CN112239503B

CN112239503B - 针对人TGF-β的LAP片段的抗体及其利用

Info

Publication number: CN112239503B
Application number: CN202010693254.1A
Authority: CN
Inventors: 井上育代; 小岛聪一; 白水美香子; 津曲千恵美; 松本武久; 齐藤隆; 竹森利忠; 松浦知和; 政木隆博; 三浦雅央; 须藤浩三
Original assignee: Sysmex Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Jikei University
Current assignee: Sysmex Corp; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research; Jikei University
Priority date: 2019-07-19
Filing date: 2020-07-17
Publication date: 2024-04-26
Anticipated expiration: 2040-07-17
Also published as: US20210017265A1; EP3766899A1; CN112239503A; US11261244B2; JP7350242B2; JP2021017413A

Abstract

本发明旨在提供使人TGF‑β1的LAP片段的检测能力的提升的测定变得可能的针对LAP片段的抗体。本发明由识别人TGF‑β的LAP片段的整联蛋白结合部位的针对人TGF‑β的LAP片段的分离的单克隆抗体解决所述的课题。

Description

针对人TGF-β的LAP片段的抗体及其利用

【技术领域】

本发明涉及识别人转化生长因子(TGF)-β的LAP片段的整联蛋白结合部位的分离的单克隆抗体。另外，本发明涉及含所述抗体的LAP片段检测用试剂。再者，本发明涉及使用所述抗体的生物体试样中的LAP片段的测定方法及监测LAP片段的测定值的方法。

【背景技术】

TGF-β是显示多样的生物活性的细胞因子，还与肝纤维化等的病态关联。TGF-β作为被称为潜伏期相关蛋白(Latency associated protein，LAP)的前肽部分捕获的潜在型复合体产生。由某些活化反应从此潜在型复合体释放活性型TGF-β。例如，如图1所示，在由作为丝氨酸蛋白酶的血浆激肽释放酶(PLK)的活化反应中，潜在型复合体中的LAP在第58位精氨酸残基和第59位亮氨酸残基之间切断而释放活性型TGF-β。另外，作为此活化反应的副产物而发生LAP片段(LAP degradates：LAP-D)。在专利文献1中记载了制作特异性地识别由PLK的截面的抗LAP-D抗体，由使用所述抗体及市售的抗LAP抗体的夹心ELISA法测定人LAP-D。

【现有技术文献】

【专利文献】

【专利文献1】美国专利申请公开第2011/0071278号说明书

【发明内容】

【发明要解决的课题】

在专利文献1中，作为LAP-D，测定用PLK处理的重组型LAPβ1(人TGF-β1的LAP)蛋白质，但不进行从受试者采集的血浆等的临床受试体中的LAP-D的测定。LAP-D有在生物体内受进一步分解的可能性，另外，不限于在临床受试体中LAP-D以对于检测而言充分的量存在。实际上，当本发明人使用专利文献1中记载的抗体及市售的抗LAP抗体测定从C型肝炎病毒感染患者得到的血浆受试体中的LAP-D时，有不能测定的受试体及测定值非常地低的受试体。从而，本发明旨在提供使LAP-D的检测能力的提升的测定成为可能的抗LAP-D抗体。

【用于解决课题的手段】

本发明提供识别人TGF-β的LAP片段的整联蛋白结合部位的针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体及其利用。另外，本发明提供含此分离的单克隆抗体的LAP片段检测用试剂。再者，本发明提供具备含此分离的单克隆抗体的第1试剂和含特异性地识别含SEQID NO:3所表示的氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基的区域的抗体的第2试剂的LAP片段检测用试剂盒。

本发明提供人TGF-β的LAP片段的测定方法，其包括：使用上述的分离的单克隆抗体而测定在从受试者采集的生物体试样中的TGF-β的LAP片段。

再者，本发明提供监测人TGF-β的LAP片段的测定值的方法，其包括：使用上述的分离的单克隆抗体而测定在从受试者采集的第1生物体试样中的TGF-β的LAP片段的工序，及使用上述的分离的单克隆抗体而测定在从受试者采集的第2生物体试样中的TGF-β的LAP片段的工序，第1生物体试样是在第1时间点从受试者采集的生物体试样，第2生物体试样是在与第1时间点不同的第2时间点从受试者采集的生物体试样。

【发明的效果】

根据本发明，提供使人TGF-β的LAP片段的检测能力的提升的测定成为可能的针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体及其利用。

【附图说明】

【图1】是显示由PLK的TGF-β的潜在型复合体的活化反应的模式图。

【图2】是显示本实施方式的试剂的一例的概略图。

【图3】是显示本实施方式的试剂盒的一例的概略图。

【图4A】是以本实施方式的分离的单克隆抗体作为检测抗体使用而测定LAP-D的稀释系列而制成的校准曲线。

【图4B】是以市售的抗LAP抗体(141402、BioLegend公司)作为检测抗体使用而测定LAP-D的稀释系列而制成的校准曲线。

【图4C】是以市售的抗LAP抗体(349702、BioLegend公司)作为检测抗体使用而测定LAP-D的稀释系列而制成的校准曲线。

【图4D】是以市售的抗LAP抗体(MA5-17186、Thermo Fisher Scientific公司)作为检测抗体使用而测定LAP-D的稀释系列而制成的校准曲线。

【图5A】是以本实施方式的分离的单克隆抗体作为检测抗体使用而测定LAP-D的稀释系列而制成的校准曲线。

【图5B】是以市售的抗人LAP TGF-β1抗体(BAM2462、R&D Systems公司)作为检测抗体使用而测定LAP-D的稀释系列而制成的校准曲线。

【图6A】是显示由以本实施方式的分离的单克隆抗体及抗人LAP TGF-β1抗体(BAM2462、R&D Systems公司)作为检测抗体使用的测定的血浆受试体中的LAP-D浓度的坐标图。

【图6B】是显示由以本实施方式的分离的单克隆抗体及抗人LAP TGF-β1抗体(BAM2462、R&D Systems公司)作为检测抗体使用的测定的血浆受试体中的LAP-D浓度的坐标图。

【图7A】是显示由Biacore(注册商标)测定的市售的抗人LAP TGF-β1抗体(BAM2462、R&D Systems公司)的反应性的传感图。

【图7B】是显示由Biacore(注册商标)测定的本实施方式的分离的单克隆抗体的反应性的传感图。

【具体实施方式】

[1.针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体]

本实施方式的针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体(以下，也简称为“抗体”)通过识别人TGF-β的LAP片段的整联蛋白结合部位，与人TGF-β的LAP片段特异性地结合。

在本说明书中，“LAP”是指在人TGF-β的潜在型复合体中，与活性型TGF-β由疏水键缔合的二聚体的前肽部分。“人TGF-β的LAP片段”是指通过人TGF-β的潜在型复合体中的LAP由蛋白酶切断而生成的LAP的分解物。以下，将人TGF-β的LAP片段也称为“LAP-D”或简称为“LAP片段”。“分离的单克隆抗体”是指从天然环境的成分分离和/或回收的单克隆抗体，是实质上不含有不同的抗原特异性的其他抗体的单克隆抗体。

在人TGF-β中，存在TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3的3个同种型。本实施方式的抗体也可与人TGF-β之任一者的同种型的LAP-D结合，优选与人TGF-β1的LAP-D结合。任何同种型的TGF-β最初都作为含成为活性型TGF-β的部分和作为前肽部分的LAP的前体多肽合成。其中，以人TGF-β1的前体多肽的氨基酸序列作为SEQ ID NO:1显示。人TGF-β1的前体多肽由390个氨基酸残基构成。在SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列中，第30位氨基酸残基至第278位氨基酸残基的部分是人TGF-β1的LAP(单体)，第279位氨基酸残基至第390位氨基酸残基的部分是成为活性型TGF-β1的部分(活性型TGF-β1的单体)。以人TGF-β1的LAP(单体)的氨基酸序列作为SEQ ID NO:2显示。

TGF-β的前体多肽在高尔基体中被切断而分离为成为活性型TGF-β的部分和LAP。分离的LAP经二硫键而形成二聚体。成为分离的活性型TGF-β的部分也形成二聚体而生成活性型TGF-β。但是，活性型TGF-β被二聚体的LAP捕获而作为如图1所示的潜在型复合体分泌。进而，LAP由蛋白酶切断，则释放活性型TGF-β，生成LAP-D。刚生成的LAP-D被认为以二聚体存在，但其后，在生物体内LAP-D也可成为单体。本实施方式的抗体可为与二聚体的LAP-D结合，也可为与单体的LAP-D结合。

