CN104271590A - 用于癌治疗的肽剂 - Google Patents
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Abstract
在此提供了用于抑制癌细胞生长的肽,这些肽包括氨基酸序列RxKxKxxxxR,其中K和R分别是赖氨酸和精氨酸氨基酸残基,每个x独立地是一种氨基酸,并且其中该肽与氨基酸序列RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)具有50%或更小的氨基酸序列一致性。每个x氨基酸可以独立地是选自下组的氨基酸残基,该组由以下各项组成:丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、和丝氨酸(S)氨基酸残基。在此还提供了包含氨基酸序列10RxKxKxxxxR的肽的嵌合蛋白,编码该肽的核酸、用于表达该肽的包括编码该肽的核酸的表达载体、以及用于使用该肽以便抑制癌细胞生长的方法。
Description
发明领域
本发明涉及用于抑制癌细胞生长和/或增殖的试剂。
发明背景
整合素包括由提供细胞外基质和细胞内信号传递分子之间的功能性和结构性桥接的α/β异源二聚体亚基构成的细胞粘着受体的一个家族(Hynes(海因斯)RO,1992)。卵巢癌中αvβ6整合素的表达可以有助于卵巢癌的侵袭潜力(Ahmed(艾哈迈德)N.等人,2001;Ahmed(艾哈迈德)N.等人,2002),并且结肠癌中αvβ6整合素的表达已经被鉴别为患有这一疾病的患者中的更坏结果的独立预兆指示物(Bates(贝茨)RC.等人,2005)。位于β6整合素亚基的胞质尾区内的15mer氨基酸序列RSKAKWQTGTNPLYR(SEQ ID No.1)结合至胞外信号调节的激酶2(ERK2),并且它已经被提出有助于肿瘤生长(Ahmed(艾哈迈德)N.等人,2002)。
衍生自β6结合序列的非天然发生肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)已经被报道抑制癌细胞生长,这可能至少是部分由于c-Src活性被该肽抑制(Agrez(阿格莱兹)MV.等人,2011)。
值得注意地,在此序列内存在形成磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域的规范识别序列的一部分的β整合素胞质结构域共有的NPxY/F(SEQ IDNo.3)基序。的确,NPxY/F(SEQ ID No.3)基序存在于衍生自对应于RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽的β2、β3和β5整合素亚基的氨基酸序列中,还已经示出所有这些都是抗癌肽并且结合ERK2(参见国际专利申请WO 2005/037308),反映了该基序的明显的重要性。PTB结构域是多种信号的和细胞骨架的蛋白中存在的蛋白模块。例如,已经提出,NPxY(SEQ ID No.4)基序中的酪氨酸(Y)残基的磷酸化表示在质膜的细胞质面处调节整合素与其他蛋白的相互作用的模式(Takada(高田)Y.等人,2007)。已经由Filardo(费加罗)和同事强调了高度保守的NPxY(SEQ ID No.4)基序在调节整合素介导的功能中的基本作用,他们示出在β3胞质尾区内的NPxY(SEQ ID No.4)基序对于黑色素瘤细胞的细胞迁移和转移表型中涉及的αvβ3依赖的配体结合后事件而言是必需的(Filardo(费加罗)EJ,1995)。
发明概述
本发明涉及意外的发现,虽然衍生自β6整合素亚基的肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)内的NPxY(SEQ ID No.4)基序对于癌细胞生长抑制性活性是必需的,但其中NPxY(SEQ ID No.4)基序和除了带电氨基酸精氨酸(R)和赖氨酸(K)之外的其他氨基酸残基已经被取代为不同氨基酸的肽的改性形式在抑制癌细胞增殖时,与RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽基序基本上一样有效。这一令人惊讶的观察结果允许提供待合成的一系列肽,在本发明的至少一些实施例中,这些肽可以抑制细胞激活途径中涉及的多种激酶的活性,为预防或治疗癌提供了新的替代方案。
具体地,在本发明的一个方面中,提供了用于抑制癌细胞生长的分离的或纯化的肽,该肽包括氨基酸序列RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5),其中K和R分别是赖氨酸和精氨酸氨基酸残基,每个x独立地是氨基酸,并且该肽与氨基酸序列RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)具有50%或更少的氨基酸序列一致性。
在至少一些实施例中,该肽与氨基酸序列RSKAKNPLYR(SEQ IDNo.2)具有50%序列一致性。在其他实施例中,该肽与RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)具有40%氨基酸序列一致性。
在由本发明体现的肽中的x氨基酸可以是彼此相同或不同的。
典型地,每个x氨基酸独立地是选自下组的氨基酸残基,该组由以下各项组成:丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)、和丝氨酸(S)氨基酸残基。
典型地,每个x独立地是非极性氨基酸。更典型地,每个x氨基酸独立地是丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。
在另一个方面,提供了编码由本发明体现的肽的分离的核酸。
在另一个方面,提供了包含编码由本发明体现的肽的核酸用于在细胞中表达该肽的表达载体。
可以将由本发明体现的肽或核酸连接至易化子(facilitator)部分,用于协助肽或核酸跨越癌细胞的外层细胞膜进入细胞。然而,这并不是必需的,可以采用协助肽或核酸进入细胞的不同其他方法。可替代地,由本发明体现的肽可以具有跨越外层细胞膜进入癌细胞的细胞质的固有能力。
在另一个方面中,提供了用于抑制癌细胞生长的试剂,该试剂包括连接至易化子部分的由本发明体现的肽或核酸,该易化子部分用于协助肽或核酸跨越癌细胞的外层细胞膜进入细胞。
在另一个方面,提供了包括由本发明体现的肽、核酸或试剂连同药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。
在另一个方面,提供了用于抑制癌细胞生长或增殖的方法,该方法包括使细胞与有效量的由本发明体现的肽、核酸或试剂接触。
在另一个方面,提供了用于预防或治疗哺乳动物体内的癌的方法,该方法包括给予哺乳动物有效量的由本发明体现的肽、核酸或试剂。
在另一个方面,提供了用于预防或治疗哺乳动物体内的癌的方法,该方法包括用有效量的由本发明体现的肽或试剂治疗哺乳动物。将理解,治疗可以包括给予有效量的编码肽的用于在哺乳动物癌细胞中表达肽的核酸。
在另一个方面,提供了用于抑制细胞中至少一种蛋白激酶的活性的方法,该方法包括用由本发明体现的至少一种肽、核酸或试剂处理细胞。
典型地,该激酶选自下组,该组由以下各项组成:
c-Src和Akt非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族中的至少一种激酶。
典型地,该肽抑制细胞中Akt2和Akt3中至少一种的活性。
在另一个方面,提供了由本发明体现的肽、核酸或试剂,用于在预防或治疗哺乳动物体内的癌中使用。
仍在本发明的另一个方面,提供了由本发明体现的肽、核酸或试剂在制造用于预防或治疗哺乳动物体内的癌中的用途。
术语“肽”在此与“多肽”可互换地使用。
术语“抗癌肽”是指可以抑制癌细胞生长和/或增殖的肽。在一些实施例中,该肽可以连接至如在此描述的易化子部分而给予,用于协助该肽进入癌细胞。
术语“癌”是指任何类型的恶性的、未经调节的细胞增殖。癌可以选自下组,该组由以下各项组成,但不局限于:上皮细胞癌、癌症(carcinomas)、肉瘤、淋巴瘤和血细胞癌,包括白血病,例如骨髓性白血病、嗜酸性粒细胞白血病和粒细胞性白血病。
从非限制性实施例的以下详细说明,本发明的特征和优点将变得进一步明显。
附图简要说明
图1:图像示出与肽RKKR(SEQ ID No.6)、ASAAANPLYA(SEQ IDNo.7)和RKRK(SEQ ID No.8)相比,在无血清条件下培养并且暴露于肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)72小时的HT29结肠癌细胞。
图2:图像示出与肽RSKAKR(SEQ ID No.9)、RSKAKNPLAR(SEQID No.10)和RSKAKNPLAR(SEQ ID No.11)相比,在无血清条件下培养并且暴露于肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)72小时的HT29结肠癌细胞。
图3:图像示出与肽RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQ ID No.12)和RAAKAARAAK(重组的10Ala)(SEQ ID No.13)相比,在无血清条件下培养并且暴露于肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)72小时的HT29结肠癌细胞。
图4:图像示出在无血清条件下培养并且暴露于多种肽72小时的HT29结肠癌细胞,肽RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQ ID No.12)与肽KAKAKAAAAK(SEQ ID No.14)、RARAKAAAAK(SEQ ID No.15)和RARARAAAAR(SEQ ID No.16)相比,。
图5:图像示出与肽RAKARAAAAK(SEQ ID No.17)、KARARAAAAK(SEQ ID No.18)和RβAKβAKβAβAβAβAR(SEQ ID No.12)相比,在无血清条件下培养并且暴露于肽RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQ ID No.12)72小时的HT29结肠癌细胞。
图6:图像示出与肽RAKAK(SEQ ID No.19)、RAKAKAAAR(SEQID No.20)和RAKAKAAAAAR(SEQ ID No.21)相比,在无血清条件下培养并且暴露于肽RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQ ID No.12)72小时的HT29结肠癌细胞。
图7:图像示出与肽RSKSKSSSSR(SEQ ID No.22)、RGKGKGGGGR(SEQ ID No.23)和RVKVKVVVVR(SEQ ID No.24)相比,在无血清条件下培养并且暴露于肽RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQID No.12)72小时的HT29结肠癌细胞。
图8:图像示出在无血清条件下培养并且暴露于肽RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQ ID No.12)72小时的前列腺癌细胞系(DU145)、乳腺癌细胞系(MCF-7)和卵巢癌细胞系(A2780)。
图9:显微照片示出FITC标记的肽FITC-KRAKAKAAAAR(FITC-K10(4)Ala)(SEQ ID No.25)通过癌细胞的内化。
图10:图像示出在含5%血清培养基中培养并且暴露于肽RVKVKVVVVRRRRRRRRR(10RVK Arg)(SEQ ID No.26)48小时对比8mer聚精氨酸肽的MDA468乳腺癌细胞。
图11:图像示出在含5%血清培养基中培养并且暴露于肽RVKVKVVVVRRRRRRRRR(10RVK Arg;实心菱形)(SEQ ID No.26)、RVKVKVVVVRRRRRRRR(10RVK 7Arg;实心方块)(SEQ ID No.27)、或RRRRRRRRRVKVKVVVVR(Arg 10RVK;实心三角)(SEQ ID No.28)48小时的MDA468乳腺癌细胞。
图12:图像示出在含5%血清培养基中培养并且暴露于肽RVKVKVVVVRRRRRRRRR(10RVK Arg;实心菱形)(SEQ ID No.26)、RVKVKVVVVRRRRRRRR(10RVK 7Arg;实心方块)(SEQ ID No.27)、或RRRRRRRRRVKVKVVVVR(Arg 10 RVK;实心三角)(SEQ ID No.28)48小时的DU145前列腺癌细胞。
本发明的示例性实施例的详细说明
在细胞膜上通过酪氨酸激酶受体激活的主要生长信号传导途径之一是PI3激酶/Akt/mTOR途径。
该丝氨酸/苏氨酸Akt(也称为蛋白激酶B(PKB))亚家族包括三种哺乳动物亚型Akt1、Akt2和Akt3(分别是PKBα、PKBβ和PKBγ)。Akt功能为用于转导细胞外的(生长因子和胰岛素)与细胞内的(受体酪氨酸激酶Ras与Src)致癌信号的关键节点。此外,Akt的异位表达,尤其是组成型激活的Akt,足以诱导转基因小鼠中的细胞致癌性转化和肿瘤形成连同化学抗性(Cheng(程)JQ等人,2005)。激活的Akt是可检测的并且已经被报道为对于很多类型的癌而言差的预测因子(Dennis(丹尼斯)PA,2008)。已经提出,Akt3会有助于更侵犯性的临床表型,这些表型特征在于雌激素受体阴性的乳腺癌和雄激素不敏感的前列腺癌(Nakatani(中谷)K.等人,1999)。的确,Akt2被认为是对于细胞存活而言是必需的并且在恶性转化中是重要的,并且已经在80种原发性乳腺癌中的32种中鉴别到升高的Akt2水平(Sun(孙)M.等人,2001)。此外,在一些人类卵巢癌和胰腺癌中已经发现Akt2推定癌基因被扩增并且过表达(Cheng(程)JQ等人,1996)。
