KR20060117920A - 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 만성적 질병을 유발하는 병리에 대한 치료적 백신의 분야에 관한 것이다. 이것은 주요 화합물로 간염 B 표면 항원 (HBsAg)을 함유하는 제형의 치료의 용도를 포함하며 HBsAg는 피키아 파스토리스(Picchia pastoris)에서 재조합 산물로 생산된다. 본 발명의 제형은 또한 간염 B 표면 항원과 다른 함께 투여되는 항원의 조합을 포함한다. 얻어진 제형은 특정 항체의 현저한 반응성과 별도로 강력한 림프증식성 및 세포독성 반응을 발생할 수 있어, 이들 제형이 이런 질병의 치료에 매우 효과적으로 이용된다.

간염 B 표면 항원(HBsAg), 피키아 파스토리스(Picchia pastoris), γIFN

Description

치료용 약학적 조성물 {PHARMACEUTICAL COMPOSITIONS FOR THERAPEUTIC USE}

본 발명은 만성 질환을 유발하는 병원균에 대한 치료 백신을 위한 생명공학 분야에 관한 것으로, 상세하게는 치료적 사용을 위해 약학적 조성물의 주요 화합물로서 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서의 재조합 기술에 의해 생산된 간염 B 표면 항원(HBsAg)의 용도에 관한 것이다.

약 3억5천만 인구가 간염 B바이러스에 만성적으로 감염되어 있다(HBV). HBV 만성 감염 환자의 주요한 위험요소는 간세포의 악성종양 또는 간경변의 비-악성종양성 합병증(간문 고혈압 및 신부전증)에 관련되는 증가된 치사율을 가져오는 간경변이다

바이러스 복제의 제어는 HBV 감염의 병리가 주로 면역을 매개로 하여 되기 때문에 이들 위험요소를 유의적으로 감소한다.

오늘날, HBV에 의해 유발된 만성적 간염을 치료하기 위한 단지 두 가지의 치료법이 광범위하게 인식되어져 있으며 임상적인 이점을 보여준다. 감마 인터페론으로 치료 및 라미부딘(Lamivudine)과 같은 뉴클레오스/타이드스 (nucleos/tides) 의 아날로그로 치료법에는 주요한 제한이 있다. 감마 인터페론으로 치료하는 것은 γIFN의 항바이러스 및 면역증강성 특성을 결합하여 그 결과 단지 3분의 1의 환자에 있어서만 바이러스성 증식의 지속적 억제를 가져온다.

라미부딘 처리법은 HBV 증식의 빠르고 거의 완전한 감소를 유도하지만 단기간의 처리는 빠른 재발에 관련된다.

장기간 동안의 처리는 년간 15 내지 20%의 발생빈도로 재발을 증가한다. HBV에 대한 양 항바이러스 치료법의 제한은 만성적으로 감염된 환자에서 T 세포의 낮은 반응성을 개선하기 위해 도움이 되는 신규한 뉴클레오티드의 유사화합물 및 신규한 특이 또는 비특이적 면역치료제법을 포함하는 새로운 후천적 치료법을 찾아낼 필요성을 요하게 된다.

특이 면역성의 수동적 전이, 면역조절약물(시토퀸, 다임 유도체 및 성장 인자) 및 백신 치료법(현행의 재조합 백신, DNA-기재 백신 및 T 세포 펩티드와 같은 신규한 접근법)은 근래의 면역치료적 방법이다.

HBV 는 사이토패트 바이러스가 아니며 감염되는 동안에 간의 손상이 주로 숙주 면역 반응 대 감염된 세포에 의해 그리고 염증성 사이토킨의 생성에 기인하여 조정되어 진다. 강한 시토퀸 반응 대 HBV 뿐 아니라 사이토톡신 및 헬퍼 세포의 서브유닛에서의 강력한 폴리크로날 및 다특이적 세포 반응은 급성 및 자가-제한 간염 B 감염이 된 환자의 말초 혈액에서 쉽고 그리고 빠르게 감지되어 질 수 있다. 다음으로, 동일한 반응이 약한 만성 감염이 된 환자는 항유전적으로 제한되거나 또는 감지될 수 없다. T 세포 반응은 HBV 제거에 반응적이었음이 입증되어 있다. 급성 간염 B 동안에, Th1 시토퀸(감마 인터페론, TNF-a) 및 IL-2는 바이러스의 제거에 관련된다.