本实施方式的抗体所结合的LAP-D只要是有整联蛋白结合部位，就也可由任何蛋白酶从LAP生成。优选为由可切断人TGF-β的LAP而使活化TGF-β游离的蛋白酶生成的LAP-D。作为这样的蛋白酶，例如，血浆激肽释放酶(PLK)、纤溶酶、基质金属蛋白酶(MMP)3、MMP9等是公知的。在它们之中，也特别优选PLK。PLK已知在SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的第58位精氨酸残基和第59位亮氨酸残基之间切断LAP。在人TGF-β1的LAP由PLK切断时，单体的LAP-D的氨基酸序列是SEQ ID NO:3所表示的序列。

“整联蛋白结合部位”是指含整联蛋白识别的部位的人TGF-β的LAP上的区域。已知潜在型复合体中的LAP与整联蛋白结合，则LAP的结构发生改变而活性型TGF-β游离。在由TGF-β的活化反应发生的LAP-D中，也存在整联蛋白结合部位。在本实施方式中，不管LAP-D能经其整联蛋白结合部位而与整联蛋白结合与否。在本实施方式中，LAP-D的整联蛋白结合部位优选含RGD序列(由精氨酸、甘氨酸及天冬氨酸构成的序列)。特别是，LAP-D的整联蛋白结合部位更优选为含RGD序列的由4～10个氨基酸残基构成的LAP-D中的区域、或者由RGD序列构成的区域。

本实施方式的抗体优选作为LAP-D的整联蛋白结合部位而含SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列的第215～217位的氨基酸残基(RGD序列)的识别人TGF-β1的LAP-D中的区域。特别是，本实施方式的抗体优选识别含SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列的第215～217位的氨基酸残基(RGD序列)的由4～10个氨基酸残基构成的人TGF-β1的LAP-D中的区域、或者由SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列的第215～217位的氨基酸残基构成的区域。

本实施方式的抗体可为来源于小鼠、大鼠、仓鼠、兔、山羊、马等之任一者的哺乳动物的单克隆抗体，优选为来源于小鼠的单克隆抗体。本实施方式的抗体的类可为IgG、IgA、IgM、IgD及IgE之任一者，优选为IgG。IgG的亚类不特别限定，也可为IgG1、IgG2、IgG3及IgG4之任一者。本实施方式的抗体不仅是免疫球蛋白的形态，也可处于抗体片段的形态。作为这样的抗体片段，可举出例如Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fv、Fd、结构域抗体(dAb)、单链抗体(scFv)、双抗体等。在它们之中，也优选Fab。

本实施方式的抗体与人TGF-β的LAP-D的结合、优选对于与人TGF-β1的LAP-D的结合，优选与指定的参照抗体竞争结合。此参照抗体的重链及轻链的可变区域各自有3个互补性决定区域(CDR)。3个CDR从抗体链的氨基末端数而称为CDR1、CDR2及CDR3。在本实施方式中，参照抗体有含各自由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:4、5及6)构成的CDR1、CDR2及CDR3的轻链和含各自由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:7、8及9)构成的CDR1、CDR2及CDR3的重链。这些CDR的氨基酸序列是基于Kabat分类(Wu TT.及Kabat EA.,1970,J.Exp.Med.132:211-250)的序列。此参照抗体是与人TGF-β1的LAP-D的整联蛋白结合部位结合的分离的单克隆抗体，在本实施方式的抗体中不含。

[参照抗体的CDR的氨基酸序列]

·轻链CDR1：SASSSVSYMH(SEQ ID NO:4)

·轻链CDR2：STSNLAS(SEQ ID NO:5)

·轻链CDR3：QQRSSYPFT(SEQ ID NO:6)

·重链CDR1：SYWMN(SEQ ID NO:7)

·重链CDR2：MIDPSDSETH YNQMFKD(SEQ ID NO:8)

·重链CDR3：WPYALDY(SEQ ID NO:9)

优选地，参照抗体有含由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:10)构成的可变区域的轻链和含由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)构成的可变区域的重链。有这些可变区域的参照抗体是小鼠来源的单克隆抗体。

[参照抗体的可变区域的氨基酸序列]

·轻链的可变区域

·重链的可变区域

本实施方式的抗体对于与LAP-D的结合，“与参照抗体竞争结合”是指本实施方式的抗体所结合的LAP-D上的部位和参照抗体结合的LAP-D上的部位相同，或者，本实施方式的抗体与成为参照抗体和LAP-D的结合的立体障碍的LAP-D上的部位结合。即，本实施方式的抗体识别与上述的参照抗体的表位完全或部分相同的表位。

对于与LAP-D的结合，本实施方式的抗体和参照抗体的竞争结合可由表面等离子体共振(SPR)分析评价。SPR分析可使用例如SPR分析装置而进行。作为这样的分析装置，可举出例如Biacore(注册商标)装置。在此分析中，参照抗体也可为Fab等的抗体片段的形态。例如，由参照抗体的存在，对于本实施方式的抗体和LAP-D的结合，由Biacore(注册商标)装置测定的最大结合应答值(以下，也称为“Rmax值”)降低至少70％、优选至少75％。换言之，在参照抗体的存在下的本实施方式的抗体和LAP-D的结合的Rmax值与在参照抗体的非存在下的本实施方式的抗体和LAP-D的结合的Rmax值相比降低至少70％、优选降低至少75％。其中，Rmax值是由Biacore(注册商标)装置测定的应答的最大值，是不由固定于传感器芯片的抗原(分析物)的分子量调整的值。利用Biacore(注册商标)装置的测定条件是实施例4中记载的试验条件。再者，在利用Biacore(注册商标)装置的测定中，应答的值以RU(ResonanceUnit)表示。

本实施方式的抗体的重链及轻链的可变区域各自有3个CDR。本实施方式的抗体优选有含各自由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:12、13及14)构成的CDR1、CDR2及CDR3的轻链。另外，本实施方式的抗体优选有含各自由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:15、16及17)构成的CDR1、CDR2及CDR3的重链。这些CDR的氨基酸序列是基于Kabat分类的序列。有这些CDR的本实施方式的抗体与人TGF-β1的LAP-D特异性地结合。

[本实施方式的抗体的CDR的氨基酸序列]

·轻链CDR1：RASHEISGYL G(SEQ ID NO:12)

·轻链CDR2：AASTLDS(SEQ ID NO:13)

·轻链CDR3：LQYASYPFT(SEQ ID NO:14)

·重链CDR1：RFWMN(SEQ ID NO:15)

·重链CDR2：MIHSSDSITR LNQKFKD(SEQ ID NO:16)

·重链CDR3：GYDEYSAMDY(SEQ ID NO:17)

在本实施方式的抗体是小鼠来源的单克隆抗体时，该抗体优选有含由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:18)构成的可变区域的轻链。另外，该抗体优选有含由下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)构成的可变区域的重链。有这些可变区域的本实施方式的抗体与人TGF-β1的LAP-D特异性地结合。

[本实施方式的抗体的可变区域的氨基酸序列]

·轻链的可变区域

·重链的可变区域

本实施方式的抗体是小鼠来源的单克隆抗体时，该抗体优选有含下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:20)的轻链。另外，该抗体优选有含下述的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)的重链。有这些可变区域的本实施方式的抗体与人TGF-β1的LAP-D特异性地结合。

[本实施方式的抗体的轻链及重链的氨基酸序列]

·轻链

·重链

本实施方式的抗体也可为有SEQ ID NO:18及19各自所表示的可变区域的嵌合抗体。嵌合抗体是指来源于某个种(species)的抗体的可变区域和来源于与其异种的抗体的恒定区连接的抗体。另外，本实施方式的抗体也可为有各自由SEQ ID NO:12、13及14所表示的氨基酸序列构成的轻链的CDR1、CDR2及CDR3和各自由SEQ ID NO:15、16及17所表示的氨基酸序列构成的重链的CDR1、CDR2及CDR3的人源化抗体。人源化抗体是指向人抗体基因移植(CDR移植)非人来源的抗体的CDR的基因序列而得到的抗体。

在本实施方式的抗体中，不使与人TGF-β1的LAP-D结合的活性减少，也含其氨基酸序列发生改变的抗体。作为这样的氨基酸序列的改变，可举出氨基酸残基的取代、缺失、附加和/或插入。抗体的氨基酸序列发生改变的部位可为重链或轻链的恒定区，也可为可变区域。在改变可变区域时，优选改变框架区域(FR)。FR是指存在于抗体的轻链及重链的各自的可变区域的CDR以外的区域。FR发挥连接3个CDR的支架的作用，CDR的结构稳定性贡献。抗体的氨基酸序列的改变可通过由DNA重组技术及其他分子生物学技术等的公知的方法，向抗体基因导入变异来进行。