不希望受理论限制,本发明体现的肽的抗癌活性可以至少部分地归因于在癌细胞中抑制至少一些蛋白激酶的能力。该肽可以经由肽与一种或多种激酶的直接相互作用或通过间接机制抑制一种或多种激酶的活性。然而,本发明并不局限于这些肽用于治疗任何具体类型的癌的用途,以及癌的细胞是否表现出一种或多种激酶的上调水平的活性。
氨基酸序列RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)的一个或多个氨基酸可以是β-氨基酸、D-氨基酸、或合成的氨基酸。
此外,氨基酸序列RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)中的每个x氨基酸可以独立地被选择并且可以是并不由遗传密码涵盖的氨基酸。
典型地,每个x氨基酸可以选自下组,该组由以下各项组成:丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)和丝氨酸(S)氨基酸残基,但不局限于这些氨基酸。
典型地,每个x氨基酸独立地是在附接至氨基酸残基的α碳(Cα)的侧链中具有末端甲基的氨基酸,例如丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)或苏氨酸(T)残基。
典型地,RxKxKxxxxR肽(SEQ ID No.5)(可以写作Rx1Kx2Kx3x4x5x6R)在位置x1并不具有丝氨酸(S)或苏氨酸(T)(这二者是极性氨基酸)。
典型地,在RxKxKxxxxR肽(SEQ ID No.5)的位置x6中的氨基酸是选自丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、或异亮氨酸(I)的非极性氨基酸。
更典型地,每个x氨基酸独立地是选自上组的“非极性”氨基酸。
在至少一些实施例中,式RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)的肽包括仅三种不同氨基酸,即精氨酸(R)、赖氨酸(K)和一个其他氨基酸。
在特别优选的实施例中,每个x氨基酸独立地是丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。在一些实施例中,所有x氨基酸都是丙氨酸(A),而在其他实施例中,x氨基酸都是缬氨酸(V)残基。仍在另外的实施例中,x氨基酸是丙氨酸(A)和缬氨酸(V)氨基酸的混合物。
当RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)氨基酸序列的每个x氨基酸都是丙氨酸残基时,该肽将与RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽具有50%序列一致性,其条件是肽已经包括一个丙氨酸氨基酸(加下划线的)。在其他实例中,例如当所有x氨基酸都是缬氨酸时,由本发明体现的肽将与RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽具有40%氨基酸序列一致性。因此,如在此所述的肽可以与RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽具有40%或50%序列一致性。
在至少一些实施例中,由本发明体现的肽可以包括RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)序列的二聚体。在一些这样的实施例中,可以通过在添加至每个RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)序列的N末端的各自的半胱氨酸(C)残基之间的二硫桥键的形成提供该二聚体,由此该二聚体具有总体氨基酸序列RxxxxKxKxRC-s-s-CRxKxKxxxxR(SEQ ID No.29),该二硫桥键表示为-s-s-。
另外,在至少一些实施例中,根据本发明的肽可以具有连接至该肽的N和/或C末端的一个或多个带正电的氨基酸残基。例如,如以下进一步讨论,从1至8个或更多个额外的带正电的氨基酸可以提供在RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)肽的N和/或C末端。例如,带正电荷的氨基酸可以独立地选自赖氨酸、精氨酸和组氨酸。在至少一些实施例中,每个另外的带正电荷的氨基酸是赖氨酸(K)残基。在其他实施例中,单个的这样的带正电荷的氨基酸可以被各自连接至该肽的N和/或C末端。带正电荷的一个或多个氨基酸(例如赖氨酸)的添加可以协助将氟代异硫氰酸酯(FITC)或其他标记连接至该肽。
当序列是处于比较的目的最佳对齐时,如在此所述的氨基酸序列之间的序列一致性可以通过比较在序列中的每个位置的氨基酸来确定。可以使用任何适合的程序或算法(例如像通过Needleman(尼德曼)和Wunsch(温施)算法(Needleman(尼德曼)和Wunsch(温施),1970)来进行序列的比对。使用标准软件程序(例如是Wisconsin Package版本10.1的一部分的GAP(Genetics Computer Group公司,麦迪逊,威斯康星州,美国),使用具有50的空位产生罚分和3的空位拓展罚分的默认评分矩阵,可以方便地进行计算机辅助的序列比对。用于比较的序列的比对的其他方法也是熟知的,例如但不局限于Smith(史密斯)和Waterman(沃特曼)(1981)的算法,以及Pearson(皮尔森)和Lipman(李普曼)(1988)的算法,此类算法的计算机化实施(例如BESTFIT、FASTA和BLAST),以及通过序列的手工比对和检验。
可以通过有技能的读者熟知的合成的或重组的技术来提供由本发明体现的肽。另外,在此所述的肽可以结合不由遗传密码编码的一个或多个氨基酸,或者一个或多个氨基酸类似物。例如,由本发明体现的肽可以包括一个或多个D-氨基酸而不是L-氨基酸。的确,根据本发明的肽可以部分地或完全地由D氨基酸组成。因此,在一些实施例中,这一种或多种肽可以包括L-氨基酸、D-氨基酸或L-氨基酸和D-氨基酸的混合物。与对应的L-肽相比,包括D-氨基酸的肽的合成可以抑制肽酶活性(例如内肽酶),并且由此增强稳定性并且增加肽的体内半衰期。
同样,可以修饰由本发明体现的肽的N末端和/或C末端,来进行保护,对抗或抑制体内由肽酶降解。例如,肽的C末端可以被酰胺化,用来进行保护,对抗肽酶降解。可以用多个乙二醇单体单元可替代地将如在此所述的肽的N-或C-末端聚乙二醇化,用来使它对体内蛋白酶降解更具抗性或者抑制它们从循环中经由肾的清除。用于将肽聚乙二醇化的方法在本领域是熟知的,并且所有此类方法都明确涵盖在内。典型地,用于由本发明体现的方法的聚乙二醇化肽将连接至2个或更多个聚乙二醇(PEG)单体单元,并且一般是从约2至约11个PEG单体(即(PEG)n,其中n等于从2至11)。最通常地,n将是2。
可以将由本发明体现的肽环化,用来提供增强的硬度,以及由此而来的体内稳定性,和/或将其连接至一个或多个部分,这些部分改进溶解度、亲脂特征来增强细胞摄取,稳定性或生物半衰期、降低的细胞毒性,或例如充当用于随后的检测等的标记。如在此所述的肽还可以生成自翻译后或合成后修饰,例如碳水化物部分的附接或导致一个或多个结构改变的化学反应,例如氨基酸残基的烷基化或乙酰化,或涉及化学键形成的其他改变。
根据本发明的方法,在一些实施例中,肽的树状聚合物可以用于将肽递送至癌细胞。在本发明的至少一些实施例中,肽的树状聚合物呈现了连接至聚氨基酸的分枝框架的根据本发明的肽的单元(典型地是赖氨酸分枝单元)。该树状聚合物将典型地具有至少3个层的/代的氨基酸分枝单元,由本发明体现的肽的单元连接至最外层的/代的氨基酸分枝单元,这样使得该树状聚合物呈现了至少8个或更多个单元的肽(例如8、9或10或12个单元)。由树状聚合物呈现的本发明的活性肽的单元可以是肽的单体单元、多聚体单元和/或单体单元和多聚体单元的混合物。此外,可以设计树状聚合物用于在细胞质中释放由本发明体现的一种或多种肽。例如树状聚合物框架可以包括用于在细胞内被一种或多种蛋白酶切割或水解的位点,以便释放本发明的一种或多种肽。
由本发明体现的肽可以结合至形成树状聚合物的框架的聚氨基酸分枝单元的最外层/代,或在树状聚合物的聚氨基酸分枝单元上进行合成组装。在由本发明体现的一个或多个方法中有用的树状聚合物的合成可以通过发散性合成或汇集合成策略而实现。如在此所述的多肽可以连接的适合的肽树状聚合物框架,以及用于提供肽树状聚合物的方法,例如描述于Lee(李)等人,2005;Sadler(萨德勒)和Tam(塔姆),2002;以及Cloninger(克洛宁格),2002,这些文献的全部内容通过交叉引用以其全文结合在此。用于本发明体现的方法的由树状聚合物呈现的一种或多种肽还可以被针对蛋白降解而进行N-或C-末端保护(例如通过酰胺化、聚乙二醇化等)。
由本发明体现的肽的肽模拟物都明确涵盖在此。例如,肽模拟物可以包括可以用氨基酸类似物取代由本发明体现的肽的一个或多个氨基酸,其中这一个或多个氨基酸类似物基本上并不减小本发明的亲本肽的抗癌活性,如可以通过MTT试验等进行评估。
典型地,由本发明体现的肽将具有约60个氨基酸或更少的长度。通常,该肽将具有高达约50个氨基酸、45、40、35、30、25、20或15个氨基酸的长度。例如,该肽可以具有10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个氨基酸或更多,例如高达30、35、40、45、50或60个氨基酸的长度。然而,将理解,在以上鉴别的那些内的所有特定长度和长度范围的肽被明确涵盖在内(例如10至12个氨基酸、10至13个氨基酸、10至14个氨基酸、10至15个氨基酸、10至16个氨基酸、10至17个氨基酸、10至18个氨基酸、10至19个氨基酸、10至20个氨基酸、10至21个氨基酸、10至22个氨基酸、10至22个氨基酸、10至23个氨基酸、10至24个氨基酸、10至25个氨基酸等)。
长于10个氨基酸的根据本发明的肽或在由本发明体现的方法中有用的肽会被适应在细胞内切割,用于释放包括RxKxKxxxxR(SEQ IDNo.5)氨基酸序列的更短的肽。例如,更长的肽可以包括用于切割的酶切割位点,用于在宿主或癌细胞内释放更短的RxKxKxxxxR(SEQ IDNo.5)序列或包括RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)序列的氨基酸序列。本发明明确提供了包括具有或不具有用于在细胞上或细胞内释放肽的酶切割位点的由本发明体现的肽的嵌合蛋白/多肽(即融合蛋白)。
可以化学合成或使用常规重组技术产生由本发明体现的肽和融合蛋白。例如通过采用平末端和寡核苷酸接头,按情况消化来提供交叉末端(staggered termini),并且连接粘性末端,以便连接编码具有希望的一个或多个氨基酸序列的肽的分开的cDNA片段,可以提供编码融合蛋白的核酸。可替代地,采用造成具有可以随后连接在一起的互补末端的扩增子的引物,可以利用DNA片段的PCR扩增。
根据本发明的肽或融合蛋白可以被体外表达并且纯化自细胞培养,用于给予哺乳动物受试者,或者可以用编码该肽或融合蛋白的核酸转染该受试者的靶细胞(例如癌细胞),用于利用一种或多种宿主细胞的细胞转录元件和翻译核糖体复合物体外表达核酸。
为了表达编码由本发明体现的肽或融合蛋白的核酸,典型地将首先将核酸引入克隆载体并且在宿主细胞中扩增,然后切离该核酸并且将其并入一种或多种适合的表达载体,用于转染细胞。可以设计表达载体用于表达独立于宿主细胞的基因组DNA的核酸插入物,或者用于定位的、同源的、或异源的重组进入宿主细胞的基因组DNA,以便在宿主细胞中随后表达核酸插入物。
典型的克隆载体(例如粘粒)包含用于允许有效复制载体的复制起点(ori)、用于使能够选择用载体转化的宿主细胞的报道子或标记基因、以及用于协助插入并且随后切离感兴趣的核酸序列的限制性内切酶切割位点。优选地,克隆载体具有包含一些限制酶切位点的多聚接头序列。标记基因可以是药物抗性基因(例如用于氨苄青霉素抗性的Ampr),编码酶(例如氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-内酰胺酶、腺甙脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶(HPH)、胸苷激酶(TK)、或例如由大肠杆菌lacZ基因(lacZ')编码的β-半乳糖苷酶)的基因。酵母报道子基因包括咪唑甘油磷酸酯脱水酶(HIS3)、N-(5'-磷酸核糖酰)-邻氨基苯甲酸异构酶(TRP1)和β-异丙基苹果酸脱氢酶(LEU2)。如将理解,本发明的表达载体还可以包含这类标记基因。
可以使用的克隆载体包括用于哺乳动物细胞、酵母细胞和昆虫细胞的克隆载体。可以发现应用的具体载体包括基于pBR322的载体和pUC载体,例如pUC118和pUC119。
适合的表达载体包括能够表达DNA(例如基因组DNA或cDNA)插入物的质粒。表达载体将典型地包括向其可操作地连接插入的核酸序列的转录调控序列。“可操作地连接”是指将核酸插入物连接至转录调控序列,用于允许插入序列的转录而不移入插入物的阅读框。此类转录调控序列包括用于协助RNA聚合酶的结合来启动转录的启动子、用于使核糖体能够结合至转录的mRNA的表达控制元件、以及用于调节启动子活性的增强子。启动子可以是组织特异性启动子,有助于核酸插入物仅在特定细胞谱系中转录,并且不在其他细胞类型中转录,或者只至较低水平在此类其他细胞类型中转录。表达载体的设计将取决于在转染的宿主细胞、转染模式、以及核酸插入物的转录的希望的水平。
