JP2021017413A - ヒトTGF−βのLAP断片に対する抗体及びその利用 - Google Patents
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Abstract
Description
本実施形態のヒトTGF-βのLAP断片に対する単離モノクローナル抗体(以下、単に「抗体」ともいう)は、ヒトTGF-βのLAP断片のインテグリン結合部位を認識することにより、ヒトTGF-βのLAP断片と特異的に結合する。
・軽鎖CDR1:SASSSVSYMH (配列番号4)
・軽鎖CDR2:STSNLAS (配列番号5)
・軽鎖CDR3:QQRSSYPFT (配列番号6)
・重鎖CDR1:SYWMN (配列番号7)
・重鎖CDR2:MIDPSDSETHYNQMFKD (配列番号8)
・重鎖CDR3:WPYALDY (配列番号9)
・軽鎖の可変領域
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMHWFQQKPGTSPKLWIYSTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRMEAEDAATYYCQQRSSYPFTFGSGTKLEIKRA (配列番号10)
・重鎖の可変領域
EVQLQQSGAELVRPGASVKLSCKASGYTFTSYWMNWVKQRPGQGLEWIGMIDPSDSETHYNQMFKDKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVNWPYALDYWGQGTSVTVSS (配列番号11)
・軽鎖CDR1:RASHEISGYLG (配列番号12)
・軽鎖CDR2:AASTLDS (配列番号13)
・軽鎖CDR3:LQYASYPFT (配列番号14)
・重鎖CDR1:RFWMN (配列番号15)
・重鎖CDR2:MIHSSDSITRLNQKFKD (配列番号16)
・重鎖CDR3:GYDEYSAMDY (配列番号17)
・軽鎖の可変領域
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASHEISGYLGWLQRQPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPFTFGSGTKLEVKRA (配列番号18)
・重鎖の可変領域
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRFWMNWVRQRPGQGLEWIGMIHSSDSITRLNQKFKDKATLTLDYSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARGYDEYSAMDYWGQGTSVPVSS (配列番号19)
・軽鎖
MDMRVPAHVFGLLLLWFPGTRCDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASHEISGYLGWLQRQPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPFTFGSGTKLEVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号20)
・重鎖
MGWSSIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRFWMNWVRQRPGQGLEWIGMIHSSDSITRLNQKFKDKATLTLDYSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARGYDEYSAMDYWGQGTSVPVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (配列番号21)
本実施形態のLAP断片検出用試薬(以下、単に「試薬」ともいう)は、上記の本実施形態のヒトTGF-βのLAP断片に対する単離モノクローナル抗体を含む試薬である。
本実施形態のLAP断片検出用試薬キット(以下、単に「試薬キット」ともいう)は、上記の本実施形態のヒトTGF-βのLAP断片に対する単離モノクローナル抗体を含む第1試薬と、配列番号3で表されるアミノ酸配列のN末端のロイシン残基を含む領域を特異的に認識する抗体を含む第2試薬とを備える試薬キットである。
本実施形態のヒトTGF-βのLAP断片の測定方法(以下、「測定方法」ともいう)は、抗体を用いて、被検者から採取した生体試料におけるヒトTGF-βのLAP断片を測定することを含む。
本実施形態のヒトTGF-βのLAP断片の測定値をモニタリングする方法(以下、「モニタリング法」ともいう)では、上記の本実施形態の抗体を用いて、被検者から採取した第1生体試料におけるTGF-βのLAP-Dを測定する工程と、該被検者から採取した第2生体試料におけるTGF-βのLAP-Dを測定する工程とを含む。第1生体試料は、第1の時点において被検者から採取された生体試料である。第2生体試料は、第1の時点とは異なる第2の時点において、同じ被検者から採取された生体試料である。本実施形態のモニタリング法では、第1及び第2生体試料中のTGF-βのLAP断片の測定値を比較することで、被検者におけるLAP断片の測定値の変化をモニタリングすることができる。
