WO2005028667A1 - ヒト肥満細胞で発現するｇ蛋白質共役型受容体を標的とした薬剤およびそのスクリーニング方法 - Google Patents

ヒト肥満細胞で発現するｇ蛋白質共役型受容体を標的とした薬剤およびそのスクリーニング方法 Download PDF

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Hirohisa Saito
Yoshimichi Okayama
Junichi Kashiwakura
Kazumi Miura
Masaya Obayashi
Hironori Kawai
Tetsuo Yoshida
Katsutoshi Sasaki
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Riken
Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Definitions

  • human mast cells expressed in human mast cells are selected from the group consisting of PAFRs A2b, CD97, EDG2, 0PN3, CRTH2 N EDG1, H4, GPR32 and CELSR1; 2.
  • a G protein-coupled receptor expressed on human mast cells for the manufacture of a pharmaceutical composition for treating atopic dermatitis, asthma, chronic obstructive pulmonary disease or allergic disease, CysLTRls GPR91, GPR34, EMR2, PAFR ⁇ GPR105, TM7SF1, GPR37, CD97, MC1, FIRE ⁇ fMLPl, 5, EP3 variant h, P2Y8, D2, EDG2, A3, C5R1, 0PN3, GP27 CRTH2, 'EDG1, FPRL2 , CC L2 N mglu6, CB2, GPR39, P2Y5, Al, P2Y4, EP3 variant j ⁇ A2a, AT1B ⁇ ETB ⁇ GN thigh, CELSR2, CCR7, H4, GPR12, Hl, GPR32, TEM5, GPR58 S CELSR1 ⁇ GPR85 N Motilin R ⁇ HE 6, CELSR3, CALGRLs RRH,
  • FPRL2 Chemokine (C-C motif) receptor-like 2 (CCRL2), Methotropic bomiotropic receptor 6 (mglu6), Cannabinoid receptor 2 (CB2), G protein-coupled receptor 39 ( GPR39), purine receptor P2Y5 (P2Y5), adenosine A1 receptor (A1), pyrimidine receptor P2Y4 (P2Y4), prostaglandin G receptor E receptor 3 oryzae native variant j (EP3 variant j) N adenosine A2a receptor (A2a;), type 1 angiotensin receptor (AT1B), type B endoselin receptor (ETB), gonadotropin releasing hormone receptor (GNRHR), cadherin EGF LAG 7-pass G-type receptor 2 (CELSR2), Chemokine (C-C motif) receptor 7 (CCR7), histamine receptor H4 (H4), G protein-coupled receptor 12 (GPR12), histamine receptor HI (HI), G
  • the screening method described below is based on the GPCiU, which acts on human mast cells by (i) induction of apoptosis, (ii) suppression of activation, (iii) suppression of degranulation, and (iv) inflammatory mediation.
  • the present invention provides a method for screening a substance that suppresses the activation of human mast cells, which has at least one action of suppressing production overnight, (V) suppressing production of cytokin, and (vi) suppressing production of chemokine.
  • the supernatant of the reaction solution is collected by centrifugation, and the radioactivity of the inorganic phosphoric acid (Pi) released into the supernatant is measured with a radiation measuring device such as a liquid scintillation counter. Measure and use as GTPase activity.
  • the reaction solution is filtered through a glass fiber filter paper and the like, washed with an appropriate amount of the same buffer, and the filtrate is collected. May be measured by the radiation measurement device described above.
  • GTPase activity in the presence of the test substance in (i) can be compared with the GTPase activity of it can.
  • a substance that increases GTPase activity can be selected as an agonist for the selected GPCR.
  • a similar assay using another GPCR-expressing cell or a cell membrane fraction of the cell instead of the selected GPCR-expressing cell or the cell membrane fraction of the cell is carried out.
  • human mast cells include mast cells derived from human peripheral blood, mast cells derived from human umbilical cord blood, mast cells prepared from human lung, skin, and tonsils, and human mast cell lines such as LAD2.
  • the dose of the compound or a salt thereof varies depending on the administration subject, target organ, symptom, administration method and the like. However, in the case of oral administration, in general, for an adult (as 60 kg), the dose is about 0 per day. 1 to 100 mg, preferably about 1.0 to 50 mg, more preferably about 1.0 to 20 mg. In the case of parenteral administration, the single dose varies depending on the administration target, target organ, symptoms, administration method, etc. It is convenient to administer about 0.01 to 30 mg, preferably about 0.1 to 20 mg, more preferably about 0.1 to 10 mg per day by intravenous injection. In the case of other animals, the dose can be administered in terms of 6 O.kg. (4) Preparation and use of antibodies specifically recognizing GPCR expressed in human mast cells
  • the antibody has an apoptosis-inducing effect on mast cells, an inhibitory effect on human mast cell activation, an inhibitory effect on human mast cell degranulation, an inhibitory effect on human mast cell inflammatory mediator production, and an inhibitory effect on human mast cells.
  • Cytokine It can also be used as a drug having a production inhibitory action or a chemokine production inhibitory action on human mast cells. It has the effect of specifically recognizing GPCRs expressed in human mast cells and whose expression levels fluctuate due to glucocorticoid stimulation, and controlling the action of glucocorticoids, obtained in (4-1)
  • the antibody can be used as a drug for controlling the action of dalcocorticoid.
  • the “F” column is a flag of the AD value, P is “Present”, M is “Merginal”, and A is “Absent”.
  • the “Ratio” column shows the ratio of the expression level to the control cells. Genes that were first revealed by the present invention to be expressed in human mast cells are indicated by * in the column of “expression”. In addition, the ratio of the expression amount of the IgE-treated cells to the control cells is 1.8 or more and 0.5 or less, and the control cells and the IgE-treated cells If the expression is judged to be "expressed” in at least one of the above, it is judged to be a gene whose expression fluctuates due to IgE treatment. Is indicated by "”. O
  • Activation of human mast cells instead of degranulation, TNF-chilled GM- side Cain production such as CSF, IL-8, 1-309, chemokine production, such as MIP- 1, LTC 4, LTD 4 , LTE 4. It can also be examined by measuring the production of inflammatory media such as PGD2 overnight (Blood 100> 3861 (2002)).
  • LAD2 mast cells derived from small umbilical cord blood, mast cells derived from human peripheral blood, and mast cells prepared from human lung, skin, and tonsils can also be used.

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Abstract

ヒト肥満細胞からRNAを抽出し、該RNAを用いてDNAチップ解析またはRT-PCR解析を行うことにより、ヒト肥満細胞で発現するGPCRを多数同定した。これらのGPCRのアゴニスト、アンタゴニストおよび機能修飾物質、該GPCRを特異的に認識する抗体、該GPCRの発現を抑制するアンチセンスDNAやsiRNAは、ヒト肥満細胞の活性化抑制剤およびアレルギー性疾患の治療薬となる。これらのGPCRを発現する細胞または細胞の膜画分を用いて、ヒト肥満細胞の活性化抑制剤やアレルギー性疾患の治療薬をスクリーニングすることができる。

Description

明 細 書
ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体を標的とした薬剤およびそのスクリ一ニン グ方法 技術分野
ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体（以下 GPCRと略す）を標的とした薬剤お よびそのスクリーニング方法に関する。 背景技術
肥満細胞は各猶 U激により活性化され、 脱顆粒を起こし、 数多くの炎症性メディエー夕 一を遊離、産生することが知られている〔黒沢元博編， 「肥満細胞の臨床」，先端医学社， P142および p559 (2001 ) ; Crit , Rev. Immunol . , 22 , 115-140 (2002 )〕。主な feのはアミ ン類、 ァラキドン酸代謝産物、 プロテア一ゼ、 サイト力イン、 ケモカインなど多種多様で ある。例えば、 肥満細胞に抗原が認識されると、 脱顆粒によりヒスタミンやトリプ夕一ゼ が速やかに放出されると共に、 プロスタグランジン D2 (PGD2)、 ロイコトリェン (LT) 、 血小板活性化因子（PAF)などのケミカルメディェ一夕一、およびマクロファ一ジ炎症性蛋 白質（MIP) -1ひ等の各種のケモカインゃ顆粒球マクロファ一ジコロニー刺激因チ (GM-CSF) 等の各種サイト力インが新たに合成され、 放出されることが知られている。 また、 これま で好酸球が作ると考えられていた細胞障害性蛋白質である主要塩基性蛋白質（major basic protein)に関しても、ヒトの場合は肥満細胞が多量につくることが最近明らかになつてい る [： Blood, 1127-1134 (2001 )〕 。 このように、 肥満細胞は種々のアレルギー疾患の病 態形成において主要な役割を演じていると考えられることから、 肥満細胞の活性ィ匕を制御 することにより、 アレルギー疾患の治療が可能であると考えられる。
肥満細胞からの炎症性メディェ一ター遊離を抑制する作用を有する種々の既存のアレル ギー治療薬が知られているが、 ^はげつ歯類の肥満細胞を用いた研究が主体であり、 ヒ ト肥満細胞に対して実際に効果があるかについては充分検討されていなかった。 しかし、 最近、 ヒト肥満細胞の調製法が確立され、 既存薬のヒト肥満細胞に対する作用を解析する ことが可能になり、 げっ歯類肥満細胞に対する作用と比較することが可能になった。 その 結果、 げっ歯類肥満細胞とヒト肥満細胞では、 薬剤への反応性が異なることが明らかにな つている 〔黒沢元博編， 「肥満細胞の臨床」 ， 先端医学社， P559 (2001 )〕。例えば、 炎症 性メディエー夕一遊離抑制薬として使用されているクロモグリク酸ナトリウムは、 ラット 腹腔肥満細胞においては IgE依存性の炎症性メディェ一夕一遊離を顕著に抑制するが、 ヒ ト肥満細胞に対する作用は強いものではなかった Clin. Exp. Allergy, 28 , 1 228-1236 ( 1998 )〕 o塩酸ァゼラスチンは、 高濃度においてはヒト培養肥満細胞からのヒスタミン、 PGD2、 LTの遊離、 GM-CSFおよび MIP-1ひの産生を抑制するが、 いずれの活性も強いもので はなかった。 また、 抗サイト力イン薬として使用されているトシル酸スブラタストは、 ラ ヅト肥満細胞に対して炎症性メデイエ一夕一遊離抑制作用を示したが、 ヒト肥満細胞に対 する作用はなかった CClin. Exp . Allergy, 28 , 1228-1236 (1998 )〕 。
一方、肥満細胞に発現している GPCRに作用する薬剤が、ヒト培養肥満細胞からの炎症性 メデイエ一夕一の産生を顕著に抑制することが知られている。例えば、 /^アドレナリン受 容体刺激薬ィソプロテレノールは 10 nmol/1の低濃度で、 ヒト培養肥満細胞からのヒス夕 ミン、 LT、 PGD2、 GM- CSFおよび MIP-1ひの遊離を 8 0 %以上抑制する。 〔J . Al lergy Cl in. Immunol . , 103 , 421-426 (1999 )〕 。 したがって、 ヒト肥満細胞上に発現している GPCRの ァゴニスト、 アン夕ゴニストあるいは機能修飾物質は、 ヒト肥満細胞からの炎症性メディ エー夕一の産生を抑制し、 肥満細胞が関与する疾患の治療に有効と考えられる。 また、 ヒ ス夕ミンの投与により、 ヒト肥満細胞のアポトーシスが促進されること 〔Exp . Dermatol . , 12 , 53-60 (2003 )〕 およびひ一メラノサイト刺激ホルモンにより、 肥満細胞のアポトーシ スが誘導されること 〔FEBS Lett . , 87 , - 87-93 (2003 )〕 などから、 肥満細胞に発現してい る GPCRに作用する薬剤は、 ヒト肥満細胞のアポトーシスを誘導すると考えられる。
しかし、 ヒト肥満細胞で発現する GPCI こ関する情報は、 限られていた。具体的には、 ヒ ト肥満細胞で発現する GPCRとしては、 補体第 3成分受容体 1、 ?2アドレナリン受容体、 アデノシン A2b受容体、 プロスタグランジン E受容体 2、 プロスタグランジン E受容体 3 サブタイプ la、 プロスタグランジン E受容体 3オルタナティプバリアント f (別名プロス タグランジン E受容体 3サブタイプ lb) 、 ェプス夕イン一バーウィルス誘導遺伝子 1 (Epstein-Barr virus induced gene 1) 、 ェプス夕インーバ一ウィルス誘導遺伝子 2
(Epstein-Barr virus induced gene 2) 、 G蛋白質共役型受容体 RE2、 G蛋白質共役型受 容体 35、 C- X-Cモチーフケモカイン受容体 3、スロンビン受容体等が知られている〔Blood， 98 , 1127-1134 (2001 ) ; Blood, 100 , 3861-3868 (2002 ) ; BMC Immunol . , 3 , 5 (2002 )〕 。 ヒト臍帯血由来培養肥満細胞とマウス骨髄由来培養肥満細胞で発現する遺伝子について比 較された結果、 ヒトとマウスでは発現する遺伝子が必ずしも一致しないことが明らかにな つた 〔Blood， , 3861-3868 (2002 )〕。 上述したように、 薬剤の反応性にも種差がある。 したがって、 GPCR遺伝子に関しても、 動物の肥満細胞で発現している GPCRがヒトの肥満 細胞で発現している保証はなく、 ヒトの肥満細胞での発現を調べる必要があった。 発明の閧示
本発明は、 ヒト肥満細胞で発現している GPCRを明らかにし、 これらの GPCRを標的とし た、. ヒト肥満細胞の活性化抑制剤およびアレルギー性疾患の治療薬、 ならびにこれらのス クリーニング法を提供することを目的としている。
本発明者らは、 ヒト臍帯血由来培養肥満細胞およびヒト末梢血由来培養肥満細胞等の各 種ヒト肥満細胞を各種条件で培養後、 R NAを抽出し、 該 R NAを用いて DNAチップ解析 または RT- PCR解析を行うことにより、これまでヒト肥満細胞で発現することが知られてい なかった GPCRを同定することに成功し、 該 GPCRを標的とした薬剤や抗体およびそのスク リ一二ング法を提供することにより、 本発明を完成するに至つた。
本発明は、 以下の （1 ) 〜 （3 4 ) に関する。
( 1 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 システィニルロイコトリエ ン受容体 1 (CysLTRl) 、 G蛋白質共役型受容体 91 (GPR91) 、 G蛋白質共役型受容体 34 (GPR34) 、 EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様配列 2 (E R2)、 血小板活性 化因子受容体 (PAFR) 、 G蛋白質共役型受容体 105 (GPR105) 、 7回膜貫通スーパーファ ミリー'メンバ一 1 (TM7SF1) 、 G蛋白質共役型受容体 37 (GPR37) 、 CD97抗原 (CD97) 、 メラノコルチン 1受容体 (MCI) 、 G蛋白質共役型受容体 FIRE (FIRE) 、 フオルミルぺプ チド受容体 1 (fMLPl) 、 G蛋白質共役型受容体 65 (GPR65)、 プロス夕グランジン E受容 体 3オルタネイティブバリアント h(EP3 variant h)ヽ プリン受容体 P2Y8 (P2Y8)、 ド一パ ミン受容体 D2 (D2) 、 内皮分化リゾホスファチジン酸 G蛋白質共役型受容体 2 (EDG2) 、 アデノシン A3受容体 (A3)、 補体第 5成分受容体 1 (C5R1)、 ォプシン 3 (0PN3) 、 G蛋 白質共役型受容体 27 (GPR27) 、 G蛋白質共役型受容体 44 (CRTH2)、 内皮分化スフインゴ 脂質 G蛋白質共役型受容体 1 (EDG1)、 フオルミルペプチド受容体様 2 (FPRL2)、 ケモカ ィン（C- Cモチーフ）受容体様 2 (CCRL2),メタボトロピヅクグル夕ミン酸受容体 6 (mglu6) カンナビノィド受容体 2 (CB2) 、 G蛋白質共役型受容体 39 (GPR39)、 プ'リン受容体 P2Y5 (P2Y5)、 アデノシン A1受容体 (A1) 、 ピリミジン受容体 P2Y4 (P2Y4)、 プロス夕グラ ンジン E受容体 3オルタネイティブバリアント j (EP3 variant «i )、 アデノシン A2a受容体 (A2a) 、 1型アンジォテンシン受容体 (AT1B) 、 B型エンドセリン受容体 (ETB) 、 ゴナ ドトロピン放出ホルモン受容体 (GNRHR) 、 カドヘリン EGF LAG 7回貫通 G型受容体 2 (CELSR2)、 ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体 7 (CC 7)、 ヒスタミン受容体 H4 (H4) 、 G蛋白質共役型受容体 12 (GPR12) 、 ヒスタミン受容体 HI (HI) 、 G蛋白質共役型受容体 32 (GPR32)、 腫瘍内皮細胞マ一カー 5 (TEM5) 、 G蛋白質共役型受容体 58 (GPR58) 、 力 ドヘリン EGF LAG 7回貫通 G型受容体 1 (CELSR1) 、 G蛋白質共役型受容体 85 (GPR85) 、 モチリン受容体 .(Motilin R) 、 G蛋白質共役型受容体 64 (HE6) 、 力ドヘリン EGF LAG 7 回貫通 G型受容体 3 (CELSR3)、 カルシトニン受容体様 (CALCRL)、 網膜色素上皮由来口 ドプシンホモログ（Rffl) 、 G蛋白質共役型受容体 18 (GP 18) 、 G蛋白質共役型受容体 35 . (GPR35) 、 プリン受容体 P2Y10 (P2Y10) 、 FLJ40279 (C-TESTI2027296) 、 G蛋白質共役 型受容体 141 (GPR141) 、 精巣下降関連 G蛋白質共役型受容体 (hRUP16) 、 内翻巴厚関連 受容体（ITR)、 G蛋白質共役型受容体 MRGX2 (MRGX2)、 トレースアミン受容体 1 (SNORP33) 7回膜貫通受容体 CBRC7TM— 375 (C-THYMU2011548)、 アドレノメデユリン受容体 (GlOd) 、 G蛋白質共役型受容体 107 (GPR107) 、 G蛋白質共役型受容体 126 (GPR126) 、 G 蛋白質共役型受容体 41 (GPR41) 、 G蛋白質共役型受容体 43 (GPR43) 、 G蛋白質 役型受 容体 68 (GPR68) 、 ガストリン放出ペプチド受容体 (GRPR) 、 G蛋白質共役型受容体 1019 (HE0AD54) 、 推定 G蛋白質共役型受容体 hGPCRlO (hRUP9) 、 膜型プロゲスチン受容体 α: (mPRa)、膜型プロゲスチン受容体ァ （mPRg)、推定 G蛋白質共役型受容体 GPCR1 (SRL)、 血小板活性化受容体ホモログ H963 (H963) 、 プロスタグランジン E受容体 4 (EP4)、 ケモ 力イン （C- Cモチーフ） 受容体 1 (CCR1)、 ド一パミン受容体 D5 (D5)、 ロイコトリェン B4 受容体（LTB4R)およぴケモカイン （C- X- Cモチーフ）受容体 5 (CXCR5)からなる群から選 ばれる受容体を発現する細胞または該細胞の膜画分と試験物質とを接触させる工程を含む、 該受容体に作用し、かつヒト肥満細胞に対し（a)アポト一シス誘導、 ( b)活性化抑制、 ( c )脱顆粒抑制、 ( d )炎症性メディエー夕一産生抑制、 ( e ) サイトカイン産生抑制 および （f ) ケモカイン産生抑制のうちの少なくとも 1つの作用を示す物質のスクリー二 ング方法。
( 2 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 GPR34、 PAFR、 GPR105、 TM7SF1、 GPR65、 P2Y8、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ EDG1ヽ GPR39S EP3 variant A2a, ETBヽ H4、 CELSR2、 TEM5、 C-TESTI2027296N GPR141、 ITR、 MRGX2、 G10d、 GPR43、 GRPR、 HEOAD54, H963、 EP4および LTB4Rからなる群から選ばれる、 ヒト肥満細胞を IgE受容体を介した活性化刺激すること により発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリーニング方法。
( 3 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 PAFRヽ CD97、 MCIヽ C5R1、 A2a、 AT1B、 CELS 2, GCR7および EP4からなる群から選ばれる、 ヒト肥満細胞をリポポリサヅカ ラィド刺激することにより発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリーニング 方法。
( 4 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質離型受容体が、 PAFRs A2b、 CD97、 EDG2、 0PN3、 CRTH2N EDG1、 H4、 GPR32および CELSR1からなる群から選ばれる、 ヒト肥満細胞をイン夕 一フエロンァ刺激することにより発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリー ニング方法。 -
( 5 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 PAFR、 GPR105、 CD97、 MC1、 A3、 0PN3、 EDG1、 CCRL2, P2Y5、 A2a、 CCR7、 CELSR2、 CELSR1および EP4からなる群から選ばれ るヒト肥満細胞をィン夕ーフヱロンァおよびリポポリサヅカライドで共剌激することによ り発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリ一ニング方法。
( 6 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 GPR34、 GPR105、 TM7SF, fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2N P2Y5、 A2a、 H4、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれるヒ ト肥満細胞をグルココルチ イド処理することによりで発現が変動する受容体である請求 項 1に記載のスクリ一ニング方法。 .