适合转染原核生物(例如细菌)或真核生物(例如酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞)的多种表达载体是本领域已知的。适合转染真核细胞的表达载体包括pSV2neo、pEF.PGK.puro、pTk2、pRc/CNV、pcDNAI/neo,包含聚腺苷酸化位点和延长因子1-α启动子的非复制型腺病毒穿梭载体以及最优选地包含巨细胞病毒(CMV)启动子的基于pAdEasy的表达载体。为了在昆虫细胞中表达,可以利用杆状病毒表达载体,它的实例包括基于pVL的载体,例如pVL1392、和pVL941,以及基于pAcUW的载体,例如pAcUW1。根据本发明的实施例,在哺乳动物细胞中,用于表达核酸插入物的优选表达载体包括具有CMV或延长因子1α的质粒,例如pEF.PGK.puro(Huang(黄),David(大卫)C.S.等人,1997)。pEF.PGK.puro质粒包含SV40起点、EF-1α启动子、多克隆位点和polyA区,并且特别优选的用于表达编码根据本发明的肽或嵌合蛋白的核酸插入物。
如在此描述,用于预防或治疗癌的由本发明体现的肽和核酸的细胞内递送可以利用“易化子部分”实现,该“易化子部分”用于协助或核酸穿过或易位跨过外部细胞/细胞质膜进入细胞质和/或细胞核,例如是一个运载体肽。如在此所述的易化子部分可以协助由本发明体现的肽、试剂或核酸以多种方式中的任一种进入癌细胞,并且本发明并不局限于任何具体机制。例如,涉及的机制可以包括直接穿透进入细胞(例如经由增强的细胞膜溶解度或在细胞膜中形成瞬时孔隙),胞吞介导的细胞进入(例如经由与细胞相互作用、表面表达的受体、或大胞饮),以及经由在细胞膜上形成暂时结构的细胞进入。在其范围内,术语“一种或多种运载体肽”包括一个或多个细胞穿透肽(CPP)。在本领域已知的运载体肽包括穿透素及其片段或变体,人类免疫缺陷病毒Tat衍生肽,转运蛋白衍生肽,阳离子肽(例如聚精氨酸)(进一步参见以下),两亲性肽例如MPG和PEP-1(例如参见美国专利号6,841,535),信号肽,并且可以采用任何适合的此类肽易化子部分。特别适合的信号肽描述于美国专利号5,807,746中,其内容以其全文结合在此。用于Kaposi(卡波西)成纤维细胞增长因子(K-FGF)的信号肽由以下组成,或者包含以下:氨基酸序列AAVALLPAVLLALLA(SEQ ID No.30)或AAVALLPAVLLALLAP(SEQ ID No.31)是可以采用的运载体肽的具体实例。同样,在至少一些实施例中,可以利用PEP-1肽。并不必需的是,用于本发明的方法中的运载体肽是完整的肽,并且可以利用其活性片段或修饰的或变体的形式,它们保留跨越外部细胞膜或者以另外方式易位进入靶细胞的能力,用来将附接的货物肽、核酸或核酸构建体有效递送进细胞质或细胞核。
除了载体肽,易化子部分可以是脂质部分或其他非肽部分(例如碳水化合物部分),它增强根据本发明的抗癌肽的细胞膜溶解度,用于跨越靶细胞的外部细胞膜或由此协助使肽进入细胞。例如,脂质部分可以选自甘油三酸脂,包括混合甘油三酸酯。还可以使用脂肪酸,并且具体地是C16–C20脂肪酸。典型地,脂肪酸将是饱和脂肪酸,并且最通常是硬脂酸。本发明并不局限于使用任何此类非肽易化子分子,并且可以使用提供希望的细胞膜溶解度并且是生理学上可以接受的任何分子。
仍在另一个实施例中,由本发明体现的肽可以轭合有一种轭合剂,用于与标记的、信号的、或其他分子(例如造影剂、显像剂、生物素、链霉亲和素、放射性同位素、荧光染料、化学发光剂、化学发光基团、生物发光剂、酶或其结合片段(例如Fab和F(ab)2片段)、一种或多种磁性颗粒、等)形成复合物,以便检测该肽。如将理解,由本发明体现的肽可以连接至易化子部分(用于协助该肽进入靶细胞)和轭合剂,该轭合剂与或用于与标记、信号分子、放射性同位素或类似物复合,以便利用适合的成像技术(例如核磁共振成像(MRI))检测在细胞内的肽。DOTA(1,4,7,10-四氮杂环癸烷-1,4,7,10-四乙酸)是可以使用并且可以与一系列化合物复合的轭合剂的实例,这些化合物用于在癌治疗和诊断中使用,例如是单克隆抗体、放射性同位素、以及金属阳离子(例如钙和钆)。在特别优选的实施例中,由本发明体现的肽可以轭合至与钆复合的DOTA(Sturzu(斯图尔祖)A等人,2008),作为用于使靶细胞成像的造影剂。
在另一个实施例中,根据本发明的肽可以与典型地大小为1-30nm的金纳米粒子轭合,通过分枝金粒子的激光辐射,用于使靶细胞成像或用于靶细胞的辅助细胞死亡。已经报道了转移跨越质膜和核膜的金纳米粒子(de la Fuente(德拉福恩特)J.M.和Berry(拜里)C.C.,2005)。然而,由本发明体现的肽可以直接被一个标记标签化的、信号的或其他分子(例如放射性同位素),用于针对标靶癌细胞检测该肽或发挥治疗效果(例如细胞毒性)。
可以按任何常规已知方式,例如通过各自的接头,将由本发明体现的肽或核酸连接至易化子部分(例如肽或树状聚合物/树状聚合物框架)和/或轭合剂。例如,可以使用交联试剂,借助肽键,或经由非肽共价键,通过氨基酸接头序列将肽直接连接至运载体肽或树状聚合物。还可以经由一种或多种静电的或疏水的相互作用,将由本发明体现的肽或核酸连接至易化子部分。例如,可以通过核酸的一个或多个带负电荷的基团和运载体肽或氨基酸接头序列的一个或多个带正电荷的氨基酸之间的电荷关联,将具有负电荷的“货物”分子(例如,如在此所述的核酸)连接至运载体肽或树状聚合物。化学连接方法还可以用于产生运载体肽或接头序列的羧基端氨基酸与由本发明体现的肽之间的共价键。在实例中,试剂包括编码本发明的肽的核酸,如在此所述的易化子部分还可以协助核酸穿过真核细胞的细胞膜进入细胞核。已经报道,例如,当与细胞穿透肽(CPP)复合时,增强了进入哺乳动物细胞的DNA递送(Kim(金),H.H等人,Int.J.(国际期刊),2007)。迅速生长的癌细胞通常过表达癌特异性受体,用来增强营养素或维生素的摄取,并且正常细胞和癌细胞之间的固有形态学的和生理学的差异提供了用于靶向递送由本发明体现的肽、核酸和试剂至癌细胞的手段。具体地,可以将结合至在细胞表面上表达的分子(例如,一种受体,比如EGFR)的靶向部分(例如;配体、结合肽、或抗体或其结合片段(例如Fab和F(ab)2片段)连接至易化子部分(例如运载体肽、树状聚合物等)或直接连接至由本发明体现的肽、核酸或试剂(例如融合蛋白、树状聚合物等),实现癌细胞的靶向。除了其他,可以利用的靶向部分还包括多不饱和脂肪酸、生物素、叶酸和透明质酸,参见例如Ojima(大岛)I.等人,2012,其全部内容通过交叉引用结合在此。
根据本发明的一个靶向方法采用的是:将易化子部分-肽复合物连接至靶向细胞外整合素结构域的整合素受体靶向肽。例如,具有序列DLXXL(SEQ ID No.32)的肽接头可以用于靶向β6整合素亚基的细胞外结构域。如果β6表达通过基质金属蛋白酶-9(MMP-9)增强在细胞表面的有效蛋白水解(Agrez(阿格莱兹)MV等人,1999),那么此类靶向方法可以包括将靶向部分和易化子部分之间的MMP-9或其他MMP切割位点工程化,用于在细胞膜释放该复合物以及该复合物的内化。作为另一个实例,用于αVβ6整合素、RTDLDSLRTYTL(SEQ ID No.33)的配体识别基序可以用于结合或不结合工程化的MMP(例如MMP-9)切割位点,以便将如在此所述的易化子部分-肽复合物递送至靶细胞表面。也可以利用对整合素αvβ6具有高亲和性和选择性的其他靶向肽,例如NAVPNLRGDLQVLAQKVART(SEQ ID No.34)(Howard(霍华德)M.等人,2007),可以将其直接连接至再一次在此所述的肽,提供或不提供MMP切割位点。
将理解,根据本发明,易化子部分可以发挥作用来提供至癌细胞的靶向递送,连同协助附接的货物进入这些细胞。也就是说,同一部分可以按着两种作用发挥功能。像这样,本发明延伸至仅包括细化子部分或包括靶向部分和易化子部分二者的复合物。
可以经由如以上所述的多种机制,包括经由富含组织蛋白酶的溶酶体,使该复合物进入细胞。在此实例中,该复合物可以包括组织蛋白酶切割位点,用于货物(例如由本发明体现的肽、核酸或树状聚合物)从该复合物的细胞内释放,以便有效治疗细胞。不同的可酶促切割的和非可切割的接头是本领域已知的,并且在该复合物中可以利用一种或多种适合的独立选择的此类接头,用于根据本发明连接至靶向部分和/或易化子部分。除了由组织蛋白酶可切割的那些的适合的接头包括含半胱氨酸残基的接头,这些接头提供由胞内酶(例如谷胱甘肽-S-转移酶)可切割的二硫键(-S-S-)。在特别优选的实施例中,该复合物包括用于在细胞内切割或降解的接头,以便释放在癌细胞内释放由本发明体现的货物肽、核酸或试剂。
作为另一种方法,细菌衍生的微细胞(例如De Boer PA(德布尔PA),1989)、脂质体、幽灵细菌细胞(ghost bacterial cell)、窝球(caveospheres)、合成聚合物剂、超速离心的纳米粒子、和其他无核纳米粒子可以加载有根据本发明的树状聚合物、肽、核酸或表达载体(例如质粒),并且用于将货物靶向递送至癌细胞(例如经由微细胞或脂质体等上的双特异性抗体、靶向肽、或类似物)(例如还参见MacDiarmid(麦克迪米德)J.A等人,2007)。可以配制此类梭子(shuttles)用于注射或口服消耗,以便穿过胃的酸性环境,用于经由小肠的肽、树状聚合物或类似物的释放和摄取。对于在此所述的方法中使用而言,加载有由本发明体现的肽的细菌衍生的微细胞是特别优选的。
微细胞是可以通过一个或多个基因(这些基因控制正常细胞分裂)的突变产生的纳米大小的细胞并且包含细胞质以及由此而来的用于亲本细胞的蛋白表达的细胞质组分,但是这些微细胞是染色体异常的(achromosonal)并且不能自我复制。通过去抑制(或上调)控制细胞分裂的的基因的微细胞的产生已经示出为以比将在静脉输注期间正常用量远远更低的剂量将药物递送至肿瘤提供了解决方案(MacDiarmid(麦克迪米德)J.A等人,2007)。本发明的背景下的微细胞可以是通过亲本细胞的异常细胞分裂产生的任何染色体异常的细胞,如可以生成自细胞分裂过程(例如二分裂变)的干扰或紊乱,例如通过一种或多种基因突变和/或所涉及的细胞组分的抑制。
可以通过任何常规已知的方法制备用于如在此所述的方法中使用的微细胞,这些方法例如描述于国际专利申请号WO 03/033519、美国专利号7,183,105和MacDiarmid(麦克迪米德)J.A等人,2007中,所有这些文件的全部内容通过交叉引用以其全文明确结合在此。例如,用来产生细菌微细胞的控制细胞分裂的细菌基因灭活进一步描述于DeBoer PA(德布尔PA)等人,“A division inhibitor and a topologicalspecificity factor coded for by the minicell locus determine placement ofthe division septum in E.coli(分裂抑制剂和由微细胞座编码的拓扑特异性因子确定大肠杆菌中的分裂隔膜的放置”,Cell(细胞),56,1989,页641-649中。利用密度梯度离心(例如OptiPrepTM,Axis-Shield PLC公司,Dundee(邓迪),苏格兰)和错流过滤纯化完整微细胞的方法描述于US 7,611,885和US 8,003,091中,这两篇文件的内容通过交叉引用以其全文明确结合在此。
同时微细胞可以生成自细胞分裂中涉及的基因下调表达,一些基因的过表达还可以导致微细胞产生。从其可以衍生在此有用的微细胞的细菌细胞的实例包括细菌,例如大肠杆菌(E.coli)(例如具有MinA、MinB、cya、crp、MukA1、或MukeE中的突变,或者它过表达minB、minE、flsZ、sdi),枯草芽孢杆菌(例如具有minC、minD、ripX中的突变、或具有smc突变或OriC缺失),乳杆菌,淋球菌,沙门氏菌(例如鼠伤寒沙门菌),螺杆菌;假单胞菌(例如铜绿假单胞菌),李斯特菌(例如单核增生李斯特菌)以及弯曲杆菌。细菌可以是革兰氏阳性的(例如单核增生李斯特菌)或革兰氏阴性的(例如铜绿假单胞菌)。对于协助微细胞加载有待递送至靶细胞的根据本发明的肽、核酸、表达载体或其他试剂(或以上中多项的混合物)而言,已经分离自在其外膜具有孔蛋白的细菌(即,正常是革兰氏阴性菌,虽然一些革兰氏阳性菌也具有孔蛋白)的微细胞是特别优选的。微细胞也可以衍生自古细菌或真核细胞,例如参见US 7,183,105。典型地,然而,将利用细菌衍生的微细胞,也就是衍生自细菌亲本细胞的微细胞。
可以通过使用任何适合的靶向部分,获得至癌细胞的微细胞的靶向。可以在微细胞表面上表达靶向部分,或者例如微细胞可以被标签化或标记有一个或多个选择的靶向部分。在特别优选的实施例中,可以使用双特异性抗体复合物形式的靶向部分实现那篇报道中的至肿瘤细胞的微细胞的靶向,该双特异性抗体复合物识别微细胞表面脂多糖的O-抗原组分和特异性针对待靶向的哺乳动物细胞的细胞表面受体(例如,EFGR),利用蛋白A/G,经由它们的Fc区将该复合物的两个抗体连接在一起(参见MacDiarmid(麦克迪米德)J.A等人,2007和WO03/033519)。
然而,本发明并不局限于此,并且在微细胞上可以采用其他靶向部分。例如,靶向部分可以包括一个或多个抗体结合片段,而不是如以上所述的完整抗体。在其他实施例中,特异性针对靶细胞上的结合配偶体的结合肽或受体可以表达在微细胞的外表面上,并且所有适合的此类替代方案都是可能的。在大量其他受体中,由一种或多种靶细胞表达的受体可以选自激素受体、神经递质受体、受体酪氨酸激酶受体、和G-蛋白偶联受体。在包含肽、核酸或其他试剂的孵育介质中,经由微细胞的孵育,通过被动扩散,微细胞可以加载有肽或核酸(或其他试剂,例如根据本发明的表达载体、树状聚合物等)。为了辅助加载,可以使微细胞对一种或多种试剂可渗透(例如通过穿通微细胞),或者可以使用常规技术另外增加或增强微细胞对试剂的穿透性。可以通过引起自微细胞与在靶细胞上表达的细胞表面受体的相互作用的吞噬作用(例如通过中性粒细胞和巨噬细胞),或者通过胞吞作用(网格蛋白介导的抑或网格蛋白独立的胞吞作用),借助进入靶细胞的微细胞的易位,使微细胞的内容物进入靶标癌细胞,并且随后降解微细胞,并且释放微细胞的内容物进入靶细胞的细胞质(例如从细胞内区室,例如内涵体和/或溶酶体)。
