WO2005023870A1 - ＴＧＦ－β活性化制御領域の切断面を認識する抗体 - Google Patents

ＴＧＦ－β活性化制御領域の切断面を認識する抗体 Download PDF

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WO2005023870A1
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antibody
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cleavage site
human tgf
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Soichi Kojima
Wakako Kondo
Naoshi Domae
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Riken
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to an antibody that recognizes a cleavage surface of a TGF—] 3 activation control region, and a use thereof.
  • TGF-] 3 Transforming Growth Factor (TGF)-] 3 enhances hepatic fibrosis by strongly promoting extracellular Matritus production of mesenchymal cells and suppressing the proliferation of epithelial cells, resulting in liver fibrosis Z cirrhosis, atherosclerosis, lung fibrils It is a multifunctional cytokine with a molecular weight of 25 kD, which has various biological activities, such as inhibiting the function of immunocompetent cells while forming the pathology of sclerotic diseases such as scleroderma, scleroderma, and renal failure. Studies in animal models using neutralizing antibodies against TGF-] 3 have shown that suppressing the action of TGF- ⁇ can prevent and treat sclerotic diseases.
  • liver fibrosis and cirrhosis are described in Okuno et al. Gastroenterology 120: 18784-1800, 2001.
  • Akita et al. Gastroenterology 123: 352-364, 2002 describes the promotion of liver regeneration by inhibiting the TGF-i3 activation reaction using a protease antibody.
  • Kondo et al. Journal of the Japanese Society of Thrombosis and Hemostasis 14 (3): 210-219, 2003 and Annes et al. J Cell Sci 116: 217-224, 2003.
  • TGF- also plays an important role in living organisms, for example, by suppressing overproduction of proteases, preventing lung tissue from being degraded and causing emphysema, and suppressing the growth of cancer cells. .
  • TGF- / 3 has isoforms from 1 to / 33 showing almost the same biological activity. Therefore, by detecting and suppressing TGF-generating reactions specific to disease states, tissues, and isoforms, There has been a demand for a technique that suppresses only the production of a specific TGF-J3 isoform that is sometimes abnormally produced, and is useful for treatment of disease and diagnosis of prognosis. However, it has been difficult to detect a specific production reaction using the techniques reported so far.
  • TGF-] 3 isoform-specific antibody R & D or Sant Cruz
  • a gene probe Bissell et al. J Clin Invest 96: 447-455, 1995
  • TGF-J3 is specifically activated in the disease state, ligament and isoform, and in the liver, it is cleaved and activated by the plasmin-plasma lipoprotein, a protease, and the activity of these proteases is reduced. It has been shown in animal models that disease can be prevented by using a small-molecule synthetic protease inhibitor (Ono F0Y) or an antibody (Japanese Patent Application No. 2002-057253) to inhibit the disease. No technique has been established to detect the forces that are taking place or what activation reactions are taking place.
  • An object of the present invention is to provide an antibody capable of detecting an active TGF- ⁇ generation reaction specific to a disease state, a tissue, or an isoform.
  • Another object of the present invention is to provide a method for detecting a TGF- / 3 production reaction using the above antibody.
  • the present invention further provides a method for the specific diagnosis of TGF-] 3-related diseases including sclerotic diseases such as liver fibrosis, cirrhosis, arterial sclerosis, pulmonary fibrosis, scleroderma, and renal failure using the above antibody. Development was an issue to be solved.
  • the present invention focuses on the fact that TGF-J3 is activated specifically in disease states, tissues, and isoforms, and solves the above-mentioned problems by providing an antibody specific to a fragment generated upon generation of active TGF-. Settled.
  • human TGF-] 32 and human Antibodies against human TGF-1 and human TGF-32 and LAP fragments of human TGF-] 33 which are capable of specifically recognizing the protease cleavage site present in the relevant region of TGF-j83. Is provided.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • antibody of the present invention include the following antibodies.
  • protease cleavage site is between the 106th lysine residue and the 107th glutamic acid residue and specifically recognizes a cleavage plane containing the 106th lysine residue; 76 an antibody that specifically recognizes a cleavage plane between the alanine residue at position 6 and the valine residue at position 77 and containing the valine residue at position 7; An antibody that specifically recognizes a cleavage plane between the residue and the 77th valine residue and containing the 76th alanine residue.
  • a diagnostic agent for a TGF- / 3-related disease such as a sclerotic disease, comprising the antibody of the present invention described above.
  • the antibody of the present invention described above is used to detect or activate human TGF- / 31 and human TGF-j32 and human TGF-3 in a sample or tissue.
  • a method for measuring is provided.
  • the activation reaction of human TGF-j31 and human TGF-] 32 and human TGF-3 in a sample or tissue is detected using the above-described antibody of the present invention.
  • a method for diagnosing a sclerosing disease which comprises measuring.
  • FIG. 1 shows an outline of the TGF-activation mechanism and its control.
  • T G F—] 3 vitamin A, antiestrogen, bleomycin,
  • Dexamethasone viral infection, lymphocyte activation, fracture, liver fibrosis, myocardial infarction, liver damage
  • Vitamin A cholesterol, hematoma, androsis
  • FIG. 2 shows a tissue-isoform-specific TGF- / 3 activation reaction. It is expected that the LAP fragment recognized by the newly-created plasma force reclein cleavage site C-terminal cross-section recognition antibody will remain in extracellular matrix via LTBP
  • FIG. 3 shows TGF-j3 activation by protease in the pathogenesis of sclerosing disease.
  • TGF-; 3 is activated 1 "by proteases specific to each disease state in sclerosis diseases such as arteriosclerosis, pulmonary fibrosis, scleroderma, and renal failure. ing.
  • FIG. 4 shows TGF-activation by protease in the pathogenesis of sclerosing disease.
  • the figure on the right shows the results of detection of LA-degraded products produced by protease in tissues from patients with sclerosis disease.
  • FIG. 5 shows the results of limited degradation of LAP] 31 by various proteases and the amino acid sequence and base sequence of human TGF-] 31.
  • FIG. 6 shows the results of measuring the titer of the LAP peptide antibody produced in the example by ELISA.
  • Figure 7 shows the results of ELISA measurement of the titer of the LAP peptide antibody prepared in the example.
  • FIG. 8 shows the results of Western blot analysis using a LAP peptide antibody.
  • FIG. 9 shows a liver tissue-stained image of a liver regeneration-deficient animal model.
  • FIG. 10 shows a stained image of a liver section of a patient who died of fulminant hepatitis.
  • Fig. 11 shows a stained image of a liver section of a patient who died of hepatitis B.
  • FIG. 12 shows the results of sandwich ELISA using the standard materials described in the examples. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • TGF- is produced as an inactive latent form with a molecular weight of about 300 kD that cannot bind to the receptor, and is activated on or around the target cell surface to become an active form that can bind to the receptor, and can exert its action for the first time. ( Figure 1).
  • Active TGF- / 31 with a molecular weight of 25 kD is a precursor protein consisting of 39 1 amino acids (the amino acid sequence is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, and the base sequence is described in SEQ ID NO: 2)
  • a fragment between the 279Arg and 280Ala is cleaved by the action of a furin-like protease, and the carboxyl-terminal 112 amino acid portion is dimerized by a disulfide bond.
  • TGF-] 32 and-/ 33 have the same structure, and the Arg-Ala sequence is common.
  • the remaining portion of the cleaved amino terminal is called LAP (latency associated peptide), which is also dimerized (molecular weight 75 kD) and remains undigested from active TGF-] 3.
  • LAP latency associated peptide
  • TGF-J3 Covalently traps TGF-J3 to form a latent TGF- ⁇ complex (SLC) and forms a structure that cannot bind active TGF-] 3 to the receptor, ie, a latent form Fastening.
  • the end of the LAP dimer is bound to a latent TGF-j3 large complex (Large latent TGF-j3) by binding to a protein with a molecular weight of about 200 kD produced from another gene called LTBP (latent TGF- ⁇ binding protein). - ⁇ complex; LLC).
  • TGF-J32 and-] 33 have a similar structure (Fig. 2).
  • LTBP is similar in structure to fibrillin, a type of extracellular matrix protein, and LLC is pooled into extracellular matrix through this part ( Figures 1 and 2).
  • TGF- ⁇ Activation of TGF- ⁇ is a reaction that dissociates and releases active TGF- ⁇ trapped by LLC by preventing the association between LAP and active TGF- ⁇ in some way. Occurs at and near the surface of the target cell after the release of it ( Figure 1).
  • the LAP structure changes by binding to topombospondinintegrin and the adhesive activation reaction releases active TGF-, and LAP is limitedly degraded by proteases. It is known that the cleavage activation reaction releases the retained active TGF-J3 (FIG. 2).
  • the present inventors have found that inhibition of serine proteases such as plasmin ⁇ plasma recruitin using a synthetic low-molecular-weight protease inhibitor or a specific antibody inhibits the TGF-activation reaction and suppresses the formation of pathological conditions, resulting in hepatic fibrosis.
  • serine proteases such as plasmin ⁇ plasma recruitin using a synthetic low-molecular-weight protease inhibitor or a specific antibody inhibits the TGF-activation reaction and suppresses the formation of pathological conditions, resulting in hepatic fibrosis.
  • TGF- ⁇ activation via plasmin occurs during the pathogenesis of liver cirrhosis
  • TGF- ⁇ activation by plasmatic recrein occurs during the pathogenesis of liver regeneration failure (Fig. 3).
  • TGF- is present in various tissues throughout the body, but its activation mechanism depends on the tissue and the state of the tissue.
  • thrompospondin 1 works in pulmonary lung
  • integrin aVj3 works in inflamed lungs and skin
  • serine protease works in liver (particularly damaged liver).
  • Matrix meta-oral proteinase (MMP) has been reported to work on cancer and skin.
  • activation can be considered as a tissue-specific TGF-i3 regulatory mechanism.
  • activation defines the specificity of isoforms when and where which isoforms work.
  • TGF-] 31 and-/ 33 Mammal smell
  • MMP-9 has been reported to work primarily on TGF- / 32. It is expected that a specific isoform will be produced by the action of different enzymes depending on the disease state ( Figure 2).
  • the present inventors determined the activation site for cleavage by plasmin and plasma kallikrein, and found that plasmin specifically cleaved between 56Lys-57Leu of latent TGF- ⁇ , and that plasma-potential recline cleaved specifically between 58Arg-59Leu. It has been found that TGF-] 3 is activated by causing a similar structural change.
  • TGF-] 3 is activated by causing a similar structural change.
  • the antibody that recognizes the 59Leu cleavage surface did not undergo the activation reaction (not cleaved), but did not recognize intact LAP, but specifically recognized LAP cleaved by plasma kallikrein. Furthermore, this antibody stains liver tissue sections from animal models of hepatic regeneration insufficiency and patients who have died of fulminant hepatitis, indicating that TGF-i3 activation by the protease is occurring during the pathogenesis of humans. This was the first successful indication, strongly suggesting that a specific inhibitor ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ antibody against plasma recruitin could work effectively in liver regeneration failure during fulminant hepatitis (Fig. 4). Next, when the cleavage site by MMP3 was determined, it was found that MMP3 specifically cleaves between 79Ala-80Leu of latent TGF- ⁇ and activates TGF- / 3.
  • the region that is cleaved by various proteases and causes activation is defined as a TGF-activation control region.
  • a TGF-activation control region By producing a specific antibody that recognizes the oral protease cleavage site, it is difficult for conventional techniques using antibodies against active TGF-J3 or intact LAP to differ depending on the disease state, tissue, and isoform.
  • a technique was established to specifically detect the TGF-J3 production reaction by the cleavage activation reaction.
  • an antibody can be prepared that detects the cleavage activation reaction by other proteases, and also the adhesion activation reaction by thrombosbondin or integrin.