( 7 ) ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコイドの刺激により発現量が変動する G 蛋白質共役型受容体である、補体第 3成分受容体 1 (C3aRl)、 GPR34, 2アドレナリン受 容体 ( ? 2)、 GP画、 WSF, fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2, CCRL2, P2Y5、 A2a、 ェプス夕ィ ン―バ一ウィルス誘導遺伝子 2 (EBI2) 、 スロンビン受容体 (PARI) 、 H4、 G蛋白質共役 型受容体 RE2 ( E2)、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受容体を発現する細胞ま たは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させる工程を含む、 該受容体に作用し、 グルココ ルチコィド作用を制御できる物質のスクリーニング方法。
( 8 )ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、GPR91、GPR34、EMR2、 PAFRs GPR105、 TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MCIヽ FIREヽ fMLPlヽ GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant jヽ A2a、 AT1B、 ETB、 GNRHRヽ CELSR2, CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32、 TEM5, GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motilin R、 HE6、 CELSR3、 CALCRL、 RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR141, hRUP16s ITR、 MRGX2, SNORF33、 C-TH丽 2011548、 G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41、 GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HEO編、 hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLヽ H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニ ストまたは機能修飾物質を用いて、ヒト肥満細胞に対し、 （a)アポトーシスの誘導、 ( b ) 活性化の抑制、 （c )脱顆粒の抑制、 （d ) 炎症性メデイエ一夕一の産生抑制、 （e ) サ ィトカインの産生抑制おょぴ ( f ) ケモカインの産生抑制のうちの少なくとも 1つを行う 方 。
( 9 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である A2aまたは HEOAD54に対する ァゴニストを用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a ) アポト一シスの誘導、 （b )活性化の 抑制、 （c ) 脱顆粒の抑制、 （d ) 炎症性メディエー夕一の産生抑制、 （e ) サイトカイ ンの産生抑制および （f ) ケモカインの産生抑制のうちの少なくとも 1つを行う方法。
( 1 0 )ヒト肥満細胞で発現する0蛋白質共役型受容体でぁる、0?&91、0卩1134、？人?1^卩^05、 D2、 D5、 EDG2、 EP3 variant h、 EP3 variant j、 EP4、 ETBヽ HIヽ H4および GPR43からなる 群から選ばれる受容体に対するアンタゴニストを用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a ) ァ ポト一シスの誘導、 （b ) 活性ィ匕の抑制、 （c ) 脱顆粒の抑制、 （d ) 炎症性メデイエ一 夕一の産生抑制、 （ e ) サイト力インの産生抑制、 （ f ) ケモカインの産生抑制のうちの 少なくとも 1つを行う方法。
( 1 1 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91, GPR34, EMR2、 PAFR、 GPR105、' TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MC1、 FIRE、 fMLPl、 GPR65, EP3 variant h、
P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant j A2a AT1B、 ETB、 GNRHR CELSR2S CCR7、 H4、 GPR12、 Hl、 GPR32、 TM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motil in R, HE6、 CELS 3 CALCRL RRH GPR18、 GPR35, P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR141、 hRUP16、 ITR MRGX2、 SNORF33, C-THYMU2011548, GlOd GPR107、 GPR126 GPR41, GPR43、 GPR68、 GRPR HEOAD54, hRUP9、 mPRa mPRg、 SRL H963、 EP4、 C 1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾 患またはァレルギ一性疾患を治療する方法。
( 1 2 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である A2aまたは HEOAD54に対す るァゴニストを用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性 疾患を治療する方法。
( 1 3 )ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 GPR91、 GPR34、 PAFR、 GPR105、 EP3 variant h、 D2、 EDG2、 EP3 variant _j、 ETBヽ HIおよび GPR43からなる群から選ばれ る受容体に対するアン夕ゴニストを用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患 またはァレルギ一性疾患を治療する方法。
( 1 4 ) ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコイドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34、 β、 GPR105、 TM7SF、 fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 EBI2、 PARIヽ H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を用いて、 細胞に対するク' ルココルチコイド作用を制御する方法。
( 1 5 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFR GPR105、 TM7SF1、 GPR37S CD97、 MCI FIRE fMLPl、 GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1S 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant js A2a AT1B、 ETB, GNRHR、 CELSR2, CCR7、 H4、 GPR1 , HI GPR32S TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motil in R、 HE 6, CELSR3, CALCRL, RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296N GPR141、 hRUP16、 ITR, MRGX2、 SNORF33、 C-THYMU2011548, G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41、 GPR43N GPR68、 GRPR、 HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLおよび H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対するァゴニ スト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を有効成分として含有する、 （a ) 〜 （： i ) の いずれかの医薬。 ( a ) ヒト肥満細胞のアポト一シス誘導剤 .
(b) ヒト肥満細胞の活性ィ匕抑制剤
(c) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d) ヒト肥満細胞の炎症性メディェ一夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
(： e ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
(g) アトピー性皮膚炎の治療薬
(h) 喘息の治療薬
( i ) 慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) ァレルギ一性疾患の治療薬
(16) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である A2aまたは HEOAD54に対す るァゴニストを有効成分として含有する、 （a) 〜 （j) のいずれかの医薬。
(a) ヒト肥満細胞のアポトーシス誘導剤
(b) ヒト肥満細胞の活性化抑制剤
(c) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
(d) ヒト肥満細胞の炎症性メデイエ一夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカィン産生抑制剤
(g) アトピ一性皮膚炎の治療薬
(h) 喘息の治療薬
( i ) 慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) アレルギー性疾患の治療薬
( 17)ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である GPR91、GPR34、PAFR、GPR105、 D2、 D5、 EDG2、 EP3 variant h、 EP3 variant jヽ EP4、 ETB、 HIヽ H4および GPR43からなる, 群から選ばれる受容体に対するアン夕ゴニストを有効成分として含有する、 （a)〜（ j ) のいずれかの医薬。
(a) ヒト肥満細胞のアポトーシス誘導剤
( b ) ヒト肥満細胞の活性ィ匕抑制剤
(c) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
(d) ヒト肥満細胞の炎症性メデイエ一夕一産生抑制剤
(e) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
(f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
(g) アトピー性皮膚炎の治療薬
(h) 喘息の治療薬
( i ) 慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j) アレルギー性疾患の治療薬
(18) ヒト肥満細胞で発現し、 かつダルココルチコイドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 β GPR34、 GPR105S fMLPl, P2Y8、 A3、 CRTH2, CCRL2S P2Y5、 A2a、 EBI2、 CELSR2, PAR1、 H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体に対するァゴニスト、アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を有効成分として含有する、 ダルココルチコィド作用の制御剤。
( 1 9 ) アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患の治療用の 医薬組成物の製造のための、 ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRU GPR9 GPR3 , EMR2、 PAFRS GPR105, TM7SF1, GPR37、 CD97、 MCIヽ FIREヽ fMLPl, GP 65, EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6s CB2、 GPR39、 P2Y5、 Alヽ P2Y4、 EP3 variant js A2a、 AT1B、 ETBヽ GNRHRヽ CELSR2 CCR7、 H4、 GPR12、 Hl、 GPR32 麵ヽ GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Moti lin R、 腿、 CELSR3 CALCRL、 RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR141, hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33, C-THYMU2011548. G10d、 GPR107、 GPR126, GPR41, GPR43、 GPR68、 CM¾、 HEOAD54, 匿 9、 mPRa、 mPRg、 SRLヽ H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ば れる受容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質の使用。
( 2 0 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFRS GPR105, TM7SF1S GPR37、 CD97、 MC1、 FIRE, fMLPl、 GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8S D2、 EDG2N A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant A2aヽ AT1B、 ETBヽ GNRHRヽ CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32、 TEM5、 GPR58、 CELSRK GP 85S Motil in R HE6、 CELS 3, CALCRL, RRH、 GPR18、 GP 35S P2Y10, C-TESTI2027296, GPR141、 hRUP16、 ITRS MRGX2、 SNORF33, C-THYMU2011548. G10d、 GPR107、 GPR126, GPR41ヽ GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HE0AD54, hRUP9 mPRa、 mPRgヽ SRLH963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対して特異的に反応 し、 かつヒト肥満細胞に対し、 以下の （a )〜（f ) のうちの少なくとも 1つの作用を有 する ί几体。
( a ) アポト一シスの誘導
( b ) 活性化の抑制
( c )脱顆粒の抑制
( d ) 炎症性メディエー夕一の産生抑制
( e ) サイトカインの産生抑制
( f ) ケモカインの産生抑制
( 2 1 ) ヒト肥満細胞で発現し、 かつダルココルチコイドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34、 β ヽ GPR105、 TM7SFS fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2, P2Y5、 A2a、 EBI2、 PARI, H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体に対して特異的に反応し、 かつダルココルチコィドの作用を制御する効果を有する抗 体。
( 2 2 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105、 TM7SF1ヽ GPR37、 CD97、 MCIヽ FIREヽ fMLPl、 GPR65S EP3 variant h、 P2Y8、 D2S EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 C顯、 EDG1ヽ FPRL2、 CCRL2S raglu6s CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant j, A2aヽ AT1B、 ETBヽ GNRHR, CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32、 TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motil in R、 HE 6, CELSR3、 CALCRLヽ RRHヽ GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR14U hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33、 C-THYMU2011548, G10ds GPR107, GPR126、 GPR41、 GPR43、 GPR68S GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRL, 画、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対して特異的に反応 する抗体を用いて、 肥満細胞の検出または単離を行う方法。
(23) 請求項 20に記載の抗体を用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a) アポト一シスの 誘導、 ( b ) 活性化の抑制、 ( c )脱顆粒の W制、 （ d ) 炎症性メディエー夕一の産生抑 制、 (Θ) サイトカインの産生抑制および（f ) ケモカインの産生抑制のうちの少なくと も 1つを行う方法。
(24) (20) に記載の抗体を用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患ま たはァレルギ一性疾患を治療する方法。
(25) (21) に記載の抗体を用いて、 細胞に対し、 グルココルチコィドの作用を制御 する方法。
(26) (20) に記載の抗体を有効成分として含有する、 （ a) 〜 （： i ) のいずれかの
(a) ヒト肥満細胞のアポトーシス誘導剤
(b) ヒト肥満細胞の活性化抑制剤
(c) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メディエー夕一産生抑制剤
(e) ヒト肥満細胞のサイト力イン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
( g ) アトピー性皮膚炎の治療藥 '
(h) 喘息の治療薬
( i )慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) ァレルギ一性疾患の治療薬
(27) 請求項 21に記載の抗体を有効成分として含有する、 ダルココルチコィドの作用 の制御剤。
(28) アトピー性皮膚炎、，喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患の治療用の 医薬組成物の製造のための、 (20) に記載の抗体の使用。
(29) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34, EMR2、 PAFR GPR105、 TM7SF1 GPR37, CD97、 MC1、 FIRE fMLPl GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2, mglu6 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4, EP3 variant j、 A2a、 AT1B ETB GN腿、 CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HI GPR32S TEM5、 GPR58、 CELSR1S GPR85、 MotilinR、 HE6、 CELSR3, CALCRL、 RRH、 GP 18, GPR35, P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33、 C-THYMU2011548, G10d、 GPR107, GPR126、 GP 41S GPR43、 GPR68S GRPR、 HEOAD54, hRUP9、 mPRa mPRg SRL、 H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ば ήる受容体の発現を抑制する、 該 受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを用いて、 ヒト肥満細 胞に対し、 （a) アポト一シスの誘導、 （b)活性ィ匕の抑制、 （c)脱顆粒の抑制、 （d) 炎症性メディエー夕一の産生抑制、 (e) サイトカインの産生抑制および （f ) ケモカイ ンの産生抑制のうちの少なぐとも 1つを行う方法。
(30) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91N GP 34, EM 2N PAFRヽ GP 105, TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MCIヽ FIRE, fMLPl、 GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1ヽ FPRL2、 CCRL2S mglu6、 CB2、 GP 39, P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant A2aヽ AT1B、 ETBヽ GNRHRヽ CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 Hl、 GPR32N TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Moti l in R、 HE6、 CELSR3、 CALCRL、 RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296s GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33 C-THYMU2011548S GlOdヽ GPR107、 GPR126, GPR41, GPR43、 GP 68, GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRa, fflPRgヽ SRLヽ H963, EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体の発現を抑制する、 該 受容体をコ一ドする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを用いて、 ァトピ一性 皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患を治療する方法。
( 3 1 ) ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコイドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34, β、 GPR105、 T 7SF、 fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 EBI2、 PARIヽ H4、 RE2、 CALCRLLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体の発現を抑制する、 該受容体をコ一ドする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを用いて、 ヒト肥満細胞に対するグルココルチコイドの作用を制御する方法。
( 3 2 ) ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105, TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPls GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1ヽ籠 2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39, . P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant j, A2a、 AT1Bヽ ETBヽ GNRHRヽ CELSR2, CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32、 TEM5、 GPR58、 CELSRU GPR85, Moti l in R、 HE6、 CELSR3、 CALCRL, RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10ヽ C-TESTI2027296, GPR1 1, hRUP16、 I R, MRGX2、 SNO F33, C-THYMU2011548, G10d、 ' GPR107, GPR126, GPR41、 GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HEO扁ヽ膽9ヽ mPRa、 mPRgヽ SRLヽ H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体の発現を抑制する、 該 受容体をコ一ドする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを有効成分として含有 する （a ) 〜 （： i ) のいずれかの医薬。
( a) ヒト肥満細胞のアポトーシス誘導剤
( b ) ヒト肥満細胞の活性化抑制剤
( c ) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メディエー夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
( g ) アトピ一性皮膚炎の治療薬
( h) 喘息の治療薬
( i )慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) アレルギー性疾患の治療薬