在至少一些实施例中,为了通过存在于细菌衍生的微细胞上的LamB孔蛋白的运送的目的,由本发明体现的肽还可以连接至碳水化合物部分,例如葡萄糖(D或L异构体)。孔蛋白超家族包含形成跨越革兰氏阴性菌外部细胞膜的充水孔的同源三聚体跨膜蛋白。多数孔蛋白形成由环境改变调节的普通非特异性通道。麦芽糖孔蛋白,也称为LamB孔蛋白,负责进入大肠杆菌细胞的麦芽糖和麦芽糊精的受引导的扩散。具体地,LamB蛋白还可以协助葡萄糖的扩散(von Meyerburg(冯梅耶博格)K和Nikaido(二阶堂)H,1977),并且已经发现,在体外,从大量测试的糖中,葡萄糖具有最快的跨越LamB蛋白的扩散速率(Luckey(勒基)M和Nikaido(二阶堂)H,1980)。
阳离子肽已经成功用于将大分子(例如DNA和氨基酸序列)转移进入活细胞。在根据本发明的实施例中,阳离子肽和如在此所述的其他易化子还可以用于协助肽、核酸和其他试剂进入微细胞,并且在例如是核酸的情况下,跨越核膜。阳离子肽的实例包括聚精氨酸、聚组氨酸和聚赖氨酸肽,以及由精氨酸、组氨酸和赖氨酸氨基酸残基中的至少两种的混合物组成的肽。例如,已经报道一种15mer精氨酸肽是用来介导癌细胞系中编码绿色荧光蛋白和β-半乳糖苷酶基因的DNA的表达的氨基酸残基的优选数目(Choi(崔)HS等人,2003)。已经报道,9-35mer阳离子肽和/或两亲性肽被迅速内化跨越外部细胞膜(Bitler(比特勒)B.G.和Schroeder(施罗德)J.A.,2010)。本发明延伸至此类阳离子肽作为易化子部分的用途,用于协助使由本发明体现的肽或编码该肽以便在这些细胞内表达该肽的核酸(例如DNA)进入靶标癌细胞。阳离子肽可以是适合协助该肽或核酸进入根据由本发明体现的方法的靶细胞的任何长度。一般,阳离子肽将长度小于20个氨基酸,并且更通常长度小于15个氨基酸或更少。典型地,用于协助由本发明体现的肽进入细胞的阳离子肽(例如肽RVKVKVVVVR(SEQ ID No.24)将是长度从2至10个氨基酸,并且更一般是长度从5至8个氨基酸。当阳离子肽是聚精氨酸或聚赖氨酸时,它将优选长度是约8个氨基酸,而聚组氨酸肽将一般长度是约5个氨基酸。该阳离子肽可以包括L-和/或D-氨基酸,并且将一般是聚精氨酸肽(即完全由精氨酸残基组成的肽)。该阳离子肽还可以增加本发明的肽的溶解度,在该情况下,RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)的“x”氨基酸是,或主要是非极性氨基酸(例如选自丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I))。
可以将各自独立选择的阳离子肽连接至由本发明体现的肽的C-末端和/或N-末端或核酸,例如共价连接,例如通过肽键或经由接头。在利用接头来将阳离子肽连接至肽或核酸的情况下,该接头可以是如以上所述的可酶促切割的接头。可以与或不与另外的易化子部分或运载体肽(例如聚精氨酸肽、PEP-1或TAT肽)一起使用聚组氨酸肽,因为组氨酸的咪唑基可以协助进质子流至内涵体,导致内涵体破裂并且将货物肽或核酸释放进入靶细胞的细胞质。也就是说,组氨酸残基可以充当内涵体逃逸剂(Liu(刘),B.R.等人,2011)。这对于利用如以上所述的细菌衍生的微细胞将肽和核酸递送进靶细胞或者经由利用靶向部分(例如特异性针对由靶细胞表达的EGFR的单克隆抗体)直接(非封装的)递送至靶细胞而言,这具有适用性。
如以上所述,不同形式的表达载体是本领域已知的,并且任何适合的此类表达载体可以用于根据本发明的目的。在体外抑或体内,病毒转移法还可以用于达到将编码由本发明体现的肽或融合蛋白的核酸引入靶细胞(例如癌细胞)。可以将表达载体包装进入用于递送至靶细胞的病毒包括腺病毒、牛痘病毒、鸟类逆转录病毒、鼠源和人源孢疹病毒(包括单纯性疱疹病毒(HSV)和EBV)、乳多空病毒(例如SV40)、和腺病毒伴随病毒。在此所述的方法中有用的特别优选的病毒包括复制缺陷型重组腺病毒。可以局部地或全身地给予重组病毒,来达到将编码肽或融合蛋白的核酸递送进靶细胞。在体外还可以使用如本领域已知的常规冷休克或热休克技术,或例如磷酸钙共沉淀或电穿孔方案,细胞内地递送编码根据本发明的肽或融合蛋白的核酸。
可以筛选转染细胞来鉴别表现出核酸插入物的稳定可再现表达和本发明的肽或融合蛋白的伴生生产的培养物或细胞系。在多种宿主细胞内,核酸的稳定整合和表达是本领域熟知的。可以用于表达多肽或融合蛋白的宿主细胞包括细菌或益生菌(例如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、乳酸乳球菌、链霉菌和假单胞菌、短杆菌,并且特别是亚麻短杆菌菌株),酵母(例如酵母属和毕赤酵母属),昆虫细胞,鸟类细胞和哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、COS、HeLa、HaRas、WI38、SW480、和NIH3T3细胞)。在适合的培养基中,在用于协助引入的核酸表达的条件下培养宿主细胞,然后按情况可以使用标准纯化技术从这些宿主细胞和/或上清液纯化表达产物。
可以通过使用去垢剂、离心来声处理或破坏细胞膜,以除去细胞膜和和固体片段,来从细胞培养物纯化由本发明体现的肽和融合蛋白,并且如果适用的话,通过借助本领域已知方法的亲和色谱法或免疫亲和色谱法,从溶液或上清液进行纯化。可以使用的适合的此类固体基质和支持物包括但不局限于琼脂糖、琼脂糖凝胶和其他可商购的支持物(例如乳胶、聚苯乙烯、或葡聚糖等的珠粒)。可以利用常用的酰胺或酯接头,或通过吸附,将用于固定本发明的肽或融合蛋白于固体支持物上,以便随后从其洗脱和浓缩的抗体、结合片段或其他适合的结合分子共价地结合至固体基质。例如,可以用如本领域已知的标签(例如聚-His(例如六组氨酸)标签),在宿主细胞中表达根据本发明的肽和融合蛋白,用于辅助它们的纯化。在利用标签(例如聚-His)的情况下,编码的肽或融合蛋白可以进一步包括使用肽链内切酶协助移除标签的适合的氨基酸序列(如果使用N-末端His-标签,可以不提供此类另外的氨基酸序列)。同样,编码根据本发明的肽或融合蛋白的核酸可以进一步包括信号肽序列,用于协助该肽或融合蛋白从宿主细胞分泌,以便通过如以上所述的亲和色谱法纯化该肽或融合蛋白。例如,用于制备免疫亲和色谱法所用固体基质的方案,和亲和色谱法方案描述于CurrentProtocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验指南)——Ausubel(奥苏贝尔)FM等人,Wiley-Interscience公司,1988及其随后更新中。
因此,可以按分离的或纯化的形式提供根据本发明的肽、融合蛋白、和核酸。如在此使用,术语“纯化的”涵盖本发明的肽、核酸或试剂的部分纯化,例如至80%纯或更大、或至少85%、90%、95%、96%、97%、98%、或更大(例如99%或更大)的水平,如可以通过电泳和/或其他技术进行评价。
在细胞上,可以通过细胞形态学的评价、台盼蓝排除法、细胞凋亡的评估和细胞增殖研究(例如细胞计数、3H-胸苷摄取和MTT试验),确定由本发明体现的肽或试剂的毒性特征。
可以与反义疗法或一种或多种常规抗癌化合物或药物联合给予根据本发明的一种或多种肽(包括其树状聚合物)、核酸或其他试剂。“联合给予”是指通过相同或不同途径,在同一配制品或在两种不同配制品中同时给予,或通过相同或不同途径顺序给予,由此在重叠治疗窗上这一种或多种肽和药物发挥它们的效果。
根据本发明的一个或多个实施例可以使用的常规化学治疗药可以选自下组,该组由以下各项组成:金属基和非金属基药物。金属复合物可以是有机的、无机的、或混合的配体配合化合物或螯合物。例如过渡金属复合物包括铂、钯、铜、锌、铑和钌的复合物。铂基化学治疗药的实例包括顺铂(顺式-二胺二氯铂(II))、奥沙利铂、([Pt(1)xalto(1R),(2R)-二氨基环己烷]复合物)、卡铂(顺式-二氨(1,1-环丁烷二羧酸)铂(II)、和博来霉素。非金属化学治疗药的实例包括紫杉醇、格列卫、多西他赛、紫杉酚、5-氟尿嘧啶、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱(安可平)、长春花碱、长春地辛、喜树碱、吉西他滨、阿霉素、和拓扑异构酶抑制剂(例如伊立替康(CPT-11))。因此,可以与一种或多种此类常规抗癌药物或其他药物一起联合给予由本发明体现的肽。
在正治疗抗药性癌的情况下,可以与癌细胞以其他方式抵抗的化学治疗药组合或结合,将由本发明体现的肽或核酸联合给予至哺乳动物受试者。例如,已经示出Src酪氨酸激酶的抑制增强了化疗剂(例如药物敏感性卵巢癌细胞中的顺铂)的细胞毒性,并且恢复了抗药细胞的敏感性。
细胞质膜关联的非受体酪氨酸激酶的Src家族在细胞活性调节中起重要作用。这一激酶家族在丝裂原活化蛋白(MAP)激酶的上游发挥它们的作用并且因此ERK激活。如以上所述,以不定向的方式发生c-Src对靶标的磷酸化,并且通过c-Src和很多膜结合受体与质膜附近的细胞因子之间的相互作用来启动该磷酸化。像这样,c-Src和Src家族成员是调节多种细胞类型中的癌进展(从启动至转移)的所有阶段的多个信号传导途径的关键中介物。根据本发明,在联合治疗中可以采用的c-Src的抑制剂包括多肽、树状聚合物等,描述于国际专利申请号PCT/AU2010/000203中,其全部内容通过交叉引用结合在此。可以利用的此类c-Src抑制剂的实例包括肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)。
例如,用本发明的方法治疗的癌可以选自下组,该组由以下各项组成:癌症(carcinomas)、肉瘤、淋巴癌、实体瘤、头颈癌、血细胞癌、白血病、髓系白血病、嗜酸细胞白血病、粒细胞白血病、和肝癌、舌癌、唾液腺癌、牙龈癌、口腔底癌和口腔其他区域的癌、口咽癌、鼻咽癌、下咽癌及其他口腔癌、食道癌、胃肠道癌、胃癌、小肠癌、十二指肠癌、结肠癌、结肠直肠癌、直肠癌、胆囊癌、胰腺癌、喉癌、气管癌、支气管癌、肺癌(包括非小细胞肺癌)、乳癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、阴道癌、外阴癌、前列腺癌、睾丸癌、阴茎癌、膀胱癌、肾癌、甲状腺癌、骨髓癌、以及皮肤癌(包括黑色素瘤)。典型地,癌将典型地是上皮癌,并且最通常是非真皮癌。最通常,癌将选自下组,该组由以下各项组成:肺癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、结肠腺癌和卵巢癌。
典型地在包括药学上可以接受的运载体和/或赋形剂的药物组合物中提供由本发明体现的肽、核酸(例如表达载体)或其他试剂(例如融合蛋白),用于给予至预期受试者。在至少一些实施例中,可以将肽或试剂装载到细菌衍生的微细胞中。可以口服、静脉内、肠胃外、直肠、皮下、通过输注、外用地(例如在皮肤癌的治疗中)、肌内、腹膜内、鼻内、或认为适当的任何其他途径给予该肽、试剂或药物组合物。例如,药物组合物可以处于以下形式:液体、悬浮液、乳剂、糖浆、乳膏、可消化片剂、胶囊、药丸、栓剂、粉末、锭剂、丹药、或适于选择的给予途径的其他形式。
本发明体现的药物组合物包括水溶液。可注射组合物将是流体,达到这样的程度以至存在容易注射性,并且典型地,将正常稳定持续一个预定时期,以提供制造后的储存。此外,药学上可接受的运载体可以包括任何适合的常规已知的溶剂、分散介质、生理盐水和等渗制剂或溶液、和表面活性剂。例如适合的分散介质可以包含以下项中的一种或多种:乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、植物油及其混合物。为了口服给予,可以使用任何口腔接受的运载体。具体地,可以用惰性稀释剂、可同化食用运载体配制该多肽,或者它可以被封闭在硬的或软的壳体胶囊中。可以采用常规用于形成乳膏、洗液或软膏以便内服用或外敷用的外用可接受的运载体。可以将此类组合物直接应用至待治疗的部位或经由浸渍有该组合物的敷料等来应用。
如在此所述,药物组合无还可以包含适合体内和/或局部外用给予的一种或多种防腐剂,例如尼泊金、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、和硫汞撒。此外,通过用于延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)在该组合物中的使用,可以带来该组合物的延长吸收。包含由本发明体现的肽的片剂、锭剂、药丸、胶囊等还可以包含以下项中的一种或多种:粘合剂,例如黄芪胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶;崩解剂,例如玉米淀粉、马铃薯淀粉或藻酸;润滑剂,例如硬脂酸镁;甜味剂,例如蔗糖、乳糖或糖精;以及调味剂。
如以上所述的成分和介质在药物组合物中的用途是熟知的。除了在任何常规介质或成分与该树状聚合物不相容的情况下,在如在此所述的治疗的和预防的组合物中,其用途都包括在内。
特别优选的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式,以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式被用来指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散单位;每个单位包含预定量的由本发明体现的至少一种肽,该预定量是经过计算以产生与所用相关运载体和/或赋形剂相关联的所希望的治疗或预防效果。例如,当该剂量单位形式是胶囊、片剂或药丸时,可以使用不同成分作为涂层(例如虫胶、糖或二者)来以另外方式修饰剂量单位的物理形式,或用来协助给予至受试者。
药物组合物将总体上包含按重量计至少1%的该肽。该百分比当然可以变化,并且方便地可以在该组合物或制剂的约5%至约80%w/w之间。如将理解,考虑到提出的给予途径,在该组合物中,由本发明体现的肽或其他试剂的量将是使得适合的有效剂量将被递送至受试者。由本发明体现的优选口服组合物将包含在约0.1μg和15g之间的该肽。