  • the antibodies of the present invention are antibodies against human TGF-1 and LAP fragments of human TGF- / 32 and human TGF-] 33, In the region from the amino acid residue glycine to the amino acid residue arginine at position 110, the protease cleavage site present in the corresponding region of human TGF-2 and human TGF-] 33 is specific. It is characterized by being able to recognize.
  • the protease cleavage site is located between the 58th arginine residue and the 59th leucine residue, and the cut section containing the 59th leucine residue is specifically formed.
  • the antibodies of the present invention may be either polyclonal or monoclonal antibodies. Preparation of the antibody of the present invention can be performed by a conventional method.
  • a polyclonal antibody against activated human TGF-] 31 has a cysteine residue at the end of the C-terminal LAP / 31 sequence (for example, 10 amino acid residues) starting from the amino acid at the protease cleavage site as described above.
  • mammals such as mice, hamsters, guinea pigs, chickens, rats, egrets, dogs, goats, sheep, and birds can be immunized.
  • the immunization can be carried out using a usual immunization method known to those skilled in the art, for example, by administering the antigen one or more times.
  • the antigen can be administered, for example, 2 to 14 times at an interval of 7 to 30 days, particularly 12 to 16 days.
  • the dose can be set at a time, for example, about 0.05 to 2 mg of the antigen.
  • the route of administration is not particularly limited, and can be appropriately selected from subcutaneous administration, intradermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, etc., by injecting intravenously, intraperitoneally or subcutaneously. It is preferred to administer.
  • the antigen may be in a suitable buffer, such as complete Freund's adjuvant, RAS (MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system), which can be used by dissolving in a suitable buffer containing commonly used adjuvants such as aluminum hydroxide.
  • RAS MPL (Monophosphoryl Lipid A) + TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) + CWS (Cell Wall Skeleton) adjuvant system
  • adjuvant refers to a substance that when administered together with an antigen, non-specifically enhances an immune response to the antigen.
  • a small amount of serum from the mammal is sampled from the ear vein or the like, and the antibody titer can be measured.
  • administer the antigen appropriately as many times as necessary.
  • booster immunization can be performed using an antigen of 10 / zg to 100 / ig.
  • blood is collected from the immunized mammal by an ordinary method, and the blood is subjected to centrifugation, precipitation using ammonium sulfate or polyethylene glycol, gel filtration, for example.
  • the polyclonal antibody of the present invention can be obtained as a polyclonal antiserum by separation and purification by a conventional method such as chromatography such as chromatography, ion exchange chromatography, and affinity chromatography.
  • the serum may be inactivated by, for example, treating the serum at 56 ° C for 30 minutes.
  • the globulin type of the monoclonal antibody is not particularly limited, and examples thereof include IgG, IgM, IgA, IgE, and IgD. Further, the monoclonal antibody of the present invention may be a humanized antibody or a human antibody.
  • the cell line that produces the monoclonal antibody of the present invention is not particularly limited. For example, it can be obtained as a hybridoma by cell fusion of an antibody-producing cell and a Myeoma cell line.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by the following cell fusion method.
  • spleen cells As antibody-producing cells, spleen cells, lymph node cells, B lymphocytes and the like from immunized animals are used.
  • the antigen the same peptide as in the case of polyclonal antibody Can be used. Mice, rats, and the like are used as animals to be immunized, and administration of the antigen to these animals is performed according to a conventional method. For example, a suspension or emulsion of an antigen peptide and an adjuvant, such as complete oral adjuvant or incomplete Freund's adjuvant, is prepared and administered several times to the vein, subcutaneous, intradermal, intraperitoneal, etc. of animals. To immunize the animal. For example, spleen cells are obtained as antibody-producing cells from the immunized animal, and these cells and myeloma cells are isolated by a method known per se.
  • Myeloma cell lines used for cell fusion include, for example, P3X63Ag.8, P3U1, and Sp2Z0 strains in mice.
  • Cell fusion is performed using a fusion promoter such as polyethylene glycol or Sendai virus.Hypoxanthine 'aminopterin' thymidine (HAT) medium is used according to standard methods for selection of hybridomas after cell fusion. can do.
  • Hybridomas obtained by cell fusion can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • a cell line that produces a monoclonal antibody that specifically recognizes the LAP fragment generated with the production of active human TGF-] 31 can be obtained.
  • the hybridoma is cultured by a conventional cell culture method or ascites formation method, and the monoclonal antibody is purified from the culture supernatant or ascites. Just fine. Purification of the monoclonal antibody from the culture supernatant or ascites can be performed by a conventional method. For example, ammonium sulfate fractionation, gel filtration, ion exchange chromatography, abundance chromatography and the like can be used in appropriate combination.
  • fragments of various antibodies as described above are also within the scope of the present invention.
  • antibody fragments include F (ab ') 2 fragment, Fab, and fragment.
  • the antibodies of the present invention can also be used as labeled antibodies. Activation of human TGF-] 31, human TGF-132 and human TGF-j33 by preparing labeled antibodies Reaction detection and measurement can be performed easily. The type of labeling of the antibody and the labeling method can be appropriately selected from those known to those skilled in the art.
  • an enzyme for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, gnorecosoxidase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate Dehydrogenase, glucose-16-phosphate dehydrogenase and the like can be used as labels.
  • an enzyme for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, gnorecosoxidase, ⁇ -galactosidase, glucoamylase, carbonic anhydrase, acetylcholinesterase, lysozyme, malate Dehydrogenase, glucose-16-phosphate dehydrogenase and the like can be used as labels.
  • the enzyme of the present invention As a method of labeling the enzyme of the present invention or a fragment thereof (F (ab ') 2 fragment, Fab' fragment, etc.), the enzyme obtained by oxidizing the sugar chain of the enzyme with periodate to form an aldehyde And a method in which a maleimide group or a pyridyl sulfide group is introduced into an enzyme to bind to a thiol group present in the Fab ′ fragment of the antibody. it can.
  • the labeled antibody can be detected.
  • peroxidase it produces a brown or yellow color in combination with hydrogen peroxide as a substrate and diaminobenzidine or O-phenylenediamine as a color reagent.
  • glucose oxidase for example, 2,2,1-acido-di (3-ethylbenzothiazoline-16-sulphonic acid (ABTS)) or the like is used as a substrate.
  • the antibody of the present invention or a fragment thereof can be labeled with a fluorescent dye such as FITC (fluorescein isothiocyanate) or TRITC (tetramethylrhodamine B isothiosinate).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • TRITC tetramethylrhodamine B isothiosinate
  • the binding of the antibody of the present invention or a fragment thereof to a fluorescent dye can be performed by a conventional method.
  • a colored labeling substance for example, a colloidal metal-colored latex can be used as the label.
  • colloidal metals include gold sol, silver sol, selenium sol, tellurium sol, and platinum sol. And metal colloid particles which are particles.
  • the size of colloidal metal particles is usually about 3 to 6 O nm in diameter.
  • a synthetic latex such as polystyrene latex colored with respective pigments such as red and blue can be given.
  • Natural latex such as natural rubber lattas can be used as the latex.
  • the size of the colored latex can be selected from several tens nm to several hundred nm in diameter. Commercially available products can be used for these coloring labeling substances as they are, but they may be further processed in some cases or produced by a method known per se.
  • the binding between the antibody of the present invention or a fragment thereof and the color labeling substance can be performed by a conventional method.
  • the color labeling substance is colloidal gold particles that are dispersed particles of gold sol, it is usually possible to physically bind the antibody and gold sol by mixing them at room temperature. .
  • the Afi two tee one label e.g., Piochin etc.
  • isotopic labels e.g., 1 2 5 I, etc.
  • the analysis using the labeled antibody of the present invention can be performed by methods well known to those skilled in the art. Also, those skilled in the art can appropriately select.
  • TGF- ⁇ 1 and human TGF-2 and human TGF-3 in a biological sample or tissue.
  • Diseases and other TGF- ⁇ related diseases can be diagnosed.
  • a method for detecting or measuring such an activation reaction of human TGF- / 31, human TGF- / 32 and human TGF- ⁇ 3, and diagnosis of TGF- ⁇ -related diseases including sclerosing diseases Methods are also within the scope of the present invention.
  • the antibody of the present invention can detect or measure the activation reaction of human TGF-1 and human TGF-2 and human TGF- ⁇ 3 in a living body.
  • 3 related diseases can be diagnosed. That is, the antibody of the present invention is derived from active human TGF-] 31 and human TGF- / 32 and human TGF- / 33. It is useful as a diagnostic agent for TGF- / 3 related diseases such as sclerotic diseases such as hepatic fibrosis / cirrhosis, arteriosclerosis, pulmonary fibrosis, scleroderma, and renal failure.
  • Human Recombinant LAP] 31 was cleaved with various proteases; human plasma potent reclein (PLK), human blood-derived plasmin, and human recombinant Matrix Meta-Mouth Protease 3 (MMP3), and the amino acid sequence of each cleavage site was determined. .
  • a peptide containing a cleavage site was synthesized to prepare an antigen peptide.
  • the peptide sequence-recognizing antibody was removed from this peptide antibody, and the target cleavage site cross-section recognizing antibody (the antibody that specifically recognizes the site cleaved by the LAP1 protease) was obtained.
  • the specificity of the obtained cut site cross-section recognizing antibody was confirmed using a stamp lot.
  • the staining properties of liver tissue sections of patients dying from hepatic regeneration dysfunction animal model and fulminant hepatitis were evaluated.
  • Example 1 Limited degradation of LAP1 by various proteases
  • PTH phenylthiohydantoin
  • the peptide to which a cysteine residue was added at the beginning of (10 amino acid residues) was synthesized by the Fmoc method of solid-phase synthesis (synthesizer; Shimadzu PSSM-8).
  • the deprotecting agent used was ethanedithiol / thioanisole / trifluoroacetic acid.
  • Hemosyanin as a carrier protein to confer antigenicity to synthetic peptides (keyhole limpet hemocyanin; KLH) (manufactured by Sigma). Amino groups contained in KLH are modified with m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester (MBS), and then reacted with a synthetic peptide containing a cysteine residue to form a covalent bond between the two. I let it. To 1.25 ml of 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2, in which 20 mg of hemocyanin is dissolved, add 10 ⁇ l of 0.3 mg / zl MBS dimethylformamide solution dropwise, and stir at room temperature for 30 minutes to bind the two.
  • KLH keyhole limpet hemocyanin
  • Egret female, about 2 kg, New Zealand White, Kitayama Labes
  • KLH-peptide antigen solution containing 100 // g of synthetic peptide and 100 ⁇ l of RIBI's complete adjuvant were homogenized through a metal connection tube.
  • I was immunized in several tens of places on the back. From 4 weeks after the initial immunization, 10 ml of blood was collected every week and booster immunization was repeated for up to 14 weeks, and whole blood was collected from the heart.
  • Figures 6 and 7 show the C-terminal (56Lys) antibody (Fig. 6A) and the N-terminal (57Leu) antibody (Fig. 6B) of the plasmin (PLN) cleavage site (56Lys-57Leu), and plasma kallikre.
  • the data of the C-terminal (58Arg) antibody (A in FIG. 7) and the N-terminal (59Leu) antibody (B in FIG. 7) of the C-terminal (PLK) cleavage site (58Arg-59Leu) are shown.
  • the antibody titer increased, and thereafter, a high antibody titer was maintained.
  • Example 6 Purification of specific peptide antibodies
  • a Sepharose resin on which the antigen peptide was immobilized was prepared, and the peptide antibody contained in the antiserum was purified by adsorption to the resin.
  • Epoxy-activated Sepharose resin (Pharmacia Biotech) swelled with distilled water 1 ml of 50% slurry and lmg of various antigen peptides in 4 ml of binding buffer (50 mM carbonate buffer, pH 8) at 45 ° C, The reaction was performed with burnite to bind the antigen peptide to the Sepharose resin. After blocking unreacted functional groups by incubating with 0.1 M monoethanolamine in 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8 at 45 ° C and overnight, 0.5 M
  • Example 7 Purification of antibody recognizing cross section of cleavage site (removal of antibody recognizing peptide sequence)
  • the end of the cut surface of the peptide immobilized on the Sepharose resin was acetylated to produce a block resin, and the peptide antibody was passed through a column filled with the resin to remove the peptide sequence-recognizing antibody and cut the cut surface. Only the recognition antibody was purified.
