WO2005019451A1

WO2005019451A1 - Ｐｄｋ−１の活性阻害物質の発現用核酸構築物

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Publication number: WO2005019451A1
Application number: PCT/JP2004/004536
Authority: WO
Inventors: Norio Sakai
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2004-03-30
Publication date: 2005-03-03
Anticipated expiration: 2006-02-22
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Abstract

PDK-1によるリン酸化活性の制御手段、及び該活性の異常に起因する疾患の治療手段を提供すること。生体内において、該ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ1の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有した。3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ1の活性阻害物質の発現用核酸構築物;該発現用核酸構築物を保持した、哺乳動物細胞における3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ1の活性阻害物質の発現用担体;該発現用核酸構築物又は該発現用担体を有効成分として含有した、3-ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤及び治療方法;並びに該疾患の治療用医薬組成物の製造のための該発現用核酸構築物又は発現用担体。

Description

明細書

PDK- 1の活性阻害物質の発現用核酸構築物技術分野

本発明は、リン酸化酵素である 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ PDK— 1の活性阻害物質に関する。さらに詳しくは、本発明は、生体内において、前記 P D K— 1によるタンパク質リン酸化を抑制する活性阻害物質を発現させうる発現用核酸構築物、該 PDK— 1の活性阻害物質の発現用担体、 PDK 一 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤、該疾患の治療方法等に関する。背景技術

癌の治療には、例えば、抗癌剤等を用いて、癌細胞そのものを殺すことなどが試みられている。

前記抗癌剤によれば、種々の細胞においてアポトーシスが引き起こされることが知られている〔ダンジ（Gun j i， H. ) ら著、キャンサーリサーチ（C an c e r R e s . ) ，第 51巻， 741— 743頁， 1991 ；カウフマン (K a u f ma n n, S. H. ) 著，キャンサ一リサーチ（C anc e r R e s . ) ，第 49巻， 5870— 5878頁， 1989〕。しかしながら、例えば、スタウロスポリン等のタンパク質リン酸化酵素阻害剤は、標的となる癌細胞以外にも非特異的にアポトーシスを引き起こす場合があり、抗癌剤としての使用は困難である場合があるという欠点がある。発明の開示

本発明の 1つの側面は、 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼのリン酸化活性を阻害しうる活性阻害物質を発現させること、生体内で該活性阻害物質を発現させること、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼによるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療を必要とする個体内で、該活性阻害物質を発現させること、該活性阻害物質を大量かつ簡便に製造すること等の少なくとも 1つを可能にする、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性阻害物質の発現用核酸構築物を提供することにある。また、本発明の他の側面は、前記活性阻害物質を安定して供給すること、該活性阻害物質を生体内で高い効率で発現させること、該活性阻害物質を生体内で高い効率で発現させること、該活性阻害物質を所望の細胞等に特異的に発現させること等の少なくとも 1つを可能にする、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性阻害物質の発現用担体を提供することにある。さらに、本発明の他の側面は、 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患、具体的には、癌等に罹患した個体において、所望の細胞、特に、癌細胞において、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性阻害物質を発現させ、該 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼのリン酸化活性を阻害すること、所望の細胞、特に、癌細胞にアポト一シスを引き起こさせること等の少なくとも 1つを可能にする治療剤を提供することにある。また、本発明のさらに他の側面は、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性の異常に起因する疾患を治療することを可能にする、治療方法を提供することにある。さらに、本発明のさらに別の側面は、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性阻害物質の発現用核酸構築物又は発現用担体の使用に関する。本発明の要旨は、

〔1〕 (A) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列、 (B) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び

(C) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTアルゴリズム (Co s t t o op e n g ap 1 1， Co s t t o e x t e n d g a p 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるアミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列と、

(a) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列、

(b) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び

(c) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTアルゴリズム (Co s t t o o e n g 1 1, Co s t t o e x t e nd ap 1, e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるァミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列とを含有し、かつ生体内において、ホスホィノシチド依存性プロティンキナーゼ 1の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有してなる、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1 の活性阻害物質の発現用核酸構築物、

〔 2〕活性阻害物質をコ一ドする核酸が、

( i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列、

( i i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び

( i i i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTァルゴリズム (Co s t t o o p e n g a 11， Co s t t o e x t e nd g ap 1， e xp e c t v a l ue 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるァミノ酸配列、

からなる群より選ばれたァミノ酸配列

をコードする核酸の下流に作動可能に連結されてなる、前記〔1〕記載の発現用核酸構築物、

〔3〕活性阻害物質をコードする核酸が、テロメラ一ゼプロモーター支配下に発現する、前記〔1〕又は〔2〕記載の発現用核酸構築物、

〔4〕前記〔1〕〜〔3〕いずれか 1項記載の発現用核酸構築物を保持してなる、哺乳動物細胞における 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナ一ゼ 1の活性阻害物質の発現用担体、

〔5〕前記〔1〕〜〔3〕いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物又は前記

〔4〕記載の発現用担体を有効成分として含有してなる、 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤、

〔6〕疾患が、癌又はウィルス感染症である、前記〔5〕記載の治療剤、

〔7〕前記〔1〕〜〔3〕いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物の発現産物を有効成分として含有してなる、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤、

〔 8〕発現産物が、

(I) 配列番号： 5又は配列番号： 7に示されるアミノ酸配列、

(I I) 配列番号： 5又は配列番号： 7に示される配列において、少なくとも 1 個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び