该肽或其他试剂的剂量取决于多个因素,包括该肽是否被给予用于预防或治疗用途,打算给予该肽或试剂的病情,病情的严重性,受试者的年龄,并且相关因素包括受试者的体重和一般健康状况,如可以由内科医师或护理人员根据公认的原理进行确定。例如,可以最初给予低剂量,并且在评价了个体反应后,随后在每次给予时增加剂量。类似地,可以按相同方式确定给予频率,即通过连续监测每个剂量之间的个体反应,并且如果必要,增加给予频率,或者可替代地,减小给予频率。
典型地,将根据在此所述的方法给予由本发明体现的肽,以提供高达约100mg/kg个体体重的多肽剂量,更通常是在高达约50mg/kg体重的范围内,并且最通常是在约5mg/kg至40mg/kg体重的范围内。在至少一些实施例中,将给与该肽以提供在以下范围内的该肽的一个计量:约5至约25mg/kg体重,通常在以下范围内:从约5mg/kg至约20mg/kg,并且更通常在以下范围内:从10mg/kg至约20mg/kg。当以树状聚合物的形式口服给予时,可以每天给予高达约20g的树状聚合物(例如每天4个口服计量,每个剂量包括5g的树状聚合物)。
关于静脉内途径,特别适合的途径是经由注射进入在具体器官中供应待治疗的肿瘤或癌的血管中。具体地,可以通过任何适合的输注或灌注技术,将肽、树状聚合物、融合蛋白或类似物递送进入分离的器官、肢体和组织。还可以将肽或其他试剂(例如加载在微细胞中的表达载体)递送进多个腔,例如胸膜腔或腹膜腔,或者将其直接注射进肿瘤组织。
在有技能的读者熟知的手册(manuals和handbook)中描述了在本发明的方法中有用的适合的克隆载体和表达载体和用于其制备和递送的方法,例如参见Ausubel(奥苏贝尔)等人,(1994)Current Protocols inMolecular Biology(现代分子生物学实验指南),美国,卷1和2,JohnWiley&Sons(约翰成立父子出版公司),1992;Sambrook(萨姆布鲁克)等人(1998),Molecular cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验指南),第二版,Spring Harbour Laboratory Press(冷泉港实验室出版社),1989,纽约,以及它们的再版和更新,它们的内容通过交叉引用以其全文结合在此。同样,例如,可以在有技能的读者熟知的手册和教科书中发现在本发明的组合物中有用的适合的药学上可接受的运载体和配制品,这些手册和教科书例如是“Remington:The Science and Practiceof Pharmacy(雷明顿:药物科学和实践)(Mack Publishing Co.(默克出版公司),1995)”,及其任何再版和更新。例如,在WO 200631996、WO200631689、WO 200629981、WO 200629005、US 20060063731、和US 20060063924中描述了用于转染细胞和体内表达核酸插入物的方法和方案,所有以上列出的出版物、手册(manuals和handbooks)的内容都通过交叉引用以其全文结合在此。
哺乳动物可以是用本发明的方法可治疗的任何哺乳动物。例如,哺乳动物可以是以下项中的成员:牛、猪、羊或马科,实验室实验动物(例如小鼠、兔、豚鼠、猫、狗或灵长类动物),或人类。典型地,哺乳动物是人类。
在参考多个非限制性实例后,在此将描述本发明。
实施例
实例1:癌细胞生长抑制研究
1.方法
1.1细胞系和培养条件
为了体外研究,使用人结肠癌细胞系HT29、卵巢癌细胞系A2780、乳腺癌细胞系MCF-7和MDA468,以及前列腺癌细胞系(DU145)。在含5%CO2的空气下,在37℃培养这些细胞系,并且定期传代用于最佳生长。在含10%胎牛血清的DMEM培养基中维持细胞。所有培养基制剂进一步补充有青霉素和链霉素(100μg/ml),以及
1.2体外生长抑制MTT试验
按每孔4000个细胞的密度,将对数生长中的细胞转移至100μl的含血清培养基的96孔板中。24小时后,除去预先添加的含血清培养基,并且将具有或不具有肽的200μl无血清培养基(SFM)添加至一式三个的孔中的每一个里。使用不同浓度的肽(50nM–100μM),在细胞系上进行药物暴露实验,并且在无血清培养基中,使细胞暴露于肽持续72小时。用MTT(3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]2,5-二苯基-溴化四唑)细胞生长试验评价生长抑制效果,并且在540nm读取吸光度。在全孵育期间,对照细胞的生长是指数的。对于每个肽/顺铂浓度,确定平均存活分数±SEM值(3次单独实验的最小值)。
1.3c-Src激酶活性试验
按照每个生产商指南进行体外c-Src激酶活性试验。简要地,以25μL的最终反应体积,将c-Src(h)(5-10mU)与8mM MOPS pH 7.0,0.2mM EDTA,250μM KVEKIGEGTYGVVYK(SEQ ID No.35)(Cdc2肽),10mM Mg乙酸盐和[γ-33P-ATP](比活性约500cpm/pmol)一起孵育。通过添加MgATP混合物启动反应。在室温下孵育40分钟后,通过添加5μL的3%磷酸溶液停止反应。然后将10μL的反应点在P30filtermat上,并且在75mM磷酸中洗涤三次持续5分钟,并且在甲醇中洗涤一次,之后干燥和闪烁计数。
1.4Akt激酶活性试验
按照每个生产商指南进行体外PKB激酶活性试验。简要地,以25uL的最终反应体积,将PKB(h)(5-10mU)与8mM MOPS pH 7.0,0.2mMEDTA,30uM的GRPRTSSFAEGKK(SEQ ID No.36),10mM Mg乙酸盐和[γ33P-ATP](比活性约500cpm/pmol,浓度按需要)一起孵育。通过添加MgATP混合物启动反应。在室温下孵育40分钟后,通过添加5μL的3%磷酸溶液停止反应。然后将10μL的反应混合物点在P30filtermat上,并且在75mM磷酸中洗涤三次持续5分钟,并且在甲醇中洗涤一次,之后干燥和闪烁计数。
2.结果
2.1在体外细胞增殖上的肽修饰效果
进行研究,以确定RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽序列内的NPLY(SEQ ID No.37)基序的损失或带电荷的氨基酸残基(即RKKR)的损失(例如肽序列ASAAANPLYA)(SEQ ID No.7)是否消除了全长RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽对HT29细胞增殖的细胞生长抑制效果(Agrez(阿格莱兹)等人,2011)。
如图1中所示,发现NPLY(SEQ ID No.37)基序和带电荷残基RKKR(SEQ ID No.6)这二者对于细胞生长抑制效果而言都是必需的,但是单独每一个不足以抑制体外癌细胞增殖达到与全长10mer肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)相同的程度。在以最高肽浓度100uM抑制细胞生长时,RKKR(SEQ ID No.6)的扰乱版本(即RKRK)(SEQ ID No.8)显著地更无效(图1)。
为了进一步检验在抑制HT29细胞增殖时NPLY(SEQ ID No.37)基序的要求,将细胞暴露于10mer RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)的短变体,即RSKAKR(SEQ ID No.9),该变体缺少NPLY(SEQ ID No.37)基序。如图2所示,即使在最高浓度100uM,RSKAKR(SEQ ID No.9)肽也不能抑制HT29细胞增殖。此外,在NPLY(SEQ ID No.37)基序内用丙氨酸取代特定残基脯氨酸和酪氨酸消除了在亲本10merRSKAKNPLYR(SEQ ID No 2)存在下可见的生长抑制效果(图2)。
为了进一步确认对于抑制癌细胞生长NPLY(SEQ ID No.37)基序是必需的,用丙氨酸代替RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)内的所有非带电荷残基,并且测试生成的肽RAKAKAAAAR(指定的10Ala)(SEQ IDNo.12)对于HT29细胞增殖的作用。令人惊讶地,如在图3中所见,这两个肽抑制细胞生长的能力相似,而扰乱的丙氨酸取代的肽RAAKAARAAK(扰乱的10Ala)(SEQ ID No.13)是无效的。
以上已经示出,在体外,在血清存在下,不利地影响了β6衍生的肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)的生长抑制效果。这被认为是由于从RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)的氨基端切割了氨基酸(Agrez(阿格莱兹)等人,2011)。在本研究中,当在含血清培养基中进行测试时,类似地发现了不利地影响了10Ala(数据未示出)。
还已经报道,源自与β6衍生的肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)共享显著同源性的β2(即KEKLKNPLFK)(SEQ ID No.38)、β3(即RARAKNPLYK)(SEQ ID No.39)、和β5(即RSRARNPLYR)(SEQ ID No.40)整合素胞质结构域的10mer肽在体外抑制结肠癌细胞增殖时是有效的(例如PCT/AU2010/000203)。为了确定这些肽的丙氨酸取代同系物是否将还反映10Ala的生长抑制效果,将β2、β3和β5衍生的肽的非带电荷残基取代为丙氨酸并且检验它们对于HT29细胞生长的作用。
生成的丙氨酸(A)取代的肽如下:
·KAKAKAAAAK(SEQ ID No.14)(β2衍生的丙氨酸取代的肽)
·RARAKAAAAK(SEQ ID No.15)(β3衍生的丙氨酸取代的肽)
·RARARAAAAR(SEQ ID No.16)(β5衍生的丙氨酸取代的肽)
如图4中所示,与衍生自β2、β3或β5整合素胞质结构域的三种丙氨酸取代的肽中的任一个相比,在体外抑制细胞增殖时,10Ala都显著更有效。
为了确定10Ala内精氨酸和赖氨酸的位置是否影响10Ala抑制癌细胞生长的能力,在其中精氨酸和赖氨酸残基中一者或二者的位置已经被倒置的10Ala肽(分别为RAKARAAAAK(SEQ ID No.17)和KARARAAAAK(SEQ ID No.18))存在下培养HT29细胞。如图5中所示,这显著降低了这些肽抑制细胞生长的能力。此外,如在图5中所示,将所有丙氨酸残基转化为β丙氨酸的异构体形式类似地降低了该肽抑制HT29细胞生长的能力。
如图6所示,10Ala的更短变体,即RAKAK(SEQ ID No.19)和RAKAKAAAR(SEQ ID No.20)对于HT29细胞增殖具有最低效果,而与这些更短变体相比,在羧基端包含一个另外丙氨酸残基的11mer肽更有效,但是在抑制细胞生长方面仍不如10Ala有效(图6)。
为了确定丙氨酸的存在是否是生长抑制效果的特定要求,用缬氨酸(另一种非极性氨基酸)或丝氨酸或甘氨酸(这二者都是极性氨基酸)代替10Ala内的丙氨酸残基。如图7中所示,用甘氨酸代替丙氨酸使该肽无效,除了在最高浓度,而丝氨酸取代物更有效,虽然显著小于10Ala。然而,用缬氨酸代替丙氨酸残基导致与对10Ala观察到的对HT29结肠癌细胞生长类似的抑制。还针对其他癌细胞类型,检验了10Ala对细胞生长的抑制效果。如图8中所示,在体外抑制人类前列腺癌细胞系(DU145)、乳腺癌细胞系(MCF-7)和卵巢癌细胞系(A2780)生长时,10Ala同样有效。
2.2癌细胞摄取10Ala
借助于在无血清培养条件下,暴露于轭合至异硫氰酸荧光素(FITC)的10Ala的细胞的共聚焦显微镜,评估10Ala跨越HT29细胞质膜的能力。在此研究中使用的肽包括在氨基端(FITC标记附接至此)具有另外赖氨酸残基的序列KRAKAKAAAAR(SEQ ID No.25)(鉴别为FITC-K10(4)Ala)。在培养24小时后,很多细胞表现出肽的胞质定位。在图9中示出,显微照片示出与单独用FITC处理的细胞相比,FITC-标记的肽至细胞质的定位。
2.3对蛋白激酶活性的作用
借助无细胞体外激酶试验,确定β6衍生的肽RSKAKNPLYR(SEQID No.2)、RAKAKAAAAR(10Ala)(SEQ ID No.12)、RAAKAARAAK(扰乱的10Ala)(SEQ ID No.13)、和10mer缬氨酸取代的肽RVKVKVVVVR(SEQ ID No.24)抑制蛋白激酶活性的能力。如在表1中所示,对于c-Src活性,RAKAKAAAAR(SEQ ID No.12)和RVKVKVVVVR(SEQ ID No.24)具有与RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)类似的效果,但是相反,在抑制Akt2(PKBβ)和Atk3(PKBγ)活性方面,那些肽显著更有效,而10Ala的扰乱版本基本上无效。
表1:激酶活性的抑制
3.讨论
考虑到对β6-衍生的肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)内NPLY(SEQID No.37)基序以及具体地,酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)残基用来使RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)氨基酸序列在抑制癌细胞增殖时有效的要求,完全意外地发现,用丙氨酸残基(包括氨基末端丝氨酸)取代NPLY(SEQ ID No.37)基序(RAKAKAAAAR;指定的10Ala)(SEQ ID No.12)恢复了对细胞增殖的抑制效果,当细胞暴露于缺少NPLY(SEQ IDNo.37)基序的RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)的缺失变体(即RSKAKR)(SEQ ID No.9)或具有NPLY(SEQ ID No.37)基序内的脯氨酸抑或酪氨酸残基的单一丙氨酸取代的变体(即分别是RSKAKNPLAR(SEQ ID No.41)和RSKAKNALYR(SEQ ID No.42))时,这种抑制效果是不可见的。