몇 가지의 재조합 항 간염 B 백신이 면역치료법에 대해 분석되어왔다. 구조적으로 간에서 HBsAg를 발현하는 형질전환 마우스의 면역화 반응은 특이적 면역 반응을 포함하는 HBsAg에 대한 기능적 내성을 극복하기 위한 이 치료적 요법의 역량을 보여준다. (Mancini M, et al., Induction of anti-hepatitis B surface antigen (HBsAg) antibodies in HBsAg transgenic mice: a possible way of circumventing "nonresponse" to HBsAg. J Med Virol. 1993; 39:67-74.). 파이롯트 스케일에서의 초기 임상적 시험은 특이적 백신 치료법은 만성적 담지자의 약 50%에서 HBV의 증식을 제거 또는 감소할 수 있다는 것을 입증하였다(Pol S, et al. Lancet 1994; 342 (Letter), Wen Y-M, et al. Lancet 1995; 345: 1575-1576 (Letter), Pol S, et al. Acta Gastroenterologica Belgica 1998; 61:228-33).

마지막으로, 다중심적이고 제어된 연구는 만성 감염의 치료에서 항-간염 B 백신의 실질적인 역량을 보여주었다 (Pol S, et al. J Hepatol 2001; 34: 917-21). S 영역 단독으로 또는 전-S 영역을 포함하는 항원을 함유하는 상업적 백신이 분석되었다. 일 년 후 그리고 다섯 번의 주입 후 비처리 대조군에 비하여 바이러스 DNA의 음성화 반응의 백분율에서 차이점이 없으며, HBsAg의 제거가 없고, 백신 군에 대해서는 양호하지만 "e" 항원의 음성화 반응 또한 열악하였다. 모든 이들 결과는 신규한 면역치료방법에 대한 요구뿐 아니라 보다 강력한 후보군으로 면역화 방법의 강화가 상술한 치료전략의 요구인 것으로 귀결되었고 입증되었다.

CD14 리셉터에 결합하는 낮은 능력을 갖는 항원이 HBsAg에 높은 반응성을 발생하는 개개인의 PBMC에서의 보다 높은 증식적 활성을 유도할 수 있는 사실이 최근에 입증되었다. 이 사실은 면역 억제 메카니즘과 CD14에 결합하는 역량간의 상관관계를 제시한다 (Valandschoot P, et al. J. Med Virol 2003, 70: 513-519).

함께 투여된 상동 및 비상동성의 항원에 대한 활성 증진이 입증되고 또한 그 물리-화학적 특징화의 결과로 CD14 리셉터에 대한 그 결합 능에서 유의적인 감소를 갖는 변형체를 선택하는 공정에 의해 생산된 것으로, 세포 반응성이라는 관점에서 그 우월한 면역형성성을 입증하는 신규한 간염 B 표면 항원은 신규한 항원이고 또 단독으로 또는 만성적 감염 또는 공-감염의 치료를 위한 복합 항원의 제형의 일부로서 포함되어 간염 B 바이러스에 대한 항바이러스 치료법으로의 사용여부가 고려되어 질 수 있다.

본 발명에서는, 치료적 용도를 위한 새로운 약학적 조성물을 얻기 위하여, 이 출원에 기술된 방법에 의해 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)에서 생산된 간염 B 표면 항원의 새로운 용도가 기술되어 진다. 이를 달성하기 위해, 본 조건에서 생산된 HBsAg의 새로운 특성은 다른 간염 B 항원과 비교할 수 있는지에 대한 검토가 이루어졌다.

본 발명에서는 특허 EP 0480525 B1의 "간염 B 바이러스의 재조합 표면 항원을 수득하기 위한 방법"에 기술된 방법이 얻어진 항원에 새로운 특성을 제공하고 있음을 발견하였다. 다음의 단계를 포함하는 정제 과정을 이용하여 피키아 파스토리스에서 생산된 HBsAg는, 이 항원의 치료적 용도를 지지하는 것으로, 문헌에 기술된 다른 간염 B 표면 항원과 다른 새로운 항원이 된다; 카오트로프 제(caotropic agent)를 포함하는 용균 버퍼 내에서 세포 용균; 산성 조건(낮은 pH값)에서 오염물질의 침전; 간염 B 표면 항원에 대해 특정 모노크로날 항체를 사용하여 항원의 면역친화성 크로마토그래피; 30℃ 내지 40℃의 범위 내의 온도로 용리된 항원의 열처리.

HBsAg 항원 사이에서의 차이점은 다른 숙주에서 생산된 본 발명의 항원 대상물의 보다 높은 면역유발성과 다른 정제방법을 사용하는 것에 기초한다. 다른 차이는 본 HBsAg의 활성을 고양하는 결과로 함께 투여되어진 치료 백신에 포함되어진 잠재적인 항원으로 또한 고려되어진 상동 및 비상동성의 항원에 대하여 고양되는 활성이다. 더욱이, 면역계의 앞에서 이들의 행동에 현저하게 영향을 미치는 본 조건 하에서 생산된 HBsAg의 화학적 조성 및 구조의 다른 측면에 있다.

본 발명의 HBsAg는 간염 B 만성 감염을 치료하기 위한 백신 제제와 비상동성의 항원에 대한 증식성 및 기능성인 세포 반응의 증진을 고양하는 항원의 능력에 기인하여 다른 바이러스와 만성적 공감염인 경우에 사용될 수 있다.

