WO2005028644A1 - フレームシャッフリングによるタンパク質分子多様性集団の作製 - Google Patents

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WO2005028644A1
WO2005028644A1 PCT/JP2004/011719 JP2004011719W WO2005028644A1 WO 2005028644 A1 WO2005028644 A1 WO 2005028644A1 JP 2004011719 W JP2004011719 W JP 2004011719W WO 2005028644 A1 WO2005028644 A1 WO 2005028644A1
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dna
gene
dna sequence
sequence
population
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PCT/JP2004/011719
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French (fr)
Inventor
Kiyotaka Shiba
Kenji Kashiwagi
Original Assignee
Japan Science And Technology Agency
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication of WO2005028644A1 publication Critical patent/WO2005028644A1/ja

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C12N15/1027—Mutagenizing nucleic acids by DNA shuffling, e.g. RSR, STEP, RPR

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a protein molecular diversity population by frame shuffling, and a method for preparing a gene DNA population into which a frameshift has been randomly introduced, which is used for the method.
  • a library of protein mutant populations is prepared, and a protein clone having the target function is selected from the library. Is taken.
  • an error prone PCR method see, for example, Cadwell R., et al. PCR Methods Appl, 2: 28-33 1992
  • a DNA shuffling method for example, Ste marder er WPC Nature, 370) : 389-391 1994
  • Error prone PCR is a method for preparing a mutant population library by introducing a base gene into a parent gene and performing PCR amplification in the presence of manganese ions, thereby randomly introducing base substitutions into the parent gene.
  • error prone PCR When the efficiency of introducing mutations by base substitution is increased by error prone PCR, there is a problem that not only amino acid substitution but also the possibility that a codon encoding an amino acid is replaced with a stop codon is increased. In this error prone PCR, unintended deletion mutations are likely to occur under conditions that increase the mutation rate (see, for example, Arnold FH et al., Trends Biochem. Sci., 26: 100-106, 2001).
  • the DNA shuffling method uses a gene encoding a protein and one or more similar DNAs having sequence homology to homologously recombine them in a test tube to produce a relatively wide range of mutations.
  • a body population library can be prepared.
  • the DNA shirt fluffing method is based on homologous recombination, it is difficult to shuffle DNA having low sequence similarity.
  • the resulting mutant population is a conservative population very similar to the gene of the starting material, and has a large sequence from the parent strain.
  • a method for preparing a gene DNA in which the stop codon of each translational reading frame has been eliminated in advance a method for preparing a high molecular weight gene gene polymer (for example, see Patent No. 3415995, ⁇ )
  • a method for producing a multifunctional nucleotide sequence and an artificial gene containing the same see, for example, JP-A-2001-325900
  • a method for producing a random gene of a microgene see, for example, No. 1,545,855, Shiba K., et al., J. Biochem. 132: 689-696, 2002.
  • An object of the present invention is to prepare an artificial protein gene library composed of mutants having widely separated sequences, by randomizing DNA in which stop codons of three translational reading frames have been eliminated in advance. It is an object of the present invention to provide a method for producing a protein molecular diversity population by introducing a crossover mutation in the translation reading frame and preparing a mutant population. Since the codons encoding amino acids are translated in units of three bases, the DNA sequence of one gene encodes three proteins by shifting the reading frame. In other words, a natural gene can be thought of as containing three times more information, including reading frames that are not actually used.
  • Another more preferable method is a method for producing a high molecular weight gene polymer invented by Shiba et al.
  • Japanese Patent No. 3415995, Shiba K., et al. Proc. Natl. USA, 94: 3805-3810, 1997) can be used to prepare an artificial gene in which the stop codon of all translational reading frames has been eliminated.
  • This method prepares a large translational reading frame by tandemly polymerizing a short DNA sequence (micro gene) from which the termination codon has been eliminated.
  • a multifunctional nucleotide sequence design method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-35290 developed by Shiba et al.
  • Y-family DNA polymerases are a group of DNA polymerases that have recently attracted attention (Ohmori H., et al. al., Mol. Cell 8: 7-8, 2001), and its ability to survive injuries, and its low fidelity during replication, which makes it easy to cause single nucleotide deletion. Have been. In particular, since deletion of a single base is a frameshift mutation itself, it was expected that it would be possible to introduce a random frameshift mutation by using this property. When considering the use of these enzymes by genetic engineering, it is reported that Y-family DNA polymerase (Boudsocq, F. et al.) Of Sulforobus solfataricus P2, which has been reported to be excellent in heat resistance and capable of performing PCR.
  • the artificial gene pYT320 in which the stop codon of each translational reading frame has been eliminated, is prepared by the Mic-mouth gene polymerization method, and this is used as a type III PCR reaction with Y-family DNA polymerase to produce a frameshift mutant. I tried to create a group. As a result, the mutation introduction efficiency for pYT320 was 1.86% for the base substitution rate and 0.555% for the frameshift mutation rate, and an average of one or more frameshift mutations per clone was introduced. Was able to do.
  • the obtained mutant protein was purified and its physicochemical properties were analyzed. It was confirmed that the Stokes radius of the mutant protein changed from 13.5 A to 53.8 A due to the introduction of the mutation. It was confirmed that it changed to dispersion. Ultracentrifugation by sedimentation equilibrium analysis confirmed that the change in the average molecular weight of the protein due to the introduction of the mutation, that is, the change in the association state of the subunits. When the secondary structure content of the mutant protein was confirmed by circular dichroism spectrum, the amount of the a-helix varied greatly from 0% to 55.8% depending on the mutant protein. In addition, the stability of the secondary structure of some mutant proteins to heat and denaturant concentrations was different.
  • the present invention prepares a gene DNA sequence from which three types of translational reading frames of a gene DNA sequence have been excluding a stop codon in advance, and frequently causes a mutation of a base in the gene DNA sequence during replication.
  • a method for preparing a protein molecule diversity population characterized by preparing a gene DNA population into which a frameshift has been randomly introduced by amplification with DNA polymerase, and expressing the gene DNA population ( Claim 1) or claim 1, characterized in that the DNA polymerase that causes mutation of bases frequently during replication is DNA polymerase that causes deletion of bases frequently during replication.
  • Item 2 A method for preparing a protein molecule diversity population (Claim 3) and at least a part of the gene DNA sequence from which three stop reading codons have been removed from the three translation reading frames of the gene DNA are complementary to each other.
  • the protein molecule diversity population according to any one of claims 1 to 3, wherein the oligonucleotide A and the oligonucleotide B are prepared by reacting a DNA polymerase to perform a polymerase chain reaction. And a base sequence encoding an amino acid sequence having a predetermined function, from the three types of translational reading frames of the gene DNA sequence and the gene DNA sequence excluding the stop codon in advance.
  • the gene DNA sequence excluding the stop codon was A DNA sequence containing a specific DNA sequence "A” at one end of the fragment and a specific DNA sequence "B” at the other end, and containing at least a part of a sequence complementary to each of the DNA sequences "8" and "B" (A) and (b) are prepared, and the DNA sequence is prepared by performing a ligation reaction of the microgene using a single-stranded DNA in which the DNA sequences (a) and (b) are linked.
  • a method for producing a protein molecule diversity population according to any one of claims 1 to 3 (claim 6).
  • the present invention prepares a gene DNA sequence excluding a stop codon in advance from three types of translational reading frames of a gene DNA sequence, and mutates the gene DNA sequence at a high frequency during replication.
  • a method for preparing a gene DNA population into which a random frameshift has been introduced characterized in that the DNA is amplified by a DNA polymerase that causes the DNA polymerase (Claim 7), and a DNA polymerase that frequently causes base mutation during replication, 8.
  • the DNA polymerase is a DNA polymerase that frequently causes base deletion at the time of replication.
  • the method (Claim 9) and the oligonucleotide A and the oligonucleotide A, at least a part of which of which are complementary to each other, are obtained by removing a stop codon from the three translational reading frames of the gene DNA sequence.
  • Preparation method (Claim 1), and the nucleotide sequence encoding an amino acid sequence having a predetermined function, based on the three types of translational reading frames of the gene DNA sequence, Among the combinations of The random preparation according to any one of claims 7 to 9, wherein the preparation is performed by selecting a base sequence having the same or different function as the predetermined function in a reading frame different from the reading frame of the amino acid sequence.
  • a method for preparing a DNA group in which a frame shift has been introduced into the gene DNA (Claim 11), and a gene DNA sequence in which the stop codon has been previously removed from three types of translational reading frames of the gene DNA sequence, are obtained by using a microphone gene.
  • a specific DNA sequence “A” is added to one end of the fragment and a specific DNA sequence “B” is added to the other end, and a DNA sequence “at least partially containing a sequence complementary to each of the DNA sequences“ A ”and“ B ” (a) and (b) are prepared, and ligase anti-S of the microphone gene is performed using a single-stranded DNA in which the DNA sequences (a) and (b) are linked.
  • the la relates to a method for preparing a gene DNA population into which a frame shift has been introduced randomly (claim 12). Brief Description of Drawings
  • FIG. 1 is a photograph showing an outline of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph showing the result of PCR using ⁇ -family DNA polymerase as a photograph after electrophoresis on a 1% agarose gel. The type of ⁇ used at the top is shown.
  • FIG. 3 is a photograph showing the sequence of a predicted translation product of each mutant clone of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph showing the expected translation product sequence of each mutant clone of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph showing the expression of each mutant clone of the present invention in Escherichia coli.
  • Total proteins contained in the E. coli culture after expression induction were separated on a PAG gel 15/25 (Daiichi Pure Chemicals).
  • the marker is the evening protein marker “No. 1 ”3 (Daiichi Kagaku), 99, 66, 42, 30, 20 and 14 kDa from the top, respectively.
  • the number of each mutant is shown at the top of the gel.
  • FIG. 6 is a photograph showing a CD spectrum of each mutant protein of the present invention.
  • the obtained circular dichroism values were represented on the graph as residue average molar ellipticity.
  • FIG. 7 is a photograph showing the change in the CD value at 222 nm of each protein with respect to the temperature of 5 ° C. to 95 ° C. of the present invention. In order to show different CD values for each protein, the values were normalized with 0 at 5 ° C and 1 at 95 ° C.
  • FIG. 8 is a photograph showing a change in the CD value of each protein at 222 nm when the concentration of guanidine hydrochloride of the present invention was changed from 0 M to 6 M. In order to show different CD values for each protein, the values were normalized with 0 at 0 M and 1 at 6 M.
  • the method for producing the protein molecule diversity population of the present invention includes preparing a gene DNA sequence from which three types of translational reading frames of a gene DNA sequence of a natural gene or the like have been prepared by excluding a stop codon in advance, and preparing the gene DNA sequence. Is amplified with DNA polymerase that causes mutation of bases at high frequency during replication, thereby preparing a gene DNA population into which a frameshift is randomly introduced, and expressing the gene DNA population.
  • the method for preparing a randomly-transferred gene DNA population of the present invention used for preparing such a protein molecular diversity population includes natural gene DNA From the three types of translational reading frames of the sequence, prepare a gene DNA sequence from which stop codons have been removed in advance, and cause a mutation in the gene DNA sequence at high frequency during replication.
  • You DN A Polymerer The method is not particularly limited as long as it is a method for amplifying with ze.
  • the DNA polymerase that frequently causes base mutations during replication is not particularly limited as long as it is a DNA polymerase that frequently causes mutations such as deletion, substitution, and addition of bases during replication.
  • Preferable examples include DNA polymerases that frequently cause base deletion during replication.