这更加令人惊讶,因为丙氨酸不太可能有力地结合受体,其条件是它是非极性的疏水性氨基酸,对于静电作用没有机会。相反,如在图3中所示,10Ala的扰乱版本无效,提示由两个精氨酸和两个赖氨酸的间隔和顺序确定10Ala化合物的抑制效果。
此外,当β-丙氨酸保留与丙氨酸相同的四面体结构时,β-丙氨酸插入10Ala的效果是用来延长该肽的主链,这使该肽在抑制癌细胞生长方面更无效。除此以外,与如图6中所示的10Ala相比,发现在赖氨酸和C-末端精氨酸之间分别包含3抑或5个丙氨酸残基的肽RAKAKAAAR(SEQ ID No.20)(9mer)和RAKAKAAAAAR(SEQ ID No.21)(11mer)二者在抑制结肠癌细胞生长时都显著更无效,证实了长度对生长抑制效果的关联性。
通过以下发现进一步突出了缺少与整合素结构的关系:在β6-衍生的序列RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)中用丙氨酸代替NPxY(SEQ IDNo.4)基序产生了有效的抗癌化合物,而在β2、β3和β5的对应的整合素胞质结构域中这一基序的丙氨酸取代产生了在抑制细胞生长时相对无效的化合物。此外,不像RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2),10Ala抑制促生长激酶Akt3,同时仍保留实质的抗Src活性(参见表1)。此外,如表1中所示,不像RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)肽,10RVK(RVKVKVVVVR)(SEQ ID No.24)不仅抑制c-Src活性,而且还在抑制Akt2和Akt3二者时非常有效。总之,这些发现表明,10Ala及其相关肽不可以被分类为β整合素胞质结构域的衍生物。
在癌治疗中的主要挑战是当靶向单一激酶时,肿瘤细胞逃脱细胞上施加的生长限制的能力。在响应大量信号的信号传导蛋白中,Akt3似乎是细胞存活和增殖中的主角,使它成为用于治疗癌的有吸引力的治疗靶标。例如,已经发现,在乳腺癌和前列腺癌中Akt3过表达(Anderson(安德森)等人,1998),并且已经发现,在前列腺癌中,Akt3的基础酶活性持续升高,并且代表主要Akt亚型(Nakatani等人,1999)。有关的,最近还已经示出,抑制Akt3导致VEGF减少,致使在卵巢异种移植小鼠模型中更少的血管化肿瘤(Liby(利比)等人,2011)。
靶向Src激酶还与癌治疗相关,其条件是对于促生长Ras-MAPK途径的内膜激活,需要Src家族激酶,并且已经在超过50%的源自结肠、肝脏、肺、乳房和先烈先的肿瘤中证明了c-Src激活(Bivona(比沃纳)T.G等人,2003)。因此,用由本发明体现的肽和c-Src抑制剂(例如β6整合素衍生的肽RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)进行治疗可以提供有效的联合癌治疗。
总的来说,在此提供了新颖的抗癌肽(在优选的实施例中它只包括三种不同氨基酸),其独特地不同于先前已经报道的抑制癌细胞生长的基于整合素的肽。
实例2:MDA468乳腺癌细胞的抑制
通过实例1.2中描述的MTT试验的修改形式评估不同浓度的具有连接至其C-末端的8mer多聚精氨酸序列的10RVK肽(RVKVKVVVVR)(SEQ ID No.24)(即RVKVKVVVVRRRRRRRRR(SEQ ID No.26),在此称为10RVK Arg)对MDA468乳腺癌细胞的生长抑制活性,其中在含5%血清的培养基中每个孔3000个细胞,培养48小时。对于阴性对照,使用8mer多聚精氨酸肽(8Arg)。在图10中示出的结果是对于每个剂量3个重复孔的平均值。如可见,在从5μM至50μM的浓度,10RVK Arg肽(实心菱形)完全抑制了癌细胞生长,而8mer Arg肽自身(实心方块)表现出在此浓度范围内无效。
在另一研究中,如通过MTT试验测定,在以从5μM至10μM的浓度处理MDA468乳腺癌细胞,以及以10μM至50μM的浓度处理DU145前列腺癌细胞时,与具有连接至其N-末端的穿透肽的10RVK肽(即RQIKIWFQNRRMKWKKRVKVKVVVVR)(SEQ ID No.43)相比,10RVK Arg肽示出增强的细胞生长抑制活性(结果未示出)。
实例3:MDA468乳腺癌细胞和DU145前列腺癌细胞的抑制
通过MTT试验评估不同浓度的10RVK Arg肽对MDA468乳腺癌细胞和DU145前列腺癌细胞的生长抑制活性涉及如在实例2中所述的在含5%血清培养基中孵育细胞48小时。作为比较,还评估了用具有连接至其C-末端的7mer多聚精氨酸序列的10RVK肽(即RVKVKVVVVRRRRRRRR(SEQ ID No.27),在此称为10RVK 7Arg)和具有连接至其N-末端的8mer多聚精氨酸序列的10RVK肽(即RRRRRRRRRVKVKVVVVR(SEQ ID No.28),在此称为Arg 10RVK)抑制细胞生长。在图11中示出了抑制乳腺癌细胞的结果,而在图12中示出了处理前列腺癌细胞的结果。如可见,在0.5μM或更大的浓度,这些肽显著抑制了乳腺癌细胞和前列腺癌细胞这二者的生长,并且示出彼此类似的活性谱。
虽然已经描述了多个优选实施例,但是本领域普通技术人员将理解,可以提供多个另外的实施例而不偏离本发明。因此,描述的这些实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
参考文献
1.Ahmed(艾哈迈德)N,Niu(牛)J,Dorahy(多雷)DJ,Gu(顾)X,Andrews(安德鲁斯)S,Meldrum(梅尔德伦)CJ,Scott(斯科特)RJ,Baker(贝克)MS,Macreadie(麦克格雷迪)IG,Agrez(阿格莱兹)MV(2002)Direct integrinαvβ6-ERK binding:implications for tumour growth(《直接整合素αvβ6-ERK结合:对肿瘤生长的意义》).Oncogene(《癌基因》)21:1370-1380。
2.Ahmed(艾哈迈德)N,Pansino(潘什奴)F,Clyde(克莱德)R,Murthi(穆尔蒂)P,Quinn(奎恩)MA,Rice(莱丝)GE(2001),Overexpression ofαvβ6integrin in serous epithelial ovarian cancer regulates extracellular matrixdegradation via the plasminiogen activation cascade(经由血浆纤溶酶原激活级联,在浆液性上皮性卵巢癌中,αvβ6整合素的过表达调节细胞外基质降解).Carcinogenesis(《致癌作用》)23:237-244。
3.Agrez(阿格莱兹),M.V.,Gu(顾),X.,Turton(图尔顿),J.,Meldrum(麦德鲁姆),C.,Niu(牛),J.,Antalis(安塔莉丝),T.和Howard(霍华德),E.W.,The αvβ6 integrin induces gelatinase B secretion in colon cancer cells(在结肠癌细胞中,αvβ6整合素诱导明胶酶B分泌).Int.J.Cancer(《国际癌症杂志》)81,90-97(1999)。
4.Agrez(阿格莱兹)等人,anti-tumour effect of cisplatin when combinedwith an anti-Src kinase integrin based peptide(当与基于抗Src激酶整合素的肽组合时,顺铂的协同抗肿瘤作用).J Cancer Therapy(《癌症治疗杂志》),2(3);2011年8月:doi:10.4236/jct.2011.23039。
5.Anderson(安德森)KE等人(1998)Translocation of PDK-1 to theplasma membrane is important in allowing PDK-1 to activate proteinkinase B(在允许PDK-1激活蛋白激酶B中,PDK-1至浆膜的易位是重要的).Curr Biol(《当今生物学》)8:684-691。
6.Bates(贝茨)RC,Bellovin(贝拉文)DI,Brown(布朗)C,Maynard(梅纳德)E,Wu(吴)B,Kawakatsu(川胜)H,(2005),Transcriptional activation ofintegrin β6 during the epithelial-mesenchymal transition defines a novelprognostic indicator of aggressive colon carcinoma.(在上皮间质转化期间,整合素β6的转录激活限定了侵犯性结肠癌的新颖预后指标)J ClinInvest(《临床研究杂志》)115:339-347。
7.Bitler(比特勒)B.G.和Schroeder(施罗德)J.A.,Recent Patents onAnticancer Drug Discovery(关于抗癌药物发现的近期专利),2010,5:99-108.
8.Bivona(比沃纳)TG等人,Phospholipase Cgamma activates Ras on thegolgi apparatus by means of RasGRP1.(借助RasGRP1,在高尔基体上磷脂酶Cγ激活Ras)Nature(《自然》),卷424:694-698,2003。
9.Cheng(程)JQ,Ruggeri(鲁杰里)B,Klein(克雷恩)WM,Sonoda(园田)G,Altomare(奥托马雷)DA,Watson(沃森)DK,Testa(泰斯塔)JR(1996)Amplification of AKT2in human pancreatic cancer cells and inhibition ofAKT2expression and tumorigenicity by antisense RNA.(在人胰腺癌细胞中,AKT2扩增,并且通过反义RNA,抑制AKT2表达和致肿瘤性)PNAS 93:3636-3641。
10.Cheng(程)JQ,Lindsley(林斯利)CW,Cheng(程)GZ,Hua(华)Y,Nicosia(尼科西亚)SV(2005)The AKT/PKB pathway:molecular target forcancer drug discovery.(AKT/PKB通路:癌症药物发现的分子靶)Oncogene(《癌基因》)24:7482-7492。
11.Choi(崔)HS,Kim(金)HH,Yang(杨)JM和Shin(锡恩)S.,An insight intothe gene delivery mechanism of the arginine peptide system:Role of thepeptide/DNA complex size.(深入了解精氨酸肽系统的基因递送机制:peptide的作用/DNA复合物大小)Biochimica et Biophysica Acta(BBA)(《生物化学和生物物理学报》),2006;1760:1604-1612。
12.Cloninger(克洛宁格),M.J.Biological applications of dendrimers.(树状聚合物的生物学引用)Curr.Opin.Chem.Biology(《细胞生物学新观点》).6,742-748(2002)
13.De Boer(波尔)PA,Crossley(克罗斯雷),RE,和Rothfield(罗斯菲德),LI.A division inhibitor and topological specific factor coded for by themiicell locus determine proper placement of the division septum inE.coli.(大肠杆菌中,由微细胞座编码的分裂抑制剂和拓扑特异性因子确定分割隔膜的适当放置)Cell(《细胞》),56;641-649,1989。
14.de la Fuente(德拉芬特)J.M.和Berry(贝里)C.C.BioconjugateChemistry(《生物轭合物化学》),2005,16(5);ACS,页1176-1180。
15.Dehm(德恩)SC和Bonham(邦汉)K.“Src gene expression in humancancer:The role of transcriptional activation.(人癌症中Src基因表达:转录激活的作用)Biochem.Cell Biol.(《生物化学与细胞生物学》)卷82,2:263-274,2004。
16.Dennis(丹尼斯)PA,Targeting Akt in Cancer:Promise,Progress,andPotential Pitfalls.(癌症中的靶向Akt:许诺、进展和潜在危险)AACREducation Book(《AACR教科书》),2008:25-35。
17.Filardo(菲拉尔多)EJ,Brooks(布鲁克斯)PC,Deming(戴明)SL,Damsky(丹姆斯基)C,CHeresh(切雷什)DA(1995)Requirement of theNPXY motif in the integrin beta 3 subunit cytoplasmic tail for melanomacell migration in vitro and in vivo.(在体内和体外,对于黑色素瘤迁移,整合素β3亚基细胞质尾中的NPXY基序的要求)J Cell Biol(《细胞生物学杂志》)130:441-450。