  • the acetylation is carried out by stirring the peptide-fixed Sepharose resin twice in acetylformimidazole 0.12 g / 4 ml dimethylformamide at room temperature for 5 minutes, washing with dimethylformamide and spinning the column.
  • the peptide sequence-recognizing antibody was removed by packing (column volume: lml) and passing the purified peptide antibody (100 ⁇ g) as described above, and the non-adsorbed fraction was collected to obtain a cut site cross-section recognizing antibody.
  • Antibody protein concentration was determined by BCA assay.
  • FIG. 8A shows the results obtained using an antibody recognizing the N-terminal cross section (57Leu) of the plasmin cleavage site (56Lys-57Leu).
  • Figure 8B shows the plasma kallikrein cleavage site. The results obtained using an antibody recognizing the N-terminal cross section (59Leu) of (58Arg-59Leu) are shown.
  • Recognition site of plasma force reclein N-terminal cross section (59Leu) recognition antibody hardly recognizes intact LAP jSl that has not been activated (not cleaved) (lane 1) and is cleaved by plasma kallikrein (PLK) been LAP] 3 1 fragment only strongly recognized (lane 2), the plasma power Rikurein cleavage site (58Arg- 59Leu between) from 2 residues before 56Lys- 5 7 Leu at cut plasmin (PLN) cutting LAP] The 31 fragment was weakly recognized (lane 3).
  • TGF-activation by plasma-powered reclein is known to be responsible for the pathogenesis of endotoxin (LPS).
  • LPS endotoxin
  • liver tissue section of a patient who died of fulminant hepatitis was stained with an antibody recognizing the N-terminal cross section of the plasma force reclein cleavage site (Fig. 10), indicating that TGF-activation by protease was observed during human pathogenesis. Succeeded to show that a reaction was taking place.
  • a section (2.5 Um) was prepared from a patient's liver tissue fixed in 10% buffered formalin and embedded in paraffin, deparaffinized with xylene 20 times 4 times, and then ethanol 2 times, 90%, 80%. %, 70% Rinse once each in ethanol, rinse with water, air-dry and draw a circle around the section with ⁇ 0 Pen (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan), air-dry for another 30 minutes, and allow the primary antibody (immune Reaction with the pre-antibody (left panel in Fig. 10) or the antibody recognizing the N-terminal cross section of the plasma kallikrein cleavage site (right panel in Fig.
  • a 10% buffered formalin-fixed, paraffin-embedded section (2.5 ⁇ ) was prepared from the liver tissue of a patient who died of hepatitis B, deparaffinized with xylene for 20 min 4 times, and ethanol twice. Rinse with 0%, 80%, and 70% ethanol once each, rinse with water, air-dry, draw a circle around the section with a DAKO Pen (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan), air-dry for another 30 minutes, and then section.
  • the primary antibody is a plasma kallikrein cleavage site C-terminal cross-sectional recognition antibody (an antibody that recognizes arginine at position 58) (upper left panel in Fig.
  • the secondary antibody Biotin-labeled Swine anti-Rabbit IgG F (ab) 2 fragment (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) or Biotin-labeled Swine
  • the reaction was carried out at room temperature for 1 hour with 10 ⁇ g / m 1 of anti-Mouse IgG F (ab,) 2 fragment (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan).
  • the plate was reacted with Horseradish Peroxidase-labeled Strept ABC Complex (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) at room temperature for 40 minutes.
  • the plasma kallikrein cleavage site C-terminal cross-sectional recognition antibody (upper middle in Fig. 11) shows staining centered on stellate cells, but the plasma force reclein cleavage site N-terminal
  • the cross-section recognizing antibody (upper left in Fig. 11) was able to obtain a clearer stained image than the C-terminal cross-section recognizing antibody (upper middle in Fig. 11).
  • the mouse monoclonal antibody recognizing active TGF-] 3 (right in the upper panel in Fig. 11) was able to obtain the same staining image as the antibody recognizing the C-terminal cross section (middle in the upper panel in Fig. 11).
  • Human recombinant LAP ⁇ 1 (R & D Co., Ltd.) 50 mM of a 800 ng total 27 mu 1 Tris buffer (50 mM Tris-HCl, H 7-200 mM NaCl-1 ⁇ M ZnCl 2 - 5 mM CaCl 2 - 0. 05 % Brij 35-0. 05% NaN 3 ) Human matrix meta-oral protease 2 (MMP2) at a final concentration of 13.3 g / ml
  • the sandwich ELIZA method was performed according to the information (Harlow and Lane, Immunoassays, _II Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 553-612, 1988). That is, a commercially available anti-human LAP monoclonal antibody (manufactured by R & D) was added at 1 jug (50 il of 20 ⁇ g / ml of PBS) per 1 ml of Imnoplate (manufactured by Nunc), and incubated at 4 ° C. Coated by doing. After washing twice with PBS, blocking was performed by further incubation with 200 ⁇ l of a blocking solution (3% serum albumin-0.02% sodium azide-containing PBS) at 4 ° C.
  • a blocking solution 3% serum albumin-0.02% sodium azide-containing PBS
  • the present invention by producing a specific antibody that recognizes each protease cleavage site present in the TGF-activation control region, pathogenesis, tissue, and isoform-specific TGF- It has become possible to detect reactions (activation reactions). In addition, it is expected to be useful for the diagnosis of new treatments that suppress only abnormal TGF-forming reactions using synthetic low-molecular-weight inhibitors and antibodies that specifically inhibit the detected activation reactions, as well as for prognostic diagnosis it can.

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Abstract

本発明の目的は、病態、組織、アイソフォーム特異的活性型TGF-β生成反応を検出することができる抗体を提供することである。本発明によれば、ヒトＴＧＦ−β１中の５１番目のアミノ酸残基グリシンから１１０番目のアミノ酸残基アルギニンまでの領域ならびにヒトTGF-β２およびヒトTGF-β３の当該領域に存在するプロテアーゼ切断部位を特異的に認識することができる、活性型ヒトＴＧＦ−β１ならびにヒトTGF-β２およびヒトTGF-β３の生成に伴い生じるＬＡＰ（もしくは潜在型ＴＧＦ−β）断片に対する抗体が提供される。

Description

明細書
T G F - i3活性化制御領域の切断面を認識する抗体 技術分野
本発明は、 T G F— ]3活性化制御領域の切断面を認識する抗体、 及ぴその利用 に関する。 背景技術
Transforming Growth Factor (TGF) - ]3は、 間葉系細胞の細胞外マトリツタス産 生を強力に促すとともに上皮系細胞の増殖を抑制することにより、 肝線維化 Z肝 硬変、 動脈硬化、 肺線維症、 強皮症、 腎不全などの硬化性疾患の病態を形成する 一方、 免疫担当細胞の働きを抑制するなど、 多彩な生物活性を示す分子量 25 kD のホモダイマー多機能性サイトカインである。 TGF- ]3に対する中和抗体を用いた 動物モデルにおける検討から、 TGF- βの働きを抑制することによつて硬化性疾患 を予防 ·治療できることがわかってきた。 例えば、 プロテアーゼ阻害剤を用いた TGF- 活性化反応の抑制による肝線維化ノ肝硬変の予防 ·治療については Okuno et al. Gastroenterology 120: 18784- 1800, 2001に記載されている。 また、 プロ テアーゼ抗体を用いた TGF- i3活性化反応の抑制による肝再生促進については Akita et al. Gastroenterology 123 : 352-364, 2002に記載されている。 さらに、 TGF- J3活性化反応に関する総説としては、 近藤ほか 日本血栓止血学会誌 14 (3) : 210-219, 2003及び Annes et al. J Cell Sci 116: 217-224， 2003が挙げら れる。