  • DNA polymerases that frequently cause base deletion during polymerase replication include Sulforobus solfataricus PI Y-family DNA polymerase (po1Y1) and Sulforobus solfataricus P2.
  • Y-family DNA polymerase (polYl or Dpo4), E. coli Umu C, E. coli D in B, DNA polymerase? 7.
  • Mutazyme DNA polymerase (Stratagene, La Jolla), Escherichia coli DNA polymerase (po) as DNA polymerase that causes mutation of other bases, such as DNA polymerase, DNA polymerase, ReV30, etc. 1 A) Mutants (Camps., ⁇ ⁇ , et al., MAS 100: 9727-9732, 2003) and the like can be exemplified.
  • the expression system may be any expression system capable of expressing the gene DN'A in a host cell, such as an expression system derived from chromosomes, episomes and viruses, for example, Bacterial plasmid derived, yeast plasmid derived, papovavirus such as SV40, vaccinia virus, adenovirus, fowlpox virus, pseudorabies virus, retrovirus derived vector, bacteriophage derived, transposon derived and these Vectors derived from the combination of, for example, those derived from genetic elements of plasmid and bacteriophage such as cosmid and phagemid.
  • These expression systems may contain control sequences that not only cause expression but also regulate expression.
  • Examples of the host cells include bacterial prokaryotic cells such as Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus subtilis, Streptococcus, Staphylococcus, eukaryotic cells such as yeast and Aspergillus, and Drosophila S2 and Spodoptera Sf9.
  • Insect cells L cells, CHO cells, COS cells, HeLa cells, C127 cells, BALB / c3T3 cells (including mutants deficient in dihydrofolate reductase / thymidine kinase) , BHK21 cells, HEK293 cells, Bowes melanoma cells, oocytes and other animal cells and plant cells, and the like.
  • the protein molecule diversity population of the present invention can be bound to a marker protein or a peptide tag.
  • the marker protein is not particularly limited as long as it is a conventionally known marker protein.Examples thereof include, for example, lipophilic phosphatase, the Fc region of an antibody, HRP, and GFP.
  • the peptide tag of the present invention conventionally known peptide tags such as HA, FLAG, Myc and the like, and affinity tags such as GST, maltose binding protein, biotinylated peptide, oligohistidine and the like are known. This can be specifically exemplified by the type of peptide.
  • Such a fusion protein can be produced by a conventional method.
  • Recovery and purification of such proteinaceous molecular diversity populations from cell cultures includes ammonium sulfate or ethanol precipitation, acid extraction, anion or cation exchange chromatography, phosphocellulose chromatography, hydrophobic interactions.
  • Known methods including chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography and lectin chromatography, preferably high performance liquid chromatography.
  • a topography is used.
  • columns used for affinity chromatography include, for example, a column to which an antibody such as a monoclonal antibody against the above-mentioned protein molecule diversity population is bound, and a peptide such as a His tag to the above-mentioned protein molecule diversity population.
  • these protein molecule diversity populations can be obtained by using a column to which a substance such as Ni—NTA having an affinity for this peptide tag is bound.
  • the protein molecular diversity population can be prepared, for example, as follows. First, from the three translational reading frames of the natural gene DNA sequence, a straight-chain type II DNA is prepared in which the stop codon has been eliminated in advance. This linear ⁇ -type DNA is used to express the DNA polymerase, which promotes mutations of bases frequently during replication of the D ⁇ o4 gene, which is a Y-family one DNA polymerase of Sulfolobus solfataricus P2, including a promoter.
  • the gene DNA population is cloned.
  • the cloned gene DNA population into which a frameshift has been randomly introduced can be obtained by expressing the purified DNA in a host such as Escherichia coli by a conventional method and purifying it.
  • Example 1 Expression of Dpo4 gene
  • D ⁇ 4 gene which is the Y-family DNA polymerase of Sulfolobus solfataricus P2, has an expression plasmid containing ⁇ ⁇ 7 promoter ⁇ ⁇ ⁇ Escherichia coli Rosetta (DE3) containing plasmid p1914 (Boudsocq, F., et al. Ucleic Acid Res. 29, 4607, 2001) incorporated into 22b (+) (Novagen, Madison) LB medium (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., containing 50 gZm1 carbenicillin (Sigma, St.
  • Escherichia coli that has induced expression of the stored recombinant protein is thawed on ice, and column buffer (20 mM HEPES (Sigma) pH 7.0, 75 mM sodium chloride (Wako Pure Chemical Industries, Tokyo), 0 After suspending in 2 mL of ImM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), ImM dithiothreitol (Sigma), ImM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF, Sigma), Spitz tube for ultrasonic device (AS-1000, Tosho Denki), and irradiate for 10 seconds at an output of 200 W at intervals of 50 seconds using an ultrasonic cell crusher (Biorupter, Cosmo Bio, Tokyo). This was repeated 5 times to disrupt the cells. 1.
  • ImM ethylenediaminetetraacetic acid EDTA, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • ImM dithiothreitol Sigma
  • the obtained crude fraction was purified by Hi-Load-S16 / 10 column (Pharmacia Biotech, Uppsala) and FPLC system (Pharmacia Biotech). After passing approximately 2 ml of the crude extract through the column at a flow rate of 2.5 mlZ, wash the column with a column buffer containing 10 OmL of 5 OmM sodium chloride at the same flow rate. The recombinant protein was eluted by linearly changing the sodium chloride concentration to 1000 mM in minutes. Separate the eluate by 8 ml each, and use a part of each fraction as Multigel 15 Z25 (Daiichi Kagaku Tokyo) and electrophoresis tank “Daiichi”
  • P YT 3 20 (SEQ ID NO: 1) and p YT 2 88 (SEQ ID NO: 2)
  • a linear type II DNA was prepared by PCR.
  • pYT320 and PYT288 are based on a microgene polymerization method based on a microgene in which the stop codon of each translational reading frame has been removed in advance (see the publication of Patent No. 3415995). This is a plasmid containing a gene sequence artificially produced by Shimadzu (Shiba K., et al. J. Mol. Biol. 320: 833, 2002).
  • a PCR reaction solution containing 2 ng of plasmid DNA of pYT320 or pYT288 was prepared.
  • the reaction mixture contained 10 mM 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol hydrochloride (hereinafter referred to as Tris-HCl) pH 8.3, 50 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride, 50 mM nMd NTP s, 3.5units High Fideryty Taq DNA polymerase (Roche Diagnostics, Basel) and primer KY1087 (SEQ ID NO: 3: 5'-GGA TAA CAA TTC CCC TCT AGA AAT-3 ') , KY1086 (SEQ ID NO: 4: 5'-TTG CTC AGC GGT GGC AGC AGC CAA-3 ') are each included in 300 pmol.
  • Tris-HCl 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol hydrochloride
  • 50 mM potassium chloride 1.5 mM magnesium chloride
  • 50 mM nMd NTP s 3.5units High Fideryty Ta
  • the reaction solution was placed in a 200 L thin wall PCR tube (Toyobo, Osaka), and subjected to a temperature cycle (30 seconds at 94 ° C, 30 min.) Using a Thermocycler PCR-2400 (Pakinkinema, Norwalk). The reaction was carried out for 30 seconds at 55 ° C and 30 seconds at 72 ° C).
  • the amplified DNA was electrophoresed on a 1.0% TAE agarose gel (agarose ME Iwai Chemical Tokyo) and a Mupid II electrophoresis apparatus (Cosmo-Bio Tokyo) for 100 minutes at 100 V.
  • Example 7 40 mM Tris-HCl (pH 8.0), 5 mM magnesium chloride, 10 mM dithiothreitol, 60 mM potassium chloride, 1 M betaine (Sigma), 480 nM d NT P s, Reaction solution containing 480 nmo 1 of primers KY 1 0 8 7 and 0 1 0 8 6, and each l ng of ⁇ type ⁇ 3 2 0 and ⁇ 2 288 DNA prepared in Example 3 was prepared respectively. The mixture was heated at 99.9 ° C. for 5 minutes in a thermal cycler, and then cooled to 90 ° C., and 1.5 g of the purified D po 4 prepared in Example 2 was added.
  • pKS600 is a modified multiple cloning site of a commercially available plasmid pQE9 (Qiagen, Hilden) for expression in Escherichia coli, and contains the aforementioned restriction enzyme site.
  • the ligation reaction solution is used for E. coli XL
  • the Y-family DNA polymerase amplifies the region encoding the pYT32 gene, and the 20 clones from the SalI site to the SpeI site of 20 clones randomly picked from a library based on it. As a result of sequence determination, it was confirmed that mutations were introduced into all clones except for the two clones (3 ⁇ 4: 1106-12 and 1: 111106-19) (SEQ ID NO: 8 to 2 7; ⁇ 6 106-1 to ⁇ ⁇ 106-20). The base substitution rate of these 20 clones was 1.86%, and the frameshift mutation rate was 0.55%.
  • the Y-fami DNA polymerase was used to amplify the region encoding the pYT288 gene, and from the SalI site of the 20 clones randomly picked up from the library based on it, to the SpeI site.
  • the mutation was introduced into all clones except one clone (PKK105-3) (SEQ ID NOS: 28 to 47; p KK 10 5-l, ⁇ ⁇ 105-3 to ⁇ ⁇ 105-10, ⁇ ⁇ 105-12 to ⁇ 0 105-22).
  • Four of the 20 clones analyzed contained a deletion of about 30 'to 40 amino acid residues.
  • E. coli XL Blue containing plasmid encoding each mutant protein is inoculated into 1 mL of LB medium containing 50 g / mL carbenicillin and 1% glucose and incubated at 37 ° C for 16 hours. Cultured. Transfer 60 L of the obtained overnight culture into a 1.5 mL eppendorf tube, centrifuge with a micro high-speed centrifuge at 100,000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, and remove the cells from the culture vessel of the same concentration. Suspend in 6 mL of LB medium containing nicillin and glucose, and place in a pre-sterilized 18 mm diameter Pyrex glass test tube (Asahi Techno Glass) at 37 ° C and 150 rpm. With shaking.
  • OD 66 colorimeter Measuring the time course of absorbance, confirm that the has OD 66 "after about 3 hours reached 0.3, the addition of I PTG to a final concentration of 1 mM, and further 2 hours culture Then, transfer the culture solution containing the bacterial strain expressing the mutant protein (100) into a 1.5 mL eppendorf tube, centrifuge with a micro high-speed centrifuge at 100,000 rpm for 1 minute to remove the supernatant, 100 L of SDS-PAGE sample buffer (125 mM Tris-HCl pH 6.8, 5% ⁇ -mercaptoethanol, 2% sodium lauryl sulfate, 5% sucrose, 0.01% bromophenol blue The cells were lysed, heated at 95 ° C for 5 minutes in a heat block, separated into proteins by SDS-PAGE, and the proteins were detected by CBB staining.
  • SDS-PAGE sample buffer 125 mM Tris-HCl pH 6.8, 5% ⁇ -mercaptoethanol,
  • Frameshift mutants (106-3, 106-8, 106-6-10, 106-6-11, 106 — 1 3 and 1 0 5 _ 4, 1 0 5 — 7, 1 0 5 1 8, 1 0 5-9, 1 0 5 — 1 0, 1 0 5 — 1 2, 1 0 5-1 3, 0 5-17, 105-19, 105-22) was confirmed.