改变的氨基酸残基的数通常是10个残基以下，优选5个残基以下，更优选为3个残基以下。作为抗体的氨基酸序列的改变，优选保守的取代。保守的取代是指将某氨基酸残基取代为具有与该残基的侧链有化学上同样的性质的侧链的氨基酸残基。氨基酸序列的保守的取代本身是在现有技术领域中公知的。或者，也可由美国专利申请公开第2018/0179298号说明书中记载的包括改变抗体的FR3的氨基酸残基的控制抗体对抗原的亲和性的方法改变抗体的氨基酸序列。

本实施方式的抗体也可用在现有技术领域中公知的标记物质修饰。这样的标记物质只要是发生能检测的信号，就不特别限定。例如，可为其本身发生信号的物质(以下，也称为“信号发生物质”)，也可为催化其他物质的反应而发生信号的物质。作为信号发生物质，可举出例如，荧光物质、放射性同位素等。作为催化其他物质的反应而发生能检测的信号的物质，例如，可举出酶。作为酶，可举出碱性磷酸酶、过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶等。作为荧光物质，可举出异硫氰酸荧光素(FITC)、若丹明、Alexa Fluor(注册商标)等的荧光染料、GFP等的荧光蛋白质等。作为放射性同位素，可举出¹²⁵I、¹⁴C、³²P等。

本发明的别的实施方式含编码本实施方式的抗体或其片段的分离并且纯化的多核苷酸。本发明的别的实施方式包括含上述的多核苷酸的载体。载体是为了转导或转染而设计的多核苷酸构建物。载体的种类不特别限定，可从表达载体、克隆载体、病毒载体等现有技术中公知的载体适宜选择。另外，本发明的别的实施方式包括含该载体的宿主细胞。宿主细胞的种类不特别限定，可从真核细胞、原核细胞、哺乳动物细胞等适宜选择。

本实施方式的抗体可由例如，杂交瘤法、噬菌体展示法等的公知的单克隆抗体的制作法得到。在由杂交瘤法制作产生本实施方式的抗体的杂交瘤时，首先，作为免疫原，可使用有TGF-β1-LAP的氨基酸序列的一部分或全部的多肽。该多肽优选含LAP-D的整联蛋白结合部位。具体而言，例示TGF-β1-LAP(氨基酸残基30～390)。为了不发生此多肽由蛋白酶的切断，可在位于活化TGF-β的氨基酸序列和LAP的氨基酸序列之间的切断位点有变异。例如，通过将第278位氨基酸残基精氨酸取代为丙氨酸等的精氨酸以外的氨基酸而变得无法由蛋白酶识别，变得无法发生切断。多肽的合成法本身是公知的，可举出例如Fmoc固相合成法。合成的多肽由于免疫原性低，优选与匙孔－青贝－血蓝蛋白(KLH)、白蛋白等的载体蛋白质结合。在由交联结合载体蛋白质和合成肽时，在合成多肽之时，优选向该序列的N末端或C末端附加半胱氨酸残基。或者，免疫原也可作为重组型蛋白质制作。重组型TGF-β可通过将编码TGF-β的氨基酸序列的多核苷酸整合到公知的表达载体，用此载体转化宿主细胞而使重组型TGF-β表达之后，由公知的方法纯化得到。纯化的重组型TGF-β可作为免疫原使用。

接下来，用制作的多肽免疫适合的动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等)，从免疫的动物取得脾脏细胞等的产生抗体的细胞。进而，根据Kohler及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975等中记载的公知的杂交瘤的制作方法而融合得到的产生抗体的细胞和适合的骨髓瘤细胞而得到杂交瘤。在杂交瘤的筛选中，可使用在免疫原中使用的合成多肽。本实施方式的抗体可从杂交瘤的培养上清、或者腹腔施用该杂交瘤的哺乳动物的腹水得到。得到的抗体也可由盐析、亲和性层析法、凝胶过滤等的公知的方法纯化。

在噬菌体展示法中，例如，可制作本实施方式的抗体的Fab片段。首先，用上述的合成多肽免疫小鼠等的动物，从该动物的脾脏取得mRNA，合成cDNA。将得到的cDNA使用用于克隆抗体基因的公知的引物而扩增，制作Fab噬菌体库。可使用得到的库而由公知的Fab噬菌体展示法及生物淘选(参照Philippa M.O'Brien及Robert Aitken,Antibody PhageDisplay,(2002)Methods in Molecular Biology Volume No.178)得到本实施方式的抗体的Fab克隆。

本实施方式的抗体的氨基酸序列，在有产生抗体的杂交瘤时，可如后述的实施例3中记载一样地解析。首先，使用从该杂交瘤提取的RNA而由逆转录反应及RACE(cDNA末端快速克隆，Rapid Amplification of cDNA ends)法合成编码本实施方式的抗体的多核苷酸。进而，将合成的多核苷酸的碱基序列由测序解析，基于其碱基序列而确定抗体的氨基酸序列。

如后述的实施例所示，在夹心ELISA法中使用本实施方式的抗体时，不仅对于重组型的LAP-D，即使对于从血浆等的受试者采集的生物体试样中的LAP-D，检测能力高的测定也变得可能。从而，本实施方式的抗体对于生物体试样中的LAP-D的测定有用。另外，近年得知，由PLK诱导的TGF-β的活化及释放促进肝纤维化。认为由PLK的LAP的切断而发生的LAP-D被释放到血中。从而，本实施方式的抗体对于例如，澄清LAP-D的血中浓度和肝纤维化的进行的关联的研究等有用。

[2.LAP片段检测用试剂]

本实施方式的LAP片段检测用试剂(以下，也简称为“试剂”)是含上述的本实施方式的针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体的试剂。

如上所述，由于本实施方式的抗体在夹心ELISA法中使用之时，对于LAP-D而显示高的检测能力，本实施方式的试剂可适宜地在夹心ELISA法中使用。在本实施方式的试剂中，抗体也可用在现有技术领域中公知的标记物质修饰。这样的标记物质的详细与对于本实施方式的抗体而述及的同样。

本实施方式的试剂的形态不特别限定，可为固体(例如粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如溶液、悬浮液、乳浊液等)。在试剂是液体时，溶剂只要是可溶解保存本实施方式的抗体，就不特别限定。作为溶剂，例如，可举出水、生理盐水、磷酸缓冲生理盐水(PBS)、Tris缓冲生理盐水(TBS)、Good的缓冲液等。作为Good的缓冲液，例如，可举出MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、Bis-Tris-Propane、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、HEPPS、Tricine、Tris、Bicine、TAPS等。

本实施方式的试剂也可含公知的添加物。作为添加物，例如，可举出牛血清白蛋白(BSA)等蛋白质稳定化剂、叠氮化钠等的防腐剂、氯化钠等的无机盐类等。

在本实施方式中，也可将收容试剂的容器捆包到箱中而提供于使用者。在箱中，也可同装附带文书。在附带文书中，也可对于本实施方式的试剂的组成、使用方法、保存方法等进行记载。本实施方式的试剂的一例示于图2。在图2中，11表示本实施方式的试剂，12表示收容本实施方式的抗体的第1容器，13表示捆包箱，14表示附带文书。

[3.LAP片段检测用试剂盒]

本实施方式的LAP片段检测用试剂盒(以下，也简称为“试剂盒”)是具备含上述的本实施方式的针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体的第1试剂和含特异性地识别含SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基的区域的抗体的第2试剂的试剂盒。

SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列是由PLK导致的人TGF-β1的LAP的切断发生的LAP-D的氨基酸序列(由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的第59～278位的氨基酸残基构成的序列)。此氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基是由PLK的LAP的切断位置。即，第2试剂中所含的抗体是特异性地识别由PLK的LAP的截面的抗体。此抗体本身是公知的，记载在专利文献1(专利文献1由参照并入本说明书)。在优选的实施方式中，第2试剂中所含的抗体是特异性地识别含SEQ ID NO:22所表示的氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基的区域的抗体。SEQID NO:22所表示的氨基酸序列是由SEQ ID NO:1所表示的氨基酸序列的第59～68位的氨基酸残基构成的序列。

在本实施方式中，各试剂也可含公知的添加物。添加物的详细与对于本实施方式的试剂而述及的同样。各试剂中所含的抗体的形态不特别限定，可为固体(例如粉末、结晶、冷冻干燥品等)，也可为液体(例如溶液、悬浮液、乳浊液等)。

本实施方式的试剂盒适宜地在夹心ELISA法中使用。在本实施方式的试剂盒中，第1试剂中所含的本实施方式的抗体优选作为夹心ELISA法中的检测抗体使用。另外，第2试剂中所含的抗体优选作为夹心ELISA法中的捕获抗体使用。其中，“检测抗体”是指与受试物质特异性地结合的抗体，在与标记物质结合时，可经该标记物质而提供能检测的信号的抗体。检测抗体优选不固定于固相。“捕获抗体”是指与受试物质特异性地结合，并且通过自身固定于固相，用于在固相上捕获该受试物质的抗体。