し力 し、 例えば、 プロテアーゼの過剰産生を抑制することにより肺組織が分解 され肺気腫に陥るのを防いだり、 癌細胞の増殖を抑制するなど、 TGF- は生体に とって大切な働きもしている。 また、 TGF- /3には殆ど同じ生物活性を示す 1か ら /3 3までのァイソフォームが存在する。 したがって、 病態、 組織、 アイソフォ ーム特異的な TGF- 生成反応を検出して、 これを抑制することにより、病態形成 時に異常産生される特定の TGF- J3アイソフォームの生成のみを抑え病気の治療 や予後の診断に役立てる技術が望まれていた。 し力 し、 従来報告されている技術 では特異的生成反応を検出することは困難であった。
また、 各 TGF- ]3アイソフォーム特異的抗体 （R&D社製、 又は Sant Cruz社製） もしくは遺伝子プローブ (Bissell et al. J Clin Invest 96 : 447 - 455， 1995) を 用いて、病態形成動物モデルゃヒト患部においてどの TGF- ]3ァイソフォームが産 生されるかを検出する技術は開発されていたが、 病態、 組織、 ァイソフォーム特 異的 TGF- J3生成反応を検出する方法ではなかったので、特異的治療 ·予防法の開 発には繋がらなかった。 発明の開示
TGF- J3が病態、 糸且織、 ァイソフォーム特異的に活性化され、 肝臓においてはプ 口テアーゼのプラスミンゃ血漿力リクレインによつて切断活性化されるので、 こ れらのプロテアーゼの活性を低分子合成プロテアーゼ阻害剤 （小野 F0Y) や抗体 (特願 2002-057253号） を用いて阻害することによって、 病気を防ぐことができ る可能性が動物モデルで示されているが、 ヒトでも同じことが起きている力、 ま たどの活性化反応が起こっているかを検出する技術は確立されていなかった。 本発明は、病態、 組織又はアイソフォームに特異的な活性型 TGF- β生成反応を 検出することができる抗体を提供することを解決すべき課題とした。 本発明はさ らに、上記抗体を用いて TGF- /3生成反応を検出する方法を提供することを解決す べき課題とした。 本発明はさらに、 上記抗体を用いて肝線維化 肝硬変、 動脈硬 化、 肺線維症、 強皮症、 腎不全などの硬化性疾患を始めとする TGF- ]3関連疾患の 特異的診断法を開発することを解決すべき課題とした。
本発明では、 TGF- J3が病態、 組織、 ァイソフォーム特異的に活性化されること に着目し、活性型 TGF - 生成に伴い生じる断片に特異的な抗体を提供することに より上記課題を解決した。
即ち、 本発明によれば、 ヒト T G F— j3中に存在するプロテアーゼ切断部位切 断面を特異的に認識することができる、 ヒト T G F— ]3の L A P断片に対する抗 体が提供される。
好ましくは、 本発明によれば、 ヒト T G F— 1中の 5 1番目のアミノ酸残基 グリシンから 1 1 0番目のアミノ酸残基アルギニンまでの領域ならぴにヒ ト TGF- ]3 2およぴヒ ト TGF- j8 3の当該領域に存在するプロテアーゼ切断部位を特 異的に認識することができる、 ヒ ト T G F— 1ならびにヒ ト TGF - 3 2およびヒ ト TGF - ]3 3の L A P断片に対する抗体が提供される。
本発明の抗体は、 ポリクローナル抗体でもよいし、 モノクローナル抗体でもよ レゝ
本発明の抗体の具体例としては以下の抗体が挙げられる。
プロテアーゼ切断部位が 5 8番目のアルギニン残基と 5 9番目のロイシン残基 の間であり、 5 9番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が 5 8番目のアルギニン残基と 5 9番目のロイシン残基 の間であり、 5 8番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が 5 6番目のリジン残基と 5 7番目のロイシン残基の間 であり、 5 7番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が 5 6番目のリジン残基と 5 7番目のロイシン残基の間 であり、 5 6番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；
プロテアーゼ切断部位が 7 9番目のァラニン残基と 8 0番目のロイシン残基の 間であり、 8 0番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が 7 9番目のァラニン残基と 8 0番目のロイシン残基の 間であり、 7 9番目のァラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が 8 5番目のアルギニン残基と 8 6番目のァスパラギン 酸残基の間であり、 8 6番目のァスパラギン酸残基を含む切断面を特異的に認識 する抗体；プロテアーゼ切断部位が 8 5番目のアルギニン残基と 8 6番目のァス パラギン酸残基の間であり、 8 5番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に 認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が丄 0 6番目のリジン残基と 1 0 7番目のグルタミン酸 残基の間であり、 1 0 7番目のグルタミン酸残基を含む切断面を特異的に認識す る f几体；
プロテアーゼ切断部位が 1 0 6番目のリジン残基と 1 0 7番目のグルタミン酸 残基の間であり、 1 0 6番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体； プロテアーゼ切断部位が 7 6番目のァラニン残基と 7 7番目のバリン残基の間 であり、 7 7番目のバリン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；並びに、 プロテアーゼ切断部位が 7 6番目のァラニン残基と 7 7番目のバリン残基の間 であり、 7 6番目のァラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体。
本発明の別の側面によれば、 上記した本発明の抗体を含む、 硬化性疾患を始め とする TGF - /3関連疾患の診断薬が提供される。
本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の抗体を用いて、 試料又は 組織中のヒト T G F— /3 1ならびにヒト TGF- j3 2およびヒト TGF - 3の活性化 反応を検出又は測定する方法が提供される。 本発明のさらに別の側面によれば、 上記した本発明の抗体を用いて試料又は組織中のヒ ト T G F— j3 1ならびにヒ ト TGF- ]3 2およびヒト TGF - 3の活性化反応を検出又は測定することを含む、硬化 性疾患の診断方法が提供される。 図面の簡単な説明
図 1は、 T G F— 活性化機構とその制御の概要を示す。
Α ： T G F— の合成 ·分泌を高める因子、 要因
T G F— ]3、 ビタミン A、 抗エストロゲン、 ブレオマイシン、
デキサメサゾン、 ウィルス感染、 リンパ球活性化、 骨折、 肝線維化、 心筋梗塞、 肝障害
B ：細胞外基質から T G F— /3を放出させる因子
エラスターゼ、 チマーゼ、 プラスミン、 トロンビン
C ： T G F— の活性ィ匕を起こす因子 酸、 アルカリ、 熱、 変性剤。 活性酸素種 （ROS)、
エンドグリコシダーゼ、 トロンボスポンジン、 セリンプロテアーゼ、 インテグリン、 マトリックスメタ口プロテアーゼ
D：細胞に TGF_ 活 1"生化を起こす因子、 要因
混合培養、 ビタミン Α、 ビタミン D、 抗エストロゲン、 ブレオマイシン、 デキサメサゾン、 リポ多糖、 I gG、 インターフェロン、 癌化
E ： TGF— ]3受容体の発現を高める因子、 要因
ビタミン A、 肝線維化
F ： TGF— ]3受容体の発現を減らす因子、 要因
癌化、 細胞外マトリックス
図 2は、 組織 ·ァイソフォーム特異的 TGF—/3活性化反応を示す。 新たに作 製した血漿力リクレイン切断部位 C末断面認識抗体により認識される LAP断片は、 LTBPを介して細胞外マトリックスにより多く残っていることが予想される
図 3は、 硬化性疾患の病態形成におけるプロテアーゼによる TGF— j3活性ィ匕 を示す。 肝硬変 ·肝再生不全に加えて、 動脈硬化、 肺線維症、 強皮症、 腎不全な どの硬化症疾患においても、 それぞれの病態に特異的なプロテアーゼにより TG F— ;3が活 1"生化されている。
図 4は、 硬化性疾患の病態形成におけるプロテアーゼによる T G F— 活性ィ匕 を示す。 右図には、 硬化症疾患の患者からの組織で、 プロテアーゼにより生成し た L A Ρ分解物を検出した結果を示す。
図 5は、 各種プロテアーゼによる LAP ]3 1の限定分解の結果とヒト TGF - ]31の ァミノ酸配列と塩基配列を示す。
図 6は、 実施例で作製した LAPぺプチド抗体の力価を ELISAで測定した結果を 示す。
A：抗体力価チェック EL I S A (2172-PLN C- ter 56Lys Ab)
B ：抗体力価チェック EL I S A (Rabbit Y-PLN N-ter 57Leu Ab)
図 7は、 実施例で作製した LAPぺプチド抗体の力価を ELISAで測定した結果を 日本国特許庁 2 I 示す。
A：抗体力価チヱック E L I S A (2173-PLKN C-ter 58Arg Ab)
B ：抗体力価チェック E L I S A (Rabbit K - PLK N-ter 59Leu Ab)
図 8は、 LAPペプチド抗体を用いたウェスタンブロット分析の結果を示す。
A： PLN N-ter 57Leu Ab (1/800)
B ： PLK N-ter 59Leu Ab (1/800)
図 9は、 肝再生不全動物モデルの肝臓組織染色像を示す。
図 1 0は、 劇症肝炎で死亡した患者の肝臓切片の染色像を示す。
図 1 1は、 B型肝炎で死亡した患者の肝臓切片の染色像を示す
図 1 2は、 実施例に述べた標準物質を用いたサンドイッチ E L I S Aの結果を 示す。 発明を実施するための最良の形態
TGF - は、 硬化性疾患の病態形成を担ったり、 免疫担当細胞の働きを抑制する 一方、 プロテアーゼの過剰産生を抑制することによって肺組織が分解され肺気腫 に陥るのを防いだりしたり癌細胞の増殖を抑制するなど、 多彩な生物活性を示す 分子量 25 kDのホモダイマー多機能性サイトカインである。 TGF- は受容体に結 合できない分子量約 300 kDの不活性な潜在型として産生され、標的細胞表面やそ の周囲で活性化されて受容体に結合できる活性型となり、 始めてその作用を発揮 できるようになる（図 1 )。 分子量 25 kDの活性型 TGF- /3 1は、 3 9 1個のアミノ 酸からなる前駆体タンパク質 （アミノ酸配列を配列表の配列番号 1に記載し、 塩 基配列を配列番号 2に記載する） としてつくられた後、 ゴルジにおいてフューリ ン様プロテアーゼの働きで 279Argと 280Alaの間が切断され、 カルボキシル末端 側の 112個のアミノ酸からなる部分がジスルフィド結合によって 2量体化するこ とにより生成する。 TGF - ]3 2と - /3 3も同じ構造で、 Arg- Ala配列は共通している。 切られた残りのァミノ末端側の部分は LAP (latency associated peptide) とよ ばれ、 やはり 2量体化し （分子量 75 kD)、 活性型 TGF - ]3から切り離された後も非
6 a」正された用紙 (規則 91》 共有結合で TGF- J3をトラップして潜在型 TGF- β小複合体 （small latent TGF - β complex ; SLC)を形成し、 活性型 TGF- ]3を受容体に結合できない構造、 すなわち 潜在型に留めている。さらに多くの場合、 LAPダイマーの端には LTBP (latent TGF- β binding protein)という別の遺伝子から作られる分子量約 200 kDのタンパク 質が結合して潜在型 TGF- j3大複合体 （Large latent TGF- β complex ; LLC)を形 成する。 TGF - J3 2と- ]3 3も同様の構造をとっている（図 2 )。 LTBPは細胞外マトリ ックスタンパク質の 1種であるフイブリリンと構造が似ており、 LLC はこの部分 を介して細胞外マトリッタスにプールされている（図 1及ぴ図 2 )。
T GF- βの活性化は、なんらかの方法で LAPと活性型 TGF - β間の会合を妨げる ことによって LLCにトラップされている活性型 TGF - βを解離、放出する反応であ り、 マトリッタスから LLCが放出されたのちに標的細胞表面やその近傍において 起こる（図 1 )。 生理的な TGF- β活性化反応には、 ト口ンボスポンジンゃィンテグ リンと結合することによって LAPの構造が変化し活性型 TGF- を放出する接着活 性化反応と、プロテアーゼによって LAPが限定分解され、保持していた活性型 TGF- J3を放出する切断活性化反応とが知られている（図 2 )。 本発明者らは、 合成低分 子プロテアーゼ阻害剤や特異抗体を用いてプラスミンゃ血漿力リクレインなどの セリンプロテアーゼを阻害すると TGF- 活性化反応が阻害され、病態形成を抑制 できることから、肝線維化 ·肝硬変の病態形成過程ではプラスミンを介する TGF - β活性化が、肝再生不全の病態形成過程では血漿力リクレインによる TGF- β活性 化が起こつていることを動物モデルで証明した（図 3 )。