  • the suspension was suspended in 500 mL of a culture medium, placed in a previously sterilized 3-L flask with blades, and cultured at 37 with shaking at 100 rpm. In colorimeter ⁇ D 66. It was over time the change in absorbance measurement, ⁇ _D 66 after about 3 hours. After confirming that the concentration reached 0.3, IPTG was added to a final concentration of 1 mM, and the cells were further cultured for 3 to 4 hours. Then, the culture solution containing E. coli expressing the mutant protein was transferred to a 25 OmL centrifuge tube (Beckman) and centrifuged at 300 g for 15 minutes in a Beckman centrifuge (HP301, JA-14 rotor, Beckman). The supernatant was removed, and the cells were transferred to a 50 mL centrifuge tube and stored at -80.
  • ⁇ D 66 It was over time the change in absorbance measurement, ⁇ _D 66 after about 3 hours.
  • IPTG was added to a final concentration
  • the recombinant protein was purified under denaturing conditions using a histidine tag.
  • a lysis buffer 50 mM sodium phosphate, 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 6 M guanidine hydrochloride (Nacalai Tesque), 100 mM sodium chloride, ImM PMS F).
  • the cells were suspended in 37 mL and gently shaken at 37 ° C for 1 hour to dissolve the cells. Thereafter, the mixture was centrifuged at 700 g for 30 minutes with a Beckman centrifuge (JA-12 rotor 1), and the supernatant was transferred to another tube.
  • the resin was suspended again in 20 mL of the lysis buffer, the resin was similarly recovered by stirring and centrifugation, the resin was suspended in 2 mL of the lysis buffer, and a Muromak column (M size, Muromachi Chemical Co., Tokyo The resin was transferred to), and the dissolution buffer was dropped from below and removed. Next, wash the resin with 6 mL of washing buffer (50 mM sodium phosphate, pH 7.0, 8 M urea (Nacalai Tesque), 100 mM sodium chloride, 15 mM imidazole (Wako Pure Chemical Industries)).
  • washing buffer 50 mM sodium phosphate, pH 7.0, 8 M urea (Nacalai Tesque), 100 mM sodium chloride, 15 mM imidazole (Wako Pure Chemical Industries)
  • elution buffer 50 mM sodium phosphate, pH 5.0, 20 mM MES (Wako Pure Chemical Industries), 8 M urea, 100 mM sodium chloride, 250 mM imidazole
  • the protein was dissociated from the resin and eluted.
  • each protein sample was diluted to 200 ⁇ g / mL, and the sample was diluted using a microdialyzer (Bio-Tech, Daiichi Kagaku) and a sample prep (fraction molecular weight 8000, Daiichi Kagaku). 5 0 mM N a H 2 P 0 4 p H 7. 5, 1 5 0 mM NaCl Te was completely denatured by dialysis against buffers one containing 6 M hydrochloric Guaniji down. Next, a portion of it is dialyzed against the same buffer containing 1 M guanidine. " Gel filtration chromatography is a Superose 12 column (Pharmacia) o
  • Decent M is calculated from the predicted amino acid sequence using ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.htmD5r
  • each mutant protein was dialyzed against 10 mM phosphate at pH 8.0, 6.0, 4.0, and 2.0 to a final concentration of 5 M. Aggregated proteins were removed by transferring to a 5 ml eppendorf tube and centrifuging at 1500 rpm for 5 minutes in a high speed microcentrifuge. Next, 500 ⁇ L of the prepared protein solution was placed in a 2 mm cell length quartz cell, The CD spectrum at 5 ° C was measured using a polarization dichroism spectrum analyzer (J-820, JASCO, Tokyo) and a Peltier-type microcell device (PMH-428L, JASCO). It was measured ( Figure 6).
  • the mutant protein 106--11 aggregated strongly in the phosphate buffer at pH 8, and could not be measured at that pH.
  • the obtained spectrum was analyzed by the secondary structure analysis program (JASCO), and it was shown that the secondary structure was contained at the ratio shown in (Table 3). From this result, it was found that the secondary structure content was changed by the introduction of the frameshift mutation.
  • the temperature was changed from 5 ° C to 95 ° C for 1 106—12, 106—8, and 106—10.
  • the change in the CD value at 222 nm was measured at a rate of ° C (Fig. 7).
  • the Tm was 83.10 ° C and 65, assuming that only the folded state and the denatured state were absent and the folding intermediate was not present, based on the CD spectrum change with respect to the temperature of each protein.
  • the temperature was 46 ° C and 34.13. Thus, it was shown that the thermal stability was greatly changed by the frameshift mutation.
  • the concentration of guanidine hydrochloride as a denaturant in 106 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) was determined for 106-122, 106-8, and 106-10.
  • the change in CD value at 222 nm when changing from 0 M to 6 M was observed (FIG. 8).
  • the guanidine hydrochloride concentration (Cm) at the midpoint of the state change when the folding intermediate is not present and assuming only the two states, the folded state and the denatured state is 2.5 M, respectively.
  • each protein was diluted to a final concentration of 2 mgZmL, and dialyzed against a buffer containing 5 OmM phosphoric acid and 150 mM sodium chloride. As a result, proteins other than 106—12 and 106-6—8 precipitated, The measurement was performed in a buffer of mM Trisacetic acid, 100 mM sodium chloride, and 1 mM EDTA. Fluid radii were measured using a dynamic light scattering measurement device Dynapro-MS800 (Proton Solutions, Charlottesville) (Table 4). As a result, before the introduction of the mutation, 106--12 and 106-8 showed monodispersion, but the other mutant proteins showed polydispersity, indicating that they were in various association states. Was.
  • a buffer of 50 mM sodium phosphate and 150 mM sodium chloride For a pH of 7.5, use a buffer of 50 mM sodium phosphate and 150 mM sodium chloride.
  • a buffer of 50 mM tris-acetic acid pH 4.0, 100 mM sodium chloride, and 1 mM EDTA.
  • Fluid radius (Rh) is shown in nm.
  • the average molecular weight of 106—12 and 106—8 was measured by ultracentrifugation analysis using the sedimentation equilibrium method.
  • each protein was dialyzed against 20 mM phosphoric acid and 200 mM sodium chloride, and 0.16-1, 0.25, 0.5, 1 mgZmL, and 10-6-8, 0. 0 25, 0.05, 0.1 mgZmL
  • a 6-hole charcoal-filled epoxy resin centerpiece (Beckman) and a buffer without protein for background correction into each well, and use a quartz glass window for the cell. was assembled.
  • the cell was assembled in an An_Ti60 rotor (Beckman), and the absorbance at 280 nm was scanned radially with an ultracentrifuge XL-1 (Beckman) at 20 ° C and 250 ° C. The absorbance in the radial direction when the equilibrium was reached by centrifugation at rpm for about 20 hours was recorded. The molecular weight as a monomer was determined by a computer attached to the apparatus. As a result, a value of 58232 was obtained for 106-6, and a value of 64343 was obtained for 106-8. Therefore, the dynamic light scattering measurement revealed that even the mutant protein showing monodispersity changed the association state of the protein due to the introduction of the frameshift mutation.