(I I I) 配列番号： 5又は配列番号： 7に示されるアミノ酸配列に対し、 BL A S Tアルゴリズム（Co s t t o o p e n g ap 1 1， Co s t t o e t e nd g ap 1, e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるアミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、前記〔7〕記載の治療剤、

〔9〕前記〔1〕 ~ 〔3〕いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物又は前記

〔4〕記載の発現用担体を、 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ 1 によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体に、治療上有効量投与する、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナ一ゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療方法、並びに

〔10〕 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナ一ゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、前記〔1〕〜

〔3〕いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物又は前記〔4〕記載の発現用担体の使用、

に関する。図面の簡単な説明

図 1は、緑色蛍光タンパク質（GFP) を結合した PDK— 1活性阻害物質の一次構造の概略図を示す。パネル Aは、 PKBAL— P I F— GFPを示し、パネル Bは、 Ly n s i g— PKBAL— P I F— GFPを示し、パネル Cは、 δ AL-P I F— GFPを示し、パネル Dは、 Lyn s i g— SAL— P I F— G F Pを示す。

図 2は、細胞における AL— P I F— GFP及び Ly n s i g- (5 AL-P I F-GFPそれぞれの発現分布を示す。パネル Aは、 5AL— P I F— GFP の発現分布を示し、パネル Bは、 Lyn s i g— SAL— P I F— GFPの発現分布を示す。図中、スケールパーは、 10 mを示す。

図 3は、細胞における 3 AL— P I F— GFPによる細胞の形態変化を示す。パネル Aは、 GFPによる蛍光像を示し、パネル Bは、核染色を行なった結果を示す。図中、スケールバーは、 10 mを示す。

図 4は、 PKBのァクチべ一ションループのリン酸化における δ ALP I F— GFPの影響を調べた結果を示す図である。図中、パネル Aは、抗 GFP抗体を用いたウエスタンプロット解析、パネル Bは、抗リン酸化 P KB (Th r 30 8) 抗体を用いたウェスタンプロット解析を行なった結果を示す。また、各パネルにおいて、レーン 1は、 PKB cn— GFPと GFPとを共発現させた COS— 7細胞から調製したタンパク質試料（20 / g) を用いた場合、レーン 2は、 P ΚΒ θί— GFPと 6ALP I F— G F Ρとを共発現させた C O S— 7細胞から調製したタンパク質試料（20 g) を用いた場合を示す。発明を実施するための最良の形態

本発明は、 1つの側面では、

(A) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列、

(B) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び

(C) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTアルゴリズム (Co s t t o o e n g ap 1 1, Co s t t o e x t e n d g ap 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるアミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列と、

(a) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列、

(c) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTアルゴリズム (Co s t t o o p e n g ap 1 1, Co s t t o e x t e nd g ap 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるァミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列とを含有し、かつ生体内において、該 PD K一 1の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有する、 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ 1 (以下、「PDK— 1」という）の活性阻害物質の発現用核酸構築物である。

本発明の発現用核酸構築物は、前記（A) 〜（C) のいずれかのアミノ酸配列と前記（a) 〜（c) のいずれかのアミノ酸配列とをコードする核酸を含有しているため、 PDK— 1の活性阻害物質を発現させることができる。したがって、かかる発現用核酸構築物を、 PDK— 1の活性の異常に起因する疾患の患部に供給することにより、 PDK— 1の活性の異常を是正することができる。また、 P DK- 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療を必要とする個体内、細胞内等において、 PDK— 1のリン酸化活性を阻害しうる活性阻害物質を発現させ、大量かつ簡便に製造することができるという優れた効果を発揮する。

なお、本明細書において、「PDK— 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患」とは、 PDK— 1の活性の異常により引き起こされる疾患を意味し、例えば、癌、ウィルス感染症等が挙げられる。前記癌としては、具体的には、例えば、 PDK - 1により活性化される PKBの活性の上昇に基づき、細胞増殖が促進している癌等が挙げられる。なお、本明細書において、「PDK - 1によるリン酸化活性の異常」とは、健常個体、罹患していない個体、罹患していない状態にあつた個体等と比較した場合、 PDK - 1によるリン酸化活性の平均値から逸脱した状態を意味する。

また、本明細書において、「PDK— 1の活性阻害物質」は、 PDK— 1によりリン酸化される性質を示す物質をいう。

「PDK— 1の活性の阻害」は、例えば、 PDK— 1によりリン酸化されたァミノ酸残基を特異的に認識する抗体を用いて、この抗体が認識する PDK - 1の基質タンパク質の量が減少することを確認することにより評価されうる。

なお、 PDK— 1の活性阻害物質の親和性は、生体内で、 PDK— 1による P KBの活性化を抑制し、細胞にアポトーシスを誘導する活性を十分に発揮させる程度であればよい。

PDK— 1による前記活性阻害物質のリン酸化は、例えば、 PDK - 1によりリン酸化されたアミノ酸残基（主に、スレオニン残基等）を特異的に認識する抗体を用いて、前記活性阻害物質がこの抗体で認識されるかどうかをィムノブロット法等により測定されうる。

また、 PDK— 1と活性阻害物質との親和性は、結合活性によっても評価されうる。前記結合活性は、特に限定されないが、 two— hyb r i d法、共免疫沈降法、表面プラズモン共鳴測定等により測定されうる。