本实施方式的试剂盒也可还含用于使捕获抗体固定化的固相。固相只要是能固定捕获抗体的不溶性的载体即可。向捕获抗体的固相的固定的实施方式不特别限定。例如，捕获抗体和固相可为直接的结合，也可为经别的物质而间接结合。作为直接的结合，例如，可举出物理吸附等。作为间接的结合，可举出例如，经生物素类(含生物素、及脱硫生物素等的生物素类似物)和亲和素类(含亲和素、及链霉亲和素、Tamavidin(注册商标)等的亲和素类似物)的组合的结合。此时，通过将捕获抗体预先用生物素类修饰，使固相预先结合亲和素类，可经生物素类和亲和素类的结合而捕获抗体和固相间接结合。

固相的原料不特别限定，例如，可从有机高分子化合物、无机化合物、生物体高分子等选择。作为有机高分子化合物，可举出乳胶、聚苯乙烯、聚丙烯等。作为无机化合物，可举出磁性体(氧化铁、氧化铬及铁素体等)、氧化硅、氧化铝、玻璃等。作为生物体高分子，可举出不溶性琼脂糖、不溶性葡聚糖、明胶、纤维素等。也可组合使用这些中的2种以上。固相的形状不特别限定，例如，可举出微平板、微管、试管、粒子、膜等。在它们之中，也优选微平板及粒子(特别是磁性粒子)。

在本实施方式中，各试剂中所含的抗体也可用在现有技术领域中公知的标记物质修饰。特别是，第1试剂中所含的抗体优选用标记物质修饰。这样的标记物质的详细与对于本实施方式的抗体而述及的同样。在标记物质是酶时，试剂盒也可含该酶的底物。底物可对应于酶的种类而适宜确定。

在本实施方式中，也可将各自收容第1试剂及第2试剂的容器捆包到箱中而提供于使用者。在箱中，也可同装附带文书。在附带文书中，也可对于本实施方式的试剂盒的构成、使用方法、保存方法等进行记载。本实施方式的试剂盒的一例示于图3。在图3中，21表示本实施方式的试剂盒，22表示收容本实施方式的抗体的第1容器，23表示收容本实施方式的捕获抗体的第2容器，24表示捆包箱，25表示附带文书。在此例中，试剂盒也可还含用于使捕获抗体固定化的固相。

在本实施方式中，试剂盒也可含LAP-D的校准物。作为校准物的一例，可举出LAP-D定量用校准物。此校准物也可具备例如，不含LAP-D的缓冲液(阴性对照)和以已知浓度含LAP-D的缓冲液。作为校准物中所含的LAP-D，可为重组型的LAP-D，也可为由LAP-D的氨基酸序列构成的合成肽。重组型的LAP-D可通过将重组型人TGF-β的LAP蛋白质用PLK等的蛋白酶限定分解得到。

[4.人TGF-β的LAP片段的测定方法]

本实施方式的人TGF-β的LAP片段的测定方法(以下，也称为“测定方法”)含使用抗体而测定在从受试者采集的生物体试样中的人TGF-β的LAP片段。

受试者不特别限定，可举出例如，有与TGF-β的异常关联的病态或疾病的患者等。作为这样的病态，可举出例如肝脏、肺、肾脏等的纤维化。另外，作为疾病，可举出病毒性肝炎(特别是C型肝炎)、肝硬化、癌等。作为生物体试样，可举出从受试者采集的临床受试体等。作为临床受试体，可举出例如血液(全血、血浆、血清)、组织液、脑脊髓液、腹水、尿等。

在生物体试样含细胞等的不溶性的混杂物时，也可由离心分离、过滤等的公知的手段从生物体试样除去混杂物。另外，生物体试样也可根据需要用适合的水性介质稀释。这样的水性介质只要是不妨碍后述的测定，就不特别限定，例如，可举出水、生理盐水、缓冲液等。缓冲液只要是在中性附近的pH(例如6以上8以下的pH)有缓冲作用，就不特别限定。这样的缓冲液例如，可举出HEPES、MES、PIPES等的Good缓冲液、TBS、PBS等。

在本说明书中，“对人TGF-β的LAP片段进行测定”含确定人TGF-β的LAP-D的量或浓度的值，及取得反映人TGF-β的LAP-D的量或浓度的信息。“反映人TGF-β的LAP-D的量或浓度的信息”是指对应于由生物体试样或该生物体试样调制的测定试样中的人TGF-β的LAP-D的量或浓度改变的指标。这样的指标优选为能目视确认或能机械地测定的光学变化的指标。作为光学变化的指标，例如，可举出发光强度、荧光强度、吸光度、浊度、显色的浓度等。

使用上述的本实施方式的抗体而测定LAP-D的方法不特别限定，可从公知的免疫学测定法适宜选择。作为这样的测定法，可举出例如ELISA法、蛋白印迹法等。或者，也可使用特开平1-254868号公报中记载的免疫复合体转移法。在它们之中，也优选ELISA法。ELISA法的种类可为夹心法、竞争结合法、直接法、间接法等之任一者，特别优选夹心法。作为一例，接下来说明由夹心ELISA法测定的情况。在此例中，本实施方式的抗体作为检测抗体使用。

首先，使含LAP-D、针对LAP-D的捕获抗体和本实施方式的抗体(检测抗体)的复合体在固相上形成。该复合体可通过将可含生物标志物的生物体试样、捕获抗体和检测抗体混合来形成。进而，通过使含复合体的溶液与可捕获捕获抗体的固相接触，可使上述的复合体在固相上形成。或者，也可使用使捕获抗体预先固定的固相。即，通过使固定捕获抗体的固相、生物体试样和检测抗体接触，可使上述的复合体在固相上形成。

捕获抗体只要是可与LAP-D特异性地结合的抗体，就不特别限定。在捕获抗体是单克隆抗体时，捕获抗体的表位优选为整联蛋白结合部位以外的。在优选的实施方式中，捕获抗体是特异性地识别含SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基的区域的抗体。更优选为，特异性地识别含SEQ ID NO:22所表示的氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基的区域的抗体。

进而，通过将在固相上形成的复合体用现有技术中公知的方法检测，可对生物体试样中所含的生物标志物进行测定。例如，在作为检测抗体，使用被标记物质标记的本实施方式的抗体时，通过检测由该标记物质发生的信号，可对生物体试样中的人TGF-β1的LAP-D进行测定。或者，在使用针对检测抗体的标记第二抗体时，也可同样地对生物体试样中的人TGF-β1的LAP-D进行测定。标记物质的详细与对于上述的本实施方式的抗体而述及的同样。

在本实施方式中，也可在复合体的形成和复合体的检测之间，进行除去不形成复合体的未反应的游离成分的B/F(Bound/Free)分离。未反应的游离成分是指不构成复合体的成分。例如，可举出不与人TGF-β1的LAP-D结合的捕获抗体及检测抗体等。B/F分离的手段不特别限定，如果固相是粒子，可通过由离心分离回收仅捕获复合体的固相来进行B/F分离。固相只要是微平板或微管等的容器，就可通过除去含未反应的游离成分的液而进行B/F分离。另外，在固相是磁性粒子时，可通过在用磁铁磁约束磁性粒子的状态下由管嘴吸除含未反应的游离成分的液来进行B/F分离，从自动化的观点来看优选。也可在除去未反应的游离成分之后，将捕获复合体的固相用PBS等的适合的水性介质清洗。

在本说明书中，“检测信号”含定性检测信号的有无，对信号强度进行定量，及半定量检测信号的强度。半定量的检测是指将信号的强度如“不发生信号”、“弱”、“中”、“强”等一样阶段性地表示。在本实施方式中，优选定量或半定量检测信号的强度。

检测信号的方法本身是在现有技术中公知的。在本实施方式中，适宜选择对应于来源于上述的标记物质的信号的种类的测定方法即可。例如，在标记物质是酶时，可通过使用分光光度计等的公知的装置而测定通过使对于该酶的底物反应而发生的光、色等的信号来进行。

酶的底物可对应于该酶的种类从公知的底物适宜选择。例如，作为酶，使用碱性磷酸酶时，作为底物，可举出CDP-Star(注册商标)(4-氯-3-(甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2'-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)、CSPD(注册商标)(3-(4-甲氧基螺[1,2-二氧杂环丁烷-3,2-(5'-氯)三环[3.3.1.13,7]癸烷]-4-基)苯基磷酸2钠)等的化学发光底物、5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)、5-溴-6-氯-吲哚基磷酸2钠、p-硝基苯基磷酸等的显色底物。另外，作为酶，使用过氧化物酶时，作为底物，可举出LUMINOR及其衍生物等的化学发光底物、2,2'-连氮基双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸铵)(ABTS)、1,2-亚苯基二胺(OPD)、3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)等的显色底物。