  • the method for producing a protein molecule diversity population of the present invention since the amino acid sequence is replaced in the middle of a different translation reading frame, it becomes possible to introduce more continuous amino acid substitution mutations as compared with the known method. Because the stop codon is excluded in each translation reading frame in advance, there is little possibility that translation will be stopped halfway due to frame shift mutation, and the replication reaction with Y-family DNA polymerase will be repeated multiple times. Allows more frame shifts to be introduced. Therefore, according to the present invention, in order to prepare an artificial protein gene library composed of mutants having largely separated sequences, a DNA in which stop codons of three translational reading frames have been excluded in advance is prepared. By introducing a crossover mutation in the random translation reading frame to prepare a mutant population, a protein molecular diversity population can be obtained.

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Abstract

　大きく配列の離れた変異体から構成される人工タンパク質遺伝子ライブラリーを調製するために、あらかじめ３つの翻訳読み枠のストップコドンを排除したＤＮＡに対して、ランダムな翻訳読み枠の乗換え変異を導入し変異体集団を調製することにより、タンパク質分子多様性集団の作製方法を提供するものである。天然の遺伝子ＤＮＡ配列の３種類の翻訳読み枠から、あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子ＤＮＡ配列を調製し、該遺伝子ＤＮＡ配列を、複製時に高頻度に塩基の変異を起こすＹ−ファミリーＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮＡポリメラーゼで増幅することにより、ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子ＤＮＡ集団を調製し、該遺伝子ＤＮＡ集団を常法により発現させ、タンパク質分子多様性集団を作製する。

Description

フレームシャツフリングによるタンパク質分子多様性集団の作製 技術分野
本発明は、 フレームシャッフリングによるタンパク質分子多様性集団 の作製方法、 及びそれに用いられるランダムにフレームシフトが導入さ れた遺伝子 DN A集団の調製方明法に関する。 田
背景技術
試験管内進化法を用いてタンパク質の機能特化をおこなう場合、まず、 タンパク質の変異体集団ライブラリ一を調製し、 このライブラリ一中か ら狙った機能を持つタンパク質クロ一ンを選択する、 といった手順がと られる。 変異体集団の調製法としては、 error prone P C R法 （例えば、 Cadwell R. ， et al. PCR Methods Appl, 2:28-33 1992 参照。） や D N Aシャッフリング法 （例えば、 Ste匪 er W. P. C. Nature, 370:389-391 1994参照。） が現在よく使われている。
error prone P C Rは、 親遺伝子を铸型としてマンガンイオン存在下 で P C R増幅をおこなうことにより、 親遺伝子にランダムに塩基置換を 導入して変異体集団ライブラリーを調製する方法である。 error prone P C Rで塩基置換変異導入効率を上げた場合に、アミノ酸置換のみならず、 アミノ酸をコードするコドンがストップコ ドンに置換されてしまう確率 も高くなつてしまうといった問題が存在する。また、 この error prone P C Rでは、 変異の割合を上昇させるような条件では意図しない欠失変異 が起こりやすく（例えば、 Arnold F. H. et al., Trends Biochem. Sci. , 26:100-106, 2001 参照。 ；)、 その結果、 他の読み枠にコードされている ストップコ ドンが出現してしまう問題点を有している。そのため、 error prone P C Rは、 通常は低い変異導入率、 すなわち、 遺伝子あたり 2か ら 3塩基の置換、 アミノ酸として 1残基の変異率が導入されるような条 件で行われる。
DNAシャッフリング法は、 あるタンパク質をコードする遺伝子 DN A及び配列相同性をもつ 1つ又は複数の類似 DN Aを用いて、 それらを 試験管内で相同組み換えさせることにより、 比較的幅広い変異をもった 変異体集団ライブラリ一を調製することができる。 しかしながら、 DN Aシャツフリング法は相同組み換えを基本としているため、 配列類似性 の低い DNA間でシャッフリングさせることは困難である。
以上のように従来の変異体集団ライブラリー調整法である error prone P C R法や D N Aシャッフリング法では、 得られる変異体集団は 出発材料の遺伝子によく似た保守的な集団となり、 親株から大きく配列 .の離れた変異体を得ようとした場合、 これらの手法には限界がある。
他方、 あらかじめ、 各翻訳読み枠の停止コドンを排除した遺伝子 DN Aの調製方法として、 高分子マイク口遺伝子重合体の作製方法（例えば、 特許第 3 4 1 5 9 9 5号公報参照。、ヽ多機能塩基配列およびそれを含む 人工遺伝子の作製方法（例えば、 特開 2 0 0 1— 3 5 2 9 9 0号公報参 照。 ）、 マイクロ遺伝子のランダム重合体作製法 (例えば、 特開平 9一 1 54 5 8 5号公報、 Shiba K. , et al. , J. Biochem. 132:689-696, 2002. 参照。） が本発明者らにより提案されている。
本発明の課題は、 大きく配列の離れた変異体から構成される人工タン パク質遺伝子ライブラリ一を調製するために、 あらかじめ 3つの翻訳読 み枠のストップコドンを排除した D N Aに対して、 ランダムな翻訳読み 枠の乗換え変異を導入し変異体集団を調製することにより、 タンパク質 分子多様性集団の作製方法を提供することにある。 アミノ酸をコードするコ ドンは 3塩基単位で翻訳されるため、 1つの 遺伝子 D N A配列は読み枠をずらすことにより 3種のタンパク質をコー ドすることになる。 つまり、 ある天然遺伝子は実際には使われていない 読み枠を含めて 3倍の情報を含んでいると考えることもできる。 したが つて、 翻訳読み枠の乗り換え変異を導入することにより、 他の翻訳読み 枠の情報を活用でき、 その結果、 親株と配列の似た変異体集団しか得ら れないといつた従来の問題を回避できることになる。 これをフレームシ ャッフリング法と呼ぶ。
フレームシャツフリング法を行うためには、 乗り換え変異を導入する 標的 D N Aの全ての読み枠でストップコドンが出現しないことが望まし レ さもなければ、 翻訳読み枠の乗り換え変異を導入しても、 短い翻訳 産物しか得られないと予想される。
全ての読み枠でストップコ ドンが出現しない D N Aを調製するには、 1つには、 あるタンパク質配列をコードする天然遺伝子から出発して、 遺伝子工学的手法により、 タンパク質配列をコードしている以外の読み 枠のストップコドンを排除することにより可能となる。
もう 1つのより望ましい方法としては、 芝らの発明した高分子マイク 口遺伝子重合体の作製手法 （特許 3 4 1 5 9 9 5号、 及び、 Sh i ba K. , e t a l . Proc . Na t l . Ac ad. Sc i . USA, 94 : 3805-3810, 1997) を用いること により、 全ての翻訳読み枠のストップコドンが排除された人工遺伝子を 準備することができる。 この方法は、 あらかじめ終止コドンが排除され た短い D N A配列 （マイクロ遺伝子） をタンデムに重合し大きな翻訳読 み枠を調製する方法である。 さらに、 繰り返しの単位となるマイクロ遺 伝子を、 芝らの発明した多機能塩基配列設計法 （特開 2 0 0 1— 3 5 2 9 9 0 ) を用い、 複数の読み枠に複数の機能や構造に対応したペプチド をコ一ドするようにデザィンし、 その重合体をフレームシャツフリング 変異導入出発材料とすることから、 潜在能力の高いライブラリーを調製 することができる。 また、 複数の全ての翻訳読み枠のストップコドンが 排除されたマイクロ遺伝子を、 芝らの発明したマイクロ遺伝子のランダ ム重合体作製法（特開平 9一 1 54 5 8 5号公報，及び ShibaK., et al.， J. Biochem. 132:689-696, 2002) を用いて重合させることにより、 全て の翻訳読み枠でストップコドンが出現しない大きな D N Aを調製するこ とができる。
以上のような方法で調製した全ての読み枠でストップコドンが出現し ない D N Aを出発材料にして、 これにランダムに翻訳読み枠の乗換え変 異、 すなわちフレームシフト変異を導入することにより、 大きく配列の 離れた変異体から構成される人工タンパク質遺伝子ライブラリーを調製 することができる （図 1 )。
翻訳読み枠の乗換え変異、 すなわちフレームシフト変異を導入するに は、 化学化合物による D N A処理、 マンガンイオン存在下での P C R (error prone P C R法）、 人工ヌクレオチド誘導体や、 誤り率を高くし た変異体 D N Aポリメラーゼを用いた P C Rなどが考えられる。 しかし ながら、 これらの従来手法では、 塩基置換は効率良くおこるおものの、 翻訳読み枠の乗換えを誘導する、 塩基の欠失ゃ揷入といったフレームシ フト変異は低頻度でしか生じない。 十分なフレームシフト変異を導入す るために、 全体の変異導入効率をあげてしまうと、 塩基置換の中から、 高頻度に終止コドンの出現がおこるといった問題が生じる問題をもつ。 したがって、 上述の目的のように、 ランダムにフレームシフト変異を効 率良く導入する方法には、 そのような性質をもつ D N Aポリメラーゼを 用いる必要がある。
Y—ファミリー D N Aポリメラ一ゼ （Y- family DNA polymerase) は、 近年注目されている DNAポリメラーゼの一群であり （Ohmori H.， et al. , Mol. Cell 8:7-8, 2001)、 損傷乗り越え複製の能力や、 複製反応時 の忠実度が低く一塩基の欠失（single nucleotide delet ion)を起こしや すいなどの性質が知られている。 特に一塩基の欠失はフレームシフト変 異そのものであるため、 この性質を利用してランダムにフレームシフト 変異を導入することが可能となると予想された。 遺伝子工学的にこれら の酵素を利用しようと考えた場合、 耐熱性に優れ、 P C Rを行うことが できることが報告されている好熱古細菌 Sulforobus solfataricus P2 の Y—ファミリ一 D N Aポリメラーゼ （Boudsocq, F.， et al. Nucleic Acid Res. 29， 4607, 2001) が有用である。 また、 この酵素は铸型の D NAに損傷塩基が含まれていた場合、 その部分を欠失した複製産物が高 い割合で得られることが分かっており、 この性質を利用してフレ一ムシ フト変異の導入率を制御できると考えられる。 また、 単純に複製反応自 体の回数を増やすことによつてもフレ一ムシフト変異の導入率の制御が 可能である。
各翻訳読み枠のストップコドンが排除されている人工遺伝子 p YT 3 2 0をマイク口遺伝子重合法で調製し、 これを铸型として Y—ファミリ — DNAポリメラーゼによる P C R反応を行い、 フレームシフト変異体 集団の作成を試みた。 その結果、 p YT 3 2 0に対する変異の導入効率 は、 塩基置換率 1. 8 6 %、 フレームシフト変異率 0. 5 5 %であり、 クロ一ンあたり平均 1回以上のフレームシフト変異の導入を行うことが できた。
同じく P YT 3 2 0を铸型として従来の error prone P C R法で変異 導入をおこなってみると、 3 3サイクルの変異導入ではフレームシフト 変異率 0. 0 9 %にすぎなかった。 Y—ファミリー D N Aポリメラーゼ で得られたフレームシフト変異率 0. 5 5 %に近い効率 （ 0. 44 %) を得るためには 9 9サイクルの error prone P C Rが必要であつたが、 この条件では塩基置換変異率が 7 . 3 1 %と跳ね上がってしまい、 終止 コドンが頻発するためにライブラリーの多くのクロ一ンは短いタンパク 質しかコードしな.いといつた重大な問題がおこってしまう。
以上のように、 Y —ファミリ一 D N Aポリメラーゼを利用することに より、 塩基置換変異を抑えながら、 フレームシフト変異を導入すること が可能となった。
フレームシャツフリング法で得られた変異体遺伝子から大腸菌内での タンパク質の発現を試みたところ、 フレームシフトが導入された変異体 遺伝子 1 2種のうち、 5種の発現を確認した。
次いで、 得られた変異体タンパク質を精製し、 その物理化学的な性質 を解析した。 変異体タンパク質のストークス半径は、 変異導入により 1 3 . 5 Aから 5 3 . 8 Aまで変化することが確認され、 これら変異体夕 ンパク質の動的光散乱測定では変異導入により単分散から多分散へと変 化することが確認された。 沈降平衡法による超遠心.分析で、 変異導入に よるタンパク質の平均分子量の変化、 すなわちサブユニッ トの会合状態 の変化が確認された。 変異体タンパク質の二次構造含量を円偏光二色性 スぺク トルにより確認したところ、 その aヘリックスの量は 0 %から 5 5 . 8 %と変異体タンパク質により大きく異なっていた。 また、 いくつ かの変異体タンパク質の二次構造の熱及び変性剤濃度に対する安定性は、 それぞれ異なっていた。
このように、 ランダムにフレームシフト変異を遺伝子に導入すること により、 その翻訳産物である変異夕ンパク質の諸性質が大きく変化する ことが示された。 すなわち、 従来の e r ror prone P C Rなどによる変異 体集団の作成法では得られなかった、 多様な物理化学的性質を持つ変異 体集団が得られることが明らかとなった。 本発明は、 以上の知見に基づ いて完成するに至ったものである。 発明の開示 .