具体的には、 two— hy b r i d法の場合、

(1) 活性阻害物質をコードする核酸を、 p r e yベクタ一に組込み、 p r e yプラスミドを得るステップ；

(2) 得られた p r e yプラスミドを酵母 CEGY48 [p 8 o p l a c Z] 〕に導入して、 p r e yプラスミド保持クローンを得るステップ；

(3) PDK— 1遺伝子を、 b a i tベクターに組込み、 b a i tプラスミドを得るステップ；

(4) 得られた b a i tプラスミドを、前記ステップ（2) で得られた p r e yプラスミド保持クローンに導入し、クローンを得るステップ；並びに

(5) 前記（4) で得られたクローンを、ロイシン欠失プレート上で 3日間培養し、酵母細胞内における前記活性阻害物質との相互作用をロイシン欠失プレート上でのコロニー形成能により評価するステップ；

を行ない、ロイシン欠失プレート上でコロニーが形成されることを、 PDK- 1 と前記活性阻害物質とが結合することの指標として評価されうる。また、共免疫沈降法の場合、

(1) シグナル配列の下流に FLAG配列を有する PDK— 1を発現する PD K— 1—FLAG発現プラスミドを得るステップ；

(2) N末側に HA配列を有する前記活性阻害物質を発現しうる HA—活性阻害物質発現プラスミドを得るステップ；

(3) 細胞に、前記ステップ（1) で得られた PDK— 1—FLAG発現ブラスミドと前記ステップ（2) で得られた HA—活性阻害物質発現プラスミドとを、一過的にコトランスフエクトして、トランスフエクタントを得るステップ；

(4) 前記ステップ（3) で得られたコトランスファクタントを培養して、培養細胞を得るステップ；

(5) 前記ステップ（4) で得られた培養細胞から、細胞抽出液を得るステツプ；

(6) 前記ステップ（5) で得られた細胞抽出液に抗 FLAG抗体又は抗 HA 抗体を加えて共免疫沈降を行なうステップ；並びに

(7) 共免疫沈降を、ウエスタンプロット解析により検出するステップ；を行ない、抗 FLAG抗体及び抗 H A抗体のいずれを用いた場合においても、複合体の沈降が検出されることを、 PDK— 1と前記活性阻害物質とが結合することの指標として評価されうる。

表面プラズモン共鳴解析の場合、 PDK— 1を固定化したチップに、活性阻害物質を含有した溶液を一定の流速で、送液し、光学的（蛍光度、蛍光偏向度等）検出手段、質量分析計（マトリックス支援レーザー脱離イオン化一飛行時間型質量分析計： MALD I—TOF MS、エレクトロスプレー ·イオン化質量分析計： ES I—MS) 等の検出手段により、該 PDK— 1と活性阻害物質とからなる複合体の形成を示すセンサーグラムが呈示された場合、該 PDK— 1と活性阻害物質とが結合することの指標として評価されうる。かかる表面プラズモン共鳴解析によれば、反応速度等も併せて評価されうる。「生体内で、 PDK— 1による PKBの活性化を抑制し、細胞にアポトーシスを誘導する活性」（アポトーシス誘導活性ともいう）は、クロマチンの凝縮、細胞核の断片化、アポトーシス小体の形成等の形態的変化に基づく検出、細胞死に伴い細胞から漏出する酵素（乳酸脱水素酵素等）の活性の増加の測定、トリパンブルー等による染色、 TUNE L法等により評価されうる。

前記（A) において、配列番号： 1に示されるアミノ酸配列は、 PKBZAk tの a c t i v a t i on 1 o o pの配列であり、配列番号： 2に示されるァミノ酸配列が、 δ PKCのアミノ酸配列である。本発明の発現用核酸構築物を用いることにより得られる活性阻害物質は、前記配列番号： 1又は 2に示されるァミノ酸配列を有するため、生体内で、 PDK— 1による ΡΚΒの活性化を抑制するという驚くべき性質を発現する。

なお、本発明においては、前記 a c t i v a t i on l o o と実質的に同等の機能、すなわち、 PDK— 1との親和性、アポト一シス誘導活性等を示し、 PDK— 1によりリン酸化され、 PDK— 1の偽基質として働き、 PDK— 1のリン酸化機能を抑えるものであれば、前記配列番号： 1又は 2に示されるァミノ酸配列の誘導体配列〔例えば、前記（B) 又は（C) のアミノ酸配列〕であってもよい。

前記（B) のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加の数は、前記 a c t i V a t i o n l o opと実質的に同等の機能、すなわち、 PDK— 1との親和性、アポトーシス誘導活性等を示し、かつ PDK— 1によりリン酸化される範囲で適宜設定されうる。

なお、本明細書において、「少なくとも 1個」とは、 1若しくは複数個、好ましくは 1若しくは数個をいう。

前記（C) のアミノ酸配列において、配列同一性の算出に用いられるアルゴリズムにおける条件は、例えば、 Co s t t o op e n g ap 1 1， Co s t t o e x t e nd g ap 1 , e p e c t v a l u e 10， w o r d s i z e 3が挙げられる。他の値は、通常用いられるデフォルト値であつてもよい。