본 발명의 HBsAg와 같이 함께 투여되어지는 항원 중에는, 만성 감염을 일으킬 수 있는 다른 바이러스로부터의 항원, 예를 들어 간염 C 및 HIV 항원이 있다. 본 발명의 실시예에 기술된 결과는 간염 C 바이러스의 뉴클레오캡시드(nucleocapsid)와 상기 병원체에 대해 인체에서 세포 반응에 관련된 에피토프를 포함하는 VIH-1의 키메라 단백질로 얻어졌다.

본 발명자가 본 실험에서 얻은 증거에 따른 이 특성은 같은 목적으로 이 과정에서 얻어진 HBsAg와 함께 투여될 수 있는 어떤 상동 또는 비상동성의 단백질까지 확대된다. 본 제형에서 사용될 수 있고 또한 제형의 최종 효과에 중요한 상동 단백질은 간염 B 바이러스 또는 HbcAg의 뉴클레오캡시드의 단백질이다. 이 단백질은 이것이 본 발명의 HBsAg와 함께 투여될 때 그의 세포 반응에서 면역고양 효과를 수용할 수 있다.

동시에, 만성적 질병에 대해 치료적으로 유리해지는 간염 B와 동떨어진 질병의 만성적 경로로 고통받고 있는 개인에게 영향을 미치는 얻어진 다가의 제형의 가능한 용도가 본 발명으로부터 명백하고, 동시에 이들은 HBV 감염에 의해 감염에 대한 예방적 면역 반응을 포함할 것이다.

또한, 본 발명의 대상물은 용액 형태뿐 아니라 편리하게 명반염 또는 보조 목적으로서 선택된 어떤 다른 보조제와 같은 보조제를 사용하여 만성 간염 B에 대한 치료를 위해 기술된 방법을 사용하여 피키아 파스토리스에서 얻어진 HBsAg를 사용한 약학적 조성물이다. 이들은 치료 용도로 본 백신의 투여에 유용한 명반염 또는 다른 보조제일 수 있지만 이것이 이들에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 대상물은 또한 기술된 방법에 의해 피키아 파스토리스에서 얻어진 간염 B 표면 항원이 이들의 치료적 활성에 중요한 보조적 효과를 수용하는 상동 및 비상동적 항원과 조합하여 투여되어지는 치료용 용도를 위한 약학적 조성물이다. 상동성 항원은 간염 B 바이러스의 항원, 바람직하게는 상기 바이러스의 뉴클레오캡시드 항원 중에서 구성되어 진다. 본 발명의 제형 대상물에 포함되어질 수 있는 다른 항원은, 이들에 한정되는 것은 아니지만, 이런 특성을 갖는 다른 바이러스로부터 항원의 사용을 가능하게 하는 것으로, 예를 들어 간염 C 바이러스 및 HIV-1 같은 인간에서 만성적 진화를 갖는 바이러스에 속하는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물이 일종의 필요한 치료적 반응을 강화할 목적으로 점막, 비경구를 통해 또는 양 경로를 조합하여 사용될 수 있다는 것을 알아내는 것은 중요하다. 본 발명의 약학적 조성물에서의 항원의 양은 제형에 포함된 항원에 의존하는 것으로, HBsAg 의 경우에는; 항원은 일 복용량 당 5 내지 300 마이크로그램의 범위로 존재한다. 나머지 함께 투여된 항원의 비율은 고려되어지는 치료 특성에 의존하여 5:1 내지 1:5로 다양하게 변한다.

도 1A는 다른 상업적 백신으로 0, 15, 30 및 90일에 면역된 마우스의 혈청에서 항 HBsAg IgG 면역 반응의 운동학을 보여주는 그래프로, 백신의 하나는 헤베르바이오백(Heberbiovac)-HB로 피키아 파스토리스에서 얻어진 HBsAg를 포함하고, 다른 백신은 다른 숙주에서 다른 방법으로 생산되었다. 도 1B는 90일에 추가면역 투여 후 다른 백신에 의해 발생된 림프증식 반응이고, 도 1C는 펩티드 S_{28 -39}로 펄스된 뮤린 마스토사이톰 p815의 세포로 자극 후 γIFN 분비 세포의 반응을 나타낸다.

도 2는 다른 함께 투여된 항원에 대해 세포적 반응을 증진하는 그 능력에 대하여 피키아 파스토리스에 의해 생산된 항원과 고등생물로부터의 세포(CHO)에서 생 산된 항원의 비교연구이다. 이 경우에 간염 B 코아 항원이 항원의 모델로 사용되었다.

도 3은 HBsAg, HBcAg 및 HIV-1으로부터의 서열을 함유하는 멀티에피토프 단백질을 포함하여 치료적 사용을 위해 조합된 제형에 의해 유도된 면역 반응의 연구이다. 코의 면역화 스케쥴: 3A) 삽입된 CR3의 서열을 갖는 형질전환 p815를 갖는 비장 세포의 자극 후 γIFN를 분비하는 항-CR3 CD8+ 림포사이트. 3B) CR3를 사용한 비장 세포의 자극 직후 γIFN 분비 림포사이트.