( 3 3 ) ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコイドの刺激により発現量が変動する G蛋白質 殳型受容体である、 C3aRl、 GPR34、 (31、 GPR105, WSFS fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2S P2Y5 A2a、 EBI2、 PAR1、 H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体の発現を抑制する、 該受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを有効成分として含有する、 グルココルチコィドの作用の制御剤。
( 3 4 ) アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患の治療用の 医薬組成物の製造のための、 ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRls GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105、 TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPl、 ■ 5、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GP 27 CRTH2、 'EDG1、 FPRL2、 CC L2N mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant jヽ A2a、 AT1Bヽ ETBヽ GN腿、 CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 Hl、 GPR32、 TEM5、 GPR58S CELSR1ヽ GPR85N Motilin Rヽ HE 6, CELSR3、 CALGRLs RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296S GPRU1、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33、 C-THYMU2011548N G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41 GPR43、 GPR68、 GRPR、 HEOAD54、 h聽、 raPRa, mPRg、 SRL、 觀ヽ EP4、 CCR1ヽ D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ば れる受容体の発現を抑制する、 該受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチ センス DNAの使用。
以下に本発明を詳細に説明する。
( 1 ) ヒト肥満細胞で発現する GPCRの同定
ヒト肥満細胞は、 ヒトの肺、皮膚、胎児肝臓などから公知の方法〔J. Immunol. Methods, 169, 153 (1994); J. Immunol., 138> 861 (1987); J. Allergy Clin. Immunol . , 107, 322 (2001); J. Immunol . Methods., 40> 101 (2000)〕 により調製することができる。 また、 公知の方法 〔J. Immunol . , 157> 343, (1996); Blood, 91> 187 (1998); J. Allergy Clin. Immunol . , 皿， 141 (2000)·; Blood, 97, 1016 (2001); Blood, 98, 1127 (2001); Blood, 里， 3861 (2002 ); Blood, 97, 2045 (2001)〕 に従って、 ヒトの臍帯血、 末梢血、 骨髄、 肺あるいは皮膚から調製した単核球を、 幹細胞因子 （以下、 SCFと略す） の存在下で培養 し、 肥満細胞に分化させることにより、 調製することができる。 このようにして単核球を 培養により分化させて調製した肥満細胞を培養肥満細胞ともよぶ。
上記の各種ヒト肥満細胞を培菌臭、 RNAを抽出し、 該 RNAを用いて DNAチップまたは RT-PCRによって、各種 GPCRの mRNAの発現量を解析することにより、 これまでヒト肥満細 胞で発現することが知られていなかった GPCRを同定することができる。
さらに、 調製したヒト肥満細胞を、 肥満細胞の活性ィ匕と関係する各種条件で培養し、 そ の条件で発現量の変動する GPCRを同定することにより、肥満細胞の活性化抑制作用を有す る薬剤をスクリーニングするのにより適した GPCRを選択することができる。
各種条件での培養としては、 例えば、 サイトカイン、 増殖因子、 ケモカインの存在下で の培養、 肥満細胞を活性ィ匕する条件下での培養、 各種薬剤存在下での培養、 微生物やウイ ルス由来成分の存在下での培養等があげられる。 サイトカインとしては、 例えば、 イン夕 —ロイキン 4 (IL-4) 、 イン夕一ロイキン 6 (IL-6) 、 イン夕一フヱロンァ （IFN-ァ） 等 があげられる。 肥満細胞を活性ィ匕する条件としては、 例えば、 IgE受容体を介した活性化 刺激、 リポポリサヅカライド （LPS) 刺激、 カルシウムィオノフォア刺激、 コンパウンド 48/80刺激、 ペプチドグリカン刺激、肥満細胞で発現している GPCRのリガンドを用いた刺 激等があげられる。 薬剤としては、 例えば、 プレドニゾロンやデキサメタゾン等のグルコ コルチコイド、 FK-506やサイクロスポリン等の免疫抑制薬、 32アドレナリン受容体刺激 薬やホスホジエステラーゼ阻害薬等の炎症性メディエー夕一遊離抑制作用を有する薬物、 等があげられる。
DNAチップ解析としては、 例えば、 市販のァフィメトリックス （Affymetrix) 社のジー ンチヅプ (GeneChip)を用いることができる。 RT- PCR解析には、公知の方法！: PCR Protocols、 Academic Press (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2725 (1990); 実験医学 （増 刊） ， ， 6 (1997 )〕 を用いることができる。 定量的 RT- PCR法としては、 リアルタイム RT- PCR用の宝酒造社製のキヅト （For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq -PC Version) を 用いることもできる。
本発明においてヒト肥満細胞で発現することが初めて明らかになった GPCRとしては、例 えば、システィニルロイコトリエン受容体 1 (CysLTRl)、 G蛋白質共役型受容体 91 (GPR91)、 G蛋白質共役型受容体 34 (GPR34)、 EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様配列
2 (EMR2) 、 血小板活性化因子受容体 (PAFR)、 G蛋白質共役型受容体 105 (GPR105)、 7回膜貫通スーパーファミリー'メンバ一 1 ( M7SF1)、 G蛋白質共役型受容体 37(GPR37)、 CD97抗原（CD97)、メラノコルチン 1受容体（MCI)、 G蛋白質共役型受容体 FIRE (FIRE)、 フオルミルペプチド受容体 1 (fMLPl)、 G蛋白質共役型受容体 65 (GPR65)、 プロスタグ ランジン E受容体 3オル夕ネイティブバリアント h(EP3 variant h)、 プリン受容体 P2Y8 (P2Y8)、 ドーパミン受容体 D2 (D2)、 内皮分化リゾホスファチジン酸 G蛋白質共役型受 容体 2 (EDG2)、 アデノシン A3受容体 (A3)、 補体第 5成分受容体 1 (G5 1)、 ォプシン
3 (0PN3)、 G蛋白質共役型受容体 27 (GPR27)、 G蛋白質共役型受容体 44 (CRTH2)、 内 皮分化スフインゴ脂質 G蛋白質共役型受容体 1 (EDG1) 、 フオルミルペプチド受容体様 2
(FPRL2) 、 ケモカイン (C - Cモチーフ) 受容体様 2 (CCRL2) 、 メ夕ボトロピックグル夕 ミン酸受容体 6 (mglu6)、カンナビノィド受容体 2 (CB2)、 G蛋白質共役型受容体 39(GPR39)、 プリン受容体 P2Y5 (P2Y5)、アデノシン A1受容体 (A1)、ピリミジン受容体 P2Y4 (P2Y4)、 プロス夕グランジン E受容体 3オル夕ネイティブバリアント j (EP3 variant j )N アデノシ ン A2a受容体 (A2a；)、 1型アンジォテンシン受容体 (AT1B)、 B型ェンドセリン受容体 (ETB)、. ゴナドトロピン放出ホルモン受容体 (GNRHR) 、 カドヘリン EGF LAG 7回貫通 G型受容体 2 (CELSR2)、 ケモカイン （C- Cモチーフ）受容体 7 (CCR7)、 ヒスタミン受容体 H4 (H4)、 G蛋白質共役型受容体 12 (GPR12)、 ヒスタミン受容体 HI (HI)、 G蛋白質共役型受容体 32 (GPR32)、腫瘍内皮細胞マーカ一 5 (TEM5)、 G蛋白質共役型受容体 58 (GPR58)、 力 ドヘリン EGF LAG 7回貫通 G型受容体 1 (CELSR1)、 G蛋白質 殳型受容体 85 (GPR85)、 モチリン受容体 (Motil in R)、 G蛋白質共役型受容体 64 (HE6)、 力ドヘリン EGF LAG 7 回貫通 G型受容体 3 (CELSR3) 、 カルシトニン受容体様 (CALCRL)、 網膜色素上皮由来口 ドプシンホモログ（RRH)、 G蛋白質共役型受容体 18 (GPR18)、 G蛋白質共役型受容体 35 (GPR35) 、 プリン受容体 P2Y10 (P2Y10)、 FLJ40279 (C-TESTI 027296)、 G蛋白質共役 型受容体 141 (GPR141)、 精巣下降関連 G蛋白質共役型受容体 (hRUP16)、 内膜肥厚関連 受容体（ITR)、 G蛋白質共役型受容体 MR(S2 (MRGX2)、 トレースアミン受容体 1 (SNORF33)、 7回膜貫通受容体 CBRC7 MJ75 (C-THYMU2011548)、 アドレノメデユリン受容体 (GlOd)、 G蛋白質共役型受容体 107 (GPR107)、 G蛋白質共役型受容体 126 (GPR126)、 G蛋白質共 役型受容体 41 (GPR41)、 G蛋白質共役型受容体 43 (GPR43)、 G蛋白質共役型受容体 68 (GPR68)、ガストリン放出ぺプチド受容体 (GRPR)、 G蛋白質共役型受容体 1019(HEOAD54)、 推定 G蛋白質共役型受容体 hGPCRlO (hRUP9)、 膜型プロゲスチン受容体ひ (mPRa)、 M プロゲスチン受容体ァ （mPRg)、 推定 G蛋白質共役型受容体 GPCR1 (SRL)、 血小板活性ィ匕 受容体ホモログ H963 (H963) 、 プロスタグランジン E受容体 4 (EP4)、 ケモカイン （C-C モチーフ）受容体 1 (CCR1)、 ドーパミン受容体 D5 (D5)、ロイコ.トリェン B4受容体 (LTB4R) およびケモカイン (C - X- Cモチーフ) 受容体 5 (CXC 5) をあげることができる。 本発明において、各 GPCRは、第 1表、第 3表、第 5表および第 7表に記載したデ一夕べ —スの登録番号のアミノ酸配列および塩基配列により定義されるものである。 ただし、ァ リル変異体も含まれるものとする。
上記の GPCRのうち、 IgE受容体を介した活性化刺激により発現が変動する GPCRとして は GPR34、 PAFRヽ GPR105, WSF1S GP 65N P2Y8、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ EDG1、 GPR39、 EP3 variant j、 A2a、 ETB、 H4、 CELSR2、 TEM5、 C-TESTI2027296S GPR141, ITR, MRGX2N GlOdヽ GPR43、 GRPR、 HEOAD54、 H963N EP4および LTB4Rをあげることができる。 また、 補体第 3成分受容 体 1 (C3aRl)、 アドレナリン受容体 ( /3 2) および G蛋白質共役型受容体 RE2 (RE2) は、 ヒト肥満細胞に発現していることは報告されていたが、 本発明において初めて IgE処 瑪で発現が変動することが明らかになった。
LPS刺激により発現が変動する GPCRとしては、 C3aRl、 PAFRヽ CD97、 MC1、 C5R1、 A2a、 AT1B、CELSR2、CCR7および EP4をあげることができ、 IFN-ァ刺激により発現が変動する GPCR としては、 C3aRl、 PAFRヽ A2b、 CD97、 EDG2、 0PN3、 CRTH2、 EDG1、 プロスタグランジン E 受容体 2 (EP2) 、 H4、 GPR32および CELSR1をあげることができ、 IFN-ァおよび LPSの共 刺激により発現が変動する GPCRとしては、 C3aRl、 PAFRヽ GPR105、 CD97、 MCIヽ A3、 0PN3、 EDG1、 CCRL2, P2Y5、 A2a、 CCR7、 RE2、 CELSR2、 CELSR1および EP4をあげることができる。 このうち、 C3aRl、 EP2および REは、 ヒト肥満細胞に発現していることは報告されていた が、本発明において初めて IFN-ァまたは LPS刺激により発現が変動することが明らかにな つた o
グルココルチコイド処理によりで発現が変動する GPCRとしては、 C3aRl、 GPR34、 β、 GPR105、 TM7SFS fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2, P2Y5、 A2a、 ェプス夕インーバ一ウィル ス誘導遺伝子 2 (EBI2) 、 スロンビン受容体 (PARI) 、 H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4をそ れそれあげることができる。 このうち、 C3aRl、 32s EBI 2、 PARIおよび REは、 ヒト肥満 細胞に発現していることは報告されていたが、 本発明において初めてグルココルチコィド 処理で発現が変動することが明らかになった。
( 2 )ヒト肥満細胞で発現する GPCRを標的とするヒト肥満細胞の活性化等を抑制する物質 のスクリーニング方法
( 1 ) で見出されたヒト肥満細胞で発現する GPCRから、 スクリーニングの標的とする GPCRを選択し、 該 GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分を利用した公知の方法 （特 閧 2001-245666) により、選択した GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物 質をスクリーニングすることができる。これらの物質は、該 GPCRを介してヒト肥満細胞に 対し、 （i) アポト一シスの誘導、 （ii)活性化の抑制、 （iii) 脱顆粒の抑制、 （iv) 炎 症性メディエー夕一の産生抑制、 (V)サイトカインの産生抑制、 (vi)ケモカインの産生 抑制の少なくとも 1つの作用を有するので、 その結果、 肥満細胞が病態と深く関与してい るアトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患、 アレルギー性疾患等の治療薬として用い ることができる。 したがって、以下に示すスクリーニング方法は、該 GPCiUこ作用し、 ヒト 肥満細胞に対し、 （i)アポトーシスの誘導、 （ii)活性化の抑制、 （iii)脱顆粒の抑制、 ( iv)炎症性メデイエ一夕一の産生抑制、 (V)サイト力インの産生抑制、 (vi )ケモカイ ンの産生抑制の少なくとも 1つの作用を有するヒト肥満細胞の活性化を抑制する物質のス クリーニング方法となる。炎症性メデイエ一夕一としては、 ヒスタミン等のアミン類、 ト リプ夕ーゼ等のプロテア一ゼ、 PGD2や LT等のァラキドン酸代謝産物、 PAF等を、 サイト力 インとしては GM- CSF等を、 ケモカインとしては MIP-1ひ等があげられる。
また、 同じ方法により、 （1 ) で見出されたヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチ コィドの刺激により発現量が変動する GPCRのァゴニスト、アン夕ゴニストまたは機能 ί 飾 物質をスクリーニングすることができる。これらの物質は、該 GPCRを介してグルココルチ コィドの作用を制御する効果を有するので、 ダルココルチコィ ド作用の制御剤として用い ることができる。
以下、 簡単にスクリーニング方法を記載する。 スクリーニングに用いる、 選択した GPCR を発現する細胞としては、ヒト末梢血由来肥満細胞、ヒト臍帯血由来肥満細胞、 トの肺、- 皮膚、 扁桃から調製した肥満細胞、 ヒト肥満細胞から樹立した細胞株があげられ、 また該 GPCRをコ一ドする DNAを含む発現ベクターを動物細胞や酵母等の宿主細胞に導入して得ら れる形質転換細胞を用いることもできる。 該形質転換細胞は公知の方法 （特開
2001-245666) により構築することができる。 ヒト肥満細胞から樹立した細胞株としては、 ヒト肥満細胞の性質をよく保持していることが知られている LAD2 CLeuk. Res . , 27 , 671 (2003 ) ; Leuk . Res . , 27 , 677 (2003 )〕 等があげられる。 選択した GPCRに特異的なリガン ド、ァゴニストまたはアン夕ゴニストをスクリーニングに用いない場合は、該 GPCRをコー ドする DNAを含有する形質転換体を用いるのが好ましい。
( a ) リガンド結合ァヅセィ
スクリ一ニングの標的として選択した GPCRのリガンド、ァゴニストまたはアン夕ゴニス トが知られている場合は、それらを放射性同位元素等で標識したものと、該 GPCRを発現す る細胞または該細胞の膜画分を用いて、 公知の方法 （特開 2001-245666) によりリガンド 結合アツセィを行うことにより、該 GPCRのァゴニストまたはアン夕ゴニストをスクリー二 ングすることができる。 以下、 標識したリガンドを用いた方法を述べるが、 ァゴニストま たはアン夕ゴニストもリガンドと同様に用いることができる。
スクリ一ニングは、（i)標識したリガンドを該 GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画 分に接触させた場合と、 （ii )標識したリガンドおよび試験物質を本発明のポリべプチドま たは部分べプチドを含有する細胞または該細胞の膜画分に接触させた場合における、 標識 したリガンドの該細胞または該膜画分に対する結合量を測定して比較し、 試験物質が存在 しない（i)の場合と比較して試験物質が存在する（i i )の場合に、標識したリガンドの結合 量が低下する場合に、試験物質を該 GP のァゴニストまたはアン夕ゴニストとして選択す る。選択した試験物質が、該 GPCRのァゴニストであるかアン夕ゴニストであるかは、以下 の （b ) ~ ( d ) の方法で確認できる。
標識したリガンドの結合量の測定は、 以下のようにして行うことができる。
該 GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分を一定量含む緩衝液に、 （i )試験物質と放 射性同位元素で標識した一定の方姊寸能量のリガンドを添加したもの、 （i i )放射性同位元素 で標識した一定の放射能量のリガンドのみを添加したもの、（ i i i )放射性同位元素で標識し , た一定の放射能量のリガンドと大過剰の未標識のリガンドを添加したものを用意し、 反応 させる。 反応は約 0 ~50° (、 好ましくは約 4〜37°Cで、 約 20分〜 24時間、 好ましくは約 30分〜 3時間行なう。 （i )〜（ii i )それそれを反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の 緩衝液で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射能量を液体シンチレ一シヨンカウン 夕一あるいはァーゥエルカウン夕一等の放射線測定装置で計測する。（i )および (ii )それそ れの放射能量（全結合量： B)から（i ii )の放射能量（非特異的結合量： NSB) を差し引いた 値を、 （i )および ( ii )それぞれの特異的結合量として計算する。
( b ) GTPァ S結合アツセィ
標識した GTPァ Sと、 スクリーニングの標的として選択した GPCRを発現する細胞または 該細胞の膜画分を用いて、 公知の方法（特閧 2001-245666) により GTPァ S結合ァヅセィを 行うことにより、該 GPCRのァゴニスト、アン夕ゴニスト、 または機能 ί 飾物質をスクリ一 ニングすることができる。ヒト肥満細胞で発現する GPCRを含有する細胞としては、肥満細 胞で発現する GPCRをコ一ドする DNAを含有する形質転換体を用いることもできる。該形質 転換体ほ公知の方法 （特開 2001-245666) により構築することができる。
例えば、試験物質を選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分に接触させ、 GTP ァ S結合ァヅセィを行うことにより、 該 GPCRのァゴニストを探索することができる。
GPCRのァゴニストが知られている場合は、 試験物質の存在下、 ァゴニストを選択した GPC を発現する細胞または該細胞の膜画分に接触させ、 GTPァ S結合アツセィを行うことに より、該 GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニスト、 または機能修飾物質を探索することができ る。
GPCRが構成活性型 GPCRである場合は、試験物質を選択した GPCRを発現する細胞または 該細胞の膜画分に接触させ、 GTPァ S結合ァヅセィを行うことにより、 該 GPCRのァゴニス ト、 アン夕ゴニスト、 または機能修飾物質を探索することができる。
GTPァ Sの G への結合量は、 文献〔Mol . Pharmacol . , 7 , 848-854 (1995 )、 W098/46995) に記載の方法に従って、 標識した GTPy Sを、 GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画 分へ添カ卩し、 GTPァ Sの細胞または細胞膜画分への結合量として測定することができる。 GTP ァ Sは GTPと同様に G と結合するが、 によるカロ水分解を受けないため、 結合量を正確に 測定できる。標識した GTPァ Sとしては、例えば35 Sで標識した GTPァ Sを用いることができる。 具体的には、 GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を一定量含む緩衝液に、 (i ) 試験物質、一定量のァゴニスト、 GDPおよび放射性崗位元素で標識した一定の放射能量の GTP ァ Sを添加したもの、 （ii )—定量のァゴニスト、 GDPおよび放射性同位元素で標識した一定 ' の放射能量の GTPァ Sを添加したもの、 ^ )ー定量のァ ニスト、 GDP、 放射性同位元素で 標識した一定の放射能量の GTPァ Sおよぴ大過剰の未標識の GTPァ Sを添加したものをそれそ れ用意し、 反応させる。 反応は O〜50°C、 好ましくは 4〜37°Cで、 20分〜 24時間、 好まし くは 30分〜 3時間行なう。 （i )〜（ii i )それそれを反応後、 ガラス繊維濾紙等で濾過し、 適 量の緩衝液で洗浄した後、 ガラス繊維濾紙に残存する放射能量を液体シン レ一シヨン力 ゥン夕一等の放射線測定装置で計測する。 （i )および ( ii )それそれの放射能量（全結合量： B) から（i ii )の放射能量 （非特異的結合量： NSB) を差し引いた値を、 （i )および ( i i )それ それの特異的結合量として計算する。 '
( i i )の試験物質非存在下における GTPァ Sの特異的結合量と、（i )の試験物質存在下におけ る GTP r Sの特異的結合量を比較して、（ i )の試験物質存在下で GTP γ Sの特異的結合量を減少 させる物質を、選択した GPCRに対するアン夕ゴニストとして選択することができる。一方、 GTPァ Sの特異的結合量を増力 Πさせる物質を選択した GPCRに対するァゴニストとして選択す ることができる。 上記の方法で（i )〜（i i i )の系にァゴニストを入れずに、 同様の測定を行い、 （ii )の試験 物質非存在下における GTPァ Sの特異的結合量と、（ i )の試験物質存在下における GTP γ Sの特 異的結合量を比較して、（i )の試験物質存在下で GTPァ Sの特異的結合量を増加させる物質物 質を選択した GPCRに対するァゴニストとして選択することができる。
選択した GPCRが構成活性型の GPCRの場合は、 上記の方法で（ i )〜（ i i i )の系にァゴニスト を入れずに、 同様の測定を行い、 （ii )の試験物質非存在下における GTPァ Sの特異的結合量 と、 （i )の試験物質存在下における GTPァ Sの特異的結合量を比較して、 （i )の試験物質存在 下で GTPァ Sの特異的結合量を減少させる物質を選択した GPCRに対するアン夕ゴニストとし て選択することができる。一方、 GTPァ Sの特異的結合量を増加させる物質を選択した GPCR に対するァゴニストとして選択することができる。 ―'
また、 選択された物質について、 他の GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を 選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアツセィ を行うことにより、 選択した GPCRに特異的なァゴニストまたはアン夕ゴニストであるかを 確認することができる。
( c ) GTPase活性測定法
スクリ一ニングの標的として選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分を用 いて、公知の方法（特開 2001-245666) により GTPase活性測定を行うことにより、該 GPCR のァゴニスト、アン夕ゴニスト、または機能 飾物質をスクリーニングすることができる。 例えば、 試験物質を選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分に接触させ、 GTPase活性を測定することにより、 該 GPCRのァゴニストを探索することができる。
GPCRのァゴニストが知られている場合は、 試験物質の存在下、 ァゴニストを選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分に接触させ、 GTPase活性を測定することにより、 該 GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニスト、 または機能修飾物質を探索することができる。
GPCRが構成活性型 GPCRである場合は、試験物質を選択した GPCRを発現する細胞または 該細胞の膜画分に接触させ、 GTPase活性を測定することにより、 該 GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニスト、 または機能修飾物質を探索することができる。
GTPase活性は、 文献〔J . Biol . Che . , 271 , 1857-1860 ( 1996 )、 W098/46995) に記載の 方法に従って、 GPCR4を発現する細胞または該細胞の細胞膜画分へ、ァ位リン酸を放射性同 位元素で標識した GTPを基質として添加し、測定することができる。ァ位リン酸を放射性同 位元素で標識した GTPとしては、 例えば32 Pで標識した [ァ- 32P]GTPを用いることができる。 具体的には、選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の膜画分を一定量含む緩衝液に、