(1) 抗原の作製
TGF-β1-LAP(アミノ酸残基30-390)にR278Aの変異を挿入したポリペプチドを作製した。このポリペプチドをコードする遺伝子配列にHisタグ配列を付加した配列を有するポリヌクレオチドを、Igkシグナルの下流につなぎ、pOripベクターを用いてHEK293F細胞において発現させた。HisTrap(GE healthcare社)をメーカーの使用説明書に従って用いて、可溶性画分からTGF-β1-LAPを精製した。HisタグをTEVプロテアーゼで切断し、得られたTGF-β1-LAPをもう一度HisTrapカラムへローディングし、素通り画分を回収した。これをゲル濾過カラム(Superdex 200 Increase 10/300 GL、GE Healthcare社)にて公知の方法により精製し、低分子画分を回収した。回収した低分子画分を抗原として用いた。
作製した抗原をメスのBalb/cマウスに免疫し、Kohler及びMilstein, Nature, vol.256, p.495-497, 1975に記載される方法により、ヒトTGF-βのLAP断片に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製した。得られたバイブリドーマについて、抗原に反応性を示す抗体を産生する株をELISA法により選択した。選択したハイブリドーマを限界希釈法によりクローニングし、ヒトTGF-βのLAP断片に対する抗体を安定に産生する株をさらに選択した。
ハイブリドーマの培養上清(10O mL)を0.22μmフィルタ一でろ過して不溶物を除去した。ろ過した培養上清を、1mLのProtein G-sepharose 4B(GE Healthcare社)を充填したカラムに通し、抗体をカラムに吸着させた。カラムから非特異吸着分を除去した後、カラムを酸性条件におくことでモノクローナル抗体を遊離させた。回収したモノクローナル抗体を、100倍量のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で透析して、精製されたモノクローナル抗体を得た。得られたモノクローナル抗体を以下「抗LAP-D抗体(A10)」とも呼び、以降の実施例に用いた。
抗LAP-D抗体(A10)を検出抗体として用いたサンドイッチELISA法の感度を評価するため、3種類の市販の抗LAP抗体との比較試験を行った。
(1.1) 検出抗体の調製
Biotin Labeling Kit-NH2(Cat#LK03、同仁化学研究所)を用いて、抗LAP-D抗体(A10)、抗LAP抗体(141402、BioLegend社)、抗LAP抗体(349702、BioLegend社)及び抗LAP抗体(MA5-17186、Thermo Fisher Scientific社)のそれぞれをビオチン標識して、検出抗体を得た。各検出抗体を抗体希釈用溶液(10μg/mLマウスIgG含有HEPES)で希釈して、各検出抗体の溶液(いずれも5μg/mL)を得た。
7.0μLのヒト組換えLAP(20μg/mL、R&D社)、9.4μLのPLK(59.3μg/mL、Sigma-Aldrich社)及び83.6μLのPBSを混合し、得られた混合液を37℃で1時間インキュベートして、LAP-D溶液を得た。LAPの分子量を27 kDaとした場合、得られたLAP-D溶液の濃度は52 nMとなった。LAP-D溶液を1%BSA/TBSで800倍に希釈し、検量線の上限を65 pMとした。LAP-Dの希釈溶液をさらに希釈して、希釈系列(32.5 pM、16.3 pM、8.1 pM、4.1 pM、2.0 pM、1.0 pM及び0pM)を調製した。
捕捉抗体として、特許文献1に記載のLAP-Dに対する抗体(以下、「抗L59 LAP-D抗体」とも呼ぶ)を用いた。この抗体は、PLKにより切断されたLAPの切断面、すなわち配列番号3で表されるアミノ酸配列のN末端のロイシン残基を含む領域を特異的に認識する。抗L59 LAP-D抗体をTBSで希釈して、捕捉抗体溶液(20μg/mL)を得た。
6本のNNモジュールF8マキシソープ(NUNC社)を1フレームにセットしたプレートに捕捉抗体溶液を1ウェルあたり50μLで分注し、プレートを4℃で一晩インキュベートした。プレートを、1ウェル当たり200μLの洗浄液(0.05%Tween20含有TBS)で3回洗浄した。ブロッキング溶液(1%BSA含有TBS)を1ウェルあたり350μLで分注し、プレートを4℃で一晩インキュベートした。ブロッキング溶液を除去し、8段階に希釈した検量線用標準物質を1ウェルあたり50μL(n=3)で分注し、プレートを4℃で一晩インキュベートした。プレートを上記のように洗浄液で3回洗浄した後、各検出抗体の溶液を1ウェルあたり50μLで分注し、プレートを4℃で3時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄液で3回洗浄した後、アルカリホスファターゼ・ストレプトアビジン溶液(0.05μg/mL)を1ウェルあたり50μLで分注し、プレートを室温で3時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄液で3回洗浄した後、発色基質溶液(4-ニトロフェニルリン酸)を1ウェルあたり100μLで分注し、プレートを4℃で一晩インキュベートした。プレートを室温に戻した後、405 nmの吸光度を測定した。検量線用標準物質のLAP-D濃度に対する吸光度の測定値をプロットして、検量線を作成した。
