: HBsAg + CR3 y HBcAg + HBsAg + CR3 en fosfato de aluminio (Fig. 4B), comprobándose nuevamente el efecto potenciador sobre la respuesta celular al antígeno CR3. Ejemplo 5: Estudio de la combinación del HBsAg y antígenos del VHC.
Con el objetivo de evaluar la influencia de la combinación de la proteína truncada de la cápsida del VHC particulada (Co.120), (Lorenzo LJ, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001 ;281 (4): 962-965) con el HBsAg sobre la respuesta inmune generada contra los antígenos de la región estructural del VHC fueron inoculados por vía intramuscular 10 ratones BALB/c, hembras de 8 semanas, por grupo. El esquema incluyó 4 inoculaciones en las semanas 0, 3, 6 y 9. Se realizó extracción de sangre 11 semanas después de la primera inmunización. Todos los inmunógenos fueron adyuvados en hidróxido de aluminio. El grupo 1 se empleó como control negativo y recibió hidróxido de aluminio. El grupo 2 fue inoculado con 5 μg de la proteína Co.120. El grupo 3 fue inoculado con la mezcla de 5 μg de la proteína Co.120 y 5 μg de HBsAg. El grupo 4 fue inmunizado con 5 μg de HBsAg. Los animales fueron retados por vía intraperitoneal con 106 unidades formadoras de placas de un virus vaccinia recombinante para el antígeno de la cápsida del VHC, 2 semanas después de la última dosis. Los animales fueron sacrificados 5 días después del reto y fueron extraídos y procesados los ovarios. Se realizaron diluciones seriadas y se infectaron células BSC-40 durante 2 días para determinar el título viral después de la tinción con violeta cristal. La figura 5 muestra el título viral en ovario de los animales de los diferentes grupos. El test T de Student fue empleado para analizar estadísticamente los resultados comparativos entre 2 grupos, p<0.05 fue considerada una diferencia significativa. En la Figura 5 se muestra que los animales inmunizados con la mezcla de la proteína Co.120 y el HBsAg presentan una carga viral estadísticamente inferior al resto de los grupos (p<0.05), lo cual evidencia la inducción de una respuesta celular in vivo efectiva contra el antígeno de la cápsida del VHC. Este grupo fue además el único que logró reducir de manera significativa la carga viral con respecto al grupo control negativo (animales inmunizados con hidróxido de aluminio). De este modo, se evidencia la actividad potenciadora del HBsAg sobre una propiedad antiviral, correlacionada con la reducción de la carga viral. Ejemplo 6: Estudio del efecto potenciador del HBsAg de esta invención producido en Pichia pastoris sobre diferentes antígenos asociados a diversas patologías.
Con el objetivo de evaluar el uso del HBsAg en inmunizaciones parenterales como un antígeno y al mismo tiempo como inmunopotenciador de la respuesta de tipo celular específica dentro de vacunas terapéuticas combinadas o sencillas contra enfermedades crónicas, se desarrollaron experimentos de coadministración del HBsAg utilizando antígenos de los virus comprendidos en las siguientes patologías: Virus de la Inmunodeficiencia Humana, se trabajó con antígenos virales atenuados conteniendo secuencias del VIH1-1 , con antígenos peptídicos y con polipéptidos multiepitópicos; Virus del Papiloma Humano, se trabajó con partículas semejantes a virus o VLP del HPV 16, 18 y 33; Virus de la Hepatitis C: se utilizaron antígenos que contienen secuencias del antígeno de la nucleocápsida y de la envoltura viral así como segmentos de regiones no estructurales; igualmente se administraron antígenos de otras patologías que generan cronicidad como el cáncer, estos fueron antígenos tumor asociados y tumor específicos de cáncer del hígado, pulmón, mama y próstata. En todos estos casos se pudo apreciar un incremento en la actividad secretora de IFN gamma respecto a la administración de los antígenos por separado, evidenciándose la utilidad de la presencia del HBsAg en formulaciones terapéuticas.
Ejemplo 7. Estudios de la capacidad de unión a CD14 de diferentes lotes del HBsAg obtenidos a partir de Pichia pastoris por el método descrito en comparación con lotes de HBsAg producido en otros hospederos. El análisis de los antígenos de superficie del VHB obtenidos de manera recombinante a partir de diferentes hospederos evidenció que existen entre los mismos diferencias que influyen en su mayor inmunogenicidad a nivel celular, como es el caso de su capacidad de unión al receptor CD14 presente en macrófagos y relacionados al desarrollo de procesos de tolerancia inmunológica. Se ha podido comprobar, luego del análisis ¡nmunofluorométrico que existe una marcada reducción de la capacidad de unión a CD14 en el antígeno que procede de la levadura hospedero Pichia pastoris por el método aquí descrito, cuando se compara con el antígeno procedente de Saccharomyces cerevisiae (Fig. 6). Este aspecto influye en el comportamiento inmunológico y al mismo tiempo justifica el comportamiento inmunológico diferencial de los antígenos ensayados en la presente invención.

