KR100390769B1 - 단백질의 열안정화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 단백질의 열안정화 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수용성 단백질의 표면에 있는 친수성 아미노산 잔기인 아스파르트산(aspartic acid)을 특이자리돌연변이(site-specific mutagenesis) 기법을 이용하여 글루탐산 (glutamic acid)으로 치환함으로써 열안정성을 높이는 단백질의 열안정화 방법에 관한 것이다. 따라서, 이러한 본 발명에 따르면 서로 유사한 정전기적 형질과 분자량을 지닌 친수성 아미노산이며 대부분 단백질의 표면에 존재하는 아스파르트산을 글루탐산으로 치환함으로써 단백질의 구조가 규명되어 있지 않은 상태에서도 단백질의 구조나 기능에 영향을 주지 않은 채 열안정성을 높일 수 있어 의료, 식품, 화학 등 단백질을 이용하는 각종 산업에 응용할 수 있는 효과가 있다.
Description
본 발명은 단백질의 열안정도 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수용성 단백질 표면에 있는 친수성 아미노산 잔기인 아스파르트산(aspartic acid)을 특이자리돌연변이(site-specific mutagenesis) 기법을 이용하여 글루탐산(glutamic acid)으로 치환함으로써 열 안정성을 높이는 단백질의 열안정화 방법에 관한 것이다.
단백질은 친수성 및 소수성 아미노산 잔기로 구성된 고분자로서 생체 내에서 여러 가지 화학적, 생물학적 기능을 지니고 있다. 단백질의 화학적 기능은 식품, 의약품 제조 등 생화학적 반응을 이용하는 산업에 효소로서 널리 이용되고 있으며, 의약품으로서 단백질이 직접 이용되기도 한다. 단백질의 산업적인 이용시 문제점으로서 대두되는 것이 단백질의 안정성이며 단백질이 안정하지 않으면 산업적으로 이용하는데 유통이나 이용 중 불활성화로 여러 가지 문제점이 야기된다.
따라서, 단백질의 안정성을 개선시키기 위한 노력이 있어왔는데, 종래 단백질을 안정화시키는 방법으로는 다른 첨가제를 넣거나 변이를 유도하여 안정화시키는 방법이 이용되고 있으며, 변이를 이용하는 방법은 대부분이 자연발생적 또는 무작위적 변이를 유도하여 선택한 것이 대부분이었다. 이밖에도, 인위적인 단백질의 안정화방법으로 지금까지 알려진 것은 단백질의 구조형성의 중심을 이루는 소수성 아미노산 잔기의 변이를 통한 방법[Kellis et al., (1988). Nature 333, 784-786; Karpusas et al., (1989). PNAS 86, 8237-8241], 디설파이드 결합(disulfide bond)[Matsumara et al., (1989). Nature 342, 291-293]이나 프로린 아미노산 잔기(proline residue)[Matthews et al., (1987). PNAS 84, 6663-6667]를 치환하여이들의 수를 늘려 줌으로써 엔트로피(entropy)를 변화시켜 안정화시키는 방법, 그리고 나선 이중극자(helix dipole)와 정전기적(electrostatic) 형질을 이용[Nicholson et al., (1988). Nature 336, 651-656]하여 안정화시키는 방법 등이 알려져 있다. 그러나, 이러한 방법들은 단백질의 구조형성에 영향을 줄 수 있어 구조변화에 따른 여러 문제점과 구조를 정확하게 이해하지 않으면 오히려 단백질이 불안정하게 되는 요인이 되기도 한다. 따라서, 최근에는 단백질의 종류에 관계없이 구조 및 기능에 아무런 영향을 주지 않으면서 열안정화시키는 방법에 대한 개발의 필요성이 절실한 실정이었다.
이에, 본 발명의 발명자들은 상기 문제점들을 해결하고자 예의 노력한 결과, 단백질의 구조를 모르는 상태에서도 단백질의 표면에 위치한 아스파르트산을 유사한 정전기적 형질과 분자량을 지닌 글루탐산으로 대체하면 단백질의 구조나 기능에 영향을 주지 않고 단백질을 안정화시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명은 아스파르트산(aspartic acid)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환하는 공정을 포함하는 단백질 열안정화 방법을 제공하는 데에 그 주된 목적이 있다.