各検出抗体についての検量線を図4A〜Dに示す。これらの図から分かるように、検出抗体として抗LAP-D抗体(A10)を用いた場合のみ、定量性を有する検量線を作成することができた。抗LAP-D抗体(A10)は、PLKにより得られたLAP-Dに対する感度が高く、LAP-Dを検出するためのELISA法の検出抗体として有用であることが示された。
抗LAP-D抗体(A10)の有用性を評価するため、ヒト血漿検体中のLAP-DをELISA法で測定した。比較のため、市販のLAP-D検出用ELISAキットに含まれる抗LAP-D抗体による測定を同じ条件下で行った。
(1.1) 生体試料
直接作用型抗ウイルス剤(DAA)投与中のC型肝炎ウイルス感染患者6名から、所定の間隔をあけて血液を複数回採取し、血漿検体(48検体)を得た。各血漿検体は、ブロッキング溶液(1%BSA含有TBS)で20倍に希釈して測定に用いた。これらの血漿検体について、あらかじめ市販のLAP-D検出用ELISAキット(R&D Systems社)を用いてLAP-Dを測定し、測定不能の検体及び測定値が非常に低かった検体を選択した。測定は、キットに添付のマニュアルに従って行った。実施例2では、選択された検体を用いた。
検出抗体として、実施例1と同様にして調製したビオチン標識抗LAP-D抗体(A10)を用いた。また、比較のための検出抗体として、上記のLAP-D検出用ELISAキットに含まれるビオチン化抗ヒトLAP TGF-β1抗体(BAM2462、R&D Systems社)(以下、「BAM2462抗体」ともいう)を用いた。各検出抗体を抗体希釈用溶液(10μg/mLマウスIgG含有HEPES)で希釈して、各検出抗体の溶液(いずれも2.5μg/mL)を得た。検量線用標準物質及び捕捉抗体は、実施例1と同様にして調製した。
8本のNNモジュールF8マキシソープ(NUNC社)を4フレーム(プレート2枚×抗体2種類分)にセットしたプレートに、捕捉抗体溶液を1ウェルあたり50μLで分注し、プレートを4℃で一晩インキュベートした。実施例1と同様に、プレートを洗浄してブロッキングした。ブロッキング溶液を除去し、8段階に希釈した検量線用標準物質及び20倍希釈した血漿検体を1ウェルあたり50μL(n=3)で分注し、プレートを4℃で一晩インキュベートした。実施例1と同様に、プレートを洗浄し、各検出抗体の溶液を各ウェルに分注してプレートを4℃で3時間インキュベートした。実施例1と同様に、プレートを洗浄し、発色基質溶液を各ウェルに分注してインキュベートし、405 nmの吸光度を測定した。
プレートごとに検量線を作成した。各検出抗体についての検量線の一例を図5A及びBに示す。検量線から、20倍希釈した各血漿検体についてLAP-Dの値を得た。得られたLAP-Dの値を20倍した値を、各血漿検体中のLAP-D濃度値とした。検量線から得られた値がマイナスである場合は「0 pM」とみなした。5名の患者の各血漿検体中のLAP-D濃度値のグラフを図6A及びBに示す。
図5A及びBに示されるように、検量線の傾きは、抗LAP-D抗体(A10)を用いた測定の方が大きかった。また、抗LAP-D抗体(A10)を用いた測定によるLAP-Dの定量性は、BAM2462抗体を用いた測定と同等かそれ以上であった。図6A及びBから分かるように、検出抗体として抗LAP-D抗体(A10)を用いた場合のみ、LAP-Dを検出できた検体が多数認められた。よって、血漿検体などの生体試料中のLAP-Dを測定する場合、抗LAP-D抗体(A10)を用いるELISA法が有用であることが示された。
(1) RACE-Ready cDNAライブラリーの調製
抗LAP-D抗体(A10)産生ハイブリドーマの凍結ストック(1x107 cells/vial、1本)を解凍し、500 gで5分間遠心分離して上清を除去した。得られた細胞から、GenElute Direct mRNA Miniprep Kit(Sigma-Aldrich社)を用いてmRNAを調製した。得られたmRNAを核酸定量装置Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific社)で測定して濃度を定量した。100μgのmRNAから、SMARTer RACE5'/3'Kit (Clontech社)を用いてRACE-Ready cDNAを調製した。プライマーは該キットに添付の5'-CDRプライマーを用いた。