TGF- は体中のいろいろな組織に存在するが、 その活性化機構は組織や組織の 状態によって異なる。例えば、肺ゃ脖 fl蔵においてはトロンポスポンジン 1が働き、 炎症を起こした肺や皮膚においてはインテグリン a V j3、肝臓（特に障害肝） にお いてはセリンプロテアーゼが働く。 また、 マトリックスメタ口プロテインナーゼ (MMP) は癌や皮膚で働くということが報告されている。 このように、活性化は組 織特異的な TGF- i3調節機構とみなすことができる。 さらに、活性化はいつどこで どのアイソフォームが働くかァイソフォームの特異性を規定する。 哺乳類におい ては TGF- ]3 1, - β 2, - ]3 3の 3つのアイソフォームが産生されるが、 活性型の部 分はいずれも 112個のァミノ酸のポリぺプチドによる 2量体構造を持ち、 71〜82% という高いホモロジ一を有することからほとんど同じような生理活性を発現する。 これに対して、 LAP部分のホモロジ一は 34〜35%と低いことから、 ァイソフォー ムによって活性化の機構は異なる。 すなわち、 TGF- ]3活性化はァイソフォーム特 異性を決める翻訳後調節機構であると考えられる。例えば、 TGF- J3 1と- 3は LAP 部分に RGD配列を持つが、 TGF- /3 2にはそれが無い。 よって、 インテグリンが結 合して活性化するのは、 TGF- ]3 1と- /3 3である。 逆に、 MMP- 9は TGF- /3 2に主に 働くことが報告されている。 病態に応じて異なる酵素が働くことによって特定の アイソフォームが生成することが予想される（図 2 )。
本発明者らは、 プラスミンと血漿カリクレインによる切断活性化サイトを決定 したところ、 プラスミンは潜在型 TGF- βの 56Lys- 57Leuの間を、血漿力リクレイ ンは 58Arg- 59Leuの間を特異的に切断し似たような構造変化を引き起こして TGF- ]3を活性化させることがわかった。 次に、 これらのプロテアーゼによって断片化 された潜在型 TGF- を特異的に検出するプロテアーゼ断片化 TGF- 抗体の作製 を試みたところ、 57Leuと 59Leuの各々の切断面を認識する抗体の作製に成功し た。 59Leu切断面を認識する抗体は活性化反応を受けていない （切断されていな い） インタタトな LAPは認識せず、 血漿カリクレインによって切断された LAPを 特異的に強く認識した。 さらに、 この抗体によって肝再生不全動物モデルや劇症 肝炎で亡くなった患者肝組織切片が染色されることから、 ヒ トの病態形成時にプ 口テアーゼによる TGF- i3活性化反応が起こっていることを示すことに初めて成 功し、 劇症肝炎時の肝再生不全には血漿力リクレインに対する特異的阻害剤ゃ抗 体が有効に働く可能性を強く示唆した（図 4 )。 次に、 MMP3による切断部位を決定 したところ、 MMP3は潜在型 TGF- βの 79Ala- 80Leuの間を特異的に切断し TGF - /3 を活性化させることを見出した。
本発明においては、 各種プロテアーゼによって切断され活性化を引き起こす領 域 （51Gly- llOArg) を TGF- 活性化制御領域と定義し、 ここに存在する各々のプ 口テアーゼ切断サイトを認識する特異抗体を作製することによって、活性型 TGF - J3やインタタトな LAPに対する抗体を用いた従来の技術では困難であった病態、 組織、ァイソフォームによつて異なるそれぞれの切断活性化反応による TGF- J3生 成反応を特異的に検出する技術を確立した。 同様なストラテジーを用いて他のプ 口テアーゼによる切断活性化反応、 さらにはトロンボスボンジンやインテグリン による接着活性化反応を検出する抗体を作製することができる。
上記の通り、本発明の抗体はヒト T G F— 1ならびにヒト TGF - /3 2およぴヒ ト TGF- ]3 3の L A P断片に対する抗体であって、 特に、 ヒト T G F— 1中の 5 1番目のアミノ酸残基グリシンから 1 1 0番目のアミノ酸残基アルギニンまでの 領域ならぴにヒ.ト TGF- 2およぴヒト TGF- ]3 3の当該領域に存在するプロテア ーゼ切断部位を特異的に認識することができることを特徴とする。
本発明の抗体の具体例としては、 プロテアーゼ切断部位が 5 8番目のアルギニ ン残基と 5 9番目のロイシン残基の間であり、 5 9番目のロイシン残基を含む切 断面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が 5 8番目のアルギニン残 基と 5 9番目のロイシン残基の間であり、 5 8番目のアルギニン残基を含む切断 面を特異的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が 5 6番目のリジン残基と 5 7番目のロイシン残基の間であり、 5 7番目のロイシン残基を含む切断面を特異 的に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が 5 6番目のリジン残基と 5 7番目の ロイシン残基の間であり、 5 6番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識す る抗体；プロテアーゼ切断部位が 7 9番目のァラニン残基と 8 0番目のロイシン 残基の間であり、 8 0番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する抗 体；プロテアーゼ切断部位が 7 9番目のァラニン残基と 8 0番目のロイシン残基 の間であり、 7 9番目のァラニン残基を含む切断面を特異的に認識する抗体；プ 口テアーゼ切断部位が 8 5番目のアルギニン残基と 8 6番目のァスパラギン酸残 基の間であり、 8 6番目のァスパラギン酸残基を含む切断面を特異的に認識する 抗体；プロテアーゼ切断部位が 8 5番目のアルギニン残基と 8 6番目のァスパラ ギン酸残基の間であり、 8 5番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識 する抗体；プロテアーゼ切断部位が 1 0 6番目のリジン残基と 1 0 7番目のダル タミン酸残基の間であり、 1 0 7番目のグルタミン酸残基を含む切断面を特異的 に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が 1 0 6番目のリジン残基と 1 0 7番目 のグルタミン酸残基の間であり、 1 0 6番目のリジン残基を含む切断面を特異的 に認識する抗体；プロテアーゼ切断部位が 7 6番目のァラニン残基と 7 7番目の パリン残基の間であり、 7 7番目のパリン残基を含む切断面を特異的に認識する 抗体；並びに、 プロテアーゼ切断部位が 7 6番目のァラニン残基と 7 7番目のノ リン残基の間であり、 7 6番目のァラニン残基を含む切断面を特異的に認識する 抗体が挙げられる。
本発明の抗体は、ポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体の何れでもよい。 本発明の抗体の作製は定法により行なうことができる。
例えば、 活性型ヒト T G F— ]3 1に対するポリクローナル抗体は、 上記したよ うなプロテアーゼ切断部位のァミノ酸から始まる C末側 LAP /3 1配列（例えば、 1 0アミノ酸残基） の最後にシスティン残基を付与したペプチド、 もしくは上記し たようなプロテアーゼ切断部位で終わる N末側 LAP β 1配列 （例えば、 1 0アミ ノ酸残基） の最初にシスティン残基を付与したぺプチドを抗原として哺乳動物を 免疫感作し、 該哺轧動物から血液を採取し、 採取した血液から抗体を分離 ·精製 することにより得ることができる。 例えば、 マウス、 ハムスター、 モルモッ ト、 ニヮトリ、 ラット、 ゥサギ、 ィヌ、 ャギ、 ヒッジ、 ゥシ等の哺乳動物を免疫する ことができる。 免疫感作の方法としては、 当業者に公知の通常の免疫感作の方法 を用いて、 例えば抗原を 1回以上投与することにより行うことができる。
抗原投与は、 例えば、 7から 3 0日、 特に 1 2から 1 6日間隔で 2〜1 4回投 与することができる。 投与量は 1回につき、 例えば抗原約 0 . 0 5から 2 m g程 度を目安とすることができる。投与経路も特に限定されず、皮下投与、皮内投与、 腹膜腔内投与、 静脈内投与、 筋肉内投与等を適宜選択することができるが、 静脈 内、腹膜腔内もしくは皮下に注射することにより投与することが好ましい。また、 抗原は適当な緩衝液、 例えば完全フ ロイ ン トアジュバン ト、 R A S 〔 MPL (Monophosphoryl Lipid A) +TDM (Synthetic Trehalose Dicorynomycolate) +CWS (Cell Wall Skeleton) アジュバントシステム〕 、 水酸化 アルミニウム等の通常用いられるアジュパントを含有する適当な緩衝液に溶解し て用いることができるが、 投与経路や条件等によっては、 上記したアジュバント は使用しない場合もある。 ここでアジュパントとは抗原とともに投与したとき、 非特異的にその抗原に対する免疫反応を増強する物質を意味する。
免疫感作した哺乳動物を 0 . 5から 4ヶ月間飼育した後、 該哺乳動物の血清を 耳静脈等から少量サンプリングし、 抗体価を測定することができる。 抗体価が上 昇してきたら、 状況に応じて抗原の投与を適当回数実施する。 例えば 1 0 /z g〜 1 0 0 0 /i gの抗原を用いて追加免疫を行なうことができる。 最後の投与から 1 〜 2ヶ月後に免疫感作した哺乳動物から通常の方法により血液を採取して、 該血 液を、 例えば遠心分離、 硫酸アンモ-ゥムまたはポリエチレングリコールを用い た沈澱、 ゲルろ過クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 アブイ 二テイクロマトグラフィ一等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって分 離 ·精製することにより、 ポリクローナル抗血清として、 本発明のポリクローナ ル抗体を得ることができる。 なお血清は、 たとえば、 5 6 °Cで 3 0分間処理する ことによつて補体系を不活性化してもよい。
また、 本発明の抗体がモノクローナル抗体の場合、 該モノクローナル抗体のグ ロブリンタイプは特に限定されず、 例えば I g G、 I g M、 I g A、 I g E、 I g D等が挙げられる。 また、 本発明のモノクローナル抗体は、 ヒト化抗体又はヒ ト抗体でもよい。
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株は特に制限されないが、例えば、 抗体産生細胞とミエ口一マ細胞株との細胞融合によりハイブリ ドーマとして得る ことができる。 本発明のモノクローナル抗体を産生するハイプリ ドーマは、 以下 のような細胞融合法によって得ることができる。
抗体産生細胞としては、 免疫された動物からの脾細胞、 リンパ節細胞、 Bリン パ球等を使用する。 抗原としては、 ポリクローナル抗体の場合と同様のペプチド を使用することができる。免疫される動物としてはマウス、ラット等が使用され、 これらの動物への抗原の投与は常法に従って行う。 例えば完全フ口インドアジュ バント、 不完全フロインドアジュパントなどのアジュバントと抗原ペプチドとの 懸濁液もしくは乳化液を調製し、 これを動物の静脈、 皮下、 皮内、 腹腔内等に数 回投与することによつて動物を免疫化する。 免疫化した動物から抗体産生細胞と して例えば脾細胞を取得し、 これとミエローマ細胞とをそれ自体公知の方法
(G. Kohler et al . , Nature, 256 495 (1975) ) により融合することにより、 ハイブ リ ドーマを作製することができる。
細胞融合に使用するミエローマ細胞株としては、 例えばマウスでは P 3 X 6 3 A g .8、 P 3 U 1株、 S p 2 Z 0株などが挙げられる。 細胞融合を行なうに際し ては、 ポリエチレングリコール、 センダイウィルスなどの融合促進剤を用い、 細 胞融合後のハイプリ ドーマの選抜にはヒポキサンチン 'アミノプテリン 'チミジ ン （HA T) 培地を常法に従って使用することができる。 細胞融合により得られ たハイプリ ドーマは限界希釈法等によりクローユングすることができる。 更に、 酵素免疫測定法等によりスクリーニングを行なうことにより、 活性型ヒト T G F - ]3 1生成に伴 、生じる L A P断片を特異的に認識するモノクローナル抗体を産 生する細胞株を得ることができる。
このようにして得られたハイブリ ドーマから目的とするモノクローナル抗体を 製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイプリ ドーマを培養し、 培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。 培養上清も しくは腹水からのモノクローナル抗体の精製は、常法により行なうことができる。 例えば、 硫安分画、 ゲルろ過、 イオン交換クロマトグラフィー、 アブイ二ティー クロマトグラフィーなどを適宜組み合わせて使用できる。
また、 上記したような各種抗体の断片も本発明の範囲内である。 抗体の断片と しては、 F ( a b ' ) 2フラグメント、 F a b， フラグメント等が挙げられる。 本発明の抗体は標識抗体として使用することもできる。 標識抗体を作製するこ とにより、ヒト T G F— ]3 1ならびにヒト TGF- 13 2およぴヒト TGF— j3 3の活性化 反応の検出や測定を簡便に行うことができる。 抗体の標識の種類及び標識方法は 当業者に知られているものから適宜選択することができる。
標識として酵素を使用する場合には、 例えば、 西洋ヮサビペルォキシダーゼ、 アルカリホスファターゼ、 グノレコースォキシダーゼ、 β—ガラク トシダーゼ、 グ ルコアミラーゼ、 炭酸アンヒ ドラーゼ、 アセチルコリンエステラーゼ、 リゾチ一 ム、 マレートデヒドロゲナーゼ、 グルコース一 6—ホスフェートデヒドロゲナー ゼ等を標識として使用することができる。 これらの酵素を本発明の抗体又はその 断片 （F ( a b ' ) 2フラグメント、 F a b ' フラグメント等） に標識する方法と しては、 酵素の糖鎖を過ヨウ素酸で酸化し、 生成したアルデヒド基に該抗体など のアミノ酸を結合させる方法や、 酵素にマレイミド基あるいはピリジルスルフィ ド基等を導入し、 該抗体の F a b ' フラグメントに存在するチオール基と結合さ せる方法等を挙げることができる。
標識として酵素を使用する場合、 試験試料と標識抗体とをィンキュベートした 後、 遊離した標識抗体を洗浄して除去してから、 上記の標識酵素の基質を作用さ せて発色等で反応を測定することによって標識抗体を検出することができる。 例 えば、 ペルォキシダーゼで標識される場合には、 基質として過酸化水素、 発色試 薬としてジァミノべンジジンまたは O—フエ二レンジァミンと組み合わさって褐 色または黄色を生じる。 グルコースォキシダーゼで標識される場合には、 基質と して、 たとえば 2， 2， 一ァシドージ一 （3—ェチルベンゾチアゾリン一 6—ス ルホン酸 （A B T S ) 等を用いる。 .