도 1은MjTRX와ETRX 야생형 단백질 발현벡터의 제조 방법을 나타낸 것으로서 각 유전자가 이입된 부위를 나타내었다.
도 2은MjTRX와ETRX 변이형 단백질 발현벡터의 제조 방법으로서, DNA 중합 연쇄 반응법(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 이용한 특이자리돌연변이(site-specific mutagenesis)방법을 나타낸다.
도 3는 야생형 및 3개의 글루탐산 (Glu25, Glu36, Glu51)을 아스파르트산으로 치환한 변이형MjTRX의 열 안정성을 나타낸 것이다.
도 4은 야생형 및 3개의 아스파르트산 (Asp15, Asp43, Asp47)을 글루탐산으로 치환한 변이형ETRX의 열 안정성을 나타낸 것이다.
도 5는 야생형 (●) 및 변이형 (○)MjTRX의 활성도를 비교한 그래프이다.
도 6는 야생형 (●) 및 변이형 (○)ETRX의 활성도를 비교한 그래프이다.
본 발명은 아스파르트산(aspartic acid)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환하는 공정을 포함하는 단백질 열안정화 방법에 그 특징이 있다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 수용성 단백질 표면에 있는 친수성 아미노산 잔기인 아스파르트산(aspartic acid)을 특이자리돌연변이(site-specific mutagenesis) 기법을 이용하여 글루탐산(glutamic acid)으로 치환하여 단백질을 열안정화시키는 방법에 관한 것이다.
단백질내의 아미노산 중 친수성 아미노산으로는 아스파르트산(aspartic acid)과 글루탐산(glutamic acid)이 있으며, 이들 아미노산은 친수성이기 때문에 단백질의 표면에 존재하고, 그 형질이 아주 유사한 아미노산 잔기이다. 즉, 이들은 유사한 정전기적 형질을 지니고 있는 산성 아미노산이며, 글루탐산이 아스파르트산보다 하나의 메칠렌기(-CH2-)를 더 가진 것이 다른 점일 뿐이다. 따라서, 형질이 유사한 이들 친수성 아미노산 잔기를 특이자리돌연변이(site-specific mutagenesis) 기법을 이용하여 서로 대체함으로써, 분자량에 많은 차이가 없기 때문에 단백질의 구조를 모르는 상태에서도 단백질의 구조 및 기능에 영향을 거의 주지 않고 보다 안정화시킬 수 있는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 메타노코커스 야나시 티오레독신 (
Mj
TR)과 대장균 티오레독신 (
E
TRX)의 제조
(1) 야생형 단백질 발현벡터의 제조
MjTRX와ETRX는 각각 메타노코커스 자나스치(Methanococcus jannaschii)와 대장균(Escherichia coli)의 유전체를 DNA 주형으로 하여 변성(denaturing)온도 96℃, 서냉복원(annealing)온도 58℃, 합성진행(extention)온도 72℃의 반응조건에서 DNA 중합 연쇄 반응법(PCR, Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 티오레독신(thioredoxin) 유전자를 얻었다. 그리고 야생형 단백질을 발현시키기 위하여 상기 과정을 통해 합성된 티오레독신 유전자를 이용해 pET15b[Novagen, USA] 단백질 발현벡터의NdeI과BamHI 제한효소부위에 이입시켜 발현벡터를 제조하였다[도1].
(2)MjTRX 변이형 단백질 발현벡터의 제조
MjTRX 변이형 단백질의 생산을 위하여, 상기에서 제조한MjTRX 유전자를 지닌 발현벡터[Novagen, USA]를 이용하여 25번째, 36번째, 51번째 글루탐산을 아스파르트산으로 각각 또는 전부를 치환하여MjTRX 변이형 단백질 발현벡터를 제조하였다.
돌연변이 시키고자 하는 글루탐산의 코돈(codon)인 GAA를 아스파르트산의 코돈인 GAT로 치환하기 위해서 DNA 중합 연쇄 반응법을 이용하였고, 각각 이용한 DNA 소중합체(oligomer)는 다음과 같다(밑줄 친 부분이 치환된 코돈).