( i )試験物質、一定量のァゴニストおよびァ位リン酸を放射性同位元素で標識した一定の放 射能量の GTPを添加したもの、（ii )一定量のァゴニストおよびァ位リン酸を放射性同位元素 で標識した一定の放射能量の GTPを添加したものをそれぞれ用意し、 反応させる。反応は 0 〜50°C；、好ましくは 4〜37°Cで、 20分〜 24時間、好ましくは 30分〜 3時間行なう。 （i )および
( i i )それそれを反応後、 遠心分離により反応液の上清を回収し、 上清に放出された無機リ ン酸 (Pi )の放射能量を液体シンチレ一ションカウンタ一等の放射線測定装置で計測し、 GTPase活性とする。 あるいは、 反応液をガラス繊維濾紙等で濾過し、 適量の同バッファ一 で洗浄した後、 濾過液を回収し、 濾過液中の無機リン酸 (Pi )の放射能量を液体シンチレ一 シヨンカウン夕一等の放射線測定装置で計測してもよい。 （ii )の試験物質非存在下におけ る GTPase活性と、 （i )の試験物質存在下における GTPase活性とを比較して、 （i )の試験物質 存在下で GTPase活性を減少させる物質を選択した GPCRに対するアン夕ゴニストとして選択 することができる。一方、 GTPase活性を増加させる物質を選択した GPCRに対するァゴニス トとして選択することができる。
上記の方法で（i )および (ii )の系にァゴニストを入れずに、同様の測定を行い、（ii )の試 験物質非存在下における GTPase活性と、（i )の試験物質存在下における GTPase活性とを比較 して、（i )の試験物質存在下で GTPase活性を増加させる物質を選択した GPCRに対するァゴニ ストとして選択することができる。
選択した GPCRが構成活性型の GPCRの場合は、上記の方法で（ i )および ( i i )の系にァゴニス トを入れずに、 同様の測定を行い、 （ii )の試験物質非存在下における GTPase活性と、 （i ) .— の試験物質存在下における GTPase活性とを比較して、 GTPase活性を減少させる物質を選択 した GPCRに対するアン夕ゴニストとして選択することができる。一方、 GTPase活性を増加 させる物質を選択した GPCRに対するァゴニストとして選択することができる。
また、 選択された物質について、 他の GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を 選択した GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のアツセィ を行うことにより、 選択した GPCRに特異的なァゴニストまたはアン夕ゴニストであるかを 確認することができる。 ヒト肥満細胞としては、 ヒト末梢血由来肥満細胞、 ヒト臍帯血由. 来肥満細胞、 ヒトの肺、 皮膚、 扁桃から調製した肥満細胞、 LAD2等のヒト肥満細胞系細胞 株があげられる。
( d )機能アツセィ
スクリーニングの標的として選択した GPCRを発現する細胞を用いて、 公知の方法 （特開 2001-245666) により機能ァヅセィを行うことにより、 該 GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニ スト、 または機會 g修飾物質をスクリーニングすることができる。
例えば、 試験物質を選択した GPCRを発現する細胞に接触させ、 該 GPCRを介した細胞の 応答（例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生 成、細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸 ィ匕、 C- fos活性化、 pHの低下、 細胞増殖活性、 メラニン色素の または拡散、 またはレ ポーター遺伝子の発現量など）を測定することにより、該 GPCRのァゴニストを探索するこ とができる。
GPCRのァゴニストが知られている場合は、 試験物質の存在下、 ァゴニストを選択した GPCRを発現する細胞に接触させ、 該 GPCRを介した細胞の応答（例えば、 ァラキドン酸遊 離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシ トールリン酸産生、細胞膜電位変動、細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fos活性化、 pHの低下、 細胞増殖活性、 メラニン色素の,または拡散、 またはレポ一ター遺伝子の発現量など） を測定することにより、該 GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニスト、 または機能修飾物質を探 索することができる。
GPCRが構成活性型 GPCRである場合は、試験物質を選択した GPCRを発現する細胞に接触 させ、該 GPCRを介した細胞の応答（例えば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、細 胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシト一ルリン酸産生、 細胞膜電 位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fos活性化、 pHの低下、 細胞増殖活性、 メラニン色 素の凝集または拡散、 またはレポ一夕一遺伝子の発現量など） を測定することにより、 該
GPCRのァゴニスト、 アン夕ゴニスト、 または機能修飾物質を探索することができる。 これらの GPCRを介した細胞の応答は、文献 J. Biol. C em. , 271, 1857 (1996)、 Science, 268> 98 (1995) 、 J. Pharmacol. Exp. Ther., 275, 1274 (1995)、 J. Biol. Chem., 272, 1822 (1997)、 J. Recept. Signal Transduct. Res. , 17, 57 (1997)、 Endocrinology 138, 1400 (1997)N Endocrinology 138, 1471 (1997)、 Nat. Biotec nol . , 16, 1334 (1998)、 Biochem. Biophys. Res. Commun. , 251, 71 (1998 )、 Br. J. Pharmacol. , 125, 1387 (1998)、 Trends Biotechnol., 15, 487 (1997)、 Anal. Biochem. , 252, 115 (1997)、 Nature, 358, 325 (1992), Nature, 393 > 272 (1998)、 Cell, 9 > 573 (1998)、 J. Biol. Chera,, 272, 27497 (1997), rends Pharmacol. Sci. , 18, 430 (1997)sTrends Pharmacol. Sci. , 20, 370 (1999)、 W098/46995 に記載の方法により測定することができる。
レポ一夕一系を用いて細胞の応答をモニターする場合は、 例えば、 選択した GPCRを発現 させた細胞に、 選択した GPCRの活性ィ匕により発現が誘導される遺伝子のプロモーター配列 の下流に適当なレポーター遺伝子を連結した DNAを導入することにより、選択した GPCRの活 性ィ匕をレポ一夕一遺伝子の発現で測定することができる。 該プロモ一夕一としては、 例え ば ICAM- 1遺伝子のプロモー夕一、 c-fosのプロモ一夕一、 Krox-24のプロモーター〔Biochem. J., 320, 145 (1996)〕 などが利用できる。 また、 該プロモ一夕一は、 適当な転写因子の結 合配列と基本プロモ一夕一からなる人工プロモーターでもよい。 転写因子の結合配列とし ては、 に共役する GPCRの活性化に伴い転写を活性ィ匕する SRE (serum responsive element) や Gsに共役する GPCRの活性ィ匕に伴い転写を活性ィ匕する CRE (cAMP responsive element) な どが利用できる。 また、 Gasの C末端 5アミノ酸を G«iの C末 5アミノ酸に置換したキ メラ Gasを選択した GPCRの発現細胞に発現させることにより、 本来 Gsと共役する GPCRの活 性ィ匕に伴い転写を活性ィ匕する CREを含む人工プロモ一夕一からも、 が共役する GPCRの活性 化に伴いレポ一夕一遺伝子の発現を誘導することができる。
レポ一夕一遺伝子としては、あらゆるレポ一夕一遺伝子を使用することが可能であるが、 例えば、 ホ夕ル ·ルシフェラ一ゼ遺伝子、 ゥミシィ夕ケ 'ルシフェラ一ゼ遺伝子、 クロラ ムフエニコ一ル 'ァセチルトランスフェラ一ゼ遺伝子、 3—グルクロニダ一ゼ遺伝子、 β 一ガラクトシダーゼ遺伝子、 /5-ラク夕マーゼ遺伝子、ェクオリン遺伝子およびグリーン · フルォレヅセント ·プロティン遺伝子などが利用できる。
具体的には、 選択した GPCRを発現する細胞をマルチウエルプレート等に培養する。 必要 に応じて新鮮な培地あるいは細胞に毒性を示さない適当なバッファーに交換し、（i)試験物 質および一定量のァゴニストを添加したもの、 （ii)一定量のァゴニストのみ添加したもの それそれを用意し、 一定時間インキュベートする。 インキュベート後、 細胞の応答 （例え ば、 ァラキドン酸遊離、 アセチルコリン遊離、 細胞内 Ca2+遊離、 細胞内 cAMP生成、 細胞内 cGMP生成、 イノシトールリン酸産生、 細胞膜電位変動、 細胞内蛋白質のリン酸化、 c-fos 活性化、 pHの低下、 細胞増殖活性、 メラニン色素の または拡散、 またはレポ一ター遺 伝子の発現量などを促進する活性または抑制する活性など） を測定する。 細胞刺激活性の 指標とする物質 （例えば、 ァラキドン酸など） の生成が、 細胞が含有する分解酵素によつ て検定困難な場合は、 該分解酵素に対する阻害剤を添加して定量してもよい。
また、 cAMP産生抑制などの活性については、 フオルスコリンなどで細胞の cAMP産生量を 増大させておいた細胞に対する産生抑制作用として検出することができる。
( i i )の試験物質非存在下における細胞の応答の程度と、（ i )の試験物質存在下における細 胞の応答の程度を比較して、 ( i )の試験物質存在下で細胞の応答を減少させる物質を選択し た GPCRに対するアン夕ゴニストとして選択することができる。 一方、 細胞の応答を増加さ せる物質を選択した GPCRに対するァゴニストとして選択することができる。
上記の方法で（i )および (ii )の系にァゴニストを入れずに、同様の測定を行い、 （ii )の試 験物質非存在下における細胞の応答の程度と、（i )の試験物質存在下における細胞の応答の 程度を比較して、（i )の試験物質存在下で細胞の応答を増加させる物質を選択した GPCRに対 するァゴニストとして選択することができる。
選択した GPCRが構成活性型の GPCRの場合は、上記の方法で ）および ( i i )の系にァゴニス トを入れずに、同様の測定を行い、（ii )の試験物質非存在下における細胞の応答の程度と、 ( i )の試験物質存在下における細胞の応答の程度を比較して、 （i )の試験物質存在下で細胞 の応答を減少させる物質を選択した GPCRに対するアン夕ゴニストとして選択することがで きる。 一方、 細胞の応答を増加させる物質を選択した GPCRに対するァゴニストとして選択 することができる。
また、 選択された物質について、 他の GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分を 選択された GPCRを発現する細胞または該細胞の細胞膜画分の代わりに用いた同様のァヅセ ィを行うことにより、 選択された GPCRに特異的なァゴニストまたはアン夕ゴニストである かを確認することができる。
以上のようにして得られた、 選択された GPCRに特異的ァゴニスト、 アン夕ゴニストまた は機能修飾物質が、 ヒト肥満細胞に対し、 活性化抑制、 画粒抑制、 炎症性メデイエ一夕 —産生抑制、 サイトカイン産生抑制およぴケモカイン産生抑制のうちの少なくとも 1つの , 作用を有していることは、 例えば、 得られたァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾, 物質を、ヒト IgEを添加して培養したヒト肥満細胞に添加してィンキュベートした後、抗ヒ ト IgE抗体の添加等によりヒト肥満細胞を活性ィ匕し、 放出された (i )脱顆粒の指標となるヒ ス夕ミンや ーへキソサミニダ一ゼ、 (ii )LTC4、 LTD4、 LTE4、 PGD2等の炎症性メデイエ一夕 ―、 （ii i )TNF- や GM- CSF等のサイト力イン、 (iv) IL - 8ヽ 1-309、 MIP- 1 等のケモカイン等 を文献 CBlood 100 , 3861 (2002)〕 に従って測定し、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは 機能修飾物質を添加しなかった場合と比較することにより確認できる。 また、 ヒト肥満細 胞に、 ァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を添カ卩し、 アポトーシスが誘導さ れることを、 クロマチン DNAの断片化の測定や TUNEL法等によって検出することより、 アポ トーシス誘導作用を有していることを確認できる。 ヒト肥満細胞としては、 ヒト末梢血由 来肥満細胞、 ヒト臍帯血由来肥満細胞、 ヒトの肺、皮膚、扁桃から調製した肥満細胞、 LAD2 等のヒト肥満細胞由来の細胞株を用いることができる。
( 3 )ヒト肥満細胞で発現する GPCRのァゴニスト、アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を 含有する医薬組成物
上記のスクリーニング方法で取得される、ヒト肥満細胞で発現する GPCRに対するァゴニ スト、 アン夕ゴニスト、 機能修飾物質は、 ヒト肥満細胞の機能を制御する、 安全で低毒性 · な医薬組成物として有用である。 上記のスクリ一ニング方法を用いて得られる化合物またはその塩を上記の医薬組成物と して使用する場合、 常法に従って製剤化することができる。例えば、 必要に応じて糖衣を 施した錠剤、 カプセル剤、 エリキシル剤、 マイクロカプセル剤などとして経口的に、 ある いは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの 注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、 該ィ匕合物またはその塩を生理学的に認めら れる担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安定剤、 結合剤などとともに一般に認め られた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするもの である。錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラチ ン、 コーンスターチ、 トラガント、 アラビアゴムのよ-うな結合剤、 結晶性セルロースのよ うな賦形剤、 コーンスターチ、 ゼラチン、 アルギン酸などのような膨化剤、 ステアリン酸 マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖、 乳糖またはサッカリンのような甘味剤、 ぺパ一ミ ント、 ァカモノ油またはチヱリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカブ セルである場合には、 前記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することが できる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油、 椰 子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施にし たがって処方することができる。
注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水、 プドウ糖やその他の補助薬を含む等張 液（例えば、 D—ソルビト一ル、 D—マンニトール、 塩化ナトリウムなど） などが用いら れ、適当な溶解補助剤、例えば、 アルコール（例えば、エタノール）、 ポリアルコール（例 えば、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコ一ル）、 非イオン性界面活性剤 （例え ば、 ポリソルべ一ト 8 0 ( T M) 、 H C O - 5 0 ) などと併用してもよい。 油性液として は、 例えば、 ゴマ油、 大豆油などが用いられ、 溶解補助剤である安息香酸ペンジル、 ベン ジルアルコールなどと併用してもよい。 また、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液、 酢酸ナ トリウム緩衝液） 、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム、 塩酸プロ力インなど） 、 安定剤（例えば、 ヒト血清アルブミス ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、 ベンジルアルコール、 フエノールなど） 、 酸化防止剤などと配合してもよい。 調整された 注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。 このようにして得られる製剤は安全で低毒 性であるので、例えば、 ヒトゃ哺乳動物（例えば、 ラヅト、 ゥサギ、 ヒヅジ、 プ夕、 ゥシ、 ネコ、 ィヌ、 サルなど） に対して投与することができる。該化合物またはその塩の投与量 は、 投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などにより差異はあるが、 経口投与の場合、 一 般的に成人（60 kgとして） においては、 一日につき約 0 . 1〜100 mg、 好ましくは約 1 . 0〜 50 mg、 より好ましくは約 1 . 0〜20 mgである。非経口的に投与する場合は、 その 1回投与 量は投与対象、 対象臓器、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば、 注射剤の形 では通常成人 (60 kgとして） においては、 一日につき約 0 .01~30 mg程度、 好ましくは 約 0 . 1~20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜10 mg程度を静脈注射により投与するのが好 都合である。他の動物の場合も、 6 O. k g当たりに換算した量を投与することができる。 ( 4 ) ヒト肥満細胞で発現する GPCRを特異的に認識する抗体の作製と利用法
( 4 - 1 ) ヒト肥満細胞で発現する GPCRを特異的に認識する抗体の作製 公知の方法（特開 2001-245666) にしたがって、 ヒト肥満細胞で発現する GPCRを特異的 に認識するポリクローナル抗体およびモノク口一ナル抗体を作製することができる。 得ら れた抗体についてヒト肥満細胞のアポト一シス、 活性化、 脱顆粒、 炎症性メディエー夕一 の産生、 サイト力インの産生、 ケモカインの産生等に対する作用を測定することにより、 (i) アポトーシスの誘導、 （ii)活性ィ匕の抑制、 （iii)脱顆粒の抑制、 （iv) 炎症性メ デイエ—夕一の産生抑制、 （ サイト力インの産生抑制、 （vi)ケモカインの産生抑制の 少なくとも 1つの作用を有する抗体を選択し、 得ることができる。 また、 同様にして、 ヒ ト肥満細胞で発現しかつダルココルチコィドの刺激により発現量が変動する GPCRを特異 的に認識するポリクローナル抗体およびモノクロ一ナル抗体を作製することができる。得 られた抗体について、 グルココルチコイドの作用に与える効果を測定することにより、 該 GPCRを介してグルココルチコィドの作用を制御する効果を有する抗体を選択し得ること ができる。
( 4 - 2 ) ヒト肥満細胞で発現する GPCRを認識する抗体の利用
( a )ヒト肥満細胞で発現する GPCRを認識する抗体を用いるヒト肥満細胞で発現する GPCR の免疫学的検出および定量
ヒト肥満細胞で発現する GPCRの免疫学的検出法としては、マイクロタイ夕一プレートを 用いる ELISA法、 蛍光抗体法、 ウエスタンプロヅト法、免疫組織染色法〔別冊 実験医学， ザ.プロトコ一ルシリーズ， 免疫染色 · in situハイブリダイゼ一ション , 羊土社 (1997)； J . Immunol . Methods , 150 > 5 , (1992 )〕等をあげることができる。
免疫学的定量法としては、液相中でヒト肥満細胞で発現する GPCRと反応する抗体のうち ェピト一プが異なる 2種類のモノクローナル抗体を用いたサンドィヅチ ELISA法、 mI等 の放射性同位体で標識したヒト肥満細胞で発現する GPCRと該 GPCRを認識する抗体とを用 いるラジ才ィムノアヅセィ法等をあげることができる。
上記検出あるいは定量法は、 ヒト肥満細胞の検出や肥満細胞が関与する疾患の診断に利 用することができる。 また、 上記検出あるいは定量法を用いてヒト肥満細胞で発現する GPCRを発現する細胞や細 «を同定することができる。 ヒト肥満細胞で発現する GPCRを 発現する細胞や細胞株は、該 GPCRのリガンド、ァゴニストまたはアン夕ゴニストの探索や 該 GPCRの機能解析に有用である。
( b ) ヒト肥満細胞で発現する GPCRを認識する抗体を用いるヒト肥満細胞の単離 公知の方法〔J. Immunol . Methods 169 > 153 (1994) ; J . Allergy Clin. Immunol . , 107 , 322 (2001 )〕に準じて、 ヒト肥満細胞で発現する GPCRを認識する抗体を用いて、 ヒトの各 種組織から肥満細胞を高純度に調製することができる。
( c ) ヒト肥満細胞で発現する GPCRを認識する抗体を含有する医薬
( 4 - 1 ) で取得される、 ヒト肥満細胞で発現する GPCRを特異的に認識し、 かつ （i) アポトーシスの誘導、 （ii)活性化の抑制、 （iii)脱顆粒の抑制、 （iv)炎症性メデイエ —夕一の産生抑制、 （V)サイト力インの産生抑制、 （vi)ケモカインの産生抑制の少なく とも 1つの作用を有する抗体は、 医薬、 例えば、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺 疾患、 あるいはアレルギー性疾患の治療薬として用いることができる。 該抗体は、 肥満細 胞のアポト一シス誘導作用、 ヒト肥満細胞の活性化抑制作用、 ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制 作用、 ヒト肥満細胞の炎症性メデイエ一夕一産生抑制作用、 ヒト肥満細胞のサイトカイン '産生抑制作用、 あるいはヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制作用を有する医薬として使用 することもできる。 （4— 1) で取得される、 ヒト肥満細胞で発現しかつグルココルチコ ィドの刺激により発現量が変動する GPCRを特異的に認識し、かつグルココルチコィドの作 用を制御する効果を有する抗体は、 ダルココルチコィドの作用を制御する医薬として使用 することができる。
ヒト肥満細胞で発現する GPCRを特異的に認識する抗体を含有する医薬は、治療薬として 該化合物単独で投与することも可能ではあるが、 通常は薬理学的に許容される一つあるい はそれ以上の担体と一緒に混合し、 製剤学の技術分野においてよく知られる任意の方法に より製造した医薬製剤として提供するのが望ましい。
投与経路は、 治療に際して最も効果的なものを使用するのが望ましく、 経口投与、 また は口腔内、 気道内、 直腸内、 皮下、 筋肉内および静脈内等の非経口投与をあげることがで きる。投与形態としては、噴霧剤、 カプセル剤、錠剤、顆粒剤、 シロップ剤、乳剤、座剤、 注射剤、 軟膏、 テープ剤等があげられる。
経口投与に適当な製剤としては、 乳剤、 シロップ剤、 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤 等があげられる。例えば乳剤およびシロップ剤のような液体調製物は、 水、 ショ糖、 ソル ビトール、 果糖等の糖類、 ポリエチレングリコール、 プロピレングリコール等のグリコ一 ル類、 ごま油、 オリ一ブ油、 大豆油等の油類、 p—ヒドロキシ安息香酸エステル類等の防 腐剤、 スト口ペリ一フレーバ一、 ペパーミント等のフレーバー類等を添加剤として用いて 製造できる。 カプセル剤、 錠剤、 散剤、 顆粒剤等は、 乳糖、 ブドウ糖、 ショ糖、 マンニト —ル等の賦形剤、 デンプン、 アルギン酸ナトリウム等の崩壊剤、 ステアリン酸マグネシゥ ム、 タルク等の滑沢剤、 ポリビニルアルコール、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ゼラチ ン等の結合剤、 脂肪酸エステル等の界面活性剤、 グリセリン等の可塑剤等を添加剤として 用いて製造できる。
非経口投与に適当な製剤としては、 注射剤、 座剤、 噴霧剤等があげられる。例えば、 注 射剤は、塩溶液、プドウ糖溶液、あるいは両者の混合物からなる担体等を用いて調製する。 座剤はカカオ脂、 水素化脂肪またはカルボン酸等の担体を用いて調製される。 また、 噴霧 剤は該ィ匕合物そのもの、 ないしは受容者の口腔および気道粘膜を刺激せず、 かつ該化合物 を微細な粒子として分散させ吸収を容易にさせる担体等を用いて調製する。 担体として具 体的には乳糖、 グリセリン等が例示される。 該化合物および用いる担体の性質により、 ェ ァロゾル、 ドライパウダ一等の製剤が可能である。 また、 これらの非経口剤においても経 口剤で添加剤として例示した成分を添加することもできる。
投与量または投与回数は、 目的とする治療効果、 投与方法、 治療期間、 年齢、 体重等に より異なるが、 通常成人 1日当たり 10 〃g/kg〜8 mg/kgである。
( 5 ) ヒト肥満細胞で発現する GPCR遺伝子の発現を抑制する方法
アンチセンス RNA/DNA技術〔バイオサイエンスとィンダストリー， 50, 322 (1992); 化 学， 6> 681 (1991 ); Biotechnology, 9, 358 (1992); Trends Biotechnol., 10, 87 (1992); Trends Biotechnol . , 10, 152 (1992); 細胞工学， 16, 1463 (1997)〕、 トリプル.ヘリヅ クス技術 Trends Biotechnol., 10, 132 (1992)〕、 リボザィム技術 (Curr. Opin. Chem. Biol., 3, 274 (1999); FEMS Microbiol. Rev, , 23, 257 (1999); Front . Biosci., 4, D497 (1999); Chem, Biol., 6, R33 (1999); Nucleic Acids Res. , 6> 5237 (1998); Trends Biotechnol . , 16 , 438 (1998 )〕、 デコイ DNA法〔日本臨床， 56 , 563 (1998 ) ; Circ . Res . , 82 , 1023 (1998 ) ; Exp . Nephrol . , 5， 429 ( 1997 ) ; 日本臨床， 54 > 2583 (1996 )〕、 ある いは siRNA (short interfering RNA) を用いて任意の遺伝子の発現を抑制することができ る。