前記（C) のアミノ酸配列と、配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列との間の配列同一性は、前記 a c t i v a t i on l o o pと実質的に同等の機能、すなわち、 PDK— 1との親和性、アポトーシス誘導活性等を示し、かつ P DK— 1によりリン酸化される範囲であればよく、前記条件にて、 BLASTァルゴリズムにより適切にァライメントし、算出した場合、少なくとも 26%、好ましくは、 50%以上、より好ましくは、 60%以上、さらに好ましくは、 7 0%以上、よりさらに好ましくは、 80%以上、一層好ましくは、 90%以上、より一層好ましくは、 95 %以上であることが望ましい。

なお、前記（B) 及び（C) のアミノ酸配列においては、配列番号： 9に示されるアミノ酸配列（Thr Phe Cys Gly Thr) が保存されていることが望ましい。また、本発明の発現用核酸構築物を用いることにより得られる活性阻害物質は、前記（A) 〜（C) からなる群より選ばれたアミノ酸配列に加え、前記（a) 〜 (c) からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有しているため、生体内で、 PD K- 1による PKBの活性化をより効率よく抑制し、細胞にアポトーシスを誘導するという優れた効果を発揮する。

前記（a) のアミノ酸配列において、配列番号： 3に示されるアミノ酸配列は、 PDK— 1相互作用断片（P I F) の配列である。

前記配列番号： 3に示されるアミノ酸配列は、該アミノ酸配列を有するポリべプチドが、 PDK— 1の本来の基質である AGCキナーゼの 1つであるプロティンキナーゼ C関連キナーゼ— 2 (PRK2) と結合する活性を呈するものであれば、該配列番号： 3に示されるアミノ酸配列の誘導体配列〔例えば、前記（b) 又は（c) のアミノ酸配列〕であってもよい。

前記（b) のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加の数は、前記 P I Fと実質的に同等の機能、すなわち、 PDK— 1との親和性等を示す範囲で適宜設定されうる。

前記（c) のアミノ酸配列において、配列同一性は、前記 P I Fと実質的に同等の機能、すなわち、 PDK— 1との親和性等を示す範囲であればよい。

また、本発明の発現用核酸構築物は、

( i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列、

( i i i ) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTァルゴリズム (Co s t t o op e n g ap 1 1, Co s t t o e x t e nd a p 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるァミノ酸配列、

からなる群より選ばれたァミノ酸配列

をコードする核酸をさらに含有してもよい。かかる発現用核酸構築物としては、活性阻害物質をコードする核酸が、前記（ i) 〜（ i i i) からなる群より選ばれたアミノ酸配列の下流に作動可能に連結された構築物が挙げられる。前記

( i) 〜（ i i i) からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有した発現用核酸構築物によれば、細胞膜に前記活性阻害物質を発現させることができる。

前記（ i) のアミノ酸配列において、配列番号： 4に示されるアミノ酸配列は、細胞膜に存在するチ口シンリン酸化酵素 L y nの N末端配列であり、該配列番号： 4に示されるァミノ酸配列からなる部分がパルミチン化されることにより、かかるアミノ酸配列を有するポリペプチドが細胞膜に局在化する。

したがって、本発明においては、パルミチン化され、細胞膜への局在化能を呈するものであれば、前記配列番号： 4のアミノ酸配列の誘導体配列〔前記（ i i) 又は（ i i i) のアミノ酸配列〕であってもよい。

前記（i i) のアミノ酸配列において、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加の数は、前記 Ly nの N末端配列と同様に、パルミチン化されることにより、細胞膜への局在化能を発揮する範囲で適宜設定されうる。

前記（ i i i) のアミノ酸配列において、配列同一性は、前記 Lynの N末端配列と同様に、パルミチン化されることにより、細胞膜への局在化能を発揮する範囲であればよい。

前記パルミチン化は、細胞を細胞膜成分と細胞質成分とに分画し、細胞膜成分に多く P D K - 1活性阻害物質が発現していることをィムノブロット法により検出することにより評価されうる。また、細胞膜への局在化能は、 GFPを融合した Lyn付加 PDK— 1活性阻害物質が Lyn付加しているか PDK - 1物質に比べ、細胞膜に、より多く局在することを蛍光顕微鏡下で観察することにより評価されうる。

本発明の発現用核酸構築物に用いられる活性阻害物質をコードする核酸は、配列表に記載のアミノ酸配列を基に、対応する核酸を合成すること、 PKB又は P KC d e l t aをコードする核酸を铸型として PC Rを行なうこと等により得られうる。

また、本発明の発現用核酸構築物においては、テロメラーゼプロモーター等のプロモーターの支配下に、前記活性阻害物質をコードする核酸を発現させることにより、癌細胞に特異的に前記活性阻害物質を発現させることができる。具体的には、例えば、

1. 活性阻害物質をコードする核酸が、テロメラーゼプロモ一夕一等の下流に作動可能に連結された構築物、

2. テトラサイクリントランスァクチべ一夕一をコードする核酸が、テロメラ —ゼプロモータ一等のプロモータ一の下流に作動可能に連結された構築物と、前記活性阻害物質をコードする核酸が、前記トランスァクチベータ一に活性化されるプロモータ一の下流に作動可能に連結された構築物との組み合わせ

等が挙げられる。本明細書において、「作動可能に連結された」とは、所望の機能を発揮するポリペプチドが、正常に発現するように、連結された状態をいう。例えば、「核酸が、プロモーターの下流に作動可能に連結された」とは、プロモーターの制御下に核酸から発現産物が生じることを意味する。