[서열 1] E25D-1: 5'-CTAAAAGAGTTGTT GAT GAGGTAGCAAATG-3'
[서열 2] E25D-2: 5'-CATTTGCTACCTC ATC AACAACTCTTTTTAG-3'
[서열 3] E36D-1: 5'-CCGGATGCTGTT GAT GTAGAATACATAAAC-3'
[서열 4] E36D-2: 5'-GTTTATGTATTCTAC ATC AACAGCATCCGG-3'
[서열 5] E51D-1: 5'-CAAAAGGCAATG GAT TATGGGATAATGG-3'
[서열 6] E51D-2: 5'-CCATTATCCCATA ATC CATTGCCTTTTG-3'
[서열 7] T7 프로모터 : 5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'
[서열 8] T7 종결암호 : 5'-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'
반응용액에는 0.1 μM의 dNTP 혼합액과 약 20ng의 pET15b-야생형MjTRX 플라스미드(plasmid), 1.5 유닛(unit)의 pfu-DNA 중합효소(polymerase) [STRATAGENE, USA]과 반응 완충액이 있으며 총 반응 부피는 50 ㎕이다. 먼저, 반응용액에 T7 프로모터(promoter) 소중합체와 서열번호가 짝수인 소중합체를 넣고 다른 반응용액에는 T7 종결암호(terminator) 소중합체와 서열번호가 홀수인 소중합체를 넣은 후, 변성온도 96℃에서 60초간, 서냉복원온도 60℃에서 30초간, 합성진행온도 72℃에서 50초간의 반응조건을 30회 순환 DNA 중합 연쇄 반응법을 실시했다. 이들 반응으로부터 아스파르트산으로 치환된 5' 절편과 3' 절편을 각각 증폭시킬 수 있었으며, 이들 각 절편들을 분리하여 두 번째 DNA 중합 연쇄 반응법을 실시하였다. 이때, 상기 반응용액에 각 절편만 첨가하여 10회 순환 반응 후, T7 프로모터와 T7 종결암호을 추가로 첨가한 후 세 번째 DNA 중합 연쇄 반응법을 같은 조건으로 30회 순환 실시하였다. 이로부터 얻은 돌연변이MjTRX 절편을 pET15b[Novagen, USA]단백질 발현벡터의NdeI과BamHI 제한효소부위에 이입시켜 발현벡터를 제조하였다[도 2].
(3)ETRX 변이형 단백질 발현벡터의 제조
ETRX 변이형 단백질의 생산을 위하여, 상기에서 제조된 ETRX 유전자를 지닌 발현벡터를 이용하여 15번째, 43번째, 47번째 아스파르트산을 글루탐산으로 치환하여ETRX 변이형 단백질 발현벡터를 제조하였다. 이때 사용한 DNA 소중합체는 다음과 같으며, 구체적인 방법은MjTRX 변이형 단백질을 만드는 절차와 동일하다.
[서열 9] D15E-1: 5'-CAGTTTTGACACG GAA GTACTCAAAGCGG-3'
[서열 10] D15E-2: 5'-CCGCTTTGAGTAC TTC CGTGTCAAAACTG-3'
[서열 11] D43E-1: 5'-CGCCCCGATTCTG GAA GAAATCGCTGACG-3'
[서열 12] D43E-2: 5'-CGTCAGCGATTTC TTC CAGAATCGGGGCG-3'
[서열 13] D47E-1: 5'-CTGGATGAAATCGCT GAA GAATATCAGGGCAAAC-3'
[서열 14] D47E-2: 5'-GTTTGCCCTGATATTC TTC AGCGATTTCATCCAG-3'
모든 돌연변이들의 유전자 서열은 ABI373-DNA 자동 염기서열 결정기(auto sequencer)[Perkin Elmer, USA]를 이용하여 확인하였다.
실시예 2: 단백질의 생산 및 분리
상기 실시예 1에서 완성된 각각의 단백질 발현벡터를 이용하여 목적하는 야생형과 변이형의 단백질을 발현시키기 위하여 이들 발현벡터를 대장균 BL21(DE3)에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균 BL21(DE3)을 37℃에서 100 ㎍/ml의 암피실린(Ampicillin)이 첨가된 엘비 배지(LB broth)에서 지수 상태[logarithmic phase (OD600 1)]에 이를 때까지 기른 후, 0.4 mM의 이소프로필β-D-티오갈락토피라노시드(isopropylβ-D-thiogalactopyranoside)를 첨가함으로써 단백질을 발현시켜 생산하였다.