Claims

REIVINDICACIONES - Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico caracterizadas porque comprenden el antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B producido a partir de levadura por un método de purificación que comprende al menos uno de los pasos siguientes: lisado de las células en presencia de un buffer de ruptura que comprende un agente caotrópico; precipitación de contaminantes a pH ácido; sometimiento de la preparación del antígeno a una cromatografía de inmunoafinidad empleando un anticuerpo monoclonal específico para antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B; y sometimiento del antígeno eluído a un tratamiento térmico a una temperatura entre 30°C y 40°C.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizadas porque la levadura empleada para la producción del antígeno es la Pichia pastoris.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 y 2 caracterizadas porque se emplean en el tratamiento de infecciones por virus de progresión crónica.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizadas porque se emplean en el tratamiento de la infección crónica por el Virus de la Hepatitis B.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizadas porque se emplean en el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y el Virus de la Hepatitis C.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizadas porque se emplean en el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizadas porque se emplean en el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y otra infección comprendida en el grupo de las enfermedades de curso crónico. - Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizadas porque se emplean como una vacuna bivalente en la que se trata la infección crónica por un virus de evolución crónica y a la vez tenga un carácter preventivo para el Virus de la Hepatitis B.- Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 8 en la que el antígeno de la Hepatitis B es administrado solo o convenientemente adyuvado.0-Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 9 en la que el antígeno de la Hepatitis B es administrado en combinación con otros antígenos homólogos o heterólogos que recibirían un efecto adyuvante de importancia para la actividad terapéutica.1 -Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a la reivindicación 10 en la que el antígeno heterólogo puede ser un antígeno vacunal proveniente de un virus que posee capacidad de inducir enfermedades crónicas.2-Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico de acuerdo a las reivindicaciones 1 a la 11 para uso parenteral, mucosal o que combine ambas vías.3-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B en composiciones farmacéuticas terapéuticas, caracterizado porque el antígeno es producido a partir de levadura por un método de purificación que comprende al menos uno de los pasos siguientes: lisado de las células en presencia de un buffer de ruptura que comprende un agente caotrópico; precipitación de contaminantes a pH ácido; sometimiento de la preparación del antígeno a una cromatografía de inmunoafinidad empleando un anticuerpo monoclonal específico para antigeno de superficie del virus de la Hepatitis B; y sometimiento del antígeno eluído a un tratamiento térmico a una temperatura entre 30°C y 40°C.4-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a la reivindicación 13 caracterizado porque la levadura empleada para la producción del antígeno es la Pichia pastoris. -Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a las reivindicaciones 13 y 14 para la obtención de una vacuna para el tratamiento de la infección por virus de progresión crónica.-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a las reivindicaciones 13 a la 15 para la obtención de una vacuna para el tratamiento de la infección crónica por el Virus de la Hepatitis B.-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a las reivindicaciones 13 a la 15 para la obtención de una vacuna para el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y el Virus de la Hepatitis O-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a las reivindicaciones 13 a la 15 para la obtención de una vacuna para el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana.-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a las reivindicaciones 13 a la 15 para la obtención de una vacuna para el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y otra infección comprendida en el grupo de las enfermedades de curso crónico.-Uso del antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B de acuerdo a las reivindicaciones 13 a la 15 para la obtención de una vacuna bivalente en la que se trate la infección crónica por un virus de evolución crónica y a la vez tenga un carácter preventivo para el Virus de la Hepatitis B. -Método para el tratamiento de infecciones por virus de progresión crónica caracterizado por el empleo de un antígeno de superficie del Virus de la Hepatitis B producido a partir de levadura por un método de purificación que comprende al menos uno de los pasos siguientes: lisado de las células en presencia de un buffer de ruptura que comprende un agente caotrópico; precipitación de contaminantes a pH ácido; sometimiento de la preparación del antígeno a una cromatografía de inmunoafinidad, empleando un anticuerpo monoclonal específico para antígeno de superficie del virus de la Hepatitis B; sometimiento del antígeno eluído a un tratamiento térmico a una temperatura entre 30°C y 40°C.-Método de acuerdo a la reivindicación 21 caracterizado porque la levadura empleada para la producción del antígeno es la Pichia pastoris. -Método de acuerdo a las reivindicaciones 21 y 22 para el tratamiento de la infección crónica por el Virus de la Hepatitis B.-Método de acuerdo a las reivindicaciones 21 y 22 para el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y el Virus de la Hepatitis C.-Método de acuerdo a las reivindicaciones 21 y 22 para el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y el Virus de la Inmunodeficiencia Humana.-Método de acuerdo a las reivindicaciones 21 y 22 para el tratamiento de la coinfección crónica por el Virus de la Hepatitis B y otra infección comprendida en el grupo de las enfermedades de curso crónico.-Método de acuerdo a las reivindicaciones 21 y 22 para la obtención de una vacuna bivalente en la que se trate la infección crónica por un virus de evolución crónica y a la vez tenga un carácter preventivo para el Virus de la Hepatitis B.
PCT/CU2004/000011 2003-10-20 2004-10-20 Composiciones farmacéuticas para uso terapéutico WO2005037311A1 (es)

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