18.Huang(黄)David(大卫),CS.,Cory(克里)S和Strasser(斯特拉瑟)A.,Oncogene(《癌基因》)(1997)14:405-414。
19.Howard(霍华德)M,Dicara(迪卡拉)D,Marshall(马歇尔)JF(2007)αvβ6Peptide ligands and their uses.(αvβ6肽配体及其应用)PCT.WO2007/039728
20.Hynes(海因斯)RO.(1992)Integrins:versatility,modulation,andsignaling in cell adhesion.(整合素:细胞粘附中的多功能性、调制和信号传导)Cell(《细胞》):69:11-25。
21.Kim(金)HH,Lee(李)WS,Yang(杨)JM和Shin(锡恩)S.,Basic peptidesystem for efficient delivery of foreign genes.(用于外源基因的有效递送的碱性肽)Biochimica et Biophysica Acta(BBA)(《生物化学和生物物理学报》),2003;1640:129-136。
22.Kim(金),H.H.等人,Int.J.Pharmaceutics(《药剂学国际杂志》),2007,335:70-78
23.Lee(李),C.C.,MacKay(麦基),J.A.,Frechet(弗雷谢),J.M.和Szoka(索卡),F.C.Designing dendrimers for biological applications.(用于生物学应用的设计的树状聚合物)Nature Biotech.(《自然生物技术》)23,1517-1526(2005)。
24.Liby(立白)TA,Spyropoulos(斯皮罗普罗斯)P,Lindner(林德纳)HB,Eldridge(埃尔德里奇)J,Beeson(彼森)C,Hsu(许)T,Muise(缪伊斯)-Helmericks(赫尔梅里克斯)RC(2011)Akt3 controls vascularendothelial growth factor secretion and angiogenesis in ovarian cancercells.(在卵巢癌细胞中,Akt3控制血管内皮生长因子分泌和血管生成)Cancer Cell Biol.(《癌细胞生物学》)DOI:10.1002/ijc.26010。
25.Liu(刘),B.R.等人,Biomaterials(《生物材料?),2011,32:3520-353726.Luckey(拉基)M和Nikaido(二阶堂)H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美国国家科学院院刊》)卷77:页167-171,(1980)。
27.MacDiarmid(麦克迪尔米德),JA.,Mugridge(马格里奇),NB.,和Wiess(韦斯),JC(2007),Cancer Cell(《癌细胞》);11;431-445。
28.Nakatani(中谷)K,Thompson(汤普森)DA,Barthel(巴塞尔)A,Hiroshi(弘)S,Liu(刘)W,Weigel(韦格尔)RJ,Roth(罗特)RA(1999)Upregulation of Akt3in estrogen receptor-deficient and androgenindependent prostate cancer cell lines.(在雌激素受体缺陷的和雄激素独立的前列腺癌细胞系中,Akt3上调)J Biol Chem(《生物化学杂志》)274:21528-21532。
29.Needlemen(内德勒曼),S.B.,和Wunsch(翁施),C.C.A general methodapplicable to the search for similarities in the amino acid sequence of twoproteins.(可用于寻找两个蛋白的氨基酸序列中的相似性的一般方法)J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)48(3),443-53,1970。
30.Ojima(大岛)I.等人,Future Med Chem,2012,4(1):33-50。
31.Pearson(皮尔森),WR.和Lipman(利普曼),DJ.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(《美国国家科学院院刊》),1988,Apr,85(8):2444-2448。
32.Sadler(塞德勒),K.和Tam(塔姆),J.P.Peptide dendrimers:applicationsand synthesis.(肽树状聚合物:应用和合成)Rev.Mol.Biotechnology.(《分子生物技术综述》)90,195-229,(2002)。
33.Smith(史密斯),TF.和Waterman(沃特曼),MS.J.Mol.Biol(《分子生物学杂志》),1981,147(1)页:195-197。
34.Sun(孙)M,Paciga(佩西加)JE,Feldman(费尔德曼)RI,Yuan(袁)Z,Coppola(科波拉)D,Lu(卢)YY,Shelley(谢莉)SA,Nicosia(尼科西亚)SV,Cheng(程)JQ(2001)Phosphotidylinositol-3-OH(PI3K)AKT2,activated inbreast cancer,regulates and is induced by estrogen receptorα(ERα)viainteraction between ERαand PI3K.(经由Erα和PI3K之间的相互作用,在乳癌中激活磷脂酰肌醇-3-OH(PI3K)AKT2,调节,并且由雌激素受体α对其进行诱导)Cancer Res(《癌症研究》|)61:5985-5991。
35.Takada(高田)Y等人Protein family review-The integrins.(蛋白家族综述——整合素)Genome Biology(《基因组生物学》),2007;8(5):215。
36.von Meyerburg(冯迈恩堡)K和Nikaido(二阶堂)H.BiochemBiophys Res.(《生物化学和生物物理学研究》)卷78:页1100-1107,(1977)。
Claims (25)
1.一种用于抑制癌细胞生长的分离的或纯化的肽,该肽包括氨基酸序列RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5),其中K和R分别是赖氨酸和精氨酸氨基酸残基,每个x独立地是一种氨基酸,并且该肽与氨基酸序列RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)具有50%或更少的氨基酸序列一致性。
2.根据权利要求1所述的肽,其中每个x氨基酸独立地是一种选自下组的氨基酸残基,该组由以下各项组成:丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、苏氨酸(T)和丝氨酸(S)氨基酸残基。
3.根据权利要求1或2所述的肽,其中每个x氨基酸独立地是一种非极性氨基酸。
4.根据权利要求2或3所述的肽,其中每个x氨基酸独立地是丙氨酸(A)或缬氨酸(V)。
5.根据权利要求4所述的肽,其中每个x氨基酸是丙氨酸(A)。
6.根据权利要求4所述的肽,其中每个x氨基酸是缬氨酸(V)。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的肽,具有与氨基酸序列RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)50%的序列一致性。
8.根据权利要求1或4所述的肽,具有与氨基酸序列RSKAKNPLYR(SEQ ID No.2)40%的序列一致性。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的肽,其中该肽由氨基酸序RxKxKxxxxR(SEQ ID No.5)组成。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的肽,其中该肽具有从10至25个氨基酸的长度。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的肽,其中该肽抑制一种选自下组的激酶,该组由以下各项组成:c-Src和Akt非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。
12.一种用于抑制癌细胞生长和/或增殖的试剂,包括一种连接至一个易化子部分的如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽,该易化子用于使该肽跨越该癌细胞的外部细胞膜进入该细胞的细胞质中。
13.一种根据权利要求12所述的试剂,是一种嵌合肽。
14.编码如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽或如在权利要求12或13中所限定的试剂的一种分离的核酸,用于表达该肽或试剂。
15.包括编码如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽的核酸插入物的一种表达载体,用于在细胞中表达该肽。
16.包括如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽、如在权利要求12或13中所限定的试剂、或如在权利要求15中所限定的表达载体连同药学上可接受的运载体或赋形剂的一种药物组合物。
17.根据权利要求16所述的药物组合物,包括加载有该肽的细菌衍生的微细胞。
18.根据权利要求16所述的药物组合物,包括加载有该表达载体的细菌衍生的微细胞。
19.一种用于抑制癌细胞生长和/或增殖的方法,包括用一个有效量的如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽、如在权利要求12或13中所限定的试剂、或用于在该细胞中表达该肽的编码该肽的核酸处理该细胞。
20.一种用于预防或治疗哺乳动物中的癌的方法,包括给予该哺乳动物一个有效量的如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽、如在权利要求12或13中所限定的试剂、或用于在该癌的癌细胞中表达该肽的编码该肽的核酸。
21.一种用于抑制细胞中至少一种蛋白激酶的活性的方法,包括用以下项处理该细胞:根据在权利要求1至11中任一项中所述的至少一种肽、根据权利要求12或13所述的试剂、或一种编码该肽的核酸,该核酸用于在该细胞中表达该核酸。
22.根据权利要求21所述的方法,其中该激酶选自下组,该组由以下各项组成:c-Src激酶和Akt非特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的至少一种激酶。
23.根据权利要求17所述的方法,其中该肽抑制Akt2和Akt3中至少一个的活性。
24.如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽、如在权利要求12或13中所限定的试剂、或一种编码该肽的核酸,用于在预防或治疗哺乳动物中的癌中使用。
25.如在权利要求1至11中任一项中所限定的肽、如在权利要求12或13中所限定的试剂、或一种编码该肽的核酸在制造用于预防或治疗哺乳动物中癌的药物中的用途。
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Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105294839A (zh) * | 2015-10-28 | 2016-02-03 | 上海大学 | 对新生血管形成有阻断功能的多肽化合物及其应用 |
CN105936643A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-09-14 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
CN105936642A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-09-14 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
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CN106146620A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-11-23 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
CN106167513A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-11-30 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
WO2021068890A1 (zh) * | 2019-10-09 | 2021-04-15 | 中山大学 | 溶酶体靶向的抗体-药物偶联物及其应用 |
Families Citing this family (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101644982B1 (ko) * | 2015-07-23 | 2016-08-02 | 주식회사 엔솔바이오사이언스 | 신규 펩타이드 및 그 용도 |