200 ngのRACE-Ready cDNAを鋳型とし、DNAポリメラーゼKOD Plus neo(TOYOBO)を用いて50μLスケールで抗体遺伝子(重鎖及び軽鎖)を増幅した。フォワードプライマーには、SMARTer RACE5'/3'Kitに添付のUniversal Primier Mixを1/10量用いた。リバースプライマーには、軽鎖用プライマー3種及び重鎖用プライマー3種をそれぞれ用いた。反応液の組成は、キットに添付のマニュアルに従った。反応条件は、94℃で2分の変性後、96℃で10秒及び68℃で80秒の2ステップを35サイクルであった。
PCRの増幅産物を2%アガロースゲル(1/20000 GelGreen Nucleic Acid Gel Stain(Biotium社)含有)中に100 Vで30分間電気泳動した。泳動後、緑色LED照射下で、各リバースプライマーに対応する増幅産物のバンドをゲルから切り出した。切り出したバンドを含むゲルから、Wizard SV Gel and Clean-Up System(Promega社)を用いてDNAを抽出した。得られたDNAの核酸配列解析をユーロフィンジェノミクス株式会社に委託した。軽鎖の3種の配列情報及び重鎖の3種の配列情報を解析ソフトウェアGenetyx Ver.14.1(ゲネティックス社)で解析して、軽鎖及び重鎖のそれぞれの配列情報を自動統合した。
抗LAP-D抗体(A10)の軽鎖及び重鎖のアミノ酸配列は、以下のとおりであった。
・軽鎖
MDMRVPAHVFGLLLLWFPGTRCDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASHEISGYLGWLQRQPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPFTFGSGTKLEVKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC (配列番号20)
・重鎖
MGWSSIILFLVATATGVHSQVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKTSGYSFTRFWMNWVRQRPGQGLEWIGMIHSSDSITRLNQKFKDKATLTLDYSSSTAYMQLSSPTSEDSAVYYCARGYDEYSAMDYWGQGTSVPVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK (配列番号21)
・軽鎖可変領域
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASHEISGYLGWLQRQPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYASYPFTFGSGTKLEVKRA (配列番号18)
・重鎖可変領域
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・軽鎖CDR1:RASHEISGYLG (配列番号12)
・軽鎖CDR2:AASTLDS (配列番号13)
・軽鎖CDR3:LQYASYPFT (配列番号14)
・重鎖CDR1:RFWMN (配列番号15)
・重鎖CDR2:MIHSSDSITRLNQKFKD (配列番号16)
・重鎖CDR3:GYDEYSAMDY (配列番号17)
本発明者らはこれまでに、抗LAP-D抗体(A10)とは別の抗LAP-Dモノクローナル抗体(以下、「A2D109抗体」と呼ぶ)を作製し、このA2D109抗体がLAP-Dのインテグリン結合部位に結合することをX線結晶構造解析により明らかにしている(後述の参考例を参照)。ここで、A2D109抗体は、配列番号4〜6で表されるアミノ酸配列からそれぞれなる軽鎖CDR1〜3と、配列番号7〜9で表されるアミノ酸配列からそれぞれなる重鎖CDR1〜3とを有する。また、A2D109抗体は、配列番号10で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む軽鎖と、配列番号11で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む重鎖とを有する。抗LAP-D抗体(A10)のの反応性の評価するため、LAP-Dとの結合について、抗LAP-D抗体(A10)がA2D109と競合するか否かを、Biacore(登録商標)装置を用いるSPR分析により検討した。比較のため、BAM2462抗体も用いて同様の分析を行った。
(1.1) 抗原(Analyte)の調製
・ヒトTGF-β1のLAP-Dの調製
TGF-β1-LAP(アミノ酸残基30-390)をコードする遺伝子配列にTEVプロテアーゼ切断可能なリンカー配列及びHisタグ配列を付加した配列を有するポリヌクレオチドを、Igkシグナルの下流につなぎ、pOripベクターを用いてHEK293F細胞において発現させた。HisTrap(GE healthcare社)をメーカーの使用説明書に従って用いて、可溶性画分からTGF-β1-LAPを精製した。HisタグをTEVプロテアーゼで切断し、得られたTGF-β1-LAPをもう一度HisTrapカラムへローディングし、素通り画分を回収した。これをカチオン交換カラム(HiTrap SP HP、GE Healthcare社)にて従来の方法により精製し、ヒトTGF-β1のLAP-Dを調製した。ヒトTGF-β1のLAP-Dの分子量は41653 Daであった。