도 4는 HBsAg, HBcAg 및 HIV-1으로부터 CR3 단백질의 조합된 제형에 의해 유도된 면역 반응의 연구이다. 비경구적 면역화 스케쥴: 4A) 삽입된 CR3의 서열을 갖는 형질전환 p815를 갖는 비장 세포의 자극 후 γIFN를 분비하는 항-CR3 CD8+ 림포사이트. 4B) CR3를 사용한 비장 세포의 자극 직후 γIFN 분비 림포사이트.

도 5는 다른 군으로부터의 동물 난소에서의 바이러스의 역가이다.

도 6은 CD14 결합능 군으로 1)은 사카로마이세스(Saccharomyces) 군에서 생산된 HBsAg이고 2-9)는 상술된 조건에서 피키아에서 생산된 HBsAg이다.

실시예 1: 다른 숙주로부터 생산된 다른 간염 B 백신의 체액성 및 세포적 면역 반응을 유도하는 이들의 능력에 대한 면역형성성 .

다른 상업적 항-간염 B 백신에 의해 발생된 체액성 및 세포적 면역 반응을 연구할 목적으로, 면역화 계획이 Balb/C 마우스에서 실행되었다. 8 내지 12주령의 각 10마리 마우스의 5개 군이 근육 내로 2㎍(마이크로그램)의 HBsAg의 복용량으로 0, 15, 30 및 90일에 면역화시켰다. 체액성 반응을 평가하기 위해 혈액 채취가 각 투여 후 10일에 수행되어 졌으며, 세 번째 및 네 번째 복용 후 군 당 3 내지 4마리의 동물군의 마우스가 희생되어 연구 타입에 따른 면역 반응을 연구하였다.

이 연구에서, 마우스 당 2㎍ 의 HBsAg 복용은 선택되었는데 이는 이것이 매우 유사한 생산품(모든 분석된 백신은 유사한 양의 HBsAg와 수산화명반을 가짐) 사이에 어떤 차이점을 충분히 감지할 수 있는 낮은 양이기 때문이다

면역화 계획의 군은 1) 피키아 파스토리스에서 생산된 HBsAg 항원을 포함하는 헤베르바이오백(Heberbiovac) HB 백신, 2) 또한 피키아 파스토리스에서 생산되지만 다른 정제방법을 사용한 산백(Shanvac) B 백신, 3) 헤파박스 진(Hepavax Gene) 및 4) 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 및 한센뉼라 폴리모르파(Hansnula polymorpha)에 의해 각각 생산된 유백스(Euvax) B 백신이다. 다섯 번째 군은 유사한 양으로 수산화 명반만을 수용한 마우스를 포함하는 플라시보 대조군이다.

역가의 지속성 뿐 아니라 체액성 면역 반응은 혈청 샘플에서 전체 IgG를 결정하는 ELISA에 의해 평가되었다. 혈청 IgG 역가는 2차, 3차 및 4차 복용 후 2주에 그리고 4차 복용 전에 또한 시험되었다. 항체 반응의 결과는 도 1A에 나타냈다.

분석 기간 동안, 헤베르바이오백(Heberbiovac) HB 백신과 산백(Shanvac) B 백신으로 면역된 군 사이에 아무런 유의성 있는 차이가 발견되지 않았다. 양 백신은 유사한 역가를 나타냈고 2차 및 3차 복용 후 나머지 분석된 백신(유백스 B와 헤 파박스 진)에 비해 우월하였다.

4차 복용 10일 후, 군 당 4마리 마우스를 희생하여 개개의 마우스 당 림프증식 반응을 측정하는 세포의 면역성 연구를 수행하였다. 낮은 항원 복용량의 본 실험 조건에서, 단지 헤베르바이오백(Heberbiovac) HB 만이 추가면역 투여 후 명확하게 감지할 수 있는 림프증식 반응을 유도할 수 있었다. 연구되어진 나머지 백신에 대해서는 양성적인 반응성이 없었다 (도 1B).

림프증식성 분석은 특이적 세포 서브 유닛의 선정 없이 증식하는 비장 세포의 능력을 나타내지만, 분석 시에 메모리 T CD4+가 자극에 반응하는 주요 세포군이라는 것이 알려졌다. 항원 자극에 특이적으로 증식하는 이 T CD4+ 림포사이트는 B세포와 그리고 각각 체액성 및 세포질 반응의 전개를 돕는 CD8⁺ T 세포와 상호 작용할 수 있다.

3 차 복용 10일 후, 군 당 3마리 마우스가 희생되고 ELISPOT 분석이 수행되어, 그 결과는 도 1C에 나타냈다.