GB201706472D0 (en) * | 2017-04-24 | 2017-06-07 | Cancer Res Tech Ltd | Tumour-targeting peptide variants |
CN111094324B (zh) * | 2018-03-14 | 2023-10-10 | 武汉博威德生物技术有限公司 | 一种溶瘤病毒、合成dna序列及其应用 |
WO2019218016A1 (en) * | 2018-05-15 | 2019-11-21 | Interk Peptide Therapeutics Limited | Peptide activating agent |
JP2021523945A (ja) * | 2018-05-15 | 2021-09-09 | インテルク ペプチド セラピューティクス リミテッド | 活性化剤 |
US20220409510A1 (en) * | 2018-11-30 | 2022-12-29 | Interk Peptide Therapeutics Limited | Polypeptides And Methods For Improving Skin Conditions |
CN112646018B (zh) * | 2021-01-25 | 2023-04-28 | 井冈山大学 | 一种抑制肿瘤细胞增殖和转移的生物活性肽及其应用 |
WO2023019323A1 (en) * | 2021-08-20 | 2023-02-23 | Interk Peptide Therapeutics Limited | Compositions and methods for treating autoimmunity, including autoimmunity associated with cancer and cancer therapy |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005037308A1 (en) * | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Inter-K Pty Limited | Methods and agents for the treatment of cancer |
WO2010094085A1 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Inter-K Pty Limited | Inhibition of multiple cell activation pathways |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030162956A1 (en) | 1997-04-07 | 2003-08-28 | Human Genome Sciences, Inc. | Leukocyte regulatory factors 1 and 2 |
ATE385503T1 (de) * | 1999-06-28 | 2008-02-15 | Inter K Pty Ltd | Verfahren zur modulierung von integrin- vermittelter zellaktivitaet und hierfuer geeignete reagenzien |
AU2001275423B2 (en) * | 2000-06-09 | 2007-01-11 | Regulon, Inc. | Encapsulation of polynucleotides and drugs into targeted liposomes |
US6696546B1 (en) | 2000-11-06 | 2004-02-24 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Peptide that kills growing but not stationary cells |
AUPR230500A0 (en) * | 2000-12-22 | 2001-01-25 | University Of Newcastle Research Associates Limited, The | A method of modulating map kinase mediated cellular activity and agents useful in same |
WO2002053726A2 (en) | 2001-01-02 | 2002-07-11 | Hybrigenics | Protein-protein interactions in adipocyte cells |
US20030194798A1 (en) | 2001-05-24 | 2003-10-16 | Surber Mark W. | Minicell compositions and methods |
PT2302063T (pt) | 2001-10-15 | 2016-07-28 | Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd | Minicélulas intactas, como vetores para a transferência de adn e terapêutica genética in vitro e in vivo |
MXPA04004609A (es) * | 2001-11-16 | 2004-08-12 | Genentech Inc | Composicion que comprende y metodo para utilizar angptl3 de proteina 3 como angiopoyetina. |
WO2005009346A2 (en) | 2003-06-24 | 2005-02-03 | Mirus Corporation | Inhibition of gene function by delivery of polynucleotide-based gene expression inhibitors to mammalian cells in vivo |
US7611885B2 (en) | 2003-06-24 | 2009-11-03 | Engeneic Molecular Delivery Pty, Ltd. | Pharmaceutically compatible method for purifying intact bacterial minicells |
WO2005105837A2 (en) | 2004-04-14 | 2005-11-10 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Use of the ribosomal protein rpl41 to treat infections and inhibit cancer |
WO2006029005A2 (en) | 2004-09-02 | 2006-03-16 | Oklahoma Medical Research Foundation | Promoter substitution for immunoglobulin therapy |
WO2006029981A1 (en) | 2004-09-13 | 2006-03-23 | Vib Vzw | Abin-mediated protection against lung inflammatory disease |
PL1804835T3 (pl) | 2004-09-13 | 2010-11-30 | Genzyme Corp | Konstrukty multimeryczne |
US7429481B2 (en) | 2004-09-14 | 2008-09-30 | University Of Pittsburgh | Targeting viruses using a modified sindbis glycoprotein |
GB0520068D0 (en) | 2005-10-03 | 2005-11-09 | Cancer Res Technology | av peptide ligand |
US7912214B2 (en) | 2007-07-20 | 2011-03-22 | Amadeus S.A.S. | Method and system for generating and controlling the distribution and use of personal promotion codes by targeted customers |
US20110105408A1 (en) * | 2008-02-22 | 2011-05-05 | Inter-K Pty Limited | Therapeutic peptides |
EP2254592B1 (en) * | 2008-02-28 | 2019-06-05 | Dako Denmark A/S | Mhc multimers in borrelia diagnostics and disease |
WO2010039778A2 (en) * | 2008-09-30 | 2010-04-08 | Zirus, Inc. | Mammalian genes involved in infection |
-
2013
- 2013-01-24 EP EP13740583.3A patent/EP2807180B1/en active Active
- 2013-01-24 JP JP2014553578A patent/JP6249447B2/ja active Active
- 2013-01-24 CN CN201380016372.7A patent/CN104271590B/zh active Active
- 2013-01-24 US US14/374,245 patent/US9403877B2/en active Active
- 2013-01-24 AU AU2013202137A patent/AU2013202137B2/en active Active
- 2013-01-24 WO PCT/AU2013/000045 patent/WO2013110120A1/en active Application Filing
- 2013-01-24 CA CA2862485A patent/CA2862485C/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005037308A1 (en) * | 2003-10-17 | 2005-04-28 | Inter-K Pty Limited | Methods and agents for the treatment of cancer |
WO2010094085A1 (en) * | 2009-02-23 | 2010-08-26 | Inter-K Pty Limited | Inhibition of multiple cell activation pathways |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
AGREZ M.等: "Novel Anti-Cancer Peptides Comprising Three Amino Acids", 《JOURNAL OF CANCER THERAPY》 * |
Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105294839A (zh) * | 2015-10-28 | 2016-02-03 | 上海大学 | 对新生血管形成有阻断功能的多肽化合物及其应用 |
CN105936643A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-09-14 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
CN105936642A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-09-14 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
CN106084012A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-11-09 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
CN106146620A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-11-23 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
CN106167513A (zh) * | 2016-07-09 | 2016-11-30 | 青岛大学 | 具有抑制癌细胞生长活性的肽及其应用 |
WO2021068890A1 (zh) * | 2019-10-09 | 2021-04-15 | 中山大学 | 溶酶体靶向的抗体-药物偶联物及其应用 |
CN113453718A (zh) * | 2019-10-09 | 2021-09-28 | 中山大学 | 溶酶体靶向的抗体-药物偶联物及其应用 |
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