생산된 단백질은 니켈 니트릴로트리아세트산-아가로스 친화성 칼럼(nickel nitrilotriacetic acid-agarose (Ni-NTA) affinity column)[Qiagen, USA]과 DEAE-세파로스(DEAE-Sepharose) 및 슈퍼덱스(Superdex) G75[Pharmacia, USA]을 이용하여 분리하였고, 최종 95% 이상의 순도를 갖는 각 야생형 및 변이형 단백질들을 리터당 약 10 mg 분리 정제하였다[Lee et al. (2000). Biochemistry. 39, 6652-6659].
실험예 1: 단백질의 열역학적 안정성 비교
상기 실시예 2에서 생산된 각각의 단백질의 열역학적 안정성을 측정하기 위하여 약 1 mg/ml 농도의 단백질을 50 mM 포타슘 포스페이트(potassium phosphate) pH 6.5의 완충용액에서 시차주사열량계법(differential scanning calorimetry)을 이용하여 1 ℃/min의 속도로 단백질에 열을 가하여 이에 따라 변하는 단백질의 열 함량을 측정함으로써 단백질의 안정성을 조사하였다. 그 결과, 야생형MjTRX의 경우 50%의 단백질이 변성된 온도(transition temperature; Tm)가 116 ℃이었으며, 3개의 글루탐산이 모두 아스파르트산으로 치환된 경우 109 ℃를 나타내었다.그리고 치환 개수에 따라 변성온도는 약 2 ℃씩 낮아지는 것을 알 수 있었다[도 3 참조]. 이때, 도 3에서 실선은 야생형을 점선은 변이형MjTRX를 나타낸다. 야생형은 116 ℃ 그리고 변이형은 109 ℃의 변성온도(Tm)를 가지는 것을 보여준다. 반면에ETRX의 아스파르트산을 글루탐산으로 치환하였을 때 변성온도는 약 2 ℃씩 높아져, 3개의 아스파르트산을 글루탐산으로 치환했을 경우 86 ℃에서 92 ℃로 6 ℃ 높아지는 것을 확인하였다[도 4 참조]. 이때, 도 4에서 실선은 야생형을 점선은 변이형ETRX을 나타낸다. 야생형은 변성온도(Tm)가 86 ℃인 반면 변이형은 92 ℃이다.
실험예 2: 단백질의 활성비교
상기 실시예 2에서 생산된 야생형 및 변이형MjTRX와ETRX의 활성도를 측정하기 위해 인슐린-환원 활성도 측정법(Insulin-reduction activity assay)을 도입하였으며, 측정방법은 다음과 같다. 반응 단백질을 2 μM 농도로 사용하였으며, 시간에 따라 인슐린이 환원되어지는 정도를 흡광도 650 nm에서 측정하고, 그 결과를 도 5 및 도 6에 나타내었다. 이때, 도 5의 경우 야생형과 변이형 단백질간에 활성도 차이가 거의 없음을 알 수 있으며, 또한 도 6의 경우도 야생형과 변이형 단백질간에 약 7% 정도의 미미한 차이가 나타났을 뿐 유의성있는 차이를 나타내지는 않았다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명은 수용성 단백질의 열안정화 방법에 관한 것으로, 이러한 본 발명에 따르면 서로 유사한 정전기적 형질과 분자량을 지니고 수용성 단백질의 표면에 주로 존재하는 것으로 알려진 아미노산인 아스파르트산을 글루탐산으로 치환함으로써 단백질의 구조가 규명되어 있지 않은 상태에서도 단백질의 구조나 기능에 영향을 주지 않은 채 열안정성을 높일 수 있어 의료, 식품, 화학 등 단백질을 이용하는 각종 산업에 응용할 수 있는 효과가 있다.
Claims (1)
- 단백질 안정화 방법에 있어서, 단백질 유전자의 특이자리돌연변이(site-specific mutagenesis) 기법을 이용하여 수용성 단백질 표면의 아스파르트산(aspartic acid)을 글루탐산(glutamic acid)으로 치환하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질 열안정화 방법.
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