ELISPOT 분석에서 얻어진 결과는 명반 내의 HBsAg가 HBsAg로부터 유도된 S_{28 -39} 펩티드로 재자극 후 림포사이트를 분비하는 γIFN의 강력한 반응을 유도할 수 있다는 것을 입증하고 있다. 직접 ELISPOT 분석은 재자극 후 결과에 비하여 보다 낮은 반응성을 입증한다(데이타 도시 생략). 도 1C에 나타난 결과는 헤베르바이오백(Heberbiovac) HB가 평가 하에 있는 나머지 백신에 비하여 면역된 동물로부터 비장 세포에서 γIFN 분비 세포의 보다 높은 빈도를 유도하는 능력을 갖는 것을 입증 한다. γIFN의 분비는 HBV 복제의 제어에 매우 중요한 Th1 세포의 전개를 나타낸다.

얻어진 결과를 조합하면 다른 숙주에서 얻어진 항원 뿐 아니라 동일한 숙주 및 다른 조건에서 얻어진 항원에 비하여 피키아 파스토리스에서 생산되고 본 발명에서 설명된 조건으로 정제된 HBsAg의 우수한 세포 반응성이 증명된다. 간염 B 바이러스 감염의 조절로 본 실험(림포증식성 활성 및 γIFN 분비)에서 평가된 반응성 사이의 상관관계가 광범위하게 수용되기 때문에 이 결과는 치료적 백신화의 분야에서 현저하다.

실시예 2: 상술된 방법에 의하여 생산된 HBsAg 에 의한 세포 면역 반응 상의 증진효과.

다른 숙주에서 얻어진 HBsAg 항원에 비하여 피키아 파스토리스[Centraal Bureau voor Schimmelcultures(CBS) 기탁번호 제 CBS 450.90호]에서 얻어진 HBsAg의 가능성을 평가하기 위해, 상동성 항원 HBcAg (간염 B 뉴클레오캡시드 항원)에 양 항원의 공동 투여에 의해 유도된 면역 반응성을 평가하기 위한 실험이 계획되었다.

이 목적으로, ELISPOT 분석에 의한 뉴클레오캡시드 항원으로 비장 세포의 자극 후 γIFN 분비 세포의 빈도를 측정하였다.

이 측정은 헤베르바이오백 HB로부터 HBsAg 및 우수한 기관(CHO)으로부터 생산된 HBsAg로 면역된 군 별로, 뉴클레오캡시드 항원으로 함께 투여된 양 경우에서 수행되었다. 더욱이, 상당하는 플라시보 대조군(데이타 도시 생략) 뿐 아니라 뉴클레오캡시드 항원만을 함유하는 대조군(C군, 도 2)이 평가되었다.

이 결과는 CHO 세포에서 생산된 HBsAg를 함유하는 군(B 군, 도 2)에 비하여 피키아 파스토리스에서 얻어진 HBsAg(A 군)으로 면역된 군에서 γIFN를 분비하는 세포의 빈도가 증가하는 것을 입증한다. 그래서 우리는 다른 항원: 이 경우에서는 상동성 또는 다음의 추가적 실험에서 나타나는 경우로서는 비상동성 항원을 포함하여 치료적 제형의 디자인에 있어 피키아로부터 생산된 HBsAg의 사용을 제안할 수 있다.

실시예 3: HBV 항원과 HIV -1로부터 HIV -1 유래 단백질 CR3 를 조합한 치료적 백신 제형에서 HBsAg 의 용도.

항원으로서 코의 면역화작용에서 HBsAg의 용도와 동시에 치료적 백신 제형에서 비상동성 항원에 대해 세포 특이적 반응의 면역강화작용용 보조약으로서 용도를 평가하기 위해, 6 내지8 주령의 암컷 Balb/c 마우스의 여섯 군이 스케쥴 0, 7, 14, 35 및 63에 따라 접종되어 졌다. 동물들은 다음과 같이 비강 내의 경로에 의해 다른 군에 면역되어 졌다: 1. PBS, 2. HBcAg + HBsAg, 3. CR3, 4. HBcAg + CR3, 5. HBsAg + CR3, 6. HBcAg + HBsAg + CR3. 재조합 기술에 의해 얻어진 멀티에피토프 폴리펩티드에 상응하고 HIV-1로부터 몇 가지 서열을 포함하는 CR3 항원은 인간 T 세포에 특이적이다. 이 항원은 PBS에 용해되고 50ml (콧구멍 당 25ml)로 현탁된다. HBsAg (CIGB, Cuba), HBcAg (CIGB, Cuba) 및 CR3 (CIGB, Cuba)에 대해 마우스 당 각각 5, 5 및 10 mg의 복용량이 사용되었다. 비 항-CR3 γIFN 분비 면역 반응이 CD8+ 세포에 대해서 ELISPOT 분석에서 뿐 아니라 마지막 접종 10일 후 전체 비장 세포를 사용하여 측정되었다.