siRNAとは、 ある標的遺伝子の mRNAの一部の配列を含む短い二本鎖 RNAであり、 RNA干 渉 （RNAi) により、 該遺伝子の発現を抑制できるものをいう。 siHNAの配列は、 標的とす る GPCRの mRNAの塩基配列から文献 [Genes Dev. , 13 , 3191 (1999 ) ] の条件に基づいて適 宜設計することができる。好ましくは、 mRNAの翻訳領域中の開始コドンより 50〜100塩基 下流の領域中で、 Mに続く 19塩基、 GC含量が 30〜70%、 より好ましくは 50%前後の配列 を選択する。選択した 19塩基の配列おょぴ相補的な配列それそれの 3 '端に TTまたは UU を付加した配列を有する 2本の RNAを DNA合 により合成し、 アニーリングすることに より siRNAを作製できる。また、 pSi lencer 1 .0-U6 (Ambion社製）、 SUPER (OligoEngine 社)等の siRNA発現用べクタ一に上記の選択した 19塩基の配列に相当する DNAを挿入する ことにより、 該遺伝子の発現を抑制できる siRNAを発現ずるべクタ一を作製することがで きる。
例えば、ヒト肥満細胞で発現する GPCR遺伝子に特異的なアンチセンス DNAまたは siRNA を用いて、ヒト肥満細胞で発現する GPCR遺伝子の発現の抑制を行うことが可能である。す なわち、 該 GPCR遺伝子に特異的なアンチセンス DNAまたは RNAiを投与することにより該 GPCRの生産を抑制し、 ヒト肥満細胞の機能を制御することができる。
例えば、 ヒト肥満細胞で発現する GPCRの発現増加または該 GPCRのリガンドの発現増加 が原因で受容体を介した生理作用が亢進している患者がいる場合、該 GPCRの遺伝子に特異 的なアンチセンス DNAまたは siRNAを患者に投与することにより、 ヒト肥満細胞の機能を 制御し、 疾患治療することができる。 すなわち、 該 GPCR遺伝子に特異的なアンチセンス DNAまたは siRNAは、 ヒト肥満細胞が閧与する疾患の治療剤として有用である。
該 GPCR遺伝子に特異的なアンチセンス DNAまたは siRNAを上記治療剤として使用する場 合は、 アンチセンス DNAまたは siRNAを単独、 あるいはレトロウイルスベクター、 アデノ ウィルスベクター、 アデノウイルスァソシエーテツドウィルスベクタ一などの適当なべク 夕一に挿入した後、 上記 （2 ) に記載した常法に従って製剤化、 処方および投与すること ができる。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によって限定 されるものではない。 発明を実施するための最良の形態
実施例 1 ヒト臍帯血由来肥満細胞を各,件で培養した際に発現する GP の解析
( 1 ) ヒト臍帯血由来肥満細胞の調製
ィンフォームドコンセントに基づいて取得した、ヒト臍帯血より、公知の方法〔Blood,lI， 1016 (2001 ) ; Blood , 98. 1127 (2001 ) ; Blood, 道， 3861 (2002)〕 に基づき、 以下のよ うにして、 ヒト肥満細胞を調製した。
CD34+単離キヅト 〔ミルテ二 'バイオテク （Mi Uenyi Biotec) 社製〕 を用いて、 ヒト臍 帯血より肥満細胞の前駆細胞である CD34陽性単核球細胞を取得後、 100 ng/mlの SCF、 50 ng/mlの IL- 6、および 5%め牛胎児血清（以下、 FCSと略す）を含むイスコフ改変ダルべヅ コ培地 (Iscove' s modified Dulbecco' s medium, 以下、 IMDMと略す) で 12〜18週間細胞 を糸代した。
( 2 ) IgE受容体を介した活性ィ匕処理およびグルココルチコィド処理をした肥満細胞の調 製
上記 （ 1 ) で調製したヒト臍帯血由来培養肥満細胞を、 l〃g/mlのヒトミエローマ IgE (コスモバイオ社製)の存在下く 37°Cで 24時間培養した。次いで、細胞を洗浄後、 1.5〃g/ml のゥサギ抗ヒト IgE抗体〔ダコ （Dako)社製〕 の存在下または非存在下、 37°Cで 6時間培 養した。 ヒトミエロ一マ IgEとゥサギ抗ヒト IgE抗体で処理した細胞では、 IgE受容体を 介した活性化シグナルが流れる。 この細胞を IgE—処理細胞と呼ぶ。 ヒトミエローマ IgEの みで処理した細胞では活性化シグナルは流れないので、 この細胞をコントロールとして使 用する。 こ φ細胞をコントロール細胞と呼ぶ。 また、 ヒトミエロ一マ IgEとゥサギ抗ヒト IgE抗体で処理する前に、 グルココルチコィドとして 10— 6 mol/1のデキサメタゾン存在下 で 48時間培養した細胞も同時に調製した。 この細胞を IgE+Dex処理細胞と呼ぶ。 培養に は、 100 ng/mlの SCF、 50 ng/mlの IL-6、 および 5%の FCSを含む IMDMを使用した。
( 3 ) ジーンチップを用いた発現解析
ァフィメトリックス社のジーンチヅプ（ヒト■ゲノム U133Aプローブ ·アレイおよびヒ ト 'ゲノム U133Bプローブ 'アレイ） を用いて、 上記 （2 ) で各種条件で培養し調製した 肥満細胞で発現する GPCRの解析を行った。
角军析の方法は、 ァフィメトリヅクス社のプロトコール （発現麟斤テクニカル ·マ二ユア ル）および文献〔Blood， 97, 1016 (2001 )、 Blood, 98 > 1127 (2001 )ヽ Blood, 100 , 3861 (2002 )〕 に従った。以下、 方法を簡単に記載する。
上記（2 )で各種条件で培養し調製した肥満細胞から、 RNィ一ジ一'ミニ'キヅト〔RNeasy Mini Kits, キアゲン ½iagen)社製〕 を用いて全 RNAを取得した。 スーパ一スクリプト · チヨイス ·システム (Superscript Choice systemインビトロジェン社製） と 7-(dT)24 プライマ一〔アマシャム 'バイオサイェンシズ（Amersham Biosciences)社製〕を用いて、 上記 RNAから二本鎖 cDNAを調製した。バイオアレイ高収率 RNA転写物標識キット〔BioArray High-yield RNA Transcript Labeling Kit. ェンゾ一 ·ダイァグノステイクス （Enzo Diagnostics)社製〕 を用いて、 上記 cDNAからビォチン化 cRNAを調製した。 ビォチン化 ' cRNAをヒト ·ゲノム U133Aプローブ.アレイおよびヒト 'ゲノム U133Bプロ'一プ.アレイ それそれと 45°Cで 16時間ハイプリダイズした。アレイを洗浄後、ハイプリダイズした cRNA をストレプトアビジン一フィコエリスリン〔streptavidin- phycoeirthrin、モレキュラー · プロ一ブズ（Molecular probes)社製〕 を用いて染色し、 ヒュ一レヅトーパッカード ·ジ —ン ·アレイ ·スキャナー (Hewlett-Packard Gene Array Scanner ヒュ一レヅ卜—ノ Sヅ カード社製） を用いて測定した。
各プロ一ブの蛍光強度は、 ァフィメトリックス社製のソフトウェア ジ一ンチヅプ-ァ ナリシス 'スイート （GeneChip Analysis Suite) 5.0を用いて定量した。以下このソフト ゥエアのァルゴリズムに従 ヽ各遺伝子の発現量を決定した。各遺伝子に対応する 10種類の プローブについて、 それそれの蛍光強度および対応する 1塩基ミスマッチプローブの蛍光 強度を測定し、 各遺伝子の発現量として、 AD(average difference)値 （各プローブの蛍光 強度と 1塩基ミスマッチプローブの蛍光強度の差の平均値）を求めた。各遺伝子の AD値に ついては、 ァフィメトリックス社のデ一夕解析仕様に基づき、 発現ありと判定されたもの は「Present」、 発現があるかないかはっきりしないと判定されたものは「Merginal」、 発 現がないと判定されたものは「Absent」というフラッグを示した。さらなるデ一夕解析は、 ソフトウェア ジーンスプリング'バージョン 5.1 〔GeneSpring version 5.1、 シリコン ' ジエネテイクス （Silicon Genetics)社製〕 を用いて行った。
, コントロール細胞、 IgE処理細胞、 IgE- Dex処理細胞間での各遺伝子の発現量の比較にお いては、 チヅプ毎のシグナル強度の分散を補正するために、 全ての遺伝子について上記で 求めた AD値をそのチヅプのメディアン値で補正した。各遺伝子について、コントロール細 胞に対する、 IgE処理細胞あるいは IgE- Dex処理細胞における発現量の比 （コントロール 細胞を 1としたときの相対発現量） を、 補正後の AD値を発現量として用いて算出した。 各遺伝子については、 AD値の値が 100以上でかつフラヅグが「Present」である場合に、 「発現している」と判断した。コントロール細胞、 IgE処理細胞、 IgE-Dex処理細胞のいず れかで「発現している」と判断された遺伝子をヒト肥満細胞で発現している遺伝子とした。 以上の解析の結果、 ヒト臍帯血由来培養肥満細胞で発現が見られた GPCRの名称、 略称、 蛋白質のアミノ酸配列の NCBI (National Center for Biotechnology Information)蛋白 質データベースの登録番号、 cDNAの塩基配列の NCBI塩基配列デ一夕ベースの登録番号、 ァフィメトリックス社のプロ一ブ ID、 どちらのジーンチップ上の遺伝子か （A：ヒト ·ゲ ノム U133Aプローブ 'アレイ、 B:ヒト 'ゲノム U133Bプロ一プ 'アレイ） を第 1表に示し た。 NCBIの蛋白質データべ一スおよび塩基配列デ一夕べ一スは NCBIのィン夕一ネットの サイト (http :〃丽. ncbi .nlm.nih. gov/) を参照した。
またこれらの GPCRの解析結果を第 2表に示した。各 GPCR遺伝子は第 1表の略称で示し、 遺伝子発現量としてメディアン値で補正する前の AD値を示した。 「F」の欄は AD値のフラ ヅグで Pは「Present」、 Mは「Merginal」、 Aは「Absent」 である。 「比」 の欄はコント ロール細胞に対する発現量の比を示した。 ヒト肥満細胞で発現していることが、 本発明に より初めて明らかになった遺伝子については「発現」 の欄に *で示した。 また、 IgE処理 細胞における、コントロール細胞に対する発現量の比が、 1.8以上または 0. 5以下であり、 かつコントロール細胞および IgE処理細胞の少なくとも 1つで 「発現している」 と判断さ れた場合に、 IgE処理により発現が変動する遺伝子と判断し、 「変動」 の欄に.1.8以上の 場合には「个」 0.5以下の場合には「φ」で示した。 IgE処理細胞の発現量の比 （A) を 1 としたときの IgE- Dex処理細胞の発現量の比 （B) の相対値 (B/A) を求め、 B/Aが 1.8以 上または 0.5以下であり、 かつ IgE処理細胞および IgE- Dex処理細胞の少なくとも 1つで 「発現している」 と判断された場合に、 グルココルチコイド処理により発現が変動する遺 伝子と判断し、 「変動」 の欄に 1.8以上の場合には「个」 0.5以下の場合には「 」で示 した。 第 1表
GPCR名 略称 塩基配列 アミノ酸配列 プローブ ID チ 補体第 3成分受容体 1 C3aRl 丽— 004054 Ρ一 004045 209906— at A システィニルロイコトリエン受容体 1 CysLTRl NMJ06639 Ρ— 006630 231747 at B
G蛋白質 殳型受容体 91 GPR91 應—033050 ΝΡ一 149039 223939— at B
G蛋白質 殳型受容体 34 GPR34 NM— 005300 Ρ— 005291 223620— at B
EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受
ΤΓ Ρ9 画 Π1 ^Α Ί u l〖 一 Λ 容條配列 2
? 2アドレナリン受容体 β ΐ NMJ00024 P_000015 206170— at A 血小板活性化因子受容体 PAFR ΝΜ— 000952 P— 000943 211661_x_at A アデノシン A2b受容体 A2b Μ— 000676 P— 000667 205891— at A
G蛋白質 ¾f殳型受容体 105 GPR105 丽—014879 NP— 055694 206637一 at A
7回膜貫通スーパ一ファミリ一 ·メンバ一 1 IM7SF1 腿— 003272 NP一 003263 204137— at' A
G蛋白質 殳型受容体 37 GPR37 U87460 AAC51281 209630一 s一 at A
CD97抗原 CD97 丽— 001784 NP一 001775 202910— s一 at A メラノコルチン 1受容体 MCI MJ02386 NP— 002377 205458一 at A
G蛋白質共役型受容体 FIRE FIRE Α画 700 配列番号 47 234675— x— at B フオルミルペプチド受容体 1 fMLPl NM— 002029 NP— 002020 205119—s— at A
G蛋白質^ 1殳型受容体 65 GPR65 丽— 003608 NP— 003599 214467— at A プロス夕グランジン E受容体 3 EP3
D38300 BAA07419 210374— x— at A . オルタナティブバリアント h varaint h
プリン受容体 P2Y8 P2Y8 丽— 178129 NP一 835230 229686— at . B プロスタグランジン E受容体 3 EP3 。 A オル夕ナティプノ、'リアント f variant f
ドーパミン受容体 D2 D2 S69899 AAB20571 216938一 x— at A 内皮分化リゾホスファチジン酸 丽 nm m MP ΠΠ1 Q9 ώυ¾ b d
G蛋白質 殳型受容体 2
ド一パミン受容体 D2 D2 ■—000795 NP— 000786 206590一 x—at A アデノシン A3受容体 A3 丽—000677 NPJ00668 206171— at A 補体第 5成分受容体 1 C5R1 NM— 001736 NP— 001727 220088— at A ォプシン 3 0PN3 丽—014322 NP— 055137 219032— x—at A
G蛋白質 殳型受容体 27 · GPR27 MJ18971 NP一 061844 221306— at A
G蛋白質 殳型受容体 44 CRTH2 MJ04778 NP— 004769 206361— at A 内皮分化スフインゴ脂質
,υ υ υ 一
G蛋白質 型受容体 1
フオノレミルぺプチド受容 ft¾ 2 FPRL2 MJ02030 NP— 002021 214560— at A プロス夕グランジン E受容体 2 EP2 MJ00956 NPJ00947 206631— at A
EGF様モジュ一ル含有ムチン様ホルモン受
EMR2 匪— 013447 NP— 038475 232009— at B 容ィ様配列 2
ケモカイン （C-Cモチーフ）受容体様 2 CCRL2 NMJ03965 NP— 003956 211434—s一 at A メ夕ボトロピックグル夕ミン酸受容体 6 mglu6 丽—000843 NP— 000834 208035— at A
Figure imgf000027_0001
6
Figure imgf000028_0001
第 2表 （つづき）
Figure imgf000029_0001
第 1表および第 2表にあげた GPCRのうち、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFR、 GPR105、 TM7SF1、 GPR37, CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPl, GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1ヽ FPRL2, CCRL2、 mglu6, CB2、 P2Y5、 P2Y4、 EP3 variant j、 A2a、 ETB、 CELSR2、 H4、 Hl、 CELSRlヽ GPR85、 HE 6, CELSR3, CALCRLヽ RRH、 EP4、 CCR1 および D5は、ヒト肥満細胞で発現していることが今回初めて明らかになつた GPCRである。 コントロール細胞と IgE処理細胞での発現量を比較することにより、 IgE受容体を介し てヒ ト肥満細胞を活性化した際に発現が変動する GPCRを同定した。 その結果、 GPR34, GP画、 P2Y8 EDG1 EP3 variant j A2a ETB H4 RE2および EP4は、 IgE受容体を介 した活性化により発現が変動することが今回初めて明らかになった。 IgE処理細胞で発現 が変動する GPCRは、 肥満細胞の活性ィ匕の制御に関与していると推定され、 それらの GPCR は、 肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として特に有用である。 IgE処理細胞と IgE+Dex処理細胞での発現量を比較することにより、デキサメタゾン処 理した際に発現が変動する GPCRを同定した。その結果、 C3aRl、GPR34、 ^2、GPR105、 M7SF、 fMLPl、 P2Y8S A3、 CRTH2、 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 EBI2、 PARI. H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4 は、 デキサメタゾン処理により、 発現が変動することが今回初めて明らかになった。 グル ココルチコィドは抗炎症効果を発揮する一方、 副作用も引き起こす。 デキサメタゾン処理 で発現が変動する GPCRは、グソレココルチコィドの薬効または副作用に関与する可能性が推 定され、それらの GPCRは、グルココルチコィドの薬効または副作用を制御する薬剤の標的 として有用である。 実施例 2 ヒト'末梢血由来肥満細胞を各 »件で培養した際に発現する GPCRの解析
( 1 ) ヒト末梢血由来肥満細胞の調製
ヒト末梢血由来肥満細胞は、公知の方法〔Blood， 97 , 1016 (2001 )〕によって調製した。 ヒト末梢血は、 インフォ一ムドコンセントに基づいて取得した。 以下、 簡単に方法を記載 する。
ヒト末梢血より肥満細胞の前駆細胞であるリ二ァ一ジ陰性の «球細胞を分画後、 無血 清のイスコフのメチルセルロース培地〔ステム ·セル ·テクノロジ一ズ社 (Stem Cell Technologies Inc . ) 製〕 と、 200 ng/mlの SCF、 50 ng/mlの IL- 6、 および 1 ng/mlの IL-3 を含む IMDMを用いて細胞を培養した。 培養 42日目にメチルセルロースを溶かじて細胞を 回収後、 100 ng/mlの SCF、 50 ng/mlの IL-6、 および 5%の FCSを含む IMDMで培養を継代 した。
( 2 ) IgE受容体を介した活性化処理をした肥満細胞の調製
上記（ 1 )で調製したヒト末梢血由来培養肥満細胞を、実施例 1の（ 2 )と同様にして、 ヒトミエローマ IgEの存在下で培養した後、 ゥサギ抗ヒト IgE抗体存在下または非存在下 で培養した。 ヒトミエロ一マ IgEとゥサギ抗ヒト IgE抗体で処理した細胞を IgE処理細胞 と呼び、 ヒト I gEのみで処理した細胞をコント口ール細胞と呼ぶ。
( 3 ) ジーンチヅプを用いた発現解析
ジーンチヅプ（ヒトゲノム U133Aプローブアレイ） を用いて、 上記 （2 ) で調製した肥 満細胞で発現する GPCRの解析を行った。方法は、実施例 1 ( 3 )に記載した方法を用いた。 各遺伝子については、 AD値の値が 100以上でかつフラヅグが「Present」である場合に、 「発現している」 と判断した。 コントロール細胞または IgE処理細胞で 「発現している」 と判断された遺伝子をヒト肥満細胞で発現している遺伝子とした。 ヒト末梢血由来培養肥 満細胞で発現が見られた GPCRの名称、 略称、 蛋白質のアミノ酸配列の NCBI蛋白質データ ペースの登録番号、 cDNAの塩基配列の NCBI塩基配列デ一夕ベースの登録番号、 ァフィメ トリヅクス社のプローブ IDを第 3表に示した。 またこれらの GPCRの解析結果を第 4表に 示した。各 GPCR遺伝子は第 3表の略称で示し、遺伝子発現量としてメディアン値で補正す る前の AD値を示した。 「F」の欄は AD値のフラヅグで Pは「Present」、 Mは「Merginal」、 Aは「Absent」 である。 「比」の欄はコントロール細胞に対する発現量の比を示した。 ヒ ト肥満細胞で発現していることが、 本発明により初めて明らかになった遺伝子については 「発現」 の欄に *で示した。 また、 IgE処理細胞における、 コントロール細胞に対する発 現量の比が、 1.8以上または 0.5以下であり、 かつコントロール細胞および IgE処理細胞 の少なくとも 1つで 「発現している」 と判断された場合に、 IgE処理により発現が変動す る遺伝子と判断し、 「変動」 の欄に 1.8以上の場合には 「个」 0.5以下の場合には 「 」 で示した。 O
GPCR名 略称 塩基配列 アミノ酸配列 プローブ ID 補体第 3成分受容体 1 C3aRl 雇—004054 PJ04045 209906一 at
EGF様モジュ一ル含有ムチン様ホルモン受容体様
EMR2 丽— 013447 PJ38475 207610一 s— at 配列 2
?2アドレナリン受容体 βΐ MM— 000024 MP— 000015 206170— at 血小板活性化因子受容体 PAFR M— 000952 NP— 000943 211661一 x— at アデノシン A 受容体 A2b 丽一 000676 PJ00667 205891— at
G蛋白質 殳型受容体 105 GPR105 丽— 014879 NP— 055694 206637— at
7回莫貫通スーパ一フアミリー ·メンバ一 1 TM7SF1 M— 003272 NP— 003263 204137一 at
G蛋 ή質 殳型受容体 37 GPR37 U87460 AAC51281 209630— s— at
CD97抗原 CD97 丽— 001784 NP— 001775 202910— s— at メラノコノレチン 1受容体 MCI MJ02386 NP— 002377 205458— at
G蛋白質 殳型^"容体 65 GPR65 NM_003608 NP 003599 214467— at プロス夕グランジン Ε受容体 3 EP3
D38300 BAA07419 210374— x— at オル夕ナティプパリアント h varaint h
プロス夕グランジン E受容体 3 EP3
D38298 AAC51281 2l0832_x_at オル夕ナティブパリアント f variant f
ド一パミン受容体 D2 D2 S69899 AAB20571 216938一 x— at 内皮分化リゾホスファチジン酸 G蛋白質共役型受
EDG2 顧一 001401 NP— 001392 204038— s一 at 容体 2
ド一パミン受容体 D 2 D2 NM— 000795 NP— 000786 206590_x_at 補体第 5成分受容体 1 C5R1 M— 001736 NPJ01727 220088— at アデノシン A3受容体 A3 腿— 000677 NP— 000668 206171— at 才プシン 3 0PN3 NM— 014322 PJ55137 219032— x— at
G蛋白質共役型受容体 27 GPR27 MJ18971 NP— 061844 221306_at 内皮分化スフィンゴ脂質 G蛋白質 殳型受容体 1 EDG1 丽—001400 NPJ01391 204642一 at プロス夕グランジン E受容体 2 EP2 腿—000956 PJ00947 206631一 at ケモカイン （C-Cモチーフ）受容体様 2 CCRL2 MJ03965 PJ03956 211434一 s— at メ夕ボトロピックグル夕ミン酸受容体 6 mgl 6 丽ー 000843 NP— 000834 208035一 at
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
第 4表 （つづき）
Figure imgf000034_0001
第 3表および第 4表にあげた GPCRのうち、 EMR2、 PAF S GPR105, TM7SF1, GPR37, CD97、 MCIヽ GP 65N EP3 variant h、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3, GPR27、 EDG1ヽ CCRL2, mglu6、 CB2、 GP 39, Alヽ P2Y4、 EP3 variant js A2a、 ETBヽ CELSR2、 TEM5、 GP 58, Motilin R、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5は、 ヒト肥満細胞で発現していることが今回初めて明らか になった GPCRである。実施例 1の（ 3 )に記載したように、 ヒト肥満細胞で発現する GPCR は、 肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として有用である。
コントロール細胞と IgE処理細胞での発現量を比較することにより、 IgE受容体を介し てヒト肥満細胞を活性化した際に発現が変動する GPCRを同定した。その結果、 C3aRl、^2、 PAFRS GPR105S TM7SF1、 GPR65, EDG2、 A3、 C5R1S EDG1、 GPR39, A2aヽ ETBヽ RE2N CELSR2S TEM5、 EP4および LTB4Rは、 IgE受容体を介した活性化により、発現が変動することが今回 初めて明らかになった。 IgE処理細胞で発現が変動する GPCRは、肥満細胞の活性化の制御 に関与して ると推定され、それらの GPCRは、肥満細胞が閧与する疾患の治療薬の標的と して特に有用である。 ( )定量的 RT-PCRによる発現解析
ジーンチップを用いた発現解析では、発現量が少ない GPCRの発現は検出できない可能性 があるため、定量的 RT-PCRを用いた発現解析も実施した。また、 ジーンチヅプにプローブ が載っていない GPCRに関して、 定量的 RT- PCRを用いた発現解析を実施した。 第 5表に今 回 RT- PCRで発現解析を行った GPCRの名称、略称、蛋白質のアミノ酸配列の NCBI蛋白質デ —夕べ一スの登録番号、 cDNAの塩基配列の NCBI塩基配列デ一夕ベースの登録番号、 遺伝 子特異的プライマーの配列番号を示した。
第 5表
Figure imgf000035_0001
上記（2 ) で調製した肥満細胞から、 RNイージー ·ミニ 'キヅト （キアゲン社製） を用 いて DNasel処理を加えて全 RNAを取得後、 スーパースクリブト RT- PCR用第 1鎖合成シス テム（インビトロジェン社製）を用いて一本鎖 cDNAを合成した。方法はキットの説明書に したがって行った。 プライマ一としては、 ォ'リゴ (dT)プライマ一を使用した。 全應 Al〃g から調製した一本鎖 cDNAを水で希釈し、全量を 2.1 mlとした。以下の定量的 RT- PCR解析 には、 さらに 20倍希釈した溶液を 10〃1使用した。
定量的 RT-PCRは下記のようにして行った。試薬は宝酒造社製のキヅト（For Real Time PCR TaKaRa Ex Taq R-PCR Version) を用いた。 10 lの上記一本鎖 cDNA、 2.0 1の 10 XR- PCRバッファ一 （Mg free )、 0.2 1の 250 mM Mg2+ solutionヽ 0.6 z lの dNTPs (10 腿 ol )、 1.0〃1の SYBRグリーン I (1/2500希釈） 、 各 1.5 〃1の遺伝子特異的プライ マ一 （4 〃mol/l )、 0.2 〃1の ExTaq R-PCR Version, および 3〃1の水からなる反応液を 調製後、 ABI配列検出システム （ABI PRISM 7700, アプライドバイオシステムズ社製） を 用いて PCRを行った。遺伝子特異的プライマーとしては.、 第 4表に示した配列番号 1〜46 の配列からなる DNAを使用した。反応条件としては、最初 94°Cで 5分間加熱後、 94°Cで 30 秒、 65°Cで 1分間、 72°Cで 30秒からなるサイクルを 45サイクル繰り返し、最後に 25°Cで 2分間加熱する条件を用いた。