前記トランスァクチべ一ター及び該トランスァクチべ一夕一により活性化されるプロモーターとしては、テトラサイクリントランスァクチべ一ター及び T e t Opプロモー夕一等が挙げられる。前記テトラサイクリントランスァクチべ一夕一及び Te t Opプロモーターを用いた場合、発現用核酸構築物による活性阻害物質の発現を停止させることができるため、活性阻害物質の時期特異的発現制御、例えば、適度に働くように、発現を停止させる場合、ある一定の期間のみに発現させる場合等に好適である。

なお、前記発現用核酸構築物により発現される活性阻害物質としては、特に限定されないが、

(I I I) 配列番号： 5又は配列番号： 7に示されるアミノ酸配列に対し、 BL ASTァルゴリズム（Co s t t o o p e n g a p 1 1, Co s t t o e x t e nd g a 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26 %であるアミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチド等が挙げられる。本発明の発現用核酸構築物は、細胞等への核酸の導入に適した担体に保持させることにより、安定して活性阻害物質を発現させることができる。したがって、本発明の発現用核酸構築物によれば、活性阻害物質を安定して供給することができるという優れた効果を発揮する。また、本発明の発現用核酸構築物によれば、より効率よく、個体、細胞等に導入し、前記活性阻害物質を個体内、細胞内等で高い効率で発現させることができ、該活性阻害物質を所望の細胞等により特異的に発現させることができるという優れた効果を発揮する。

したがって、本発明の他の側面は、前記発現用核酸構築物を保持した、哺乳動物細胞における P D K— 1の活性阻害物質の発現用担体である。

細胞等への核酸の導入に適した担体としては、ウィルスベクター、例えば、ァデノウィルスべクタ一、ヘルぺスウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクタ一、シンドビスウィルスベクタ一、レトロウイルスベクター等の哺乳動物細胞用ベクター、プラスミドベクタ一を含有するリボソーム、プラスミドベクタ一を付着した金粒子等が挙げられる。なかでも、細胞における発現効率の観点から、好ましくは、一過性発現能を有するウィルスベクターが望ましい。

また、本発明の発現用核酸構築物及び発現用担体は、 P D K— 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療に用いられうる。

したがって、本発明の別の側面は、 P D K _ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療剤である。

本発明の治療剤は、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体を有効成分として含有することに 1つの大きな特徴がある。本発明の治療剤は、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体を含有するため、 P D K— 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体において、所望の細胞内で前記活性阻害物質を発現させ、該 P D K— 1のリン酸化活性を阻害し、 P D K— 1によるターゲティング機構を抑制し、所望の細胞にアポト一シスを引き起こさせることができるという優れた効果を発揮する。

したがって、本発明の治療剤は、 P D K— 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患、より具体的には、アポトーシス誘導が治療効果につながる疾患の治療に好適である。

P D K - 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患としては、前記と同様であり、例えば、癌、例えば、癌、特に、 P D K— 1により活性化される P K Bの活性の上昇に基づき、細胞増殖が促進している癌、ウィルス感染症等が挙げられる。前記癌としては、例えば、特に、 P D K— 1により活性化される P K Bの活性の上昇に基づき、細胞増殖が促進されうる乳癌等が挙げられる。

本発明の治療剤は、標的細胞、標的組織、標的臓器等に応じた投与経路により投与されうる。前記投与経路としては、例えば、静脈、動脈、皮下、皮内、筋肉内、局所等が挙げられる。

本発明の治療剤における前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体の含有量は、疾患、患者の年齢及び体重等に応じて適宜設定することができるが、生体内で、前記活性阻害物質が発現して、 P D K— 1によるターゲティング機構をより効率よく抑制し、細胞にアポトーシスを誘導するに十分な量（治療上有効量）であればよい。

本発明の治療剤は、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体の他、薬理学的に許容されうる助剤、例えば、核酸を安定に保持しうる緩衝液、賦形剤、結合剤、安定剤、溶解補助剤、等張剤等をさらに含有してもよい。

本発明の治療剤の投与法としては、リン酸一カルシウム共沈法、微小ガラス管を用いた直接注入法、リボソームによる遺伝子導入法、パーティクル銃で細胞に移入する方法、正電荷ポリマーによる導入法等が挙げられる。

本発明の治療剤について、例えば、癌の場合、以下のような動物実験により薬理評価を行なうことができる。腫瘍の形成が確認されたヌードマウスの癌モデルに適切な用量の治療剤を適切な投与回数投与し、同時に、腫瘍径の変化を観察する。なお、対照群として、治療剤を投与しなかったマウス、又は他の治療法を用いて治療したマウス等が挙げられる対照群に比べ、投与群において、より腫瘍の退縮が見られた場合、動物実験レベルで癌の治療ができたことを示す指標となる。また、組織、細胞等について、アポトーシスの検出を行なってもよい。さらに、本発明の治療剤によるヒトへの臨床試験は、例えば、癌細胞の場合、腫瘍の定期的な観察（写真撮影等）、 CTスキャン、 MR I等での記録により、腫瘍径を測定し、直交する長径と短径から推定腫瘍体積を算出し腫瘍の増殖を計算する。治療効果は、腫瘍の種類に応じた評価指標に基づき評価されうる。また、アポト一シスの有無を組織、細胞等の形態学的観察により評価してもよい。