在标记物质是放射性同位素时，可使用闪烁计数器等的公知的装置而测定作为信号的放射线。另外，在标记物质是荧光物质时，可使用荧光酶标仪等的公知的装置而测定作为信号的荧光。再者，激发波长及荧光波长可对应于使用的荧光物质的种类适宜确定。

信号的检测结果可作为人TGF-β1的LAP-D的测定结果使用。例如，在对信号的强度进行定量时，可以信号强度的测定值本身或从该测定值取得的值作为人TGF-β1的LAP-D的测定结果使用。作为从信号强度的测定值取得的值，例如，可举出从该测定值减去阴性对照试样的测定值或背景的值的值等。另外，也可向校准曲线适用信号强度的测定值，确定人TGF-β1的LAP-D的量或浓度的值。阴性对照试样可适宜选择，例如，可举出从健康人得到的生物体试样等。

在本实施方式中，也可由使用固定于磁性粒子的捕获抗体和经标记物质标记的本实施方式的抗体(检测抗体)的夹心ELISA法测定生物体试样中的人TGF-β1的LAP-D。此时，测定也可使用HISCL系列(Sysmex株式会社制)等的市售的全自动免疫测定装置进行。

[5.监测人TGF-β的LAP片段的测定值的方法]

在本实施方式的监测人TGF-β的LAP片段的测定值的方法(以下，也称为“监测法”)中，包括：使用上述的本实施方式的抗体而测定在从受试者采集的第1生物体试样中的TGF-β的LAP-D的工序，及测定在从该受试者采集的第2生物体试样中的TGF-β的LAP-D的工序。第1生物体试样是在第1时间点从受试者采集的生物体试样。第2生物体试样是在与第1时间点不同的第2时间点，从相同的受试者采集的生物体试样。在本实施方式的监测法中，通过对第1及第2生物体试样中的TGF-β的LAP片段的测定值进行比较，可监测在受试者中的LAP片段的测定值的变化。

作为第1及第2生物体试样，可举出从受试者采集的临床受试体等。临床受试体的详细与对于本实施方式的测定方法而述及的同样。第1生物体试样和第2生物体试样优选为相同的种类的试样。受试者不特别限定，例如，可举出有与TGF-β的异常关联的病态或疾病的患者等。这样的病态及疾病的详细与对于本实施方式的测定方法而述及的同样。或者，受试者也可为受对于与TGF-β的异常关联的病态或疾病的治疗，或者有受该治疗的预定的患者。

第1时间点不特别限定，可为任意的时间点。第2时间点只要是与第1时间点不同，就不特别限定。第2时间点也可为从自第1时间点起1天～6个月的范围选择的期间经过的时间点。具体而言，第1时间点至第2时间点之间可为3个月左右。例如，可约每3个月从受试者采集生物体试样，进行测定。在受试者受对于与TGF-β的异常关联的病态或疾病的治疗时，也可以受治疗的时间点作为第1时间点，以受第二次的治疗的时间点作为第2时间点。在受试者是有受对于与TGF-β的异常关联的病态或疾病的治疗的预定的患者时，也可以治疗的开始前的时间点或治疗开始的时间点作为第1时间点，以从治疗开始起指定的期间的经过后的时间点作为第2时间点。与TGF-β的异常关联的病态或疾病和TGF-β的LAP片段的测定值密切关联时，通过对第1及第2生物体试样中的TGF-β的LAP片段的测定值进行比较，可监测治疗的效果。

对于第1及第2生物体试样中的TGF-β的LAP-D的测定与对于本实施方式的测定方法而述及的同样。第1及第2生物体试样的测定可实质上同时进行，也可依次进行。在实质上同时进行第1及第2生物体试样的测定时，优选至测定之间、适合地保存第1生物体试样。如果必要，第2生物体试样也可至测定之间、适合地保存。

接下来，将本发明由实施例详细地说明，本发明不限于这些实施例。

【实施例】

【制造例：识别人TGF-β的LAP片段的整联蛋白结合部位的单克隆抗体的制作】

(1)抗原的制作

制作向TGF-β1-LAP(氨基酸残基30-390)插入R278A的变异的多肽。将有向编码此多肽的基因序列附加His标签序列的序列的多核苷酸与Igk信号的下游连接，使用pOrip载体而使在HEK293F细胞中表达。根据厂商的使用说明书而使用HisTrap(GE healthcare公司)，从可溶性级分纯化TGF-β1-LAP。将His标签用TEV蛋白酶切断，向一次HisTrap柱装载得到的TGF-β1-LAP，回收通过级分。将其用凝胶过滤柱(Superdex 200Increase 10/300GL、GEHealthcare公司)由公知的方法纯化，回收低分子级分。以回收的低分子级分作为抗原使用。

(2)杂交瘤的制作及筛选

向雌的Balb/c小鼠免疫制作的抗原，由Kohler及Milstein,Nature,vol.256,p.495-497,1975中记载的方法制作产生针对人TGF-β的LAP片段的抗体的杂交瘤。对于得到的杂交瘤，将产生对抗原显示反应性的抗体的株由ELISA法选择。将选择的杂交瘤由有限稀释法克隆，进一步选择稳定产生针对人TGF-β的LAP片段的抗体的株。

(3)单克隆抗体的纯化

将杂交瘤的培养上清(100mL)用0.22μm滤器一过滤而除去不溶物。向填充1mL的蛋白G-sepharose 4B(GE Healthcare公司)的柱通入过滤的培养上清，使柱吸附抗体。通过从柱除去非特异吸附分之后，将柱放置于酸性条件下而使单克隆抗体游离。将回收的单克隆抗体用100倍量的磷酸缓冲生理盐水(PBS)透析而得到纯化的单克隆抗体。将得到的单克隆抗体以下也称为“抗LAP-D抗体(A10)”，在往后的实施例中使用。

【实施例1：抗LAP-D抗体(A10)和市售的抗LAP抗体的比较】

为了评价以抗LAP-D抗体(A10)作为检测抗体使用的夹心ELISA法的灵敏度，进行与3种市售的抗LAP抗体的比较试验。

(1)试验条件

(1.1)检测抗体的调制

使用生物素标记试剂盒-NH₂(Cat#LK03、同仁化学研究所)而生物素标记抗LAP-D抗体(A10)、抗LAP抗体(141402、BioLegend公司)、抗LAP抗体(349702、BioLegend公司)及抗LAP抗体(MA5-17186、Thermo Fisher Scientific公司)各自而得到检测抗体。将各检测抗体用抗体稀释用溶液(含有10μg/mL小鼠IgG的HEPES)稀释而得到各检测抗体的溶液(均5μg/mL)。

(1.2)校准曲线用标准物质(LAP-D)的调制

将7.0μL的人重组LAP(20μg/mL、R&D公司)、9.4μL的PLK(59.3μg/mL、Sigma-Aldrich公司)及83.6μL的PBS混合，将得到的混合液于37℃温育1小时而得到LAP-D溶液。以LAP的分子量作为27kDa时，得到的LAP-D溶液的浓度成为52nM。将LAP-D溶液用1％BSA/TBS稀释800倍，以校准曲线的上限作为65pM。进一步稀释LAP-D的稀释溶液而调制稀释系列(32.5pM、16.3pM、8.1pM、4.1pM、2.0pM、1.0pM及0pM)。

(1.3)捕获抗体的调制

作为捕获抗体，使用专利文献1中记载的针对LAP-D的抗体(以下，也称为“抗L59LAP-D抗体”)。此抗体特异性地识别含由PLK切断的LAP的截面、即SEQ ID NO:3所表示的氨基酸序列的N末端的亮氨酸残基的区域。将抗L59 LAP-D抗体用TBS稀释而得到捕获抗体溶液(20μg/mL)。

(2)试验方法

向将6条NN模块F8MaxiSorp(NUNC公司)设置于1框的板以每1孔50μL分注捕获抗体溶液，将板于4℃温育一晚。将板用每1孔200μL的清洗液(含有0.05％Tween20的TBS)清洗3次。以每1孔350μL分注封闭溶液(含有1％BSA的TBS)，将板于4℃温育一晚。除去封闭溶液，以每1孔50μL(n＝3)分注稀释为8阶段的校准曲线用标准物质，将板于4℃温育一晚。将板如上述一样用清洗液清洗3次之后，以每1孔50μL分注各检测抗体的溶液，将板于4℃温育3小时。将板如上述一样用清洗液清洗3次之后，以每1孔50μL分注碱性磷酸酶－链霉亲和素溶液(0.05μg/mL)，将板于室温温育3小时。将板如上述一样用清洗液清洗3次之后，以每1孔100μL分注显色底物溶液(4-硝基苯基磷酸)，将板于4℃温育一晚。使板返回室温之后，对405nm的吸光度进行测定。标绘对于校准曲线用标准物质的LAP-D浓度的吸光度的测定值而制成校准曲线。