発現量は、 パックグラウンド補正後のシグナル強度が 500に達する時のサイクル数 (Ct 値)で表した。ネガティブコントロールとして、一本鎖 cDNAの代わりに滅菌水を用いた PCR も行った。反応終了後、得られた PCR反応液より 5 μ\を分取し、 1.5%ァガロー ゲル〔シ —ケム （SeaKem) GTGァガロース （カンプレックス （CAMBREX)社製） をトリス （Tris) - 酢酸バッファー （40腿 ol/l トリス—酢酸、 1醒 ol八 エチレンジァミン 4酢酸） に溶かし て作製〕 にて電気泳動した。 ゲルを SYBRグリーン 1 10000倍希釈液にて 30分染色し、 フ ルオルイメージャ一〔FluorImagerヽ モレキュラー'ダイナミクス (Molecular Dynamics) 社製〕を用いて予想される DNA断片の増幅を確認した。一本鎖 cDNAを用いた際に予想され る DNA断片のみが増幅され、滅菌水を用いた際には該断片の増幅がな かつ一本鎖 cDNA を用いた際の Ct値が 39以下の場合に、 遺伝子発現があると判定した。結果を第 6表に示 す。 滅菌水を用いた際の Ct値が 39以下のものに関しては、 プライマ一のダイマー化に由 来する断片が増幅されために Ct値が低くなつたことを確認した。
第 6表
Figure imgf000037_0001
解析の結果、 GPR18S GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296、'GPR141、 hRUP16、 ITR、MRGX2、 SNORF33, C- THYMU2011548、 ' G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41、 GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HEOAD54、 hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLおよび H963が、 ヒト末梢血由来培養肥満細胞で発現していることが今回 初めて明らかになった。 GPR18、 P2Y10, GPR1 6, GPR41、 GPR43、 GPR68、 および H963は、 ジーンチップでは発現が検出できなかったが、 RT- PCR解析では発現が検出された。 これら のヒト肥満細胞で発現する GPCRは、肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として有用で める。
コントロール細胞と IgE処理細胞での発現量を比較することにより、 IgE受容体を介し てヒト肥満細胞を活性化した際に発現が変動する GPCHを同定することができる。
C - TESTI2027296、 GPR14 ITR、 MRGX2、 G10d、 GPR43、 GRPRヽ HEOAD54および H963は、 IgE 受容体を介した活性ィ匕により、 発現が変動 （Ct値が 1以上変動） することが今回初めて明 らかになつた。 IgE処理細胞で発現が変動する GPCRは、肥満細胞の活性ィ匕の制御に関与し ていると推定され、それらの GPCRは、肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として特に 有用である。 実施例 3 ヒト末梢血由来肥満細胞を各 件で培養した際に発現する GPCRの解析 ( 2 ) ( 1 ) 各種培養条件を用いた肥満細胞の調製 （LPS受容体を介した肥満細胞の活性化） 実施例 2の （1 ) に記載した方法で調製したヒト末梢血由来培養肥満細胞を、 30 ng/inl の IFN-ァ (R&Dシステムズ社製）の存在下または非存在下、 37°Cで 24時間培養した。次い で、 細胞を洗浄後、 100 ng/mlの LPS (Salmonella typhi murium由来、 シグマ一アルドリ ツチ社製)の存在下または非存在下、 37°Cで 2時間または 6時間培養した。 培養には、 100 ng/mlの SCF、 50 ng/mlの IL- 6、 および 5%の FCSを含む IMDMを使用した。
IFN-ァのみで処理した細胞を IFN-ァ処理細胞、 IFN-ァと LPSで処理した細胞を IFN-ァ +LPS処理細胞、 LPSのみで処理した細胞を LPS処理細胞、 IFN-ァと LPSで処理していない 細胞をコントロール細胞と呼ぶ。
( 2 ) ジ一ンチヅプを用いた発現解析
ジーンチップ（ヒト 'ゲノム U133Aプロ一プ 'アレイ） を用いて、 上記 （1 ) で調製し た肥満細胞で発現する GPCRの解析を行った。方法は、実施例 1 ( 3 )に記載した方法を用 いた。
各遺伝子については、 AD値の値が 100以上でかつフラッグが「Present」である場合に、 「発現している」 と判断した。 コントロール細胞、 IFN-ァ処理細胞、 LPS処理細胞および IFN-ァ +LPS処理細胞のいずれかで「発現している」 と判断された遺伝子をヒト肥満細胞で 発現している遺伝子とした。 ヒト末梢血由来培養肥満細胞で発現が見られた GPCRの名称、 略称、 蛋白質のアミノ酸配列の NCBI蛋白質データベースの登録番号、 cDNAの塩基配列の NCBI塩基配列デ一夕ペースの登録番号、 ァフィメトリヅクス社のプロ一ブ IDを第 7表に 示した。またこれらの GPCRの解析結果を 2時間培養した結果を第 8表に、 6時間培養した 結果を第 9表に示した。各 GPCR遺伝子は第 7表の略称で示し、遺伝子発現量としてメディ アン値で補正する前の AD値を示した。 「F」の欄は AD値のフラッグで Pは「Present」、 M は「Merginal」、 Aは「Absent」 である。 「比」 の欄はコントロール細胞に対する発現量 の比を示した。 ヒト肥満細胞で発現していることが、 本発明により初めて明らかになった 遺伝子については「発現」の欄に *で示した。 また、 各薬剤処理細胞における、 コント口 ール細胞に対する発現量の比が、 1.8以上または 0.5以下であり、 かつコントロール細胞 およぴ該薬剤処理細胞の少なくとも 1つで 「発現している」 と判断された場合に、 該薬剤 処理により発現が変動する遺伝子と判断し、 「変動」の欄に 1.8以上の場合には「个」 0.5 以下の場合には「 」 で示した。 第 7表
GPCR名 略称 塩基配列 アミノ酸配列 プローブ ID 補体第 3成分受容体 1 C3aRl 丽— 004054 NPJ04045 209906_at
EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体
EMR2 丽ー 013447 NPJ38475 207610—s— at 様配列 2
' ? 2アドレナリン受容体 βΐ NM— 000024 NPJ00015 206170— at 血小板活性化因子受容体 PAF NMJ00952 NPJ00943 211661— x— at アデノシン A2b受容体 A2b NMJ00676 NPJ00667 205891— at
G蛋白質共役型受容体 105 GPR105 NMJ14879 NPJ55694 206637— at
7回莫貫通スーパーフアミリー 'メンバ一 1 TM7SF1 M— 003272 NP— 003263 204137一 at
G蛋白質共役型受容体 37 GPR37 U87460 AAC51281 209630_s_at
CD97¾¾ ' - CD97 NM— 001784 NPJ01775 202910一 s— at メラノコルチン 1受容体 MCI M— 002386 NP— 002377 205458一 at
Gl^白 殳型受容体 65 GPR65 NM— 003608 NP— 003599 214467一 at プロス夕グランジン E受容体 3 EP3
D38300 BAA07419 210374一 x— at オル夕ナティブパリアント h varaint
プロス夕グラン ン E受容体 3 EP3
D38298 ' AAC51281 210832— x一 at オル夕ナティブパリアント f variant f
ド一パミン受容体 D2 D2 S69899 AAB20571 216938— x— at 内皮分ィ匕リゾホスファチジン酸
EDG2 M— 001401 ML001392 204038— s— at G蛋白質^ =殳型受容体 2
ド一ノ ミン受容体 D2 D2 M— 000795 PJ00786 206590一 x— at アデノシン A3受容体 A3 丽ー 000677 NPJ00668 206171— at 補体第 5成分受容体 1 C5R1 NM— 001736 NPJ01727 220088— at ォプシン 3 0PN3 雇—014322 NPJ55137 219032— x— at
G蛋白質 殳型受容体 27 GPR27 KM— 018971 PJ61844 221306— at
G蛋白質街殳型受容体 44 CRTH2 丽— 004778 NPJ04769 206361— at 内皮分化スフインゴ脂質
EDG1 NM— 001柳 NPJ01391 204642一 at G蛋白質 殳型受容体 1
プロス夕グランジン E受容体 2 EP2 M— 000956 PJ00947 206631— at ケモカイン （C- Cモチーフ）受容体様 2 CCRL2 NM— 003965 NPJ03956 211434— s— at メ夕ボトロピックグル夕ミン酸受容体 6 mglu6 劃一 000843 NPJ00834 208035— at 第 7表 （つづき）
GPCR名 略称 塩基配列 アミノ酸配列 プローブ ID カンナビノィド受容体 2 CB2 MJ01841 PJ01832 206586— at
G蛋白質受容体 39 GPR39 M— 001508 PJ01499 212909一 at プリン受容体 P2Y5 P2Y5 NMJ05767 PJ05758 218589一 at アデノシン A1受容体 A1 NMJ00674 NPJ00665 216220— s at ピリミジン受容体 P2Y4 P2Y4 MJ02565 PJ02556 221466— at プロス夕グランジン E受容体 3 · EP3 L27489 AAC133731 210831— s— at オル夕ナティブパリアント0 varinat j
アデノシン A2a受容体 A2a NMJ00675 NP 000666 205013— s— at
1型アンジォテンシン Π受容体 AT1B PJ00676 208016 s at
B型エンドセリン受容体 ETB MJ00115 PJ00106 204273— at ゴナドトロピン放出ホルモン受容体 GNRHR PJ00397 216341—s— at カドヘリン EGF LAG 7回膜貫通型受容体 2 CELSR2 NM 001408 PJ01399 204029— at ケモカイン （C-Cモチーフ）受容体 7 CCR7 NMJ01838 PJ01829 206337— at スロンビン 容体 PARI μ NMJ01992 PJ01983 203989 x at ヒス夕ミン受容体 Η4 H4 NMJ21624 PJ67637 221170— at
G蛋 ft質雜型受容体 12 GPR12 MJ05288 PJ05279 214558 at
G¾S質^ 受容体 RE2 RE2 MJ07369 PJ31395 214104— at 力ドヘリン EGF LAG 7回膜貫通型受容体 2 CELSR2 MJ01408 NP— 001399 36499一 at
G蛋白質微型受容体 32 GPR32 MJ01506 PJ01497 221469— at
G蛋白質離型受容体 58 GPR58 NMJ14626 PJ55441 221394— at カドヘリン EGF LAG 7回膜貫通型受容体 1 CELSRl 應— 014246 NPJ55061 41660— at モチリン受容体 Motilin R 丽—001507 PJ01498 215910— s— at カドヘリン EGF LAG 7回膜貫通型受容体 3 CELSR3 NMJ01407 PJ01398 40020— at 網膜色素上皮由来口ドプシンホモログ 丽 丽 J06583 NPJ06574 208314— at プロス夕グランジン E受容体 4 EP4 NMJ00958 NPJ00949 204897 at ケモカイン （C-Cモチーフ） 受容体 1 CCR1 NMJ01295 NPJ01286 205098— at ド一パミン受容体 D5 D5 NMJ00798 PJ00789 208486 at ケモカイン （C- X- Cモチーフ） 受容体 5 CXCR5 NMJ01716 PJ01707 228065 at
第 8表
3ン卜 Π - IFN-7+L PS処理
I FNマ処理細胞 LPS処理細胞
GPCR 発 ル細胞 細月
( ) 現
AD AD しレ 久 Λ Πノ: 久
値 レレ 久
i1 ί匕 比 AJJ π
恤 r tレレil 動 動 動
C3aRl 3277 Ρ 7493 P 1 .9 个 2898 P 1 , 1 5097 P 1 .5 腿 2 2315 Ρ 3104 P 1 , 1 3069 P 1.7 3694 P 1 .5 β ΐ 9336 Ρ 10866 P 1.0 6817 P 0.9 9917 P 1.0
PAFR * 990 Ρ 2103 P 1.8 个 2939 P 3 , 7 个 4009 P 3.8 个
A2b 753 Ρ 1810 .P ' 2.0 个 680 P 1.1 1332 P 1.7
GPR105 1352 Ρ 1032 P 0.6 764 P 0.7 693 P 0.5
TM7SF1 % 1473 Ρ 1932 P 1.1 1251 P 1.1 1555 P 1.0
GPR37 % 1446 Ρ 2326 P 1.4 1090 P 0.9 1054 P 0.7
CD97 % 1180 Ρ 4301 P 3.1 个 1984 P 2.1 个 4852 P 3.9 个
MCI % 1485 Ρ 1271 P 0.7 586 P .0.5 357 P 0.2
GPR65 % 1280 ρ · 1501 P 1.0 1315 , P 1.3 1704 P , 1 , 3
EP3
氺 1035 ρ . 1111 P 0.9 837 P 1.0 938 P 0.9 variant h
EP3
138 η7 Ρ 1205 P 0.7 1186 P 1.丄 1363 P 0.9 variant f
D2 % 463 Ρ . 379 P 0.7 327 P 0.9 353 P 0.7
EDG2 % 522 Ρ 3'87 P 0.6 ' 314 P 0.8 378 P 0.7
D2 441 Ρ 422 P 0.8 234 P 0.7 375 E 0.8
A3 % 593 Ρ 726 P 1.0 430 P 0.9 270 P 0.4
C5R1 % 278 Ρ 386 P 1.2 608 P 2.7 个 389 P 1.3 '
0PN3 % 168 Ρ 109 A 0.5 144 A 1.1 92 A 0.5
GPR 7 % 156 Ρ 153 P 0.8 208 P 1 , 7 200 P 1.2
CRTH2 % 172 A 384 P 1.9 个 280 A 2.0 280 P 1.5
EDG1 % 1213 Ρ 1229 P 0.9 963 P 1.0 420 P 0.3
EP2 198 Ρ 468 P 2.0 个 168 P 1.1 306 P 1.5
CCRL2 % 2767 Ρ 3705 P 1.1 1744 P 0.8 3251 P 1.1 mglu6 % 293 Ρ 347 P 1.0 152 P 0.6 360 P 1 :2 第 8表 （つづき）
3ントロ PS処理
I FN-ァ処理細胞 LPS処理細胞
GPC ール細胞
現 変 久 久
AD値 F AD値 F 比 AD値 F 比 AD値 F 比
CB2 137 A 233 P 1.4 211 A 1.9 236 M 1.6
GPR39 * 303 A 250 A 0.7 412 P 1.7 383 P 1 ..2
P2Y5 135 P 276 P 1.7 133 P 1.2 341 P 2.4 个
Al 252 A 250 P 0.8 184 P 0.9 235 P 0.9
Ρ2Υ4 167 A 87 A 0.4 108 A 0.8 170 M 1.0
ΕΡ3
776 P 866 P 0.9 838 P 1.3 720 P 0.9 variant j
A2a 656 P 428 P 0.6 1564 P 3.0 个 2517 P 3.6 个
AT1B 74 A 57 A 0.6 80 A 1.4 126 A 1.6
ETB 80 P 45 P 0.5 47 P 0.7 70 P 0.8
GNRHR 125 M 197 A 1.3 149 M 1.5 146 A 1.1
CELSR2 ネ 151 P 135 P 0.8 85 A 0.7 158 M 1 .0
CCR7 * 103 A 128 A 1.0 188 A 2.3 711 P 6.5 个
PARI 556 P 796 P 1.2 285 P 0.6 824 P 1.4
H4 70 A 183 P 2.2 个 93 A 1.7 120 P 1.6
GPR12 227 P 238 P 0.9 151 M 0.8 167 1 P 0.7
RE2 96 A 81 A 0.7 26 , k 0.3 43 A 0.4
CELSR2 82 A 103 A 1.1 75 A 1.1 123 A 1.4
GPR32 62 A 158 P 2.2 个 43 A 0.9 70 A 1.1
GPR58 ネ 117 A 74 A 0.5 93 A 1.0 111 P 0.9
CELSRl * 188 P 79 A 0.4 112 P 0.7 89 A 0.4
Motilin R 94 A 71 A 0.6 95 A 1.3 127 A 1.3
CELSR3 求 134 P 192 M 1.2 109 A 1.0 209 A 1.5
RRH 18 A 174 A 8.2 33 A 2.3 189 A 10.0
第 9表
3ン卜ロー IFN- 7+LPS処理
IFN-ァ処理細胞 LPS処理細胞
GPCR 発 ル雜胞 細胞
) 現
AD値 F AD値 F 比 AD値 F 比 AD値 F 上匕
C3aRl 3649 P 3261 P 1.0 1848 P 0.4 870 P 0.3
EMR2 1354 P 1295 P 1.1 1696 P 1.0 1244 P 1.1 j32 5116 P 4597 P 1.0 5837 P 0.9 3391 P 0.8
PAFR 2578 P 2093 P 0.9 3655 P 1.2 3434 P 1.6
A2b 647 P 630 P 1.1 653 P 0.8 586 P 1.1
GPR105 木 1183 P 867 P 0.8 986 P 0.7 450 P 0.4
TM7SF1 * 862 P 641 P 0.8 820 P 0.8 601 P 0.8
GPR37 水 1043 P 711 P 0.8 1197 P 1.0 601 P 0.7
CD97 1164 P 858 P 0.8 1014 P 0.7 1185 P 1.2
MCI 743 P 529 P 0.8 463 P 0.5 372 P 0.6
GPR65 * 712 P 726 P 1.2 789 P 0.9 760 P 1.3
EP3
氺 415 P 424 P 1.2 560 P 1.1 331 P 0.9 variant h
EP3
654 P 570 P 1 , 0 662 P 0.8 548 P 1.0 variant f
D2 · 木 506 P 527 P 1.2 447 P 0.7. 322 P 0.7
EDG2 木 215 P 335 P 1.8 个 399 P 1.5 211 P 1.2
D2 429 •P 436 P 1.1 452 P 0.9 581 P 1.6
A3 575 P 347 P 0.7 562 P 0.8 378 P 0.8
C5R1 151 A 84 P 0.6 83 A 0.5 77 A 0.-6
0PN3 * 145 P 123 A 1.0 131 P 0.7 97 M 0.8
GPR27 木 187 P 197 P 1.2 346 P 1.5 112 P 0.7
CRTH2 57 A 6 A 0.1 11 A 0.2 6 A 0.1
EDG1 ネ 602 P 237 P 0.4 420 P 0.6 144 P 0 , 3
EP2 126 P 231 P 2.1 个 110 P 0.7 171 P 1 , 6
CCRL2 木 995 P 668 P 0.8 761 P 0.6 439 P 0.5 mglu6 ネ 189 p 194 P 1.2 330 P 1.5 137 P 0.9 第 9表 （つづき）
Figure imgf000044_0001
第 7表、第 8表および第 9表にあげた GPCRのうち、 EMR2, PAFR、 GPR105, TWSF1、 GPR37、 CD97、 MC1、 GPR65N EP3 variant hN D2、 EDG2、 A3、 C5R1 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 CCRL2、 mglu6 CB2 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant j、 A2a、 AT1B ETB GNRHR CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 GPR32, GPR58、 CELSR1、 Moti lin R、 CELSR3, RRH、 EP4、 CCRl D5およ び CXCR5は、 ヒト肥満細胞で発現していることが今回初めて明らかになった GPCRである。 これらのヒト肥満細胞で発現する GPCRは、肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として 有用である。 '
コントロール細胞と IFN-ァ処理細胞での発現量を比較することにより、 IFN-ァ受容体を 介してヒト肥満細胞を活性ィ匕した際に発現が変動する GPCRを同定した。その結果、 C3aRl、 PAFR、 A2b、 CD97、 EDG2、 0PN3、 CRTH2、 EDG1ヽ EP2、 H4、 GPR32および CELSR1は、 IFN- y 受容体を介した活性ィ匕により、 発現が変動することが今回初めて明らかになった。 IM-ァ 処理細胞で発現が変動する GPCRは、 肥満細胞の活性ィ匕の制御に関与していると推定され、 それらの GPCRは、 肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として特に有用である。
コントロール細胞と LPS処理細胞での発現量を比較することにより、 LPS受容体を介し-' てヒト肥満細胞を活性化した際に発現が変動する GPCRを同定した。その結果、 C3aRl、PAFR、 CD97、 MC1、 C5R1ヽ A2a、 AT1Bヽ CELSR2, CCR7および EP4は、 LPS受容体を介した活性ィ匕に より、 発現が変動することが今回初めて明らかになった。 LPS処理細胞で発現が変動する GPCRは、 肥満細胞の活性化の制御に関与していると推定され、 それらの GPCRは、 肥満細 胞が関与する疾患の治療薬の標的として特に有用である。
コントロール細胞と IFN-ァ +LPS処理細胞での発現量を比較することにより、 IFN-ァ受容 体と LPS受容体の両方を介してヒト肥満細胞を活性化した際に発現が変動する GPCRを同定 した。その結果、 C3aRl、 PAFR、 GPR105、 CD97、 MC1、 A3、 0PN3、 EDG1、 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 CCR7、 RE2、 CELSR2、 CELSR1および EP4は、 IFN-ァ受容体と LPS受容体の両方を介した活 性ィ匕により、発現が変動することが今回初めて明らかになった。 IFN-ァ +LPS処理で発現が 変動する GPCRは、肥満細胞の活性化の制御に関与していると推定され、それらの GPCRは、 肥満細胞が関与する疾患の治療薬の標的として特に有用である。
LPS処理細胞と IFN-ァ +LPS処理細胞での発現量を比較することにより、 LPS受容体を介 したヒト肥満細胞の活性化に及ぼす IFN-ァの影響を調べることができる。 CD97、 A2aおよ び CCR7は、 LPS単独刺激でも発現が増加するが、 IFN-ァで前処理しておくとさらに発現が 増加することが今回初めて明らかになった。一方、 MC1は、 LPS単独刺激でも発現が減少す るが、 IFN- γで前処理しておくとさらに発現が減少することが今回初めて明らかになつた。 これらの GPCRは、肥満細胞の活性ィ匕の制御に深く関与していると推定され、肥満細胞が関 与する疾患の治療薬の標的として特に有用である。 実施例 4 IgE受容体を介したヒト肥満細胞の活性化に及ぼす HEOAD54のァゴニス卜の作用 ( 1 ) IgE受容体を介したヒト末梢血由来肥満細胞の活性ィ匕に及ぼす HEOAD54のァゴニスト の作用
5 -ォキソ - 6E, 8Z，11Z，14Z-エイコサテトラェン酸（以下 5- oxo- ETEと略す）は HEOAD54のリ ガンドであり、 ァゴニストとして作用することが最近明らかになった 〔J. Biol . Chem.， 277, 31459 (2002 )； Mol . Pharmacol . , 63 > 471 (2003 )〕。実施例 2 ( 4 ) において、 HEOAD54 がヒト末梢血由来肥満細胞で発現していることが判明したことから、 5 - oxo- ΕΤΕのヒト末梢 血由来肥満細胞の活性化に及ぼす作用を検討した。 ヒト末梢血由来肥満細胞の調製と培養 は、 実施例 2に記載した方法で行った。
l〃g/mlのヒトミエローマ IgE (コスモバイオ社製)、 100 ng/mlの SCF、 50 ng/mlの IL-6、 および 5%の FCSを含む IMDM中にヒト末梢血由来肥満細胞を 2.5 x 105個/ mlになるように調 製し、 96ゥエル 'プレートに 1ゥエル当たり 100 dずつ分注し 37°Cで 24時間培養した。遠心 分離により培地を除き、タイロード (Tyrode)緩衝液（126.1腿 ol/l NaCl、 4.0腿 ol KC1ヽ 1 , 0 腿 ol/l CaCl2、 0.6 墮 ol/l MgCl2、 0.6 醒 ol/l K¾P04、 10 應 HEPES、 5.6 mmol/1 D - グルコース、 0.1%ゥシ血清アルブミン、 pH7.4) で洗浄後、 100〃1の夕イロ一ド緩衝液を 加えて 37°Cで 30分間インキュベートした。 次いで最終濃度 1.5 zg/mlのゥサギ抗ヒト IgE抗 体〔ダコ （Dako)社製〕 を加え、 さらに 37°Cで 30分間インキュベートし、 脱顆粒を誘導し た。 遠心により上清を回収し、 ヒスタミン ·ィムノアヅセィ 'キヅト 〔ィムノテック (Immunotech)社製〕 を用いて上清中のヒスタミン量を測定することにより、 «粒の程 度を測定した。 ゥサギ抗ヒト IgE抗体を添加しないで同様の実験を行うことにより、 IgE受 容体を介した刺激がないときの自発的なヒス夕ミンの放出量を測定した。 また、 ゥサギ抗 ヒ HgE抗体の代わりに最終濃度 1%のトリトン（Triton) X- 100 (ナカライテスク社製）を 添カロして同様の実験を行うことにより、 ヒト末梢血由来肥満細胞中の全ヒスタミン量を測 定した。 '
上記において、抗ヒト IgE抗体添加の前に加えるタイ口一ド緩衝液の代わりに、各種濃度 の 5- 0X0- ETE〔ケィマン（Cayman)社製〕を含むタイ口一ド緩衝液を用いた場合の上清中に 放出されたヒスタミン量を測定することにより、 脱顆粒に及ぼす 5-0X0- ETEの影響を調ぺ た。使用した 5-0X0- ETEの濃度と脱顆粒の程度を第 10表に示した。脱顆粒の程度は、全ヒス 夕ミン量に対する上清中に放出されたヒス夕ミン量の割合（％)で示した。 第 10表に示す ように、 5-0X0-ETEは、 IgE受容体を介した肥満細胞の脱顆粒を抑制することがわかった。
第 10表 .