さらに、本発明は、さらに他の側面では、前記発現用核酸構築物又は前記発現用担体を、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体に、治療上有効量投与することを特徴とする、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療方法である。

本発明の治療方法は、前記治療剤を個体に投与する場合と同様に行なわれる。また、かかる治療方法による治療効果の評価は、前記治療剤の薬理評価及び臨床試験と同様に行なわれうる。

また、本発明によれば、 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼの活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性阻害物質の発現用核酸構築物又は発現用担体の使用も提供される。本発明の発現用核酸構築物又は発現用担体によれば、 3 一ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼの活性の異常に起因する疾患の治療方法の開発が可能になる。以下、本発明を、実施例により詳細に説明するが、本発明は、下記実施例により何ら限定されるものではない。実施例 1

3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ（「PDK— 1」という；配列番号： 1 ) のァクチべーションループ（a c t i v a t i on l o o p) に対応する部分と、 PDK— 1相互作用フラグメント（「P I F」という；配列番号： 3) とをコードする核酸を 2コピー有する核酸構築物（PKBAL— P I F) を作製した。また、前記核酸構築物（PKBAL— P I F) の発現産物の C 末端側に、緑色蛍光タンパク質（GFP) が配置されるように、該核酸構築物の下流に、 GFPをコードする核酸を配置させ、核酸構築物（PKBAL— P I F -GFP) を得た。

ついで、前記 PKBAL— P I Fを、哺乳動物細胞用発現ベクター pTB 70 1の SV40プロモーターの下流に組み込み、 PKBAL— P I F発現用組換えベクタ一を得た。また、前記 PKBAL— P I F— GFPを、前記哺乳動物細胞用発現ベクター pTB 701の SV40プロモーターの下流に組み込み、 PKB AL-P I F— GFP発現用組換えべクタ一を得た。

さらに、細胞膜に存在するチロシンリン酸化酵素 L y nの N末端領域のァミノ酸配列（配列番号： 4) からなるペプチドをコードする核酸を、該ペプチドが、核酸構築物（PKBAL— P I F) の発現産物及び核酸構築物（PKBAL— P I F-GFP) の発現産物のそれぞれの N末端側に付加されるように、各核酸構築物に連結させ、核酸構築物（Lyn s i g-PKBAL-P I F) 及び核酸構築物（Lyn s i g— PKBAL— P I F— GFP) のそれぞれを得た。

また、 PKB/Ak tと同様に PDK— 1の基質である <5 PKCのァクチべ一シヨンループ（a c t i v a t i on l o o p) に対応する部分と δ PKCの P I Fとをコードする核酸を 2コピー有する核酸構築物（0AL-P I F) を作製した。また、前記核酸構築物（(5AL— P I F) の発現産物の C末端側に、 G FPが配置されるように、該核酸構築物の下流に、 GFPをコードする核酸を配置させ、核酸構築物（<5 AL— P I F— GFP) を得た。

ついで、前記 SAL— P I Fを、前記哺乳動物細胞発現ベクター pTB 701 の S V40プロモーターの下流に組み込み、 δ AL— P I F発現用組換えべクタ —を得た。また、前記 <5 AL— P I F— GFPを、哺乳動物細胞発現ベクター ρ TB 701の SV40プロモーターの下流に組み込み、（5AL— P I F— GFP 発現用組換えベクターを得た。

さらに、細胞膜に存在するチロシンリン酸化酵素 L y nの N末端領域のァミノ酸配列（配列番号： 4) からなるペプチドをコードする核酸を、該ペプチドが、核酸構築物（SAL— P I F) の発現産物及び核酸構築物（SAL— P I F— G FP) の発現産物のそれぞれの N末端側に付加されるように、各核酸構築物に連結させ、核酸構築物（Lyn s i g-5AL-P I F) 及び核酸構築物（Lyn s i g- (5 AL-P I F-GFP) のそれぞれを得た。

得られた各組換えベクターを、エレクト口ポレーシヨン法により、それぞれ、哺乳動物細胞 COS— 7株（理化学研究所細胞パンク供給）に導入した。

得られた発現産物のうち、 GFP結合発現産物の一次構造の概略図を図 1に示す。

また、前記核酸構築物のそれぞれを用い、相同組換法により、組換えアデノウィルスを作製した。なお、組換えアデノウイルスの作製には、ストラタジーン社製、商品名： pAdEASY S y s t em、商品名： AdE a s y Ad e n o v i r a 1 Ve c t o r Sy s t emを用いた。

HEK 293細胞（八丁（：〇 CRL— 1573) を、 100ユニット/ m 1 ペニシリン Gナトリウムと 100 gZm 1 ストレプトマイシンと 10重量％ゥシ胎仔血清とを含む ο;— MEM上、 60mm 培養プレートあたり細胞数 2〜5 X 10⁵ (約 100細胞/ mm²) になるように接種し、 5体積％ C0₂ を含む加湿気相中、 37°Cで培養した。

12〜24時間後、得られた組換えアデノウイルスベクターで、 HEK 29 3細胞をトランスフエクシヨンした。 4〜7日後、プレートから剥離した細胞を、培養液中の細胞を、 1500 X gで 5分間遠心分離して、ウィルス上清を得た。得られた組換えアデノウイルス上清について、ウィルスタイター値を測定した。その結果、前記核酸構築物の発現アデノウイルスベクターを得た。実施例 2