標識として蛍光色素を使用する場合には、 例えば、 F I T C (フルォレセイン イソチオシァネート） 又は T R I T C (テトラメチルローダミン Bイソチオシァ ネート）等の蛍光色素で本発明の抗体又はその断片を標識することができる。 本 発明の抗体又はその断片と蛍光色素との結合は常法によって行うことができる。 標識として呈色標識物質を使用する場合には、 例えば、 コロイド金属おょぴ着 色ラテックスなどを標識として使用できる。 コロイド金属の代表例としては、 金 ゾル、 銀ゾル、 セレンゾル、 テルルゾルおよび白金ゾルなどのそれぞれの分散粒 子である金属コロイド粒子を挙げることができる。 コロイド金属の粒子の大きさ は、 通常は、 直径 3〜6 O nm程度とされる。 また、 着色ラテックスの代表例とし ては、 赤色および青色などのそれぞれの顔料で着色されたポリスチレンラッテク スなどの合成ラテツクスを挙げることができる。 ラテックスとして天然ゴムラテ ッタスのような天然ラッテクスを使用することができる。 着色ラテックスの大き さは、 直径数十 nm〜数百 n m程度から選択することができる。 これらの呈色標識 物質は市販品をそのまま使用することができるが、 場合によりさらに加工し、 ま たは、 それ自体公知の方法で製造することもできる。
本発明の抗体又はその断片と呈色標識物質との結合は常法によって行うことが できる。 例えば、 呈色標識物質が金ゾルの分散粒子である金コロイド粒子の場合 には、 通常は、 抗体と金ゾルとを室温下で混合することによって両者を物理的に 結合することが可能である。
なお、標識としては、上記以外にもァフィ二ティ一標識（例えば、ピオチン等）、 又は、 同位体標識 （例えば、 1 2 5 I等） 等を使用することもできる。
本発明の標識抗体を用いた酵素抗体法、 免疫組織染色法、 免疫プロット法、 直 接蛍光抗体法又は間接蛍光抗体法等の分析は当業者に周知の方法で行なうことが でき、 その実験条件も当業者ならば適宜選択することができる。
本発明の抗体を用いることにより、 生体試料又は組織中において、 ヒト T G F 一 β 1ならびにヒト TGF- 2およぴヒト TGF - 3の活性化反応を検出又は測定 することができ、これにより硬化性疾患を始めとする TGF - β関連疾患を診断する ことができる。 このようなヒ ト T G F— /3 1ならびにヒト TGF - /3 2およぴヒト TGF- ^ 3の活性化反応を検出又は測定する方法並びに硬化性疾患を始めとする TGF- β関連疾患の診断方法も本発明の範囲内である。
本発明の抗体は、生体内におけるヒト T G F— 1ならびにヒト TGF- 2およ ぴヒト TGF- β 3の活性化反応を検出又は測定することができ、 これにより硬化性 疾患を始めとする TGF - ]3関連疾患を診断することができる。 即ち、本発明の抗体 は、活性型ヒト T G F— ]3 1ならびにヒト TGF- /3 2およびヒト TGF- /3 3に起因す る硬化性疾患 （例えば、 肝線維化 /肝硬変、 動脈硬化、 肺線維症、 強皮症、 腎不 全など） を始めとする TGF - /3関連疾患の診断薬として有用である。
以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、 本発明は実施例によ つて限定されるものではない。 実施例
先ず、 実施例の全体の概要を説明する。 ヒト組換え LAP ]3 1を各種プロテア一 ゼ； ヒト血漿力リクレイン （PLK) 、 ヒト血液由来プラスミン、 ヒト組換えマトリ ックスメタ口プロテアーゼ 3 (MMP3)で切断したのち各切断部位アミノ酸配列を決 定した。 切断部位を含むペプチドを合成し、 抗原ペプチドを作製した。 抗原ぺプ チドの切断面と反対側に付与したシスティン残基のチオール基を利用して代表的 キャリアータンパク質である KLH (Keyhole Lympet Hemocyanin) に結合させた抗 原ペプチドをゥサギに免疫し、 初回免疫 4週間後から抗血清を回収し、 目的の抗 体が産生されていることを ELISAにより評価した。 抗体力価の上昇が安定してき たところで、 抗原ペプチドを固定したセファロース樹脂を用いて特異的ペプチド 抗体を精製した。さらに、このぺプチド抗体よりぺプチド配列認識抗体を除去し、 目的物である切断部位断面認識抗体 (LAP 1のプロテアーゼにより切断される部 位を特異的に認識する抗体）を得た。得られた切断部位断面認識抗体の特異性をゥ エスタンプロットにて確認した。 また、 肝再生不全動物モデル、 劇症肝炎による 死亡患者の肝組織切片における染色性を評価した。 実施例 1 ：各種プロテアーゼによる LAP 1の限定分解
ヒト組換え LAP β 1 (R&D社） 800 ngを総量 27 ^ 1の PBSバッファ一中にて終 濃度 222. 2 μ g/mlのヒト血漿力リクレイン（シグマ社）、終濃度 111. 1 μ g/mlのヒ ト血液由来プラスミン （PLN) (シグマ社）、 並びに終濃度 6 μ g/mlのヒト組換え マトリックスメタ口プロテアーゼ 3 (匿 3) (Alexis社） と 37°C、 0- 30分インキ ュベーシヨンし、 12. 5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離したのちに、和 光純薬の銀染色キットを用 ヽて分解を確認した。 実施例 2 ：限定分解部位の決定- TGF- 活性化制御領域の発見
各種プロテアーゼによって限定分解した LAP )3 1断片 （200- 400 ng) を Laemmli
Mature 227， 680 (1979) ) の方法に従い SDS- 12. 5%ポリアタリルァミドゲル電気 泳動にて分離し、 ゲル上のタンパク質を PVDF (ポリビニデンジフルオリ ド） 膜に 電気泳動転写後、 CBB (クマシ一ブルー R250) 色素で可視化した。 可視化された PVDF膜状のタンパク質バンドを切り取り、微量パルス液相プロテインシークェン サー （Procise 494cLC, Applied Biosysytems 社製） の反応層に入れ、 標準のプ ログラムにてェドマン分解を行い、 各サイクルで N末端より順番に切り出される PTH (フエ二ルチオヒダントイン） -アミノ酸をクロマトグラフィーの溶出時間よ り同定した。このようにして限定分解された各断片の N末端 10残基のシークェン スを決定することにより各限定分解部位を決定したところ、 プラスミンは潜在型 TGF- βの 56Lys - 57Leuの間を、 血漿力リクレインは 58Arg- 59Leuの間を、 さらに MMP3は 79Ala-80Leuの間を特異的に切断し、似たような構造変化を引き起こすこ とで TGF - を活性化させることがわかった（図 5 )。 さらに長時間インキュベーシ ョンすると、 プラスミンは 85Arg- 86Aspの間、 106Lys- 107Gluの間を順次切断し た。 このように各種プロテアーゼによって切断され活性化を引き起こす領域
(51Gly- 1 lOArg) を TGF- β活性化制御領域と定義した。 実施例 3 ：抗原べプチドの作製
上記で決定した切断部位のァミノ酸から始まる C末側 LAP β 1配列（ 1 0ァミノ 酸残基） の最後にシスティン残基を付与したペプチド、 もしくは切断部位で終わ る Ν末側 LAP β 1配列 （ 1 0ァミノ酸残基） の最初にシスティン残基を付与した ぺプチドを固相合成の Fmoc法 （合成機；島津製作所 PSSM- 8) にて合成した。 脱 保護剤はエタンジチオール/チオア二ソール /トリフルォロ酢酸を用いた。 合成べ プチドに対し抗原性を付与するためにキヤリア蛋白質としてへモシァニン (keyhole limpet hemocyanin ； KLH) (シグマ社製） を結合させた。 KLH に含ま れるァミノ基を m -マレイミ ドベンゾィル- N-ヒ ドロキシスクシユミ ドエステル (MBS)で修飾したものを作り、これにシスティン残基を含む合成ぺプチドを反応さ せて、 両者を共有結合させた。 へモシァニン 20mgを溶かした 10mMリン酸ナトリ ゥムバッファー， pH7. 2、 1. 25mlに 0. 3 mg/z lMBSジメチルホルムアミド溶液 10 μ 1を滴下し室温で 30分攪拌して両者を結合させる。沈殿物を遠心して取り除い た上清をセフアデックス G25ゲルろ過カラムにかけ 50mMリン酸ナトリゥムバッフ ァー， pH6. 0で流して未反応の MBSと MBS結合 KLHとを分取した。 MBS結合 KLH 分画は CBBで同定し 100 μ gずつ使用した。 0. 5 mlの蒸留水に溶かした合成ぺプ チド 1 mgと MBS結合 KLH溶液半量の 0. 2Mリン酸ナトリウムバッファー， pH7. 4 を加えて室温で 3時間振とうし、 MBSの NHSエステルを介して KLHを各ぺプチド のシスティン残基と結合させた。 実施例 4 ： ゥサギへの免疫 ·採血
ゥサギ （雌、 約 2kg、 ニュージーランドホワイト、 北山ラベス） を購入後 1週 間隔離し環境に慣れさせた。 免疫前採血 （10 ml) したのちに、 合成ペプチド 100 // gを含む KLH—ぺプチド抗原溶液と、 RIBI社の完全アジュバンド 100 μ ΐとを金 属製接続管を通して均一にしたェマルジョンをゥサギの背中へ数十箇所に分けて 免疫した。 初回免疫 4週間後から、 一週間毎に 10mlずつ採血と追加免疫を 14週 間まで繰り返し、 心臓より全採血した。 採血は、 左右交互の耳動脈より行い、 抗 血液凝固剤として 1/10量 の 3. 8%タエン酸ナトリゥム溶液を用いた。 採血した 血液を 4 °C、 30分、 10， 000 rpmで遠心して血球成分を取り除いて血漿を得た。 こ れに終濃度 10 mM塩化カルシウム溶液を加えて 4 °C、 オーバーナイト静置して固 め、凝固成分を遠心（4 °C、 15分、 10, 000 rpm)で取り除いて抗血清を回収した。 実施例 5 ：抗体産生の確認
各抗血清中の抗体力価の推移は BSA を結合させた各種抗原ペプチドを用いた ELISA (Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay) にて測定した。 BSA結合ペプチド は、 抗原に用いた KLH結合ペプチドと同じ方法で作製した。 これを 50 mM炭酸バ ッファー， PH 9. 6で 4 iz g/mlに希釈したものを 100 μ 1ずつ 96穴ィムノプレート (ヌンク社製） の各穴に入れ 4 °C、 オーバーナイトでインキュベーションしてプ レートを BSA結合ぺプチドでコートし、 PBS- 0. 05 Tween20で 3回洗浄したのちに、 各抗血清を PBS- 0. 05 Tween20で薄めた希釈系列を調製し、 これを 100μ 1ずつ加 えて 37°Cで 2時間ィンキュベーションする。 PBS- 0. 05%Tween20で 3回洗浄したの ちに、 アルカリフォスファターゼ結合ャギ抗ゥサギ抗体 （Jackson社製、 7, 500 倍 PBS- 0. 05%Tween20で希釈）を 100 // 1ずつ加えて再度 37°Cで 2時間ィンキュベ ーションする。 PBS- 0. 05%Tween20で 3回洗浄したのちに 1 mg/ml p-ニトロフエ二 ルリン酸塩含有ジエタノールァミンバッファ一を 200 μ ΐずつ加えて 37°Cで 1時 間ィンキュベーションしたのちに黄色の発色程度を 405 nmの吸光度を測定するこ とにより決定した。
図 6および図 7に、プラスミン (PLN)切断部位（56Lys- 57Leu)の C末断面（56Lys) 抗体 （図 6の A) と N末断面 （57Leu) 抗体 （図 6の B )、 並びに血漿カリクレイ ン （PLK) 切断部位 （58Arg- 59Leu) の C末断面 （58Arg) 抗体 （図 7の A) と N 末断面 （59Leu) 抗体 （図 7の B ) のデータを示す。 4回目免疫後から抗体力価の 上昇がみられ、 それ以降、 高い抗体力価が保持された。 実施例 6 ：特異的べプチド抗体の精製
抗原ぺプチドを固定したセファロース樹脂を作製し、 これに吸着させることに より抗血清中に含まれるぺプチド抗体を精製した。 蒸留水で膨潤したエポキシ活 性化セファロース樹脂 （Pharmacia Biotech社） 50%スラリー 1 mlと各種抗原ぺプ チド lmgを結合バッファー （50 mM炭酸バッファー， pH8) 4 ml中にて 45°C、 ォ 一バーナイトで反応させ、セファロース樹脂に抗原ペプチドを結合させた。 0. 1 M モノエタノールァミン含有 50 mM トリス塩酸バッファー， pH8中にて 45°C、 ォー バーナイトでインキュベーションして未反応の官能基をブロックした後に、 0. 5 M