すなわち本発明は、 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あ らかじめ停止コドンを排除した遺伝子 DNA配列を調製し、 該遺伝子 D NA配列を、 複製時に高頻度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラ一ゼ で増幅することにより、 ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DN A集団を調製し、 該遺伝子 DN A集団を発現させることを特徴とす るタンパク質分子多様性集団の作製方法 （請求項 1 ) や、 複製時に高頻 度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラ一ゼが、 複製時に高頻度に塩基 の欠失を起こす DN Aポリメラーゼであることを特徴とする請求項 1記 載のタンパク質分子多様性集団の作製方法 （請求項 2) や、 複製時に高 頻度に塩基の欠失を起こす DN Aポリメラ一ゼが、 Y—ファミリー DN Aポリメラ一ゼであることを特徴とする請求項 2記載のタンパク質分子 多様性集団の作製方法 （請求項 3) や、 遺伝子 DN A配列の 3種類の翻 訳読み枠から、 あらかじめ停止コドンを排除した遺伝子 DN A配列を、 少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリゴヌクレオチド A及び ォリゴヌクレオチド Bに、 D N Aポリメラ一ゼを作用させてポリメラー ゼ連鎖反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項 1〜 3の いずれか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法 （請求項 4) や、 遺伝子 DN A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを 排除した遺伝子 DNA配列を、 所定の機能を有するアミノ酸配列をコ一 ドする塩基配列のすべての組合せの中から、 前記所定の機能を有するァ ミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、 前記所定の機能と同一 又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製することを 特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のタンパク質分子多様性集団の 作製方法（請求項 5 )や、遺伝子 DN A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 D N A配列を、 マイクロ遺伝子 断片の一端に特定の D N A配列 「A」、 他端に特定の DNA配列 「B」 を 付加し、 DNA配列 「八」 .及び 「B」 にそれぞれ相補的な配列を少なく とも一部含む DNA配列 「 a」 及び 「b」 を調製し、 該 DNA配列 「 a」 と 「b」 とが連結した一本鎖 DNAを用いて該マイクロ遺伝子のリガ一 ゼ反応を行うことにより調製することを特徴とする請求項 1〜 3のいず れか記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法（請求項 6 )に関する。
また本発明は、 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらか じめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DN A配列を調製し、 該遺伝子 DNA 配列を、 複製時に高頻度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラーゼで増 幅することを特徴とするランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DNA集団の調製方法 （請求項 7) や、 複製時に高頻度に塩基の変異を 起こす DNAポリメラ一ゼが、 複製時に高頻度に塩基の欠失を起こす D N Aポリメラーゼであることを特徴とする請求項 7記載のランダムにフ レームシフトが導入された遺伝子 D N A集団の調製方法（請求項 8 )や、 複製時に高頻度に塩基の欠失を起こす D N Aポリメラーゼが、 Y—ファ ミリ一 DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項 8記載のラン ダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DN A集団の調製方法 （請求 項 9) や、 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停 止コ ドンを排除した遺伝子 D N A配列を、 少なくとも一部の配列が互い に相補しているオリゴヌクレオチド A及びオリゴヌクレオチド Bに、 D N Aポリメラ一ゼを作用させてポリメラ一ゼ連鎖反応を行うことにより 調製することを特徴とする請求項 7〜 9のいずれか記載のランダムにフ レームシフトが導入された遺伝子 DNA集団の調製方法 （請求項 1 ひ） や、 遺伝子 D N A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コド ンを排除した遺伝子 DN A配列を、 所定の機能を有するアミノ酸配列を コードする塩基配列のすべての組合せの中から、 前記所定の機能を有す るアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、 前記所定の機能と 同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製するこ とを特徴とする請求項 7〜 9のいずれか記載のランダムにフレームシフ トが導入された遺伝子 DN A集団の調製方法 （請求項 1 1 ) や、 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コドンを排除し た遺伝子 D N A配列を、 マイク口遺伝子断片の一端に特定の DN A配列 「A」、 他端に特定の DNA配列 「B」 を付加し、 DNA配列 「A」 及び 「B」 にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含む DNA配列 「a」 及び 「b」 を調製し、 該 DNA配列 「a」 と 「b」 とが連結した一本鎖 DN Aを用いて該マイク口遺伝子のリガーゼ反 |Sを行うことにより調製 することを特徴とする請求項 7〜 9のいずれか記載のランダムにフレ一 ムシフトが導入された遺伝子 DNA集団の調製方法 （請求項 1 2 ) に関 する。 図面の簡単な説明
第 1図は、 本発明の概略を示す写真である。
第 2図は、 Υ- family DNA polymerase による P C Rの結果を、 1 %ァ ガロースゲルで泳動後の写真として示す写真である。 上端に用いた铸型 の種類を示す。
第 3図は、 本発明の各変異体クローンの予想される翻訳産物の配列を 示す写真である。
第 4図は、 本 明の各変異体クローンの予想される翻訳産物の配列を 示す写真である。
第 5図は、 本発明の各変異体クローンの大腸菌での発現を示す写真で ある。 発現誘導後の大腸菌培養液に含まれる総タンパク質を P AGゲル 1 5 / 2 5 (第一化学薬品） で分離。マーカーは夕ンパク質マーカー「第 一」 3 (第一化学薬品） で、 上からそれぞれ 9 9、 6 6、 42、 3 0、 2 0、 1 4 kD a。 各変異体の番号はゲルの上端に示した。
第 6図は、 本発明の各変異体タンパク質の CDスペク トルを示す写真 である。 得られた円二色性値は残基平均モル楕円率としてグラフに表し た。
第 7図は、 本発明の 5 °Cから 9 5 °Cの温度に対する各タンパク質の 2 2 2 nmの C D値の変化を示す写真である。 各タンパク質で異なる C D 値を示すため、 5 °Cのときを 0、 9 5 °Cのときを 1 として規格化して表 示した。
第 8図は、 本発明の塩酸グァニジン濃度を 0 Mから 6 Mまで変化させ たときの、各タンパク質の 2 2 2 nmの CD値の変化を示す写真である。 各タンパク質で異なる C D値を示すため、 0 Mのときを 0、 6 Mのとき を 1 として規格化して表示した。 発明を実施するための最良の形態
本発明のタンパク質分子多様性集団の作製方法としては、 天然の遺伝 子等の遺伝子 D N A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DNA配列を調製し、 該遺伝子 DNA配列を、 複 製時に高頻度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラ一ゼで増幅すること により、 ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DNA集団を調 製し、 該遺伝子 DN A集団を発現させる方法であれば特に制限されるも のではなく、 また、 かかるタンパク質分子多様性集団の作製に用いられ る本発明のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DN A集団の 調製方法としては、天然の遺伝子 D N A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DNA配列を調製し、 該遺伝子 DNA配列を、 複製時に高頻度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラー ゼで増幅する方法であれば特に制限されるものではない。
上記複製時に高頻度に塩基の変異を起こす D N Aポリメラーゼとして は、 複製時に高頻度に塩基の欠失、 置換、 付加等の変異を起こす DNA ポリメラ一ゼであれば特に制限されないが、 中でも DNAポリメラ一ゼ 複製時に高頻度に塩基の欠失を起こす DN Aポリメラーゼを好適に例示 することができる。 具体的には、 D NA.ポリメラーゼ複製時に高頻度に 塩基の欠失を起 こす D N Aポ リ メ ラーゼと して、 Sulforobus solfataricus PI の Y—ファミ リー D N Aポリ メ ラーゼ（po 1Y1)、 Sulforobus solfataricus P2 の Y—ファミ リー D N Aポリメラーゼ (polYl又は Dpo4)、 大腸菌の Umu C、 大腸菌の D i n B、 DNAポリ メラ一ゼ？7、 DNAポリメラ一ゼ 、 DNAポリメラーゼ 、 R e V 3 0等を、 その他の塩基の変異を起こす D NAポリメラーゼとして、 Mutazyme DNA ポリメラ一ゼ （ストラタジーン社、 La Jolla), 大腸菌の D N Aポリメラーゼ （ p o 1 A) 変異体（Camps., Μ· , et al. , MAS 100:9727-9732, 2003)等を例示することができる。
また、 上記の天然の遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あ らかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DN A配列の調製方法は特に制限 されないが、 例えば、 少なくとも一部の配列が互いに相補しているオリ ゴヌクレオチド A及びォリゴヌクレオチド Bに、 D N Aポリメラーゼを 作用させてポリメラーゼ連鎖反応を行うことにより調製する、 特許第 3 4 1 5 9 9 5号公報に詳述されている方法や、 所定の機能を有するアミ ノ酸配列をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、 前記所定の 機能を有するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、 前記所 定の機能と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択する、 特開 2 0 0 1 — 3 5 2 9 9 0号公報に詳述されている方法や、 マイク口遺伝子断 片の一端に特定の DN A配列 「A」、 他端に特定の DNA配列 「B」 を付 加し、 DNA配列 「A」 及び 「B」 にそれぞれ相補的な配列を少なくと も一部含む DNA配列 「 a」 及び 「b」 を調製し、 該 DNA配列 「a」 と 「b」 とが連結した一本鎖 DNAを用いて該マイクロ遺伝子のリガ一 ゼ反応を行う、 特開平 9一 1 54 5 8 5号公報に詳述されている方法な どを有利に挙げることができる。
また、 上記のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DN A集 団を発現させる方法としては、 遺伝子 DN Aを発現させる公知の方法で あればどのような方法でもよい。 例えば、 発現系としては、 遺伝子 DN ' Aを宿主細胞内で発現させることができる発現系であればどのようなも のでもよく、 染色体、 ェピソ一ム及びウィルスに由来する発現系、 例え ば、 細菌プラスミ ド由来、 酵母プラスミ ド由来、 S V 4 0のようなパポ バウィルス、 ワクシニアウィルス、 アデノウィルス、 鶏痘ウィルス、 仮 性狂犬病ウィルス、 レトロウイルス由来のベクタ一、 バクテリオファー ジ由来、 トランスポゾン由来及びこれらの組合せに.由来するべクタ一、 例えば、 コスミ ドゃファージミ ドのようなプラスミ ドとバクテリオファ ージの遺伝的要素に由来するものを挙げることができる。 これら発現系 は、 発現を起こさせるだけでなく、 発現を調節する制御配列を含んでい てもよい。
上記宿主細胞としては、 大腸菌、 ストレプトミセス、 枯草菌、 ストレ プトコッカス、 スタフイロコッカス等の細菌原核細胞や、 酵母、 ァスぺ ルギルス等の真核細胞や、 ドロソフイラ S 2、 スポドプテラ S f 9等の 昆虫細胞や、 L細胞、 CHO細胞、 CO S細胞、 H e L a細胞、 C 1 2 7細胞、 BAL B/c 3 T 3細胞 （ジヒドロ葉酸レダクターゼゃチミジ ンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、 BHK 2 1細胞、 HEK 2 9 3細胞、 B owe sメラノ一マ細胞、 卵母細胞等の動物細胞や植物細胞 などを挙げることができ、 また、 遺伝子 DNAが組み込まれた発現系の 宿主細胞への導入は、 Davis ら （BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986) 及び Sambrookら (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989) などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法、 例え ば、 リン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 D EAE—デキストラン 媒介トランスフエクシヨン、 トランスべクシヨン（transvection)、 マイ クロインジェクション、 カチオン性脂質媒介トランスフエクシヨン、 ェ レク トロボレ一シヨン、 形質導入、 スクレープローデイング （scrape loading)、 弾丸導入（bal 1 i s t i c introduction), 感染等により行うこと ができる。
本発明のタンパク質分子多様性集団は、 マーカータンパク質やべプチ ドタグと結合させておく こともできる。 マーカータンパク質としては、 従来知られているマーカータンパク質であれば特に制限されるものでは なく、 例えば、 アル力リフォスファタ一ゼ、 抗体の F c領域、 H R P、 G F Pなどを具体的に挙げることができ、 また本発明におけるペプチド タグとしては、 HA、 F LAG、 My c等のェピト一プタグや、 G S T、 マルト一ス結合夕ンパク質、 ピオチン化ペプチド、 オリゴヒスチジン等 の親和性タグなどの従来知られているべプチド夕グを具体的に例示する ことができる。 かかる融合タンパク質は、 常法により作製することがで きる。
かかる夕ンパク質分子多様性集団を細胞培養物から回収し精製する には、 硫酸アンモニゥムまたはエタノール沈殿、 酸抽出、 ァニオンまた はカチオン交換ク口マトグラフィ一、 ホスホセルロースクロマトグラフ ィー、 疎水性相互作用クロマトグラフィー、 ァフィ二ティークロマトグ ラフィー、 ハイ ドロキシァパタイ トク口マトグラフィーおよびレクチン クロマトグラフィーを含めた公知の方法、 好ましくは、 高速液体クロマ トグラフィ一が用いられる。 特に、 ァフィ二ティークロマトグラフィー に用いるカラムとしては、 例えば、 上記タンパク質分子多様性集団に対 するモノクローナル抗体等の抗体を結合させたカラムや、 上記タンパク 質分子多様性集団に H i sタグ等のペプチドタグを付加した場合は、 こ のべプチドタグに親和性のある N i —NT A等の物質を結合したカラム を用いることにより、 これらのタンパク質分子多様性集団を得ることが できる。
本発明の遺伝子 DN A配列を調製夕ンパク質分子多様性集団は、 例え ば、 以下のようにして作製することができる。 まず、 天然の遺伝子 DN A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コドンを排除した直 鎖状の铸型 D N Aを調製する。 この直鎖状の铸型 D N Aを、 Sulfolobus solfataricus P2 の Y—ファミリ一 D N Aポリメラーゼである D ρ o 4 遺伝子等の複製時に高頻度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラーゼを、 プロモータ一を含む発現用プラスミ ドに組み込み、 .これを大腸菌等の宿 主で発現させた後に精製した、 複製時に高頻度に塩基の変異を起こす D N Aポリメラーゼを用いた P C Rにより増幅し、 ランダムにフレームシ フトが導入された遺伝子 DN A集団をクローニングする。 次に、 クロ一 ニングしたランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DN A集団を 常法により大腸菌等の宿主で発現させ、 精製することにより得ることが できる。
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明の技術 的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。 実施例 1 (D p o 4遺伝子の発現）
Sulfolobus solfataricus P2の Y—フアミリー DNAポリメラーゼで ある D ρ ο 4遺伝子が Τ 7プロモータ一を含む発現用プラスミ ド ρ Ε Τ 2 2 b ( + ) (ノバジェン， Madison)に組み込まれているプラスミ ド p 1 9 1 4 (Boudsocq, F. , et al. ucleic Acid Res. 29, 4607, 2001)を含 む大腸菌 Rosetta(DE3)pLysS (ノバジェン）を 5 0 gZm 1カルべニシ リン（シグマ社， St. Louis)と 2 5 UL gZm 1 クロラムフエニコ一ル （シ グマ） を含む L B培地 （MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. , 1989) 5111 1で 3 7 ° 、 1 6時間以上培養した。 その後、 培養液を 5 0 mLポリプロピレン製遠心管 （旭テクノグラス，千葉） に移し、 低速遠心 機 H— 3 R (コクサン，東京） で 3 0 0 0 r p mで 1 5分遠心して菌体を 沈殿させた後に上清を除き、 同量の同じ抗生物質を含む培地に再び懸濁, した。 この大腸菌懸濁液を 3 0 0 m l枝付きフラスコ中の同じ抗生物質 を含む 1 0 0 mLの培地に 1 m 1接種して 3 7 で約 4時間培養し、 大 腸菌の増殖の度合いを比色計（タイテック社，東京） で 6 6 0 nmの吸光 度の経時変化により確認し、 OD66。= 0. 4に達してから、 イソプロピ ルー）3 — D—チォ一ガラクトピラノシド（以下 I P T G、夕カラバイオ、 滋賀） を終濃度 I mMになるように添加し、 さらに 3時間培養した。 そ の後、 培養液を低速遠心機と 5 0 m 1ポリプロピレン製遠心管で 3 0 0 O r p m, 1 5分で回収し、 一 8 0 °Cで保存した。 実施例 2 (D p o 4の精製）
保存した組換えタンパク質の発現を誘導した大腸菌を、 氷上で解凍し、 カラムバッファー （2 0 mM H E P E S (シグマ） p H 7. 0 , 7 5 m M 塩化ナトリウム （和光純約工業、 東京）， 0. I mM エチレンジアミ ン四酢酸 （以下 E D TA、 和光純約工業）， I mM ジチオトレイ トール (シグマ）， I mM フエ二ルメチルスルホニルフルオリ ド （以下 P M S F、 シグマ），） 2 mLに懸濁した後に、 超音波装置用スピッツチューブ ( A S— 1 0 0 0、東湘電気）に入れ、超音波細胞粉砕装置（Biorupter、 コスモバイオ、 東京） を用いて、 出力 2 0 0 Wで 5 0秒間隔をおいて 1 0秒照射し、これを 5回繰り返して菌体を破砕した。破砕した菌体を 1.