前記実施例 1で得られた発現ベクターのうち、 — P I F— GFPの発現プラスミドベクター及び Ly n s i g- a AL-P I F— GFPの発現プラスミドベクターのそれぞれを、エレクト口ポレーシヨン法により、サル腎臓癌細胞 C

OS- 7に導入した。

導入 24時間後、 δ AL— P I F— GFP発現細胞及び Ly n s i g— δ AL - P I F— GFPの発現細胞のそれぞれについて、 GFPによる蛍光を指標として観察した。結果を図 2に示す。

その結果、図 2に示されるように、 <5 AL— P I F— GFPの発現産物は、主に細胞質に発現が見られ、 Lyn s i g— δ AL— P I F— GFPの発現産物は、主に細胞膜に発現が見られた。

導入 48時間後、（5AL— P I F— GFPの発現細胞及び L y n s i g~ δ A L-P I F— GFPの発現細胞のそれぞれについて、 GFPによる蛍光を指標として観察した。

その結果、 SAL— P I F— GFPの発現細胞及び L y n s i g— <5AL— P I F— GFPの発現細胞共に、球形に形態変化を起こした。また、それぞれの細胞について、へキスト 33342を用いて、染色した結果、形態変化を示した細胞は、いずれもクロマチンの凝集と核の分断化を示し、アポトーシスを起こしていることがわかった。なお、図 3に、代表例として、（5AL— P I F— GFPの発現細胞の場合の結果を示す。

したがって、実施例 1で得られた発現ベクターにより発現される核酸構築物の発現産物は、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1の活性を阻害し、アポトーシスを誘導することがわかった。実施例 3

テロメラ一ゼプロモーターの支配下にテトラサイクリントランスァクチべ一夕一を連結させ、癌細胞特異的にテトラサイクリントランスァクチベータ一を発現させるためのベクター 1を作製する。

また、実施例 1の核酸構築物の上流に Te t Op最小プロモーターを連結し、実施例 1と同様に発現ベクターを作製する（ベクター 2) 。

得られたベクター 1とベクター 2とを樹立された癌細胞及び樹立されていない癌細胞のそれぞれを導入する。

その結果、細胞が、球形に形態変化を起こし、クロマチン凝集、核の分断化を示すことを指標として、核酸構築物の発現産物の効果を評価する。実施例 4

実施例 3で得られたベクタ一 1とベクター 2とを、固形癌モデルに、血管内投与又は該モデルの癌細胞に局所的に注入する。

その結果、固形癌の大きさの変化を指標として、癌に対する発現産物の効果を評価する。実施例 5

COS - 7細胞において、 PKB a— GFPと、 <5 AL P I F— G F P又は対照として GF Pとを共発現させた。

ついで、抗 GF P抗体又は PKBの a c t i v a t i on l o opのリン酸化スレオニンを認識する抗リン酸化 P KB (Th r 308) 抗体を用い、ウェスタンプロット解析を行なった。結果を図 4に示す。

図 4のパネル Aに示されるように、発現させた目的のタンパク質が、それぞれ目的のサイズを保持していることがわかる。また、 PKB 一 GFPの発現量は、 ? 8ひー0 ？と0??とを共発現させた(：03— 7細胞及び？1^80!— Pと δ ALP I F— GFPとを共発現させた COS— 7細胞の間でほぼ等しいことがわかる。また、パネル Bに示されるように、 <5 ALP I F— GFPを共発現させた場合 (レーン 2) 、 GFPを共発現させた場合（レーン 1) に比べ、 PKB «— GF Pのバンドが薄く認識されており、 <5 ALP I F— GFPが PKB CK— GFPのァクチべ一シヨンルーペのリン酸化を抑制していることがわかる。なお、この抗体は、 δ ALP I F— GFPのリン酸化も認識している。実施例 6

前記実施例 1で得られた発現べクタ一のうち、偽基質 δ AL— P I F-GFP の発現プラスミドベクター及び偽基質 Lyn s i g— — P I F— GFPの発現プラスミドベクターのそれぞれを、エレクト口ポレーシヨン法により、癌由来培養細胞（COS— 7細胞及び PC— 12細胞）に導入した。

また、前記偽基質の発現プラスミドベクタ一と、 GSTと PDK— 1との融合タンパク質（GST— PDK— 1) の発現プラスミドベクターとを、エレクト口ポレーシヨン法により、癌由来培養細胞（COS— 7細胞及び PC— 12細胞）に導入した。

なお、前記 GST—PDK— 1の発現プラスミドベクタ一は、ヒト PDK— 1 をコードする cDNAの 5' 側に、ダル夕チオン一 S—トランスフェラ一ゼ (G ST) をコードする cDNAを付加し、得られた核酸構築物を、前記実施例 1の場合と同様のプラスミドベクターに連結することにより作製したベクタ一である。対照として、前記偽基質の発現ベクターの代わりに、 GFPの発現べクタ一を、前記 C〇 S— 7細胞及び P C— 12細胞それぞれに導入した。

遺伝子導入 48時間後に、 GFPに由来する蛍光を呈する細胞のうち、アポト一シスを起こしている細胞を計数し、アポトーシス誘導率を算出した。なお、ァポトーシス誘導細胞は、細胞核を慣用の方法で染色し、蛍光顕微鏡下、クロマチン凝集と核の分断化とを指標として判定した。