18 訂正された用紙 (規則 91) 塩化ナトリウム含有 0. 1 M酢酸バッファー， PH 4と 0. 5 M塩ィヒナトリゥム含有結 合バッファ一にて交互に 3回ずつ洗浄して抗原ぺプチドを固定したセファロース 樹脂を作製した。ペプチド固定セファロース樹脂 l mlと回収した抗血清 5mlとを 4°C、オーバーナイトで撹拌して抗血清中に含まれるぺプチド抗体を樹脂に結合さ せたのちに、 TBSバッファー （0. 15M塩化ナトリウムを含む 20mMトリス塩酸バッ ファー， pH7. 5)、 洗浄バッファー （1M塩化ナトリウム、 1%トライトン X- 100を 含む 20mMトリス塩酸バッファー， PH7. 5)、 TBSバッファー、 0. 15M塩化ナトリウ ム溶液で洗浄したのちにグリシンバッファー pH2. 5 中に溶出した。 このとき抗体 を即座に中性にするために、 回収分画には予め溶出体積の 1/20の 1Mトリスバッ ファーを入れておく。 得られた抗体の濃度は BCAアツセィキット （Pierce) によ り決定した。 実施例 7 ：切断部位断面認識抗体の精製 （ペプチド配列認識抗体の除去）
上記セファロース樹脂に固定化したペプチドの切断面末端をァセチル化してブ 口ックした樹脂を作製し、これを詰めたカラムにぺプチド抗体を通すことにより、 ペプチド配列認識抗体を除去して切断面認識抗体のみを精製した。ァセチル化は、 ァセチルイミダゾール 0. 12 g/ 4 mlジメチルホルムァミド中にてぺプチド固定セ ファロース樹脂を室温にて 5分を 2回撹拌して行い、 ジメチルホルムアミドで洗 浄後スピンカラムに詰め （カラムボリューム lml)、 これに上術のように精製した ぺプチド抗体 100 μ gを通してぺプチド配列認識抗体を除去し、非吸着分画を回収 し切断部位断面認識抗体とした。 抗体のタンパク濃度は BCAァッセィにより決定 した。 実施例 8 ：切断部位断面認識抗体の認識特異性の確認
上記で得られた切断部位断面認識抗体の認識特異性をウェスタンプロット解析 にて確認した。図 8の Aに、プラスミン切断部位（56Lys- 57Leu)の N末断面（57Leu) 認識抗体を用いた結果を示す。 図 8 の Bに、 血漿カリク レイン切断部位 (58Arg-59Leu) の N末断面 （59Leu) 認識抗体を用いた結果を示す。
図 8では、プロテァーゼ処理していないヒト組換え LAP 1、終濃度 222. 2 μ g/ml の血漿カリクレインで 37°C、 30分インキュベーションして切断した LAP /3 1、 終 濃度 111. 1 μ g/ml のプラスミンで 37°C、 10分インキュベーションして切断した LAP ]8 1、各 800 ngを 12. 5%ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離したのちに、 PVDF (ポリビュデンジフルオリ ド） 膜に電気泳動転写した。 膜上のタンパク質の ウェスタンプロット解析は、 プラスミン切断部位 N末断面認識ゥサギ抗体または 血漿カリクレイン切断部位 N末断面認識ゥサギ抗体 （終濃度 3. 25 μ g/ml) とホー スラディッシュペルォキシダーゼ結合ャギ抗ゥサギ IgG抗体（最終 1： 1, 500希釈） の組み合わせを用いて、既報の方法に従って行った（Okuno M他、 Gastroenterology 2001 ; 120： 1784-1800) 0 バンドは Amer sham- Pharmacia (Buckinghamshire, UK) ECL systemで検出した。
血漿力リクレイン切断部位 N末断面（59Leu)認識抗体は、活性化反応を受けて いない（切断されていない）インタクトな LAP jS lをほとんど認識せず（レーン 1 )、 血漿カリクレイン （PLK) よって切断された LAP ]3 1断片のみ強く認識し （レーン 2 )、血漿力リクレイン切断部位（58Arg- 59Leuの間）より 2残基前の 56Lys- 57Leu で切断されたプラスミン （PLN) 切断 LAP ]3 1断片を弱く認識した （レーン 3 )。 こ の結果は、 血漿力リクレイン切断部位 N末断面認識抗体は、 血漿力リクレインに よって断片化された潜在型 TGF- ]3の切断面を特異的に検出する抗体であること を示している。 実施例 9 ：肝再生不全動物モデルにおける有用性の確認
血漿力リクレイン切断部位 N末断面認識抗体の組織免疫染色における有用性を 評価するために、血漿力リクレインによる TGF- 活性化反応が病態形成の原因で あることがわかっている内毒素（LPS)前投与による部分肝切除後の肝再生不全マ ウスモデル （Akita ほか、 Gastroenterology 123 : 352-364, 2002) を作製し抗体 の染色性を試した （図 9 )。 C3H/HeN マウス （5週齢、 日本クレア， 東京， 日本） を 1週間隔離し、 無作為 に各 1 0匹に分けたマウスに、 50 μ 1の生理食塩水 （500ng/g 体重の LPS
(Escherichia coli 0111 :B4、 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) ) を含むも の、 又は含まないもの） を腹腔内注射し、 24時間後に偽手術もしくは Higginsお ょぴ Andersonの方法 （Higgins GM他、 Arch Pathol 1931； 12： 186- 202) に従つ て 67%部分肝切除手術を施し、手術 48時間後にエーテル麻酔下で下大静脈から失 血させて屠殺した。 肝臓を素早く取り出し、 1 0 %緩衝ホルマ リン [ホルマリン
( 3 7 %パラホルムアルデヒド 3 %エタノール水溶液） を P B Sで 1 0倍希釈し たもの]にて 4 °C、 2 4時間固定したのちに、 アルコール系列で脱水し， キシロ ールで置換した後、 自動包埋装置を用いてパラフィンに入れ， 型に固めて肝組織 パラフィン包埋ブロックを作製した。 ミクロトームを用いて肝組織パラフィン包 埋ブロックから薄さ 5 μ ιηの切片を作製し、免疫組織染色に用いた。キシレン 1 0 分 2回にてパラフィンを除去した後， 1 0 0 %, 7 0 %， 5 0 %エタノール各 1 回でリンスし， 水洗後風乾して DAK0 Pen (DAK0 Cytomation, Kyoto, Japan) に て切片周囲にサークルを描き， さらに数分風乾後、無水エタノール： 3 %過酸化水 素水 = 9 ： 1混合液に浸して内在性パーォキシダーゼ活性のブロッキングを行つ た。 その後に、 Vectastain ABC elite kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) を用いて染色、 発色を行った。 キット付属のブロッキング溶液とインキュベーシ ヨンしたのちに、 一次抗体 （マウス抗 TGF- 3モノクローナル抗体 （図 9の上段） もしくは血漿力リクレイン切断部位 N末断面認識抗体 （図 9の中段）； 1 %BSAを 含むリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)中に最終濃度 1 3 /X g/ml)と一緒に加湿チャンバ 一内で 4°Cでー晚ィンキュベートした。 同一ゥサギの免疫前抗体を対照として用 いた （図 9の下段)。 PBSで洗浄後、 使用説明書に従ってピオチン化二次抗体、 ァ ビジン DH -ビォチン化パーォキシダーゼ混合液と順次反応させ切片を染色した。 ジァミノべンジジンテトラヒドロクロライドを用いて発色させ、 へマトキシリン を用いて核の対比染色を行った。 軽く水でリンスしたのち， 風乾させ， 5 0 %，
7 0 %, 1 0 0 %エタノール各 1回でリンスし、キシレン 1 0分 1回にて透徹し， 非水溶性封入剤にて封入して顕微鏡観察に用いた。
生理的食塩水投与偽手術を施したコント口ール群ではいずれの抗体によっても 染色性は認められなかった （図 9の左側）。 生理的食塩水投与部分肝切除手術群、 LPS投与偽手術でも同様にほとんど染色性は認められなかった。 これに対して、 LPS投与部分肝切除手術群においては、 TGF- ]3抗体によって類洞周囲の星細胞を 中心とした顕著な染色像とその周囲の肝細胞にうつすらとした染色像 （図 9の右 側上段パネル） が認められ、 血漿力リクレイン切断部位 N末断面認識抗体におい ても類洞周囲を中心とした染色像が認められた（図 9の右側中段パネル)。免疫前 抗体では特異的な染色像は得られなかった（図 9の右側下段パネル)。この結果は、 LPS投与部分肝切除手術群において起こった血漿力リクレイン依存 TGF - ) S活性化 反応の結果生じた活性型 TGF- βと LAP断片とがそれぞれの抗体で認識されたこと を 示 し て レヽ る 。 す な わ ち 、 血 漿 カ リ ク レ イ ン切断部位 N末断面認識抗体によって LPS投与部分肝切除手術群において血漿力 リクレイン依存 TGF- jS活性化反応が起こったことを表しており、動物モデルにお ける有効性が示された。 実施例 1 0 ： ヒト病変肝における有用性の確認 1
さらに、 血漿力リクレイン切断部位 N末断面認識抗体によつて劇症肝炎で死亡 した患者肝組織切片が染色されること（図 1 0 )から、 ヒ トの病態形成時にプロテ ァーゼによる TGF - 活性化反応が起こっていることを示すことに成功した。
1 0 %緩衝ホルマ リン固定， パラフィン包埋した患者肝組織から切片 （2 . 5 U m) を作製し， キシレン 2 0分4回にて脱パラフィン後， エタノール2回， 9 0 % , 8 0 % , 7 0 %ェタノール各 1回でリンスし， 水洗後風乾して ΜΚ0 Pen (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan)にて切片周囲にサークルを描き， さらに 3 0分 風乾後、 切片に一次抗体 (免疫前抗体 （図 1 0の左側パネル） もしくは血漿カリ クレイン切断部位 N末断面認識抗体（図 1 0の右側パネル)）を最終濃度 1 3 μ g Zm 1にて室温 1時間湿箱中で反応させた。 P B Sにて 1回リンス後さらに 3 0 分洗浄したのちに、 二次抗体 (Biotin-labeled Swine anti-Rabbit IgG F (ab' ) 2 fragment (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) ) 1 0 μ g /m 1にて室温 1時間反 応させた。 P B Sにて 1回リ ンス後さらに 3 0分洗浄したのちに、 Alkaline phosphatase - labeled Strept ABC Complex (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan)に て室温で 4 0分反応させた。 P B Sにて 1回リンス後さらに 3 0分洗浄したのち に、 添付書に従い調製した New Fuchsin substrate (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan)を反応させ陰性コントロール （図 1 0の左側パネル） に淡くバックダウン ドの染まりが出るまで発色した。 軽く水でリンスしたのち， 風乾させ， キシレン 1 0分 3回にて透徹し， 非水溶性封入剤にて封入して顕微鏡観察に用いた。
免疫前抗体 （図 1 0の左側パネル） に比べて血漿カリクレイン切断部位 N末断 面認識抗体 （図 1 0の右側パネル） では、 線維に埋もれながらも僅かに細胞構造 を保っている肝細胞が淡く染色されるとともに、 特に星細胞と思われる幾つかの 細胞が赤く染まっていることが観察された （矢印）。 この結果は、患者さんの病態 形成時に血漿力リクレインによる TGF - ]3活性化反応が起こっていることを示し ており、 劇症肝炎時の肝再生不全には血漿力リクレインに対する特異的阻害剤や 抗体が有効に働く可能性を強く示唆している。 実施例 1 1 ： ヒ ト病変肝における有用性の確認 2
B型肝炎で死亡した患者肝組織切片を染色したところ、 血漿力リクレイン切断 部位 C末切断面認識抗体を用いた場合と比較して、 血漿力リクレイン切断部位 N 末切断面認識抗体を用いた場合により明確な染色像を得ることができた（図 1 1 )。