Pierce(商標) Mouse IgG1 Fab and F(ab')2 Preparationキット(Thermo Fisher社)を用いて、A2D109抗体をFab断片(A2D109 Fab)にした。具体的な操作は、該キットに添付のマニュアルに従って行った。得られた反応液を、Superdex 200 Increase 10/300 GL(GEヘルスケア社)を用いて、ゲルろ過精製した。50 kDa溶出フラクションを回収し、得られたフラクションをA2D109 Fabとして用いた。精製した組み換えTGF-β1-LAPと精製したA2D109 Fabとを1:1のモル比で混合した。複合体を、20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl及び10%グリセロールからなるバッファーで平衡化したカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg、GE Healthcare社)により精製した。得られた複合体の分子量は89514 Daであった。
Biacore(登録商標)用センサーチップSeries S Sensor Chip CM5(GEヘルスケア社)に抗LAP-D抗体(A10)及びBAM2462抗体をそれぞれ固定化した。固定化量はそれぞれ2027RU及び310RUであった。ヒトTGF-β1LAP、及びヒトTGF-β1LAPとA2D109 Fabとの複合体溶液を、10 mM HEPES-NaOH(pH 7.5)、150 mM NaCl、3 mM EDTA及び0.005 % Surfactant P-20からなるバッファーで希釈して、種々の濃度の溶液を調製した。これらの溶液をBiacore(登録商標)T200(GEヘルスケア社)に送液した。各溶液におけるアナライト濃度及び測定条件は、下記のとおりである。測定データをBiacore(登録商標) Evaluationソフトウェアを用いて解析し、各抗体の親和性に関するデータを取得した。センサーグラムを図7A及びBに示す。また、各パラメータを表1に示す。
1.56 nM、3.13 nM、6.25 nM、12.5 nM及び25 nM
[測定条件]
Association:30μL/min, 60 sec
Dissociation:30μL/min, 60 sec
Regeneration:Gly-HCl (pH 1.5) / 60μL/min, 60 sec
(1) 試験条件
(1.1) TGF-β1-LAP(C33S/N176Q)の発現及び精製
TEVプロテアーゼ切断可能なリンカーを介してHisタグに融合させた、2箇所(C33S/N176Q)に変異が入ったTGF-β1-LAP(アミノ酸残基30-390)を、Igkシグナルの下流につなぎ、pOripベクターを用いてHEK293F細胞において発現させた。HisTrap(GE healthcare社)をメーカーの使用説明書に従って用いて、可溶性画分からTGF-β1-LAPを精製した。ヒスタグをTEVプロテアーゼで切断し、得られたTGF-β1-LAPをもう一度HisTrapカラムへローディングし、素通り画分を回収しカチオン交換カラム(HiTrap SP HP、GE Healthcare社)で、従来の方法により調製した。
TEVプロテアーゼ切断可能なリンカーを介してヒスタグに融合させたA2D109 Fv(重鎖及び軽鎖)をpCR.2.1ベクターを用いて大腸菌無細胞系において発現させた。可溶性画分をHisTrapカラム(GE healthcare社)を用いてA2D109 Fvを精製した。ヒスタグをTEVプロテアーゼで切断し、得られたA2D109 Fvをもう一度HisTrapカラムへローディングし、素通り画分を回収し、アニオン交換カラム(HiTrap Q HP、GE Healthcare社)でさらに精製した。Fvを含む画分をプールして、-80℃で保存した。
精製した組み換えTGF-β1-LAPと精製したFvとを1:1.2のモル比で混合した。複合体を、20 mM Tris-HCl(pH 8.0)、150 mM NaCl及び10%グリセロールからなるバッファーで平衡化したカラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィー(HiLoad 16/600 Superdex 200 pg、GE Healthcare社)により精製した。
精製した複合体を約6 mg/mLに濃縮し、シーディング法と組み合わせたシッティングドロップ蒸気拡散法により25℃で結晶化を行った。リザーバー溶液は、25%w/vポリエチレングリコール3350及び0.1M HEPES(pH 7.5)からなるものであった。これにより、1週間程度で板状結晶を得ることに成功した。この結晶を、25%w/vポリエチレングリコール3350、0.1M HEPES(pH 7.5)及び5%グリセロールからなる溶液中に浸漬した。