5 m 1エツペンドルフ管に移し、微量高速遠心機（MRX- 150および TMA II ローター、 トミー社、 東京） で 1 5 0 0 0 r p m、 1 0分間遠心して不 溶性画分を除き、 上清を得た。 この上清を再び別のエツペンドルフ管に 移し、 ヒートブロック AL B— 1 2 0 (旭テクノグラス） で 5 5°Cに 1 0分間加熱し、 夾雑タンパク質を凝集させ、 再び微量遠心機で 1 5 0 0 0 r pmで 1 0分間遠心することにより、 組換えタンパク質を含む粗 分画液を得た。 得られた粗分画液を H i — L o a d— S 1 6/ 1 0 力 ラム（フアルマシアバイオテック社， Uppsala)及び F P L Cシステム（フ アルマシアバイオテック） により精製した。 流速 2. 5m l Z分で粗抽 出液約 2 m 1 をカラムに通じた後に、 同じ流速で 1 0 O mLの 5 OmM 塩化ナトリゥムを含むカラムバッファーでカラムを洗浄し、 その後流速 5 m l Z分で塩化ナトリゥム濃度を 1 0 0 0 mMまで線形に変化させて. 組換えタンパク質を溶出した。 溶出液を 8m 1ずつ分取し、 その各分画 の一部をマルチゲル 1 5 Z2 5 (第一化学 東京） と電気泳動槽 「第一」
(第一科学）、 及び電気泳動用電源装置 AE - 84 5 0 (アト一，東京） を用いた S D S— PAGEにより分離後、 ゲルを C B B染色（Phast gel blue- R， フアルマシアバイオテック）することにより溶出されたタンパ ク質を検出し、 組換えタンパク質 D p o 4が含まれている分画を集め、 CENTRIPREP10 (アミコン， Bever ly)で 3 m g /m 1 のタンパク質濃度ま で濃縮し、 _ 2 0°Cで保存した。 実施例 3 (铸型の調製）
P YT 3 2 0 (配列番号 1 ) 及び p YT 2 8 8 (配列番号 2 ) を鐽型 とした P C Rにより直鎖状の铸型 D N Aを調製した。 p YT 3 2 0及び P YT 2 8 8は、 あらかじめ各翻訳読み枠の停止コドンを排除したマイ クロ遺伝子をもとに、 マイクロ遺伝子重合法 （特許 3 4 1 5 9 9 5号公 報参照） により人工的に作製した遺伝子配列を含むプラスミ ドである (Shiba K.， et al. J. Mol. Biol. 320:833, 2002)。 p YT 3 2 0又は p Y T 2 8 8のプラスミ ド DNA 2 n gを含む、 P C R反応液を調製し た。この反応液には、 1 0mM 2—アミノー 2—ヒドロキシメチルー 1， 3—プロパンジオール塩酸塩 （以下トリス塩酸） pH 8. 3， 5 0 mM 塩化力リウム， 1. 5 mM塩化マグネシウム， 5 0 nMd NTP s , 3. 5uni ts High Fider i ty Taq DNA polymerase (ロシュ ダイァグノスティ ックス社， Basel)及びプライマー KY 1 0 8 7 (配列番号 3 ： 5' -GGA TAA CAA TTC CCC TCT AGA AAT-3' ), K Y 1 0 8 6 (配列番号 4 : 5' -TTG CTC AGC GGT GGC AGC AGC CAA- 3')が各々 3 0 0 pmo l含まれる。 この反応液を 2 0 0 2 L thin wall PCR チューブ （東洋紡績，大阪） に入れ、 サーマ ルサイクラ一 PCR- 2400 (パ一キンエルマ一， Norwalk) による温度サイク ル （ 9 4 °Cで 3 0秒、 5 5 °Cで 3 0秒、 7 2 °Cで 3 0秒を 3 0回） によ り反応を行った。 増幅した DNAを 1. 0 %TAEァガ口一スゲル （ァ ガロース ME 岩井化学 東京）、及び Mupid II電機泳動装置（コスモ - バイオ 東京） を用いて 1 0 0 V, 3 0分の電気泳動で分離し、 目的の 大きさのバンドをゲルより切り出した後に、 GeneClean II kit (キュー バイオジーン， Carlsbad) により精製した。 得られた DN Aを再び T A Eァガロースで電気泳動し、 バンドをェチジゥムブロミ ド （シグマ） で 染色し、 その蛍光強度を濃度既知の DNAと比較することにより、 その 濃度を决定した。 実施例 4 (Y- polymeraseによる P C R)
7 4 0 mMトリス塩酸 （ p H 8. 0 ), 5 mM塩化マグネシウム， 1 0 mMジチオトレイ トール，. 6 0 mM塩化力リウム， 1 Mベタイン （シグ マ）， 4 8 0 n M d NT P s , 4 8 0 n m o 1 のプライマー K Y 1 0 8 7及び Κ Υ 1 0 8 6、 並びに実施例 3で調製した铸型 ρ ΥΤ 3 2 0及び Ρ ΥΤ 2 8 8の DNA各 l O n gを含む反応溶液をそれぞれ調製した。 サーマルサイクラ一で 9 9. 9°Cで 5分加熱し、 その後 9 0°Cに温度を 下げ、 実施例 2で調製した精製済みの D p o 4を 1. 5 g添加した。 その後、 温度サイクル 9 0 °Cで 3 0秒， 5 5 °Cで 2 0秒， 6 5 °Cで 3分 を 3 0回繰り返した後に 4°Cに温度を下げ、 反応を終了した。 反応産物 の 1 0 Lを TAE—ァガロースゲルに泳動し、 増幅の確認をした （図 2 )。 実施例 5 (クローニング)
上記の各 P C R反応産物 40 Lを 1. 0 %TAEァガロースゲルで 分離し、 特異的に増幅したバンドをゲルから切り出し、 G e n e C l e a n il k i tにより精製した。 精製 DNAを铸型として、 内側のブラ イマ一 KY 8 3 7 (配列番号 5 ： 5' -AAT TTT GTT TAA CTT TAA GAA GGA GA-3' ), K Y 8 3 6 (配列番号 6： 5' -TCA GCT TCC TTT CGG GCT TTG TTA-3' ) を用いて P C R反応を行った。 その他の反応条件等は上記実施例 3と同 様に行った。 各反応産物を同様にァガロースゲル電気泳動と DNA精製 キッ トにより精製し、 その後、 制限酵素 Sal I 及び Spe I (ニューイン グランドバイオラブス， Beverly) で切断し、 同酵素で切断済みのベクタ — p K S 6 0 0 (配列番号 7) へとライゲ一ションした。 p KS 6 0 0 は市販の大腸菌発現用のプラスミ ド p QE 9 (キアゲン， Hilden) のマ ルチプルクローニングサイ トを改変したものであり、 前述の制限酵素サ ィ トを含んでいる。 そのライゲーション反応液を大腸菌 XL卜 blue (スト
8 ラタジーン， La 〗olla) に形質転換し、 インサートを含む 2 0クローン を選択し、 そのプラスミ ドを QIAGEN mini kit. (キアゲン） により精製 し、 DTCS cycle sequence reaction kit (ベックマン） を用いたダイ夕 一ミネィ ト法によりキヤピラリーシーケンサ一 CEQ2000XL DNA analyzer (ベックマン） で配列を決定した。 実施例 6 (変異導入の解析）
Y - family DNA polymerase により p YT 3 2 0の遺伝子をコードする 領域を増幅し、 それを元にしたライブラリーからランダムにピックァッ プした 2 0クローンの Sal Iサイ トから Spe Iサイ トまでの DNA配列 を決定した結果、 2つのクロ一ン （ ¾：1 1 0 6— 1 2と 1：111 0 6 - 1 9 ) を除く全てのクローンに変異が導入されていることを確認した (配列番号 8〜2 7 ; ρ ΚΚ 1 0 6— 1〜ρ ΚΚ 1 0 6— 2 0)。 これら 2 0クローンの塩基置換率は 1. 8 6 %、 フレームシフト変異率は 0. 5 5 %であった。
従来用いられているミュ一夕ジエネシス P C R (Bartel D. P. , et al. Science 261:1411-8, 1993) による p Y T 3 2 0の同じ領域に対して変 異導入の割合を確認したところ、 3 3サイクルの反応では塩基置換率は 2. 1 4 %、 フレームシフト変異率は 0. 0 9 %であり、 9 9サイクル の反応では塩基置換率は 7. 3 1 %、 フレームシフト変異率は 0. 44 % であった （表 1)。 これらと比較して、 Y- family DNA polymeraseを用い た P C Rは従来のミュ一タジエネシス P C Rよりもストップコドンの出 現を引き起こす塩基置換変異の割合が低く、 フレームシフト変異の導入 効率が高いことが明らかとなつた。 (表 1 )
Figure imgf000021_0001
そして、 Y- family DNA polymerase により得られた変異体 2 0クロー ン中 1 2クローンにフレームシフト変異が導入されていた。それらの内、 遺伝子の途中で停止コドンが生じたクローンは 6クローンで、 1 4クロ ーンは全長が翻訳されるようになつていた （図 3 )。