세포 반응의 연구는 ELISPOT 분석에 의해 γIFN를 분비하는 비장 세포의 빈도를 측정함으로써 수행되어 진다. 이 APC는 구조적으로 CR3 단백질을 생산하여, 세포 내적으로 보유되어 HLA 클라스 I에 발현된다. 마스토사이톰(mastocytome) P815는 이들의 표면에 MHC-II 분자를 발현하지 않고, 이 사실에 기인하여, P815CR3는 특이적으로 CD8+ T 세포를 활성화 할 것이다. 단지 HBsAg + CR3 및 HBcAg + HBsAg + CR3으로 면역된 군 만이 CR3 단백질 상에 HBsAg에 의해 자극된 항 CR3 세포 반응에 대한 활성을 고양하는 것을 입증하는 양성적 반응자(도 3A)라는 것이 입증되었다. 전체 비장 세포를 사용하여, 단백질 CR3가 이것이 식균되고 마크로파아지 및 덴드라이트 세포 같은 프로페셔날 APC의 MHC 클라스 II의 내용물로 주로 발현되어지도록 진행되어지는 배양에 부가된다.

본 결과는 CD8+ T 림포사이트에 양성적 반응을 나타내는 같은 군 만이 또한 상기 기술된 (전체 비장 세포를 사용하는) 분석에 대해 긍정적이고, 여기서 주요한 반응자는 CD4+ 세포: HBsAg + CR3 및 HBcAg + HBsAg + CR3 (도 3B)라는 것을 보여준다. 일반적으로, HBsAg가 CR3 단백질에 의해 발현된 이들의 에피토프에 대해 반응성을 강화하는 결과로서 HIV-1에 대해 세포성 반응을 고양했다는 것으로 결론지을 수 있다. 이 결과는 항원으로서 뿐 아니라 동시에 HIV-1 및 HBV에 대한 치료적 면역화반응의 내용물에서 보조약으로 사용을 정당화한다.

실시예 4: 비경구적 경로를 통한 HIV -1로부터 면역원에 대한 결합된 치료적 백신에서의 HBsAg 의 용도.

항원으로서 뿐 아니라 그리고 조합된 HBV-HIV 면역화반응의 분야에서 세포적 반응의 보조약으로 비경구적 면역화반응에서 HBsAg의 용도를 평가하기 위해, 다른 제형들이 분석되었다. 6 내지 8 주령의 8 내지 10마리의 암컷 Balb/c 마우스 (CENPALAB, Cuba)의 군이 0, 14, 35일에 면역화 되었다. 마우스는 다음과 같이 다른 군으로 피하로 면역화되었다: 1) HBsAg, 2) CR3, 3) HBsAg + CR3, 4) HBsAg + HBcAg + CR3. 모든 면역원은 1 mg/mL 인산염 명반에 보조되었다. 다음의 HBsAg 및 HBcAg 복용량이 사용되었다: 마우스 당 100 ml 내에 2, 4 및 10 mg. 양 항원은 쿠바의 CIGB에서 생산되었다. γIFN 분비 세포의 항- CR3 특이적 세포 면역 반응이 실시예 3에서 기술된 바와 같이 P815 발현 CR3을 사용하여 ELISPOT에 의해 측정되었다 (도 4A). 긍정적 반응은 단지 함께 투여된 항원의 면역원성에 대한 HBsAg의 효과를 입증하는 인산염 명반에서 HBsAg + CR3 및 HBcAg + HBsAg + CR3 (도 4A)으로 면역화된 군의 경우에만 검출되어 졌다.

γIFN 분비 세포의 항- CR3 특이적 세포 면역 반응의 분석이 또한 CR3 단백질이 APC 형 P815 없이 배양에 직접적으로 부가되는 때 수행되어 졌다. 이 실험은 CD8+ 반응의 경우 긍정적이라는 결과로 된 같은 군에 대해서만 긍정적 ELISPOT 반응으로 나타난다. 이들은: 인산염 명반에서 HBsAg + CR3 및 HBcAg + HBsAg + CR3(도 4B)로, 이들 군은 CR3에 대한 HBsAg의 세포 증진 활성을 다시 한번 입증하였다.

실시예 5: HBsAg 및 HCV 항원의 조합에 대한 연구.

HCV로부터 구조 영역의 항원 대 발생된 면역 반응에 대한 HCV 캡시드(Co.120), (Lorenzo LJ, et al. Biochem Biophys Res Commun 2001;281(4):962-965)로부터 턴케이트된 단백질과 HBsAg의 조합 영향을 평가하기 위해, 근육 내의 스케쥴이 BALB/c 마우스에서 수행되었다. 8주령의 10마리 암컷 마우스 군이 사용되었으며 이 스케쥴에 0, 3, 6 및 9 주에 네 번 접종이 포함된다. 혈액의 채취는 1차 면역화 반응 후 11주에 수행되었다. 모든 면역원은 수산화명반에 보조약으로 부가되어진다. 1군은 음성 대조군으로 사용되어 수산화명반 만이 수용된다. 2군은 단백질 Co.120의 5 mg으로 접종되어 진다. 3군은 5 mg의 각 단백질의 혼합물로 접종되고 4군은 5 mg의HBsAg으로 면역화되었다. 동물은 2 주후에 재조합 기술에 의해 삽입된 HCV 캡시드 항원으로 재조합 백신 바이러스의 106 플라그 형성 단위를 복막의 경로 투여를 통해 면역화되었다.