(3)结果

对于各检测抗体的校准曲线示于图4A～D。如从这些图得知，作为检测抗体，在仅使用抗LAP-D抗体(A10)时，可制成有定量性的校准曲线。抗LAP-D抗体(A10)显示作为对于由PLK得到的LAP-D的灵敏度高的用于检测LAP-D的ELISA法的检测抗体有用。

【实施例2：抗LAP-D抗体(A10)的有用性的评价】

为了评价抗LAP-D抗体(A10)的有用性，将人血浆受试体中的LAP-D用ELISA法测定。为了比较，在相同的条件下进行由市售的LAP-D检测用ELISA试剂盒中所含的抗LAP-D抗体的测定。

(1)试验条件

(1.1)生物体试样

从直接作用型抗病毒剂(DAA)施用中的C型肝炎病毒感染患者6名以指定的间隔多次采集血液，得到血浆受试体(48受试体)。各血浆受试体用封闭溶液(含有1％BSA的TBS)稀释20倍而在测定中使用。对于这些血浆受试体，预先使用市售的LAP-D检测用ELISA试剂盒(R&D Systems公司)而测定LAP-D，选择不能测定的受试体及测定值非常地低的受试体。测定根据试剂盒附带的手册而进行。在实施例2中，使用选择的受试体。

(1.2)检测抗体、捕获抗体及校准曲线用标准物质

作为检测抗体，使用与实施例1同样地调制的生物素标记抗LAP-D抗体(A10)。另外，作为用于比较的检测抗体，使用上述的LAP-D检测用ELISA试剂盒中所含的生物素化抗人LAP TGF-β1抗体(BAM2462、R&D Systems公司)(以下，也称为“BAM2462抗体”)。将各检测抗体用抗体稀释用溶液(含有10μg/mL小鼠IgG的HEPES)稀释而得到各检测抗体的溶液(均2.5μg/mL)。校准曲线用标准物质及捕获抗体与实施例1同样地调制。

(2)试验方法

向将8条NN模块F8MaxiSorp(NUNC公司)设置于4框(板2个×抗体2种分)的板以每1孔50μL分注捕获抗体溶液，将板于4℃温育一晚。与实施例1同样地清洗板而封闭。除去封闭溶液，以每1孔50μL(n＝3)分注稀释为8阶段的校准曲线用标准物质及稀释20倍的血浆受试体，将板于4℃温育一晚。与实施例1同样地清洗板，向各孔分注各检测抗体的溶液而将板于4℃温育3小时。与实施例1同样地清洗板，向各孔分注显色底物溶液而温育，对405nm的吸光度进行测定。

(3)数据处理

每板制成校准曲线。对于各检测抗体的校准曲线的一例示于图5A及B。从校准曲线，对于稀释20倍的各血浆受试体而得到LAP-D的值。以使得到的LAP-D的值增20倍的值作为各血浆受试体中的LAP-D浓度值。在从校准曲线得到的值是负时，看作“0pM”。5名患者的各血浆受试体中的LAP-D浓度值的坐标图示于图6A及B。

(4)结果

如图5A及B所示，校准曲线的斜率是使用抗LAP-D抗体(A10)的测定的一方大。另外，由使用抗LAP-D抗体(A10)的测定的LAP-D的定量性是与使用BAM2462抗体的测定同等或其以上。如从图6A及B得知，在作为检测抗体，仅使用抗LAP-D抗体(A10)时，确认到多数可检测LAP-D的受试体。从而显示，在对血浆受试体等的生物体试样中的LAP-D进行测定时，使用抗LAP-D抗体(A10)的ELISA法有用。

【实施例3：抗LAP-D抗体(A10)的氨基酸序列的解析】

(1)RACE-Ready cDNA库的调制

使产生抗LAP-D抗体(A10)的杂交瘤的冷冻贮存液(1×10⁷个细胞/瓶、1条)解冻，以500g离心分离5分钟而除去上清。从得到的细胞，使用GenElute Direct mRNA MiniprepKit(Sigma-Aldrich公司)而调制mRNA。将得到的mRNA用核酸定量装置Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific公司)测定而对浓度进行定量。从100μg的mRNA，使用SMARTerRACE5'/3'Kit(Clontech公司)而调制RACE-Ready cDNA。引物使用该试剂盒附带的5'-CDR引物。

(2)抗体基因的扩增

以200ng的RACE-Ready cDNA作为模板，使用DNA聚合酶KOD Plus neo(TOYOBO)而以50μL规模扩增抗体基因(重链及轻链)。在正向引物中，以1/10量使用SMARTer RACE5'/3'Kit附带的Universal PrimierMix。在反向引物中，各自使用轻链用引物3种及重链用引物3种。反应液的组成根据试剂盒附带的手册。反应条件是使于94℃2分钟的变性后，于96℃10秒钟及于68℃80秒钟的2步骤进行35个循环。

(3)抗体基因的序列解析

将PCR的扩增产物在2％琼脂糖凝胶(含有1/20000GelGreenNucleic Acid GelStain(Biotium公司))中以100V电泳30分钟。电泳后，在绿色LED照射下，将对应于各反向引物的扩增产物的条带从凝胶切出。从含切出的条带的凝胶，使用Wizard SV Gel andClean-Up System(Prω公司)而提取DNA。向Eurofinsgenomics株式会社委托得到的DNA的核酸序列解析。将轻链的3种序列信息及重链的3种序列信息用解析软件Genetyx Ver.14.1(Genetyx公司)解析而将轻链及重链的各自的序列信息自动整合。

(4)结果

抗LAP-D抗体(A10)的轻链及重链的氨基酸序列如下所述。

·轻链

·重链

抗LAP-D抗体(A10)的轻链及重链的可变区域的氨基酸序列如下所述。

·轻链可变区域

·重链可变区域

抗LAP-D抗体(A10)的轻链及重链的CDR1、CDR2及CDR3的氨基酸序列如下所述。再者，这些CDR的氨基酸序列是基于Kabat分类的序列。

·轻链CDR1：RASHEISGYL G(SEQ ID NO:12)

·轻链CDR2：AASTLDS(SEQ ID NO:13)

·轻链CDR3：LQYASYPFT(SEQ ID NO:14)

·重链CDR1：RFWMN(SEQ ID NO:15)

·重链CDR2：MIHSSDSITR LNQKFKD(SEQ ID NO:16)

·重链CDR3：GYDEYSAMDY(SEQ ID NO:17)

【实施例4：抗LAP-D抗体(A10)的反应性的评价】

本发明人至今制作与抗LAP-D抗体(A10)不同的抗LAP-D单克隆抗体(以下，称为“A2D109抗体”)，将此A2D109抗体与LAP-D的整联蛋白结合部位结合由X射线结晶结构解析解析(参照后述的参考例)。其中，A2D109抗体有各自由SEQ ID NO:4～6所表示的氨基酸序列构成的轻链CDR1～3和各自由SEQ ID NO:7～9所表示的氨基酸序列构成的重链CDR1～3。另外，A2D109抗体有含由SEQ ID NO:10所表示的氨基酸序列构成的可变区域的轻链和含由SEQ ID NO:11所表示的氨基酸序列构成的可变区域的重链。为了抗LAP-D抗体(A10)的反应性的评价，对于与LAP-D的结合，将抗LAP-D抗体(A10)与A2D109竞争结合与否由使用Biacore(注册商标)装置的SPR分析探讨。为了比较，还使用BAM2462抗体进行同样的分析。

(1)试验条件

(1.1)抗原(Analyte)的调制

·人TGF-β1的LAP-D的调制

将有向编码TGF-β1-LAP(氨基酸残基30-390)的基因序列附加能TEV蛋白酶切断的接头序列及His标签序列的序列的多核苷酸与Igk信号的下游连接，使用pOrip载体而使在HEK293F细胞中表达。根据厂商的使用说明书而使用HisTrap(GE healthcare公司)，从可溶性级分纯化TGF-β1-LAP。将His标签用TEV蛋白酶切断，向一次HisTrap柱装载得到的TGF-β1-LAP，回收通过级分。将其用阳离子交换柱(HiTrap SPHP、GE Healthcare公司)由以往的方法纯化，调制人TGF-β1的LAP-D。人TGF-β1的LAP-D的分子量是41653Da。