Figure imgf000046_0001
( 2 ) IgE受容体を介したヒト肥満細胞株 LAD2の活性ィ匕に及ぼす HEOAD54のァゴニストの作 用
LAD2は最近樹立されたヒト肥満細胞株で、 ヒト肥満細胞の性質をよく保持していること が知られている CLeuk. Res . , 27, 671 (2003 ) ; Leuk. Resつ 27, 677 (2003 )〕。 そこで、 5-oxo-ETEがヒト肥満細胞株 LAD2の活性化に及ぼす作用について検討した。 LAD2は、 100 ng/mlの SCFを含む Stem Pro- 34培地〔インビトロジェン （Invitrogen)社製〕で培養し'た。 LAD2は、 National Institute of Allergy and Infectious Diseases , National Institutes of Health (Bethesda, MD 20892-1881 , USA)より入手した。
l^g/mlのピオチン結合ヒトミエロ一マ IgE (コスモバイオ社製） および 100 ng/mlの SCF を含む Stem Pro-34培地中に LAD2を 2. 5 X 105個/ mlになるように調製し、 96ゥエル ·プレー トに 1ゥヱル当たり 100 lずつ分注し 37°Cで 24時間培養した。 遠心分離により培地を除き、 タイロード緩衝液で洗浄後、 100〃1のタイロード緩衝液を加えて 37°Cで 30分間ィンキュベ —トした。 次いで最終濃度 10〃g/mlのストレプトアビジン一フィコエリスリン 〔BDファー ミンジェン （BD PharMingen)社製、 以下ストレプトアビジン一 PEと略す〕 を加え、 さらに 37°Cで 30分間インキュベートし、 脱顆粒を誘導した。 遠心分離により上清を回収し、 ヒス 夕ミン ·ィムノアヅセィ ·.キットを用いて上清中のヒスタミン量を測定することにより、 脱顆粒の程度を測定した。 ストレプトアビジン— PEを添カ卩しないで同様の実験を行うこと により、 IgE受容体を介した刺激がないときの自発的なヒス夕ミンの放出量を測定した。ま た、 ストレプトアビジン一 PEの代わりに最終濃度 1%のトリ トン X-100を添カ卩して同様の実 験を行うことにより、 LAD2中の全ヒス夕ミン量を測定した。
上記において、ストレブトァビジン一 PE添加の前に加える夕イロ一ド緩衝液の代わりに、 各種濃度の 5-OXO- ETEを含むタイ口一ド緩衝液を用いた場合の上清中に放出されたヒス夕 ミン量を測定することにより、 脱顆粒に及ぼす 5- oxo-ETEの影響を調べた。 使用した 5 - 0X0- ETEの濃度と JW粒の程度を第 11表に示した。 S½ S粒の程度は、全ヒス夕ミン量に対 する上清中に放出されたヒスタミン量の割合 (%) で示した。
第 11表
Figure imgf000047_0001
上記 （1 )、 （2 ) の結果から、 5-oxo-ETE処理により、 IgE受容体刺激によるヒト末梢血 由来肥満細胞および LAD2の脱顆粒が抑制されることが明らかになった。 したがって、 5- oxo-ETEおよび HEOAD54のァゴニストは、 IgE受容体刺激によるヒト肥満細胞の活性ィ匕を抑 制する薬剤になると考えられる。
同様にして、 他の GPCRのァゴニストの作用を測定することにより、 各 GPCRのァゴニスト またはアン夕ゴニストが、 IgE受容体刺激によるヒト肥満細胞の活性ィ匕を抑制するかどうか 調べることができる。 ヒト肥満細胞の活性化は、 脱顆粒の代わりに、 TNF-ひや GM-CSF等の サイトカイン産生、 IL-8、 1-309、 MIP- 1ひ等のケモカイン産生、 LTC4、 LTD4、 LTE；、 PGD2 等の炎症メディェ一夕一産生等を測定することによつても調べることができる 〔Blood 100. 3861 (2002)〕。 ヒト末梢血由来肥満細胞や LAD2の代わりに、 ヒト臍帯血由来肥満細胞、 ヒトの肺、 皮膚、 扁桃から調製した肥満細胞を用いることもできる。 実施例 5 各種 GPCRのァゴニストがヒト肥満細胞の活性化に及ぼす作用
実施例 1〜 3においてヒト肥満細胞で発現することが明らかになつた GPCRのァゴ. -スト の LAD2に対する作用を検討した。 ( 1 ) IgE受容体を介したヒト肥満細胞の活性ィ匕に及ぼす各種 GPCRのァゴニストの作用 LAD2は実施例 4に記載した方法で培養した。 のヒトミエローマ IgEと 100 ng/ml の SCFを含む Stem Pro- 34培地中に LAD2を 2. 5 X 105個/ mlになるように調製し、 37°Cで 24時間 培養した。遠心分離により培地を除き、 タイロード緩衝液で洗浄した後、 タイロード緩衝 液を添加して 4.0 X 105個/ mlになるように調製し、 96ゥエル 'プレートに 1ゥヱルあたり 50 〃1ずつ分注した。 次いで、 50〃1の夕イロ一ド緩衝液を加えて 37°Cで 30分間インキュぺ一 トした後、最終濃度 10〃g/mlのゥサギ抗ヒト IgE抗体（ダコ社製）を加え、 さらに 37°Cで 20 分間ィンキュベ一トし、脱顆粒を誘導した。遠心により上清を回収し、上清中の/?-へキソ サミニダーゼ活性を測定することにより、脱顆粒の程度を測定した。 ^-へキソサミニダ一 ゼ活性は、 回収した上清 に、 40删 ol /1クヱン酸緩衝液 (pH 4 , 5) に溶解した 4腿 ol/l P-ニトロフエニル N-ァセチル- -グルコサミニド (シグマ社製) を 50〃1を加え、 37°Cで 1 時間インキュベート後、 0, 2 mol/1グリシン （pH 10.7) を 100 d加えたサンプルの 405 nra における吸光度をプレートリーダー 1420 ARVOsx (パーキンエルマ一社製）を用いて測定し た。 ゥサギ抗ヒト IgE抗体を添加しないで同様の実験を行うことにより、 IgE受容体を介し た刺激がないときの自発的な ^-へキソサミニダーゼの放出量を測定した。また、ゥサギ抗 ヒト IgE抗体の代わりに最終濃度 1%のトリトン X- 100を添加して同様の実験を行うことに より、 LAD2中の全 -へキソサミニダーゼ活性を測定した。
上記において、抗ヒト IgE抗体添加の前に加えるタイ口一ド緩衝液の代わりに、第 12表に 示す各種濃度の GPCRのァゴニストを含むタイロード緩衝液を用いた場合の上清中に放出さ れた/?-へキソサミニダ一ゼ活性を測定することにより、脱顆粒に及ぼす各ァゴニストの影 響を調べた。ただし、 GPR34のァゴニストとしてリゾホスファチジルセリンを使用した実験 においては、ァゴニストを含むタイ口一ド試薬を加えた後のィンキュベーシヨンは 10分間、 ゥサギ抗ヒト IgE抗体の最終濃度は 15〃g/ffllで行った。使用した GPCRァゴニストと濃度、お よびそれらを用いた時の β粒の程度を第 12表に示した。脱顆粒の程度は、全/? -へキソサ ミニダーゼ活性に対する上清中の/?-へキソサミニダーゼ活性の割合（％) で示した。
第 12表
Figure imgf000049_0001
以上の結果から、 A2aのァゴニスト処理により、 IgE受容体刺激による LAD2の脱顆粒が抑 制されることが明らかになった。 したがって、 A2aのァゴニストは、 IgE受容体刺激による ヒト肥満細胞の活性化を抑制する薬剤になると考えられる。
一方、 D2、 D5ヽ GPR91、 GPR105、 GPR43, Hl、 H4、 GPR34、 EP3 varaint h, EP3 variant f EP3 varaint _j、 EP2または EP4のァゴニスト処理により、 IgE受容 <f本刺激による LAD2の脱顆 粒が増強されることが明らかになった。 したがって、 D2、 D5、 GPR91、 GPR105、 GPR43, HIヽ H4、 GPR34、 EP3 varaint h、 EP3 variant f、 EP3 varaint j、 EP2または EP4のアン夕ゴニ ストは、 IgE受容体刺激によるヒト肥満細胞の活性ィ匕を抑制する薬剤になると考えられる。 同様にして、 他の GPCRのァゴニストの作用を測定することにより、 各 GPCRのァゴニスト またはアン夕ゴニストが、 IgE受容体刺激によるヒト肥満細胞の活性化を抑制するかどうか 調べることができる。 ヒト肥満細胞の活性化は、 脱顆粒の代わりに、 TNF-ひや GM- CSF等の サイドカイン産生、 IL-8、 1-309、 MIP- 1 等のケモカイン産生、 LTC4、 LTD4、 LTE4、 PGD2 等の炎症メデイエ一夕一産生等を測定することによつても調べることができる 〔Blood 100 > 3861 (2002)〕。 LAD2の代わりに、 ヒ小臍帯血由来肥満細胞、 ヒト末梢血由来肥満細胞、 ヒトの肺、 皮膚、 扁桃から調製した肥満細胞を用いることもできる。
( 2 ) ヒト肥満細胞の活性ィ匕に及ぼす各種 GPCRのァゴニストの作用
1 zg/mlのヒトミエロ一マ IgEと 100 ng/mlの SCFを含む Stem Pro-34培地中に LAD2を 2. 5 x 10δ個 /mlになるように調製し、 37°Cで 24時間培養した。 遠心により培地を除き、 夕イロ一 ド緩衝液で洗浄した後、 タイ口一ド緩衝液を添加して 2 . 0 X 105個 /mlになるように調製し、 96ゥエル 'プレートに 1ゥエルあたり 100〃1ずつ分注した。次いで、各種濃度の第 13表に示 す GPCRのァゴニストを添加したタイロード緩衝液を加えて 37°Cで 20分間ィンキュベ一トし た。遠心により上清を回収し、上清中の/?-へキソサミニダーゼ活性を測定することにより、 各 GPCRのァゴニストの単独刺激による脱顆粒の程度を測定した。^-へキソサミニダーゼ活 性は実施例 5 ( 1 ) と同様にして測定した。 GPCRのァゴニストを添カ卩しないで同様の実験 を行うことにより、 自発的な ?-へキソサミニダーゼの放出量を測定した。また、 GPCRァゴ ニストの代わりに最終濃度 1%のトリトン X- 100を添カ卩して同様の実験を行うことにより、 LAD2中の全/? -へキソサミニダーゼ活性を測定した。
使用した GPCRァゴニストと最終濃度、 およびそれらを用いた時の脱顆粒の程度を第 13表 に示した。脱顆粒の程度は、 全^-へキソサミニダーゼ活性に対する上清中の/?-へキソサ ミニダ一ゼ活性の割合 (%) で示した。
第 13表
Figure imgf000051_0001
以上の結果から、 A2aのァゴニストは、 LAD2の脱顆粒を誘導しないことが明らかになつた。 一方、 EP2、 EP3 variant h、 EP3 variant f、 EP3 variant js EP4、 PAFR ETB EDG2また は GPR34のァゴニスト処理により、 LAD2の脱顆粒が誘導されることが明らかになった。した がって、 EP2、 EP3 variant h、 EP3 variant f EP3 variant j EP4、 PAFR、 ETB、 EDG2ま たは GPR34のアン夕ゴニストは、 ヒト肥満細胞の活性化を抑制する薬剤になると考えられ る o
同様にして、 他の GPCRのァゴニストの作用を測定することにより、 各 GPCRのァゴニスト またはアン夕ゴニス卜が、 IgE受容体刺激によるヒト肥満細胞の活性化を抑制するかどうか 調べることができる。 ヒト肥満細胞の活性化は、 脱顆粒の代わりに、 TNF-ひや GM- CSF等の サイ トカイン産生、 IL- 8、 1-309、 MIP-Ι α等のケモカイン産生、 LTC4、 LTD4、 LTE4、 PGD2 等の炎症メディエー夕一産生等を測定することによつても調べることができる 〔Blood 100 , 3861 (2002)〕。 LAD2の代わりに、 ヒト臍帯血由来肥満細胞、 ヒト末梢血由来肥満細胞、 ヒトの肺、 皮膚、 扁桃から調製した肥満細胞を用いることもできる。
上記 （1 )、 ( 2 ) および実施例 4の結果から、 ヒト肥満細胞で発現する GPCRに作用する 化合物 （ァゴ二スト、 アン夕ゴニスト、 機能修飾物質） や抗体、 該 GPCRの発現を制御する 化合物、 抗体、 siRNA、 またはアンチセンス DNA、 あるいは該 GPCRのシグナル伝達を制御す る化合物、 抗体、 siRNA、 またはアンチセンス DNAは、 下記の （b ) 〜 （j ) のいずれかの 医薬として有用と考えられる。
( b ) ヒト肥満細胞の活性化抑制剤
( c ) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メデイエ一夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカィン産生抑制剤
( g) アトピー性皮膚炎の治療薬
( h) 喘息の治療薬
( i )慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) アレルギー性疾患の治療薬 産業上の利用可能性
本発明により、ヒト肥満細胞で発現する GPCRが同定され、これらの GPCRを標的とした、 ヒト肥満細胞の活性ィ匕抑制剤およびアトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患等のァレ ルギー性疾患の治療薬、 ならびにそのスクリーニング法が提供される。
「配列表フリーテキスト」
配列番号 1—発明者：斎藤博久 岡山吉道
発明者：柏倉淳ー 三浦和美；大林正也
発明者：吉田哲郎 佐々木克敏

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 システィニルロイコトリエ ン受容体 1 (CysLTRl)、 G蛋白質共役型受容体 91 (GPR91 、 G蛋白質共役型受容体 34 (GPR34)、 EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様配列 2 (EMR2)、 血小板活性 化因子受容体 (PAFR)、 G蛋白質共役型受容体 105 (GPR105)、 7回膜貫通スーパーファ ミリ一 'メンバ一 1 (TM7SF1)、 G蛋白質共役型受容体 37 (GPR37)、 CD97抗原 (CD97)、 メラノコルチン 1受容体 (MCI)、 G蛋白質共役型受容体 FIRE (FIRE) 、 フオルミルぺプ チド受容体 1 (fMLPl)、 G蛋白質共役型受容体 65 (GPR65)、 プロスタグランジン E受容 体 3オル夕ネイティブバリアント h(EP3 variant h)、 プリン受容体 P2Y8 (P2Y8) 、 ド一パ ミン受容体 D2 (D2) 、 内皮分化リゾホスファチジン酸 G蛋白質共役型受容体 2 (EDG2)、 アデノシン A3受容体 (A3)、補体第 5成分受容体 1 (C5R1)、 ォプシン 3 (0PN3)、 G蛋 白質共役型受容体 27 (GPR27)、 G蛋白質共役型受容体 44 (CRTH2)、 内皮分化スフインゴ 脂質 G蛋白貲共役型受容体 1 (EDG1)、 フオルミルペプチド受容体様 2 (FPRL2)、 ケモカ ィン（C- Cモチーフ）受容ィ 2 (CCRL2),メ夕ボトロピヅクグル夕ミン酸受容体 6 (mglu6)s カンナビノィド受容体 2 (CB2)、 G蛋白質共役型受容体 39 (GPR39)、 プリン受容体 P2Y5 (P2Y5) 、 アデノシン M受容体 (A1) 、 ピリミジン受容体 P2Y4 (P2Y4) 、 プロスタグラ ンジン E受容体 3オル夕ネィティブバリアン 1、 j (EP3 variant j )、 アデノシン A2a受容体 (A2a)、 1型アンジォテンシン受容体 (AT1B)、 B型エンドセリン受容体 (ETB) 、 ゴナ ドトロピン放出ホルモン受容体 (GNRHR) 、 カドヘリン EGF LAG 7回貫通 G型受容体 2 (CELSR2)、 ケモカイン（C- Cモチーフ）受容体 7 (CCR7)、 ヒスタミン受容体 H4 (H4)、 G蛋白質共役型受容体 12 (GPR12) 、 ヒスタミン受容体 HI (HI)、 G蛋白質共役型受容体 32 (GPR32)、 腫瘍内皮細胞マ一力一 5 (TEM5)、 G蛋白質共役型受容体 58 (GPR58)、 力 ドヘリン EGF LAG 7回貫通 G型受容体 1 (CELSR1)、 G蛋白質共役型受容体 85 (GPR85)、 モチリン受容体 (Motilin R)、 G蛋白質共役型受容体 64 (HE6) 、 カドヘリン EGF LAG 7 回貫通 G型受容体 3 (CELSR3)、 カルシトニン受容体様 (CALCRL) 、 網膜色素上皮由来口 ドプシンホモログ（RRH)、 G蛋白質共役型受容 i本 18 (GPR18)、 G蛋白質共役型受容体 35 (GPR35) 、 プリン受容体 P2Y10 (P2Y10)、 FLJ40279 (C-TESTI2027296)、 G蛋白質共役 型受容体 141 (GPR141)、 精巣下降関連 G蛋白質共役型受容体 (hRUP16)、 内翻巴厚関連 受容体（ITR)、 G蛋白質共役型受容体 MRGX2 (MRGX2)、 トレ一スァミン受容体 1 (SNORF33)、 7回膜貫通受容体 CBRC7TMJ75 (C-THYMU2011548)、 アドレノメデユリン受容体 (GlOd)、 G蛋白質共役型受容体 107 (GP 107)、 G蛋白質共役型受容体 126 (GPR126)、 G 蛋白質共役型受容体 41 (GPR41)、 G蛋白質共役型受容体 43 (GPR43)、 G蛋白質共役型受 容体 68 (GPE68) 、 ガストリン放出ペプチド受容体 (GRPR)、 G蛋白質共役型受容体 1019 (HEOAD54) 、 推定 G蛋白質共役型突容体 hGPCRlO (hRUP9)、 JI プロゲスチン受容体ひ (fflPRa)、膜型プロゲスチン受容体ァ （mPRg)、推定 G蛋白質共役型受容体 GPCRi.(SRL)、 血小板活性ィ匕受容体ホモログ H963 (H963) 、 プロスタグランジン E受容体 4 (EP4)、 ケモ 力イン （C-Cモチーフ） 受容体 1 (CCR1)、 ド一パミン受容体 D5 (D5)、 ロイコトリェン B4 受容体 (LTB4R)およびケモカイン （C-X- Cモチーフ）受容体 5 (CXCR5)からなる群から選 ばれる受容体を発現する細胞または該細胞の膜画分と試験物質とを接触させる工程を含む、 該受容体に作用し、かつヒト肥満細胞に対し（a)アポトーシス誘導、 ( b )活性化抑制、 ( c ) 脱顆粒抑制、 ( d ) 炎症性メディエー夕一産生抑制、 ( e ) サイトカイン産生抑制 および （f ) ケモカイン産生抑制のうちの少なくとも 1つの作用を示す物質のスクリ一二 ング方法。
2 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 GPR34、 PAFR、 GPR105、 TM7SF1, GPR65、 P2Y8、 EDG2、 A3、 C5R1、 EDG1ヽ GPR39、 EP3 variant jヽ A2aヽ ETB、 H4、 CELSR2、 TEMffヽ
C-TESTI2027296, GPR141, ITR、 MRGX2S G10d、 GPR43, GRPRS HEOAD54s H963、 EP4お び LTB4Rからなる群から選ばれる、 ヒト肥満細胞を IgE受容体を介した活性化刺激すること により発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリーニング方法。
3 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 PAFR、 CD97、 MC1、 C5R1、 A2a、 AT1B、 CELSR2, CCR7'および EP4からなる群から選ばれる、 ヒト肥満細胞をリポポリサヅカ ライド刺激することにより発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリーニング 方法。
4 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 PAFR、 A2b、 CD97、 EDG2、 0PN3、 CRTH2、 EDG1、 H4、 GPR32および CELSRlからなる群から選ばれる、 ヒト肥満細胞をイン夕 —フエロンァ刺激することにより発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリ一 ニング方法。
5 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 PAFR、 GPR105、 CD97、 MC1、 A3、 0PN3、 EDG1ヽ CCRL2、 P2Y5、 A2a、 CCR7、 CELS 2, CELSRlおよび EP4からなる群から選ばれ るヒト肥満細胞をイン夕一フエロンァおよびリポポリサヅカライドで共刺激することによ り発現が変動する受容体である請求項 1に記載のスクリ一ニング方法。
6 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体が、 GPR34, GPR105 TM7SF, fMLPl、 P2Y8、 A3、 C腿 2、 GCRL2, P2Y5、 A2a、 Η4、 CALCRLおよび ΕΡ4からなる群から選ばれるヒ ト肥満細胞をグルココルチコィド処理することによりで発現が変動する受容体である請求 項 1に記載のスクリーニング方法。
7 . ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコィドの刺激により発現量が変動する G 蛋白質共役型受容体である、 補体第 3成分受容体 1 (C3aRl)、 GP 34, アドレナリン受 容体 ( ?2)、 GPR105、 TM7SF、 fMLPl, P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 ェプスタイ ン―バ一ウィルス誘導遺伝子 2 (EBI2) 、 スロンピン受容体 (PARI) 、 H4S G蛋白質共役 型受容体 RE2 (RE2 )、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受容体を発現する細胞ま たは該細胞の膜画分と試験物質とを接触させる工程を含む、 該受容体に作用し、 グルココ ルチコィ ド作用を制御できる物質のスクリーニング方法。
8 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、GPR91、GPR34、EMR2、 PAFRs GP画、 M7SFU GPR37、 CD97、 MCI, FIREヽ fMLPl, GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2, A3、 C5R1ヽ 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1ヽ FPRL2、 CC L2, mglu6、 CB2、 GPR39S P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant jN A2aヽ AT1Bヽ ETB、 GN腿、 CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32ヽ TEM5S GPR58、 CELSRlヽ GPR85、 Motilin Rヽ HE6、 CELSR3, CALCRL, RRHヽ GPR18、 GPR35, P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2, SNORF33、 C-THYMU2011548, G10d、 GPR107、 GPR126, GPR41、 GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HEOAD54、 hRUP9、 mPRaヽ raPRg, SRLヽ H963 EP4、 CCR1ヽ D5s LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニ ストまたは機能修飾物質を用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a)アポト一シスの誘導、 ( b ) 活性化の抑制、 （c ) 脱顆粒の抑制、 （d ) 炎症性メデイエ一夕一の産生抑制、 （e ) サ イト力インの産生抑制および （f ) ケモカインの産生抑制のうちの少なくとも 1つを行う 方法。
9 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である A2aまたは HEOAD54に対する ァゴニストを用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a) アポト一シスの誘導、 （b )活性化の 抑制、 （c )脱顆粒の抑制、 ( d) 炎症性メデイエ一夕一の産生抑制、 ( e ) サイトカイ ンの産生抑制および （f ) ケモカインの産生抑制のうちの少なくとも 1つを行う方法。
1 0 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 GPR91、GPR34、PAFR、GPR105、 D2、 D5、 EDG2、 EP3 variant h、 EP3 variant j、 EP4、 ETBヽ Hl、 H4および GPR43からなる 群から選ばれる受容体に対するアン夕ゴニストを用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a ) ァ ポト一シスの誘導、 （b ) 活性化の抑制、 （c )脱顆粒の抑制、 （d ) 炎症性メデイエ一 ターの産生抑制、 （e ) サイトカインの産生抑制、 （f ) ケモカインの産生抑制のうちの 少なくとも 1つを行う方法。
1 1 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105, TM7SF1、 GPR37S CD97、 MCIヽ FIREヽ fMLPl、 GPR65, EP3 variant h、