동물은 면역화 5일 후에 희생되고 난소가 적출되고 진행되었다. 계열 희석 후, BSC-40 세포는 크리스탈 바이올렛 염색을 사용하여 바이러스 역가를 결정하기 위해 2일 동안 감염되었다.

도 5는 다른 군으로부터 난소에서 바이러스 역가를 보여준다. 스튜던트(student) T 테스트가 유의성 차이가 p<0.05로 여겨지는 각 군과 대조군 사이의 결과를 비교하는 통계적 분석에 채용되었다. 도 5에서, Co.120 단백질과 HBsAg의 혼합물로 면역된 동물이 나머지 군과 비교하여 유의적으로 낮은 바이러스 역가를 갖는다(p<0.05)는 것을 보여주는 것으로, 이는 간염 C 바이러스의 캡시드에 대해 생체 내에서 강력하고 효과적인 세포 반응의 유발을 입증한다. 이 군 만이 음성 대조군(수산화 명반으로 면역된 마우스)에 대해 바이러스 역가를 유의적으로 감소할 수 있는 군이다. 따라서, 바이러스 역가 감소의 관점에서 HBsAg의 활성을 고양하는 것이 기능성 항 바이러스 능의 직접적 생체 내 분석의 이 시스템에서 입증되었다.

실시예 6: 몇몇 병리와 연계된 다른 항원에 대한 이 적용에 기술된 HBsAg 의 증진효과의 연구.

만성 질환에 관련된 바이러스의 분야에서 특이적 세포 면역 반응의 면역증진자로서 뿐 아니라 동시에 항원으로서 비경구적 면역화에서의 HBsAg의 사용을 평가하기 위해, HBsAg 및 동일한 비율로 다른 공동 투여된 항원을 포함하는 제형을 사용한 다른 실험이 수행되었다. 함께 투여된 항원은 다음과 같은 인간 병리로부터 항원을 구성한다: HIV (HIV-1 바이러스, 펩티드 및 멀티에피토프 펩티드로부터 항원을 함유하는 희석된 바이러스); HPV (HPV 16, 18 및 33으로부터 바이러스-형 입자로 작업함); HCV (비구조적 서열로부터 분획뿐 아니라 뉴클레오캡시드, 펩티드 및 이들의 표면 항원으로부터 단백질로부터 서열을 포함하는 항원); 유사하게는 암(폐, 간, 유방 및 전립선으로부터 종양 특이적 항원 및 연계된 항원)과 같은 만성 질환을 발생하는 다른 병리로부터의 항원. 모든 경우에 있어서, 항원 단독 투여에 비해 γIFN 분비 활성에서의 증가가 인지되었으며, 이는 치료적 제형으로 투여되어 지는 본 출원에서 기술된 HBsAg의 가능성을 입증한다.

실시예 7. 다른 숙주에서 얻어진 항원에 비교하여 기술된 생산 방법을 사용하여 피키아 파스토리스로부터 얻어진 HBsAg 의 다른 배ㅊ를 사용하여 CD14 리셉터를 결합하는 HBsAg 능력의 연구.

본 발명에 기술된 정제 방법을 사용한 재조합 단백질로서 얻어진 HBsAg의 분석은 이것이 매크로파아지에서 발견되고 면역학적 내성의 진행 전개에 관련된 CD14 리셉터에 HBsAg의 결합능의 케이스이기 때문에 세포 구획에서 보다 높은 면역형성에 영향을 미친다는 차이점이 있음을 입증했다. 혈구단위 면역의 분석 후, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에서 생산된 항원에 비하여 본 출원서에 기술된 조건에서 생산된 효모 피키아 파스토리스에서 생산된 항원에 대해 CD14 리셉터에 결합하는 능력에 현저한 감소가 있음이 증명되었다(도 6). 이 사실은 본 발명에서 분석된 항원의 다른 행동에 대한 발견을 지지한다.