·人TGF-β1的LAP-D和A2D109抗体的Fab片段的复合体的调制

使用Pierce(商标)Mouse IgG1 Fab and F(ab')2Preparation试剂盒(ThermoFisher公司)而使A2D109抗体成为Fab片段(A2D109 Fab)。具体的操作根据该试剂盒附带的手册而进行。将得到的反应液使用Superdex 200Increase 10/300GL(GE Healthcare公司)而凝胶过滤纯化。回收50kDa溶出级分，以得到的级分作为A2D109 Fab使用。将纯化的重组TGF-β1-LAP和纯化的A2D109 Fab以1:1的摩尔比混合。由使用将复合体用由20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl及10％甘油构成的缓冲液平衡化的柱的凝胶过滤层析(HiLoad 16/600Superdex 200pg、GE Healthcare公司)纯化。得到的复合体的分子量是89514Da。

(1.2)由Biacore(注册商标)的测定

向Biacore(注册商标)用传感器芯片Series S Sensor Chip CM5(GE Healthcare公司)各自固定化抗LAP-D抗体(A10)及BAM2462抗体。固定化量各自是2027RU及310RU。将人TGF-β1LAP、及人TGF-β1LAP和A2D109 Fab的复合体溶液用由10mM HEPES-NaOH(pH 7.5)、150mM NaCl、3mM EDTA及0.005％Surfactant P-20构成的缓冲液稀释而调制各种浓度的溶液。向Biacore(注册商标)T200(GE Healthcare公司)输送这些溶液。在各溶液中的分析物浓度及测定条件如下所述。将测定数据使用Biacore(注册商标)Evaluation软件而解析，取得关于各抗体的亲和性的数据。传感图示于图7A及B。另外，各参数示于表1。

[分析物浓度]

1.56nM、3.13nM、6.25nM、12.5nM及25nM

[测定条件]

缔合：30μL/min,60sec

解离：30μL/min,60sec

再生：Gly-HCl(pH 1.5)/60μL/min,60sec

【表1】

从抗LAP-D抗体(A10)及BAM2462抗体各自结合于各抗原(分析物)之时的Rmax值由下述的式算出Rmax残留率(％)。另外，还算出考虑抗原及抗体的分子量比时的Rmax残留率(％)。结果示于表2。

(Rmax残留率)＝[(抗体与LAP-D和A2D109 Fab的复合体结合之时的Rmax值)/(抗体与LAP-D结合之时的Rmax值)]×100

(考虑分子量比的Rmax残留率)＝[[(抗体与LAP-D和A2D109Fab的复合体结合之时的Rmax值)/(LAP-D和A2D109 Fab的复合体的分子量)]/[(抗体与LAP-D结合之时的Rmax值)/(LAP-D的分子量)]]×100

【表2】

如表2所示，BAM2462抗体的反应性在作为参照抗体的A2D109抗体的存在下，相对于参照抗体的非存在下残留86.4％，而抗LAP-D抗体(A10)的反应性由A2D109抗体的存在而反应性降低至24.4％。即，在参照抗体的存在下的抗LAP-D抗体(A10)和LAP-D的结合的Rmax值与在参照抗体的非存在下的抗LAP-D抗体(A10)和LAP-D的结合的Rmax值比降低75.6％。另外，如图7A所示，在BAM2462抗体和LAP-D的结合的传感图中，即使在A2D109抗体的存在下，也与非存在下同样地应答增加。与此相比，如图7B所示，抗LAP-D抗体(A10)和LAP-D的结合的传感图由A2D109抗体的存在，应答不怎么增加。以上提示，抗LAP-D抗体(A10)的表位与A2D109抗体的表位相同或其附近。

【参考例：A2D109抗体的Fv片段和TGF-β1-LAP(C33S/N176Q)的复合体的X射线结晶结构解析】

(1)试验条件

(1.1)TGF-β1-LAP(C33S/N176Q)的表达及纯化

将向经能TEV蛋白酶切断的接头融合到His标签的2位置(C33S/N176Q)导入变异的TGF-β1-LAP(氨基酸残基30-390)与Igk信号的下游连接，使用pOrip载体而使在HEK293F细胞中表达。根据厂商的使用说明书而使用HisTrap(GE healthcare公司)，从可溶性级分纯化TGF-β1-LAP。将His标签用TEV蛋白酶切断，向一次HisTrap柱装载得到的TGF-β1-LAP，回收通过级分，由阳离子交换柱(HiTrap SP HP、GE Healthcare公司)由以往的方法调制。

(1.2)A2D109抗体的Fv片段(A2D109 Fv)的表达及纯化

使用pCR.2.1载体而使在大肠杆菌无细胞系中表达经能TEV蛋白酶切断的接头而融合His标签的A2D109 Fv(重链及轻链)。将可溶性级分使用HisTrap柱(GE healthcare公司)而纯化A2D109 Fv。将His标签用TEV蛋白酶切断，向一次HisTrap柱装载得到的A2D109Fv，回收通过的级分，用阴离子交换柱(HiTrap Q HP、GE Healthcare公司)进一步纯化。将含Fv的级分合并而于-80℃保存。

(1.3)A2D109 Fv和TGF-β1-LAP(C33S/N176Q)的复合体的调制

将纯化的重组TGF-β1-LAP和纯化的Fv以1:1.2的摩尔比混合。由使用将复合体用由20mM Tris-HCl(pH 8.0)、150mM NaCl及10％甘油构成的缓冲液平衡化的柱的凝胶过滤层析(HiLoad 16/600 Superdex 200pg、GE healthcare公司)纯化。

(1.4)结晶化

将纯化的复合体浓缩至约6mg/mL，由与接种法组合的坐滴蒸气扩散法于25℃进行结晶化。储液池溶液由25％w/v聚乙二醇3350及0.1M HEPES(pH 7.5)构成。由此，成功地用1周左右得到板状结晶。向含25％w/v聚乙二醇3350、0.1M HEPES(pH 7.5)及5％甘油的溶液中浸渍此结晶。

(1.5)数据收集及结构决定

将X射线衍射数据用SPring-8的BL32XU测定。测定中，一边将结晶常常放置于-178℃的氮流下而维持冷冻状态，使用与Beam Line连接的PAD(EIGER-9M)检测器而将结晶1次旋转0.1°，一边收集合计1800的X射线衍射像。将池参数的决定、赋予衍射斑的指数，及从衍射像得到的衍射数据的处理使用XDS包装(Acta.Cryst.D66:125-132(2010))而进行，取得最终至分解能的衍射强度数据。结晶学数据统计值示于表3。

将结构使用程序Phaser(J.Appl.Cryst.40:658-674(2007))而由分子取代确定。TGF-β1的检索模型是来源于公开的pro-TGF-β1结晶结构(PDB编码：3RJR)，Fv的检索模型是来源于公开的诺罗病毒结晶结构(PDB编码：4NCC)的Fv区域。将模型用Coot程序(ActaCryst.D66:486-501(2010))构建而用程序Phenix(Acta Cryst.D66:213-221(2010))精密化。自的衍射强度数据的结晶学信赖度因子(R)是22.14％，Free R值是29.76％。结构精密化统计值示于表3。

【表3】X射线数据收集及精密化统计值

a：R_merge＝∑hkl∑j|Ij(hkl)-〈I(hkl)〉|/∑hkl∑j|Ij(hkl)，其中Ij(hkl)及〈I(hkl)〉各自是有指数hkl的测定j的强度及反射的平均强度。

c：R_free使用随机地除的反射的3.6％而算出。

(2)结果

从上述的结构确定的结果得知，A2D109抗体的结合部位是作为人TGF-β1的LAP-D的整联蛋白结合的RGD序列。

【符号的说明】

11：试剂

12、22：第1容器

13、24：捆包箱

14、25：附带文书

21：试剂盒

23：第2容器

序列表

<110> 国立研究开发法人理化学研究所

学校法人慈惠大学

希森美康株式会社

<120> 针对人TGF-β的LAP片段的抗体及其利用

<130> TM6285CN

<150> JP2019-133839

<151> 2020-07-19

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 390

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 1

Met Pro Pro Ser Gly Leu Arg Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Leu Leu