B型肝炎で死亡した患者肝組織から 1 0 %緩衝ホルマリン固定， パラフィン包 埋した切片 （2 . 5 μ πι) を作製し， キシレン 2 0分 4回にて脱パラフィン後， エタノール 2回， 9 0 %, 8 0 %， 7 0 %エタノール各 1回でリンスし， 水洗後 風乾して DAKO Pen (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan)にて切片周囲にサークルを 描き， さらに 3 0分風乾後、 切片に一次抗体として血漿カリクレイン切断部位 C 末断面認識抗体（58番目のアルギニンを認識する抗体）（図 1 1の左側上パネル）、 血漿力リクレイン切断部位 N末断面認識抗体 (59番目のロイシンを認識する抗体） (図 1 1のまん中上パネル）、無免疫ゥサギ抗体を最終濃度 1 3 μ g /m 1、また は活性型 TGF - β認識マウスモノクロナル抗体 （図 1 1の右側上パネル）、 もしく は無免疫マウス抗体を最終濃度 1 μ g /m 1にて室温 1時間湿箱中で反応させた。 P B Sにて 1回リンス後さらに 3 0分洗浄したのちに、二次抗体 (Biotin- labeled Swine anti-Rabbit IgG F (ab ) 2 fragment (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) もしく は、 Biotin - labeled Swine anti-Mouse IgG F (ab， ) 2 fragment (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan) ) 1 0 μ g /m 1にて室温 1時間反応させた。 P B S にて 1 回 リ ンス後 さ ら に 3 0 分洗浄 したの ち に、 Horseradish Peroxidase - labeled Strept ABC Complex (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan)に 室温で 4 0分反応させた。 P B Sにて 1回リンス後さらに 3 0分洗浄したのちに、 添付書に従い調製した DAB substrate (DAKO Cytomation, Kyoto, Japan)を反応さ せ陰性コントロール （図 1 1の下段パネル） に淡くパックダウンドの染まりが出 るまで発色した。 軽く水でリンスしたのち， 風乾させ， キシレン 1 0分 3回にて 透徹し， 非水溶性封入剤にて封入して顕微鏡観察に用いた。
免疫前抗体 （下段パネル） に比べて血漿カリクレイン切断部位 C末断面認識抗 体 （図 1 1の上図まん中） では、 星細胞を中心とした染色が見られるが、 血漿力 リクレイン切断部位 N末断面認識抗体 （図 1 1の上図左） では、 C末断面認識抗 体 （図 1 1の上図まん中） に比べて、 より明確な染色像を得ることができた。 活 性型 TGF- ]3認識マウスモノクロナル抗体 （図 1 1の上図右） でも、 C末断面認識 抗体 （図 1 1の上図まん中） と同様の染色像を得ることができたが、 バックグラ ンドはやや高かった （図 1 1の下図右)。 この結果は、病態形成時に血漿力リクレ インによる TGF - β活性化反応が起こっていることを明確に示しており、 Β型肝炎 肝炎時の肝再生不全には血漿力リクレインに対する特異的阻害剤や抗体が有効に 働く可能性を強く示唆している。 実施例 1 2 ： MM Ρ 2及び MM Ρ 9では LAPの特異的切断は起こらないことの確 pひ
ヒト組換え LAP β 1 (R&D社） 800 ngを総量 27 μ 1の 50 mM Trisバッファー (50 mM Tris-HCl, H 7-200 mM NaCl-1 μ M ZnCl2- 5 mM CaCl2- 0. 05% Brij 35-0. 05%NaN3) 中にて終濃度 13. 3 g/mlのヒトマトリックスメタ口プロテアーゼ 2 (MMP2)
(Alexis社）、もしくは終濃度 13. 3 / g/mlのヒトマトリックスメタ口プロテア一 ゼ 9 (MMP9) (Alexis社） と 37°C、 30分インキュベーションし、 12. 5%ポリアク リルアミドゲル電気泳動にて分離したのちに、 和光純薬の銀染色キットを用いて 染色したが、 LAPの分解は確認できなかつた。 この時用いた MMP2と MMP9は、 潜 在型のものを購入し、 上記 50 mM Trisバッファ一中にて終濃度 2 の
4-aminophenylmercuric acetate (APMA)と 37。C、 1 B守間ィンキュべ一ンョンする ことによって活性化した後に実験に供した。 APMA処理により MMP2と MMP9が活性 型になっていることは、 150 mM Trisバッファー （150 mM Tris - HC1， pH 7. 5-100 mM NaCl-10 mM CaCl2-0. 05% Brij 35) 中にて蛍光合成基質
MOCAc- Pro- Leu- Gly- Leu- A2pr (Dnp) - Ala- Arg- H2 (ペプチド研究所製） を用いた 活' I"生 ¾J定 (Ex 280 nm-Em 360 ran; Reference： C. G. Knight, et al. , FEBS Lett. , 296： 263, 1992) を行い確認した。 実施例 1 3 ：サンドイッチ ELIZA法による断片化 LAPの検出
サンドィツチ ELIZA法は情報 (Harlow and Lane, Immunoassays, _¾ Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 553 - 612, 1988) に従って行った。 すなわち、 市販の抗ヒト LAPモノクロナル抗体 （R&D社 製） をィムノプレート （Nunc社製） 1ゥエル当たり 1 ju g (20 ^ g/ml of PBSを 50 i l) 添加し、 4 °Cでー晚インキュベーションすることによってコートした。 PBSで 2回洗浄した後に、 ブロッキング溶液 （3%ゥシ血清アルブミン- 0. 02%アジ 化ナトリゥム含有 PBS ) 200 μ ΐと 4 °Cでもうー晚インキュベーションすることに よってブロッキングを行なった。 PBSで 2回洗浄した後に、 1ゥエル当たり 0， 125, 250, 500, 1, 000， 2, 000 ngの市販ヒト LAP j3 1 (R&D社製） ブロッキング溶液希 釈系列、 ヒ ト血漿カリクレイン （Sigma社製） 処理 （37°C, 40分インキュベーシ ヨン） ヒト LAP 1 (R&D社製） ブロッキング溶液希釈系列、 もしくはプラスミン (Sigma社製） 処理 （37°C, 40分インキュベーション） ヒ ト LAP ]3 1 (R&D社製） ブ口ッキング溶液希釈系列各 50 μ 1を力!]え、 37°Cで 2時間反応させた。 PBSで 4 回洗浄後、血漿力リクレイン切断部位 C末断面認識抗体もしくは免疫前抗体 25 μ g/ml PBS溶液を各ゥエルに 40 μ ΐずつ入れて室温で 2時間シエーキングしなが ら反応させた。 PBSで 4回洗浄後、 アルカリフォスファターゼ標識ャギ抗ゥサギ 抗体 （Jackson社製、 7, 500倍 PBS- 0. 05%Tween20で希釈） を 100 μ 1ずつ加えて 37°Cで 2時間ィンキュベーションした。 PBS- 0. 05%Tween20で 3回洗浄したのちに 1 mg/ml p -二トロフエニルリン酸塩含有ジェタノールァミンパッファーを 200 μ 1 ずつ加えて 37°Cで 1時間インキュベーションしたのちに黄色の発色程度を 405 nm の吸光度を測定することにより決定した。 その結果、 断片化 LAPを検出できるこ とが確認された （図 1 2 )。 産業上の利用可能性
本発明においては、 TGF- 活性化制御領域に存在する各々のプロテアーゼ切断 部位を認識する特異抗体を作製することによって、 従来の技術では困難であった 病態、 組織、 ァイソフォーム特異的 TGF- 生成反応 （活性化反応） を検出するこ とが可能になった。 さらに、 検出された各々の活性化反応を特異的に阻害する合 成低分子阻害剤や抗体を用いて異常 TGF- 生成反応のみを抑える新規治療法の 診断、 並びに予後の診断に役立つことが期待できる。

Claims

請求の範囲
1. ヒト TGF— 中に存在するプロテアーゼ切断部位を特異的に認識する ことができる、 ヒト TGF— の LAP断片に対する抗体。
2. ヒト TGF— )3 1中の 51番目のアミノ酸残基グリシンから 1 10番目 のアミノ酸残基アルギニンまでの領域ならぴにヒト TGF- 2およぴヒト TGF - j3
3の当該領域に存在するプロテアーゼ切断部位を特異的に認識することができる、 ヒ ト TGF— ]3 1ならびにヒ ト TGF- ]32およびヒ ト TGF - ]33の LAP断片に対 する抗体。
3. ポリクローナル抗体である、 請求項 1又は 2に記載の抗体。
4. モノクローナル抗体である、 請求項 1又は 2に記載の抗体。
5. プロテアーゼ切断部位が 58番目のアルギニン残基と 59番目の口イシ ン残基の間であり、 59番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
6. プロテアーゼ切断部位が 58番目のアルギニン残基と 59番目の口イシ ン残基の間であり、 58番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
7. プロテアーゼ切断部位が 56番目のリジン残基と 57番目のロイシン残 基の間であり、 57番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請求 項 1から 4の何れかに記載の抗体。
8. プロテア ゼ切断部位が 56番目のリジン残基と 57番目のロイシン残 基の間であり、 56番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
9. プロテアーゼ切断部位が 79番目のァラニン残基と 80番目のロイシン 残基の間であり、 80番目のロイシン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請 求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
10. プロテアーゼ切断部位が 79番目のァラニン残基と 80番目の口イシ ン残基の間であり、 7 9番目のァラニン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
1 1 . プロテアーゼ切断部位が 8 5番目のアルギニン残基と 8 6番目のァス パラギン酸残基の間であり、 8 6番目のァスパラギン酸残基を含む切断面を特異 的に認識する、 請求項 1カゝら 4の何れかに記載の抗体。
1 2 . プロテアーゼ切断部位が 8 5番目のアルギニン残基と 8 6番目のァス パラギン酸残基の間であり、 8 5番目のアルギニン残基を含む切断面を特異的に 認識する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
1 3 . プロテアーゼ切断部位が 1 0 6番目のリジン残基と 1 0 7番目のダル タミン酸残基の間であり、 1 0 7番目のグルタミン酸残基を含む切断面を特異的 に認識する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
1 4 . プロテアーゼ切断部位が 1 0 6番目のリジン残基と 1 0 7番目のダル タミン酸残基の間であり、 1 0 6番目のリジン残基を含む切断面を特異的に認識 する、 請求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
1 5 . プロテアーゼ切断部位が 7 6番目のァラニン残基と 7 7番目のバリ 残基の間であり、 7 7番目のパリン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請求 項 1から 4の何れかに記載の抗体。
1 6 . プロテアーゼ切断部位が 7 6番目のァラニン残基と 7 7番目のパリン 残基の間であり、 7 6番目のァラニン残基を含む切断面を特異的に認識する、 請 求項 1から 4の何れかに記載の抗体。
1 7 . 請求項 1カゝら 1 6の何れかに記載の抗体を含む、 硬化性疾患を始めと する TGF- 0関連疾患の診断薬。
1 8 . 請求項 1カゝら 1 6の何れかに記載の抗体を用いて、 試料又は組織中の ヒ ト T G F— j3 1ならぴにヒ ト TGF- β 2およぴヒ ト TGF- β 3の活性化反応を検 出又は測定する方法。
1 9 . 請求項 1カゝら 1 6の何れかに記載の抗体を用いて試料又は組織中のヒ ト T G F— j3 1ならびにヒト TGF- ]3 2およぴヒ ト TGF - β 3の活性化反応を検出 又は測定することを含む、 硬化性疾患を始めとする TGF-/3関連疾患の診断方法。
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