Claims (27)

1. 다음의 단계 중 적어도 하나를 포함하는 정제 방법에 의하여 효모로부터 생산된 간염 B 표면 항원의 함입에 의해 특징되어지는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물:

   카오트로프 제(caotropic agent)를 포함하는 용균 버퍼 내에서 세포의 용균 단계;

   산성 pH 조건에서 오염물질의 침전 단계;

   간염 B 표면 항원에 대해 특정 모노크로날 항체를 사용하는 항원의 면역친화성 크로마토그래피 단계;

   30℃ 내지 40℃의 범위 내의 온도로 용리된 항원의 열처리 단계.
2. 제 1항에 있어서, 상기 항원 생산에 사용된 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)임을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항 중 어느 한 항에 있어서, 만성적으로 진행하는 바이러스의 치료에 사용함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스에 의한 만성적 감염의 치료에 사용함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
5. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 간염 C 바이러스에 의한 만성적 공-감염의 치료에 사용함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 인간 면역결핍 바이러스에 의한 만성적 감염의 치료에 사용함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
7. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 만성적 감염 질환의 군으로 구성된 다른 감염에 의한 만성적 감염의 치료에 사용함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
8. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 만성적 질환의 치료에 사용되는 이가의 백신 및 동시에 간염 B 바이러스에 대한 예방 백신으로서 사용함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 표면 항원은 단독으로 또는 편리하게 보조제와 함께 투여함을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 표면 항원은 이들의 치료적 활성에 대해 현저할 만큼 중요한 HBsAg로부터 보조약 효과를 수용하는 몇몇 상동성 및 비상동성 항원과 조합되어 투여됨을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 비상동성 항원은 만성적 질환을 발병시키는 바이러스로부터의 백신 항원일 수 있음을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 비경구용, 점막용 또는 이들 양 경로의 조합으로 사용됨을 특징으로 하는 치료적 사용을 위한 약학적 조성물.
13. 다음 단계 중 적어도 하나를 포함하는 정제 방법을 통해 효모로부터 생산된, 치료적 사용을 위한 약학적 조성물에서의 간염 B 표면 항원의 용도:

    카오트로프 제(caotropic agent)를 포함하는 용균 버퍼 내에서 세포의 용균 단계;

    산성 pH 조건에서 오염물질의 침전 단계;

    간염 B 표면 항원에 대해 특정 모노크로날 항체를 사용하는 항원의 면역친화 성 크로마토그래피 단계;

    30℃ 내지 40℃의 범위 내의 온도로 용리된 항원의 열처리 단계.
14. 제 13항에 있어서, 상기 항원 생산에 사용된 효모는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서, 만성적 진행 바이러스에 의해 유발된 감염의 치료를 위한 백신을 수득하기 위한 것임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
16. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스에 의해 유발된 만성적 감염의 치료를 위한 백신을 수득하기 위한 것임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
17. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 간염 C 바이러스에 의해 유발된 만성적 공-감염의 치료를 위한 백신을 수득하기 위한 것임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
18. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 인간 면역결핍-1 바이러스에 의해 유발된 만성적 공-감염의 치료를 위한 백신을 수득하기 위한 것임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
19. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 만성적 진화의 질환의 군으로 구성된 다른 감염에 의해 유발된 만성적 공-감염의 치료를 위한 백신을 수득하기 위한 것임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
20. 제 13항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 만성적 진화의 바이러스에 의한 유발된 만성적 감염의 치료를 위한 이가의 백신 및 동시에 간염 B 바이러스에 의한 감염을 예방하는 능력을 갖는 이가 백신을 수득하기 위한 것임을 특징으로 하는 간염 B 표면 항원의 용도.
21. 다음 단계 중 적어도 하나를 포함하는 정제 방법을 사용하여 효모에 의해 생산된 간염 B 표면 항원의 사용에 의해 특징되어지는 만성적으로 진행하는 바이러스에 의해 유발된 감염을 치료하는 방법:

    카오트로프 제(caotropic agent)를 포함하는 용균 버퍼 내에서 세포의 용균 단계;

    산성 pH 조건에서 오염물질의 침전 단계;

    간염 B 표면 항원에 대해 특정 모노크로날 항체를 사용하는 항원의 면역친화성 크로마토그래피 단계;

    30℃ 내지 40℃의 범위 내의 온도로 용리된 항원의 열처리 단계.
22. 제 21항에 있어서, HBsAg를 생산하기 위한 효모 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)을 사용함을 특징으로 하는 방법.
23. 제 21항 또는 제22항에 있어서, 간염 B 바이러스에 의해 유발된 만성적 감염을 치료함을 특징으로 하는 방법.
24. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 간염 C 바이러스에 의해 유발된 만성적 공-감염을 치료함을 특징으로 하는 방법.
25. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 인간 면역결핍-1 바이러스에 의해 유발된 만성적 공-감염을 치료함을 특징으로 하는 방법.
26. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 간염 B 바이러스 및 만성적 진화의 질환의 군으로 구성된 다른 감염에 의해 유발된 만성적 공-감염을 치료함을 특징으로 하는 방법.
27. 제 21항 또는 제 22항에 있어서, 만성적 진화의 바이러스의 만성적 감염을 치료하기 위한 이가 백신 및 동시에 간염 B 바이러스 감염을 예방하는 능력을 갖는 이가 백신을 얻음을 특징으로 하는 방법.

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