1 5 10 15

Trp Leu Leu Val Leu Thr Pro Gly Arg Pro Ala Ala Gly Leu Ser Thr

20 25 30

Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg Ile Glu Ala

35 40 45

Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser Pro Pro Ser

50 55 60

Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val Leu Ala Leu

65 70 75 80

Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala Glu Pro Glu

85 90 95

Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr Arg Val Leu

100 105 110

Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys Gln Ser Thr

115 120 125

His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg Glu Ala Val

130 135 140

Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu Leu Arg Leu

145 150 155 160

Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn

165 170 175

Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro Ser Asp Ser

180 185 190

Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg Gln Trp Leu

195 200 205

Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala His Cys Ser

210 215 220

Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn Gly Phe Thr

225 230 235 240

Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met Asn Arg Pro

245 250 255

Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln His Leu Gln

260 265 270

Ser Ser Arg His Arg Arg Ala Leu Asp Thr Asn Tyr Cys Phe Ser Ser

275 280 285

Thr Glu Lys Asn Cys Cys Val Arg Gln Leu Tyr Ile Asp Phe Arg Lys

290 295 300

Asp Leu Gly Trp Lys Trp Ile His Glu Pro Lys Gly Tyr His Ala Asn

305 310 315 320

Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln Tyr

325 330 335

Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr Asn Gln His Asn Pro Gly Ala Ser Ala

340 345 350

Ala Pro Cys Cys Val Pro Gln Ala Leu Glu Pro Leu Pro Ile Val Tyr

355 360 365

Tyr Val Gly Arg Lys Pro Lys Val Glu Gln Leu Ser Asn Met Ile Val

370 375 380

Arg Ser Cys Lys Cys Ser

385 390

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 2

Leu Ser Thr Cys Lys Thr Ile Asp Met Glu Leu Val Lys Arg Lys Arg

1 5 10 15

Ile Glu Ala Ile Arg Gly Gln Ile Leu Ser Lys Leu Arg Leu Ala Ser

20 25 30

Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro Glu Ala Val

35 40 45

Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly Glu Ser Ala

50 55 60

Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys Glu Val Thr

65 70 75 80

Arg Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp Lys Phe Lys

85 90 95

Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser Glu Leu Arg

100 105 110

Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu Leu Arg Leu

115 120 125

Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu Tyr Gln Lys

130 135 140

Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu Leu Ala Pro

145 150 155 160

Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly Val Val Arg

165 170 175

Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg Leu Ser Ala

180 185 190

His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val Asp Ile Asn

195 200 205

Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile His Gly Met

210 215 220

Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu Arg Ala Gln

225 230 235 240

His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg

245

<210> 3

<211> 220

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 3

Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val Pro Pro Gly Pro Leu Pro

1 5 10 15

Glu Ala Val Leu Ala Leu Tyr Asn Ser Thr Arg Asp Arg Val Ala Gly

20 25 30

Glu Ser Ala Glu Pro Glu Pro Glu Pro Glu Ala Asp Tyr Tyr Ala Lys

35 40 45

Glu Val Thr Arg Val Leu Met Val Glu Thr His Asn Glu Ile Tyr Asp

50 55 60

Lys Phe Lys Gln Ser Thr His Ser Ile Tyr Met Phe Phe Asn Thr Ser

65 70 75 80

Glu Leu Arg Glu Ala Val Pro Glu Pro Val Leu Leu Ser Arg Ala Glu

85 90 95

Leu Arg Leu Leu Arg Leu Lys Leu Lys Val Glu Gln His Val Glu Leu

100 105 110

Tyr Gln Lys Tyr Ser Asn Asn Ser Trp Arg Tyr Leu Ser Asn Arg Leu

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Asp Ser Pro Glu Trp Leu Ser Phe Asp Val Thr Gly

130 135 140

Val Val Arg Gln Trp Leu Ser Arg Gly Gly Glu Ile Glu Gly Phe Arg

145 150 155 160

Leu Ser Ala His Cys Ser Cys Asp Ser Arg Asp Asn Thr Leu Gln Val

165 170 175

Asp Ile Asn Gly Phe Thr Thr Gly Arg Arg Gly Asp Leu Ala Thr Ile

180 185 190

His Gly Met Asn Arg Pro Phe Leu Leu Leu Met Ala Thr Pro Leu Glu

195 200 205

Arg Ala Gln His Leu Gln Ser Ser Arg His Arg Arg

210 215 220

<210> 4

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 4

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 5

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 7

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

Trp Pro Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210> 10

<211> 108

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala

100 105

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 11

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Met Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Val Asn Trp Pro Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 11

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 12

Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Gly

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 13

Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 14

Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe Thr

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 15

Arg Phe Trp Met Asn

1 5

<210> 16

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 16

Met Ile His Ser Ser Asp Ser Ile Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 17

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 17

Gly Tyr Asp Glu Tyr Ser Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 18

<211> 109

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 18

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser His Glu Ile Ser Gly Tyr

20 25 30

Leu Gly Trp Leu Gln Arg Gln Pro Asp Gly Thr Ile Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val Pro Lys Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg Ala

100 105

<210> 19

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 19

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Arg Phe

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile His Ser Ser Asp Ser Ile Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Asp Glu Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Ser Val Pro Val Ser Ser

115

<210> 20

<211> 236

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 20

Met Asp Met Arg Val Pro Ala His Val Phe Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Phe Pro Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Glu Arg Val Ser Leu Thr Cys Arg Ala Ser

35 40 45

His Glu Ile Ser Gly Tyr Leu Gly Trp Leu Gln Arg Gln Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Ile Lys Arg Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Asp Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Lys Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gln

100 105 110

Tyr Ala Ser Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Val

115 120 125

Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser

130 135 140

Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn

145 150 155 160

Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu

165 170 175

Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp

180 185 190

Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr

195 200 205

Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr

210 215 220

Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 21

<211> 462

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 21

Met Gly Trp Ser Ser Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Arg Phe Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Met Ile His Ser Ser Asp Ser Ile Thr Arg Leu Asn

65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Leu Asp Tyr Ser Ser Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Tyr Asp Glu Tyr Ser Ala Met Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Ser Val Pro Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro

130 135 140

Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met

145 150 155 160

Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val

195 200 205

Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His

210 215 220

Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys

225 230 235 240

Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe

245 250 255

Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

260 265 270

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val

275 280 285

Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

290 295 300

Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu

305 310 315 320

Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys

325 330 335

Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

340 345 350

Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro

355 360 365

Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile

370 375 380

Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly

385 390 395 400

Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp

405 410 415

Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp

420 425 430

Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

435 440 445

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 22

Leu Ala Ser Pro Pro Ser Gln Gly Glu Val

1 5 10

Claims

1.针对人TGF-β的LAP片段的分离的单克隆抗体，其识别人TGF-β的LAP片段的整联蛋白结合部位，所述单克隆抗体具有：

轻链，其含：

由SEQ ID NO：12所表示的氨基酸序列构成的CDR1，

由SEQ ID NO：13所表示的氨基酸序列构成的CDR2，及

由SEQ ID NO：14所表示的氨基酸序列构成的CDR3，和

重链，其含：

由SEQ ID NO：15所表示的氨基酸序列构成的CDR1，

由SEQ ID NO：16所表示的氨基酸序列构成的CDR2，及

由SEQ ID NO：17所表示的氨基酸序列构成的CDR3。

2.权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中所述整联蛋白结合部位含RGD序列。

3.权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其识别含SEQ ID NO:2所表示的氨基酸序列的第215～217的氨基酸残基的区域。

4.权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其中对于与所述LAP片段的结合，与参照抗体竞争结合，所述参照抗体具有：

轻链，其含：

由SEQ ID NO:4所表示的氨基酸序列构成的CDR1，

由SEQ ID NO:5所表示的氨基酸序列构成的CDR2，及

由SEQ ID NO:6所表示的氨基酸序列构成的CDR3，和

重链，其含：

由SEQ ID NO:7所表示的氨基酸序列构成的CDR1，

由SEQ ID NO:8所表示的氨基酸序列构成的CDR2，及

由SEQ ID NO:9所表示的氨基酸序列构成的CDR3。

5.权利要求1所述的分离的单克隆抗体，其有：

轻链，其含由SEQ ID NO:18所表示的氨基酸序列构成的可变区域，和

重链，其含由SEQ ID NO:19所表示的氨基酸序列构成的可变区域。

6.权利要求1～5之任一项所述的分离的单克隆抗体，其有：

轻链，其含SEQ ID NO:20所表示的氨基酸序列，和

重链，其含SEQ ID NO:21所表示的氨基酸序列。

7.LAP片段检测用试剂，其含权利要求1～6之任一项所述的分离的单克隆抗体。

8.权利要求1～6之任一项所述的分离的单克隆抗体在制造人TGF-β的LAP片段的测定用试剂盒中的用途。

9.权利要求1～6之任一项所述的分离的单克隆抗体在制造监测人TGF-β的LAP片段的测定值的试剂盒中的用途，其中所述监测通过包括下列工序的方法实施：

使用所述分离的单克隆抗体测定在从受试者采集的第1生物体试样中的TGF-β的LAP片段的工序，及

使用所述分离的单克隆抗体测定在从所述受试者采集的第2生物体试样中的TGF-β的LAP片段的工序，

其中

所述第1生物体试样是在第1时间点从所述受试者采集的生物体试样，

所述第2生物体试样是在与所述第1时间点不同的第2时间点从所述受试者采集的生物体试样。