また、 COS— 7細胞での結果を表 1に、 PC— 12細胞での結果を表 2に示す。なお、表中、 *は、 p<0. 05 V s GFP [Bon f e r r on i mu l t i p l e c omp a r i s on s t e s t〕、 #は、 p 0. 05 v s 偽基質のみ、 ##は、 pく 0. 01 V s 偽基質のみ〔unp a i r e d t - t e s t] を示す。また、結果は、 3連の平均を示す。表 1

その結果、表 1及び表 2に示されるように、対照である GF Ρのみを発現した細胞と比較すると、 COS— 7細胞及び P C— 12細胞のいずれにおいても、 δ AL— P I F— GFPの発現によりアポトーシスを示す細胞の割合 (%) は有意に増加した。

また表 1及び表 2に示されるように、 Lyn s i g- δ AL-P I F-GFP を発現させた場合、対照である GFPのみを発現した細胞と比較して、 COS— 7細胞においては、有意にアポトージスを示す細胞の割合の増加を引き起こし、 PC- 12細胞においても、アポトーシス誘導細胞数は増加した。

したがって、偽基質 δ AL— P I F— GFPの発現及び偽基質 Lyn s i g— δ AL— P I F— GFPの発現により、癌由来培養細胞において、有意にアポト —シスを誘発することがわかった。さらに、前記偽基質とともに GST— PDK— 1を発現させた場合、表 1及び表 2に示されるように、 GST— PDK— 1と SAL— P I F— GFPとの共発現により、アポ卜一シスは COS— 7細胞及び PC- 12細胞の両方で有意に抑制された。

まかかる結果より、外因的に PDK— 1を過剰発現させることにより、偽基質の効果が弱まると考えられたので、前記偽基質によるアポトーシスは、内因性の PDK-1を介して起こっていることが示唆された。配列表フリーテキスト

配列番号： 1は、 PKB/Ak tの a c t i v a t i on l o o pの配列である。

配列番号： 2は、 6 PKCの a c t i v a t i on l o opの配列である。配列番号： 3は、 PDK— 1相互作用断片（P I F) の配列である。

配列番号： 4は、 Lynの配列である。

配列番号： 5は、 PKBAL— P I Fから産生した PDK— 1の阻害剤の配列である。

配列番号： 6は、 PKBAL— P I F— GFPから産生した PDK— 1の GF P結合阻害剤の配列である。

配列番号： 7は、 δ AL— P I Fから産生した PDK— 1の阻害剤の配列である。

配列番号： 8は、 δ AL— P I Fから産生した GFP結合阻害剤の配列である。配列番号： 9は、 a c t i v a t i on l o opの部分配列である。産業上の利用可能性

本発明により、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1の活性の異常に起因する疾患、癌等への治療手段の開発を行なうことができる。

Claims

請求の範囲

1. (A) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列、

(C) 配列番号： 1又は 2に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTアルゴリズム (Co s t t o o p e n g ap 11, Co s t t o e x t e n d g ap 1, e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるアミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列と、

(a) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列、

(c) 配列番号： 3に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTアルゴリズム (Co s t t o o e n g ap 1 1， Co s t t o e x t e nd g a p 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるァミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列とを含有し、かつ生体内において、ホスホィノシチド依存性プロティンキナ一ゼ 1の活性を阻害しうる活性阻害物質をコードする核酸を含有してなる、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1 の活性阻害物質の発現用核酸構築物。

2. 活性阻害物質をコードする核酸が、

( i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列、 ( i i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列において、少なくとも 1個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入又は付加を有するアミノ酸配列、及び

( i i i) 配列番号： 4に示されるアミノ酸配列に対し、 BLASTァルゴリズム (Co s t t o o e n g ap 1 1, Co s t t o e t e nd g ap 1， e xp e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26%であるァミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列

をコードする核酸の下流に作動可能に連結されてなる、請求項 1記載の発現用核酸構築物。

3. 活性阻害物質をコードする核酸が、テロメラ一ゼプロモーター支配下に発現する、請求項 1又は 2記載の発現用核酸構築物。

4. 請求項 1〜3いずれか 1項記載の発現用核酸構築物を保持してなる、哺乳動物細胞における 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1の活性阻害物質の発現用担体。

5. 請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物又は請求項 4記載の発現用担体を有効成分として含有してなる、 3 _ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性に起因する疾患の治療剤。

6. 疾患が、癌である、請求項 5記載の治療剤。

7. 請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物の発現産物を有効成分として含有してなる、 3一ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性に起因する疾患の治療剤。

8. 発現産物が、

(I I I) 配列番号： 5又は配列番号： 7に示されるアミノ酸配列に対し、 BL AS Tアルゴリズム（Co s t t o o p e n g a p 1 1, Co s t t o e x t e nd g ap 1 , e x e c t v a l u e 10, wo r d s i z e 3) によりアラインメントされ、算出された配列同一性が、少なくとも 26 %であるアミノ酸配列、

からなる群より選ばれたアミノ酸配列を含有したポリペプチドである、請求項 7 記載の治療剤。

9. 請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物又は請求項 4記載の発現用担体を、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患に罹患した個体に、治療上有効量投与する、 3—ホスホイノシチド依存性プロティンキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療方法。

10. 3—ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ 1によるリン酸化活性の異常に起因する疾患の治療用医薬組成物の製造のための、請求項 1〜 3いずれか 1項に記載の発現用核酸構築物又は請求項 4記載の発現用担体の使用。