X線回折データを、SPring-8のBL32XUで測定した。測定中、結晶を常に-178℃の窒素流下に置いて凍結状態を維持し、ビームラインに接続されたPAD(EIGER-9M)検出器を用いて、結晶を1回に0.1°回転させながら、合計1800のX線回折像を収集した。セルパラメータの決定、回折スポットのインデックス付け、及び回折像から得られた回折データの処理を、XDSパッケージ(Acta.Cryst. D66:125-132 (2010))を用いて行い、最終的に分解能2.93Åまでの回折強度データを取得した。結晶学的データ統計値が表3に示される。
上記の構造決定の結果、A2D109抗体の結合部位は、ヒトTGF-β1のLAP-Dのインテグリン結合であるRGD配列であることが分かった。
12、22: 第1容器
13、24: 梱包箱
14、25: 添付文書
21: 試薬キット
23: 第2容器
Claims (15)
- ヒトTGF-βのLAP断片のインテグリン結合部位を認識する、ヒトTGF-βのLAP断片に対する単離モノクローナル抗体。
- 前記インテグリン結合部位が、RGD配列を含む請求項1に記載の単離モノクローナル抗体。
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列の215〜217番目のアミノ酸残基を含む領域を認識する請求項1又は2に記載の単離モノクローナル抗体。
- 前記LAP断片との結合について、配列番号4、5及び6で表されるアミノ酸配列からそれぞれなるCDR1、CDR2及びCDR3を含む軽鎖と、配列番号7、8及び9からそれぞれなるCDR1、CDR2及びCDR3を含む重鎖とを有する参照抗体と競合する請求項1〜3のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体。
- 前記参照抗体の存在により、前記LAP断片との結合について表面プラズモン共鳴分析装置により測定したRmax値が少なくとも70%低下する請求項4に記載の単離モノクローナル抗体。
- 配列番号12、13及び14で表されるアミノ酸配列からそれぞれなるCDR1、CDR2及びCDR3を含む軽鎖と、配列番号15、16及び17で表されるアミノ酸配列からそれぞれなるCDR1、CDR2及びCDR3を含む重鎖とを有する請求項1〜5のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体。
- 配列番号18で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む軽鎖と、配列番号19で表されるアミノ酸配列からなる可変領域を含む重鎖とを有する請求項1〜6のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体。
- 配列番号20で表されるアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号21で表されるアミノ酸配列を含む重鎖とを有する請求項1〜7のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体を含む、LAP断片検出用試薬。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体を含む第1試薬と、
配列番号3で表されるアミノ酸配列のN末端のロイシン残基を含む領域を特異的に認識する抗体を含む第2試薬と
を備える、LAP断片検出用試薬キット。 - 前記第2試薬に含まれる抗体が、配列番号22で表されるアミノ酸配列のN末端のロイシン残基を含む領域を特異的に認識する抗体である請求項10に記載の試薬キット。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体を用いて、被検者から採取した生体試料におけるTGF-βのLAP断片を測定することを含む、ヒトTGF-βのLAP断片の測定方法。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の単離モノクローナル抗体を用いて、被検者から採取した第1生体試料におけるTGF-βのLAP断片を測定する工程と、
前記単離モノクローナル抗体を用いて、前記被検者から採取した第2生体試料におけるTGF-βのLAP断片を測定する工程と
を含み、
前記第1生体試料が、第1の時点において前記被検者から採取された生体試料であり、前記第2生体試料が、前記第1の時点とは異なる第2の時点において前記被検者から採取された生体試料である、ヒトTGF-βのLAP断片の測定値をモニタリングする方法。 - 配列番号3で表されるアミノ酸配列のN末端のロイシン残基を含む領域を特異的に認識する抗体をさらに用いて、ヒトTGF-βのLAP断片を測定する請求項12又は13に記載の方法。
- 配列番号22で表されるアミノ酸配列のN末端のロイシン残基を含む領域を特異的に認識する抗体をさらに用いて、ヒトTGF-βのLAP断片を測定する請求項14に記載の方法。
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