また、 Y- fami DNA polymerase により p Y T 2 8 8の遺伝子をコ一 ドする領域を増幅し、 それを元にしたライブラリ一からランダムにピッ クアップした 2 0クローンの Sal Iサイ トから Spe Iサイ トまでの DN A配列を決定した結果、 1つのクローン （P KK 1 0 5— 3) を除く全 てのクローンに変異が導入されていることを確認した （配列番号 2 8〜 4 7 ; p KK 1 0 5 - l , ρ ΚΚ 1 0 5— 3〜ρ ΚΚ 1 0 5— 1 0， ρ ΚΚ 1 0 5— 1 2〜ρ ΚΚ 1 0 5 - 2 2)。解析した 2 0クロ一ン中の 4 クローンは約 3 0 '〜4 0アミノ酸残基分の欠失を含んでいた。 これら 4 クローンを除く 1 6クローンの塩基置換率は 1. 6 0 %、 フレームシフ ト変異率は 0. 4 7 %であった。 2 0クロ一ン中 1 7クロ一ンにフレ一 ムシフト変異が導入されていた。 それら 1 7クローンの内、 遺伝子の途 中で停止コ ドンが生じたクローンは 5クローンで、 欠失を含まない残り の 1 2クローンは全長が翻訳されるようになっていた （図 4)。 これらの 配列を翻訳することにより得られると予想されるアミノ酸配列は、 錡型 としたクローンと異なる翻訳読み枠が出現している（図 3及び図 4) (配 列番号 48〜6 7 ； 1 0 6— 1〜： 1 0 6 - 2 0、 及び 6 8〜 8 7 ； 1 0 5 - 1 , 1 0 5— 3〜； 1 0 5— 1 0 , 1 0 5 - 1 2〜： I 0 5— 2 2 )。 実施例 7 (変異体タンパク質の発現）
各変異体夕ンパク質をコードするプラスミ ドを含む大腸菌 XL卜 Blue を 5 0 g/mLのカルべニシリンと 1 %のグルコースを含む L B培地 l mLに接種し、 3 7 °Cで 1 6時間培養した。 得られた一晩培養液 6 0 Lを 1. 5 mLエツペンドルフ管に移し、 微量高速遠心機で 1 0 0 0 0 r pmで 1分間遠心して上清を除き、 菌体を同濃度のカルべニシリン とグルコースを含む L B培地 6 mLに懸濁し、 あらかじめ滅菌しておい た直径 1 8 mmのパイレックスガラス製試験管 （旭テクノグラス）. に入 れ、 3 7 °Cにて 1 5 0 r pmで振盪培養した。 比色計で O D 66。の吸光度 の経時変化を測定し、 約 3時間後に OD66„が 0. 3に達したのを確認し てから、 終濃度 1 mMになるように I PTGを添加し、 さらに 2時間培 養した。 その後、 変異体タンパク質を発現した大腸.菌を含む培養液 1 0 0 を 1. 5 mLエツペンドルフ管に移し、 微量高速遠心機で 1 0 0 0 0 r p mで 1分間遠心して上清を除き、 1 0 0 Lの S D S— PAG Eサンプルバッファ一 （ 1 2 5 mM トリス塩酸 p H 6. 8， 5 % β — メルカプトエタノール， 2 %ラウリル硫酸ナトリウム， 5 %スクロース， 0. 0 1 % ブロモフエノールブルー） に菌体を溶解し、 ヒートブロッ で 9 5 °Cに 5分間加熱した後に S D S— P AGEにより夕ンパク質を分 離し、 C B B染色によりタンパク質を検出した。 得られた泳動像 （図 5 ) により、 フレームシフト変異体 （ 1 0 6— 3， 1 0 6 - 8 , 1 0 6 - 1 0 , 1 0 6— 1 1， 1 0 6— 1 3及び 1 0 5 _ 4， 1 0 5— 7 , 1 0 5 一 8， 1 0 5 - 9 , 1 0 5— 1 0， 1 0 5— 1 2 , 1 0 5 - 1 3， 1 0 5 - 1 7 , 1 0 5— 1 9， 1 0 5 - 2 2 ) の発現を確認した。
2 実施例 8 (変異体タンパク質の精製）
Y T 3 2 0由来の変異体夕ンパク質である 1 0 6— 3， 1 0 6— 8， 1 0 6— 1 0， 1 0 6 - 1 1 , 1 0 6— 1 3、 及び変異を含まない 1 0 6— 1 2をコードするプラスミ ドを含む大腸菌 XLl_Blue を 5 0 g Z mLのカルべニシリンと 1 %のグルコースを含む L B培地 2 5 m Lに接 種し、 3 7でで 1 6時間振盪培養した。 得られた一晩培養液を 5 OmL 遠心管に移し、 低速遠心機で 3 0 0 0 r 111で 1 5分間遠心して上清を 除き、 菌体を同濃度のカルべニシリンとグルコースを含む L B培 5 0 0 mLに懸濁し、あらかじめ滅菌しておいた羽根つき 3 Lフラスコに入れ、 3 7 にて 1 0 0 r pmで振盪培養した。 比色計で〇 D 66。の吸光度の経 時変化を測定し、 約 3時間後に〇D66。が 0. 3に達したのを確認してか ら、 終濃度 1 mMになるように I P T Gを添加し、 さらに 3〜4時間培 養した。 その後、 変異体タンパク質を発現した大腸菌を含む培養液を 2 5 OmL遠心管 （ベックマン） に移し、 ベックマン遠心機 （HP301, JA-14 rotor, ベックマン） で 3 0 0 0 gで 1 5分間遠心して上清を除き、 菌体 を 5 0 mL遠心管に移して— 8 0 で保存した。
組換えタンパク質は、 ヒスチジンタグを利用して、 変性条件下で精製 を行った。 まず、 保存した大腸菌を溶解バッファー （ 5 0 mMリン酸ナ トリウム， 1 0 mMトリス塩酸 p H 8. 0 , 6 M塩酸グァニジン （ナカ ライテスク）， 1 0 0 mM塩化ナトリウム， I mM PMS F) 40 mL に懸濁し、 3 7 °Cで 1時間穏やかに振盪することにより菌体を溶解した。 その後、 べックマン遠心機 （ J A— 1 2ロータ一） で 7 0 0 0 g, 3 0 分遠心分離し、 上清を別のチューブに移した。 これに、 あらかじめ溶解 ノ ツファーへと置換した T A L ON レジン （クロンテック） の 5 0 % 懸濁液 4 mLを加え、 マイルドミキサ一 （P R 1 2 , タイテック） を用 いて一時間室温で穏やかに撹拌し、 その後、 低速遠心機にて 7 0 0 gで 5分間遠心してから、 上清を除きレジンを回収した。 続いて、 2 0mL の溶解バッファーに再度レジンを懸濁し、 同様に撹拌と遠心分離により レジンを回収し、 2 mLの溶解バッファーにレジンを懸濁して、 ムロマ ックカラム （Mサイズ、 室町化学工業、 東京） にレジンを移し、 溶解バ ッファーを下から滴下して除いた。次いで、 6 mLの洗浄バッファー（ 5 0 mMリン酸ナトリウム p H 7. 0 , 8 M尿素 （ナカライテスク）， 1 0 0 mM塩化ナトリゥム， 1 5 mMィミダゾール （和光純薬工業）） により レジンを洗浄し、 8 mLの溶出バッファ一 （ 5 0 mMリン酸ナトリウム p H 5. 0， 2 0 mM ME S (和光純薬工業）， 8 M尿素， l O O mM 塩化ナトリウム， 2 5 0 mMイミダゾ一ル） によりタンパク質をレジン から解離させ、 溶出した。 溶出液を 1 mLずつ分取し、 S D S— PAG E によ り タ ンパク質を多く 含む分画を確認し、 その 3 m L を Slide-A_Lyzer透析カセッ ト （分画分子量 10, 000, PEBIO, Rockf ord) を用 いて、 5 0 mMトリス酢酸 p H 4. 0， 1 0 0 mM塩化ナトリウム， 1 mM E D T Aを含むバッファ一 5 0 0 m Lに対して透析して尿素を除 き、 CENTRIPREP10 (アミコン） により濃縮して、 — 2 0 で保存した。 実施例 9 (ゲルろ過クロマトグラフィ一による分子量の測定）
得られた変異体タンパク質のストークス半径をゲルろ過ク口マトダラ フィ一により測定した。 まず、 各タンパク質サンプルを 2 0 0 ^ g/m Lに希釈し、 そのサンプルを微量透析装置 （Bio-Tech, 第一化学） 及び サンプル力ップ (分画分子量 8000, 第一化学） を用いて 5 0 mM N a H2P 04 p H 7. 5， 1 5 0 mM塩化ナトリウム， 6 M 塩酸グァニジ ンを含むバッファ一に対して透析することにより完全に変性させた。 次 に、 その一部を 1 Mグァニジンを含む同バッファーに対して透析を行つ た』。 ゲルろ過クロマトグラフィ一は Superose 12カラム （フアルマシア） o
及び F P L Cシステムと亜鉛ランプを用いて行った。 分子量スタンダ一 ドとして、 アルブミン、 ォブアルブミン、 キモトリプシノ一ゲン及びリ ポヌクレア一ゼ A (いずれもフアルマシア) を用いて、 6 Mグァニジン 及び 1 Mグァニジン存在下での変異体夕ンパク質のストークス半径を求 めた （表 2)。 1 Mグァニジンで二本のピークが溶出されたものは、 各々 に対応するスト一クス半径の値を示している。 これらの結果より、 フレ 一ムシフト変異の導入により、 変異体タンパク質のストークス半径が多 様に変化することが示された。
【表 2】
各変異体タンパク質のストークス半径.