P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6, CB2、 GPR39, P2Y5、 Al、 P2Y4N EP3 variant j, A2a, AT1B、 ETBヽ GNRHRヽ CELSR2, ,.CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32 TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motilin R、 HE6、 CELSR3、 CALCRL, RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296S GPR1 1, hRUP16s ITR、 M GX2S SNORF33, C-THYMU2011548, G10d、 GPR107N GPR126、 GPR41, GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRaヽ mPRgヽ SRL、 H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾 患またはアレルギー性疾患を治療する方法。
1 2 . ヒト肥満細胞で 現する G蛋白質共役型受容体である A2aまたは HEOAD54に対す るァゴニストを用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性 疾患を治療する方法。 '
1 3 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 GPR91、 GPR34、 PAFR, GPR105、 , D2、 D5、 EDG2、 EP3 variant h、 EP3 variant j、 EP4、 ETBヽ HIヽ H4および GPR43からなる 群から選ばれる受容体に対するアン夕ゴニストを用いて、 アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性 閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患を治療する方法。 ·，
1 4 . ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコィドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34、 β、 GPR105、 TM7SF、 fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2, CCRL2N P2Y5S A2a、 EBI2ヽ. PAR1、 H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機畫修飾物質を用いて、 細胞に対するグ ルココルチコィド作用を制御する方法。
1 5 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFR, GPR105、 TM7SF1ヽ GPR37、 CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPl、 GP 65, EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ 0PN3 GPR27S C濯、 EDG1ヽ FPR 、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39S P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant A2as AT1Bヽ ETBヽ GNRHRヽ CELSR2, CCR7、 H4、 GPR12ヽ HIヽ GPR32、 TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motilin R、 HE6、 CELSR3、 CALCRLヽ RRHヽ GPR18、 GPR35, P2Y10、 C-TESTI2027296s GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33, C-THYMU2011548, G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41、 GPR43、 GPR68、 GRPRヽ 腦扁ヽ hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLおよび H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対するァゴニ スト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を有効成分として含有する、 （a)〜（j) の いずれかの医薬。
( a ) ヒト肥満細胞のアポト一シス誘導剤
(b) ヒト肥満細胞の活性化 i卬制剤
(c) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メディエー夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
(g) アトピー性皮膚炎の治療薬
(h) 喘息の治療薬
( i )慢性閉塞性肺疾患の治療薬 ' ( j ) ァレルギ一性疾患の治療薬
16. ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である A2aまたは HEOAD54に対す るァゴニストを有効成分として含有する、 （a) 〜 （j) のいずれかの医薬。
( a ) ヒト肥満細胞のアポト一シス誘導剤
( b ) ヒト肥満細胞の活性ィ匕抑制剤
(c)+ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メディエー夕一産生抑制剤
(e) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
(： f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
(g) アトピー性皮膚炎の治療薬
(h) 喘息の治療薬
( i ) 慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j) アレルギー性疾患の治療薬
17. ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である GPR91、 GPR34、 PAFR、 GPR105、 D2、 D5、 EDG2、 EP3 variant h、 EP3 variant jヽ EP4、 ETBヽ HIヽ H4および GPR43からなる 群から選ばれる受容体に対するアン夕ゴニストを有効成分として含有する、 （a)〜（ j) のいずれかの医薬。
( a ) ヒト肥満細胞のアポト一シス誘導剤
(b) ヒト肥満細胞の活性化抑制剤
(c) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
(d) ヒト肥満細胞の炎症性メデイエ一夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
(g) アトピー性皮膚炎の治療薬
(h) 喘息の治療薬
( i ) 慢性閉塞性肺疾患の治療薬 ( j ) アレルギー性疾患の治療薬
1 8 . ヒト肥満細胞で発現し、 かつダルココルチコィドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 β GPR34、 GPR105, fMLPl、 P.2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 EBI2、 CELSR2, PARI, H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体に対するァゴニスト、アン夕ゴニストまたは機能修飾物質を有効成分として含有する、 ダルココルチコィド作用の制御剤。
1 9 . アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患の治療用の 医薬組成物の製造のための、 ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRls GPR91, GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105、 TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPlヽ GPR65, EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDGU FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant js A2a、 AT1Bヽ ETB、 G画、 CELSR2S CCR7 H4、 GPR12、 Hl、 GPR32 TEM5、 GPH58、 CELSR1、 GPR85、 Motilin R、 HE6、 CELSR3, CALCRLヽ RRHヽ GPR18、 GPR35 P2Y10ヽ G-TESTI2027296S GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33, C-THYMU2011548, GlOdヽ GPR107、 GPR126、 GPR41、 GPR43S GPR68、 GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLヽ H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ば れる受容体に対するァゴニスト、 アン夕ゴニストまたは機能修飾物質の使用。
2 0 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34N EMR2、 PAFRヽ GPR105、 TM7SF1、 GPR37、 CD 97, MCIヽ FIRES fMLPls GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2, EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39, P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant j, A2a、 AT1Bヽ ETBヽ GNRHRヽ CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12ヽ Hl、 GPR32、 TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motilin R、 HE6、 CELSR3、 CALCRL, RRH, GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR1 1, hRUP16、 ITRヽ MRGX2, SNORF33、 C-THYMU2011548, G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41, GPR43、 GPR68、 GRPR、 HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLH963, EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対して特異的に反応 し、 かつヒト肥満細胞に対し、 以下の （a) 〜 （f ) のうちの少なくとも 1つの作用を有 する饥体。
( a) アポト一シスの誘導
( b ) 活性化の抑制
( c ) 脱顆粒の抑制
( d ) 炎症性メデイエ一夕一の産生抑制
( e ) サイトカインの産生抑制
( f ) ケモカインの産生抑制
2 1 . ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコィドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34S ?2、 GPR105、 TM7SF, fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2s P2Y5、 A2a、 EBI2、 PARIヽ H4、 RE2、 CALCRLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体に対して特異的に反応し、 かつグルココルチコィドの作用を制御する効果を有する抗 体。
2 2 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFR、 GPR105、 TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MCIヽ FIRE、 fMLPl、 GPR65S EP3 variant h、 P2Y8S D2 EDG2、 A3、 C5R1S 0PN3、 GPR27、議 2、 EDG1、 FPRL2N CCRL2, mglu6s CB2、 GPR39S P2Y5, Al、 P2Y4、 EP3 variant j, A2a、 AT1Bヽ ETBヽ GNRHRヽ CELSR2, CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32、 TEM5、 GPR58. CELSRl, GPR85, Motilin R、 HE6、 CELSR3S GALCRL, R H, GPR18、 GPR35, P2Y10、 C-TESTI2027296s GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNO F33N C- THYMU2011548、 GlOdヽ GPR107、 GPR126、 GPR41, GPR43、 GPR68、 GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 fflPRgヽ SRL、 H963, EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体に対して特異的に反応 する抗体を用いて、 肥満細胞の検出または単離を行う方法。
2 3 . 請求項 2 0に記載の抗体を用いて、 ヒト肥満細胞に対し、 （a ) アポト一シスの 誘導、 ( b)活性化の抑制、 ( c )脱顆粒の抑制、 （ d ) 炎症性メディエー夕一の産生抑 制、 （e ) サイトカインの産生抑制および （： ) ケモカインの産生抑制のうちの少なくと も 1つを行う方法。
2 4 . 請求項 2 0に記載の抗体を用いて、 ァトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患 またはァレルギ一性疾患を治療する方法。
2 5 . 請求項 2 1に記載の抗体を用いて、 細胞に対し、 グルココルチコィドの作用を制 御する方法。
2 6 . 請求項 2 0に記載の抗体を有効成分として含有する、 （a ) 〜 （： i ) のいずれか の医薬。 '
( a) ヒト肥満細胞のアポトーシス誘導剤
( b ) ヒト肥満細胞の活性ィ匕抑制剤
( c ) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メディェ一夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイトカイン産生抑制剤
(： f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
( g ) アトピー性皮膚炎の治療薬.
( h) 喘息の治療薬
( i ) 慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) アレルギー性疾患の治療薬
2 7 . , 請求項 2 1に記載の抗体を有効成分として含有する、 グルココルチコイドの作用 の制御剤。
2 8 . アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患の治療用の 医薬組成物の製造のための、 請求項 2 0に記載の抗体の使用。
2 9 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34, EMR2、 PAFR、 GPR105, TM7SF1ヽ GPR37, CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPU GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant j, A2a、 AT1Bヽ ETBヽ GNRHRヽ CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32、 TEM5S GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Motilin R, HE6、 CELSR3, CALCRL、 RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296, GPR141S hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33、 C-THYMU2011548, G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR4U GPR43、 GPR68、 GRPR、 HEOAD54、 hRUP9、 mPRaヽ mPRg、 SRL、 画、 EP4、 CCRls D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体の発現を抑制する、 該 受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを用いて、 ヒト肥満細 胞に対し、 （a) アポトーシスの誘導、 （b )活性ィ匕の抑制、 （c )脱顆粒の抑制、 ( d ) 炎症性メディエー夕一の産生抑制、 （ e )サイトカインの産生抑制および （ f ) ケモカイ ンの産生抑制のうちの少なくとも 1つを行う方法。
3 0 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 'CysLTRl、 GPR91 GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105, TM7SF1ヽ GPR37、 CD97、 MCI, FIRE, fMLPl、 GPR65、 EP3 variant hヽ P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1、 FPRL2、 CCRL2、 mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant js A2aヽ AT1Bヽ ETBヽ GNRHRヽ CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32N TEM5、 GPR58、 CELSR1、 GPR85、 Moti l in R, HE6 CELSR3、 CALCRL、 RRH、 GPR18、 GPR35、 P2Y10、 C-TESTI2027296s GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33, C-THYMU2011548 G10d、 GPR107、 GPR126、 GPR41S GPR43, GPR68、 GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRaヽ mPRg、 SRL、 H963、 EP4、 CCR1 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体の発現を抑制する、 該 受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを用いて、 ァトピー性 皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患を治療する方法。
3 1 . ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコィドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34、 β1、 GPR105、 TM7SF、 fMLPl, P2Y8、 A3、 CRTH2、 CCRL2、 P2Y5、 A2a、 EBI'2、 PARI, H4、 RE2、 CALCRLLおよび EP4からなる群から選ばれる受 容体の発現を抑制する、 該受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを用いて、 ヒト肥満細胞に対するダルココルチコィドの作用を制御する方法。
3 2 . ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRl、 GPR91、 GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105、 TM7SF1、 GPR37、 CD97、 MC1、 FIREヽ fMLPl、 GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8N D2、 EDG2、 A3、 C5R1、 0PN3、 GPR27、 CRTH2、 EDG1ヽ FPRL2、 CCRL2, mgl'u6、 CB2、 GPR39ヽ P2Y5、 Als P2Y4、 EP3 variant j, A2aヽ AT1B、 ETB, GNRHRヽ CELSR2, CCR7、 H4、 GPR12、 Hl、 GPR3 , TEM5, GP 58 CELSR1、 GPR85、 Motilin R、 HE6、 CELSR3、 CALCRL, RRHN GPR18、 GPR35、 P2Y10ヽ C-TESTI2027296 GPR141、 hRUP16、 ITRヽ MRGX2、 SNORF33、 C- THYMU2011548、 GlOdヽ GPR107、 GPR126, GPR41、 GPR43、 GPR68、 GRPR、 HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 mPRgヽ SRL、 H963、 EP4、 CCR1、 D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ばれる受容体の発現を抑制する、 該 受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを有効成分として含有 する （a ) 〜 （j ) のいずれかの医薬。
( a ) ヒト肥満細胞のアポトーシス誘導剤
( b ) ヒト肥満細胞の活性化抑制剤
( c ) ヒト肥満細胞の脱顆粒抑制剤
( d ) ヒト肥満細胞の炎症性メディエー夕一産生抑制剤
( e ) ヒト肥満細胞のサイト力イン産生抑制剤
( f ) ヒト肥満細胞のケモカイン産生抑制剤
( g ) アトピー性皮膚炎の治療薬
( h) 喘息の治療薬
( i )慢性閉塞性肺疾患の治療薬
( j ) アレルギー性疾患の治療薬
3 3 . ヒト肥満細胞で発現し、 かつグルココルチコィドの刺激により発現量が変動する G蛋白質共役型受容体である、 C3aRl、 GPR34、 β ヽ GPR105, TM7SF、 fMLPl、 P2Y8、 A3、 CRTH2S CCRL2、 P2Y5、 A2a、 EBI2、 PARI, H4、 RE2、 CALCRL'および EP4からなる群から選ばれる受 容体の発現を抑制する、 該受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチセンス DNAを有効成分として含有する、 ダルココルチコィドの作用の制御剤。
3 4 . アトピー性皮膚炎、 喘息、 慢性閉塞性肺疾患またはアレルギー性疾患の治療用の 医薬組成物の製造のための、 ヒト肥満細胞で発現する G蛋白質共役型受容体である、 CysLTRlヽ GPR91, GPR34、 EMR2、 PAFRヽ GPR105、 TM7SF1, GPR37S CD97、 MCIヽ FIREヽ fMLPl、 GPR65、 EP3 variant h、 P2Y8、 D2、 EDG2、 A3、 C5R1ヽ 0PN3、 GPR27、 C顯、 廳、 FPRL2 CCRL2ヽ mglu6、 CB2、 GPR39、 P2Y5、 Al、 P2Y4、 EP3 variant js A2aヽ AT1Bヽ ETB、 GNRHRヽ CELSR2、 CCR7、 H4、 GPR12、 HIヽ GPR32S 蘭、 GPR58、 CELSR1ヽ GPR85、 Motilin R、 HE 6, CELSR3s CALCRL、 RRH、 GPR18、 GPR35、 Ρ2Π0、 C-TESTI2027296, GPR141、 hRUP16、 ITR、 MRGX2、 SNORF33、 C-THYMU2011548, G10d、 GPR107、 GPR126、— GPR41、 GPR43, GPR68, GRPRヽ HEOAD54, hRUP9、 mPRa、 mPRg、 SRLヽ ■、 EP4、 CCR1ヽ D5、 LTB4Rおよび CXCR5からなる群から選ば れる受容体の発現を抑制する、 該受容体をコードする遺伝子に対する siRNAまたはアンチ センス DNAの使用。
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