6M 塩酸グァニジン 1M 塩酸グァニ .ンン 八マ
于里 測定値 計算値 b 測定値 計算値 έ
#320 12040.6 35.6C 32.4 44.8 17.0
15618.2 39.8 35.6 53.8 33.9 18.4
106 - 8 12714.7 33.9 33.0 36.3 22.2 17.2
106-10 11919.7 34.1 32.3 22.8 16.3 16.9
106-11 9885.3 26.9 30.3 13.5 16.1
106-13 11461.8 25.0 31.9 29.5 20.7 16.7 a, 分十 Mは ProtParam (http://www.expasy.ch/tools/protparam.htmD5r 用いて、予想されるアミノ酸配列から計算
b, 分子量スタンダードタンパク質の溶出ピークの位置から計算
C オングストローム 実施例 1 0 (C Dスペク トルの測定）
変異体夕ンパク質の 2次構造の含量を C Dスぺク トルにより求めた。 まず、各変異体夕ンパク質を終濃度が 5 Mになるように、 p H 8. 0 , 6. 0， 4. 0， 2. 0の 1 0mM リン酸に対して透析し、 その後 1. 5 m 1 のエツペンドルフ管に移し高速微量遠心機で 1 5 0 0 0 r pmで 5分間遠心することにより、 凝集したタンパク質を除いた。 続いて、 調 製したタンパク質溶液 5 0 0 ^ Lをセル長 2 mmの石英セルに入れ、 円 偏光二色性スぺク トル測定器 （ J一 8 2 0， 日本分光， 東京）、 及びペル チェ式ミクロセル装置 （PMH— 4 2 8 L, 日本分光） により、 5°Cで の C Dスペクトルを測定した （図 6 )。変異体タンパク質 1 0 6— 1 1は p H 8のとき、 リン酸バッファ一中で強く凝集したため、 その pHでは測 定不能であった。 得られたスペクトルを 2次構造解析プログラム （日本 分光） により解析した結果、 （表 3 ) に示す割合で 2次構造を含んでいる ことが示された。 この結果より、 フレームシフト変異の導入により、 二 次構造含量が変化することが判明した。
8Γ29 96?し ζτζζ 9Έ9 VZZ vn 0 Γ½ 2'ZZ 8-23 0 9Ί-9 TSL 8*28 0 8L-90L
Li し trot 0 S9 8'9 9"66 0 τη S LI-90L
L8'8し し 6'8 εε·ΐ9 0 Z'Lt 61 6'iS 0 9ε 92 ゲャ ε 9Ό 9SZ V9£ 0L-90L CO
L8 L 8 ' 9 0 6'8Z e l es 6 8'8L 6'8f 8 - 901·
9S'82 96'8 96'8 ereg i'Oャ 0 6U L'SS 9Ό 86 ε·93 0 に 9S ε - 90L
ϋ'ε WZ S,L 8"8L SOS 62 zs rii τη Ύ 11 8'SS 2I--90L
|[00 |IOO e I!03 |ΙΟΟ eqd|e
WdOS)P3 o! 3Jd 9Hd 8HC
Figure imgf000027_0001
O o
次いで、 1 0 6— 1 2， 1 0 6— 8 , 1 0 6— 1 0について、 温度に 対する 2次構造の安定性を調べるため、 温度を 5 °Cから 9 5 °Cまで毎分 1 °Cの速度で変化させて、 2 2 2 nmの CD値の変化を測定した（図 7)。 その結果、 各タンパク質の温度に対する CDスペクトル変化から、 折り 畳み中間体が存在せず、 折り畳み状態及び変性状態の二状態のみの変化 を仮定した場合の Tmは 8 3. 1 0 °C、 6 5. 4 6 °C、 34. 1 3でで あった。 このようにフレームシフト変異により大きく熱安定性が変化す ることが示された。
また、 1 0 6— 1 2 , 1 0 6 - 8 , 1 0 6— 1 0について、 1 0 mM リン酸ナトリウムバッファ一 （p H 6. 0 ) 中で変性剤である塩酸グァ 二ジン濃度を 0 Mから 6 Mまで変化させた時の 2 2 2 nmにおける CD 値の変化を観察した （図 8)。 温度変化の場合と同様に、 折り畳み中間体 が存在せず、 折り畳み状態及び変性状態の二状態のみの変化を仮定した 場合の状態変化の中間点の塩酸グァニジン濃度 （Cm) はそれぞれ 2. 5 M, 1. 1 M, 2. 0 Mであったが、 変性に伴う自由エネルギー変化 (△ GH2〇） を計算したところ、 2. 2 k c a 1 /mo 1 , 1. 9 k c a 1 / o 1 , 1. 3 k c a 1 /m o 1であった。 このように、 塩酸グ ァニジンに対する安定性や変性に伴う自由エネルギー変化はフレームシ フト変異の導入により、 多様に変化することが判明した。 実施例 1 1 (動的光散乱測定）
' 各タンパク質の流体半径を動的光散乱により測定した。 まず、 各タン パク質の終濃度が 2m gZmLになるように希釈し、 5 OmMリン酸、 1 5 0 mM塩化ナトリウムを含むバッファ一に対して透析した。 その結 果、 1 0 6— 1 2， 1 0 6— 8以外のタンパク質は沈殿したため、 5 0 mMトリス酢酸， 1 0 0 mM塩化ナトリウム， 1 mM EDTAのバッフ ァ一中で測定を行った。 動的光散乱測定装置 Dynapro- MS800 (プロティ ンソリュ一ションズ社、 Charlottesville)により流体半径を測定した（表 4)。その結果、変異導入前の 1 0 6— 1 2及び 1 0 6— 8は単分散を示 したが、 その他の変異体タンパク質は多分散を示し、 様々な会合状態を とっていることが示された。
【表 4】
Figure imgf000029_0001
a, pH7.5の時は、 50mM リン酸ナトリウム、 150mM 塩化ナトリウムのバッファーを、 pH4.0の時は、 50mM トリスー酢酸 pH4.0 100mM 塩化ナトリウム、 1 mM EDTAの バッファ一を使用。
b, 流体半径（Rh)は nmで示した。
実施例 1 2 (超遠心分析）
沈降平衡法による超遠心分析により 1 0 6— 1 2， 1 0 6 - 8の平均 分子量を測定した。 まず、 各タンパク質を 2 0 mMリン酸、 2 0 0 mM 塩化ナトリウムに対して透析し、 1 0 6— 1 2は 0. 2 5 , 0. 5， 1 mgZmL, 1 0 6— 8は 0. 0 2 5， 0. 0 5 , 0. l mgZmLの 溶液各々 1 2 0 を調製し、 6穴チヤコール充填エポキシ樹脂製セン ターピース （ベックマン）.と、 バックグラウンド補正用のタンパク質を 含まないバッファ一を各ゥエルに入れ、 石英ガラス製のウィンドウを用 いてセルを組み立てた。 セルを An_Ti60ローター （ベックマン） へと組 み込み、 超遠心分析器 XL— 1 (ベックマン） により 2 8 0 nmの吸光 度を半径方向に対して走査し、 2 0 °C、 2 5 0 0 0 r p mで約 2 0時間 遠心することにより平衡に達した際の半径方向に対する吸光度を記録し. 装置付属の計算機により単量体とした時の分子量を求めた。 その結果、 1 0 6— 1 2では 5 8 2 3 2、 1 0 6— 8では 64 34 3の値が得られ た。 従って、 動的光散乱測定において、 単分散を示した変異体タンパク 質でも、 フレームシフト変異の導入によりタンパク質の会合状態が変化 することが判明した。 産業上の利用可能性
本発明のタンパク質分子多様性集団の作製方法によると、 異なる翻訳 読み枠に途中からアミノ酸配列が入れ代わるため、 既知の方法と比べ多 くの連続したアミノ酸置換変異を導入することが可能となり、 また、 あ らかじめ各翻訳読み枠で停止コドンを排除してあるため、 フレームシフ ト変異により途中で翻訳が止まってしまう可能性も低く、 さらに、 Y— ファミリー DNAポリメラーゼによる複製反応を複数回繰り返すことに より、 より多くのフレームシフトを導入することが可能となる。 したが つて、 本発明によると、 大きく配列の離れた変異体から構成される人工 夕ンパク質遺伝子ライブラリ一を調製するために、 あらかじめ 3つの翻 訳読み枠のストップコドンを排除した D N Aに対して、 ランダムな翻訳 読み枠の乗換え変異を導入し変異体集団を調製することにより、 タンパ ク質分子多様性集団を得ることができる。

Claims

請 求 の 範 囲 1. 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コド ンを排除した遺伝子 DNA配列を調製し、 該遺伝子 DNA配列を、 複製 時に高頻度に塩基の変異を起こす DN Aポリメラーゼで増幅することに より、 ランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 D N A集団を調製 し、 該遺伝子 DN A集団を発現させることを特徴とするタンパク質分子 多様性集団の作製方法。
2. 複製時に高頻度に塩基の変異を起こす DNAポリメラーゼが、 複製 時に高頻度に塩基の欠失を起こす DN Aポリメラーゼであることを特徴 とする請求項 1記載のタンパク質分子多様性集団の作製方法。
3. 複製時に高頻度に塩基の欠失を起こす DNAポリメラ一ゼが、 Y_ ファミリー DNAポリメラーゼであることを特徴とする請求項 2記載の タンパク質分子多様性集団の作製方法。 ■
4. 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コド ンを排除した遺伝子 DN A配列を、 少なくとも一部の配列が互いに相補 しているオリゴヌクレオチド A及びォリゴヌクレオチド Bに、 DNAポ リメラ一ゼを作用させてポリメラ一ゼ連鎖反応を行うことにより調製す ることを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のタンパク質分子多様 性集団の作製方法。
5. 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コド ンを排除した遺伝子 D N A配列を、 所定の機能を有するアミノ酸配列を コ一ドする塩基配列のすべての組合せの中から、 前記所定の機能を有す るアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、 前記所定の機能と 同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製するこ とを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のタンパク質分子多様性集 団の作製方法。
6. 遺伝子 DNA配列の 3.種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コド ■ ンを排除した遺伝子 DNA配列を、 マイクロ遺伝子断片の一端に特定の DNA配列 「A」、 他端に特定の DNA配列 「B」 を付加し、 DNA配列 . 「A」 及び 「B」 にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含む DNA 配列 「 a」 及び 「b」 を調製し、 該 DNA配列 「a」 と 「b」 とが連結 した一本鎖 D N Aを用いて該マイク口遺伝子のリガーゼ反応を行うこと により調製することを特徴とする請求項 1〜 3のいずれか記載のタンパ ク質分子多様性集団の作製方法。
7. 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コド ンを排除した遺伝子 DNA配列を調製し、 該遺伝子 DNA配列を、 複製 時に高頻度に塩基の変異を起こす D N Aポリメラーゼで増幅することを 特徴とするランダムにフレ一ムシフトが導入された遺伝子 DN A集団の 調製方法。 ■
8. 複製時に高頻度に塩基の変異を起こす DNAポリメラーゼが、 複製 時に高頻度に塩基の欠失を起こす DN Aポリメラーゼであることを特徴 とする請求項 7記載のランダムにフレームシフトが導入された遺伝子 D NA集団の調製方法。
9. 複製時に高頻度に塩基の欠失を起こす DNAポリメラーゼが、 Y— ファミリ一 DNAポリメラ一ゼであることを特徴とする請求項 8記載の ランダムにフレ一ムシフ卜が導入された遺伝子 DN A集団の調製方法。
1 0. 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DN A配列を、 少なくとも一部の配列が互いに相 補しているオリゴヌクレオチド A及びオリゴヌクレオチド Bに、 DNA ポリメラーゼを作用させてポリメラ一ゼ連鎖反応を行うことにより調製 することを特徴とする請求項 7〜 9のいずれか記載のランダムにフレー ムシフトが導入された遺伝子 DN A集団の調製方法。
1 1. 遺伝子 DNA配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DNA配列を、 所定の機能を有するアミノ酸配列 をコードする塩基配列のすべての組合せの中から、 前記所定の機能を有 するアミノ酸配列の読み枠とは異なる読み枠において、 前記所定の機能 と同一又は異なる機能を有する塩基配列を選択することにより調製する ことを特徴とする請求項 7〜 9のいずれか記載のランダムにフレームシ フトが導入された遺伝子 DN A集団の調製方法。
1 2. 遺伝子 DN A配列の 3種類の翻訳読み枠から、 あらかじめ停止コ ドンを排除した遺伝子 DN A配列を、 マイクロ遺伝子断片の一端に特定 の DNA配列 「A」、 他端に特定の DNA配列 「B」 を付加し、 DNA配 列 「A」 及び 「B」 にそれぞれ相補的な配列を少なくとも一部含む DN A配列 「a」 及び 「b」 を調製し、 該 DNA配列 「a」 と 「b」 とが連 結した一本鎖 DN Aを用いて該マイク口遺伝子のひガーゼ反応を行うこ とにより調製することを特徴とする請求項 7〜 9のいずれか記載のラン ダムにフレームシフトが導入された遺伝子 DN A集団の調製方法。
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